CN1822849A - 长效生物活性缀合物 - Google Patents

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CN1822849A CN200480014055.2A CN200480014055A CN1822849A CN 1822849 A CN1822849 A CN 1822849A CN 200480014055 A CN200480014055 A CN 200480014055A CN 1822849 A CN1822849 A CN 1822849A
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Abstract

本发明提供能与比如清蛋白这样的大分子反应形成共价连接的复合物的生物活性化合物，其中所得的复合物在体内表现出所需生物活性。更确切地说，该复合物是包含共价结合于连接基团及蛋白的生物活性部分的分离的复合物。该复合物是通过将生物活性部分，例如肾素抑制剂或病毒融合抑制剂肽，与纯化的和分离蛋白缀合制得的。与未缀合分子相比，该复合物在血流中有更长寿命，并且与未缀合分子相比，其更长时间段地表现生物活性。本发明还提供作为病毒感染抑制剂和/或表现出抗融合特性的抗病毒化合物。尤其是，本发明提供对比如人免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的病毒具有抑制活性、并且对于治疗病毒感染具有更长作用时间的化合物。

Description

长效生物活性缀合物
本申请要求2003年11月10日提交的临时申请60/518892、2003年3月24日提交的临时申请60/456472和2003年3月25日提交的临时申请60/456952的优先权，各申请全文引入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及能用于与比如清蛋白这样的蛋白反应形成共价连接的复合物的生物活性化合物，其中所得的复合物在体内表现出所需的生物活性。更确切地说，该复合物是包含共价结合于连接基团及蛋白的生物活性部分的分离的复合物。在一种实施方案中，该蛋白是比如清蛋白或HSA这样的血液蛋白。在另一种实施方案中，该蛋白是重组HSA。该复合物是通过将生物活性部分，例如肾素抑制剂或病毒融合抑制剂肽，与纯化的和分离的蛋白缀合制得的。与未缀合分子相比，该复合物在血流中有更长寿命，并且与未缀合分子相比，其更长时间段地表现生物活性。任选地，本发明的化合物和复合物是分离和纯化的。本发明还提供在体内实现所需生物学效应的方法，包括向哺乳动物宿主血流中施以本发明的新的分离的复合物。
本发明还提供作为病毒感染抑制剂的化合物，包括核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物、多肽、多肽衍生物、肽模拟物(peptidomimetic)化合物以及它们的生物缀合形式。本发明还提供对于治疗病毒感染，包括多药物抗性病毒感染，施用具有延长的作用持续时间的这些抑制剂的生物缀合形式的方法。
特别是，本发明提供抑制人免疫缺陷病毒(HIV)的化合物及其生物缀合形式，以及为治疗HIV感染，包括多药物抗性HIV感染(mdrHIV)，施用提供延长的作用持续时间的抑制剂生物缀合形式的方法。
发明背景
可用于向哺乳动物宿主施用的某些活性肽和蛋白治疗剂表现出弱的药物代谢动力学概况，且常常在该肽或蛋白能够结合于特异靶之前即被哺乳动物系统快速降解和清除。一般地，一经施用，这些生物活性试剂即对酶降解和廓清敏感。因此，必须更加频繁地施用某些活性试剂，这将使得该试剂的血浆水平出现并非期望的大波动，引发种种不良副反应和/或降低功效。对于一种有效的治疗剂来说，活性试剂必须能够被运至活性位点或者必须能够被直接施用至靶位点而不显著丧失其生物活性。
绝大多数药物是经口服施用的。一般地，施用剂量要求反复施用该药物以维持其治疗水平，且血液水平随着时间推移的快速降低常常导致初始水平高于所需要的治疗水平。为避免这些问题已经设计出了各种技术方法，包括通过比如泵这样的机械系统、控释或缓释片剂和胶囊、积存及相关技术来施用生物活性试剂。
通过注射施用的治疗剂遇到了类似的有关其有限体内寿命的问题。此外，反复注射不方便而且非常不受欢迎。因此，需要能够简化将生物活性试剂施用至血流中并使治疗剂有效水平在体内保持更长时间段的新方法。
HIV/AIDS
获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是一种由HIV-1感染引起的致命性疾病。至2002年末，全世界有超过四千二百万人受HIV-1感染，而且将有超过两千万人死于HIV/AIDS。在患者群体中占主导的是药物抗性HIV株。目前估计的是有最多达50％的经药物治疗的HIV-感染患者带有药物抗性HIV株。仅在美国药物抗性HIV的传播就介于10-15％之间。就在眼前不远的将来对报道病例的估计也将继续大大增加。因此，非常需要开发出对抗AIDS的药物和疫苗。
AIDS病毒首次鉴定于1983年。它已经通过若干种名称和首字母缩略词为人们所知。最初它是第三种已知的T-淋巴细胞病毒(HTLV-III)，并且它具有在免疫系统细胞内复制的能力，从而导致严重的细胞破坏和免疫性损伤。AIDS病毒是一种逆转录病毒，逆转录病毒是一种在复制时使用逆转录酶的病毒家族。这一特殊的逆转录病毒也已称为淋巴结病相关病毒(LAS)、AIDS-相关病毒(ARV)以及最近的人免疫缺陷病毒(HIV)。
病毒多样性：
HIV是逆转录病毒中慢病毒家族的成员，该病毒家族包括猿猴免疫缺陷病毒(SIV)以及众多其它导致哺乳动物免疫缺陷的逆转录病毒。目前已经描述了两种不同类型的HIV，即HIV-1和HIV-2，尽管世界上更为普遍的是受HIV-1感染。本文一般将使用首字母缩写HIV来指代所有的HIV-1病毒，除非另行注明。HIV-1可以进一步分为三个组：主要的(M)、异常的(O)和新的(N)。到目前为止分离的大多数HIV-1都属于M组的十个不同进化枝或亚型之一。M组亚型用字母A-J表示。亚型B是在美国和欧洲最常见的。然而，亚型C几乎占全世界HIV的50％，并且在非洲最为常见。在非洲存在所有的亚型，其中非-C的进化枝倾向于在不同地理区域聚簇。亚型鉴定通常通过对env基因进行测序、以及比较给出亚型“指纹”的gp41序列来确定。
病毒生活周期：
HIV主要感染带有CD4的辅助性/诱导性T-细胞，且还可以感染其它在膜表面表达CD4糖蛋白的细胞。近来的证据已经表明，特定趋化因子受体在细胞表面的共定位对于有效的病毒感染是关键的。HIV会使CD4+淋巴细胞病变并使得它们的数量在若干年内稳定减少，从而导致严重的免疫系统受损。HIV感染还会导致神经退化和痴呆。除非用有效的化学疗法进行治疗，HIV几乎总是致命的，并导致由机会感染、癌症或神经变性疾病而引发的死亡。
HIV-1基因组包含至少九个不同的基因。最大的基因是gag(编码结构蛋白)、pol(编码病毒酶-蛋白酶、逆转录酶和整合酶)和env(编码被膜糖蛋白)。在所有逆转录病毒中都发现有gag、pol和env基因的同源物。
基因组中的gag和pol区域编码将被翻译成大的多蛋白前体的多顺反子信使RNA。病毒多蛋白随后被由病毒编码，其本身为pol基因产物的蛋白酶切割成成熟的结构蛋白和酶。一个大前体(gp160)被细胞酶切割成两个Env蛋白，gp120和gp41。
其它HIV-1基因产物，例如Tat、Rev、Vpr和Nef，介入调控病毒生活周期。Nef还影响颗粒感染力。基因产物Vif和Vpu分别在病毒感染力和病毒颗粒成熟化中起作用。病毒基因组两侧末端均带有长末端重复序列(LTRs)。LTRs包含能够激活转录并且还处于病毒信号控制下的细胞蛋白的结合位点。HIV的复杂调控使病毒能够建立潜伏状态，然后对各种不同的信号快速做出反应并合成高水平的病毒蛋白和病毒体，从而导致大量子代病毒的产生和释放、随后的被感染细胞被破坏、以及大量健康CD4+淋巴细胞的再次感染。
抗逆转录病毒试剂：
抗逆转录病毒化学治疗剂这一领域是对于需要有效对抗逆转录病毒，尤其是HIV的试剂而发展形成的。至2002年末，FDA已经批准了十六种用于治疗HIV/AIDS的抗逆转录病毒剂。尽管在理论上有许多种途径可以使试剂表现出抗逆转录病毒活性，但是所有这些试剂都抑制或者病毒逆转录酶或者病毒蛋白酶。高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)是指各种药物“混合物”、或三种或更多种抗逆转录病毒试剂组合，它们能够有效抑制病毒复制和预防或延迟AIDS发病(Mitsuya，H.，和J.Erickson.1999，Discovery and development ofantiretroviral therapeutics for HIV infection.，第751-780页，T.C.Merigan和J.G.Bartlet和D.Bolognesi(ed.)Textbook of AIDSMedicine，Williams&Wilkins，Baltimore)。然而，为HIV-1感染提供有效长期的抗逆转录病毒疗法的能力仅获得了部分成功，因为那些最初实现了令人满意的病毒抑制到不可检测水平的患者中有40至50％最终都遭受了治疗失败(Grabar等人，2000，Factors associatedwith clinical and virological failure in patients receiving a tripletherapy including a protease inhibitor，Aids.，14：141-9：Wit等人，1999。Outcome and predictors of failure of highly activeantiretroviral therapy：one-year follow-up of a cohort of humanimmunodeficiency virus type 1-infected persons，J Infect Dis.，179：790-8)。此外，可能是由于药物抗性HIV-1变体的传播(Wainberg，M.A.，and G.Friedland.1998.Public health implications ofantiretroviral therapy and HIV drug resistance.JAMA.279：1977-83)，有10至40％的以前从未接受过抗病毒疗法的HIV-1感染个体在HAART下带有持续的病毒复制(血浆HIV RNA＞500拷贝/ml)(Gulick等人，1997，Treatment with indinavir，zidovudine，andlamivudine in adults with human immunodeficiency virus infectionand prior antiretroviral therapy，N Engl J Med.，337：734-9；Hammer等人，1997，A controlled trial of two nucleoside analogues plusindinavir in persons with human immunodeficiency virus infectionand CD4cell counts of 200per cubic millimeter or less，AIDS ClinicalTrials Group 320Study Team.N Engl J Med.，337：725-33；Staszewski等人，1999，Efavirenz plus zidovudine andlamivudine，efavirenz plusindinavir，and indinavir plus zidovudine and lamivudine in thetreatment of HIV-1infection in adults，Study 006Team.N Engl JMed.，341：1865-73)。此外，显然利用这些抗-HIV药物在晚期HIV-1感染患者中仅实现了部分免疫重建。
药物抗性：
HIV的药物抗性突变株的快速出现和传播使得目前的药物失效并且是使治疗失败的主要原因。近期的估计是，在北美有超过75％接受过药物治疗的患者带有对16种在多药物“混合物”中所使用的经FDA批准的抗逆转录病毒试剂的一或多种具有抗性的HIV。药物抗性HIV占新感染最多达12％。药物抗性HIV株出现于受野生型HIV株感染以及接受次优剂量的一或多种抗逆转录病毒试剂的个体(Burger等人，Antivir.Tlier.，1998)。有三种主要的逆转录病毒试剂类型：核苷逆转录酶抑制剂(NRTIs)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)和蛋白酶抑制剂(PIs)。所选择的药物抗性HIV的起始株依赖于特定的药物方案，而且常需要用同类中的另一种药物替换某种药物。然而，随着时间的推移对带有多个突变的新株的持续选择常导致类别-特异性药物抗性，以及最终导致完全的治疗失败。对同类药物的交叉抗性正以惊人的高速度传播(Erickson等人，AIDS，13：S 189，(1999)；Gulnik等人，Vitam.Horm.，58：213(2000)；Menendez-Arias等人，Trends Pharmacol.Sci.，23：381(2002))。
药物副作用：
根据药物抗性的出现是在次优药物水平下低水平复制的结果这一已被普遍接受的理论，在混合物处方中开出最大可耐受剂量的各种药物已逐渐成为抗逆转录病毒疗法中的普遍措施。由于HIV是一种慢性且不可治愈的感染，所以对每日服用最大剂量的抗逆转录病毒药物混合物的需求导致了非常高的峰值药物水平。由于许多种这些药物的慢性毒性，这种措施已经导致了惊人高比率的危及生命的副作用(综述参见Tozser等人，Ann.NY Acad.Sci.，946：145(2001))。与HAART毒性相关的一些更为严重的副作用包括肝问题、心脏疾病和脂肪营养障碍(Chen等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，87：4845(2002)；Holstein等人，Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes 109：389(2001))。抗性和副作用结合导致难于遵循药物方案，并最终导致治疗失败率为40-45％(Wit等人，J.Infect.Dis.179：790(1999)；Fatkenheuer等人，AIDS 11：F113(1997)；Lucas等人，Ann.Intern.Med.131：81(1999)；Chen等人，41st Intl Conf Antimicrob.AgentsChemother.，Abstract I-1914(2001))。因此，相当大数目的目前正接受HAART的患者将很快没有治疗剂可供选择。
HAART的长期益处受限于难于遵循和药物抗性这双重问题。除这些问题之外，惊人高昂的药物费用已经严重限制了全球HIV感染人群接受HAART。因此，急切地需要新的治疗剂，它们1)有效对抗野生型和药物抗性病毒，2)安全和无毒性，和3)制备或者，至少送递，相对低廉。将这些要求加在常规的效力、药理学、安全性和药物作用机制问题上时即形成了巨大的挑战(De Clercq，ClinMicrobiol Rev.10：674-93(1997)；Erickson等人，AIDS 13：S 189-204(1999))。
融合抑制剂及其用于延长疗法的限制：
一种引人注意的解决药物抗性问题的办法是开发具有不同于市场上现有药物的作用机制的药物。理论上有许多种途径可以使试剂在细胞培养物中表现出抗逆转录病毒活性。DeClerq(Curr Med Chem.8：1543-72(2001))已经综述了具有新作用机制的HIV抑制剂。在这些化合物中，HIV融合的多肽抑制剂(“抗融合肽(anti-fusiogenicpeptide)”)已在人临床试验中显示有效。HIV感染人淋巴细胞和带有膜结合CD4糖蛋白和一个趋化因子受体的其它细胞类型。HIV感染CD4-携带性细胞的第一步是由HIVgp120被膜蛋白识别CD4受体，所述HIVgp120被膜蛋白通过病毒膜-结合的HIV gp41被膜蛋白而与病毒膜非共价结合。gp41蛋白，或“融合蛋白”，包含几个“融合(fusiogenic)”结构域，包括一个融合肽和两个自结合螺旋-形成部分(“N-螺旋”和“C-螺旋”)。
gp120蛋白对CD4和趋化因子受体的识别及结合触发融合结构域的揭开、gp41插入至细胞膜中和两个螺旋形成部分自结合成一个“发夹”结构。据信gp41发夹结构的形成是病毒和细胞膜融合中的一个关键步骤，而且是一个缓慢的过程，需要长至30分钟来完成。膜融合事件尽管常见于正常细胞活动，但它也参与各种疾病状态，包括例如，有被膜的病毒进入细胞、以及病毒感染细胞与健康细胞的异常融合，从而导致合胞体形成、以及随后的细胞廓清或死亡。已知肽和小分子抑制或者破坏膜融合-相关事件，包括，例如，抑制逆转录病毒对靶细胞的感染。
有许多种通过干扰融合反应来抑制HIV感染CD4细胞的多肽已经得到描述。几种这些所谓的“抗融合肽”衍生自gp41的两个螺旋形成部分之中任一个的天然氨基酸序列(Jiang等人，Curr.Pharmaceut.Design 8：563(2002))。由来自gp41的N-或C-螺旋-形成区域的序列组成的多肽在细胞培养测定中表现出抗病毒活性。HIV-1、HIV-2和SIV融合蛋白的各种分离、重组形式的X射线晶体结构和NMR溶液结构显示，它们全都形成带有一个反平行、螺旋束-型折叠的三聚体。这些束由三组发夹构成，每组发夹由来自单一蛋白链中的两个螺旋-形成部分间的反平行结合形成。这些发夹以这样的方式排列：第一或N-末端螺旋部分在三聚体内部束中结合，第二个或C-末端部分与由两个相邻的N-末端螺旋形成的沟相互作用。因此，该发夹结构似乎是组装成三聚体四级结构的结果，而不是三聚体的基本结构单元。
来自C-末端和N-末端七价物重复区域的肽，包括DP178(Wild等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：9770(1994))，也称为T-20、C34(Chan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：15613(1998))、和DP 107，表现出有效的抗病毒活性。
全文引入本文的第6,013,263、6,017,536和6,020,459号美国专利同样公开了对应于来自HIV-1分离物LAI(HIV-1LAI)的gp41第638至673位的36氨基酸肽DP178、和对应于来自HIV-1LAI的gp41氨基酸558-595的38氨基酸肽DP107，两者都表现有效的抗-HIV-1活性。WO 00/06599教导了利用C34来使gp41失活，并由此防止或减少HIV-1进入细胞。它们被推定为在瞬间状态下与gp41的三聚体卷曲螺旋或核心结构结合，并由此防止结合内源C-螺旋。T-20，一种34残基肽，已经在药物受试患者中显示出有效降低病毒负荷。这证实了gp41是一种有希望的开发新抗HIV药物的靶。不幸地是，T-20的治疗性送递受到其肽特性的限制。T-20具有1.8小时的短半衰期(Kilby等人，Nat.Med.，4：1302(1998))，且需要通过皮下注射施用，每天两次。注射部位发炎是常见的副作用反应，而且药物配制和制备困难使得治疗费用高昂。T-20还可能通过产生体外和体内药物抗性的许多单个突变的选择而失效。
一种候补FI，T-1249，正处于II期临床试验。该化合物是一种比T-20更长的肽。其主要优势是它比T-20更有效且具有更长的半衰期。然而，T-1249仍然需要每天注射，而且利用该药物容易选择产生药物抗性突变体。
如同许多多肽，T-20和T-1249都必须通过静脉内或皮下施用，而且，主要由于快速血清廓清和肽酶及蛋白酶活性，它们在体内都呈现短半衰期。这些药理学限制降低了这些试剂的治疗有效性，而同时还导致了高昂的治疗费用。
C34，如同T-20和T-1249，主要由于快速血清廓清和肽酶及蛋白酶活性，在体内也遭受短半衰期的缺点。由此大大降低了其有效抗病毒活性。
总的来说可以这样推断，现有技术中描述的许多与T-20和T-1249大小类似，约30-40氨基酸的抗融合多肽和肽模拟物将存在与在T-20和T-1249上所发现的相同的限制。
目前的抗逆转录病毒疗法是危及生命的副作用和危及生命的药物抗性的发展之间的折衷。因此，需要一种提供处于将能降低这些试剂的慢性毒性且不损及其治疗有效性的逆转录病毒试剂的方法。作为一个例子，需要一种延长C34类似肽体内半衰期而基本不影响其抗融合活性的方法。还需要开发在治疗药物抗性HIV感染，尤其是由对T-20和T-1249有抗性的病毒株引起的感染中有效的抑制剂。还需要开发能够在对野生型感染的治疗背景中预防或延迟药物抗性HIV出现的试剂。
还需要一种延长逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂半衰期的方法，例如，由此这些试剂就能够在长时间的基础上以毒性较小的剂量被施用。由于每位患者每年所需的累计药物量将低于目前的疗法，因此这样的方法有可能使得治疗不那么昂贵。
考虑到上述问题，因而需要对抗药物抗性HIV株的抑制剂。此外，需要对抗药物抗性HIV gp41的抑制剂。还需要能够在被感染个体中预防或延缓药物抗性HIV株出现的HIV抑制剂。将能够在野生型HIV感的背景中抑制药物抗性HIV株和延缓药物抗性株出现的抑制剂定义为“抗性-排斥”抑制剂。
还需要作用持续时间更长的HIV融合抑制剂。把对体内病毒复制具有持久抑制的、具有延长的体内半衰期的抑制剂定义为“长时”抑制剂。
应当认识到，抗性-排斥抑制剂和长时抑制剂在HIV/AIDS治疗中各自展现其清楚和独特的优势。还应当认识到，将这两种特性结合在一种试剂中将会在抗病毒疗法中产生革命性进展。把兼具抗性-排斥和长时的抑制剂定义为广谱持久抑制剂。
作为前体药物的血清清蛋白：
已经公开了一种作为抗肿瘤前体药物试剂的阿霉素-清蛋白缀合物(F.Kratz等人，J.Med.Chem.2000，43，1253-1256)。然而，该缀合物是用酸敏感接头制备的，该接头使得药物能够在肿瘤细胞的溶酶体和内体(indosome)中存在的低pH值下被释放。该缀合物的制备经过了设计以避免被视为比较耗费财力的转体内(ex vivo)合成和药物清蛋白缀合物的表征。
发明概述
本发明涉及可用于与蛋白反应从而形成共价连接的复合物的生物活性化合物，其中所得的复合物在体内表现出所需的生物活性。更确切地说，该复合物是包含比如抗病毒化合物的化合物和连接基团的复合物，且血液成分是比如清蛋白这样的蛋白。本发明还提供在体内实现比如抗病毒活性这样的所需活性的方法，包括向哺乳动物宿主血流中施用本发明的新的分离的复合物。
在一种实施方案中，提供一种药物组合物，它含有作为活性成分的根据本发明的比如抗病毒复合物这样的纯化缀合物。根据本发明的药物组合物任选地含有0.001％-100％的一或多种本发明的缀合物，比如抗病毒复合物。这些药物组合物可以通过各种本领域中已知的向血流中施用生物活性试剂的方法来施用或共同施用。在本发明的一个优选方面，该组合物可以通过注射施用。在另一个优选方面，该组合物可以通过输注施用。该组合物可有利地含有该缀合物的缓冲盐溶液。
在另一种实施方案中，提供了用于送递含有生物活性试剂，尤其是比如抗病毒剂这样的治疗性试剂的分离的缀合复合物的方法和组合物，其中的复合物包括与非缀合试剂相比在血流中具有更长半衰期的试剂。
本发明包括利用与连接基团共价附着或连接的生物活性化合物，该连接基团含有至少一个能够与蛋白上存在的官能团形成共价键的化学反应部分。通过在向宿主血液尤其是宿主血流中施用复合物之前制备该分离的复合物，可产生一种与非缀合生物活性试剂相比在血流中保持更长时间段的有效治疗效应的生物活性复合物。
特别是，本发明提供HIV gp41和HIV的抗性-排斥、长时且广谱的持久抑制剂、其组合物、设计方法、及其在救援治疗和一线治疗模式中用于治疗药物抗性HIV和wtHIV感染的用途。
在一种实施方案中，本发明提供靶向野生型和药物抗性突变gp41蛋白、且具有针对野生型和药物抗性HIV株的抗病毒活性的抗性-排斥HIV gp41抑制剂。尤其是，这些化合物具有对抗包含天然存在的gp41序列多态性的野生型HIV株、和包含赋予其T-20和/或T-1249抗性的突变的野生型HIV株的活性。在一种实施方案中，这些抑制剂是与gp41的N和C-末端螺旋重复区域肽序列有关的肽序列。
在另一种实施方案中，本发明涉及对HIV gp41广谱持久抑制剂的设计，所述抑制剂靶向野生型和药物抗性突变gp41蛋白、且具有针对野生型和药物抗性HIV株的抗病毒活性。尤其是，这些化合物具有对抗包含天然存在的gp41序列多态性的野生型HIV株、和包含赋予其T-20和/或T-1249抗性的突变的野生型HIV株的活性。设计HIVgp41的广谱持久抑制剂涉及对表现抗病毒和/或抗融合活性的肽作化学活性修饰，由此所修饰的肽能够与血液成分上可接近的官能团反应从而形成稳定的共价键。在本发明的一种实施方案中，经过修饰的肽含有一个能与血液成分上的氨基基团、羟基基团或巯基基团反应从而形成稳定共价键的反应基团。在本发明的另一种实施方案中，该反应基团可以是能够与血液蛋白，包括比如清蛋白这样的可移动血液蛋白上的巯基基团反应的部分，比如马来酰亚胺。
