SK283878B6

SK283878B6 - In vitro spôsob určenia HIV chemoterapie HIV pozitívnych pacientov

Info

Publication number: SK283878B6
Application number: SK1002-98A
Authority: SK
Inventors: B�Thune Marie-Pierre De; Kurt Hertogs; Rudi Pauwels
Original assignee: Virco B.V.B.A.
Priority date: 1996-01-26
Filing date: 1997-01-24
Publication date: 2004-04-06
Also published as: EP0877937B1; HU226203B1; EP0877937A1; WO1997027480A1; HUP9902618A3; TR199801443T2; ATE217971T1; AU1316897A; US20020042679A1; NZ325912A; ES2177922T3; BG102710A; CN1991365A; PL328069A1; CZ292899B6; IS4799A; CZ233598A3; NO321329B1; SK100298A3; NO983300L

Abstract

Je opísaný in vitro spôsob určenia HIV chemoterapie HIV pozitívnych pacientov, ktorý zahŕňa transfekciu bunkovej línie citlivej proti HIV infekcii so sekvenciou z pol génu HIV, získanou izoláciou vírusovej RNA zo vzorky biologického materiálu od pacienta a reverznou transkripciou požadovanej oblasti pol génu, a HIV-DNA konštruktom, z ktorého bola uvedená sekvencia deletovaná, kultiváciu týchto transfekovaných buniek na vytvorenie zásoby chimérových vírusov, stanovenie fenotypovej citlivosti týchto chimérových vírusov proti inhibítoru uvedeného enzýmu kódovaného pol génom HIV a priradenie určitej hodnoty tejto fenotypovej citlivosti, vytvorenie súboru dát obsahujúceho uvedenú hodnotu pre citlivosť chimérového vírusu a zodpovedajúcu hodnotu pre chimérový štandardný kmeň HIV, zopakovanie stanovenia citlivosti pre najmenej dva ďalšie inhibítory a zostrojenie celkovo najmenej troch takýchto súborov dát, zobrazujúc uvedené súbory dát v dvojrozmernej alebo trojrozmernej grafickej forme tak, že rozdiel medzi chimérovou a štandardnou citlivosťou v prípade každého súboru dát poskytuje vizuálnu mieru rezistencie chimérovej zásoby proti liečbe daným inhibítorom, a výber optimálneho inhibítora (inhibítorov) na základe grafického znázornenia takto meraných rezistencií. Spôsobom sa získa veľké množstvo fenotypových informácií o jednotlivých pacientoch infikovaných HIV, ekonomicky a rýchlo. Spôsob je použiteľný pri všetkých chemoterapeutických postupoch používaných v súčasnosti a rovnako sa očakáva jeho použiteľnosť pri chemoterapeutických postupoch v budúcnosti.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka in vitro spôsobu určenia HIV chemoterapie HIV pozitívnych pacientov na základe fenotypovej liekovej citlivosti humánnych HIV kmeňov proti inhibítorom jedného alebo viacerých enzýmov HIV pol génu, ako aj spôsobu na simultánne stanovenie fenotypovej liekovej citlivosti dvoch alebo viacerých takýchto enzýmov HIV/?o/ génu proti ich inhibítorom.

Doterajší stav techniky

Doteraz bolo vyvinutých niekoľko chemoterapeutických postupov na liečbu HIV infikovaných pacientov. Niektoré z nich boli schválené na klinické použitie, iné sú predmetom prebiehajúcich klinických skúšaní. Možno zhrnúť, že počet schválených chemoterapeutických postupov sa bude v blízkej budúcnosti neustále zvyšovať. Zvyšuje sa používanie kombinovanej terapie alebo používanie liečby viacerými liečivami, pretože počas terapie dochádza k vzniku HIV variantov rezistentných na liečivá. Hoci sa ukázalo, že tieto chemoterapeutické postupy ovplyvňujú virologické (vírusovú záťaž), imunologické a klinické parametre HIV ochorenia, praktická skúsenosť ukazuje, že tieto účinky sú prechodné. Ide najmä o to, že HIV kmene infikujúce jedného pacienta začnú po krátkom čase mať zníženú citlivosť proti liečivu alebo proti kombinácii liečiv, ktorými je pacient liečený. Strata účinnosti chemoterapie je odlišná od pacienta k pacientovi, od liečiva k liečivu alebo od jednej kombinácie liečiv k druhej kombinácii. Je dobre známe, že strata účinnosti proti určitému postupu chemoterapie môže súvisieť s genotypovou štruktúrou zmien aminokyselín v genóme HIV kmeňov, ktorými je pacient infikovaný. Toto vysvetľuje, prečo sú tieto kmene HIV menej citlivé na chemoterapiu. Keďže HIV infikovaný pacient je vystavený niekoľkým chemoterapeutickým postupom počas dlhých časových období, vyskytujú sa zložitejšie kombinácie zmien aminokyselín v genóme infikujúcich HIV kmeňov, ktoré maria racionálny prístup k ďalšej liečbe infikovaného pacienta. Ako už bolo zahrnuté do predchádzajúceho vysvetlenia, je možné rutinným spôsobom stanoviť genotypové zmeny vyskytujúce sa pri kmeňoch HIV vystavených rozličným chemoterapeutickým postupom používajúcim jednozložkové alebo mnohozložkové anti HIV liečivá, ale doteraz bolo veľmi ťažké odvodiť z týchto dát informácie, ktoré by lekárovi predpisujúcemu chemoterapiu umožňovali určiť, či jc táto chemoterapia vhodná na začatie alebo pokračovanie určeného chemoterapeutického postupu. Inými slovami, informácia genotypového charakteru, ktorá je dostupná v obmedzenom rozsahu, nemôže byť rutinne preložená do fenotypovej informácie umožňujúcej zodpovednému lekárovi dospieť ku kľúčovému rozhodnutiu, ktorá chemoterapia je pre pacienta najvýhodnejšia. Okrem toho existuje problém neliečených pacientov, ktorí sú infikovaní kmeňmi HIV rezistentnými na liečivá.

Monitorovanie vírusového zaťaženia sa stáva rutinnou súčasťou HIV liečby. Ale, mieru vírusového zaťaženia samotnú nie je možné použiť ako základ pre rozhodovanie, ktoré liečivá sa majú použiť samostatne alebo v kombinácii.

Kombinovaná liečba sa čoraz viac stáva spôsobom výberu chemoterapeutického postupu. Ak jedinec užívajúci kombináciu liečiv začne mať známky zlyhávania terapie, nie je možné s určitosťou vedieť, ktoré z liečiv v kombinácii je už neúčinné. Nie je možné jednoducho nahradiť všet ky z liečiv, vzhľadom na ich limitovaný počet dostupný v súčasnosti. Okrem toho pri zmene celého terapeutického režimu môže dôjsť k vylúčeniu jedného alebo viacerých liečiv, ktoré sú pre toho ktorého pacienta účinné. Ďalej je možné, že vírusy, ktoré majú rezistenciu proti určitému inhibítoru, majú tiež v rôznom stupni skríženú rezistenciu proti iným inhibítorom.

Bolo by preto ideálne, aby kdekoľvek, ak sa u pacienta pri teste vírusovej záťaže zistí zvýšená vírusová záťaž, bol tiež uskutočnený test na liekovú citlivosť/rezistenciu. Pokiaľ sa nevyvinie účinná kuratívna terapia, zvládanie HIV ochorenia bude takéto testovanie vyžadovať.

V súčasnosti existuje fenotypizačný spôsob, ktorý je založený na izolácii vírusu z plazmy v prítomnosti mononukleámych buniek periférnej krvi darcu (PBMCs) a následnej fenotypizácii v uvedených bunkách (Japour, A. J. et al. (1993) Antimicrobial Agents and Chemotherapy; Vol.

37, č. 5, s. 1095 až 1101). Táto kokultivačná metóda, ktorá je odporúčaná Skupinou pre klinické skúšania pri AIDS (ACTG) najmä pre fenotypizáciu AZT (synonymum zidovudinu /Retroviru (Retrovir je ochranná známka) rezistencie, je časovo náročná, finančne náročná a príliš zložitá na to, aby sa používala v rutinných podmienkach.

Fenotypový rekombinantný vírusový test na stanovenie liekovej citlivosti izolátor HIV typu I proti inhibítorom reverznej transkriptázy (RT) vyvinuli Kellam, P. a Ľarder, B. A. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1994), Vol.

38, č. 1, s. 23 až 30. Tento postup umožňuje generovanie živého vírusu homológnou rekombináciou PCR-produkovanej kmeňovú RT kódujúcich sekvencií do neinfekčného provírusového klonu s RT deléciou, pHIVARTBstEIl. Analýza dvoch pacientov počas zidovudinovej terapie ukázala, že pri tomto postupe sa produkovali vírusy, ktoré presne mali ten istý genotyp a fenotyp ako tie, ktoré boli v pôvodne infikovanej PBL DNA. Ale postup zahŕňa izoláciu vírusu od pacienta kokultiváciou pacientovej plazmy alebo pacientových PBMCs s donorovými PBMCs. Takáto predkultivácia môže skresľovať zloženie pôvodného vírusu. Okrem toho, tento spôsob, hoci umožňuje stanoviť citlivosť izolátov proti rôznym inhibítorom, neposkytuje lekárovi informáciu, či má pokračovať v existujúcom chemoterapcutickom režime, alebo má terapiu zmeniť.

Tiež, ak sa sleduje iba jeden enzým pol génu, spôsob sám osebe nie je vhodný na rutinné fenotypizačné stanovenie pri kombinovanej liečbe, ktorá zvyčajne zahŕňa použitie inhibítorov jednej proteázy a dvoch RT.

Hniezdová PCR (polymerázová reťazová reakcia) použitá v teste rekombinantného vírusu môže viesť k situácii, kde rekombinantný vírus nepravdivo odráža stav infikovania HIV kmeňmi u sledovaných pacientov. Tento problém spočíva v homológii DNA sekvencie a v minimálnom množstve homológie požadovanej pre homológnu rekombináciu v cicavčích bunkách ( C. Rubnitz, J. a Subraminí,

S. (1984) Molecularand Cellular Biology, Vol. 4, č. 11, s. 2253 až 2258). Podľa toho, akýkoľvek fenotypizačný test založený na prístupe rekombinantného vírusu by mal zaistiť, aby čo najviac materiálu od pacienta sa amplifikovalo a aby rekombinácia bola maximálna.

