CN107085093B - 重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法 - Google Patents

重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法 Download PDF

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    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry

Abstract

本发明公开了重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，它包括以下步骤：①、制备标准品溶液；②、制备供试品溶液；③、测定吸光度，记录测定结果，试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，计算供试品的生物学活性。本发明提供的重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，操作简便，容易观察，且具有良好的线性关系，重复性好，特异性强，为监控其产品质量提供了一种行之有效的技术手段。

Description

重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测 方法
技术领域
本发明属于生物药物活性的检测领域，具体涉及重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法。
背景技术
IL-1ra能与IL-1在T淋巴细胞上的受体竞争性结合，从而抑制IL-1的生物学活性，根据这一原理建立了IL-1ra生物学活性的多种检测方法：IL-1ra抑制IL-1诱导的小鼠胸腺细胞增生实验；IL-1ra抑制IL-1诱导的人皮成纤维细胞分泌PGE2实验及抑制其他T淋巴细胞株如D10AG4.1和D10(N4)增殖的实验。
但以上方法存在有很多不足之处，如PGE2的检测步骤较多；小鼠胸腺细胞法由于活体个体差异，使结果很不稳定；其他T淋巴细胞除对IL-1有增殖作用外，对其他细胞因子同样有作用，特异性较差。
发明内容
本发明的目的在于提供重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，具有良好的线性关系，重复性好，特异性强，为监控其产品质量提供了一种行之有效的技术手段。
本发明提供的重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，它包括以下步骤：
①、制备标准品溶液；
②、制备供试品溶液；
③、在加有标准品溶液和供试品溶液的培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时～108小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝溶液，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液，吹打以充分溶解还原物；
所述裂解液是由以下方法制成：取1ml盐酸、5ml Triton X-100，加异丙醇，配制成100ml的溶液；
将培养板放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果；试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：
式中，
Pr为标准品的生物学活性，U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效量的稀释倍数。
进一步的，步骤①中，所述标准品溶液是由以下方法制成：将rhIL-1ra标准品10μg用1.25ml水溶解，然后用培养液B2稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B2是培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液。
进一步的，所述rhIL-1ra标准品的比活性为1U/mg；所述rhIL-1β的比活性≥1×107U/mg。
进一步的，步骤②中，所述供试品溶液是由以下方法制成：取rhIL-1ra滴眼液，加培养液B2，至rhIL-1ra浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B2是培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液。
进一步的，所述rhIL-1ra滴眼液是由以下方法制成：rhIL-1ra 50mg、人血白蛋白1g、甘露醇60g、氯化钠70g、氯化钾2g、磷酸氢二钠14.4g、磷酸二氢钾2.4g，加水，配制成1000ml的溶液。
进一步的，步骤③中，所述A375-s2细胞悬液的细胞浓度为6×104个/ml～7×104个/ml；优选的，所述A375-s2细胞悬液的细胞浓度为7×104个/ml。
进一步的，所述A375-s2细胞悬液是由以下方法制成：取对数生长期的A375-s2细胞，胰蛋白酶消化计数后，用培养液A调细胞浓度为6×104个/ml～7×104个/ml；所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液。
进一步的，步骤③中，所述噻唑蓝溶液是由以下方法制成：取噻唑蓝0.1g，加PBS溶解并稀释至20ml，经0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
进一步的，所述PBS是由以下方法制成：取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌，即得。
进一步的，步骤③中，所述的盐酸含HCl为36％～38％。
本发明提供的重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，操作简便，容易观察，且具有良好的线性关系，重复性好，特异性强，为监控其产品质量提供了一种行之有效的技术手段。
关于本发明使用的术语的定义：除非另有说明，本文中术语提供的初始定义，适用于全文的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应当根据公开内容、上下文以及本领域的常识，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
例如：3倍系列稀释，即在96孔培养板中每孔预先加入100μl培养液，取50μl标准品溶液或供试品溶液加入其中，成为1:3稀释度，充分混合后，吸取50μl加入下一孔100μl培养液中，成为1:9稀释度，如此系列稀释若干孔至适宜稀释度(参见：《中华人民共和国药典》三部.国家药典委员会编.中国医药科技出版社.)。
噻唑蓝(MTT)法的基本原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝色结晶物(Formazan)，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能；并且，Formazan的产量与线粒体的数量和细胞活跃程度呈线性关系，用裂解液溶解结晶物后可用酶标仪测定其光吸收值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明实施例1的生物学活性测定曲线。