更确切地是，本发明提供能够在或者体内或者转体内与血液成分上的巯基反应形成稳定共价键的广谱持久gp41抑制剂。此外，由本文所公开的方法形成的复合物其本身即比未修饰化合物更加稳定和长效。由本发明所形成的复合物与相应的未修饰化合物相比具有更长的体内半衰期。本发明的复合物对抗水解切割或降解的稳定时间段为约4小时至约120天。
在进一步的实施方案中，本发明涉及对HIV gp41广谱持久抑制剂的生物缀合的组合物的设计，所述抑制剂与比如血清清蛋白这样的可移动血液蛋白以使得该抑制剂的生物缀合形式具有对抗野生型和药物抗性HIV株的抗病毒活性的方式共价相连。尤其是，这些化合物具有对抗包含天然存在的gp41序列多态性的野生型HIV株、和包含赋予其T-20和/或T-1249抗性的突变的野生型HIV株的活性。在本发明的一种实施方案中，该生物缀合物是利用含有一个能与血液成分上的氨基基团、羟基基团或巯基基团反应从而形成稳定共价键的反应基团的经修饰肽来形成的。在本发明的另一种实施方案中，该反应基团可以是能够与血液蛋白，包括比如清蛋白这样的可移动血液蛋白上的巯基基团反应的部分，比如马来酰亚胺。
本发明还提供与HIV-1 gp41野生型或药物抗性突变形式结合在复合物中的上述化合物。
本发明还提供含有上述抑制剂、以及药学可接受添加剂、赋形剂或稀释剂的药物组合物。该组合物可进一步含有另外的HIV gp41抑制剂和/或HIV蛋白酶抑制剂和/或HIV逆转录酶抑制剂。
本发明还提供治疗患有HIV感染的患者的方法，包括向患者施用上述药物组合物。
在进一步的实施方案中，本发明涉及可用于与蛋白反应从而形成共价连接复合物的生物活性化合物，其中所得复合物表现体内肾素抑制活性。更确切地，该复合物是含有肾素抑制剂和连接基团的分离的复合物，且该血液成分是比如清蛋白这样的蛋白。本发明还提供抑制体内肾素活性的方法，包括向哺乳动物宿主血流中施用本发明的新的分离复合物。
在一种实施方案中，提供含有根据本发明作为活性成分的纯化的肾素抑制剂复合物的药物组合物。根据本发明的药物组合物任选地含有0.001％-100％的一或多种本发明的肾素抑制剂复合物。这些药物组合物可以通过各种本领域中已知的向血流中施用生物活性试剂的方法来施用或共同施用。在本发明的一个优选方面，该组合物可以通过注射施用。在另一个优选方面，该组合物可以通过输注施用。
在另一种实施方案中，提供送递含有生物活性试剂，尤其是比如肾素抑制剂这样的治疗性试剂的分离的缀合复合物的方法和组合物，其中的复合物包括与非缀合试剂相比在血流中具有更长半衰期的试剂。
本发明包括利用与连接基团共价附着或连接的生物活性化合物，该连接基团含有至少一个能够与蛋白上存在的官能团形成共价键的化学反应部分。通过在向宿主血液尤其是宿主血流中施用复合物之前制备该分离的复合物，可产生一种与非缀合生物活性试剂相比在血流中保持更长时间段的有效治疗效应的生物活性复合物。
定义：
除非另行说明，为本申请之目的，说明书和权利要求书中所使用的以下术语应当具有以下含义：
如本文所使用的“复合物”，是一种含有比如抗病毒化合物或肾素抑制剂这样的生物活性剂、连接基团和比如清蛋白这样的蛋白的化合物。
“衍生物”意指衍生自一些其它化合物并通常保持其总体结构的化合物。
“分离的”比如一种分离的化合物，是一种基本上从其它在天然状态下伴随该化合物的成分中分离出来的化合物，比如象清蛋白这样的天然存在的化合物。“分离的”在应用于获自血液或血浆的化合物时，意指在该化合物进一步与一种比如抗病毒剂或肾素抑制剂等的生物活性试剂缀合前从血液或血浆中的其它生物化合物或成分中纯化或分离出来的化合物，比如来自血液蛋白或血浆蛋白的一种特定生物成分。分离的化合物在与生物活性试剂反应之前存在于不同于其天然存在的物理环境中和/或已经完全或部分从其它天然成分中分离或纯化出来。本发明的分离的化合物或复合物具有以最小的与血液或血浆中的非期望成分发生反应的干扰而与本发明的生物活性试剂，比如抗病毒剂或肾素抑制剂等发生选择性更强的反应或缀合的优点。
如本文所使用的“接头”，指将生物活性化合物AV与蛋白Pr，比如清蛋白，连接或附着从而形成一个含有生物活性成分、接头和蛋白的共价结合复合物的连接基团。
“药学可接受的”意指可用于制备药物组合物的，总体来说是安全、无毒的且既没有生物学上的也没有其它方面的不良之处，包括可接受用于兽医使用以及人类药物使用。
“药学可接受盐”意指，如上所定义的药学上可接受的本发明抑制剂的盐，且其具有所需药理学活性。这样的盐包括用比如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等这样的无机酸形成的酸加成盐；或用比如乙酸、丙酸、己酸、庚酸、环戊烷丙酸、乙醇酸(glycolic acid)、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、邻-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲基磺酸、乙基磺酸、1，2-乙基二磺酸、2-羟基乙基磺酸、苯磺酸、月桂基磺酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等的有机酸形成的酸加成盐。
药学可接受盐还包括碱加成盐，当存在的酸性质子能够与无机或有机碱发生反应时即可形成碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三羟甲基氨基甲烷、N-甲基葡糖胺等。
“受保护衍生物”意指，其中的反应位点或多个反应位点用保护基团封闭了的抑制剂衍生物。受保护衍生物可用于制备抑制剂或抗病毒剂抗病毒剂或者它们本身就是有活性的抑制剂或抗病毒剂。在T.W.Greene，Protecting Groups in Organic Synthesis，第三版，JohnWiley&Sons，Inc.1999里可以找到全面的适宜保护基团列表。
“治疗有效量”意指，当为治疗疾病而向动物施用时足以使得对疾病的这种治疗有效的量。
“治疗”意指对本发明化合物的任何施用，且包括：
(1)在倾向于发生疾病但尚未遭受或表现该疾病的病理学或症状学的动物中预防该疾病发生，
(2)在遭受或表现疾病病理学或症状学的动物中抑制该疾病(也即，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)，或
(3)在遭受或表现疾病病理学或症状学的动物中改善该疾病(也即，逆转病理学和/或症状学)。
“稳定的”：若缀合物在与靶物结合前未被切割、且缀合物的大分子量成分，比如清蛋白，在与靶结合前基本上未被降解，则该缀合物是稳定的。若即使可能发生了某些蛋白酶切割，但该缀合物仍保持分子量大于约50kDa，则大分子基本上未被降解。若缀合物保持至少约50kDa的分子量，则认为其是完整的。
“基本上保持”：若缀合物活性至少为非缀合药理学活性部分的约10％(且摩尔比可能更高)，则该缀合物基本上保持其药理学活性部分的活性。缀合物活性一般地是非缀合药理学活性部分活性的0.1至10倍，尽管还可能观察到活性进一步的增强。
“药学惰性的”：对于缀合物中所使用的大分子而言，意指该分子是无毒的。该分子可能有或者可能没有不同于缀合物的生物活性，尽管一般地它没有。“无生物活性”意指，向受试者施用非缀合载体不会对受试者的正常生理产生任何实质性的混乱。
“假肽”或“肽类似物”或“肽模拟物”意指模拟肽的结构、特性或活性而设计的、是肽的结构类似物的修饰肽。该修饰肽与非修饰肽相比由于在表现出相同或改进的生物活性的同时对酶降解的更高水平的抗性而具有改进的生物和功能活性。
对于本文中所述的所有肽，除非特别说明，肽序列将被理解为指N-保护衍生物，比如N-乙酰基化合物，和C-酰胺衍生物、以及游离氨基和游离羧基化合物。
附图简述
附图1显示本发明的融合抑制剂肽。
附图2显示未缀合的(SPI-30014Q)对HSA-缀合的(SPI30014HSA)融合抑制剂肽在Sprague-Dawley大鼠中的药物代谢动力学。
附图3显示未缀合的(SPI-70038Q)对HSA-缀合的HIV(SPI-70038HSA)融合抑制剂肽在Sprague-Dawley大鼠中的药物代谢动力学。
附图4显示反应肽(SPI-30014)对HSA-肽缀合物(SPI-30014HSA)在Sprague-Dawley大鼠中的药物代谢动力学。
附图5显示反应肽(SPI-70038)对HSA肽缀合物(SPI-70038HSA)在Sprague-Dawley大鼠中的药物代谢动力学。
发明详述
本发明提供生物或药理学活性部分和大分子的缀合物，包括纯化的缀合物，其具有优越的药理学特性且当施用给哺乳动物受试者时产生持续的生物活性。尤其是，本发明提供分离的化合物，其中药理学活性部分共价缀合于药理学惰性大分子载体，其中药理学活性部分与载体的连接在体内是稳定的，其中完整化合物基本上保持药理学活性部分的药理学活性，且其中当该化合物向哺乳动物施用时其活性半衰期至少为未缀合药理学活性部分的约两倍。载体有利地是HSA，而且该缀合物用于人治疗和预防方法。
以往的工作已经描述了包含与大分子部分连接的生物活性分子的缀合物。例如，一个重要的工作组描述了细胞毒性试剂阿霉素和甲氨喋呤与人血清清蛋白(HSA)的缀合物。在这些方法学中，基本原理是将细胞毒性试剂与HSA通过不稳定连接相连，该连接在缀合物在体内所需位点摄取后被切断。一般地，该不稳定连接是酸敏感的并且在细胞性摄入内体的酸性环境中后被切断。因此，以这种方式，该缀合物本质上被视作一种需要被降解以释放生物活性分子的前体药物部分。
其它工作已经描述了向受试者血流中注射“活化的”生物活性分子的方法，其中设想活化部分与一或多种比如HSA这样的血液蛋白结合，从而原位制备缀合物。这种方法有许多缺点，包括关于缀合物施用不能控制伴有污染不确定性的缀合物的组成和产量。此外，许多活化的生物活性分子的水可溶性有限，且化学不稳定，这不仅给对活性部分的操作和施用带来问题，还导致体内反应性和施用的不确定性。
还有其它工作描述了包含HSA和目的蛋白的融合蛋白的制备。当然这些方法都局限于可以通过重组DNA方法制备的分子的缀合物。同样，肽或蛋白与HSA的附着位点也局限于HSA的C-或N-末端，而且该附着的特性必定是借助肽键。
一般地，由于蛋白结合降低了药理学活性所需的游离药物的浓度，所以从这一程度来说药物与血液蛋白成分的非共价结合或吸附被视作一个缺陷。然而，本发明人已经惊奇地发现，转体内制备的、且带有非不稳定接头的，肽与连接于大分子量部分的非肽生物活性分子的缀合物提供了超越前述方法和组合物的有价值的优势。尤其是，已经发现这样的转体内制备的其中生物活性分子与HSA是共价相连的“掩蔽(cloaked)”组合物(其中大分子“掩蔽”生物活性部分)相对于目前已知的组合物具有预料不到的优越药理学以及尤其是药物代谢动力学特性。
更确切地，本发明人已经发现生物活性部分与比如HSA这样的大分子的转体内缀合产生高度可溶的能够纯化并以严格控制的剂量施用的缀合物。掩蔽缀合物与缀合物一样具有生物活性，也即，它不是作为从缀合物中释放生物活性部分的前体药物起作用，而且不需要切割缀合物来获得生物活性。此外，一旦向受试者施用后，该缀合物就具有惊人长的体内半衰期，具有优良的组织分布、并产生持续的对应于该缀合物中的生物活性部分的活性。此外，利用放射性标记的缀合物所作的测定表明，在向受试者施用后，基本上所有的所施用缀合物都能够在体内得到证明。相比之下，在利用放射性标记的活性部分所作的测定中，其中假定在原位形成缀合物，最高到50％的向受试者所施用的活性部分不能得到证明。此外，生物活性部分与大分子间的化学缀合允许接头的长度和性质有变化。
有利地是，生物活性部分和大分子以约1∶1的比率连接，以避免生物活性部分的“半抗原化”和形成对缀合物的免疫应答。此外，该生物活性部分有利地附加在大分子的单一位点。例如，可以利用对HSA的特殊反应性半胱氨酸34(C34)的选择性连接。利用，例如包含马来酰亚胺的接头对C34的选择性连接方法是本领域已知的。适宜的接头可从，例如Pierce(Rockford，IL)商业获得。
如果超过一个生物活性部分分子与大分子相连接，那么有利地是通过一个与大分子的单个位点相附着的“多价”接头来实现。例如，接头可以附着于HSA的C34，这可以允许多个生物活性部分与接头附着。多价接头是本领域中已知的，而且可以包含，例如，一个与HSA的C34反应的亲硫基团、和允许多个生物活性部分与接头附着的多个亲核(比如NH或OH)或亲电(比如活化酯)基团。
有利地是，该生物活性部分与大分子相比在大小上相对较小，以使得比如HSA这样的大分子的“掩蔽”效应最大化。尽管熟练的技术人员将会认识到对于生物活性部分的大小不能设定精确的上限，但据信可以利用分子量小于50kD、小于10kD、以及有利地小于7.5kD或5kD的分子。
将生物活性部分与大分子相连接的方法是本领域已知的，并且在例如WO00/76550中有描述，WO00/76550全文引入本文作为参考。关于融合抑制剂肽和肾素抑制剂的缀合物，以下还更详细地描述了这样的方法。熟练的技术人员将认识到，所描述的对病毒融合抑制剂和肾素抑制剂的缀合方法，一般可应用于各种生物活性部分，而且仅仅是本技术的示例。类似地，用于纯化缀合物(如果需要的话)的方法也是本领域已知的。例如，可以通过对缀合物透析来去除过量的生物活性部分，还可以通过反相HPLC、离子交换层析和/或大小排阻层析等来对其进一步进行纯化。
生物活性化合物
本发明包括各种可以用本文所述方法“掩蔽”的生物和/或药理学活性部分。除以下例举的肾素抑制剂和病毒融合抑制剂之外，基本上任何需要其增强的药理学特性、和尤其是持久活性的分子都可以被掩蔽。可以被掩蔽的基团的例子包括肽和非肽分子。特定例子包括具有代谢效应的化合物，比如降胆固醇和降血压化合物、用于治疗神经疾病的化合物(此处缀合物能够任选地直接施用到CNS中)包括伤口愈合剂、抗生素(包括抗感染剂)、抗氧化剂、化疗剂、抗癌剂、抗炎剂和抗增殖药物。有关这些分子的例子是本领域熟知的，且仅为示例目的包括：
基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂，尿激酶受体拮抗剂，尿激酶抑制剂，erb-2受体拮抗剂，TRAIL受体拮抗剂，抗血管生产肽，阿片样物质(opiod)和治疗疼痛的抗伤害类似物，比如肾素抑制剂这样的抗高血压药物；血管紧张素受体拮抗剂；利尿钠肽衍生物，比如干扰素这样的抗病毒物质(包括用于治疗丙型肝炎的α和β干扰素)；cyanovirin衍生物，比如胰岛素这样的用于治疗代谢失调的化合物，比如蛋白酶、噬菌体细胞溶素、病毒侵入和融合抑制剂这样的细菌和酵母细胞外毒性因子(对于比如疱疹病毒这样的病毒，比如HSV-2-生殖器疱疹，病毒糖蛋白D-柄蛋白-2互作，HCV-E1、E2糖蛋白与CD81、LDL受体以及其它细胞特异性和肝脏特异性辅因子的互作，疟原虫天冬氨酸蛋白酶，血吸虫天冬氨酸蛋白酶，使导致蛋白错误折叠疾病的蛋白稳定的伴侣蛋白或下调这些蛋白产生的药物和可以用于治疗比如阿尔茨海默病这样的疾病的药物(例如分泌酶抑制剂)。
ACE-抑制剂，α-和β肾上腺素能激动剂和拮抗剂，肾上腺类皮质激素、激素、醛糖还原酶抑制剂，醛固酮拮抗剂，5-α还原酶抑制剂，止痛药、麻醉剂、减食欲剂、驱肠虫药、抗痤疮类试剂，抗变应剂，抗脱毛剂，抗阿米巴剂，抗雄激素试剂，抗心绞痛剂，抗心律不齐剂，抗动脉硬化剂，抗关节炎/抗风湿剂，抗哮喘剂，抗细菌剂，氨基糖苷抗生素，袢霉素，比如β-内酰胺、林肯酰胺、大环内酯类、多肽、四环素、2，4-二氨基嘧啶、呋喃类药物、喹诺酮及其类似物这样的抗生素和抗细菌剂，磺胺类、砜类、抗生素类、防胆结石生成类药物，抗胆甾醇血药，抗胆碱能药物，抗凝血剂，抗惊厥剂，抗抑郁剂，酰肼/肼、吡咯烷酮类、四环类(tetracyclics)、抗糖尿病类试剂，双胍类、激素类、磺酰脲类衍生物，止泻剂，抗利尿剂，抗运动障碍剂，抗湿疹剂，止吐剂，抗癫痫药，抗雌激素药，抑制纤维药(antifibrotic agent)，抗肠胃气胀剂，抗真菌剂，抗青光眼剂，血脑屏障肽(BBB肽)，RGD肽，胰高血糖素样肽，抗促性腺激素药、抗痛风药、止血药和抗组胺药；三环抗抑郁药，抗高胆甾醇血药、抗高血脂药、抗高血脂和抗高脂蛋白血药，芳氧基链烷酸衍生物，胆汁酸螯合剂，HMG-CoA还原酶抑制剂，烟酸衍生物，甲状腺激素/类似物，抗高磷盐药，抗高血压药，芳基乙醇胺衍生物，芳氧基丙醇胺衍生物，苯并噻二嗪衍生物，n-羧基烷基衍生物，二氢吡啶衍生物，胍衍生物，肼/2，3-二氮杂萘，咪唑衍生物，季铵化合物，喹唑啉基哌嗪衍生物，利血平衍生物，磺胺衍生物，抗甲状腺机能亢进剂，抗低血压剂，抗甲状腺机能减退剂，抗炎剂，氨基芳基羧酸衍生物，芳基乙酸衍生物，芳基丁酸衍生物芳基羧酸(包括芳基丙酸衍生物)，吡唑，吡唑啉酮，水杨酸衍生物，噻嗪羧酰胺，抗麻风药、抗白血病药、抗血脂药、抗脂血药、抗疟药、抗狂燥药、抗高铁血红蛋白血症药、抗偏头痛药、抗霉菌药、止恶心药、抗肿瘤药和烷基化试剂，抗代谢物，酶，雄激素，抗肾上腺药，抗雄激素药，抗雌激素药，孕激素，uroprotective，抗骨质疏松剂，抗畸形性骨炎剂，抗震颤麻痹剂，抗蠕动药物，抗嗜铬细胞瘤药、抗肺囊虫药、抗前列腺肥大药、抗原生动物药、antiprozoal、止痒剂、抗牛皮癣剂和抗精神病试剂，butyrophene，吩噻嗪，噻吨，退热剂，抗风湿剂，抗立克次氏体药、抗皮脂溢剂和抗菌剂/杀菌剂，解痉剂，抗梅毒药、抗凝血药、抗结核药、抗肿瘤药、止咳药、抗溃疡药、抗尿石药、抗蛇毒血清、和抗眩晕剂，嘌呤/pyrimidinomes、抗焦虑剂、芳基哌嗪、苯并二氮_类衍生物，氨基甲酸酯，收敛剂，苯并二氮_拮抗剂，β阻断剂，支气管扩张药，麻黄碱衍生物，钙通道阻断剂，芳基烷基胺，二氢吡啶衍生物，哌嗪衍生物，钙调节剂，钙补充剂，癌症化疗剂，毛细血管保护剂，碳酸酐酶抑制剂，心抑制药，强心药，泻药，阳离子交换树脂，cck拮抗剂，中枢兴奋剂，大脑血管舒张剂，螯合剂，胆囊收缩素拮抗剂，溶胆石剂，胆汁分泌促进剂，类乙酰胆碱药，胆碱酯酶抑制剂，胆碱酯酶激活剂，cns兴奋剂，思维兴奋剂，避孕药，用于控制眼内压的试剂，冠动脉血管舒张剂，细胞保护剂，多巴胺受体拮抗剂，杀体外寄生虫药，催吐剂，酶，消化药，溶粘蛋白剂，青霉素灭活剂，蛋白水解剂，酶诱导剂，雌激素拮抗剂，胃质子泵抑制剂，胃分泌抑制剂，α-葡糖苷酶抑制剂，性腺刺激物质，性腺刺激激素，生长激素抑制剂，生长激素释放因子，生长刺激物，补血药，溶血药、demostatic、肝素拮抗剂，肝保护剂，组胺h.sub.1-受体拮抗剂，组胺H2-受体拮抗剂，免疫调制剂，免疫抑制剂，inotrophic剂，角质分离剂，哺乳刺激激素，脂肪增多剂，盐皮质激素，弱安定剂，缩瞳剂，单胺氧化酶抑制剂，溶粘蛋白剂，肌肉弛缓剂，散瞳剂，麻醉剂；麻醉药拮抗剂，精神镇静药，神经肌肉阻断剂，神经保护剂，NMDA拮抗剂，nootropic agent，NSAID剂，卵巢激素，催产剂，GP-41肽，促胰岛素肽拟副交感神经剂，灭虱药，胃蛋白酶抑制剂，末梢血管扩张剂，蠕动刺激物，色素沉着剂，血浆容积膨胀剂，钾通道激活剂/开启物，升压剂，孕激素，促乳素抑制剂，前列腺素/前列腺素类似物，蛋白酶抑制剂，质子泵抑制剂，逆转录酶抑制剂，灭疥癣药物，致硬化剂，镇静剂/催眠剂，血清素受体激动剂，血清素受体拮抗剂，血清素摄入抑制剂，骨骼肌弛缓剂，生长激素抑制素类似物，解痉剂，大便松软剂，琥珀酰胆碱增效剂，拟交感神经药，血栓溶解剂，甲状腺激素，甲状腺抑制剂，促甲状腺素，促尿酸排除，血管舒张剂，血管加压药和血管保护剂。
抗病毒化合物和复合物：
本发明还提供用于治疗病毒性疾病的具有延长或持续活性的抗病毒化合物。本发明还提供用这些化合物治疗病毒性疾病的方法。本发明的化合物具有更高的体内稳定性以及对于降解，例如肽酶或蛋白酶降解更低的敏感性。因此，本发明的化合物可以比现有可获得的抗病毒化合物以更少的次数施用。这些化合物可用于，例如，预防和/或治疗许多病毒感染，包括人免疫缺陷病毒(HIV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
本发明的化合物通过与至少一个血液成分、或多种不同血液成分的共价连接来实现其持续活性。该连接可以在体内或体外完成。若该连接在体外完成，则该化合物在施用给患者之前，可以任选地，例如通过过滤，来进一步纯化。对于由天然存在的氨基酸组成的肽化合物，该共价键可以通过化学途径，例如通过利用适宜的交联剂，或通过制备与血液成分的融合蛋白来实现。对于非肽化合物、或包含非天然存在的氨基酸的化合物，该连接可以通过化学途径实现。熟练的技术人员会知道适用于本发明中的血液成分。在一种特定实施方案中，该血液成分是人血清清蛋白，在另一种实施方案中，该血液成分是一种人或人源化抗体、抗体片段或抗体衍生物。该抗体、抗体片段或抗体衍生物任选地是特异性与比如人血清清蛋白这样的血液成分结合的抗体、抗体片段或抗体衍生物。
抗病毒化合物
本发明的化合物包括具有抗病毒活性的、能够与血液成分缀合而不显著丧失其抗病毒活性的化合物。在本发明上下文中，抗病毒活性的显著丧失是指这样一种状况，其中缀合化合物的抗病毒活性降低至这样一种程度：为获得适宜的体内活性，以摩尔计的该化合物的剂量必须至少提高十倍。
适用于本发明的化合物包括但不限于：病毒融合的肽抑制剂，病毒酶的核苷和核苷类似物、非核苷和非核苷类似物以及核苷酸和核苷酸类似物抑制剂、病毒蛋白酶抑制剂，和抑制病毒进入细胞的趋化因子共同受体阻断剂。这些化合物的各个例子是本领域已知的。
非限制性的代表性化合物包括，例如：
核苷类似物，比如阿糖胞苷、阿糖腺苷、碘酰尿苷(iodoxyuridine)和阿昔洛韦：
核苷和核苷酸类逆转录酶抑制剂(NRTI)，比如AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、阿波卡韦、替诺福韦(tenofovir)、恩曲他滨(emtricitabine)、amdoxovir、dOTC和d4TMP；
非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)，比如奈韦拉平、地拉韦定、依非韦伦；thiocarboxanilide UC-781、capravirine、SJ-3366、DPC083和TMC125/R165335；
蛋白酶抑制剂(PI)，包括沙喹那韦、利托那韦、吲哚那韦、奈非那韦、安泼那韦、洛匹那韦(lopinavir)、atazanavir、mozenavir、替普那韦和TMC-114；
病毒吸附抑制剂，比如cosalane衍生物和cyanovirin-N
共同受体拮抗剂，例如TAK-779和AMD3100
病毒融合抑制剂，例如pentafuside T-20、桦木酸、R170591VP-14637和NMS03
和病毒脱壳抑制剂，比如偶氮二酰胺。
其它可以使用的抗病毒化合物包括拉米夫定、法昔洛韦、洛布卡韦和阿德福韦、利巴韦林、整合酶抑制剂(二酮酸类)、转录抑制剂(temacrazine、flavopiridol)、病毒脱壳抑制剂(pleconaril)；RNA复制酶抑制剂(VP-32947)；DNA聚合酶抑制剂(A-5021、L-和D-环己烯基鸟嘌呤)；bicyclic furopyrimidine类似物；cidofovir；神经胺酸酶抑制剂(扎那米韦、奥赛他米韦、RWJ-270201)；阿德福韦二叔戊酰氧甲酯；N-糖基化抑制剂(N-壬基-脱氧野尻霉素)；和，IMP脱氢酶抑制剂和S-腺苷高半胱氨酸水解酶抑制剂。
尤其是对于治疗HIV感染，可以使用：
通过与病毒被膜糖蛋白gp120结合(多硫酸盐、多磺酸盐、多羧酸盐、多金属氧酸盐、多核苷酸和带负电荷的清蛋白)抑制病毒吸附；
通过阻断病毒共同受体CXCR4(也即，bicyclam(AMD3100)衍生物)和CCR5(也即，TAK-779衍生物)抑制病毒进入；
通过与病毒被膜糖蛋白gp41结合(T-20、T-1249)抑制病毒-细胞融合；
通过NCp7锌指-靶向试剂(2，2′-二硫代二苯甲酰胺(DIBA)、azadicarbonamide(ADA))抑制病毒装配和解装配；
通过比如4-芳基-2，4-二氧代丁酸(4-aryl-2，4-dioxobutanoicacid)衍生物这样的整合酶抑制剂抑制原病毒DNA整合；
和通过转录(反式激活)过程的抑制剂(flavopiridol、氟喹诺酮)抑制病毒mRNA转录
的化合物。
接头L1和L2：
多种不同的接头或连接基团L1和L2可用于连接血液成分与抗病毒剂。该连接基团可以是二价的或者是多价的。例如，在式I的复合物中，L1与Pr附着时可以是n价的，而L1与AV附着时可以是m价的，其中m和n是如上述定义的整数。类似地，在式II的复合物中，L2与Pr附着时可以是o价的、而与AV附着时可以是p价的，其中o和p是如上述定义的。可以出现在连接基团中的官能团的非排他性例子包括，具有羟基基团的化合物，比如N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺，以及其它化合物，比如马来酰亚胺-苯甲酰-琥珀酰亚胺、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺基丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺、异氰酸酯、硫代酸酯、硫羰羧酸酯、亚氨酸酯、碳二亚胺、酐或酯。