Preto použitá RNA extrakcia a hniezdová PCR by mala zaistiť, že vírusový genetický materiál sa amplifikuje, takže amplifikovaný materiál maximálne odráža vírusovú genetickú diverzitu u sledovaného pacienta.

V súčasnej klinickej praxi je preto veľmi významná (a) potreba rýchleho stanovenia fenotypovej liekovej senzitivity HIV kmeňov infikujúcich konkrétneho pacienta na rutinnej báze, (b) potreba transformovať takto získané dáta do ľahko zrozumiteľnej informácie a (c) potreba iniciovať terapiu predpísanú konkrétnemu pacientovi, pokračovať v nej alebo ju upraviť na základe uvedenej informácie.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je in vitro spôsob určenia Hl V chemoterapie HIV pozitívnych pacientov, ktorý zahŕňa transfekciu bunkovej línie citlivej proti HIV infekcii so sekvenciou z pol génu HIV, získanou izoláciou vírusovej RNA zo vzorky biologického materiálu od pacienta a reverznou transkripciou požadovanej oblasti pol génu, a HIV-DNA konštruktom, z ktorého bola uvedená sekvencia deletovaná, kultiváciu týchto transfekovaných buniek na vytvorenie zásoby chimérových vírusov, stanovenie fenotypovej citlivosti týchto chimcrových vírusov proti inhibítoru uvedeného enzýmu kódovaného pol génom HIV a priradenie určitej hodnoty tejto fenotypovej citlivosti, vytvorenie súboru dát obsahujúceho uvedenú hodnotu pre citlivosť chirnérového vírusu a zodpovedajúcu hodnotu pre chimérový štandardný kmeň HIV, zopakovanie stanovenia citlivosti pre najmenej dva ďalšie inhibítory a zostrojenie celkovo najmenej troch takýchto súborov dát, zobrazujúc uvedené súbory dát v dvojrozmernej alebo trojrozmernej grafickej forme tak, že rozdiel medzi chimérovou a štandardnou citlivosťou v prípade každého súboru dát poskytuje vizuálnu mieru rezistencie chimérovej zásoby proti liečbe daným inhibitorom, a výber optimálneho inhibítora (inhibítorov) na základe grafického znázornenia takto meraných rezistencií.

Výsledkom spôsobu podľa vynálezu je fenotypová informácia o jednotlivých pacientoch infikovaných HIV vo veľkom meradle, hospodárne a rýchlo. Tento spôsob je použiteľný pre všetky chemoterapeutické režimy používané v súčasnosti a očakáva sa, že bude rovnako použiteľný pre budúce chemoterapeutické režimy.

Spôsob podľa vynálezu poskytuje lekárovi fenotypové údaje o HIV kmeňoch u pacienta, ktoré možno okamžite použiť na určenie, či sa má konkrétny chemoterapeutický režim začať, či sa má v ňom pokračovať, alebo sa má upraviť.

Výhodne sú súbory dát prezentované na mnohouholníkovom alebo kvázi kruhovom grafe, ktorý obsahuje:

(a) množstvo normalizovaných osí rozširujúcich sa v radiálnom smere od počiatku, pričom každá os zodpovedá jednému súboru dát alebo jeho inhibítoru, alebo kombinácii;

(b) osi normalizované tak, že hodnoty citlivosti pre štandardný HIV pre rôzne inhibítory sú rovnaké na každej osi, dátové body pre štandardný HIV sú voliteľne znázornené a spojené, aby vytvárali pravidelný mnohouholník, ktorého vrcholy ležia na osiach a ktorého stred je definovaný počiatkom;

(c) na každej osi sa dátový bod predstavujúci hodnotu citlivosti chimérického HIV kmeňa proti inhibítoru zodpovedajúcemu uvedenej osi vynesie do grafu, body chimérových dát sú voliteľne spojené, aby tvorili pravidelný alebo nepravidelný mnohouholník tvaru, ktorý predstavuje rezistenciu zásoby chimérického HIV proti danému rozsahu inhibítorov.

Mnohouholníkový alebo kvázi kruhový graf poskytuje tú výhodu, že rezistencia pacienta proti množstvu liečiv je charakterizovaná prostredníctvom stupňa divergencie medzi mnohouholníkom predstavujúcim pacientov chimérny HIV kmeň a mnohouholníkom predstavujúcim štandardný kmeň. Plochy mnohouholníkov budú vo všeobecnosti divergovať viac v niektorých oblastiach ako v iných oblastiach, čo v každom prípade naznačuje väčší alebo menší stupeň rezistencie proti inhibítoru, ktorého os prechádza cez konkrétnu plochu.

Takže spôsob podľa vynálezu používa chimérový HIV kmeň a poskytuje mapu rezistencie tohto kmeňa v rámci rozsahu inhibítorov. Takýmto spôsobom mapa alebo graf poskytuje technickú charakteristiku aspektu chirnérového kmeňa, čo sa bežnými meraniami nedosiahne.

Vo výhodnom uskutočnení sú normalizované osi vzájomne v rovnakom uhle.

Ďalej je výhodné, aby každá os mala logaritmickú stupnicu.

Ďalej je výhodné, aby excentrické body dát v chimérovom mnohouholníku, ak sú prítomné, identifikovali inhibítory, ktorých použiteľnosť je málo vhodná alebo vôbec nie je vhodná pre pacienta, kým body dát ležiace v, na alebo mimo v blízkosti štandardného mnohouholníka identifikujú inhibítory, ktorých použitie u pacienta možno považovať za opodstatnené z hľadiska pozitívneho účinku na pacienta.

Ak sú hodnoty pre najhorší prípad zobrazené spolu s chimérovým HIV a štandardným HIV, zvyčajne nepravidelný mnohouholník zahŕňa chimérový mnohouholník a štandardný mnohouholník. Použitý termín „excentrický“ predstavuje dátový bod ležiaci relatívne blízko k hranici najhoršieho prípadu a relatívne vzdialene od štandardného mnohouholníka. Podobne termín „blízko mimo štandardného mnohouholníka“ sa vzťahuje na relatívnu blízkosť k štandardnému mnohouholníku v porovnaní so vzdialenosťou od hranice najhoršieho prípadu.

Definovaný spôsob je limitovaný v tom zmysle, že merateľná rezistencia proti inhibítoru závisí od konkrétneho rozmedzia koncentrácií použitého inhibítora. Tiež je potrebné snažiť sa o zníženie účinkov biologickej variability. Podľa toho je želateľné získať hodnotu pre maximálnu alebo v najhoršom prípade merateľnú rezistenciu, kde sa predpokladá, že inhibitor je neúčinný. Táto koncentrácia, napríklad 100 μΜ je vo všeobecnosti maximálnou koncentráciou, ktorá môže byť v praxi testovaná, ale možno ju tiež odvodiť napríklad z farmakologických, toxikologických alebo farmakokinetických štúdií. Porovnanie stupňa rezistencie sledovaného pacienta a maximálnej merateľnej rezistencie určuje, čo je významný stupeň rezistencie pre tohto pacienta. Maximálna merateľná rezistencia a skutočná rezistencia môže byť vhodne znázornená v stĺpcovom grafe, ako je uvedené ďalej.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu každý z uvedených troch alebo viacerých dátových súborov obsahuje hodnotu na meranie rezistencie konkrétneho inhibítora v najhoršom prípade, hodnoty takejto rezistencie sú prezentované graficky, tak, že dátový bod pre chimérový materiál možno porovnať jednak s bodom pre štandardný HIV a jednak s bodom pre HIV v najhoršom prípade, čim sa poskytne stanovenie relatívnej hodnoty inhibítora v konkrétnom prípade.

Experimenty so vzorkami od 150 pacientov ukázali úzku koreláciu medzi vývinom rezistencie a terapeutickou anamnézou, ako to znázorňujú príklady uvedené ďalej. Úzka korelácia sa zistila s dátami generovanými podľa vynálezu vo vzťahu k technikám klasickej izolácie vírusu a fenotypizácie.

Spôsob podľa vynálezu možno preto použiť na individualizované a racionálnejšie určenie HIV chemoterapie. Preto použitie spôsobu podľa vynálezu v kombinácii s vhodným podávaním liečiv s anti-HIV účinkom by v konečnom dôsledku malo viesť k lepšej liečbe a prežívaniu pacientov infikovaných vírusom HIV.

Spôsob podľa vynálezu je zvlášť použiteľný vtedy, ak sa individuálnemu pacientovi podáva množstvo rôznych liečiv a jeho štruktúra mutácii nie je bez ťažkostí interpretovateľná ošetrujúcimi lekármi.

Podľa ďalšieho aspektu vynálezu sa poskytuje spôsob určenia HIV chemoterapie HlV-pozitívnych pacientov, pričom tento spôsob zahŕňa:

(a) periodické stanovovanie fenotypovej citlivosti HIV kmeňov pacienta uvedeným spôsobom;

(b) zachovanie chemoterapie zvoleným inhibítorom, pokiaľ HIV kmene pacienta zostávajú citlivé proti vybranej chemoterapii;

(c) zvolenie iného inhibítora, ak jc citlivosť na pôvodný inhibítor znížená.

Podľa ďalšieho aspektu vynález poskytuje klinický riadiaci nástroj na použitie v chemoterapii pacientov, ktorí sú HIV pozitívni, nástroj s grafickým vyjadrením množstva súborov údajov, ako bolo definované.

Vo vynáleze je zavedený termín „antivirogram“ pre klinický riadiaci nástroj podľa vynálezu a tento termín sa špecifikuje ďalej. Tento nástroj poskytuje lekárovi jasnú reprezentáciu relatívnych zmien a citlivostí pre rôzne inhibítory, ktoré sa používajú, alebo by sa mohli použiť pri klinickom liečení jednotlivých HlV-infíkovaných pacientov.

Pod pojmom HIV sa všeobecne myslí HIV-1. Ale vynález je taktiež použiteľný pre IIIV-2.