图2为本发明实施例1的线性拟合。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
材料：
A375-s2细胞(人黑色素瘤细胞：购于ATCC，CRL-1872)；
rhIL-1β(重组人白细胞介素-1β：比活性≥1×107U/mg，R&D生产)；
rhIL-1ra标准品(1U/mg，NIBSC)；
培养液A：含10％新生牛血清(NBS)的DMEM培养液；
培养液B1：培养液A加入rhIL-1β至0.5ng/ml；
培养液B2：培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml；
培养液B3：培养液A加入rhIL-1β至4ng/ml；
PBS：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌；
噻唑蓝(MTT)溶液：5mg/ml，配制方法如下：称取噻唑蓝(MTT)0.1g，加PBS溶解并稀释至20ml，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存；
Triton X-100：液体，Sigma-Aldrich公司；
盐酸：含HCl为36％～38％(参见：《中华人民共和国药典》三部.国家药典委员会编.中国医药科技出版社.)。
重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)滴眼液的制备
配方：rhIL-1ra(通过购买市售产品获得，或者，按照现有的方法制备获得)50mg、人血白蛋白1g、甘露醇60g、氯化钠70g、氯化钾2g、磷酸氢二钠14.4g、磷酸二氢钾2.4g，加水，配制成1000ml的溶液，即得rhIL-1ra滴眼液。
实施例1
标准品溶液的制备：将rhIL-1ra标准品(1U/mg，NIBSC)10μg用1.25ml水溶解，分装冻存，使用前用培养液B2稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备：取上述制备的rhIL-1ra滴眼液，加培养液B2，至rhIL-1ra浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做3孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
测定法：
在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液(取对数生长期的A375-s2细胞，胰蛋白酶消化计数后，用培养液A调细胞浓度为7×104个/ml)100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml)，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液(取1ml盐酸、5ml Triton X-100，加异丙醇，配制成100ml的溶液，室温避光保存)，吹打以充分溶解还原物(Formazan)。以上操作在无菌条件下进行。
将培养板放入酶标仪(550型，Bio-Rad)，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：
式中，
Pr为标准品的生物学活性，U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效量的稀释倍数。
实施例2
标准品溶液的制备：将rhIL-1ra标准品(1U/mg，NIBSC)10μg用1.25ml水溶解，分装冻存，使用前用培养液B2稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备：取上述制备的rhIL-1ra滴眼液，加培养液B2，至rhIL-1ra浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
测定法：
在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液(取对数生长期的A375-s2细胞，胰蛋白酶消化计数后，用培养液A调细胞浓度为6×104个/ml)100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养102小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml)，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液(取1ml盐酸、5ml Triton X-100，加异丙醇，配制成100ml的溶液，室温避光保存)，吹打以充分溶解还原物(formazan)。以上操作在无菌条件下进行。
将培养板放入酶标仪(550型，Bio-Rad)，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：
式中，
Pr为标准品的生物学活性，U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效量的稀释倍数。
对比例1
标准品溶液的制备：将rhIL-1ra标准品(1U/mg，NIBSC)10μg用1.25ml水溶解，分装冻存，使用前用培养液B1稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备：取上述制备的rhIL-1ra滴眼液，加培养液B1，至rhIL-1ra浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做3孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
测定法：
在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液(取对数生长期的A375-s2细胞，胰蛋白酶消化计数后，用培养液A调细胞浓度为4×104个/ml)100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml)，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液(DMSO，二甲基亚砜)，吹打以充分溶解还原物(formazan)。以上操作在无菌条件下进行。
将培养板放入酶标仪(550型，Bio-Rad)，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：
式中，
Pr为标准品的生物学活性，U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效量的稀释倍数。
对比例2