此外，可以使用带有比如羧酸酯、酰基卤、叠氮、重氮、碳二亚胺、酐、肼、醛、巯基或氨基基团这样的官能团的特定连接基团来形成酰胺、酯、亚胺、硫醚、二硫化物、取代胺等。其它可以使用的官能团的特定例子包括酰氧甲基酮，氮丙啶，重氮甲基酮，环氧化物，碘-、溴-或氯乙酰胺，α-卤代酯，α-卤代酮，锍，氯乙基硫化物，O-烷基异脲，烷基卤化物，乙烯基砜，丙烯酰胺，乙烯基吡啶，有机金属化合物，芳基二硫化物，硫代磺酸酯，醛，腈，α-二酮，α-酮酰胺，α-酮酸酯，二氨基酮，缩氨基脲和二酰肼。
可选择作为接头的化合物的本质和类型依赖于在抗病毒剂、接头和清蛋白或血液成分上的官能团间所需的反应类型、相关反应性、选择性、可逆性和稳定性特征。例如，形成缀合复合物的特定反应源自烷基化反应，迈克尔类型加成反应，加成-消除反应，硫、羰基或氰基的加成，或金属键的形成。
一般地，从这些反应形成的共价键在抗病毒剂的活性生存期过程中是稳定的。在一种实施方案中，除非生物活性亚单位要在活性位点释放，在这些复合物中形成的共价键保持稳定。
接头可以由具有将比如清蛋白这样的蛋白与多个抗病毒剂相连接或者将多个清蛋白与单个抗病毒剂相连接的双官能团或多官能团的化合物组成。在一种特定优选实施方案中，接头含有将HSA与一或多个抗病毒剂相连接的多官能团。在一种实施方案中，如本文所使用的连接化合物包括任何一种能够在一步中将抗病毒剂与蛋白相连接的化合物。在另一种实施方案中，首先将连接化合物与抗病毒剂连接以形成可进一步与蛋白反应的抑制剂-接头中间体。在另一种实施方案中，连接化合物首先与蛋白反应从而形成能够进一步与抗病毒剂反应的蛋白-接头中间体。在上述各排列中，任选地，连接的化合物在用于进一步反应以形成式I或式II的复合物之前可经进一步纯化和/或分离。
这样的多官能团化合物的非排他性例子包括具有至少一个选自叠氮苯甲酰酰肼(azidobenzoyl hydrazide)、N-[4-(对叠氮水杨基氨基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫代)丙酰胺]、辛二酸二磺基琥珀酰亚胺酯、己二亚氨酸二甲酯(dimethyl adipimidate)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、N-γ-马来酰亚胺基-丁酰氧琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯、[4-叠氮苯基]-1，3′-二硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯、[4-碘乙酰]氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、戊二醛和4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的官能团的化合物。
可以使用，任何便于使用和接受标准化学转化的接头或连接基团，或形成所需剂量生理可接受、且可在血流中稳定所需时间段的化合物的接头。该连接基团可以是脂族、脂环族、芳族、杂环或其组合。可以用作连接基团的基团的例子包括亚烷基、亚芳基、芳亚烷基(aralkylene)、环亚烷基、聚醚等。在一种特定实施方案中，也可以使用多官能聚乙二醇(PEG)及其衍生物作为接头。
连接基团在连接链中可以具有至少一个原子，更优选在链中有1至200个原子，最优选链中有2至50个原子。链中的原子可以是线性的，或者该链可以是一或多个环的部分，分别为取代或非取代的，且该链可以包括碳原子或选自O、N、P和S的杂原子。环可以是脂族的、杂环的、芳族的或杂芳族的或其混合物，分别为取代或非取代的。在一些实施方案中，可以用氨基酸或肽或利用了上述混合物的氨基酸作为连接基团。
在一种实施方案中，L1缺失，且AV直接附着于Pr。在另一种实施方案中，L2缺失，且AV直接附着于Pr。
在式I复合物的另一种实施方案中，L1是一种能够将多于一个的AV与一个Pr相连的连接基团，例如，其中m是2或更多。在一种实施方案中，m是1、2或3，且n是1-30。在式I复合物的一种优选实施方案中，Pr是清蛋白，且n是1。在另一种实施方案中，Pr是清蛋白，AV是一种抗病毒剂，且n是2-25。
在式II的复合物的另一种实施方案中，L2是一种能够将多于一个的Pr与一个AV相连的连接基团，例如，其中o是2或更多。在一种实施方案中，Pr是清蛋白，AV是抗病毒剂，o是1、2或3，且p是1-5。
在另一种实施方案中，当比如抗病毒剂这样的抑制剂能够直接与蛋白反应时(任选地利用催化剂或偶联剂)，连接基团可以缺失，由此所形成的复合物仅由直接与蛋白附着的抗病毒剂组成。这样的一种直接偶联反应的例子是中间体混合酐的偶联反应之前的混合酐活化的羧酸偶联反应。
蛋白成分Pr：
多种血液成分可用于制备本发明的分离的复合物。天然存在的血液成分包括血液蛋白，其包括红细胞，和比如IgM和IgG这样的免疫球蛋白，血清清蛋白，运铁蛋白，p90和p38。在一种优选实施方案中，血液成分或血液蛋白是清蛋白。更优选，该清蛋白是人血清清蛋白(HSA)。
本发明中所使用的清蛋白也可以是重组清蛋白。例如，重组人清蛋白可以通过用编码人血清清蛋白氨基酸序列的核苷酸编码序列转化微生物来制备。
通常，有大量不同的可用于从血液或血浆中分离化合物的方法，所述方法提供了非常大范围的最终纯度和产物产量。清蛋白是存在于血浆中的主要蛋白，且可以从血液中提取，例如在JP 03/258728、EP 428758、EP 452753和6,638,740中、以及其中所引用的参考文献中所公开的。各种非排它性化合物分离方法的其它例子可能基于选择性可逆沉淀、离子交换层析、蛋白亲和层析、疏水层析、亲硫层析(J.Porath等人；FEBS Letters，第185卷，第306页，1985；K.L.Knudsen等人，Analytical Biochemistry，第201卷，第170页，1992)、和各种树脂基质(WO 96/00735；WO 96/09116)。特定纯度的某些血液成分可商业获得。
连接化合物AV-L1和AV-L2的制备：
在一种实施方案中，可以制备本发明的连接化合物AV-L1或AV-L2并将其用于与清蛋白缀合而无需进一步纯化和/或分离。连接化合物的纯度将依赖于接头的性质、AV的性质和反应类型以及AV与接头附着所使用的反应条件。在另一种实施方案中，未纯化的连接化合物以至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，和最优选至少98％的纯度制备并获得。
在一种特定实施方案中，本发明涉及分离的连接化合物，即AV-L1或AV-L2的制备方法。在一种优选实施方案中，分离的连接化合物AV-L1和AVL2是与接头附着的抗病毒剂。在一种实施方案中，分离的连接化合物在与Pr缀合前可以进行纯化。在另一种实施方案中，连接的化合物AV-L1或AV-L2是分离的并以至少95％、优选至少97％、更优选至少98％、和最优选至少99％或更多的纯度纯化。
可以用化学合成领域已知的标准方法制备连接化合物。可以用本领域已知的标准方法纯化化合物，比如柱层析或HPLC，来提供适于体内应用的纯化产物。连接化合物可进一步与比如清蛋白这样的蛋白缀合以形成式I和II的复合物。
与血液成分的共价连接
适用于本发明的血液成分是本领域已知的。人血清清蛋白(“HSA”)是人血液中的主要成分，且尤其适用于本发明。尤其是，HSA具有一个暴露的表面半胱氨酸残基，它为抗病毒化合物与蛋白的共价连接提供反应性巯基部分。特别适于与巯基连接的活化接头包括比如马来酰亚胺这样的不饱和环酰亚胺，比如α-碘和α-溴醋酸酯这样的α-卤酯，和乙烯基吡啶衍生物。适宜的活化接头可，例如从Pierce Chemical(Rockford，IL)商业获得。制备适于与HSA连接的活化化合物的方法是本领域已知的。参见例如，第5,612,034号美国专利，该专利全文引入本文。
在本发明的一种变形中，该接头具体地与半胱氨酸34的巯基基团连接，而且可能通过巯基基团在接头的亲电子基团上的亲核反应来形成。
此外，HSA基因已经被克隆，这可以允许容易地制备包含HSA的融合蛋白。这些具有治疗用途的融合蛋白，包括但不限于，与血液成分融合的多肽、抗体、或肽、或其片段和变体。该融合蛋白表现出延长的保存期限和/或延长的或治疗活性。制备融合蛋白的方法是本领域已知的。参见，例如WO01/79271和WO01/79258，它们全文引入本文作为参考。融合蛋白的制备可用于制备抗病毒肽的持久衍生物。
适于与抗病毒化合物连接的另一种血液成分是免疫球蛋白(“Ig”)分子。Ig持久稳定，且以相当高的浓度存在于血液中。对于体外偶联，Ig具有易于稳定和易于分离的优点，而且制备Ig缀合物的方法是本领域熟知的。此外，Ig基因可以容易地克隆，而且可以制备Ig和Ig融合蛋白。获得完全人Ig的方法是本领域熟知的。参见例如，第5,969,108和6,300,064号美国专利号，其全文引入本文作为参考。此外，选择具有特定所需结合活性，例如与HSA结合的Ig的噬菌体展示法是本领域熟知的。参见第5,885,793、5,969,108和6,300,064号美国专利。在本发明上下文中，Ig指本领域已知的任何适宜的免疫球蛋白或免疫球蛋白衍生物，包括，例如，完整IgG、IgM，Fab片段，F(ab′)2片段，和单链Fv片段。
其它适用于本发明的血液成分包括运铁蛋白、铁蛋白、类固醇结合蛋白、甲状腺素结合蛋白、和α-2-巨球蛋白。
对于肽，活化接头可以与反应性侧链残基偶联，比如赖氨酸侧链。例如，一个包含活化酯部分和马来酰亚胺部分的接头可以选择性地通过赖氨酸侧链在活化酯(比如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)处反应或者在肽的N末端反应。对于非肽抗病毒化合物，熟练的化学家能够容易地识别化合物上能够选择性与比如活化酯这样的适宜连接部分反应的亲核(或亲电子)原子或基团。适宜的亲核部分包括但不限于氨基和羟基基团。例如，对于核苷和核苷酸类似物，羟基基团可以作为偶联反应的亲核试剂起作用。对于核苷酸，还可以通过形成，例如，磷酸酯来实现偶联。类似策略可用于其它抗病毒化合物，例如用于蛋白酶抑制剂和其它酶抑制剂，可以利用酶活性位点远侧的亲核基团来实现偶联。
天然和重组HSA以及人Ig都可商业获得，且均适用于本发明。
可以利用对于熟练化学家而言熟知的合成方法来制备抗病毒化合物。例如，可以利用熟知的固相肽合成技术来制备肽。参见，例如，Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，Pierce Chemical Company，Rockford，IL，(1984)。类似地，可以合成肽片段以及随后结合或连接在一起以形成所需序列。
可以用本领域已知的方法或已知方法的简单变化来制备其它化合物。
制备连接化合物Pr-L1和Pr-L2：
对于本发明的特定用途，用Pr表示的化合物可以是清蛋白，可以以不经进一步纯化和分离而根据从商业途径获得的形式来用于制备连接化合物Pr-L1和Pr-L2。在一种特定实施方案中，Pr是HSA。在另一种实施方案中，清蛋白可以用本文公开的本领域已知的各种方法进行进一步纯化。
在一种实施方案中，可以通过在溶液中用Pr处理可以被衍生的或活化的接头L1或L2、并监控反应混合物直至反应充分完成，来制备连接化合物Pr-L1和Pr-L2。在一种特定优选实施方案中，Pr是蛋白。在另一种优选实施方案中，该蛋白是HSA或重组HSA。
在另一种优选实施方案中，所获得的连接化合物Pr-L1或Pr-L2是基本纯的；即，该连接化合物以至少10％，优选至少30％，及更优选至少50％的纯度获得。若Pr为HSA或重组HSA，则可以与连接化合物共存的成分可以由未反应的HSA和各种存在于HSA起始材料中的生物成分组成。优选地，HSA或重组HSA为干物质基础上至少10％纯度的。
与连接化合物共存的过量HSA或HSA相关生物材料不会显著干扰随后的与AV缀合的步骤。此外，相关生物材料和缀合的复合物对于体内应用在药理学上也是安全的。
然而，在特定实施方案中，连接化合物Pr-L1或Pr-L2的纯度可以是干物质基础上的至少10％，以使得化合物与AV的选择性反应能够发生而没有显著量的干扰或不形成从与其它非所需血液成分发生的缀合反应获得的不需要的副产物。然而，比如HSA或重组HSA这样的Pr的所需纯度，例如，将依赖于Ih上的官能团以及所使用的接头上的官能团的性质。一般地，如果接头上的官能团比该接头上反应性较弱的官能团更具反应性且可能形成不需要的副产物，则需要更高纯度的HSA或重组HSA。
清蛋白可以从宿主的血浆或血液清蛋白中获得、纯化至所需的纯度水平、并与接头连接。可以利用本领域已经充分确立的清蛋白纯化标准方法来完成清蛋白从血液或血浆的纯化。利用纯化的血液清蛋白，本发明的分离的复合物将由相对均一的功能化蛋白群体组成。
式I或式II复合物的制备：
在一种实施方案中，可以通过AV-L1或AV-L2与Pr的缀合、Pr-L1或Pr-L2与AV的缀合、或AV与Pr的缀合从而形成其中缺失了接头的复合物来制备式I或式II的复合物。
在一种实施方案中，在一定条件下，使AV-L1或AV-L2溶液与Pr组合，从而缀合反应必定完成。在一种特定实施方案中，连接化合物是与接头附着的抗病毒剂，并将该连接化合物加入到HSA水溶液中。温育所得溶液直到反应基本完成。
在一种实施方案中，将AV-L1或AV-L2与过量HSA组合以确保缀合反应选择性地在HSA上的单一位点进行。例如，AV-L1在HSA上单一位点处的形成使得式I的单一复合物易于鉴定，例如，当n为1时。在一种特定实施方案中，AV-L1或AV-L2与HSA的缀合反应发生在HSA的单个半胱氨酸上。不限于任何特定理论，对于一些反应，据信缀合反应还可以最初发生在一个半胱氨酸-SH基团上以形成一个动力学产物，该产物然后重排至另一个比如赖氨酸这样的氨基酸官能团，从而形成热力学产物。
在另一种实施方案中，缀合反应可以形成式I的复合物，例如，其中多于一个AV与单个HSA连接形成式I的复合物；即，其中n大于1。任选地，如果接头L1是能够与多于一个AV基团附着的多官能接头，则m可以大于1。在一种实施方案中，可以通过将相对于(AV)m-L1过量的Pr进行组合来制备式I的复合物。优选地，Pr与(AV)m-L1的比率为约50至100。在另一种实施方案中，该比率为约10至30。在另一种特定实施方案中，该比率为约2至5。
在一种实施方案中，将Pr以至少约1.1∶1的比率加至(AV)m-L1，更优选至少约1.2∶1，和最优选至少约1.4∶1。对于Pr是清蛋白的情况，优选比率基于这一假设：对于每个清蛋白存在0.7个游离巯基。优选地，所得复合物为以1∶1形成的复合物，因为比如清蛋白这样的Pr成分只有约70％用于进行缀合的游离巯基官能度。过量Pr，比如HSA或重组HSA，在药理学是安全的，且不需要进一步纯化。当产物混合物中存在过量Pr时，任选地，可以将缀合复合物纯化至至少10％纯度。在一种特定实施方案中，可以将缀合复合物纯化至至少约20％或至少约30％。
在另一种实施方案中，式I的复合物可以通过将相对于Pr过量的(AV)m-L1进行组合来制备。优选地，(AV)m-L1与Pr的比率为约50至100。在另一种特定实施方案中，该比率为约10至30。在又一种特定实施方案中，该比率为约2至5。若产物混合物中存在过量(AV)m-L1，则任选地，可以将缀合复合物纯化至至少10％纯度。在一种特定实施方案中，可以将缀合复合物纯化至至少约20％或至少约30％。
在另一种实施方案中，可以以(AV)m-L1与Pr的化学计量比率或AV与L2-(Pr)o的化学计量比率，即，以1∶1的比率，来制备式I或式II的复合物。任选地，从这些制备获得的产物可以进一步纯化至至少10％纯度。在一种特定实施方案中，可以将缀合复合物纯化至至少约20％或至少约30％的纯度。在又一种实施方案中，可以将1∶1缀合的复合物进一步纯化至大于约90％的纯度。
在另一种实施方案中，在反应前将清蛋白中的缀合半胱氨酸还原为游离半胱氨酸。
任选地，从缀合反应形成的复合物在施用前可以经进一步纯化。
在一种实施方案中，由于存在于复合物中的过量HSA或HSA相关生物材料对于体内使用在药理学上是安全的，所以从缀合反应获得的式I或式II的复合物可以不经进一步加工或纯化而施用。
在上述各实施方案中，AV是肽抗病毒剂，且Pr是HSA或重组HSA。
在一种实施方案中，包含保护或未保护的抗病毒剂与接头和清蛋白的分离的复合物任选地可经进一步纯化及之后转回至宿主。
从本发明的方法形成的复合物可以在动物或人宿主中进行测试，直到生理学、药物代谢动力学和安全性概况在更长的时间段内良好建立。一般地，所测得的复合物半衰期为约5至7天，更一般地是至少约7至10天，以及优选15至20天或更多。通常，持续时间是物种依赖性的。例如，对于人清蛋白，半衰期是约17-19天。根据抗病毒剂、连接基团的性质以及清蛋白纯度，复合物的有效治疗浓度可能是至少一个月或更多。
可以通过用同位素(例如，131I、125I、Tc、Cr、3H等)或荧光染料标记复合物或化合物以及血管内注射已知量的标记复合物和化合物之后连续测量式I或式II复合物、AV-L化合物、L-Pr化合物、或AV化合物的全血、血浆或血清水平来测定半衰期。所包括的有：红细胞(半衰期大约60天)、血小板(半衰期大约4-7天)、血管内层的内皮细胞、和长寿命血清蛋白，比如清蛋白、类固醇结合蛋白、铁蛋白、α2-巨球蛋白、运铁蛋白、甲状腺素结合蛋白、免疫球蛋白，尤其是IgG，等。除优选半衰期外，优选主题成分处于足以使其与治疗有效量的本发明化合物结合的细胞计数或浓度。对于细胞长寿命血液成分，优选至少2,000/μl的细胞计数和至少1μ/ml、通常至少约0.01mg/ml、更常为至少约1mg/ml的血清蛋白浓度。
然而，当复合物的性质经过设计以使得比如抗病毒剂这样的生物活性试剂AV得以从复合物上切除并释放到宿主中时，用于复合物和/或生物活性试剂的有效治疗浓度的所需半衰期可能不同于上述测量的半衰期。生物活性试剂的释放速率部分依赖于所释放的生物试剂的化合价或官能度、连接基团的性质、蛋白的纯度和类型、用于施用的组合物、施用方式等。因此，当血液环境、血液成分、尤其是酶、在肝脏中的活性、或其它试剂可以导致连接基团的切除和生物试剂以所需速率释放到宿主中时，可以使用各种连接基团和生物试剂。
本发明的分离的复合物提供与非缀合化合物相比具有改进的药物代谢动力学、可溶性、生物利用率、分布、和/或免疫原性特征的生物活性化合物。
令人惊讶地是，式I和式II的复合物，当根据本发明的方法制备和使用时，比AV成分本身提供显著更长时间的有效治疗浓度。此外，本发明的复合物与使用AV成分本身相比提供改进的可溶性、分布、药物代谢动力学，并导致降低的免疫原性。
本发明人已经惊奇地发现，与通过注射在原位与受体血流中内源清蛋白结合的活化化合物而进行缀合物的体内制备制得的缀合物相比，向受试者施用从纯化成分(尤其是HSA、接头和抗病毒剂)转体内制备的缀合物产生非常有效的缀合物组织活体内分布。此外，本发明人已经发现，与从体内制备的缀合物所观察到的化合物大量丢失相比，基本上所有的缀合物在施用后在循环中保留数小时或甚至数天。该效率减少了患者必须接受活性物质注射的次数，也减少了单次施用所必须给予的抗病毒剂的量。
在本发明上下文中，组合物的治疗有效量理解为意指这样一种量：当施用给受试者后，产生的所需生理性效应的程度达到有效治疗患者的疾病、状况或综合征的程度、或有效减轻疾病、状况或综合征症状的程度。
为制备包含血液成分和抗病毒肽的融合蛋白，将编码融合蛋白的基因在框内置于适宜的载体中，并用该载体转化适宜的宿主细胞。基因可以以任何顺序排列(即，抗病毒肽可以位于融合蛋白的N-或C-末端)，并可以通过接头肽直接融合或分离。适宜的接头肽是本领域中已知的，且包括几乎不具有其自身二级结构且亲水的肽序列，例如，包含甘氨酸和丝氨酸残基的的混合物的接头。制备HSA融合蛋白的方法描述于WO01/79271和WO01/79258中，且类似方法可用于制备与其它血液成分的融合蛋白。
本发明尤其预期抑制病毒与细胞膜融合的肽的用途，以及尤其预期抑制HIV融合的肽。特定的肽抑制剂一般包含最高达51个氨基酸，并包含一个具有本文所公开的序列的肽。尤其是，该肽可以包含附图1所示序列。这些序列衍生自在HIV分离物中发现的序列，而且对于长于附图1所示序列的肽，例如，其余的肽序列可以是所示序列的抑或N-末端抑或C-末端。这样的附加序列可以，例如，由出现在在那些HIV分离物中所定义的序列邻近的序列组成，或包含所述序列。
分离的式I和式II复合物的施用：
在一种实施方案中，本发明的分离复合物的施用可以用快速灌注来完成，但可以通过利用计量流量等进行输液而随着时间推移缓慢导入。
本发明的复合物可以在生理可接受介质中施用，例如去离子水、磷酸缓冲盐水、盐水、甘露醇、葡萄糖水溶液、乙醇、植物油等。尽管可以进行一次以上注射，但是如果想要的话也可以使用单次注射。该复合物可以通过任何一种便利的方式进行施用，包括注射器、套管针、导管等。无论是快速灌注方式还是持续施用等，特定的施用方式将根据施用量而变化。可以为血管内施用，其中导入位点不是本发明的关键，优选在血流快速的位点，例如静脉内、外周或中央静脉。若施用与缓释技术或保护性基质结合，则可以使用其它途径。
令人惊奇地是，注意到，施用用本发明方法从例如，比如清蛋白这样的分离的血液蛋白制备的分离的复合物，会产生与非缀合抗病毒剂相比或与不是从比如清蛋白这样的血液蛋白制得的复合物相比，在血流中保持更长时间段的有效治疗效应的抗病毒缀合物复合物。
在一种实施方案中，本发明提供药学可接受盐形式的化合物。
在另一种实施方案中，本发明提供存在于立体异构体混合物中的化合物。在又一种实施方案中，本发明提供作为单一立体异构体的化合物。
在又一种实施方案中，本发明提供含有作为活性成分的化合物的药物组合物。在又一种特定变形中，本发明提供一种药物组合物，其中该组合物是片剂或作为积存施用的固体。在另一种特定变形中，本发明提供一种药物组合物，其中该组合物是适合静脉内(IV)或皮下施用的液体制剂。在又一种特定变形中，本发明提供一种药物组合物，其中该组合物是适于肠胃外施用的液体制剂。
应注意到，对于所有本文所描述或请求保护的实施方案以及任何进一步的实施方案、变形或单个化合物来说，除非另行说明，所有这样的实施方案、变形和/或单个化合物意欲包括所有的无论是单一立体异构体或是立体异构体混合物形式的药学可接受盐形式。类似地，若在本文所说明或请求保护的任一实施方案、变形和/或单个化合物中存在一或更多个潜在的手性中心，则两个可能的手性中心都包括在内，除非另行指明。
可以通过修饰后来在体内转化为不同取代基的本发明化合物的取代基来制备本发明化合物的前体药物衍生物。还应注意到，在许多情况中前体药物本身也落入本发明化合物的范围。例如，前体药物可以通过使化合物与氨基甲酰化试剂(例如，1，1-酰氧基烷基氯甲酸酯(1，1-acyloxyalkylcarbonochloridate)，对硝基苯基碳酸酯等)或酰化剂反应来制备。制备前体药物的方法的其它例子描述于Saulnier等人(1994)，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，第4卷，p.1985。
还可以制备本发明化合物的被保护衍生物。可以在T.W.Greene，Protecting Groups in Organic Synthesis，第三版，John Wiley&Sons，Inc.1999中找到用于生成保护基团及其除去的技术的例子。
在本发明的方法中，本发明化合物也可以容易地以溶剂合物(例如水合物)制成或形成。通过利用比如二氧杂环己烷、四氢呋喃或甲醇这样的有机溶剂，从水性/有机溶剂混合物中重结晶可以方便地制备本发明化合物的水合物。
如本文所使用的“药学可接受盐”意指包括任何一种以其盐的形式利用的本发明化合物，特别是其中的盐赋予该化合物以与化合物的游离形式或该化合物的不同的盐形式相比改进的药物代谢动力学特性。药学可接受盐形式还可以最初赋予该化合物以所需的、且该化合物以前不具备的药物代谢动力学特性，甚至就该化合物在体内的治疗活性来说可以对该化合物的药物动力学产生正面影响。可以令人满意地受影响的一种药物代谢动力学特性例子是化合物跨细胞膜运输这样一种方式，其依次可以直接和正面影响该化合物的吸收、分别、生物转化和排泄。尽管药物组合物的施用途径是重要的，而且各种解剖学、生理学和病理学因素可以严重影响该化合物的生物利用率，但该化合物的可溶性通常依赖于其所使用的特定盐形式的特征。本领域技术人员将会理解，化合物的水溶液将会提供所治疗的受试者机体对该化合物的最快速的吸收，而脂质溶液和悬浮液、以及固体剂量形式会产生较为不迅速的化合物吸收。
肽及复合物：
在本发明的一种实施方案中，提供一种由最多51个氨基酸组成、包含序列Y 1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6的肽，其中：