Je výhodné, ak sa fenotypová citlivosť uvedených chimérových vírusov proti inhibítorom najmenej dvoch enzýmov kódovaných pol génom HIV stanovuje súčasne.

V ďalšom aspekte vynálezu sa poskytuje spôsob určenia fenotypovej liekovej citlivosti jednotlivých HIV kmeňov pacienta proti inhibítorom najmenej dvoch enzýmov kódovaných pol génom HIV, ktorý zahŕňa transfekciu bunkovej línie citlivej na infikovanie HIV so sekvenciou z pol génu HIV získanou od pacienta a HIV-DNA konštruktom, z ktorého bola uvedená sekvencia deletovaná, kultiváciu uvedených transferovaných buniek tak, aby vytvoril zásobný materiál chimérových vírusov a stanovenie fenotypovej citlivosti uvedených chimérových vírusov proti inhibítorom spomenutých enzýmov kódovaných pol génom HIV.

Požadovaná sekvencia z pol génu sa izoluje zo vzorky biologického materiálu získaného od pacienta, ktorého fenotypová citlivosť na liečivá sa stanovuje. Na izoláciu požadovanej sekvencie možno použiť množstvo biologických materiálov.

Takže biologický materiál môže byť vybraný z plazmy, séra alebo bezbunkovej telovej tekutiny pochádzajúcej zo seminálnej alebo vaginálnej tekutiny. Zvlášť výhodná je plazma a je tiež zvlášť výhodná vo vzťahu k použitiu PBMCs, ako už bolo opísané v predchádzajúcom stave techniky.

Alternatívne môže byť biologickým materiálom celková krv, ku ktorej sa pridáva RNA stabilizátor.

Okrem toho, biologickým materiálom môže byť aj tuhý tkanivový materiál, vybraný z mozgového tkaniva alebo tkaniva lymfatických uzlín alebo iného tkaniva získaného biopsiou.

Ako je demonštrované ďalej, ak sa použije biologický materiál, napríklad plazma pri izolácii požadovanej sekvencie, je možné použiť minimálny objem plazmy, zvyčajne asi 100 až 250 μΙ, výhodnejšie 200 μΐ.

Ďalej je výhodné, aby dva enzýmy boli vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje HIV RT, proteázu a integrázu.

Vírusová DNA je vhodne izolovaná v rámci vynálezu známymi spôsobmi per se, napríklad spôsobom, ako uvá dza Boom, R. et al. (Joumal of Clinical Microbiology (1990), Vol. 28, č. 3, s. 495 až 503).

V prípade plazmy, séra a bezbunkových tekutín možno tiež použiť QlAamp vírusovú RNA súpravu, dodávanú na trh Qiagen group of companies.

Výhodne je bunkovou líniou citlivou proti infekcii HIV CD4+T-bunková línia.

Ďalej je výhodné, aby CD4+T-bunkovou líniou bola MT4 bunková línia alebo HeLa CD4+bunková línia.

Reverzná transkripcia sa môže uskutočniť komerčnou súpravou, ako je QeneAmp súprava reverznej transkriptázy dodávaná na trh firmou Perkin Elmer.

Požadovaná oblasť pol génu pacienta je výhodne reverzne transkribovaná použitím špecifického downstream primeru.

V prípade, keď je sekvenciou, ktorá má byť transkribovaná, tá sekvencia, ktorá kóduje reverznú transkriptázu alebo reverznú transkriptázu a proteázu, je výhodne downstream primerom: OUT3: 5'CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ΑΤΑ TTT CTC ATG.3'(sekv. č.: 1)

Vo zvlášť výhodnom uskutočnení vynálezu je HIV RT gén a gén HIV proteázy pacienta reverzne transkribovaný použitím HIV-1 špecifického OUT 3 primeru a reverznej transkriptázy vyrobenej génovým inžinierstvom, ktorá nemá aktivitu Rnázy H, takže celková RNA, ktorá má byť transkribovaná, je konvertovaná do cDNA bez degradácie. Takúto génovým inžinierstvom vyrobenú reverznú transkriptázu, Expand (Expand je ochranná známka) reverznú transkriptázu, je možné získať od firmy Boehringer Mannheim GmbH.

Expand reverzná transkriptáza je RNA riadená DNA polymeráza. Enzým jc génovým inžinierstvom získanou verziou reverznej transkriptázy Moloney vírusu myšacej leukémie (M-MuLV-RT). Bodová mutácia v sekvencii Rnázy H redukuje aktivitu Rnázy H pod detegovateľnú hladinu. Použitie tejto génovým inžinierstvom získanej reverznej transkriptázy umožňuje získať vyššie množstvá transkriptov s úplnou dĺžkou cDNA.

Po reverznej transkripcii je transkribovaná DNA amplifikovaná použitím PCR technológie.

Je výhodné, aby produkt reverznej transkripcie bol amplifikovaný použitím hniezdovej PCR technológie. Výhodne, v prípade, kde oblasťou záujmu je RT oblasť, sa hniezdová PCR technológia používa použitím vnútorných a vonkajších primerov, ako to uvádza Kcllam, P. a Larder, B. A. (1994 vyššie). Ak je oblasťou záujmu oblasť, ktorá zahŕňa gény RT a proteázy, špecifickými používanými primermi je výhodne kombinácia OUT 3/IN 3 (downstream) a RVP 5 (upstream).

Primer RVP 5 (Mashera, B. et al., Joumal of Virology, 69, 5431 až 5436) má sekvenciu 5'-GGGAAGATCTGGCCTrCCTACAAGGG-3'(sekv. č.: 2).

Schematická prezentácia amplifikácie jc znázornená na obr. 3 a je detailnejšie opísaná v príklade 2.

Amlifikácia proteázovej cDNA v skutočnosti zahŕňa polohniezdový postup PCR, ako je zrejmé z obr. 3.

Hniezdová PCR technológia má výhodu v porovnaní s jednoduchými PCR technikami v tom, že umožňuje získanie špecifickejšieho PCR produktu.

Ale, aby sa dosiahla vyššia presnosť a výťažok počas PCR, možno použiť zmes termostabilných polymeráz (Barnes, W. M. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 91,2216 až 2220). Takáto polymerázová zmes je dostupná od Boehringer Mannheim GmbH, menovite Expand (Expand je ochranná známka) PCR systém s vysokou presnosťou. Použitím tohto systému sa dosiahla zvýšená citlivosť, konkrétne citlivosť 10-násobne vyššia v porovnaní s citlivos ťou dosiahnutou s bežným PCR postupom použitím samotnej Taq polymerázy.

Ak je oblasťou pol génu oblasť, ktorá zahŕňa RT a proteázové gény, je výhodným HIV-DNA konštruktom taký konštrukt, z ktorého sú gény RT a proteázy deletované a je to plazmidový pGEMT3-APRT, ako je uložený v Belgických koordinovaných zbierkach mikroorganizmov-BCCM LMBP- Kolekcii, 8. Nov. 1996 pod číslom LMBP3590.

Ale možno prispôsobiť niekoľko prístupov, aby sa generoval plazmid obsahujúci HIV-1 provírus s deletovaným génom proteázy a génom RT. Jednou z možností je zavedenie požadovanej delécie pomocou mutagcnczy sprostredkovanej oligonukleotidom. Ale postup prispôsobený v príklade 2 zahŕňa generovanie požadovaného konštruktu použitím špecifických reštrikčných enzýmov a subklonovacích postupov, ako je opísané. Hoci konečné výsledky závisia od dostupných reštrikčných miest, hlavnou výhodou tohto postupuje, žeje možné rýchlo získať presvedčivé výsledky.

Na zabezpečenie najúčinnejšieho výsledku transfekcie by mal byť PCR produkt, ktorý je transfekovaný, purifikovaný pomocou aniónových výmenných centrifugačných kolón, spôsobom známym per se. Vhodnou súpravou je QIAquick PCR purifikačná súprava dodávaná na trh Qiagen skupinou firiem.

Transfekciu je možné dosiahnuť elektroporáciou alebo, alternatívne, použitím lipidov, najmä katiónových lipidov, DEAE dextránu, CaHPO₄ atď.

V prípade transfekcie lipidov môže byť použitá PERFECT (PERFECT je ochranná známka) transfekčná súprava dodávaná na trh od Invitrogen B. V. Leek, Holandsko.

Teda, na transfekciu sa použije HIV-DNA konštrukt, z ktorého bol zvolený gén alebo gény pol génu deletovaný, v spojení s produktom získaným následnou amplifikáciou.

Konštruktom môže byť plazmid pHIVART (dostupný od Medical Research Council (MRC), ak je deletovaný iba RT gén. Ak sú deletované RT aj proteázové gény, vhodným HIV DNA konštruktom je tu opísaný plazmid pGEMT3-APRT, ktorý je vektorom s veľkým počtom kópií. Takéto plazmidy sú pred transfekciou linearizované spôsobmi známymi per se.

Zvláštnou výhodou použitia konštruktu kódujúceho viac ako jeden enzým pol génu, napríklad APRT konštruktu, je, žeje pravdepodobnejšie zahrnutie väčšieho množstva od pacienta, ako v prípade, keď sa použije jeden gén, takže amplifikovaný materiál vo väčšom rozsahu odráža genetickú diverzitu enzýmov u konkrétneho pacienta, ktorý sa sleduje.

Bude zrejmé, že je výhodné, aby špecifické primery vybrané pre hniezdovú PCR boli lokalizované mimo sekvencií cieľových enzýmov, ktoré sa majú amplifikovať a sledovať. Ďalej bude zrejmé, že je pravdepodobnejšie, že kombinácia RT a proteázy poskytne na sledovanie RT lepšie výsledky ako RT samostatne, pretože s RT samotnou súvisí 40 ďalších aminokyselín pochádzajúcich od pacienta. Pri sledovaní proteázy je potrebné si uvedomiť, že prvých 9 aminokyselín proteázy je ešte odvodených od hlavného reťazca štandardnej kostry konštruktu (pGEMTS-APRT).