标准品溶液的制备：将rhIL-1ra标准品(1U/mg，NIBSC)10μg用1.25ml水溶解，分装冻存，使用前用培养液B2稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备：取上述制备的rhIL-1ra滴眼液，加培养液B2，至rhIL-1ra浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做3孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
测定法：
在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液(取对数生长期的A375-s2细胞，胰蛋白酶消化计数后，用培养液A调细胞浓度为2×104个/ml)100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养102小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml)，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液(15％十二烷基硫酸钠溶液)，吹打以充分溶解还原物(formazan)。以上操作在无菌条件下进行。
将培养板放入酶标仪(550型，Bio-Rad)，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：
式中，
Pr为标准品的生物学活性，U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效量的稀释倍数。
对比例3
标准品溶液的制备：将rhIL-1ra标准品(1U/mg，NIBSC)10μg用1.25ml水溶解，分装冻存，使用前用培养液B2稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备：取上述制备的rhIL-1ra滴眼液，加培养液B2，至rhIL-1ra浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
测定法：
在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液(取对数生长期的A375-s2细胞，胰蛋白酶消化计数后，用培养液A调细胞浓度为4×104个/ml)100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml)，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液(10％十二烷基硫酸钠溶液，盐酸调节pH至4～5)，吹打以充分溶解还原物(formazan)。以上操作在无菌条件下进行。
将培养板放入酶标仪(550型，Bio-Rad)，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：
式中，
Pr为标准品的生物学活性，U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效量的稀释倍数。
对比例4
标准品溶液的制备：将rhIL-1ra标准品(1U/mg，NIBSC)10μg用1.25ml水溶解，分装冻存，使用前用培养液B3稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备：取上述制备的rhIL-1ra滴眼液，加培养液B3，至rhIL-1ra浓度为800ng/ml，在96孔培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做3孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
测定法：
在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液(取对数生长期的A375-s2细胞，胰蛋白酶消化计数后，用培养液A调细胞浓度为2×104个/ml)100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml)，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液(取2.8ml盐酸、10ml Triton X-100，加异丙醇，配制成100ml的溶液，室温避光保存)，吹打以充分溶解还原物(formazan)。以上操作在无菌条件下进行。
将培养板放入酶标仪(550型，Bio-Rad)，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：
式中，
Pr为标准品的生物学活性，U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效量的稀释倍数。
1、检测方法的线性关系
试验结果表明，对比例1～4检测方法的线性关系较差，其线性相关系数R2分别为0.954、0.945、0.952、0.968；并且，对比例1检测方法的本底数字较大，而对比例2～3检测方法会产生很多的泡沫，给操作和观察带来很大的困难和不便，对比例4检测方法的测定数值波动较大，都会影响检测结果的重复性以及准确性。
本发明实施例1检测方法的线性关系好，线性方程：y＝-0.043x+0.480，R2＝0.998(X轴为蛋白浓度，Y轴为OD值)，见图1和图2；而且，本发明实施例1检测方法的本底数字小，也不会产生较多泡沫，便于操作和观察，测定数值的波动很小，检测结果的重复性和准确性好。
同样，本发明实施例2检测方法的线性关系也很好，R2＝0.992。
2、检测方法的重复性
分别采用实施例1～2、对比例1～4的检测方法，对同一rhIL-1ra滴眼液样品分别进行6次重复试验，所得检测结果的RSD％，见表1。
表1、检测方法的重复性结果
供试品的生物学活性均值(6次) 重复性(RSD％)
实施例1 50.84×10<sup>-3</sup> 2.25
实施例2 49.95×10<sup>-3</sup> 2.32
对比例1 45.58×10<sup>-3</sup> 16.35
对比例2 62.36×10<sup>-3</sup> 12.45
对比例3 58.47×10<sup>-3</sup> 10.64
对比例4 57.29×10<sup>-3</sup> 9.86
上述结果表明，本发明检测方法稳定，重复性好，RSD％在3％以内，能够用于重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的测定，从而可以更好地监控其产品质量的稳定性。
此外，本发明检测方法的特异性强，不受IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、M-CSF等其它细胞因子的影响，也不受有丝分裂原PWM、LPS、ConA、PGE2等影响，检测方法简便、稳定，非常适合用于重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的测定。
综上所述，本发明提供了一种重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，操作简便，容易观察，且具有良好的线性关系，重复性好，特异性强，为监控其产品质量提供了一种行之有效的技术手段。