该序列位于该肽的N-末端、C-末端或内部位置；
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除除P、G和C之外的任何一种氨基酸；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y 1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y 1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y 10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列W-X-X-W-X-X-X-I-X-X-X-T-X-X-I-X-X-L-I-X-X-X-Q-X-Q-Q-X-X-N的肽，
其中
各X独自为任何一种氨基酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供由最多51个氨基酸组成、包含序列W-X1-X2-W-X3-X4-X5-I-X6-X7-X8-T-X9-X10-I-X11-X12-L-I-X13-X14-X15-Q-X16-Q-Q-X17-X18-N-X19-X20-X21-X22-X23的肽，
其中
X1选自M、L、I、Q、T、R和K；
X2是E、D、Q和K中的任一个；
X3选自E、D和K；
X4选自K、R、E、Q、N和T；
X5选自E、L、R、K和Q；
X6选自N、D、S、E、Q、K、R、H、T、I和G；
X7选自N、Q、D、E、K、S、T和Y；
X8选自Y、F、H、I、V和S；
X9选自G、K、R、H、D、E、S、T、N和Q；
X10选自K、H、E、Q、T、V、I、L、M、A、Y、F和P；
X11选自H、K、E、Y和F；
X12选自T、S、Q、N、E、D、R、K、H、W、G、A和M；
X13选自D、E、Q、T、K、R、A、V和G；
X14选自D、E、K、H、Q、N、S、I、L、V、A和G；
X15选自S、A和(P)；
X16选自N、K、S、T、D、E、Y、I和V；
X17选自E、D、N、K、G和V；
X18选自K、R、H、D、E、N、Q、T、M、I和Y；
X19选自E、V、Q、M、L、J和G；
X20选自Q、N、E、K、R、H、L和F；
X21选自E、D、N、S、K、A和G；
X22选自L、I和Y；和
X23选自I、L、M、Q、S和Y。
在上述实施方案的一种变形中，该肽含有一条选自附图1所示序列的序列。
在本发明的另一种实施方案中，提供一种分离的式I或式II的化合物：
             
Figure A20048001405500671
              AV-[L2-(Pr)o]p                             II
其中：
m是一个1～5的整数；
n是一个1～100的整数；
o是一个1～5的整数；
p是一个1～100的整数；
AV是一种抗病毒化合物；
L1和L2是将AV共价连接至Pr的多价接头，或者L1和L2缺失；
Pr是蛋白；和
其中该复合物具有体内抗病毒活性。
在上述实施方案的一种变形中，该抗病毒化合物是一种肽。在另一种变形中，该肽的质量小于约100kDA。在另一种变形中，该肽的质量小于约30kDA。在又一种变形中，该肽的质量小于约10kDA。
在一种特定变形中，该肽为肽模拟物。
在本发明的另一种实施方案中，该肽由最多51个氨基酸组成且包含选自以下的序列：
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14；
Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14；
Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14；
Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14；
Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14；
Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14；
W-X-X-W-X-X-X-I-X-X-X-T-X-X-I-X-X-L-I-X-X-X-Q-X-Q-Q-X-X-N；
W-X1-X2-W-X3-X4-X5-I-X6-X7-X8-T-X9-X10-I-X11-X12-L-I-X13-X14-X15-Q-X16-Q-Q-X17-X18-N-X19-X20-X21-X22-X23；
肽DP178(T-20)；和
肽T-1249；
其中
X1选自M、L、I、Q、T、R和K；
X2是E、D、Q和K中的任一个；
X3选自E、D和K；
X4选自K、R、E、Q、N和T；
X5选自E、L、R、K和Q；
X6选自N、D、S、E、Q、K、R、H、T、I和G；
X7选自N、Q、D、E、K、S、T和Y；
X8选自Y、F、H、I、V和S；
X9选自G、K、R、H、D、E、S、T、N和Q；
X10选自K、H、E、Q、T、V、I、L、M、A、Y、F和P；
X11选自H、K、E、Y和F；
X12选自T、S、Q、N、E、D、R、K、H、W、G、A和M；
X13选自D、E、Q、T、K、R、A、V和G；
X14选自D、E、K、H、Q、N、S、I、L、V、A和G；
X15选自S、A和(P)；
X16选自N、K、S、T、D、E、Y、I和V；
X17选自E、D、N、K、G和V；
X18选自K、R、H、D、E、N、Q、T、M、I和Y；
X19选自E、V、Q、M、L、J和G；
X20选自Q、N、E、K、R、H、L和F；
X21选自E、D、N、S、K、A和G；
X22选自L、I和Y；和
X23选自I、L、M、Q、S和Y。
本文所公开的含有由最多51个氨基酸组成的肽片段的肽序列可以是位于51个氨基酸的肽的N-末端、C-末端或内部任何位置的片段。在一种变形中，该肽是C-末端酰胺(-CONH2)及其受保护衍生物。在另一种变形中，肽是C-末端酯(即，-COOR，其中R是取代的或未取代的(C1-15)烷基)。
任选地，本文所公开的包含片段的肽序列可进一步用本领域已知的标准保护基团保护。这些肽的受保护衍生物可用于制备抗病毒化合物，或者其本身以部分或完全受保护形式可用作活性抗病毒化合物。也即，复合物中的衍生的或受保护的或部分受保护的肽片段仍然可以保持与靶结合的能力并显示治疗生物学活性。例如，代表性的肽片段氨基基团的保护基团包括乙酰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等。在T.W.Greene，Protecting Groups in Organic Synthesis，第三版，JohnWiley&Sons，Inc.1999中可以找到适宜的和代表性的保护基团。
在一种实施方案中，肽片段的保护基团含有C-末端酰胺和/或N-末端乙酰基及其衍生物。该肽可以具有任何能够与接头附着的氨基酸官能团，包括-NH、-SH、-OH、-COOH等。
在本发明的一种变形中，提供上述其中的蛋白是一种血液成分的实施方案和变形的复合物。在另一种变形中，该血液成分选自红细胞、免疫球蛋白、IgM、IhG、血清清蛋白、运铁蛋白、P90和P38、铁蛋白、类固醇结合蛋白、甲状腺素结合蛋白和α-2-巨球蛋白。在又一种另外的变形中，血液成分是人血清清蛋白，以及接头是肽接头。
在一种特定变形中，血液成分是人血清清蛋白，接头是非肽接头。
在本发明的一种特定实施方案中，复合物是融合蛋白。
在本发明的一种变形中，接头L1或L2是在体内对水解切割稳定的非不稳定接头。因此，本发明的复合物提供对于体内水解切割稳定的化合物。此外，本发明的复合物本身也是活性化合物，且不是简单的通过体内水解产生或释放的肽前体药物。
WO 00/76550(F.Kratz)公开了与附着于比如天然或重组清蛋白这样的巯基结合基团的间隔分子附着的药物和/或诊断活性物质。然而，该公开文件教导，由于低分子量活性物质必须与该物质对其显示药学活性的靶分子互作，所以优选释放药物化合物或诊断活性物质。此外，Kratz教导，间隔分子选自水解和/或pH-依赖性和/或易于酶解断开的化合物。优选地，这些间隔分子是酸敏感的或酸不稳定的间隔子。
若存在多于一个接头，则接头L1或L2可以是疏水接头、亲水接头或其组合。可以选择各种不同的接头L1或L2以提供不同的溶解特征和细胞穿透特征。
若本发明的抗病毒化合物是一种与一或或更多接头附着的肽，则接头L1或L2可以附着在肽的N-末端、C-末端、比如赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸或其组合这样的内部氨基酸的反应性侧链上。
在本发明的一种变形中，接头L1或L2含有至少两个使AV与Pr共价连接的官能团。在另一种变形中，接头L1或L2在人血清中是对水解具有更长时间段的稳定性。
据测定，本发明的化合物本身是比非复合的化合物对水解切割或降解更稳定的化合物。在一种变形中，本发明的复合物对抗水解切割或降解是稳定的，在人血清中具有从4小时到120天的半衰期。在一种特定的变形中，本发明的复合物对抗水解切割或降解的稳定时间段为约8小时至约30天。
在一种特定变形中，提供本发明的复合物，其中接头L1或L2在人血清中以半衰期为8小时至30天保持稳定。
在上述变形和实施方案的另一种特定变形中，接头L1或L2是选自酰氧甲基酮、氮丙啶、重氮甲基酮、环氧化物、碘-、溴或氯乙酰胺、α-卤代酯、α-卤代酮、锍、氯乙基硫化物、O-烷基异脲、烷基卤化物、乙烯基砜、丙烯酰胺、丙烯酸酯、乙烯基吡啶、有机金属化合物、芳基二硫化物、硫代磺酸或酯、醛、腈、α-二酮、α-酮酰胺、α-酮酸酯、二氨基酮、缩氨基脲和二酰肼的化合物的衍生物。
在上述变形和实施方案的另一种特定变形中，接头L1或L2是选自叠氮苯甲酰酰肼、N-[4-(对叠氮水杨基氨基)丁基]-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺、辛二酸二磺基琥珀酰亚胺酯、己二亚氨酸二甲酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯、[4-叠氮苯基]-1，3′-二硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯、[4-碘乙酰]氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、戊二醛、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺-苯甲酰-琥珀酰亚胺、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺基丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺、异氰酸酯、硫代酸酯、硫羰羧酸酯、亚氨酸酯、碳二亚胺、酐和碳酸酯的化合物的衍生物。
在一种特定实施方案中，提供其中的蛋白是清蛋白的本发明的复合物。在上述实施方案的一种变形中，清蛋白是在干物质基础上至少为10％纯的HSA或重组HSA。
在另一种变形中，连接是与人清蛋白的Cys-34的连接。在又一种另外的变形中，连接是与人清蛋白的赖氨酸连接。
在本发明的一种特定变形中，提供其中m为1、n为1、且蛋白为HSA或重组HSA的上述公开的复合物。在另一种变形中，n是1，蛋白是HSA或重组HSA，且其中的复合物进一步纯化至至少30％的纯度。在又一种特定变形中，m是1，n是2，且蛋白是HSA或重组HSA。
在一种实施方案中，通过将化学剂量比率的(AV)m-L1与Pr混合或化学剂量比率的AV与L2-(Pr)o混合来制备复合物。由此，(AV)m-L1与Pr的比率、或AV与L2-(Pr)o的比率是1∶1。在另一种特定变形中，通过将Pr与(AV)m-L1以至少约1.3∶1的比率的混合物进行组合来制备复合物。
在上述实施方案的一种变形中，L1和L2缺失，且其中的复合物通过形成AV的活化中间体、之后使该活化的AV中间体与Pr缩合来制备。在上述的一种变形中，AV的活化中间体从混合酐或N，N′-羰基二咪唑试剂制备。
根据上述羰基，将该复合物进一步纯化至至少约30％纯度。出乎意料之外，根据测定，转体内缀合化合物的制剂比体内缀合化合物的形成产生预料不到的优势。例如，对于相对不可溶的抗病毒剂，转体内缀合形成了更加可溶的试剂或复合物。除了改进的化合物稳定性之外，本发明复合物的形成导致了更加可溶的用于制剂的复合物，相对于施用不可溶非缀合药物来说这是一个显著的施用优势(通过注射)。由于抗病毒剂的转体内缀合形成了可溶药物制剂，所以本发明可以制备稳定的、生理溶液。这一制备包含本发明复合物的稳定可溶的溶液、组合物的能力使得能够为便于口服或肠胃外施用而制备该复合物的生理盐溶液。
此外，已经发现复合物的转体内形成比复合物的体内形成要优越，这是因为复合物施用在注射位点产生更小的刺激、避免了与其它蛋白的非特异性反应、以及实现了比体内法改进的复合物治疗性血液水平。
在另一种实施方案中，本发明提供含有与血液成分共价连接的非肽抗病毒化合物的抗病毒组合物。
根据上述各实施方案和变形，根据上述实施方案和变形提供含有复合物和生理可接受载体的组合物。在一种变形中，该组合物是用盐水或不用盐水配制的。在另一种变形中，该组合物是配制用于肠胃外施用的。
本发明组合物的施用可以包括肠胃外施用，包括经比如皮下、肌内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、脑室内(ICV)、静脉内等这样的其它途径的注射。
在上述的一种变形中，组合物选自溶液、在使用前与溶剂组合的干产物、悬浮液、乳剂和液体浓缩物。
在本发明的另一种实施方案中，提供体内抑制HIV gp41和HIV活性的方法，该方法包括：
向哺乳动物宿主血流中施以上述实施方案和变形的分离的缀合复合物，其中该复合物是通过将抗病毒化合物与具有至少一个能够与蛋白反应从而形成稳定共价键的反应性官能团的接头附着形成的；和
其中的分离的缀合复合物以与非缀合的抗病毒化合物相比能够在血流中维持更长时间段的有效治疗效应的量施用。
在上述方法的一种变形中，该方法可用于在上述实施方案和变形中所公开的复合物。
在另一种变形中，该方法利用了一种蛋白，其中的蛋白是HSA或重组HSA。
在上述方法的一种特定变形中，含有一个反应性官能团的接头是选自酰氧甲基酮、氮丙啶、重氮甲基酮、环氧化物、碘-、溴或氯乙酰胺、α-卤代酯、α-卤代酮、锍、氯乙基硫化物、O-烷基异脲、烷基卤化物、乙烯基砜、丙烯酰胺、丙烯酸酯、乙烯基吡啶、有机金属化合物、芳基二硫化物、硫代磺酸酯、醛、腈、α-二酮、α-酮酰胺、α-酮酸酯、二氨基酮、缩氨基脲和二酰肼的化合物。
在一种实施方案中，提供一种引发体内抗病毒活性的方法，所述方法包括：
以足以提供有效量抗病毒活性的量向哺乳动物宿主血流中施以上述实施方案和变形的复合物；
由此与未结合的抗病毒化合物的寿命相比，所述复合物更长时间段地保留在血流中。
在本发明的另一种实施方案中，提供一种在宿主中引起抗病毒活性的方法，所述方法包括：
a)制备化合物AV-L1或AV-L2，其中AV是质量小于60kD的肽抗病毒化合物，和L1或L2是与AV共价结合的接头；
b)用分离的蛋白将化合物AV-L1或AV-L2转体内处理一段足以使化合物AV-L1或AV-L2与该蛋白共价结合从而形成上述实施方案和变形的蛋白复合物的时间，和
c)向宿主施用该经过处理的蛋白复合物。
在上述实施方案的一种变形中，蛋白是清蛋白。在上述的另一种变形中，该清蛋白HSA或重组HSA。
根据一种变形，清蛋白在用化合物AV-L1或AV-L2处理前获自血液、纯化和分离自血液。在上述方法的另一种变形中，将清蛋白纯化至在干物质基础上至少10％的纯度水平。在又一种另外的变形中，将清蛋白纯化至超过95％的纯度水平。
在另一种实施方案中，本发明提供一种在宿主中引起抗病毒活性的方法，所述方法包括：
a)制备化合物AV-L1或AV-L2，其中AV是质量小于60kD的抗病毒化合物肽，L1或L2是与AV共价结合的接头；
b)用分离的一或多种蛋白Pr将化合物AV-L1或AV-L2转体内处理一段足以使化合物AV-L1或AV-L2与一种或多种分离的蛋白共价结合从而形成一或多种经过修饰的上述实施方案和变形的蛋白复合物的时间，和
c)向宿主施用该经过修饰的一种或多种蛋白。
在一种实施方案的变形中，蛋白是清蛋白。在另一种变形中，清蛋白在用化合物AV-L1或AV-L2处理前获自血液、纯化和分离自血液。在又一种另外的变形中，清蛋白是HSA或重组HSA。
在一种实施方案中，本发明提供含有治疗有效量的上述实施方案和变形的复合物、或其生理学可接受盐、以及药学可接受载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
在一种实施方案中，本发明提供抑制HIV病毒作用的方法，该方法包括对公认需要这种治疗的宿主施用有效量的上述实施方案和变形的复合物、或其药学可接受盐。
在一种变形中，本发明提供治疗病毒感染受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的上述实施方案和变形的组合物。根据上述变形，该受试者正遭受HIV感染。
在另一种实施方案中，本发明提供为怀疑暴露于病毒感染的患者提供预防的方法，包括向所述受试者施用有效量的上述变形的组合物。
治疗方法
本发明利用了现有抗病毒剂的特性。可以用本发明化合物抑制的病毒包括但不限于例如，在US 6,013,263和US 6,017,536的表V-VII和IX-XIV中所列病毒的所有株系。这些病毒包括，例如，人逆转录病毒，包括HIV-1、HIV-2和人T-淋巴细胞病毒(HTLV-I和HTLV-II)，和非人逆转录病毒，包括牛白血病病毒、猫肉瘤病毒、猫白血病病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猿猴肉瘤病毒、猿白血病和绵羊进行性肺炎病毒。利用本发明的化合物还可以抑制非逆转录病毒，例如人呼吸道合胞病毒(RSV)、犬瘟热病毒、新城疫病毒、人副流感病毒(HPIV)、流感病毒、麻疹病毒(MeV)、EB病毒、乙型肝炎病毒和猿猴Mason-Pfizer病毒。也可以抑制非被膜病毒，包括但不限于，比如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、人肠道孤病毒、柯萨奇这样的细小核糖核酸病毒，比如乳头瘤病毒、细小病毒、腺病毒和呼吸道肠道病毒这样的乳多空病毒。
本发明化合物可以根据下述方法和其它本领域已知的方法施用。化合物衍生物的有效治疗剂量可以通过本领域熟知的方法进行测定。
化合物还可以预先预防性施用给未感染个体。这对于个体已经暴露于病毒的情况，比如当个体已经与受感染个体接触而存在高病毒传播风险的情况有好处。这对于比如HIV病毒这样的还不能治愈的病毒的情况来说尤其有好处。作为例子，本发明化合物的预防性施用，在健康护理工作者已经暴露于来自HIV感染个体的血液的情况中、或者在其它使得参与高风险活动的个体潜在暴露于HIV病毒的情况中有好处。
本发明化合物的优选施用途径是静脉内施用，它可以使化合物在血流中循环并到达其所需靶。然而，本发明的方法包含任何能够使化合物在患者体内循环的施用方法。
本发明的化合物和药物组合物可单独使用或与其它抗病毒化合物组合物使用。例如，本发明的化合物和药物组合物可用于各种药物“混合物”中，或者与三种或更多种能够有效抑制病毒复制和预防或延迟AIDS发作的抗逆转录病毒试剂组合。
可进一步参考以下非限制性实施例来理解已得到充分描述的本发明。
本发明的化合物可以任选地根据以下通用反应方案进行合成：
式I复合物的制备：
         
Figure A20048001405500771
         
                                式I
式II复合物的制备：
         
         
                                式II
如上述式I复合物的制备方案所示，抗病毒物质首先与接头L1附着形成抗病毒-接头AV-L1，之后与蛋白Pr反应形成式I的复合物。然而，还可以首先将接头L1与蛋白Pr附着形成接头-蛋白化合物L1-Pr，之后与抗病毒剂连接形成式I的复合物。类似地，本发明还教导了上述所指出的相反顺序也可以用于制备式II的复合物。
实施例1设计和制备HIV融合抑制剂肽。
利用gp41三聚螺旋融合复合物的晶体结构建立推定的HIV融合抑制基肽序列的模型(综述参见Jiang等人，2002)。建立肽序列模型以形成能够适合由融合复合物的N-末端三螺旋核心形成的沟中的螺旋片段。利用对已建立模型的螺旋肽的内部结合和外部暴露表面的评估来确定模型肽中的氨基酸序列和组成。改变在复合物形成后具有暴露侧链的氨基酸以提高模型肽的溶解度和其它理化特征。与N-末端三螺旋核心结合的氨基酸决定结合亲和力和抗病毒活性。
表1和2中的大多数肽都反映表面残基的变化，并且预计为对抗HIV HXB2株同样有效的抗病毒化合物。表1中所有的肽都在N-末端具有一个乙酰基，以及一个C-末端酰胺。
用Tentagel-S-RAM树脂(Rapp Polymer)上的标准固相技术制备这些肽，0.25mmol/g。所有肽经HPLC给出的纯度均＞90％，且质谱正确。
在树脂上的合成规程：
1.去保护-25％哌啶/DMF(5+25分钟)
2.洗涤-DMF(6×1分钟)
3.偶联-3当量Fmoc-氨基酸+3当量TCTU+6当量DIEA至Kaiser测试阴性，(约1小时)；Asn31和Lys333小时
4.洗涤-DMF(5×1分钟)
5.终止乙酰化作用-乙酸酐/DIEA
从树脂上切离：
TFA-间甲酚-苯硫基甲烷-三异丙硅烷(85∶5∶5∶5)2小时，室温
真空蒸发
用醚沉淀(粗产量～80％)
纯化：
用Biosphere C-18柱进行HPLC
流动相-A：水/0.1％TFA，B：乙腈/0.1％TFA
梯度-10-20％B/10分钟，20-40％B/90分钟
检测-UV 220nm
收集大于95％的级分并冻干
分析：
HPLC：柱-Luna C 18
流动相-A：水/0.04％H3PO4，B：乙腈/0.04％H3PO4
梯度-5-65％B/30分钟
检测-W 220nm
MS[MH]+
TCTU＝O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲阳离子四氟硼酸盐
DIEA＝二异丙基乙胺
实施例2评估肽的抗病毒活性
如前人所述(参考文献1～3)做微小改动，利用对MT4细胞的细胞毒性测定分析肽对抗HIV-1 HXB2或NL4-3株的抗病毒效力。在96孔微量滴定板中，在各种浓度的测试化合物存在下，将MT-4细胞(1.5×104/ml)暴露于200半数组织培养感染量(TCID50)的病毒，并于37℃培养5天。通过向各孔中添加终浓度为0.75mg/ml的溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)溶液、并于37℃培养1小时，以此测定HIV细胞毒性。培养后，将细胞溶解于异丙醇/Triton-X 100/HCl(1000∶50∶25)溶液中。在微量培养板读取器上(Spectramax，Molecular Devices)监控540nm和690nm处的吸收。MT-4细胞获自AIDS Research and Reference ReagentProgram(ARRRP，Division of AIDS，NIAID，NIH：MT-4来自Dr.D.Richman)。使细胞在补充有10％胎牛血清、50U青霉素和每ml50μg链霉素(Invitrogen，Carlsbad CA)的RPMI 1640生长培养基上增殖。所有测试化合物的IC50值列于表1。
参考文献：
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2.Pauwels，R.，J.Balzarini，M.Baba，R.Snoeck，D.Schols，P.Herdeweijn，J.Desmyter，E.De Clerq.1988.Rapid and automated tetrazolium-based colorimetric assay for the detection of anti-HIV compounds.J.Virol.Methods.20：309-321.
3.Yoshimura，K.，R.Kato，M.F.Kavlick，A.Nguyen，V.Maroun，K.Maeda，K.A.Hussain，A.K.Ghosh，S.V.Gulnik，J.W.Erickson，H.Mitsuya.2002.A potent HIV-1protease inhibitor，UIC-94003(TMC-126)，and selection of novel(A28S)mutation in the protease active site.J.Virol.76：1349-1358.