Keď sa dosiahne transfekcia buniek prostredníctvom elektroporácie, vybrané parametre sú optimalizované, aby sa dosiahol dobrý rast buniek a dobrá produkcia vírusu. Elektroporáciu možno vhodne uskutočniť pri približne 250 pF a 300 V. Výhodne sa elektroporácia uskutočňuje v prítomnosti asi 10 pg linearizovaného plazmidu, napríklad pHIVATBstEIl a asi 5 pg amplifikovaného PCR produktu, napríklad RT PCR produktu. Pri úspešnej intracelulámej homologickej rekombinácii sa počas 5 až 10 dní vytvára nový chimérový HIV. Pomocou známych techník predstavujú časy kultivácie 12 až 14 dní pred vytvorením chimérového HIV. Alikvoty kultivačného supematantu sa uchovávajú pri teplotách -70 °C alebo nižších.

Je zrejmé, že uvedené spôsoby je možné použiť na izoláciu a amplifikáciu ďalších HIV génov, napríklad génu integrázy, alebo viac ako jedného iného HIV génu, napríklad génu RT a génu integrázy, a na transfekciu CD4+Tbunky so zodpovedajúcimi PCR produktmi integrázy alebo RT/integrázy v spojení s vhodným linearizovaným HIVDNA konštruktom, z ktorého je relevantný gén (alebo gény) deletovaný.

Novovytvorené chimérové vírusy sú titrované a potom analyzované na ich fenotypovú citlivosť (t. j. náchylnosť) proti rôznym enzymatickým inhibítorom pol génu, výhodne v automatizovanom bunkovom teste.

Výhodne je fenotypová lieková citlivosť chimérových vírusov a štandardného kmeňa, ktorým je vhodne rekombinantný štandardný HIV, proti jednej alebo viacerým inhibítorom RT, proteázy alebo integrázy, vyjadrená ako inhíbičná koncentrácia (hodnota 1C).

Citlivosti chimérových vírusov a štandardného HIV kmeňa proti jednému alebo viacerým RT inhibítorom a/alebo jednému alebo viacerým inhibítorom proteázy a/alebo jednému alebo viacerým inhibítorom integrázy môžu byť vyjadrené ako napríklad 50 % alebo 90 % inhibičné koncentrácie (IC₅₀ alebo IC₉₀ hodnoty).

Výhodne sú RT inhibítory vybrané z nukleozidových RT inhibítorov, ako sú AZT, ddl (didanozin/Videx (Videx je výrobná značka), ddC (zalcitabín), 3TC (lamivudín), d4T (stavudin), nenukleozidových RT inhibítorov, ako delavirdin (U9051125 (BMAP)/Rescriptor (Rescriptor je ochranná známka), lovirid (alfa-APA), nevirapín (Bl-RG-587/Viramunc (Viramune je ochranná známka) a tivirapin (8-CI-TIBO(R86183), inhibítorov proteázy, ako saquinavir, indinavir a ritonavir a inhibítorov integrázy, ako fenyletylester kyseliny kávovej (CÁPE).

Vhodné inhibítory RT a/alebo proteázy a/alebo integrázy sú vybrané z nukleozidových inhibítorov RT, ako sú AZT, ddl, ddC, 3TC, d4T, I592U89 a podobne, nenukleozidových inhibítorov RT, ako sú lovirid, nevirapín, delaviridin, ateviridin a tivirapin (8-CI TIBO) a podobne, proteázových inhibítorov, ako sú saquinqvir, indinavir a ritonavir a podobne a integrázových inhibítorov, ako sú fenyletylester kyseliny kávovej (CÁPE) a HIV integrázových inhibítorov typu opísaného vo WO 95/08540 a GB 2 271 566.

Spôsob podľa vynálezu zahŕňa krok porovnávania fenotypovej liekovej citlivosti HIV kmeňov pacienta s jedným alebo viacerými RT inhibítormi a/alebo jedným alebo viacerými proteázovými inhibítormi a/alebo jedným alebo viacerými inhibítormi integrázy s liekovou citlivosťou štandardného kmeňa HIV. Na jednoduché pochopenie je zostrojený graf Antivirogramu ako prezentácia relatívnych zmien v citlivosti proti rôznym testovaným liečivám (alebo ich kombináciám).

Graf treba interpretovať nasledovne: excentrické body dát v antivirograme identifikujú chemoterapeutické režimy, ktorých pozitívny účinok na HIV infikovaného pacienta je nepravdepodobný, kým body dát v alebo na referenčnom mnohouholníku, alebo mierne mimo referenčného mnohouholníka identifikujú chemoterapeutické režimy, ktorých pozitívny účinok na HIV infikovaného pacienta je pravdepodobný.

Spôsoby podľa vynálezu v kombinácii s podávaním správne zvolených liečiv s anti HIV účinkom by nakoniec mali viesť k lepšej liečbe, zvýšeniu kvality života a k zlep šeniu prežívania HIV infikovaných pacientov; t. j. neúčinnej liečbe (v dôsledku prítomnosti alebo objavenia sa rezistentných HIV kmeňov) možno predchádzať alebo ju zastaviť a neodkladne možno začať účinnú chemoterapiu.

Predkladaný vynález predstavuje aj nástroj klinického riadenia na použitie lekármi liečiacimi HIV infikovaných pacientov, ktorý zahŕňa Antivirogram, ktorý možno získať uvedenými spôsobmi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. I je schematickým znázornením skonštruovania plazmidu pGEMT3-APRT.

Obr. 2 predstavuje ďalšiu a komplementárne schematickú prezentáciu skonštruovania plazmidu pGEMT3-APRT.

Obr. 3 je schematickým znázornením časti HIV-HXB2D sekvencie obsahujúcej gény proteázy a RT.

Obr. 4 A-H je úplná sekvencia pre časť H1V-HXB2D sekvencie obsahujúcej gény proteázy a RT.

Obr. 5 je Antivirogram pacienta s 3TC rezistentnými HIV kmeňmi, ako je opísané v príklade 5.

Obr. 6 je Antivirogram pre pacienta so štandardnými HIV kmeňmi, ako je opísané v príklade 6, ktorý doposiaľ nebol liečený.

Obr. 7A je stĺpcový graf znázorňujúci relatívne zmeny v liekovej citlivosti u pacienta z príkladu 7.

Obr. 7B je Antivirogram pacienta z príkladu 7.

Obr. 8A je stĺpcový graf znázorňujúci relatívne zmeny v liekovej citlivosti u pacienta z príkladu 8.

Obr. 8 je Antivirogram pacienta z príkladu 8.

Obr. 9 A je stĺpcový graf znázorňujúci relatívne zmeny v liekovej citlivosti u pacienta z príkladu 9.

Obr. 9B je Antivirogram pacienta z príkladu 9.

Obr. 10A je stĺpcový graf znázorňujúci relatívne zmeny v liekovej citlivosti u pacienta z príkladu 10.

Obr. 10B je Antivirogram pacienta z príkladu 10.

Obr. 11A je stĺpcový graf znázorňujúci relatívne zmeny v liekovej citlivosti u pacienta z príkladu 11.

Obr. 11B je Antivirogram pacienta z príkladu 11.

Obr. 12A je stĺpcový graf znázorňujúci relatívne zmeny v liekovej citlivosti u pacienta z príkladu 12.

Obr. 12B je Antivirogram pacienta z príkladu 12.

Vynález ďalej ilustrujú nasledovné príklady.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

1. Extrakcia a amplifikácia vírusovej RNA

RNA bola izolovaná zo 100 μΐ plazmy podľa spôsobu, ktorý opísal Boom, R. et al. (1990), a bola reverzne transkribovaná súpravou GENEAmp reverznej transkriptázy (Perkin Elmer), ako uvádza výrobca a použitím HIV-1 špecifického downstream primeru (OUT3:5'-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ΑΤΑ TTT CTC ATC-3'; sekv. č. 1). PCR na reverzne transkribovanej RNA sa uskutočnila pomocou vnútorných a vonkajších primerov, ako to uvádza Kellam, P. a Larder, B. A. (1994). Po extrakcii chloroformom a centrifugácii na Centricon 100 kolónach alebo centrifugácii na aniónových výmenných ccntrifugačných kolónach bol izolovaný PCR produkt pripravený na použitie pri transfekčných reakciách.

2. Produkcia a izolácia plazmidu

Produkcia pHIVART (MCR) plazmidu sa uskutočnila v E.coli. Plazmidová DNA bola izolovaná po kultivácii použitím Qiagen kolón cez noc, podľa návodu výrobcu. Výťažok izolovaného plazmidu sa stanovil spektrofotometrický A260/280 meraním (meranie optickej hustoty pri λ = 260 a 280 nm). Získalo sa asi 250 pg ultračistej plazmidovej DNA z 500 ml bakteriálnej kultúry. Identita izolovaného plazmidu sa potvrdila reštrikčnou analýzou. Následne bola izolovaná plazmidová DNA linearizovaná pomocou BstElI a opäť purifikovaná klasickou fenol/chloroformovou extrakciou.

3. Transfekcia buniek

MT4 bunky boli subkultivované pri hustote 250 000 buniek/ml pred transfekciou (exponenciálna fáza rastu). Bunky boli peletované a resuspendované vo fyziologickom roztoku s fosfátovým tlmivým roztokom (PBS) pri koncentrácii 3,1 10E6 buniek/ml. Dávka 0,8 ml (2,5 10E6 buniek/ml) bola použitá pri každej transfekcii. Transfekcia sa uskutočnila pomocou Bio-Rad Gene pulzoru použitím 0,4 cm elektródových kyviet. Bunky boli elektroporované v prítomnosti 10 pg linearizovaného pHIVART plazmidu a približne 5 pg RT PCR produktu pri 250 pF a 300 V, s následnou 30-minútovou inkubáciou pri laboratórnej teplote. Potom sa k suspenzii buniek pridalo 10 ml čerstvého kultivačného média a inkubácia sa uskutočnila pri 37 °C vo zvlhčenej atmosfére 5 % CO₂.

4. Kultivácia a sledovanie transfcrovaných buniek

Počas 7 až 10 dní po transfekcii boli bunky monitorované z hľadiska výskytu cytopatogénneho účinku (CPE). Ak chýbal, bunky boli subkultivované v rôznych fľašiach. Potom boli kultivované supematanty transferovaných buniek použité na vytvorenie zásobného materiálu rekombinantného vírusu a boli uchovávané v množstvách po 1,5 ml pri teplote -70 °C.