Claims (5)

1.重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：
①、制备标准品溶液；
所述标准品溶液制备方法为：将rhIL-1ra标准品10μg用1.25ml水溶解，然后用培养液B2稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B2是培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液；所述rhIL-1ra标准品的比活性为1U/mg；所述rhIL-1β的比活性≥1×107U/mg；
②、制备供试品溶液；
所述供试品溶液是由以下方法制成：取rhIL-1ra滴眼液，加培养液B2，至rhIL-1ra浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B2是培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液；
所述rhIL-1ra滴眼液是由以下方法制成：rhIL-1ra50mg、人血白蛋白1g、甘露醇60g、氯化钠70g、氯化钾2g、磷酸氢二钠14.4g、磷酸二氢钾2.4g，加水，配制成1000ml的溶液；
③、在加有标准品溶液和供试品溶液的培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时～108小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝溶液，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液，吹打以充分溶解还原物；所述A375-s2细胞悬液的细胞浓度为6×104个/ml～7×104个/ml；
所述裂解液是由以下方法制成：取1ml盐酸、5ml Triton X-100，加异丙醇，配制成100ml的溶液；所述的盐酸含HCl为36％～38％；
将培养板放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果；试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：
式中，
Pr为标准品的生物学活性，U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效量的稀释倍数。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述A375-s2细胞悬液的细胞浓度为7×104个/ml。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述A375-s2细胞悬液是由以下方法制成：取对数生长期的A375-s2细胞，胰蛋白酶消化计数后，用培养液A调细胞浓度为7×104个/ml；所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的检测方法，其特征在于：步骤③中，所述噻唑蓝溶液是由以下方法制成：取噻唑蓝0.1g，加PBS溶解并稀释至20ml，经0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述PBS是由以下方法制成：取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌，即得。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1209875A (zh) * 1996-01-26 1999-03-03 维科公司 根据人类hiv病毒株的表型药物敏感性控制hiv阳性病人化疗的方法
CN1471969A (zh) * 2002-07-29 2004-02-04 北京北医联合生物工程公司 重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的药物用途
CN1822849A (zh) * 2003-03-24 2006-08-23 塞阔伊亚药品公司 长效生物活性缀合物
CN1837237A (zh) * 2005-02-25 2006-09-27 四川恒星生物医药有限公司 一种低热原重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL－1ra)及其高效制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1209875A (zh) * 1996-01-26 1999-03-03 维科公司 根据人类hiv病毒株的表型药物敏感性控制hiv阳性病人化疗的方法
CN1471969A (zh) * 2002-07-29 2004-02-04 北京北医联合生物工程公司 重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的药物用途
CN1822849A (zh) * 2003-03-24 2006-08-23 塞阔伊亚药品公司 长效生物活性缀合物
CN1837237A (zh) * 2005-02-25 2006-09-27 四川恒星生物医药有限公司 一种低热原重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL－1ra)及其高效制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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融合人血清白蛋白的白介素1受体拮抗剂的药效学和药代动力学研究;黄毅;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20130715(第07期);摘要，正文第19页第2.4.3节，第23-25页第3.4节，第27页

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