表1.未修饰肽的抗病毒活性
            IC50 *(nM)
   HIV-1 IIIB   HIV NL4-3
  肽2肽3肽4肽5肽6肽7肽8肽9肽10肽11     Ac-W-X-E-W-D-R-E-Q-N-N-Y-T-S-L-I-H-S-L-I-E-E-S-Q-N-Q-Q-E-K-N-E-Q-E-L-L-NH2Ac-W-X-E-W-D-R-E-W-N-N-Y-T-S-L-I-H-S-L-I-E-E-S-Q-N-Q-Q-E-K-N-E-Q-E-L-L-NH2Ac-W-X-E-W-D-R-E-I-N-N-Y-T-S-L-I-H-S-Y-I-E-E-S-Q-N-Q-Q-E-K-N-E-Q-E-L-L-NH2Ac-W-X-E-W-D-R-E-I-N-Y-T-T-S-L-I-H-S-Q-I-E-E-S-Q-N-Q-Q-E-K-N-E-Q-E-L-L-NH2Ac-W-X-E-W-D-R-K-I-E-E-Y-T-K-K-I-K-K-L-I-E-E-S-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-K-E-L-K-NH2Ac-W-X-E-W-D-R-K-I-E-E-Y-T-K-K-I-K-K-L-I-E-E-S-Q-E-L-Q-E-K-N-E-K-E-L-K-NH2Ac-W-X-E-W-D-R-K-I-E-E-Y-T-K-K-I-K-K-L-I-E-E-A-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-K-E-L-K-NH2Ac-W-X-E-W-D-R-K-I-E-E-Y-T-K-K-I-E-E-L-I-K-K-S-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-K-E-L-K-NH2Ac-W-X-E-W-D-R-K-I-E-E-Y-T-K-K-I-E-E-L-I-K-K-S-Q-E-L-Q-E-K-N-E-K-E-L-K-NH2Ac-W-X-E-W-D-R-K-I-E-E-Y-T-K-K-I-E-E-L-I-K-K-A-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-K-E-L-K-NH2     2.41.72.06.62.42.42.61.72.02.1     187.69.52001.21.11.20.91.21.1
  T20T1249c34SIVc34     4.72.01.43.8     1201.51.772
*-2或3个实验的平均值
Ac＝乙酰基
实施例3a经化学反应性修饰的HIV融合抑制剂肽的制备
肽2和7的类似物证明，该方法对于提高具有各种序列的肽的药物代谢动力学活性的普遍适用性。如上述利用固相合成技术制备了SPI-30014和SPI-70038(参见下述，表2)。与将N-末端乙酰化不同的是，将其与Fmoc-8-氨基-3，6-二噁辛酸(dioxaoctanoic acid)、TCTU、DIEA反应3小时，如上述进行洗涤，然后与3-马来酰亚胺基丙酸、TCTU、DIEA反应3小时。如上述进行切割和纯化。
SPI-30014MH+4545
SPI-70038MH+4673
实施例3b.淬灭、修饰的HIV融合抑制剂肽的制备
为产生非反应性对照，用过量β-巯基乙醇淬灭包含马来酰亚胺的肽。所得淬灭肽(SPI-30014Q和SPI-70038Q)不能与HSA形成共价缀合物。按照下述制备淬灭衍生物：
将1mg SPI-30014溶于22.0μl DMSO中。将5μl该溶液添加到45μl 53mM β-巯基乙醇水溶液(终浓度47.7mM)中，37℃温育5小时。肽∶β-巯基乙醇的摩尔比率为1∶51，肽终浓度为0.9mM。
类似地将1mg SPI-70038溶于21.4μl DMSO中。将5μl该溶液添加到45μl 53mM β-巯基乙醇水溶液(终浓度47.7mM)中，37℃温育5小时。肽∶β-巯基乙醇的摩尔比率为1∶58，肽终浓度为0.8mM。
实施例4.长效HIV融合抑制剂HSA-肽缀合物的制备。
将1mg SPI-30014溶于22.0μl DMSO中。将10μl该溶液添加到90μl 25％HSA(Seracare)中，37℃温育5小时。最终反应混合物中肽∶HSA的摩尔比率约为1∶4，且肽终浓度为0.9mM。
类似地将1mg SPI-70038溶于21.4μl DMSO中。将10μl该溶液添加到90μl 25％HSA(Seracare)中，37℃温育5小时。最终反应混合物中肽∶HSA的摩尔比率约为1∶4，且肽终浓度为0.8mM。
检测所得HSA-肽缀合物，SPI-30014HSA和SPI-70038HSA，与反应性中间体(SPI-30014和SPI-70038)以及淬灭的非缀合肽(SPI-30014Q和SPI-70038Q)相比的抗病毒和药物代谢动力学概况。
实施例5.评估经修饰和缀合的HIV融合抑制剂肽的抗病毒活性。
如实施例2所述，利用对MT4细胞的细胞毒性测定分析含马来酰亚胺的肽，淬灭的未缀合肽和肽-HSA缀合物对抗HXB2HIV-1的抗病毒效力。这些化合物的IC50值列于表2。反应性和淬灭肽的活性相似。各HSA-肽缀合物的抗病毒活性降低了约3-4倍。
表2.经修饰的肽和缀合物的抗病毒活性
SPI-30014SPI-30014QSPI-30014HSASPI-70038SPI-70038QSPI-70038HSA ～接头-W-M-E-W-D-R-E-I-N-N-Y-T-S-L-I-H-S-L-I-E-E-S-Q-N-Q-Q-E-K-N-E-Q-E-L-L-NH2Q-接头-W-M-E-W-D-R-E-I-N-N-Y-T-S-L-I-H-S-L-I-E-E-S-Q-N-Q-Q-E-K-N-E-Q-E-L-L-NH2HSA-接头-W-M-E-W-D-R-E-I-N-N-Y-T-S-L-I-H-S-L-I-E-E-S-Q-N-Q-Q-E-K-N-Q-E-L-L-NH2～接头-W-X-E-W-D-R-K-I-E-E-Y-T-K-K-I-K-K-L-I-E-E-S-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-K-E-L-K-NH2Q-接头-W-X-E-W-D-R-K-I-E-E-Y-T-K-K-I-K-K-L-I-E-E-S-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-K-E-L-K-NH2HSA-接头-W-X-E-W-D-R-K-I-E-E-Y-T-K-K-I-K-K-L-I-E-E-S-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-K-E-L-K-NH2   IC50(nM)*1.91.27.82.02.57.9
*-2-3个实验的平均值
～接头-指马来酰亚胺基丙酰基氨基乙氧基乙氧基乙酰基
Figure A20048001405500831
Q-接头指用β-巯基乙醇淬灭的马来酰亚胺基丙酰基氨基乙氧基乙氧基乙酰基
Figure A20048001405500832
x-正亮氨酸(非天然氨基酸)
实施例6.评估长效HIV融合抑制剂的药物代谢动力学特性。
向体重介于400-500g的Sprague-Dawley大鼠静脉内施用肽-HSA缀合物(SPI-30014HSA和SPI-70038HSA)和淬灭的、未缀合肽(SPI-30014Q和SPI-70038Q)。测试化合物在DMSO(肽)或磷酸缓冲盐水(HSA-肽缀合物)中配制，并以单剂0.5-0.6umol/kg经静脉内施用；输注速率为2.0ml/分钟；总输注时间为约20秒。给药后5分钟、30分钟、1、2、8、24、48和72小时收集血清样品。用基于细胞的抗病毒生物测定分析大鼠血浆中的抗病毒肽和缀合物浓度。对每个时间点，血清样品最先用生长培养基以1∶10进行稀释，随后用于在上述利用MT4细胞和HIV-1HXB2病毒的标准抗病毒测定中进行分析的多次连续稀释。测定IC50值，并表示为抑制50％的HIV-1 HXB2细胞毒性活性所需的样品血清百分数。制备了包含用培养基稀释10倍的前剂量(predose)的相应动物血清的参考样品。向该稀释样品中添加了设定浓度的溶于含水DMSO中的肽或肽-HSA缀合物。之后以与测试时间点样品相同的方式在抗病毒测定中分析该样品。测定了IC50参考值，并表示为肽或肽-HSA缀合物浓度。然后根据从来自相应动物血清的参考样品获得的IC50值计算各测试时间点血清样品中的肽或肽-HSA缀合物浓度：
浓度(nM)＝[IC50参考(nM)/IC50(％样品血清)]×100％
大鼠血浆中的测试化合物浓度对时间概况示于附图2和3(2-3只大鼠的平均值)。未缀合的(对照)肽显示快速廓清概况：8小时时丢失80％的肽。相反，两种HSA-肽缀合物的最终半衰期在12至14小时间变化。HSA-肽缀合物的半衰期类似于在啮齿类动物中报道的单独HSA的半衰期(15.8小时)(1).1.M.Gaizutis，Pesce A.J.，Pollak V.E.1975，Renal clearance of human and rat albumins in therat，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.148(4)：947-952。
这些结果显示，抗病毒化合物的半衰期、分布和清除是由掩蔽蛋白(HSA)确定的，而抗病毒活性是由弹头肽确定的。根据缀合物有效生物活性的保持，在动物中血浆活性的延长是预料之外的。后一发现暗示，分子的弹头部分清晰暴露并由此预计在体内将遭受代谢、降解、清除和廓清过程，但是我们的结果暗示其受到保护而免遭这些过程。
实施例7：形成本发明复合物的缀合反应
将10mM马来酰亚胺基丙酰基氨基乙氧基乙氧基乙酰基衍生的抗病毒肽在DMSO中的溶液加入到25％HSA水溶液中。反应混合物中的最终肽浓度为1mM，反应混合物中的肽∶HSA摩尔比为1∶4。将溶液在37℃下温育5小时。一旦完成温育，立即将缀合物于4℃保存。
实施例8：形成本发明复合物的缀合反应
将10mM反-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羰基衍生的抗病毒肽在DMSO中的溶液加入到25％HSA水溶液中。反应混合物中的最终肽浓度为1mM，反应混合物中的肽∶HSA摩尔比为1∶4。将溶液在37℃下温育5小时。一旦完成温育，立即将缀合物于4℃保存。
实施例9：形成本发明复合物的缀合反应
将10mM N-(3-{2-[2-(3-氨基-丙氧基)-乙氧基]-乙氧基]-乙氧基}-丙基)-2-溴乙酰胺衍生的抗病毒肽在DMSO中的溶液加入到25％HSA水溶液中。反应混合物中的最终肽浓度为1mM，反应混合物中的肽∶HSA摩尔比为1∶4。将溶液在37℃下温育5小时。一旦完成温育，立即将缀合物于4℃保存。
实施例10：形成本发明复合物的缀合反应
将10mM马来酰亚胺基丙酰基氨基乙氧基乙氧基乙酰基衍生的抗病毒肽在DMSO中的溶液加入到25％HSA水溶液中。反应混合物中的最终肽浓度为1mM，反应混合物中的肽∶HSA摩尔比为1∶1。将溶液在37℃下温育5小时。一旦完成温育，立即将缀合物于4℃保存。
实施例11：形成本发明复合物的缀合反应
将10mM马来酰亚胺基丙酰基氨基乙氧基乙氧基乙酰基衍生的抗病毒肽在DMSO中的溶液加入到25％HSA水溶液中。反应混合物中的最终肽浓度为1mM，反应混合物中的肽∶HSA摩尔比为10∶1。将溶液在37℃下温育5小时。一旦完成温育，立即将缀合物测定实施例：
实施例12：HIV融合肽基抑制剂的结合测定
用N-末端包含GCN4片段和C-末端包含来自HIV-1GP41第一个七价物重复区域的17个残基的嵌合肽(IQN17)来测量HIV融合缀合抑制剂的结合亲和力(Cell 99，103-115)。对一个来自GP41第二个七价物重复重复区域的28-残基肽(C28)用荧光分子Alexa-430(Molecular Probes)在其羧基末端进行标记。通过用IQN17滴定标记的C28来测量结合。用毛细管区带电泳测量结合的和未结合的C28的浓度。在3μM C28和8μm IQN17处，约80％C28与IQN17结合。对于未标记肽，竞争掉50％C28的IQN17量为其IC50值。
肾素抑制剂化合物和复合物
本发明涉及可用于与蛋白反应以形成共价连接的复合物的生物活性化合物，其中发现所得复合物在体内表现肾素抑制活性。更确切地说，该复合物是含有肾素抑制剂和连接基团的分离的复合物，且血液成分是比如清蛋白这样的蛋白。本发明还提供抑制体内肾素活性的方法，包括向哺乳动物宿主血流中施用本发明的新的分离的复合物。
在一种实施方案中，提供含有纯化的本发明肾素抑制剂复合物作为活性成分的药物组合物。本发明的药物组合物任选地含有0.001％-100％的本发明的一或多种肾素抑制剂复合物。这些药物组合物可以通过各种本领域已知的用于向血流中施用生物活性试剂的方法进行施用或共同施用。在本发明的一个优选方面，这些组合物可以通过注射施用。在另一个优选方面，这些组合物可以通过输注施用。
在另一种实施方案中，提供了用于送递含有生物活性试剂，尤其是比如肾素抑制剂这样的治疗剂的分离的缀合复合物的方法和组合物，其中含有试剂的复合物与非缀合试剂相比在血流中具有更长的半衰期。
本发明包括利用与连接基团共价附着或连接的生物活性化合物，该连接基团含有至少一个能够与蛋白上的官能团形成共价键的化学反应部分。通过在将该复合物施用到宿主血液中，尤其是宿主血流中之前制备分离的复合物，产生了与非缀合生物活性试剂相比在血流中保持更长时间段的有效治疗效应的生物活性复合物。
在一种实施方案中，本发明提供一种式I或式II的分离的复合物：
             [(Ih)m-L1]n-Pr        I
             Ih-[L2-(Pr)o]p        II
其中：
m是一个1～5的整数；
n是一个1～100的整数；
o是一个1～5的整数；
p是一个1～100的整数；
Ih是肾素抑制剂；
L1和L2是使Ih共价连接于Pr的多价接头，或者L1和L2缺失；
Pr是蛋白；和
其中该复合物具有体内肾素抑制活性。
在另一种实施方案中，肾素抑制剂Ih是一种肽。在另一种实施方案中，肽的质量小于约60kDA。在另一种实施方案中，肽的质量小于约10kDA。在又一种实施方案中，肽的质量小于约1000DA。
在一种特定实施方案中，该肽是肽模拟物。在另一种实施方案中，该肽是C-末端的过渡态模拟物。
在一种实施方案中，C-末端的过渡态模拟物选自：
在另一种实施方案中，Ih是一种选自下述的肾素抑制剂肽：
Iva-Val-Val-Sta-Ala-Sta，Boc-Phe-His-Sta-Ile-AMP，Boc-Phe-His-Sta-Ala-Sta-OMe，Boc-Phe-His-Sta-Leu-NHCH2Ph，Boc-Phe-His-ACHPA-Leu-AMB，Boc-Phe-His-Sta-Leu-AMB，Boc-Pro-Phe-His-Sta-Ile-AMP，Iva-Phe-Nle-Sta-Ala-Sta，Iva-His-Pro-Phe-His-Sta-Ala-Sta，Iva-His-Pro-Phe-His-Sta-Leu-Phe-NH2，Ac-His-Pro-Phe-Val-Sta-Leu-Phe-NH2，Ac-His-Pro-Phe-His-ACHPA-Leu-Phe-NH2，Ac-Trp-Pro-Phe-His-Sta-Ile-NH2，Ac-(HCO-Trp)-Pro-Phe-His-Sta-Ile-NH2，Pro-His-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-D-Lys，Pro-His-Pro-Phe-His-Sta-Ile-Phe-NH2，Z-Arg-Arg-Pro-Pbe-His-Sta-Ile-His-Lys(Boc)-OMe，Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys，His-Pro-Phe-His-Leu-D-Leu-Val-Tyr-OH，Pro-His-Pro-Phe-His-Leu(CH2NH)Val-Ile-His-Lys(H-142)，Boc-Phe-His-Cha-(CH2NH)Val-NH2(S)-Me(Bu)，Pro-His-Pro-Phe-His-Leu-Phe-Val-Tyr-OH，Boc-His-Pro-Phe-His-Leu(CH(OH)CH2)Val-Ile-His OH (H-261)和PEC-Phe-His-ACHPA-ILeNHC(CH2OH)2CH3。
在另一种实施方案中，Ih是一种选自下述的肾素抑制剂肽：
Iva-Val-Val-Sta-Ala-Sta，Boc-Phe-His-Sta-Ile-AMP，Boc-Phe-His-Sta-Ala-Sta-OMe，Boc-Phe-His-Sta-Leu-NHCH2Ph，Boc-Phe-His-ACHPA-Leu-AMB，Boc-Phe-His-Sta-Leu-AMB，Boc-Pro-Phe-His-Sta-Ile-AMP，Iva-Phe-Nle-Sta-Ala-Sta，Iva-His-Pro-Phe-His-Sta-Ala-Sta，Iva-His-Pro-Phe-His-Sta-Leu-Phe-NH2，Ac-His-Pro-Phe-Val-Sta-Leu-Phe-NH2，Ac-His-Pro-Phe-His-ACHPA-Leu-Phe-NH2，Ac-Trp-Pro-Phe-His-Sta-Ile-NH2，Ac-(HCO-Trp)-Pro-Phe-His-Sta-Ile-NH2，Pro-His-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-D-Lys，Pro-His-Pro-Phe-His-Sta-Ile-Phe-NH2，Z-Arg-Arg-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-Lys(Boc)-OMe，Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys，His-Pro-Phe-His-Leu-D-Leu-Val-Tyr-OH，Pro-His-Pro-Phe-His-Leu(CH2NH)Val-Ile-His-Lys(H-142)，Boc-Phe-His-Cha-(CH2NH)Val-NH-2(S)-Me(Bu)，Pro-His-Pro-Phe-His-Leu-Phe-Val-Tyr-OH，Boc-His-Pro-Phe-His-Leu(CH(OH)CH2)Val-Ile-His-OH (H-261)和PEC-Phe-His-ACHPA-ILeNHC(CH2OH)2CH3，
且Pr是清蛋白。
在一种特定实施方案中，接头L1或L2含有至少两个使Ih与Pr共价连接的官能团。在另一种实施方案中，接头L1或L2在人血清中保持更长时间段的水解稳定性。尤其是，该接头是足够水解稳定的，从而当活性缀合物向受试者施用后，它可以使血压在延长的时间段内持续降低。在特定实施方案中，接头足够稳定，从而使得缀合物能够产生1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长、或14天或更长的血压持续降低。在又一种实施方案中，接头L1或L2在人血清中是稳定的，其半衰期介于8小时至30天之间。
在本发明的另一种实施方案中，接头L1或L2是选自酰氧甲基酮、氮丙啶、重氮甲基酮、环氧化物、碘-、溴或氯乙酰胺、α-卤代酯、α-卤代酮、锍、氯乙基硫化物、O-烷基异脲、烷基卤化物、乙烯基砜、丙烯酰胺、丙烯酸酯、乙烯基吡啶、有机金属化合物、芳基二硫化物、硫代磺酸酯、醛、腈、α-二酮、α-酮酰胺、α-酮酸酯、二氨基酮、缩氨基脲和二酰肼的化合物的衍生物。
在一种实施方案中，接头L1或L2是选自叠氮苯甲酰酰肼、N-[4-(对叠氮水杨基氨基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫代)丙酰胺)、辛二酸二磺基琥珀酰亚胺酯、己二亚氨酸二甲酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、N-y-马来酰亚胺基丁酰氧琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯、[4-叠氮苯基]-1，3′-二硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯、[4-碘乙酰]氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、戊二醛、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺-苯甲酰-琥珀酰亚胺、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺基丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺、异氰酸酯、硫代酸酯、硫羰羧酸酯、亚氨酸酯、碳二亚胺、酐和碳酸酯的化合物的衍生物。
在本发明的一种特定实施方案中，蛋白选自红细胞、免疫球蛋白，比如IgM和IgG、血清清蛋白、运铁蛋白、p90和p38。在另一种特定变形中，蛋白是清蛋白。在另一种变形中，清蛋白是在干物质基础上纯度至少为10％的HSA或重组HSA。在又一种变形中，连接是与人清蛋白的Cys-34的连接。在又一种另外的变形中，连接是与人清蛋白的赖氨酸的连接。
在一种实施方案中，本发明提供式I或式II的复合物，其中m是1，n是1或2，且蛋白是HSA或重组HSA。在上述实施方案的另一种变形中，n是1，蛋白是HSA或重组HSA，且其中的复合物进一步纯化至至少30％的纯度。在又一种另外的变形中，m是1，n是2，且蛋白是HSA或重组HSA。
在一种变形中，通过将化学计量比的(Ih)m-L1与Pr或化学计量比的Ih与L2-(Pr)o组合来制备复合物。在另一种变形中，通过将Pr混合物与(Ih)m-L1以至少约1.3∶1的比率组合来制备复合物。
在另一种实施方案中，本发明提供式I或式II的复合物，其中L1和L2缺失，且其中通过形成活化的Ih中间体、之后使该活化的Ih中间体与Pr缩合来制备复合物。在另一种变形中，从混合的酐或N，N′-羰基二咪唑试剂制备活化的Ih中间体。任选地，在上述变形中，该复合物进一步被纯化至至少约30％的纯度。
在本发明的一种实施方案中，肾素抑制剂是质量小于约1000DA的肽模拟物。
在另一种实施方案中，提供一种含有式I或式II的复合物以及生理学可接受载体的组合物。在另一种实施方案中，将上述组合物配制用于肠胃外途径施用。在另一种实施方案中，上述组合物选自溶液、在使用前与溶剂组合的干燥产物、悬浮液、乳剂和液体浓缩物。
在另一种实施方案中，本发明提供一种体内抑制肾素活性的方法，所述方法包括：
向哺乳动物宿主血流中施以分离的式I或式II的缀合复合物，其中该复合物是通过将肾素抑制剂与具有至少一个能够与蛋白反应从而形成稳定共价键的反应官能团的接头附着形成的；和
将其中的分离的缀合复合物以与非缀合的肾素抑制剂相比能够在血流中维持更长时间段的有效治疗效应的量施用。
在一种变形中，本发明提供一种其中的复合物是本发明上述复合物中的任何一种的方法。在上述方法另一种变形中，蛋白是HSA或重组HSA。
在上述方法的一种变形中，含有一个反应性官能团的接头是选自酰氧甲基酮、氮丙啶、重氮甲基酮、环氧化物、碘-、溴-或氯乙酰胺、α-卤代酯、α-卤代酮、锍、氯乙基硫化物、O-烷基异脲、烷基卤化物、乙烯基砜、丙烯酰胺、丙烯酸酯、乙烯基吡啶、有机金属化合物、芳基二硫化物、硫代磺酸酯、醛、腈、α-二酮、α-酮酰胺、α-酮酸酯、二氨基酮、缩氨基脲和二酰肼的化合物。
在一种变形中，本发明提供一种体内抑制肾素活性的方法，所述方法包括：
以足以提供有效量肾素抑制的量向哺乳动物宿主血流中施以式I或式II的复合物；
由此与未结合的肾素抑制剂的寿命相比，所述复合物更长时间段地保留在血流中。
在又一种实施方案中，提供一种抑制宿主中肾素活性的方法，所述方法包括：
a)制备化合物Ih-L1或Ih-L2，其中Ih是质量小于60kD的肾素抑制剂肽，和L1或L2是与Ih共价结合的接头；
b)用分离的蛋白将化合物Ih-L1或Ih-L2转体内处理一段足以使化合物Ih-L1或Ih-L2与该蛋白共价结合从而形成式I或式II的蛋白复合物的时间，和
c)向宿主施用该经过处理的蛋白复合物。
在上述方法的一种变形中，蛋白是清蛋白。在另一种变形中，清蛋白是HSA或重组HSA。在上述方法的又一种另外的变形中，清蛋白在用化合物Ih-L1或Ih-L2处理前获自血液、纯化和分离自血液。在另一种变形中，清蛋白是被纯化至至少为在干物质基础上10％的纯度水平。在又一种另外的变形中，清蛋白被纯化至大于95％的纯度水平。
在另一种实施方案中，本发明提供一种抑制宿主中肾素活性的方法，所述方法包括：
a)制备化合物Ih-L1或Ih-L2，其中Ih是质量小于60kD的肾素抑制剂肽，和L1或L2是与Ih共价结合的接头；
b)用一或多种分离的蛋白Pr将化合物Ih-L1或Ih-L2转体内处理一段足以使化合物Ih-L1或Ih-L2与该一种或多种分离的蛋白共价结合从而形成一或多种修饰的式I或式II的蛋白复合物的时间，和
c)向宿主施用该一种或多种修饰的蛋白。
在上述方法的一种变形中，蛋白是清蛋白。在另一种变形中，清蛋白在用化合物Ih-L1或Ih-L2处理前获自血液、纯化和分离自血液。在该方法的又一种另外的变形中，清蛋白是HSA或重组HSA。
在一种实施方案中，提供含有治疗有效量的上述复合物、或其生理可接受盐、以及药学可接受载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。在另一种变形中，提供降低受试者血压的方法，包括向受试者施用治疗有效量的上述组合物。在又一种另外的变形中，本发明提供上述方法，其中患者患有高血压。在上述方法的又一种另外的变形中，患者患有轻度、中度或严重高血压。
在本发明的另一种实施方案中，过渡态模拟物是下式的化合物：
Figure A20048001405500931
其中：
R选自(C1-10)烷基、(C6-12)环烷基、羰基(G1-10)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基，各为取代的或未取代的；和
R′选自：(C1-10)烷基、(C6-12)环烷基、羰基(C1-10)烷基、(C1-10)烷氧羰基、(C1-10)烷基氨基羰基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基、烷基磺酰基(C1-10)烷基、芳基磺酰基(C1-10)烷基、杂芳基磺酰基(C1-10)烷基、(C1-10)烷基膦酸酯和(C1-10)烷基膦酰基，各为取代或未取代的。
在另一种实施方案中，过渡态模拟物是下式的化合物：
其中：
R选自(C1-10)烷基、(C6-12)环烷基、羰基(C1-10)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、(C2-12)链烯基、(C2- 12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基，各为取代的或未取代的；和
R″选自(C1-4)烷基、(C6-12)环烷基、杂环烷基、二环烷基、羰基(C1-10)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、氨基、亚氨基(C1-3)烷基、(C1-10)烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基、(C9-12)二环芳基、杂(C8-12)二环芳基、氨基磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基(C1-10)烷基、芳基磺酰基、芳基磺酰基(C1-10)烷基、杂芳基磺酰基、杂芳基磺酰基(C1-10)烷基、膦酸酯、(C1-10)烷基膦酰基、磺酰基基团和亚磺酰基基团，各为取代或未取代的。
在又一种实施方案中，过渡态模拟物是下式的化合物：
Figure A20048001405500941
其中：
R选自(C1-10)烷基、(C6-12)环烷基、羰基(C1-10)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、(C2-12)链烯基、(C2- 12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基，各为取代的或未取代的；和