5. Analýza rekombinantného vírusu z vírusovej RNA pacienta

Po titrácii nových vírusov boli zásobné materiály použité v antivírusových experimentoch v prítomnosti sériových zriedení rôznych HIV inhibítorov. Titrc zozbieraných supematantov v sérii sa stanovili riediacou titráciou vírusu v MT4 bunkách .

Vírusy s vhodnými titrami boli použité v antivírusových experimentoch. Z tohto dôvodu sa 96-jamkové platne naplnili 100 μΐ kompletného kultivačného média. Potom boli zásobné roztoky pridané v objeme 25 μΙ do série duplikátových jamiek. HIV a falošne infikované vzorky buniek boli testované pre každé liečivo (alebo kombináciu liečiv). Exponenciálne rastúce MT4 bunky boli potom prenesené na mikrotitračné platne s hustotou 150 000 buniek/ml. Bunkové kultúry boli potom inkubované pri 37 °C vo zvlhčenej atmosfére 5 % CO₂. Päť dní po infikovaní sa spektrofotometricky pomocou MTT metódy hodnotila životaschopnosť falošne a HIV infikovaných buniek (Pauwels, R. et al., J. Virol. Meth. (1988), 20: 309 až 321), ako je uvedené v časti 6.

6. MTT test

Do každej jamky mikrotiračných platní sa pridalo 20 μ] roztoku MTT (7.5 mg/ml v PBS). Platne boli ďalej inkubované pri 37 ^CC 1 hodinu. Potom sa vybralo 150 μΐ média tak, aby sa neporušili zhluky MT4 buniek obsahujúce kryštály formazanu. Solubilizácia formazanových kryštálov sa dosiahla pridaním 100 μΐ 5 % Tritonu X-100 v okysliče nom izopropanole (5 ml koncentrovanej HCI na 1 rozpúšťadla).

Kompletné rozpustenie formazanových kryštálov sa dosiahlo potom, ako boli platne umiestnené do roztrepávača na 10 minút. Nakoniec sa odčítali adsorbancie pri dvoch vlnových dĺžkach (540 a 690 nm). Z týchto údajov o optickej hustote (OD) sa odvodili 50 % inhibičná koncentrácia (IC₅₀) a 50 % cytotoxická koncentrácia (CC₅₀).

Príklad 2

Konštrukcia pHIVARTBstEII-variantu s deléciou génu protcázy a reverznej transkriptázy HIV-1

Zopakoval sa postup opísaný v príklade 1, s výnimkou toho, že sekvencia uvedeného pol génu HIV bola tá, ktorá kóduje RT a proteázu, a vyrobeným konštruktom bol pGEMT3-APRT, ako je opísané. Ďalšie modifikácie vo vzťahu k postupu z príkladu 1 sú uvedené.

Na amplifikáciu vírusovej RNA sa reverzná transkripcia z RNA do DNA uskutočnila pomocou OUT3 primeru. Ale pre postup hniezdovej PCR sa použili printery, ako to znázorňuje obr. 3. Preto je zrejmé, že postup hniezdovej PCR používa ako vonkajšie primery RVP5 a OUT3 a ako vnútorné primery RVP5 a IN 3. Preto je takýto hniezdový postup v skutočnosti postupom polo-hniezdovej PCR .

Produkcia a izolácia pGEMT3-APRT

Konečný pGEMT3-APRT konštrukt je derivátom plazmidu pGEM9-Zf(-) (Promega).

V stručnosti, pGEMT3-APRT konštrukt je zostrojený zavedením požadovaného inzertového HIV-HXB2 (provírusového HIV-1 klonu s deletovanou proteázou a reverznou transkriptázou, vrátane pripojených humánnych sekvencií) do Xbal reštrikčného miesta vektora pGEM9-Zf(-). Provírusový genóm je deletovaný od Ahdl miesta v géne proteázy (obklopujúce aminokyselinu 9) po BstEII miesto pHIVARTBstEIl konštruktu (MRC depozičné označenie: ADB231). V spoji AProRT sú lokalizované Smal a BstEII delečné miesta, ktoré možno použiť pri linearizácii provirusového konštruktu pred transfekciou. Konštrukcia pGEMT3-APRT je schematicky znázornená na obr. 1 a 2. Výťažok pGEMT3-APRT bol asi 1 mg z 500 ml bakteriálnej kultúry.

Ako bolo uvedené, plazmidový pGEMT3-APRT bol uložený v Belgickej koordinovanej zbierke mikroorganizmov-bCCM LMBP- kolekcia z 8.11.1996, pod č. LMBP3590.

Neočakávalo sa, že zavedenie provírusového genómu do iného vektora (pGEM9-Zf(-) namiesto plB 120) by mohlo spôsobiť väčšie problémy. PIB 120, derivát pEMBL8(-) (podľa informácie poskytnutej Kodak Scientific Imaging Systems) a PGEM9-Zf(-) sú podobné vektory. Napriek tomu provirusový vektor plB120HIV môže byť nestabilný v recA+ E. coli hostiteľských bunkách (Maschera, B. et al., J, Virol. (1995), 69, 5431-5436. Preto by mala byť stabilita pGEMT3-APRT konštruktu verifikovaná po každej novej výrobe plazmidu.

HIV-HXB2 sekvencia

Oblasť záujmu v HIV-HXB2D sekvencii (nukleotidy 1800 až 4400) je prezentovaná na obr. 3 (schematicky) a na obr. 4 (kompletná sekvencia). Je označená tiež lokalizácia niekoľkých génov, reštrikčných miest, primerov a delécii (APro, ART, (AProRT).

Sekvencia HIV-1 (izolát HXB2, referenčný genóm, 9718bp) sa získala z Národného centra pre biotechnologické informácie (NCBI), Národnej lekárskej knižnice, Ná rodného ústavu zdravia cez ENTREZ dokumentačno-rešeršný systém. Názov génovej banky: H1VHXB2CG Prístupové číslo génovej banky: 03455 NCBI Sekv. ID číslo: 327742

Oblasti rekombinácie:

V kombinácii s Rt-PCR fragmentmi generovanými RVP5 a OUT3/IN3 printermi možno na transfekciu MT4 buniek použiť pGEMT3-APRT vektor, ako je to opísané v príklade 1, časť 3. Oblasť pre rekombináciu na 5'-konci AProRT obsahuje 188 nukleotidov. Oblasť pre rekombináciu na 3'-konci AProRT je podobná tej, ktorá bola opísaná predtým (Kellam, P. a Larder, B. A. (1994) a obsahujeBO nukleotidov.

Dĺžka týchto oblastí nie je pre rekombináciu dôležitá. Predchádzajúce dáta (Bandyopadhyay, P. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1984), 81, 3476 až 3480; Rubnity, J. a Subramani, S. (1984) ukazujú, že sa môže vyskytnúť 10-násobná redukcia rekombinačnej frekvencie, ak sa sekvenčná homológia zredukuje z 214 na 163 bázových párov. Ďalej, v elektroporovaných bunkách by sa mali objaviť dostatočné rekombinačné stupne, aby sa zabezpečilo, že generovaný vírusový fenotyp predstavuje spoľahlivý odraz kvázi-druhov prítomných u liečeného HlV-pozitívneho pacienta. Optimalizáciu rekombinantných stupňov možno v prvom rade dosiahnuť upravením podielu linearizovaného provírusového vektora proti RT-PCR fragmentu, ktorý je použitý na elektroporáciu cieľových buniek. Štandardný postup, s typickými konečnými výsledkami, bol opísaný Kellamom, P. a Larderom, B. A. (1994). V dôsledku toho sa rozhodlo o zvýšení začiatočného vstupu asi 2 pg PCR produktu (s 10 pg vektora) na 5 pg alebo viac. Výsledok sa premietol do rýchlejšieho prejavenia sa vírusového rastu (cytopatogénny účinok) v kultúre transferovaných buniek.

Ďalšou možnosťou optimalizácie rekombinančných krokov by bol návrh primerov vedúcich k dlhším rekombinačným sekvenciám.

Bez ohľadu na to, skutočný vstup pri transfekčnej reakcii vždy závisí od výťažku po PCR. Niektoré vzorky majú vysoký výťažok a výsledkom bude vyšší vstup amplifilovaného materiálu do transfekčnej reakcie (s lepšími výsledkami z hľadiska účinnosti rekombinácie). Ale napriek nižšej rekombinantnej účinnosti, možno transferovať aj vzorky s nízkym výťažkom a výsledkom bude životaschopný vírus, ktorý zodpovedajúco odráža vírusovú populáciu.

Príklad 3

Alternatívne primery pre RT-PCR ProRT sekvencie

Navrhli sa nové primery (A - D) podobné tým, ktoré sa použili v príklade 2 a výsledkom by mali byť dlhšie rekombinantné sekvencie na 5' a 3' koncoch ProRT oblasti. Navrhli sa dva primery tak na 5', ako aj na 3' konci zodpovedajúcej oblasti, kde sa môže uskutočniť hniezdová PCR. Ako naznačujú obr. 3 a 4, priame opakovanie vyskytujúce sa na 5'konci ProRT oblasti sa bralo do úvahy pri navrhovaní zodpovedajúcich primerov. Nové primery sú, ako je uvedené nasledovne:

APRTO-5: S'-GCCCCTAGGA-AAAAGGGCTG-TTGG(sekv.á3) B PRTI-5: S'-TGAAAGATTG-TACTGAGAGA-CAGG (sekv. č. 4) C PRTI-3:5'OATATTTCTC-ATGTTCATCT-TGGG (sekv. č. 5) D PRTO-3: S'-AGGTOGCAGG-TTAAAATCAC-TAGC (sekv. č. Q

Príklad 4

Konštrukcia alternatívneho AproRT vektora

Ako bolo uvedené, konštrukcia alternatívneho ProRT deletovaného vektora je dosiahnuteľná mutagenézou sprostredkovanou oligonukleotidmi. Ale je tiež možné rozšíriť ProRT deléciu zo súčasného 3’-konca na ďalšie K pni miesto RT génu (40 základných párov downstream). Ligácia Klenowovým fragmentom opracovaného Kpnl miesta s Klenowovým fragmentom opracovaným miestom BstEII obnoví počiatočnú BstEU rozpoznávanú sekvenciu. Sám osebe sa alternatívny vektor správa podobne ako pGMT3-APRT vektor opísaný v príklade 2, ale má mierne väčšiu RT deléciu.