R″选自(C1-4)烷基、(C6-12)环烷基、杂环烷基、二环烷基、羰基(C1-10)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、氨基、亚氨基(C1-3)烷基、(C1-10)烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基、(C9-12)二环芳基、杂(C8-12)二环芳基、氨基磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基(C1-10)烷基、芳基磺酰基、芳基磺酰基(C1-10)烷基、杂芳基磺酰基、杂芳基磺酰基(C1-10)烷基、膦酸酯、(C1-10)烷基膦酰基、磺酰基基团和亚磺酰基基团，各为取代或未取代的。
在另一种实施方案中，过渡态模拟物是下式的化合物：
R选自(C1-10)烷基、(C6-12)环烷基、羰基(C1-10)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、(C2-12)链烯基、(C2- 12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基，各为取代的或未取代的；和
R″选自(C1-4)烷基、(C6-12)环烷基、杂环烷基、二环烷基、羰基(C1-10)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、氨基、亚氨基(C1-3)烷基、(C1-10)烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基、(C9-12)二环芳基和杂(C8-12)二环芳基，各为取代或未取代的。
本发明涉及可用作肾素抑制剂的、与非缀合肾素抑制剂相比具有更长寿命的化合物和组合物。
本发明包括利用与连接基团共价附着或连接的生物活性化合物，该连接基团含有至少一个能够与蛋白上的官能团形成共价键的化学反应部分。在一种实施方案中，蛋白是清蛋白。通过在将该复合物施用到宿主血液中，尤其是宿主血流中之前转体内制备分离的复合物，该生物活性复合物与非缀合生物活性试剂相比在血流中保持更长时间段的有效治疗效应。
有效剂量的延长的寿命通常为至少2天、更优选至少5天、甚至更优选至少10天、和最优选至少15天。可以缀合的蛋白包括红细胞、比如IgM和IgG这样的免疫球蛋白、血清清蛋白、运铁蛋白、p90和P38。在一种优选实施方案中，蛋白是清蛋白。在另一种实施方案中，蛋白是重组清蛋白。
大量生物活性试剂或治疗剂可用作与蛋白的缀合物。在一种优选实施方案中，生物活性或治疗剂Ih是一种肾素抑制剂。该肾素抑制剂，可以用Ih表示，含有一个或多个官能团，所述官能团能够与连接基团(以L1或L2表示)反应从而形成能够与一或多个蛋白Pr反应的抑制剂-连接基团化合物Ih-L1或Ih-L2。在一种实施方案中，蛋白具有许多不同的可以与抑制剂-连接基团化合物反应形成式I的复合物的官能团：
              [(Ih)m-L1]n-Pr           I
在另一种实施方案中，蛋白具有许多不同的可以与抑制剂-连接基团化合物反应形成式II的复合物的官能团：
            Ih-[L2-(Pr)o]p           II
其中Ih是一种生物活性试剂，L1和L2是将Ih与Pr相连的连接基团，Pr是一种血液成分，m和o是1～5的整数，以及n和p是1～100的整数。
在比如清蛋白这样的蛋白上有许多官能团。非限制性官能团包括氨基基团、羧基基团和硫基团。尽管蛋白上的这些官能团中的任何一个都可用于与连接基团形成共价键，但根据连接基团和接头上的官能团的性质，特定的官能团将会优于其它的官能团。例如，胺基团的反应可以形成具有酰胺基团的缀合物，羧基基团可以形成具有酰胺或酯基团的缀合物，硫基团可以形成硫醚或硫代酸酯。
生物活性试剂Ih：
生物活性试剂Ih可以是任何施用给哺乳动物宿主后将引发所需生物学应答和诱导最小免疫应答的化合物，比如酶抑制剂。优选地，生物活性试剂是一种肾素抑制剂。更优选地，该试剂是肽或肽模拟物肾素抑制剂。大量的肾素抑制剂可用于本发明。肽或肽模拟物肾素抑制剂的非排他性例子示于表中。优选地，肾素抑制剂是质量小于约60kDA、更优选小于约10kDA、以及最优选小于约1000DA的肽模拟物。
表：肽或肽模拟物肾素抑制剂
抑制剂   IC50(nM)人血浆肾素 参考文献
  Iva-Val-Val-Sta-Ala-Sta(胃酶抑制剂)   14000   JMC 1152(86)
  Boc-Phe-His-Sta---Ile-AMP   6   JMC 1837(87)
  Boc-Phe-His-Sta---Ala-Sta-OMe   27   JMC 1152(86)
  Boc-Phe-His-Sta---Leu-NHCH2Ph   26   JMC 1853(87)
  Boc-Phe-His-ACHPA---Leu-AMB   1   JMC 1918(88)
  Boc-Phe-His-Sta---Leu-AMB   9   JMC 1918(88)
  Boc-Pro-Phe-His-Sta---Ile-AMP   4.1   JMC 671(88)
  Iva-Phe-Nle-Sta-Ala-Sta   28   JMC 1152(86)，JMC 2287(87)
  Iva-His-Pro-Phe-His-Sta---Ala-Sta   1.9(Ki)
  Iva-His-Pro-Phe-His-Sta---Leu-Phe-NH2   3   JMC 1853(87)，JMC2080(90)，Nature 81(83)
  Ac-His-Pro-Phe-Val-Sta---Leu-Phe-NH2   3.2   JMC 1679(88)
  Ac-His-Pro-Phe-His-ACHPA---Leu-Phe-NH2   0.5   JMC 1679(88)
  Ac-TrP-Pro-Phe-His-Sta---Ile-NH3   1.6   JMC 18(88)
  Ac-(HCO-TrP)-Pro-Phe-His-Sta---Ile-NH2   0.1   JMC 18(88)
  Pro-His-Pro-Phe-His-Sta---Ile-His-D-Lys   26   JMC 1377(88)
  Pro-His-Pro-Phe-His-Sta---Ile-Phe-NH2   3   JMC 1287(87)
  Z-Arg-Arg-Pro-Phe-His-Sta---Ile-His-Lys(Boc)-OMe   1   JMC 18(88)，Hypertension 797(85)
  Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys(RIP)   5200   JMC 1287(87)，PNAS.5476(80)，Tetrahedron661(88)
  His-Pro-Phe-His-Leu-D-Leu-Val-Tyr-OH   --   Biochemistry 3877(73)
  Pro-His-Pro-Phe-His-Leu(CH2NH)Val-Ile-His-Lys(H-142)   10   JMC 671(88)，BiochemSoc Trans1029(85)；Szelke review
  Boc-Phe-His-Cha-(CH2NH)Val-NH-2(S)-Me(Bu)   8.6   BBRC 982(86)
  Pro-His-Pro-Phe-His-Leu-Phe-Val-Tyr-OH   --   Biochemistry 3892(75)
  Boc-His-Pro-Phe-His-Leu(CH(OH)CH2)Val-Ile-His-OH(H-261)   0.7   Szelke review
  PEC-Phe-His-ACHPA-ILeNHC(CH2OH)2CH3   ＜0.01   J.Hypertens.S23(87)
uAMP＝2-氨基甲基吡啶
AMB＝3-氨基甲基苄胺
接头L1和L2：
多种不同的接头或连接基团L1和L2可用于连接血液成分与肾素抑制剂。该连接基团可以是二价的或者是多价的。例如，在式I的复合物中，L1与Pr附着时可以是n价的，L1与Ih附着时可以是m价的，其中m和n是如上述定义的整数。类似地，在式II的复合物中，L2与Pr附着时可以是o价的、L2与Ih附着时可以是p价的，其中o和p是如上述定义的整数。可以出现在上述连接基团中的官能团的非排他性例子包括，具有羟基基团的化合物，比如N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺，以及其它化合物，比如马来酰亚胺-苯甲酰-琥珀酰亚胺、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺基丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺、异氰酸酯、硫代酸酯、硫羰羧酸酯、亚氨酸酯、碳二亚胺、酐或酯。
此外，可以使用带有比如羧酸酯、酰基卤、叠氮、重氮、碳二亚胺、酐、肼、醛、巯基或氨基基团这样的官能团的特定连接基团来形成酰胺、酯、亚胺、硫醚、二硫化物、取代胺等。其它可以使用的官能团的特定例子包括酰氧甲基酮，氮丙啶，重氮甲基酮，环氧化物，碘-、溴-或氯乙酰胺，α-卤代酯，α-卤代酮，锍，氯乙基硫化物，O-烷基异脲，烷基卤化物，乙烯基砜，丙烯酰胺，乙烯基吡啶，有机金属化合物，芳基二硫化物，硫代磺酸酯，醛，腈，α-二酮，α-酮酰胺，α-酮酸酯，二氨基酮，缩氨基脲和二酰肼。
可选择作为接头的化合物的本质和类型依赖于在肾素抑制剂、接头和清蛋白和血液成分上的官能团间所期望的反应类型、相关反应性、选择性、可逆性和稳定性特征。例如，形成缀合复合物的特定反应源自烷基化反应，迈克尔类型加成反应，加成-消除反应，硫、羰基或氰基的加成，或金属键的形成。
一般地，从这些反应形成的共价键在肾素抑制剂的活性寿命过程中是稳定的。在一种实施方案中，除非生物活性亚单位要在活性位点释放，在这些复合物中形成的共价键保持稳定。
接头可以由具有将比如清蛋白这样的蛋白与多个肾素抑制剂相连接或者将多个清蛋白与单个肾素抑制剂相连接的双官能团或多官能团的化合物组成。在一种特定优选实施方案中，接头含有将HSA与一或多个肾素抑制剂相连接的多官能团。在一种实施方案中，如本文所使用的连接化合物包括任何一种能够在一步中将肾素抑制剂与蛋白相连接的化合物。在另一种实施方案中，首先将连接化合物与肾素抑制剂连接以形成可进一步与蛋白反应的抑制剂-接头中间体。在另一种实施方案中，连接化合物首先与蛋白反应从而形成能够进一步与肾素抑制剂反应的蛋白-接头中间体。在上述各排列中，任选地，连接的化合物在用于进一步反应以形成式I或式II的复合物之前可经进一步纯化和/或分离。
这样的多官能团化合物的非排他性例子包括具有至少一个选自叠氮苯甲酰酰肼、N-[4-(对叠氮水杨基氨基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫代)丙酰胺)、辛二酸二磺基琥珀酰亚胺酯、己二亚氨酸二甲酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯、[4-叠氮苯基]-1，3′-二硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯、[4-碘乙酰]氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、戊二醛和4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的官能团的化合物。
可以使用，任何便于使用和接受标准化学转化的接头或连接基团，或形成所需剂量生理可接受、且可在血流中稳定所需时间段的化合物的接头。该连接基团可以是脂族、脂环族、芳族、杂环或其组合。可以用作连接基团的基团的例子包括亚烷基、亚芳基、芳亚烷基、环亚烷基、聚醚等。在一种特定实施方案中，也可以使用多官能聚乙二醇(PEG)及其衍生物作为接头。
连接基团在连接链中可以具有至少一个原子，更优选在链中有1至200个原子，最优选链中有2至50个原子。链中的原子可以是线性的，或者该链可以是一或多个环的部分，分别为取代或非取代的，且该链可以包括碳原子或选自O、N、P和S的杂原子。环可以是脂族的、杂环的、芳族的或杂芳族的或其混合物，分别为取代或非取代的。在一些实施方案中，可以用氨基酸或肽或利用了上述混合物的氨基酸作为连接基团。
在一种实施方案中，L1缺失，且Ih直接附着于Pr。在另一种实施方案中，L2缺失，且Ih直接附着于Pr。
在式I复合物的另一种实施方案中，L1是一种能够将多于一个的Ih与一个Pr相连的连接基团，例如，其中m是2或更多。在一种实施方案中，m是1、2或3，且n是1-30。在式I复合物的一种优选实施方案中，Pr是清蛋白，且n是1。在另一种实施方案中，Pr是清蛋白，Ih是一种肾素抑制剂，且n是2-25。
在式II的复合物的另一种实施方案中，L2是一种能够将多于一个的Pr与一个Ih相连的连接基团，例如，其中o是2或更多。在一种实施方案中，Pr是清蛋白，Ih是一种肾素抑制剂，o是1、2或3，且p为1-5。
在另一种实施方案中，当比如肾素抑制剂这样的抑制剂能够直接与蛋白反应时(任选地利用催化剂或偶联剂)，连接基团可以缺失，由此所形成的复合物仅含有直接与蛋白附着的肾素抑制剂。这样的一种直接偶联反应的例子是中间体混合酐的偶联反应之前的混合酐活化的羧酸的偶联反应。
蛋白成分Pr：
多种血液成分可用于制备本发明的分离的复合物。天然存在的血液成分包括血液蛋白，其包括红细胞，和比如IgM和IgG这样的免疫球蛋白，血清清蛋白，运铁蛋白，p90和p38。在一种优选实施方案中，血液成分或血液蛋白是清蛋白。更优选，该清蛋白是人血清清蛋白(HSA)。
本发明中所使用的清蛋白也可以是重组清蛋白。例如，重组人清蛋白可以通过用编码人血清清蛋白氨基酸序列的核苷酸编码序列转化微生物来制备。
通常，有大量不同的可用于从血液或血浆中分离化合物的方法，所述方法提供了非常大范围的最终纯度和产物产量。清蛋白是存在于血浆中的主要蛋白，且可以从血液中提取，例如在JP 03/258728、EP 428758、EP 452753和6,638,740中、以及其中所引用的参考文献中所公开的。各种化合物分离方法的其它非排它性例子可能基于选择性可逆沉淀、离子交换层析、蛋白亲和层析、疏水层析、亲硫层析(J.Porath等人；FEBS Letters，第185卷，第306页，1985；K.L.Knudsen等人，Analytical Biochemistry，第201卷，第170页，1992)、和各种树脂基质(WO 96/00735；WO 96/09116)。特定纯度的某些血液成分可商业获得。
连接化合物Ih-L1和Ih-L2的制备：
在一种实施方案中，可以制备本发明的连接化合物Ih-L1或Ih-L2并将其用于与清蛋白缀合而无需进一步纯化和/或分离。连接化合物的纯度将依赖于接头的性质、Ih的性质和反应类型以及Ih与接头附着所使用的反应条件。在另一种实施方案中，未纯化的连接化合物以至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，和最优选至少98％的纯度制备并获得。
在一种特定实施方案中，本发明涉及分离的连接化合物，即Ih-L1或Ih-L2的制备方法。在一种优选实施方案中，分离的连接化合物Ih-L1和IhL2是与接头附着的肾素抑制剂。在一种实施方案中，分离的连接化合物在与Pr缀合前可以进行纯化。在另一种实施方案中，连接的化合物Ih-L1或Ih-L2是分离的并以至少95％、优选至少97％、更优选至少98％、和最优选至少99％或更多的纯度纯化。
可以用化学合成领域已知的标准方法制备连接化合物。可以用本领域已知的标准方法纯化化合物，比如柱层析或HPLC，来提供适于体内应用的纯化产物。连接化合物可进一步与比如清蛋白这样的蛋白缀合以形成式I和II的复合物。
制备连接化合物Pr-L1和Pr-L2：
对于本发明的特定用途，用Pr表示的化合物可以是清蛋白，可以以不经进一步纯化和分离而直接按照从商业途径获得的形式用于制备连接化合物Pr-L1和Pr-L2。在一种特定实施方案中，Pr是HSA。在另一种实施方案中，清蛋白可以用本文所公开的本领域已知的各种方法进一步纯化。
在一种实施方案中，可以通过在溶液中用Pr处理可以被衍生或活化的接头L1或L2、并监控反应混合物直至反应充分完成来制备连接化合物Pr-L1和Pr-L2。在一种特定优选实施方案中，Pr是蛋白。在另一种优选实施方案中，蛋白是HSA或重组HSA。
在另一种优选实施方案中，所获得的连接化合物Pr-L1或Pr-L2是基本纯的；即，该连接化合物以至少10％，优选至少30％，及更优选至少50％的纯度获得。若Pr为HSA或重组HSA，则可以与连接化合物共存的成分可以由未反应HSA和各种存在于HSA起始材料中的生物成分组成。优选地，HSA或重组HSA为在干物质基础上至少10％纯度的。
与连接化合物共存的过量HSA或HSA相关生物材料不会显著干扰随后的与Ih缀合的步骤。此外，相关生物材料和缀合的复合物对于体内应用在药理学上也是安全的。
然而，在特定实施方案中，连接化合物Pr-L1或Pr-L2的纯度可以是在干物质基础上的至少10％，以使得化合物与Ih的选择性反应能够发生而没有显著量的干扰或不形成从与其它非所需血液成分发生的缀合反应获得的不需要的副产物。然而，比如HSA或重组HSA这样的Pr的所需纯度，例如，依赖于Ih上的官能团以及所使用的接头上的官能团的性质。一般地，如果接头上的官能团比该接头上反应性较弱的官能团更具反应性且可能形成不需要的副产物，则需要更高纯度的HSA或重组HSA。
清蛋白可以从宿主的血浆或血液清蛋白中获得、纯化至所需的纯度水平、并与接头连接。可以利用本领域已经成分确立的清蛋白纯化标准方法来完成清蛋白从血液或血浆的纯化。利用纯化的血液清蛋白，本发明的分离的复合物将由相对均一的功能化蛋白群体组成。
式I或式II复合物的制备：
在一种实施方案中，可以通过Ih-L1或Ih-L2与Pr的缀合、Pr-L1或Pr-L2与Ih的缀合、或Ih与Pr的缀合从而形成其中缺失了接头的复合物来制备式I或式II的复合物。
在一种实施方案中，在一定条件下，使Ih-L1或Ih-L2溶液与Pr组合，从而缀合反应必定完成。在一种特定实施方案中，连接化合物是与接头附着的肾素抑制剂，并将该连接化合物加入到HSA水溶液中。温育所得溶液直到反应基本完成。
在一种实施方案中，将Ih-L1或Ih-L2与过量HSA组合以确保缀合反应选择性地在HSA上的单一位点进行。例如，Ih-L1在HSA上单一位点处的形成使得式I的单一复合物易于鉴定，例如，当n为1时。在一种特定实施方案中，Ih-L1或Ih-L2与HSA的缀合反应发生在HSA的单个半胱氨酸上。不限于任何特定理论，对于一些反应，据信缀合反应还可以最先发生在一个半胱氨酸-SH基团上以形成一个动力学产物，该产物然后重排至另一个比如赖氨酸这样的氨基酸官能团，从而形成热力学产物。
在另一种实施方案中，缀合反应可以形成式I的复合物，例如，其中多于一个Ih与单个HSA连接形成式I的复合物；即，其中n大于1。任选地，如果接头L1是能够与多于一个Ih基团缀合的多官能接头，则m可以大于1。在一种实施方案中，可以通过将相对于(Ih)m-L1过量的Pr进行组合来制备式I的复合物。优选地，Pr与(Ih)m-L1的比率约为50至100。在另一种实施方案中，该比率为约10至30。在另一种特定实施方案中，该比率为约2至5。
在一种实施方案中，将Pr以至少约1.1∶1的比率加至(Ih)m-L1，更优选至少约1.2∶1，和最优选至少约1.4∶1。对于Pr是清蛋白的情况，优选比率基于这一假设：对于每个清蛋白存在0.7个游离巯基。优选地，所得复合物为以1∶1形成的复合物，因为比如清蛋白这样的Pr成分只有约70％用于进行缀合的游离巯基官能度。过量Pr，比如HSA或重组HSA，在药理学是安全的，且不需要进一步纯化。当产物混合物中存在过量Pr时，任选地，可以将缀合复合物纯化至至少10％纯度。在一种特定实施方案中，可以将缀合复合物纯化至至少约20％或至少约30％。
在另一种实施方案中，式I的复合物可以通过将相对于Pr过量的(Ih)m-L1进行组合来制备。优选地，(Ih)m-L1与Pr的比率为约50至100。在另一种特定实施方案中，该比率为约10至30。在又一种特定实施方案中，该比率为约2至5。若产物混合物中存在过量(Ih)m-L1，则任选地，可以将缀合复合物纯化至至少10％纯度。在一种特定实施方案中，可以将缀合复合物纯化至至少约20％或至少约30％。
在另一种实施方案中，可以以(Ih)m-L1与Pr的化学剂量比率或Ih与L2-(Pr)o的化学剂量比率，即，以1∶1的比率，来制备式I或式II的复合物。任选地，从这些制备获得的产物可以进一步纯化至至少10％纯度。在一种特定实施方案中，可以将缀合复合物纯化至至少约20％或至少约30％的纯度。在又一种实施方案中，可以将1∶1缀合的复合物进一步纯化至大于约90％的纯度。
在另一种实施方案中，在反应前将清蛋白中的缀合半胱氨酸还原为游离半胱氨酸。
任选地，从缀合反应形成的复合物在施用前可以经进一步纯化。
在一种实施方案中，由于存在于复合物中的过量HSA或HSA相关生物材料对于体内使用在药理学上是安全的，所以从缀合反应获得的式I或式II的复合物可以不经进一步加工或纯化而施用。
在上述各实施方案中，Ih是肽或肽模拟物肽肾素抑制剂，且Pr是HSA或重组HSA。
在一种实施方案中，包含保护或未保护的肾素抑制剂与接头和清蛋白的分离的复合物任选地可经进一步纯化及之后转回至宿主。
从本发明的方法形成的复合物可以在动物或人宿主中进行测试，直到生理学、药物代谢动力学和安全性概况在更长的时间段内良好建立。一般地，所测得的复合物半衰期为约5至7天，更一般地是至少约7至10天，以及优选15至20天或更多。通常，持续时间是物种依赖性的。例如，对于人清蛋白，半衰期是约17-19天。根据肾素抑制剂、连接基团的性质以及清蛋白纯度，复合物的有效治疗浓度可能是至少一个月或更多。
可以通过用同位素(例如，131I、125I、Tc、Cr、3H等)或荧光染料标记复合物或化合物以及血管内注射已知量的标记复合物和化合物之后连续测量式I或式II复合物、Ih-L化合物、L-Pr化合物或Ih化合物的全血、血浆或血清水平来测定半衰期。所包括的有：红细胞(半衰期约60天)、血小板(半衰期约4-7天)、血管内层的内皮细胞、和长寿命血清蛋白，比如清蛋白、类固醇结合蛋白、铁蛋白、α2-巨球蛋白、运铁蛋白、甲状腺素结合蛋白、免疫球蛋白，尤其是IgG，等。除优选半衰期外，优选主题成分处于足以使其与治疗有效量的本发明化合物结合的细胞计数或浓度。对于细胞长寿命血液成分，优选至少2,000/μl的细胞计数和至少1μ/ml、通常至少约0.01mg/ml、更常为至少约1mg/ml的血清蛋白浓度。
然而，当复合物的性质经过设计以使得比如肾素抑制剂这样的生物活性试剂Ih得以从复合物上切除并释放到宿主中时，用于复合物和/或生物活性试剂的有效治疗浓度的所需半衰期可能不同于上述测量的半衰期。生物活性试剂的释放速率部分依赖于所释放的生物活性试剂的化合价或官能度、连接基团的性质、蛋白的纯度和类型、用于施用的组合物、施用方式等。因此，当血液环境、血液成分、尤其是酶、在肝脏中的活性、或其它试剂可以导致连接基团的切除和生物试剂以所需速率释放到宿主中时，可以使用各种连接基团和生物试剂。
本发明的分离的复合物提供与非缀合化合物相比具有改进的药物代谢动力学、可溶性、生物利用率、分布和/或免疫原性特征的生物活性化合物。
令人惊讶地是，式I和式II的复合物，当根据本发明的方法制备和使用时，比Ih成分本身提供显著更长时间的有效治疗浓度。此外，本发明的复合物与使用Ih成分本身相比提供改进的可溶性、分布、药物代谢动力学，并导致降低的免疫原性。
本发明人已经惊奇地发现，与通过注射在原位与受体血流中内源清蛋白结合的活化化合物而进行缀合物的体内制备制得的缀合物相比，向受试者施用从纯化成分(尤其是HSA、接头和肾素抑制剂)转体内制备的缀合物产生非常有效的缀合物组织活体内分布。此外，本发明人已经发现，与从体内制备的缀合物所观察到的化合物大量丢失相比，基本上所有的缀合物在施用后在循环中保留数小时或甚至数天。该效率减少了患者必须接受活性物质注射的次数，也减少了单次施用所必须给予的肾素抑制剂的量。
在本发明上下文中，组合物的治疗有效量理解为意指这样一种量：当施用给受试者后，产生的所需生理性效应的程度达到有效治疗患者的疾病、状况或综合征的程度、或有效减轻疾病、状况或综合征症状的程度。尤其是，治疗有效量的抗高血压复合物或组合物理解为意指这样一个量：施用给高血压受试者后，产生所需的收缩压和/或舒张压降低。
分离的式I和式II复合物的施用：
在一种实施方案中，本发明的分离复合物的施用可以用快速灌注来完成，但可以通过利用计量流量等进行输液来随着时间推移缓慢导入。
本发明的复合物可以在生理可接受介质中施用，例如去离子水、磷酸缓冲盐水、盐水、甘露醇、葡萄糖水溶液、乙醇、植物油等。尽管可以进行一次以上注射，但是如果想要的话也可以使用单次注射。该复合物可以通过任何一种便利的方式进行施用，包括注射器、套管针、导管等。无论是单次快速灌注还是持续施用等，特定的施用方式将根据施用量而变化。可以为血管内施用，其中导入位点不是本发明的关键，优选在血流快速的位点，例如静脉内、外周或中央静脉。若施用与缓释技术或保护性基质结合，则可以使用其它途径。
令人惊奇地是，注意到，施用用本发明方法从例如，比如清蛋白这样的分离的血液蛋白制备的分离的复合物，会产生与非缀合肾素抑制剂相比或与不是从比如清蛋白这样的血液蛋白制得的复合物相比，在血流中保持更长时间段的有效治疗效应的肾素抑制剂缀合物复合物。
在一种实施方案中，本发明提供药学可接受盐形式的化合物。
在另一种实施方案中，本发明提供存在于立体异构体混合物中的化合物。在又一种实施方案中，本发明提供作为单一立体异构体的化合物。
在又一种实施方案中，本发明提供含有作为活性成分的化合物的药物组合物。在又一种特定变形中，本发明提供一种药物组合物，其中该组合物是片剂或作为积存施用的固体。在另一种特定变形中，本发明提供一种药物组合物，其中该组合物是适合静脉内或皮下施用的液体制剂。在又一种特定变形中，本发明提供一种药物组合物，其中该组合物是适于肠胃外施用的液体制剂。
应注意到，对于本文所描述或请求保护的所有实施方案以及任何进一步的实施方案、变形或单个化合物来说，除非另行说明，所有这样的实施方案、变形和/或单个化合物意欲包括所有的无论是单一立体异构体或是立体异构体混合物形式的药学可接受盐形式。类似地，若在本文所说明或请求保护的任一实施方案、变形和/或单个化合物中存在一或更多个潜在的手性中心，则两个可能的手性中心都包括在内，除非另行指明。
可以通过修饰后来在体内转化为不同取代基的本发明化合物的取代基来制备本发明化合物的前体药物衍生物。还应注意到，在许多情况中前体药物本身也落入本发明化合物的范围。例如，前体药物可以通过用化合物与氨基甲酰化试剂(例如，1，1-酰氧基烷基氯甲酸酯，对硝基苯基碳酸酯等)或酰化剂反应来制备。制备前体药物的方法的其它例子描述于Saulnier等人(1994)，Bioorganic and MedicinalChemistry Letters，第4卷，p.1985。
还可以制备本发明化合物的被保护衍生物。可以在T.W.Greene，Protecting Groups in Organic Synthesis，第三版，John Wiley&Sons，Inc.1999中找到用于生成保护基团及其除去的技术的例子。
在本发明的方法中，本发明化合物也可以容易地以溶剂合物(例如水合物)制成或形成。通过利用比如二氧杂环己烷、四氢呋喃或甲醇这样的有机溶剂，从水性/有机溶剂混合物中重结晶可以方便地制备本发明化合物的水合物。
如本文所使用的“药学可接受盐”意指包括任何一种以其盐的形式利用的本发明化合物，特别是其中的盐赋予该化合物以与化合物的游离形式或该化合物的不同的盐形式相比改进的药物代谢动力学特性。药学可接受盐形式还可以最初赋予该化合物以所需的、且该化合物以前不具备的药物代谢动力学特性，甚至就该化合物在体内的治疗活性来说可以对该化合物的药物动力学产生正面影响。可以令人满意地受影响的一种药物代谢动力学特性例子是化合物跨细胞膜运输这样一种方式，其依次可以直接和正面影响该化合物的吸收、分别、生物转化和排泄。尽管药物组合物的施用途径是重要的，而且各种解剖学、生理学和病理学因素可以严重影响该化合物的生物利用率，但该化合物的可溶性通常依赖于其所使用的特定盐形式的特征。本领域技术人员将会理解，化合物的水溶液将会提供所治疗的受试者机体对该化合物的最快速的吸收，而脂质溶液和悬浮液、以及固体剂量形式会产生较为不迅速的化合物吸收。
肾素抑制剂用途的适应症
本发明的式I和式II复合物还可用作肾素抑制剂。肾素是一种在血压控制中起重要作用的内肽酶。肾素血管紧张系统是一个多调控蛋白水解级联反应，其中肾素切割蛋白底物血管紧张肽原产生血管紧张肽I。血管紧张肽转化酶(ACE)催化末端二肽从十肽血管紧张肽I上去除从而形成表现有效加压活性的血管紧张肽II。肾素是一种具有高底物特异性的天冬氨酰蛋白酶，它在参与血压控制的肾素-血管紧张肽系统中是第一个水解步骤。肾素抑制剂已经在灵长类[J.Hypertension，1，399(1983)，J.Hypertension 1(suppl 2)、189(1983)]和人类[Lancet II，1486(1983)，Trans.Assoc.Am.Physicians，96，365(1983)，J.Hypertension，3，653(1985)]中显示出降血压作用，并因此可潜在用于控制高血压。
可注射形式
本发明还涉及设计用于通过肠胃外途径施用本发明肾素抑制剂的组合物，通常以通过皮下、肌内或静脉内注射为特征。可注射形式可以制备成任何常规形式，例如制成液体溶液或悬浮液、适于在注射前溶于或悬于液体中的固体形式或制成乳剂。
可与本发明的可注射形式结合使用的赋形剂的例子包括但不限于，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或DMSO。可注射组合物还任选地含有微量比如湿润剂或乳化剂这样的非毒性助剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度提高剂以及其它这样的试剂，比如醋酸钠、失水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸合三乙醇胺和环糊精。本文还预期引入缓释或持续释放系统，由此保持恒定的剂量水平(参见，例如，美国专利第3,710,795号)。这样的肠胃外组合物中所含的活性化合物的百分数高度依赖于其特定性质、以及化合物活性和受试者的需求。
制剂的肠胃外施用包括静脉内、皮下和肌内施用。用于肠胃外施用的制剂包括可用于注射的无菌溶液、比如本文所述的冻干粉末这样的在使用前即可与溶剂组合的无菌干燥可溶产物，包括皮下片剂，可用于注射的无菌悬浮液、在使用前即可与载体组合的无菌干燥可溶产物以及无菌乳剂。溶液可以是水性的或非水性的。
若经静脉内施用，适宜载体的例子包括但不限于，生理盐水或磷酸缓盐水(PBS)、以及包含比如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物这样的增稠剂和增溶剂的溶液。
可以任选地用于肠胃外制剂的药学可接受载体的例子包括但不限于，水性载体、非水性载体、抗微生物试剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、螯合剂(sequesteringagent)或螯合剂以及其它药学可接受物质。
可以任选使用的水性载体的例子包括氯化钠注射液、林格注射液(Ringers Injection)、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖和乳酸化的林格注射液。
可以任选使用的非水性肠胃外载体包括植物起源的固定油类，棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。
可以向肠胃外制剂中添加抑细菌和抑真菌浓度的抗微生物试剂，尤其是当制剂在多剂量容器包装并据此设计为进行保存和被多次移取的等分试样时。可以使用的抗微生物试剂的例子包括苯酚或甲酚、汞制剂、苄醇、氯丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。
可以使用的等渗剂的例子包括氯化钠和葡萄糖。可以使用的缓冲液的例子包括磷酸盐和柠檬酸盐。可以使用的抗氧化剂的例子包括亚硫酸氢钠。可以使用的局部麻醉剂的例子包括盐酸普鲁卡因。可以使用的悬浮剂和分散剂的例子包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯基吡咯烷酮。可以使用的乳化剂的例子包括多乙氧基醚(TWEEN 80)。金属离子的螯合剂(sequestering agent)和螯合剂包括EDTA。
药学载体还任选地包括作为水可混溶载体的乙醇、聚乙二醇和丙二醇和用于调节pH的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
可以调节肠胃外制剂中的肾素抑制剂复合物的浓度以使得一次注射施用足以产生所需药学效应的药学有效量。如同本领域已知的，可以使用的肾素抑制剂复合物的确切浓度和/或剂量将最终依赖于患者或动物的年龄、体重和状况。
单位剂量肠胃外制剂可以在安瓿瓶、小瓶或带有针头的注射器中包装。如本领域已知的和实践的，所有的用于肠胃外施用的制剂都应当是无菌的。
可以将可注射形式设计成适于局部或全身施用。一般地将治疗有效剂量配制成包含施用给受处理组织的肾素抑制剂浓度为至少约0.1％w/w直至最多约90％w/w或更多，优选超过1％w/w。肾素抑制剂复合物可以立即施用，或者被分成多次小剂量按一定时间间隔施用。应当理解，治疗的精确剂量和持续时间是组合物经肠胃外施用的部位、载体以及其它可以利用已知的测试规程根据经验确定或通过外推法从体内或体外测试数据确定的变量的函数。注意到，浓度和剂量值还可以随着受治疗个体的年龄而变化。还应当理解，对于任何特定受试者，可能需要根据个体需要以及实施或控制剂型施用的人的专业调整而随时间调整特定的剂量方案。因此，本文设定的浓度范围意指示例性的，且无意限制所请求保护的制剂的范围或实践。
可以任选地将肾素抑制剂复合物悬于微粉化的其它适宜的形式中，或可以是衍生的从而产生更可溶的活性产物或产生一种前体药物。所得混合物的形式依赖于多种因素，包括想要使用的施用模式和化合物在所选择的载体或媒介中的溶解度。有效浓度足以改善疾病状况的症状并可以根据经验来确定。
这些施用方法各自的适宜制剂可以在，例如，“Remington：TheScience and Practice of Pharmacy”，A.Gennaro，ed.，第20版，(2000)，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA中找到。
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Harrison，M.E.；Baldwin，M.A.；Org.Mass Spectrom.；EN；24；1989；689-693。
β-氯代酮：
Vince，R.；Daluge，S.；J.Med.Chem.；EN；14；1971；35-37。
环氧化物：
Jin，Lixia；Baillie，Thomas A.；Chem.Res.Toxicol.；EN；10；3；1997；318-327。
烯丙基卤：
Jin，Lixia；Baillie，Thomas A.；Chem.Res.Toxicol.；EN；10；3；1997；318-327。
本申请中所引用的所有文献的完整公开内容都引入本文作为参考。
肾素抑制剂实施例
制备肾素抑制剂缀合复合物
可以开发各种用于合成本发明化合物的方法。实施例中提供了合成这些化合物的代表性方法。然而应注意，还可以利用其它人设计的其它合成途径来合成本发明化合物。
可以容易地认识到，特定的本发明化合物具有与赋予该化合物特定立体化学的其他原子(例如，手性中心)相连的原子。可以知道，本发明化合物的合成可以形成不同立体异构体的混合物(对映异构体，非对映异构体)。除非特别指明某一种特定的立体化学，对某一化合物的重复引用意指包括所有不同的、可能的立体异构体。
用于分离不同的立体异构体混合物的各种方法是本领域已知的。例如，可以使化合物的外消旋混合物与光学活性拆解试剂反应从而形成一对非对映异构的化合物。之后可以将该非对映异构体分离以恢复其光学纯的对映异构体。可解离复合物(例如，结晶的非对映异构体盐)也可用于拆解对映异构体。非对映异构体一般具有足够不同的物理特性(例如，熔点、沸点、溶解度、反应性，等)，利用这些差异可以使之易于分离。例如，非对映异构体一般可以通过基于溶解度差异的层析或分离/拆解技术进行分离。可以在Jean Jacques AndreCollet，Samuel H.Wilen，Enantiomers，Racemates and Resolutions，John Wiley&Sons，Inc.(1981)中获得关于可用于从化合物的外消旋混合物中拆解化合物立体异构体的技术的更为详细的说明。
通过将本发明化合物的游离碱形式与药学可接受无机酸或有机酸反应，也可以将本发明的化合物制成药学可接受的酸加成盐。作为选择，通过将本发明化合物的游离酸形式与药学可接受无机碱或有机碱反应，也可以将本发明的化合物制成药学可接受的碱加成盐。适用于制备化合物的药学可接受盐的无机和有机的酸和碱在本申请定义部分已经给出。作为选择，可以利用起始材料或中间体来制备化合物的盐形式。
化合物的游离酸或游离碱形式可以从相应的碱加成盐或酸加成盐形式制备。例如，一个酸加成盐形式的化合物可以通过用适宜的碱(例如，氢氧化铵溶液，氢氧化钠等)进行处理而转变成相应的游离碱。一个碱加成盐形式的化合物可以通过用适宜的酸(例如，盐酸，等)进行处理而转变成相应的游离酸。
化合物的受保护衍生物可以用本领域技术人员已知的方法制备。可以在T.W.Greene，Protecting Groups in Organic Synthesis，第三版，John Wiley&Sons，Inc.1999中找到关于可用于制备和去除保护基团的技术的详细说明。
在本发明的方法中本发明化合物可作为溶剂合物(例如水合物)容易地制成或形成。利用比如二氧芑、四氢呋喃或甲醇的有机溶剂从水性/有机溶剂混合物中重结晶可以容易地制备本发明化合物的水合物。
还可以通过将本发明化合物的外消旋混合物与光学活性拆解试剂反应形成一对非对映异构体化合物、分离非对映异构体并回收光学纯的对映异构体来将本发明化合物制成其其单个的立体异构体。尽管使用化合物的共价非对映异构体衍生物可以完成对映异构体的拆解，但是优选用可解离复合物(例如，结晶的非对映异构体盐)。非对映异构体具有不同的物理特性(例如，熔点、沸点、溶解度、反应性，等)，利用这些差异可以容易地进行分离。非对映异构体可以通过基于溶解度差异的层析或者优选分离/拆解技术进行分离。之后利用任何一种不会产生外消旋作用的实用方法回收光学纯的对映异构体以及拆解试剂。
如本文所使用的，在这些方法、方案和实施例中所使用的符号和规则与同时代科技文献中所使用的一致，例如，the Journal of theAmerican Chemical Society或the Journal of Biological Chemistry中所使用的。标准单字母或三字母缩写通常用于表示氨基酸残基，除非另外指明，假定这些氨基酸残基是L-构型的。除非另外指明，所有的起始材料均获自商业供应商且未经进一步纯化。
本发明肾素抑制剂的合成方案
可以用各种反应方案合成本发明的肾素抑制剂。本文实施例中给出了一些示例性方案。本领域技术人员可以容易地设计出其它反应方案。
在下文描述的反应中，当反应性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、硫或羧基基团，需要出现在最终产物中时，则要将其保护起来以避免它们参与到非所需反应中。可以根据标准方法使用常规的保护基团，例如参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts″Protective Groups inOrganic Chemistry″John Wileyand Sons，1991。
本发明化合物可以任选地根据以下通用反应方案来合成：
制备式I的复合物：
           
           
                                 式I
制备式II的复合物：
           
           
                                 式II
实施例13：形成复合物的缀合反应
将10mM马来酰亚胺基丙酰基氨基乙氧基乙氧基乙酰基衍生的肽在DMSO中的溶液加入到25％HSA水溶液中。反应混合物中的最终肽浓度为1mM，反应混合物中的肽∶HSA摩尔比为1∶4。将溶液在37℃下温育5小时。一旦完成温育，立即将缀合物于4℃保存。
实施例14：形成复合物的缀合反应
将10mM反-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羰基衍生的肽在DMSO中的溶液加入到25％HSA水溶液中。反应混合物中的最终肽浓度为1mM，反应混合物中的肽∶HSA摩尔比为1∶4。将溶液在37℃下温育5小时。一旦完成温育，立即将缀合物于4℃保存。
实施例15：形成复合物的缀合反应
将10mM N-(3-{2-[2-(3-氨基-丙氧基)-乙氧基]-乙氧基]-乙氧基}-丙基)-2-溴乙酰胺衍生的肽在DMSO中的溶液加入到25％HSA水溶液中。反应混合物中的最终肽浓度为1mM，反应混合物中的肽∶HSA摩尔比为1∶4。将溶液在37℃下温育5小时。一旦完成温育，立即将缀合物于4℃保存。
实施例16：形成复合物的缀合反应
将10mM马来酰亚胺基丙酰基氨基乙氧基乙氧基乙酰基衍生的肽在DMSO中的溶液加入到25％HSA水溶液中。反应混合物中的最终肽浓度为1mM，反应混合物中的肽∶HSA摩尔比为1∶1。将溶液在37℃下温育5小时。一旦完成温育，立即将缀合物于4℃保存。
实施例17：形成复合物的缀合反应
将10mM马来酰亚胺基丙酰基氨基乙氧基乙氧基乙酰基衍生的肽在DMSO中的溶液加入到25％HSA水溶液中。反应混合物中的最终肽浓度为1mM，反应混合物中的肽∶HSA摩尔比为10∶1。将溶液在37℃下温育5小时。一旦完成温育，立即将缀合物于4℃保存。
显然，对于本领域技术人员来说，对本发明的化合物、组合物、试剂盒及方法可以做各种修改和变化而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明意欲涵盖对本发明的修改和变化，前提是它们落入所附的权利要求范围或其等同方案范围之内。
体外测定实施例
Cartledge，等人，Ann.Clin.Biochem.262-278(2000)中描述了各种测量肾素抑制剂活性的测定。
实施例18：体外测量肾素抑制活性
肾素抑制活性的荧光测量
一种测量肾素酶活性的方法利用了在基于荧光的微量培养板读取器上进行合成肽底物的切割。肾素的这一肽底物在一个末端与荧光团(5-(氨基乙基)氨基萘磺酸酯，EDANS)相连，在另一末端与非荧光发色团(4′-二甲基氨基偶氮苯-4-羧酸酯，DABCYL)相连。经肾素切割后，产物(肽-EDANS)为明亮荧光。通过将877μL二甲基亚砜(DMSO)加入到1mg底物中，可制备500μM的肾素底物原液。将该原液加入到测定缓冲液中至2μM终浓度。在该测定缓冲液中稀释少量(小于终体积的3％)含有肾素的溶液。通过在37℃监控490nm处荧光信号的升高5～8分钟来测量荧光底物切割的初速度。我们的缀合物在该测定中显示从低于纳摩尔到高微摩尔的活性。
1.J Protein Chem 10，553(1991)
2.Anal Biochem 210，351(1993)
3.Science 247，954(1990)
4.J Protein Chem 9，663(1990)
血浆肾素抑制剂的测量
根据最初由Haber等人(1)所述的方法测定血浆肾素活性。简言之，将血浆样品分成两等分试样。一等分试样于37℃温育3～18小时，而另一等分试样在冰中保存。根据厂商说明用商业试剂盒以RIA或ELISA形式测定血管紧张肽I浓度。用0～4℃保存的等分试样中的血管紧张肽I浓度减去37℃等分试样中的浓度而得出肾素活性测量值。
还可以利用HPLC对切割产物的分离来测定血浆中的肾素对外源添加的肽底物的活性。切割产物可以用LC-MS分析进行检测。作为选择，可以用荧光团或发色团修饰肽底物以使其能够用分光光度检测。HPLC分析前可以经沉淀除去血浆蛋白。
用基于酶的测定(2)确定血浆中的肾素抑制剂和/或肾素抑制剂-HSA缀合物的浓度，其利用商业获得的淬灭荧光底物(3)在pH7.0-8.0下测量血浆样品针对外源添加的重组人肾素的抑制潜力。
1. Haber E，Koerner T，Page LB，Kliman B，Pumode A.Application ofa radioimmunoassay for angiotensin I to the physiologic measurements of plasmarenin activity in normal human subjects.J Clin Endocrinol Metab.1969，29(10)：1349-55
2.Gulnik S.，Erickson，J.W.，Yu，B.Protease assay for therapeuticdrug monitoring.2003，WO03040390
3. Wang GT，Chung CC，Holzman TF，Krafft GA.A continuousfluorescence assay of renin activity.Anal Biochem.1993，210(2)：351-9.
实施例18：体内测试
向大鼠经静脉内施以缀合物。在对照组中施以未与清蛋白缀合的抑制剂。给药后5分钟、30分钟、1小时、2小时、8小时、24小时、48小时和72小时收集血清样品。用上述方法之一测量肾素抑制活性。从标准曲线计算肽或肽-HSA缀合物的血清浓度。根据这些试验的结果得出以下结论：
对照肽表现出快速消减的廓清概况。
HSA缀合物的最终半衰期在12至14小时间变化，类似于该物种的HSA。
在带内源启动子的人血管紧张肽原和带内源启动子的人肾素双重转基因的高血压大鼠中可以测量到由人肾素抑制而产生的抗高血压活性。
Bohlender，等人，Hypertension 428-434(1997)
对于大鼠肾素抑制与人肾素抑制相当的情况，可以在钠耗竭大鼠中检测到抗高血压活性。
Allan，等人，JPET 283：661-665，(1997)。
实施例19：肾素抑制剂衍生物的生物活性
上述给出的信息清楚地证实，Ih-L-Pr复合物上的生物素环可以与抗生物素蛋白结合。设计了以下一系列实验用于说明Ih-L-Pr复合物在与靶蛋白缀合后是否仍然具有生物活性，所述复合物的可溶游离酸形式的IC50约为50nM。
材料和方法：以下程序在无菌条件下完成。兔血浆获自新鲜抽取的肝素化血液。将一份8mL等分试样的血浆与5微摩尔Ih-L-Pr复合物在室温下温育60分钟。将另一份等分试样类似地与5微摩尔Ih-L-Pr复合物温育。将反应混合物于4℃保存过夜。保存这些样品等分试样以用于通过标准肾素放射免疫测定(RIA)分析总肾素抑制剂含量。加温至37℃后，将血浆样品注射进两只自体兔中。之后以固定的时间间隔从兔取血。2500rpm离心血液5分钟，之后用RIA分析血浆等分试样。
结果：经Ih-L-Pr复合物的NHS酯衍生的血浆蛋白在血液中循环更长时间段后，确实使抑制剂保持了生物利用率和抑制性的构象。而且，针对血浆的稀释效应，可检测抑制剂的量已根据循环中血液的体积而规格化。
这些数据显示，肾素抑制剂Ih游离酸的水平迅速降低，且在一小时后无法检测。另一方面，被修饰成Ih-L-Pr复合物的血浆蛋白在肾素测定中有抑制作用，这表明缀合并不破坏抑制剂Ih的生物活性。此外，所观察到的抑制水平直到第十天也未显著降低。几种丰富血浆蛋白(清蛋白和免疫球蛋白)是长寿命的，且可以解释这种送递概况。因此这些结果清楚地证实了，衍生的肾素抑制剂与比如清蛋白这样的血浆蛋白的共价附着，不会破坏分子的生物活性，并显著提高该抑制剂Ih在血液中的寿命。
显然，根据上述结果，通过使用式I和式II的复合物，本发明提供了大大改进的涉及肾素抑制剂Ih的治疗。利用本发明，肾素抑制剂Ih保持更长时间段，由此不需要反复给药、不需要患者的顺从以及确保安全。本发明的衍生的肾素抑制剂与红细胞、血浆蛋白和各种其它血管成分共价附着形成式I和式II的复合物，同时保持其生物活性且为非免疫原性的。
尽管本发明连同其特定实施方案已经得到了描述，但应当理解，本发明还可以做进一步修改，而且本申请意欲涵盖所有遵循本发明总体原则、且包括比如落入本发明所属领域中已知或常用实践、和比如可应用于前文所述重要特征的、以及比如落入所附权利要求书范围的这样的对本说明书的超出的本发明的变化、用途或改变。

Claims (145)

1.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6的肽，
其中：
该序列位于该肽的N-末端、C-末端或内部位置；
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除除P、G和C之外的任何一种氨基酸；和
各X独自为任何一种氨基酸。
2.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；和
各X独自为任何一种氨基酸。
3.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；和
各X独自为任何一种氨基酸。
4.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；和
各X独自为任何一种氨基酸。
5.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
6.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；和
各X独自为任何一种氨基酸。
7.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；和
各X独自为任何一种氨基酸。
8.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
9.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y1选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K、和R；
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K、和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
10.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y2选自W、Y、F、H、L、N、Q、E、D、K和R；
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
11.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y3选自I、V、L、A、S和T；
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
12.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y4选自T、S、I、K、N、H、R、Q、E和D；
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
13.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y5选自I、V、T、K、L、N、Q、D、E、R和H；
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
14.由最多51个氨基酸组成、包含序列
Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y 11-Y 12-X-X-Y13-Y14的肽，
其中
Y6选自除P、G和C之外的任何一种氨基酸；
Y7选自I、L、V、N、Q、K、R、H、E和D；
Y8选自Q、H、R、N、E、D、K和P；
Y9选自Q、H、N、E、D、K、R、L和P；
Y10选自Q、H、N、E、D、K和R；
Y11选自N、S、T、V、A和D；
Y12选自E、V、K、G、R、Q、D、N、H、T和S；
Y13选自L、I、V、K和R；
Y14选自L、S、M、Y、N、Q、E、D、K和R；和
各X独自为任何一种氨基酸。
15.由最多51个氨基酸组成、包含序列
W-X-X-W-X-X-X-I-X-X-X-T-X-X-I-X-X-L-I-X-X-X-Q-X-Q-Q-X-X-N的肽，
其中
各X独自为任何一种氨基酸。
16.由最多51个氨基酸组成、包含序列
W-X1-X2-W-X3-X4-X5-I-X6-X7-X8-T-X9-X10-I-X11-X12-L-I-X13-X14-X15-Q-X16-Q-Q-X17-X18-N-X19-X20-X21-X22-X23的肽，
其中
X1选自M、L、I、Q、T、R和K；
X2是E、D、Q和K中的任一个；
X3选自E、D和K；
X4选自K、R、E、Q、N和T；
X5选自E、L、R、K和Q；
X6选自N、D、S、E、Q、K、R、H、T、I和G；
X7选自N、Q、D、E、K、S、T和Y；
X8选自Y、F、H、I、V和S；
X9选自G、K、R、H、D、E、S、T、N和Q；
X10选自K、H、E、Q、T、V、I、L、M、A、Y、F和P；
X11选自H、K、E、Y和F；
X12选自T、S、Q、N、E、D、R、K、H、W、G、A和M；
X13选自D、E、Q、T、K、R、A、V和G；
X14选自D、E、K、H、Q、N、S、I、L、V、A和G；
X15选自S、A和(P)；
X16选自N、K、S、T、D、E、Y、I和V；
X17选自E、D、N、K、G和V；
X18选自K、R、H、D、E、N、Q、T、M、I和Y；
X19选自E、V、Q、M、L、J和G；
X20选自Q、N、E、K、R、H、L和F；
X21选自E、D、N、S、K、A和G；
X22选自L、I、和Y；和
X23选自I、L、M、Q、S和Y。
17.权利要求16的肽，其中所述肽包含一条选自图1所示序列的序列。
18.一种分离的式I或式II的复合物：
Figure A2004800140550009C1
           AV-[L2-(Pr)o]p         II
其中：
m是一个1～5的整数；
n是一个1～100的整数；
o是一个1～5的整数；
p是一个1～100的整数；
AV是一种抗病毒化合物；
L1和L2是将AV共价连接至Pr的多价接头，或者L1和L2缺失；
Pr是蛋白；和
其中该复合物具有体内抗病毒活性。
19.权利要求18的复合物，其中所述抗病毒化合物是一种肽。
20.权利要求19的复合物，其中所述肽的质量小于约100kDA。
21.权利要求19的复合物，其中所述肽的质量小于约30kDA。
22.权利要求19的复合物，其中所述肽的质量小于约10kDA。
23.权利要求19的复合物，其中所述肽是肽模拟物。
24.权利要求19的复合物，其中所述肽由最多51个氨基酸组成且包含选自以下的序列：
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13；
Y1-X-X-Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14；
Y2-X-X-X-Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14；
Y3-X-X-X-Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14；
Y4-X-X-Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14；
Y5-X-X-Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y3-Y14；
Y6-Y7-X-X-X-Y8-X-Y9-Y10-X-X-Y11-Y12-X-X-Y13-Y14；
W-X-X-W-X-X-X-I-X-X-X-T-X-X-I-X-X-L-I-X-X-X-Q-X-Q-Q-X-X-N；
W-X1-X2-W-X3-X4-X5-I-X6-X7-X8-T-X9-X10-I-X11-X12-L-I-X13-X14-X15-Q-X16-Q-Q-X17-X18-N-X19-X20-X21-X22-X23；
肽DP178(T-20)；和
肽T-1249；
其中
X1选自M、L、I、Q、T、R和K；
X2是E、D、Q和K中的任一个；
X3选自E、D和K；
X4选自K、R、E、Q、N和T；
X5选自E、L、R、K和Q；
X6选自N、D、S、E、Q、K、R、H、T、I和G；