Príklad 5

HIV infikovaný pacient dostával AZT od decembra 1989 až do nezaznamenaného dátumu neskôr a bol nastavený na kombinovú chemoterapiu AZT + 3TC (1 : 1) od februára 1994 do októbra 1995 a citlivosť jeho plazmy proti množstvu RT inhibítorov bola stanovená podľa už opísaného postupu v príklade 1. V uvedenom postupe bol použitý rekombinantný štandardný kmeň HIV recIIIB ako referenčný HIV vírus. Tabuľka 1 vyjadruje namerané IC₅₀ hodnoty (μΜ) a pomer uvedených hodnôt. Na obr. 5 je antivirogram.

Tabuľka 1

	Antí-HIV-1 aktivita ICmíbM)
liek	experiment 1	experiment 2	priemer (1)	recIIIB ref (2)	pomer (1)((2)
lovirid	0,1	0.12	0,11	0,05	2
tivirapin	0,019	0,08	0,019	0,01	1.5
AZT	0,001	0.002	0,002	0,004	0.4
3TC	31.6	100	65,8	0,56	118
d4T	0,07	0,49	0.06	0,12	0,5
ddl	2,0	0.8	1.4	2,83	0,5
ddC	0,2	0,2	0,2	0,38	0.5
AZT+3TC (1:1)	0.001	0,001	0,001	0.002	0,5

Z týchto dát možno určiť, že je nepravdepodobné, že monoterapia pomocou 3TC je pre pacienta užitočná. Kombinovaná terapia AZT + 3TC (súčasná terapia) sa zdá byť vhodnejšia.

Príklad 6

Neliečenému HIV infikovanému pacientovi sa izolovala plazma a citlivosť plazmy proti množstvu RT inhibítorov bola stanovená podľa už opísaného postupu v príklade

1. V uvedenom postupe bol použitý rekombinantný štandardný kmeň HIV recIIIB ako referenčný HIV vírus. Tabuľka 2 vyjadruje namerané IC₅₀ hodnoty (μΜ) a pomer uvedených hodnôt. Na obr. 6 jc antivirogram.

Tabuľka 2

	Anli-HIV-1 aktivita IC50 (μΜ)
Liek	experiment 1	experiment 2	priemer (1)	recIIIB ref (2)	pomer (1)/(2)
3TC	1.91	2.02	1.91	3,08	1
ddl	3,07	4,47	3,77	8,58	0,4
ddC	1,45	1.47	1.46	2,21	1
AZT	0,04	0,05	0,05	0,06	1
d4T	1.31	0,97	1.14	1,74	1
AZT*3TC (1--1)	0,05	0,04	0,05	0,02	3
DDC+D4T (1:1)	0.62	0,44	0,53	0,77	1
3TOd4T (1:1)	0,42	0,44	0,43	1.11	0,4

Z uvedených dát možno určiť, že pacient je infikovaný HIV kmeňmi veľmi podobnými štandardnému HIV. Nemožno vylúčiť ani jeden z liekových režimov, takže možno iniciovať chemoterapiu liečivom, ako je AZT, ktorý sa prejavuje pozitívnym účinkom.

Príklad 7

Neliečenému HIV infikovanému pacientovi sa izolovala plazma a citlivosť plazmy proti množstvu RT inhibítorov bola stanovená podľa už opísaného postupu v príklade 1. V uvedenom postupe bol použitý rekombinantný štandardný kmeň HIV recIIIB ako referenčný HIV vírus. Tabuľka 3 vyjadruje namerané IC₅₀ hodnoty (μΜ) a pomer uvedených hodnôt. Stĺpcový graf vyjadruje relatívnu zmenu liekovej citlivosti, ako ukazuje obr. 7A. Obr. 7B znázorňuje vytvorený antivirogram.

Tabuľka 3

	Anti-HIV-1 aktivita ICso (μΜ)
Liek	experiment 1	experiment 2	priemer (1)	recIIIB ref (2)	pomer (1)/(2)
AZT	0,052	0,050	0,051	0,023	2
3TC	2,173	NO	2,173	1,381	2
ddl	0,475	0,429	0,452	0.648	0,7
ddC	1,042	1.389	1,215	1,616	0,8
d4T	1,142	1,657	1,399	1,368	1
lovirid	0.035	0,025	0,030	0,024	1
tivirapin	0.042	0,049	0,046	0,021	2

Z týchto dát možno určiť, že pacient je infikovaný HIV kmeňmi veľmi podobnými štandardnému HIV. Nemožno vylúčiť ani jeden z liekových režimov, takže možno iniciovať chemoterapiu liečivom, ako je AZT, 3TC alebo iné, prejavujúce sa pozitívnym účinkom.

Príklad 8

HIV infikovanému pacientovi s terapeutickou anamnézou zahŕňajúcou AZT, 3TC a lovirid sa izolovala plazma a citlivosť plazmy proti množstvu RT inhibítorov bola stanovená podľa už opísaného postupu v príklade 1. V uvedenom postupe bol použitý rekombinantný štandardný kmeň HIV recIIIB ako referenčný HIV vírus. Tabuľka 4 vyjadruje namerané IC₅₀ hodnoty (μΜ) a pomer uvedených hodnôt. Stĺpcový graf vyjadruje relatívnu zmenu liekovej citlivosti, ako ukazuje obr. 8A. Obr. 8B znázorňuje vytvorený antivirogram.

Tabuľka 4

	Anti-HIV-1 aktivita IC_w(pM)
Liek	experiment 1	experiment 2	priemer (1)	recIIIB ref (2)	pomer (1)/(2)
AZT	18,264	22,251	20,257	0,084	241
3tc	>100.000	>100.000	>100.000	6,304	>16
ddl	26,861	15,435	21,148	1,586	13
ddC	9,290	8,506	8,898	1,931	5
d4T	7,500	7,097	7,298	5,465 ; 1
lovirid	>100,000	>100,000	>100.000	0,037	>2717
tivirapin	1,626	1,604	1,15	0,021	76

Z týchto dát možno usudzovať, že pacient je infikovaný HIV kmeňom preukazujúcim zníženú citlivosť proti väčšine nukleozidových a nenukleozidových antiretrovírusových liečiv. Terapiu možno začať D4T a DDC. Možno uvažovať o zahrnutí proteázových inhibítorov do terapie.

Príklad 9

HIV infikovanému pacientovi s terapeutickou anamnézou zahŕňajúcou mnohopočetné nukleozidové analógy RT inhibítorov sa odobrala plazma a citlivosť plazmy proti množstvu RT inhibítorov bola stanovená podľa už opísaného postupu v príklade 1. V uvedenom postupe bol použitý rekombinantný štandardný kmeň HIV recIIIB ako referenčný HIV vírus. Tabuľka 5 vyjadruje namerané IC₅₀ hodnoty (μΜ) a pomer uvedených hodnôt. Stĺpcový graf vyjadruje relatívnu zmenu liekovej citlivosti, ako ukazuje obr. 9A. Obr. 9B znázorňuje vytvorený antivirogram.

Tabuľka 5

	Anti-HIV-1 aktivita
Liek	experiment 1	experiment 2	priemer (1)	recIIIB ref (2)	pomer (1)/(2)
AZT	>100,000	NO	>100,000	0,291	>344
3TC	>100,000	>100,000	>100,000	16,870	>6

ddl	>100,000	>100,000	>100,000	4,757	>21
ddC	60,079	73,049	66.564	3,444	19
d4T	>100,000	>100.000	>100,000	12,030	>6
lovind	0,064	0.0S6	0,061	0,065	0,9
tivirapín	0,052	0.043	0.048	0,042	1

Z týchto dát možno usudzovať, že pacient je infikovaný HIV kmeňom preukazujúcim zníženú citlivosť proti všetkým nukleozidovým analógom antiretrovírusových liečiv. Nenukleozidové antiretrovírusové liečivá by nemali byť z terapie vylúčené. Tu tiež možno uvažovať o zahrnutí proteázových inhibitorov do terapie.

Príklad 10

Neliečenému HIV infikovanému pacientovi sa izolovala plazma a citlivosť plazmy proti množstvu RT inhibítorov a inhibitorov proteázy bola stanovená podľa postupu opísaného v príklade 1. Ako referenčný HIV vírus bol použitý štandardný rekombinantný kmeň HIV recIIIB. Tabuľka 6 vyjadruje namerané IC₅₍₎ hodnoty (μΜ) a pomer uvedených hodnôt. Stĺpcový graf vyjadruje relatívnu zmenu liekovej citlivosti, ako ukazuje obr. 10A. Obr. 10B znázorňuje vytvorený antivirogram.

Tabuľka 6

	Antl-HIV-1 aktivita IC» (μΜ)
IM	experiment 1	experiment 2	priemer (1;	recIIIB ref (2)	pomer (1)/(2)
AZT	0.019	0,019	0,019	0,041	0,5
3TC	1,525	1,718	1,622	4,608	0.4
saquinavir	0.003	0,003	0,003	0,006	0.4
ritonavir	0.022	0,017	0.019	0,033	0,6
indinavir	0.013	0,013	0,013	0,016	0,8

Príklad 11

HIV infikovanému pacientovi s terapeutickou anamnézou zahŕňajúcou RT inhibitory a proteázové inhibitory sa izolovala plazma a citlivosť plazmy proti množstvu RT inhibítorov bola stanovená podľa už opísaného postupu v príklade 1. V uvedenom postupe bol použitý štandardný rekombinantný kmeň HIV reclllb ako referenčný HIV vírus. Tabuľka 7 vyjadruje namerané IC₅₀ hodnoty (μΜ) a pomer uvedených hodnôt. Stĺpcový graf vyjadruje relatívnu zmenu liekovej citlivosti, ako ukazuje obr. 11 A. Obr. 1 IB znázorňuje vytvorený antivirogram.