X7选自N、Q、D、E、K、S、T和Y；
X8选自Y、F、H、I、V和S；
X9选自G、K、R、H、D、E、S、T、N和Q；
X10选自K、H、E、Q、T、V、I、L、M、A、Y、F和P；
X11选自H、K、E、Y和F；
X12选自T、S、Q、N、E、D、R、K、H、W、G、A和M；
X13选自D、E、Q、T、K、R、A、V和G；
X14选自D、E、K、H、Q、N、S、I、L、V、A和G；
X15选自S、A和(P)；
X16选自N、K、S、T、D、E、Y、I和V；
X17选自E、D、N、K、G和V；
X18选自K、R、H、D、E、N、Q、T、M、I和Y；
X19选自E、V、Q、M、L、J和G；
X20选自Q、N、E、K、R、H、L和F；
X21选自E、D、N、S、K、A和G；
X22选自L、I和Y；和
X23选自I、L、M、Q、S和Y。
25.权利要求24的复合物，其中所述蛋白是血液成分。
26.权利要求25的复合物，其中所述血液成分选自红细胞、免疫球蛋白、IgM、IhG、血清清蛋白、运铁蛋白、P90和P38、铁蛋白、类固醇结合蛋白、甲状腺素结合蛋白和α-2-巨球蛋白。
27.权利要求25的复合物，其中所述血液成分是人血清清蛋白、以及所述接头为肽接头。
28.权利要求25的复合物，其中所述血液成分是人血清清蛋白、以及所述接头为非肽接头。
29.权利要求27的复合物，其中所述复合物为融合蛋白。
30.权利要求18的复合物，其中所述接头L1或L2是对于体内水解切割而言稳定的非不稳定性接头。
31.权利要求18的复合物，其中所述接头L1或L2包含至少两个使AV与Pr共价连接的官能团。
32.权利要求18的复合物，其中所述接头L1或L2在人血清中保持更长时间段的水解稳定性。
33.权利要求18的复合物，其中所述接头L1或L2在人血清中的半衰期为8小时至30天。
34.权利要求18的复合物，其中所述接头L1或L2是选自酰氧甲基酮、氮丙啶、重氮甲基酮、环氧化物、碘-、溴-或氯乙酰胺、α-卤代酯、α-卤代酮、锍、氯乙基硫化物、O-烷基异脲、烷基卤化物、乙烯基砜、丙烯酰胺、丙烯酸酯、乙烯基吡啶、有机金属化合物、芳基二硫化物、硫代磺酸酯、醛、腈、α-二酮、α-酮酰胺、α-酮酸酯、二氨基酮、缩氨基脲和二酰肼的化合物的衍生物。
35.权利要求18的复合物，其中的接头L1或L2是选自叠氮苯甲酰酰肼、N-[4-(对叠氮水杨基氨基)丁基]-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺、辛二酸二磺基琥珀酰亚胺酯、己二亚氨酸二甲酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、N-y-马来酰亚胺基丁酰氧琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯、[4-叠氮苯基]-1，3′-二硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯、[4-碘乙酰]氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、戊二醛、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺-苯甲酰-琥珀酰亚胺、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺基丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺、异氰酸酯、硫代酸酯、硫羰羧酸酯、亚氨酸酯、碳二亚胺、酐和碳酸酯的化合物的衍生物。
36.权利要求25的复合物，其中所述蛋白是清蛋白。
37.权利要求36的复合物，其中所述清蛋白是在干物质基础上至少为10％纯的HSA或重组HSA。
38.权利要求36的复合物，其中所述连接是与人清蛋白Cys-34的连接。
39.权利要求36的复合物，其中所述连接是与人清蛋白赖氨酸的连接。
40.权利要求18的复合物，其中m为1、n为1，以及蛋白为HSA或重组HSA。
41.权利要求18的复合物，其中n为1，蛋白为HSA或重组HSA，以及，其中复合物进一步被纯化至纯度至少30％。
42.权利要求18的复合物，其中m为1、n为2，以及蛋白为HSA或重组HSA。
43.权利要求18的复合物，其中通过将化学计量比的(AV)m-L1与Pr或化学计量比的AV与L2-(Pr)o组合来制备复合物。
44.权利要求18的复合物，其中通过将Pr混合物与(AV)m-L1以至少约1.3∶1的比率进行组合来制备复合物。
45.权利要求18的复合物，其中L1和L2缺失，和，其中通过形成活化的AV中间体、之后使该活化的AV中间体与Pr缩合来制备复合物。
46.权利要求45的复合物，其中从混合的酐或N，N′-羰基二咪唑试剂制备活化的AV中间体。
47.权利要求43～46中任一的复合物，其中复合物进一步纯化至纯度至少约30％。
48.含有与血液成分共价连接的非肽抗病毒化合物的抗病毒组合物。
49.含有权利要求18的复合物和生理可接受载体的组合物。
50.用盐水或不用盐水配制的权利要求49的组合物。
51.为肠胃外施用配制的权利要求50的组合物。
52.选自溶液、在使用前与溶剂组合的干燥产物、悬浮液、乳剂、和液体浓缩物的权利要求51的组合物。
53.体内抑制HIV gp41和HIV活性的方法，该方法包括：
向哺乳动物宿主血流中施以权利要求18的分离的缀合复合物，其中该复合物是通过将抗病毒化合物与具有至少一个能够与蛋白反应从而形成稳定共价键的反应官能团的接头附着形成的；和
其中的分离的缀合复合物以与非缀合的抗病毒化合物相比能够在血流中维持更长时间段的有效治疗效应的量施用。
54.权利要求53的方法，其中所述复合物是权利要求26的复合物。
55.权利要求53的方法，其中所述蛋白是HSA或重组HSA。
56.权利要求53的方法，其中的含有一个反应官能团的接头是选自下列的化合物：酰氧甲基酮、氮丙啶、重氮甲基酮、环氧化物、碘-、溴-或氯乙酰胺、α-卤代酯、α-卤代酮、锍、氯乙基硫化物、O-烷基异脲、烷基卤化物、乙烯基砜、丙烯酰胺、丙烯酸酯、乙烯基吡啶、有机金属化合物、芳基二硫化物、硫代磺酸酯、醛、腈、α-二酮、α-酮酰胺、α-酮酸酯、二氨基酮、缩氨基脲和二酰肼。
57.一种引发体内抗病毒活性的方法，所述方法包括：
以足以提供有效量抗病毒活性的量向哺乳动物宿主血流中施以权利要求18的复合物；
由此与未结合的抗病毒化合物的寿命相比，所述复合物更长时间段地保留在血流中。
58.一种在宿主中引起抗病毒活性的方法，所述方法包括：
a)制备化合物AV-L1或AV-L2，其中AV是质量小于60kD的肽抗病毒化合物，和L1或L2是与AV共价结合的接头；
b)用分离的蛋白将化合物AV-L1或AV-L2转体内处理一段足以使化合物AV-L1或AV-L2与该蛋白共价结合从而形成权利要求18的蛋白复合物的时间，和
c)向宿主施用该经过处理的蛋白复合物。
59.权利要求58的方法，其中所述蛋白是清蛋白。
60.权利要求59的方法，其中所述清蛋白是HSA或重组HSA。
61.权利要求59的方法，其中所述清蛋白在用化合物AV-L1或AV-L2处理前获自血液、纯化和分离自血液。
62.权利要求61的方法，其中所述清蛋白被纯化至至少为在干物质基础上10％的纯度水平。
63.权利要求61的方法，其中所述清蛋白被纯化至大于95％的纯度水平。
64.一种在宿主中引起抗病毒活性的方法，所述方法包括：
a)制备化合物AV-L1或AV-L2，其中AV是质量小于60kD的肽抗病毒化合物，和L1或L2是与AV共价结合的接头；
b)用一或多种分离的蛋白Pr对化合物AV-L1或AV-L2转体内处理一段足以使化合物AV-L1或AV-L2与一种或多种分离的蛋白共价结合从而形成一或多种权利要求18的修饰的蛋白复合物的时间，和
c)向宿主施用修饰的一种或多种蛋白复合物。
65.权利要求64的方法，其中所述蛋白是清蛋白。
66.权利要求65的方法，其中所述清蛋白在用化合物AV-L1或AV-L2处理前获自血液、纯化和分离自血液。
67.权利要求65的方法，其中所述清蛋白是HSA或重组HSA。
68.一种包含治疗有效量的权利要求18的复合物、或其生理可接受的盐、和药学可接受载体、赋形剂、或稀释剂的药物组合物。
69.用于抑制HIV病毒作用的方法，该方法包括对公认需要这种治疗的宿主施用有效量的权利要求18的复合物、或其药学可接受盐。
70.治疗病毒感染受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求49的组合物。
71.治疗病毒感染受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求50的组合物。
72.治疗病毒感染受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求51的组合物。
73.治疗病毒感染受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求52的组合物。
74.权利要求70的方法，其中所述受试者患有HIV感染。
75.权利要求71的方法，其中所述受试者患有HIV感染。
76.一种为怀疑将受到病毒感染的患者提供预防的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求49的组合物。
77.一种为怀疑将受到病毒感染的患者提供预防的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求50的组合物。
78.一种为怀疑将受到病毒感染的患者提供预防的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求51的组合物。
79.一种为怀疑将受到病毒感染的患者提供预防的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求52的组合物。
80.一种为怀疑将受到病毒感染的患者提供预防的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求53的组合物。
81.一种分离的式I或式II的复合物：
             [(Ih)m-L1]n-Pr         I
             Ih-[L2-(Pr)o]p         II
其中：
m是一个1～5的整数；n是一个1～100的整数；o是一个1～5的整数；p是一个1～100的整数；Ih是肾素抑制剂；L1和L2是使Ih共价连接于Pr的多价接头，或者L1和L2缺失；Pr是蛋白；和，其中该复合物具有体内肾素抑制剂活性。
82.权利要求81的复合物，其中所述抑制剂是一种肽。
83.权利要求82的复合物，其中所述肽的质量小于约60kDA。
84.权利要求82的复合物，其中所述肽的质量小于约10kDA。
85.权利要求82的复合物，其中所述肽的质量小于约1000DA。
86.权利要求82～85任一中的复合物，其中所述肽是肽模拟物。
87.权利要求66的复合物，其中所述肽模拟物是C-末端的过渡态模拟物。
88.权利要求87的复合物，其中所述过渡态模拟物是下式的化合物：
Figure A2004800140550017C1
其中：
R选自(C1-10)烷基、(C6-12)环烷基、羰基(C1-10)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基，各为取代的或未取代的；和
R′选自：(C1-10)烷基、(C6-12)环烷基、羰基(C1-10)烷基、(C1-10)烷氧羰基、(C1-10)烷基氨基羰基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基、烷基磺酰基(C1-10)烷基、芳基磺酰基(C1-10)烷基、杂芳基磺酰基(C1-10)烷基、(C1-10)烷基膦酸酯和(C1-10)烷基膦酰基，各为取代或未取代的。
89.权利要求87的复合物，其中所述过渡态模拟物是下式的化合物：
其中：
R选自(C1-10)烷基、(C6-12)环烷基、羰基(C1-10)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基，各为取代的或未取代的；和
R″选自(C1-4)烷基、(C6-12)环烷基、杂环烷基、二环烷基、羰基(C1-10)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、氨基、亚氨基(C1-3)烷基、(C1-10)烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基、(C9-12)二环芳基、杂(C8-12)二环芳基、氨基磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基(C1-10)烷基、芳基磺酰基、芳基磺酰基(C1-10)烷基、杂芳基磺酰基、杂芳基磺酰基(C1-10)烷基、膦酸酯、(C1-10)烷基膦酰基、磺酰基基团和亚磺酰基基团，各为取代或未取代的。
90.权利要求87的复合物，其中所述过渡态模拟物是下式的化合物：
其中：
R选自(C1-10)烷基、(C6-12)环烷基、羰基(C1-10)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基，各为取代的或未取代的；和
R″选自(C1-4)烷基、(C6-12)环烷基、杂环烷基、二环烷基、羰基(C1-10)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、氨基、亚氨基(C1-3)烷基、(C1-10)烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基、(C9-12)二环芳基、杂(C8-12)二环芳基、氨基磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基(C1-10)烷基、芳基磺酰基、芳基磺酰基(C1-10)烷基、杂芳基磺酰基、杂芳基磺酰基(C1-10)烷基、膦酸酯、(C1-10)烷基膦酰基、磺酰基基团和亚磺酰基基团，各为取代或未取代的。
91.权利要求87的复合物，其中所述过渡态模拟物是下式的化合物：
Figure A2004800140550019C1
其中：
R选自(C1-10)烷基、(C6-12)环烷基、羰基(C1-10)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基，各为取代的或未取代的；和
R″选自(C1-4)烷基、(C6-12)环烷基、杂环烷基、二环烷基、羰基(C1-10)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、氨基、亚氨基(C1-3)烷基、(C1-10)烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、(C2-12)链烯基、(C2-12)炔基、芳基、芳基(C1-10)烷基、杂芳基、杂芳基(C1-10)烷基、(C9-12)二环芳基和杂(C8-12)二环芳基，各为取代或未取代的。
92.权利要求87的复合物，其中所述C-末端的过渡态模拟物选自：
Figure A2004800140550020C1
93.权利要求81的复合物，其中所述Ih是选自下述的肾素抑制剂肽：
                              Iva-Val-Val-Sta-Ala-Sta，Boc-Phe-His-Sta-Ile-
AMP，Boc-Phe-His-Sta-Ala-Sta-OMe，Boc-Phe-His-Sta-L-eu-NHCH2Ph，Boc-Phe-
His-ACHPA-Leu-AMB，Boc-Phe-His-Sta-Leu-AMB，Boc-Pro-Phe-His-Sta-Ile-
AMP，Iva-Phe-Nle-Sta-Ala-Sta，Iva-His-Pro-Phe-His-Sta-Ala-Sta，Iva-His-Pro-Phe-
His-Sta-Leu-Phe-NH2，Ac-His-Pro-Phe-Val-Sta-Leu-Phe-NH2，Ac-His-Pro-Phe-
His-ACHPA-Leu-Phe-NH2，Ac-Trp-Pro-Phe-His-Sta-Ile-NH2，Ac-(HCO-Trp)-Pro-
Phe-His-Sta-Ile-NH2，Pro-His-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-D-Lys，Pro-His-Pro-Phe-
His-Sta-Ile-Phe-NH2，Z-Arg-Arg-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-Lys(Boc)-OMe，Pro-His-
Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys，His-Pro-Phe-His-Leu-D-Leu-Val-Tyr-OH，Pro-
His-Pro-Phe-His-Leu(CH2NH)Val-Ile-His-Lys(H-142)，Boc-Phe-His-Cha-
(CH2NH)Val-NH2(S)-Me(Bu)，Pro-His-Pro-Phe-His-Leu-Phe-Val-Tyr-OH，Boc-
His-Pro-Phe-His-Leu(CH(OH)CH2)Val-Ile-His-OH(H-261)和PEC-Phe-His-
ACHPA-ILeNHC(CH2OH)2CH3。
94.权利要求81的复合物，其中所述Ih是选自下述的肾素抑制剂肽：
                                Iva-Val-Val-Sta-Ala-Sta，Boc-Phe-His-Sta-Ile-
AMP，Boc-Phe-His-Sta-Ala-Sts-OMe，Boc-Phe-His-Sta-Leu-NHCH2Ph，Boc-Phe-
His-ACHPA-Leu-AMB，Boc-Phe-His-Sta-Leu-AMB，Boc-Pro-Phe-His-Sta-Ile-
AMP，Iva-Phe-Nle-Sta-Ala-Sta，Iva-His-Pro-Phe-His-Sta-Ala-Sta，Iva-His-Pro-Phe-
His-Sta-Leu-Phe-NH2，Ac-His-Pro-Phe-Val-Sta-Leu-Phe-NH2，Ac-His-Pro-Phe-
His-ACHPA-Leu-Phe-NH2，Ac-Trp-Pro-Phe-His-Sta-Ile-NH2，Ac-(HCO-Trp)-Pro-
Phe-His-Sta-Ile-NH2，Pro-His-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-D-Lys，Pro-His-Pro-Phe-
His-Sta-Ile-Phe-NH2，Z-Arg-Arg-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-Lys(Boc)-OMe，Pro-His-
Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys，His-Pro-Phe-His-Leu-D-Leu-Val-Tyr-OH，Pro-
His-Pro-Phe-His-Leu(CH2NH)Val-IIe-His-Lys(H-142)，Boc-Phe-His-Cha-
(CH2NH)Val-NH-2(S)-Me(Bu)，Pro-His-Pro-Phe-His-Leu-Phe-Val-Tyr-OH，Boc-
His-Pro-Phe-His-Leu(CH(OH)CH2)Val-Ile-His-OH(H-261)和PEC-Phe-His-
ACHPA-ILeNHC(CH2OH)2CH3，
且Pr是清蛋白。
95.权利要求81的复合物，其中的接头L1或L2包含至少两个将Ih与Pr共价连接的官能团。
96.权利要求81的复合物，其中所述接头L1或L2在人血清中保持更长时间段的水解稳定性。
97.权利要求81的复合物，其中所述接头L1或L2在人血清中的半衰期为8小时至30天。
98.权利要求81的复合物，其中所述接头L1或L2是选自酰氧甲基酮、氮丙啶、重氮甲基酮、环氧化物、碘-、溴-或氯乙酰胺、α-卤代酯、α-卤代酮、锍、氯乙基硫化物、O-烷基异脲、烷基卤化物、乙烯基砜、丙烯酰胺、丙烯酸酯、乙烯基吡啶、有机金属化合物、芳基二硫化物、硫代磺酸酯、醛、腈、α-二酮、α-酮酰胺、α-酮酸酯、二氨基酮、缩氨基脲和二酰肼的化合物的衍生物。
99.权利要求81的复合物，其中所述接头L1或L2是选自叠氮苯甲酰酰肼、N-[4-(对叠氮水杨基氨基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫代)丙酰胺)、辛二酸二磺基琥珀酰亚胺酯、己二亚氨酸二甲酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、N-y-马来酰亚胺基丁酰氧琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯、[4-叠氮苯基]-1，3′-二硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯、[4-碘乙酰]氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、戊二醛、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺-苯甲酰-琥珀酰亚胺、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺基丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺、异氰酸酯、硫代酸酯、硫羰羧酸酯、亚氨酸酯、碳二亚胺、酐和碳酸酯的化合物的衍生物。
100.权利要求81的复合物，其中所述蛋白选自红细胞、免疫球蛋白，比如IgM和IgG、血清清蛋白、运铁蛋白、p90和p38。
101.权利要求100的复合物，其中所述蛋白是清蛋白。
102.权利要求101的复合物，其中所述清蛋白是在干物质基础上纯度至少为10％的HSA或重组HSA。
103.权利要求101的复合物，其中所述连接是与人清蛋白Cys-34的连接。
104.权利要求101的复合物，其中所述连接是与人清蛋白赖氨酸的连接。
105.权利要求81的复合物，其中m为1，n为1或2，且蛋白为HSA或重组HSA。
106.权利要求81的复合物，其中n为1，蛋白为HSA或重组HSA，以及，其中该复合物进一步纯化至纯度为至少30％。
107.权利要求81的复合物，其中m为1，n为2，以及蛋白为HSA或重组HSA。
108.权利要求81的复合物，其中通过将化学计量比的(Ih)m-L1与Pr或化学计量比的Ih与L2-(Pr)o组合来制备复合物。
109.权利要求81的复合物，其中通过将Pr混合物与(Ih)m-L1以至少约1.3∶1的比率组合来制备复合物。
110.权利要求81的复合物，其中所述L1和L2缺失，和，其中通过形成活化的Ih中间体、之后使该活化的Ih中间体与Pr缩合来制备复合物。
111.权利要求110的复合物，其中从混合的酐或N，N′-羰基二咪唑试剂制备活化的Ih中间体。
112.权利要求108-11中任一的复合物，其中所述复合物进一步纯化至纯度至少约30％。
113.权利要求108的复合物，其中所述肾素抑制剂是质量小于约1000DA的肽模拟物。
114.含有权利要求81的复合物和生理可接受载体的组合物。
115.为肠胃外施用配制的权利要求114的组合物。
116.选自溶液、在使用前与溶剂组合的干燥产物、悬浮液、乳剂和液体浓缩物的权利要求115的组合物。
117.一种体内抑制肾素活性的方法，该方法包括：
向哺乳动物宿主血流中施以权利要求81的分离的缀合复合物，其中该复合物是通过将肾素抑制剂与具有至少一个能够与蛋白反应从而形成稳定共价键的反应官能团的接头附着形成的；和
其中所述分离的缀合复合物以与非缀合的肾素抑制剂相比能够在血流中维持更长时间段的有效治疗效应的量施用。
118.权利要求117的方法，其中所述复合物是权利要求100的复合物。
119.权利要求117的方法，其中所述蛋白是HSA或重组HSA。
120.权利要求117的方法，其中所述含有一个反应官能团的接头是选自下列的化合物：酰氧甲基酮、氮丙啶、重氮甲基酮、环氧化物、碘-、溴-或氯乙酰胺、α-卤代酯、α-卤代酮、锍、氯乙基硫化物、O-烷基异脲、烷基卤化物、乙烯基砜、丙烯酰胺、丙烯酸酯、乙烯基吡啶、有机金属化合物、芳基二硫化物、硫代磺酸酯、醛、腈、α-二酮、α-酮酰胺、α-酮酸酯、二氨基酮、缩氨基脲和二酰肼。
121.一种体内抑制肾素活性的方法，所述方法包括：
以足以提供有效量肾素抑制的量向哺乳动物宿主血流中施以权利要求81的复合物；
由此与未结合的肾素抑制剂的寿命相比，所述复合物更长时间段地保留在血流中。
122.一种抑制宿主中肾素活性的方法，所述方法包括：
a)制备化合物Ih-L1或Ih-L2，其中Ih是质量小于60kD的肾素抑制剂肽，和L1或L2是与Ih共价结合的接头；
b)用分离的蛋白将化合物Ih-L1或Ih-L2转体内处理一段足以使化合物Ih-L1或Ih-L2与该蛋白共价结合从而形成权利要求81的蛋白复合物的时间，和
c)向宿主施用该经过处理的蛋白复合物。
123.权利要求122的方法，其中所述蛋白是清蛋白。
124.权利要求123的方法，其中所述清蛋白是HSA或重组HSA。
125.权利要求123的方法，其中所述清蛋白在用化合物Ih-L1或Ih-L2处理前获自血液、纯化和分离自血液。
126.权利要求125的方法，其中所述清蛋白被纯化至至少为在干物质基础上的10％的纯度。
127.权利要求125的方法，其中所述清蛋白被纯化至大于95％的纯度水平。
128.一种抑制宿主中肾素活性的方法，所述方法包括：
a)制备化合物Ih-L1或Ih-L2，其中Ih是质量小于60kD的肾素抑制剂肽，和L1或L2是与Ih共价结合的接头；
b)用一或多种分离的蛋白将化合物Ih-L1或Ih-L2转体内处理一段足以使化合物Ih-L1或Ih-L2与该一种或多种分离的蛋白共价结合从而形成一或多种权利要求81的经修饰的蛋白复合物的时间，和
c)向宿主施用该修饰的一种或多种蛋白。
129.权利要求128的方法，其中所述蛋白是清蛋白。
130.权利要求129的方法，其中所述清蛋白在用化合物Ih-L1或Ih-L2处理前获自血液、纯化和分离自血液。
131.权利要求129的方法，其中所述清蛋白是HSA或重组HSA。
132.一种包含治疗有效量的权利要求81的复合物、或其生理可接受的盐和药学可接受载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
133.降低受试者血压的方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求132的组合物。
134.根据权利要求133的方法，其中所述患者患有高血压。
135.根据权利要求134的方法，其中所述患者患有轻微、中度或严重高血压。
136.包含与大分子载体共价缀合的药理活性部分的分离的化合物，
其中该载体为药理学惰性载体，
其中所述药理活性部分和所述载体间的连接在体内是稳定的，
其中完整化合物基本保持所述药理活性部分的药理学活性，
以及，其中当所述化合物被施用给哺乳动物时其活性半衰期至少约为所述药理活性部分的两倍。
137.根据权利要求136的化合物，其中所述大分子载体是一种蛋白。
138.根据权利要求136的化合物，其中所述大分子载体是与所述哺乳动物同源的清蛋白。
139.根据权利要求138的化合物，其中所述清蛋白是人血清清蛋白。
140.根据权利要求136的化合物，其中所述药理活性部分与所述载体经接头部分缀合。
141.根据权利要求136的化合物，其中所述药理活性部分直接与所述载体连接。
142.根据权利要求136的化合物，其中至少两个药理活性部分分子与所述载体缀合。
143.根据权利要求137的化合物，其中与所述载体的连接是经所述载体上的赖氨酸侧链的连接。
144.根据权利要求137的化合物，其中与所述载体的连接是经所述载体上的半胱氨酸侧链的连接。
145.根据权利要求136的化合物，其中所述载体是HSA和所述连接是经HSA的C34的连接。
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