Tabuľka 7 ritonaviru. Podľa toho možno chemoterapiu upraviť takými liečivami, ako sú AZT alebo saquinavir, ktoré sa prejavujú pozitívnym účinkom.

Príklad 12

HIV infikovanému pacientovi s terapeutickou anamnézou zahŕňajúcou RT inhibitory a proteázové inhibitory sa izolovala plazma a citlivosť plazmy proti množstvu RT inhibítorov bola stanovená podľa už opísaného postupu v príklade 1. Tabuľka 8 vyjadruje namerané IC₅₀ hodnoty (μΜ) a pomer uvedených hodnôt. Stĺpcový graf vyjadruje relatívnu zmenu liekovej citlivosti, ako ukazuje obr. 12A. Obr. 12B znázorňuje vytvorený antivirogram.

Tabuľka 8

	Anti-HIV-1 aktivita ICeo(pM)
Liek	experiment 1	experiment 2	priemer (1)	recIIIB ref (2)	pomer(iy(2)
AZT	3,833	3,355	3,594	0,041	88
3TC	>100,000	>100,000	>100,000	4,606	22
saquinavir	0,350	0,352	0,351	0,006	56
ritonavir	1,610	1,530	1,570	0,033	47
indinavir	0,124	ND	0,124	0,016	8

Z týchto dát možno usudzovať, že pacient je infikovaný HIV kmeňom preukazujúcim zníženú citlivosť proti RT-inhibítorom 3TC a AZT a proteázovým inhibitorom indinaviru, ritonaviru a saquinaviru.

Príklad 13

Porovnanie fenotypizácie vo vzťahu ku genotypizácii

Vzorky plazmy boli získané od HlV-infikovaných jednotlivcov, ktorí dostávali dlhodobú monoterapiu nenukleozidovým RT inhibitorom (NNRTI). Extrahovala sa HIV-RNA, bola reverzne transkribovaná a amplifikovaná, ako je opísané v príklade 1. Vychádzajúc z PCR materiálu pozitívnych vzoriek sa prvých 785 nukleotidov RT génu amplifíkovalo a tento materiál bol použitý ďalej pre genotypizáciu.

V stručnosti, 785 nukleotidový fragment bol podrobený cyklickým sekvenčným reakciám použitím ThermoSequenase (ThermoSequenase je ochranná známka) súpravy cyklického sekvenovania s fluorescenčné značeným primerom so 7-deáza-dGTP od Amersham (cat #RPN2438). Pre každú vzorku boli použité 4 sekvenčné primery, vybrané tak, aby dovoľovali stanovenie sekvencií v oboch smeroch od nukleotidu 27 po nukleotid 681 RT génu. Reakcie sa analyzovali na ALF (ALF je ochranná známka) automatickom sekvenovači (Pharmacia). Generované sekvencie boli exportované do Power Macintosh a boli ďalej analyzované pomocou GeneWorks 2,5 softvéru (Oxford Molecular Group Inc.). Výsledné sekvencie aminokyselín boli porovnané so zodpovedajúcou sekvenciou laboratórneho HIV-lklonu HXB2D a v pacientovom materiáli sa identifikovali mutácie súvisiace s rezistenciou. Výsledky sú znázornené v tabuľke 9, kde je použitý jednopísmenový kód aminokyseliny.

	Anti-HIV-1 aktivita IC» (μΜ)
Liek	experiment 1	experiment 2	priemer (1)	recIIIB ref (2)	pomer (1)/(2)
AZT	ND	0,015	0,015	0,047	0.3
3TC	>100,000	93,962	96,981	5,178	19
saquinavir	0.014	0,015	0,014	0,012	1
ritenaw	1,198	1,739	1,468	0.062	24
indinavir	0,229	0,416	0,323	0,027	12

Z týchto dát možno usudzovať, že pacient je infikovaný HIV kmeňom preukazujúcim zníženú citlivosť proti RT-inhibítoru 3TC a proteázovým inhibitorom indinaviru a

Tabuľka 9

P					Mutácie spojené s rezistenciou				Násobok rezistencie oproti
	M 41	D 67	K 70	A 98	K 101	K 103	V 108	E 138	Y 181	M 184	G 190	T 215	R 219	AZT	3TC	NNRTI	NNRTI 2
1						N								¹	1	56	437
2						S								1	0.4	102	53
3						N								0.4	1	36	87
4														0.3	0.1	1	0,4
5															0,4	4	3
6						N								1	0,3	103	245
7						S								1	0.04	112	57
8						N								1	1	30	31
9									C					2	1	>1432	12
10						N								0.4	0.1	53	172
11	L	N	R			N				V		F	Q	94	>8	321	569
12	L											V		28	2	1	3
13					fc	WN		A			GiA		ND	1	1	>1466	455
14						N								1	1	93	349
15						N								2	1	>2424	449
16						N				V					>8	21	115
17						N								¹	1	29	102
18						S								¹	1	95	181
19						N								¹	1	78	260
20				G										0.4	1	22	25
21						N								¹	0.4	47	68
22							i							1	0,4	3	3
23						N								0,2	0.2	9	9
24					Q									1	1	7	59

P’pacient

V hornom riadku tabuľky 9 sú uvedené aminokyseliny (AA), ktoré boli nájdené v štandardnej sekvencii, a ich poloha, Zmeny aminokyselín v týchto polohách sú pre každého pacienta vyjadrené v nasledujúcich riadkoch. Sú uvedené iba tie pozície, kde sa v materiáli od pacienta zistili zmeny. Pravá časť tabuľky predstavuje násobok rezistencie proti rozličným RT inhibítorom, ako bolo určené spôsobom podľa vynálezu pre každú vzorku od pacienta. NNRTI1 je nenukleozidový RT inhibítor, ktorý bol podávaný pacientom. NNRTI2je ďalším nenukleozidovým RT inhibítorom, pri ktorom sa do istej miery zistila skrížená rezistencia s prvým inhibítorom.

Výsledky genotypizácie vo vzťahu k rezistencii proti nukleozidovým analógovým RT inhibítorom sú, ako je uvedené ďalej:

- M41L, D67N, K70R, T215F/Y a K219Q/E sú mutácie asociované s AZT rezistenciou (Larder, B. a Kemp, S. (1989), Science, 246, 1155 - 1158; Kellam, P. et al. (1992), PNAS 89, 1934 až 1938). Ich prítomnosť, individuálne alebo v rôznych kombináciách, v genóme Hl V izolovaného z materiálu od pacienta koreluje s fenotypovou rezistenciou, ako to vyjadruje vytvorený Antivirogram (pacienti 11 a 12).

- To isté sa týka rezistencie proti 3TC asociovanej s M184V mutáciou (Tisdale, M. et al. (1993) PNAS 90, 5653 - 5656), ktorá bola zaznamenaná iba u pacientov, ktorí majú fenotypovú rezistenciu proti liečivu (pacienti 11 a 16).

Výsledky genotypizácie týkajúce sa rezistencie proti NNRT1 sú nasledovné:

Traja pacienti (3,4 a 12) nemajú žiadnu mutáciu súvisiacu s NNRT1 rezistenciou a sú na liečivo fenotypovo senzitívni.

Väčšina pacientov, ktorí majú fenotypovú rezistenciu proti NNRTI majú mutáciu súvisiacu s rezistenciou proti NNRTI 1 v pozícii 103 (K103N/S).

Jeden pacient (9) má mutáciu súvisiacu s rezistenciou proti Y181C NNRTI 1 a má veľkú fenotypovú rezistenciu (>1432 násobnú) proti NNRTI 1.

Pacient 13 má niekoľko mutácii súvisiacich s rezistenciou proti NNRTI (K 101 E, K103N čiastočne a G190A čiastočne). Tento pacient tiež má veľkú fenotypovú rezistenciu (>1466 násobnú) proti NNRTI1. Mutácia

E138A zistená v tejto vzorke nesúvisí až tak s rezistenciou. Ale ďalšia mutácia v tej istej pozícii, t. j. E138K, sa prejavila, takže zohráva dôležitú úlohu pri rezistencii proti TSAO zlúčeninám (Balzarini, J. et al. (1993) PNAS 90, 6952 až 9656). Úlohu mutácie E138A je ešte potrebné zistiť.

Pacient 20 má mutáciu súvisiacu s rezistenciou proti A98G NNRTI a má fenotypovú rezistenciu proti testovaným NNRTI.

Pacient 22 má mutáciu súvisiacu s rezistenciou proti V 1081 NNRTI, ale nemá fenotypovú rezistenciu proti testovaným NNRTI.

Pacient 24 nemá žiadnu mutáciu súvisiacu s rezistenciou proti NNRTI (mutácia K101Q sa zistila v niekoľkých genómoch štandardného HIV), ale fenotypovo je rezistentný proti testovaným NNRTI.

ZOZNAM SEKVENCII (1) Všeobecné informácie (i) Žiadateľ:

(A) meno: Virco, N.V.

(B) ulica: Drie Eikenstraat 661 (C) mesto: Edegem (E) štát: Belgicko (F) poštový kód (ZIP): B-2650 (A) meno: De Bethune, Marie-Pierre (B) ulica: Tweeleeuwenstraat 15 (C) mesto: Everburg (E) štát: Belgicko (F) poštový kód (ZIP): B-3078 (A) meno: Hertogs, Kurt (B) ulica: Sint Vincentiusstraat (C) mesto: Antwerpen (E) štát: Belgicko (F) poštový kód (ZIP): B-2018 (A) meno: Pauwels, Rudi (B) ulica: Damstraat 166 (C) mesto: Weerde (E) štát: Belgicko (F) poštový kód (ZIP): B-1982 (ii) Názov vynálezu: ln vitro spôsob určenia HIV chemoterapie HIV pozitívnych pacientov (iii) Počet sekvencii; 6 (iv) Počítačovo čitateľný čas:

(a) typ média: floppy disk (b) počítač: IBM PC kompatibilný (c) operačný systém: PC-DOS/MS DOS (d) software: Patentln Release #1.0, verzia #1.30 (EPO) (vi)Predchádzajúce údaje žiadosti:

(a) číslo žiadosti: EP 96200175.6 (b) dátum registrácie: 26. I. 1996 (2) Informácie o sekvencii č. I:

(í) vlastnosti sekvencie (a) dĺžka: 33 bázových párov (b) typ: Nukleová kyselina (c) počet reťazcov: jeden (d) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: nie (vi) Pôvodný zdroj:

A. Organizmus: vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti typu 1 (xi)opis sekvencie: sekv. č.: 1

CATTGCTCTC CAATTACTGT GATATTTCTC ATG 33 (3) Informácie o sekvencií č. 2:

(i) vlastnosti sekvencie (a) dĺžka: 26 bázových párov (b) typ: Nukleová kyselina (c) počet reťazcov: jeden (d) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: nie (vi) Pôvodný zdroj:

A. Organizmus: vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti typu 1 (xi)opis sekvencie: sekv. č.: 2

GGGAAGATCT GGCCTTCCTA CAAGGG 26 (2) Informácie o sekvencií č. 3:

(i) vlastnosti sekvencie (a) dĺžka: 24 bázových párov (b) typ: Nukleová kyselina (c) počet reťazcov: jeden (d) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: nie (vi)Pôvodný zdroj:

A. Organizmus: vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti typu 1 (xi)opis sekvencie: sekv. č.: 3

GCCCCTAGGA AAAAGGGCTC TTGG 24 (2) Informácie o sekvencií č. 4:

(i) vlastnosti sekvencie (a) dĺžka: 24 bázových párov (b) typ: Nukleová kyselina (c) počet reťazcov: jeden (d) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: nie (vi) Pôvodný zdroj:

A. Organizmus: vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti typu 1 (xi)opis sekvencie: sekv. č.: 4

TGAAAGATTG TACTGAGAGA CAGG 24 (2) Informácie o sekvencií č. 5:

A. Organizmus: vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti typu 1 (xi)opis sekvencie: sekv. č.: 5

GATATTTCTC ATGTTCATCT TGGG 24 (2) Informácie o sekvencií č. 6:

(i) vlastnosti sekvencie (a) dĺžka: 24 bázových párov (b) typ: Nukleová kyselina (c) počet reťazcov:jeden (d) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii)Hypotetická: nie (vi)Pôvodný zdroj:

A. Organizmus: vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti typu 1 (xi) opis sekvencie: sekv. č.: 6 AGGTGGCAGG TTAAAATCAC TAGC 24

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. In vitro spôsob určenia HIV chemoterapie HIV pozitívnych pacientov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa transfekciu bunkovej línie citlivej proti HIV infekcii so sekvenciou z pol génu HIV, získanou izoláciou vírusovej RNA zo vzorky biologického materiálu od pacienta a reverznou transkripciou požadovanej oblasti pol génu, a HIV-DNA konštruktom, z ktorého bola uvedená sekvencia deletovaná, kultiváciu týchto transfekovaných buniek na vytvorenie zásoby chimérových vírusov, stanovenie fenotypovej citlivosti týchto chimérových vírusov proti inhibítoru uvedeného enzýmu kódovaného pol génom HIV a priradenie určitej hodnoty tejto fenotypovej citlivosti, vytvorenie súboru dát obsahujúceho uvedenú hodnotu pre citlivosť chimérového vírusu a zodpovedajúcu hodnotu pre chimérový štandardný kmeň HIV, zopakovanie stanovenia citlivosti pre najmenej dva ďalšie inhibítory a zostrojenie celkovo najmenej troch takýchto súborov dát, zobrazujúc uvedené súbory dát v dvojrozmernej alebo trojrozmernej grafickej forme tak, že rozdiel medzi chimérovou a štandardnou citlivosťou v prípade každého súboru dát poskytuje vizuálnu mieru rezistencie chimérovej zásoby proti liečbe daným inhibítorom, a výber optimálneho inhibítora (inhibítorov) na základe grafického znázornenia takto meraných rezistencií.
2. Spôsob určenia HIV chemoterapie podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že súbory dát sú prezentované na mnohouholníkovom alebo kvázi kruhovom grafe, ktorý obsahuje: (a) množstvo normalizovaných osí vybiehajúcich radiálne od počiatku, pričom každá os zodpovedá jednému súboru dát alebo jeho inhibítoru, alebo ich kombinácii; (b) osi normalizované tak, že hodnoty citlivosti pre štandardný HIV pre rôzne inhibítory sú rovnaké na každej osi, pričom dátové body pre štandardný HIV sú voliteľne znázornené a spojené, aby vytvárali pravidelný mnohouholník, ktorého vrcholy ležia na osiach a ktorého stred je definovaný počiatkom; (c) na každej osi sa dátový bod predstavujúci hodnotu citlivosti chimerickej zásoby HIV vynesie do grafu oproti inhibítoru zodpovedajúcemu uvedenej osi, pričom chimérové dátové body sú voliteľne spojené, aby tvorili pravidelný alebo nepravidelný mnohouholník, ktorého tvar predstavuje rezistenciu chimérovej zásoby proti určitému rozsahu inhibítorov.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa t ý m , že každá os má logaritmickú stupnicu.
4. Spôsob podľa nároku 2 alebo 3, vyznačujúci sa t ý m , že excentrické dátové body v chimérovom mnohouholníku, ak sú prítomné, identifikujú inhibítory, ktoré môžu byť považované za málo užitočné alebo neužitočné pre pacienta, kým body dát ležiace v, na alebo mimo v blízkosti štandardného mnohouholníka identifikujú inhibítory, ktorých použitie u pacienta možno považovať za opodstatnené z hľadiska pozitívneho účinku na pacienta.
5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že každý z troch alebo viacerých dátových súborov obsahuje hodnotu merateľnej rezistencie proti danému inhibítoru pre najhorší prípad, pričom tieto hodnoty pre najhorší prípad sú na uve dených grafických zobrazeniach zobrazené tak, že dátový bod pre chimému zásobu môže byť porovnávaný aj so štandardným HIV, aj s najhorším HIV prípadom, čo poskytuje stanovenie relatívnej hodnoty inhibítora v konkrétnom prípade.
6. Spôsob určenia HIV chemoterapie HIV pozitívnych pacientov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa: (a) periodické stanovovanie fenotypovej citlivosti HIV kmeňov pacienta podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5; vydanie inštrukcie na (b) chemoterapiu s vybraným inhibítorom, pokiaľ pacientove HIV kmene ostávajú citlivé proti vybranej chemoterapii; a (c) výber iného inhibítora, ak je citlivosť pôvodného inhibítora znížená.
7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov I až 6, vyznačujúci sa t ý m, že fenotypová citlivosť uvedených chimérových vírusov proti inhibitorom najmenej dvoch enzýmov kódovaných pol génom HIV sa stanovuje súčasne.
8. In vitro spôsob určenia fenotypovej liekovej citlivosti jednotlivých HIV kmeňov u pacienta proti inhibítorom aspoň dvoch enzýmov kódovaných pol génom HIV, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa transfekciu bunkovej línie citlivej na infikovanie HIV so sekvenciou z pol génu HIV, získanou izoláciou vírusovej RNA zo vzorky biologického materiálu od pacienta a reverzným transkribovaním požadovanej oblasti uvedeného pol génu, a s H1V-DNA konštruktom, z ktorého bola uvedená sekvencia dcletovaná, kultiváciu uvedených transferovaných buniek na vytvorenie zásoby chimérových vírusov a stanovenie fenotypovej citlivosti uvedených chimérových vírusov proti inhibitorom uvedených enzýmov kódovaných pol génom HIV.
9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že biologickým materiálom je plazma, sérum alebo bezbunková telesná tekutina, vybraná zo seminálnej alebo vaginálnej tekutiny.
10. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že biologickým materiálom je celková krv, ku ktorej sa pridal RNA stabilizátor.
11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že biologickým materiálom je tkanivo vybrané z mozgového tkaniva alebo tkaniva lymfatických uzlín.
12. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až II, vyznačujúci sa tým, že najmenej dva enzýmy sú vybrané z HIV RT, proteázy a integrázy.
13. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa tým, že bunkovou líniou citlivou proti infekcii HIV je CD4+ T-bunková línia.
14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m , že CD4+ T- bunkovou líniou je MT4 bunková línia alebo HeLa CD4+ bunková línia.
15. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov I až 14, vyznačujúci sa tým, že požadovaná oblasť pol génu pacienta je reverzne transkribovaná použitím špecifického downstream primera.
16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa t ý m , že sekvenciou, ktorá má byť reverzne transkribovaná, je sekvencia, ktorá kóduje reverznú transkriptázu a proteázu.
17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa t ý m , že downstream primerom je OUT3: 5'CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG.3'(sekv. č. : 1).
18. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 17, vyznačujúci sa tým, že produkt reverznej transkripcie je amplifikovaný použitím hniezdovej PCR technológie.
19. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 18, vyznačujúci sa tým, že HIV DNA konštruktom je konštrukt, z ktorého sú RT a proteázový gén deletované, a je ním plazmid pGEMT3-APRT, ako bol uložený v Belgických koordinovaných zbierkach mikroorganizmov-BCCM LMBP- Kolekcii, 8. novembra 1996 pod číslom LMBP3590.
20. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 19, vyznačujúci sa tým, že transfekcia sa dosiahne elektroporáciou.
21. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 19, vyznačujúci sa t ý m , že transfekcia sa dosiahne použitím katiónových lipidov.
22. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 21, vyznačujúci sa tým, že fenotypová lieková citlivosť chimérových vírusov proti rôznym inhibitorom RT, proteázy a integrázy sa stanovuje pomocou automatizovaného bunkového testu.
23. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 22, vyznačujúci sa tým, že fenotypová lieková citlivosť chimérových vírusov a štandardného kmeňa HIV proti rôznym inhibitorom RT, proteázy a integrázy je vyjadrená ako inhibičná koncentrácia (IC hodnota).
24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov I až 23, vyznačujúci sa tým, že RT inhibítory sú vybrané z nukleozidových RT inhibítorov, ako sú AZT, ddl, ddC, 3TC, d4T, nenukleozidových RT inhibítorov, ako je lovirid, nevirapin a tivirapin, inhibítorov proteázy, ako je saquinavir, indiravir a ritonavir a inhibítorov integrázy, ako je fenyletylester kyseliny kávovej (CÁPE).