CN1471969A - 重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组人白细胞介素－1受体拮抗剂在治疗眼部疾病中的药物用途，并提供了一种用于治疗眼病的药物制剂，可以代替激素治疗例如眼表面非感染性炎症、抑制角膜新生血管生成、防止角膜移植后排异反应。

Description

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的药物用途

发明领域

本发明涉及重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)在制药领域中的新用途，尤其涉及在治疗眼科疾病中的用途。

发明背景

重组白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)是存在于人体的蛋白质类细胞因子受体拮抗剂，分子量17KD，通过结合白细胞介素-1受体(I型和II型)，特异性地封闭IL-1的活性。1990年，美国Synergen公司的Eisenberg等人在英国Nature杂志首次报道了全长cDNA序列，(Nature1990；343：341-346)。

IL-1在机体的炎症反应中起着极为关键的启动作用。人类许多疾病的发生、发展过程中都有IL-1参与，IL-1本身不仅可以趋化体内的炎性反应细胞聚集至炎症发生部位，还可刺激体内的多种炎症介导介质的产生，而使炎症反应进一步加剧。因此，如何消除IL-1的影响将对治愈某些炎症疾病起着重要作用。IL-1ra是体内自然存在的IL-1拮抗剂。它可以特异地与细胞表面的IL-1受体结合而不激活靶细胞，从而阻断IL-1的生物学活性。IL-1ra是迄今为止发现的唯一细胞因子拮抗剂。

自从IL-1ra被发现以来，人们就试图将其开发为可供临床应用的药品，大量基础研究和初步临床研究结果显示IL-1ra对人类的许多炎性疾病确有疗效。此类报道更激起了人们对IL-1ra成为新药的企盼。90年代初期，Arend等成功地克隆出人IL-1ra cDNA，为使用基因重组手段大规模制备rhIL-1ra成为可能。近十年来，人类在对rhIL-1ra更为全面深入了解基础上，对rhIL-1ra的临床应用进行了全面开发。研究结果表明，rhIL-1ra将有可能用于治疗类风湿性关节炎、移植排异反应、移植物抗宿主反应、哮喘、牛皮癣等疾病。早在1996年，美国就开始了rhIL-1ra治疗类风湿性关节炎的临床研究。经过5年多的大规模、多中心、随机双盲、安慰剂对照的临床研究，结果表明，以rhIL-1ra 75-150mg的剂量治疗6个月，类风湿性关节炎病人的临床症状和影象学征象均有明显改善。2001年报11月，美国FDA正式批准rhIL-1ra作为新药投入市场。

而在我国虽然早在90年代初期就已完成rhIL-1ra表达载体的构建，但至今尚未产业化。

据国家有关部门统计，我国每年约有1460万人患眼表非感染性炎症，占眼科门诊病人的1/3，致盲率为0.34％，约400-500万人；沙眼、角膜病和眼外伤这三类疾病致盲人口达200万人，导致视力下降的人口约300万人以上。有资料表明，近年来角膜疾病致盲率呈逐年上升趋势，主要原因是皮质类激素和抗生素的广泛应用和滥用所致。绝大多数病人都伴有因角膜局部修复过程中，新生血管长入角膜而导致视力下降，如果早期可以应用恰当的药物加以治疗，就可以防止视力下降或致盲。

糖皮质激素曾是治疗非感染性眼炎药物的惟一选择。该药药效虽强，但其所产生的不良反应也很严重，尤其是它们能增高眼内压，对青光眼和眼压过高的患者仍为禁忌；对于双氯芬酸等非甾体抗炎药本身也有很多不良反应，尤其是对眼睛的刺激作用，且其抗炎效力也比糖皮质激素要低得多。因此，研究开发理想的眼炎药物成为很重要的课题。

发明内容

目前已发现IL-1ra可以特异性地与IL-1受体结合，阻断IL-1的生物学活性，因此在有IL-1参与的炎性疾病的发生，发展过程中，IL-1ra都可能发挥其治疗作用。

所以，本发明人通过大量的实验，证明了重组人白细胞介素-1受体拮抗剂在治疗眼部疾病中能够发挥效果，进而为重组人白细胞介素-1受体拮抗剂找到了新适应症。

在上述发现的基础上，本发明还提供了一种以rhIL-1ra为主要活性成分的药物组合物，它用于眼部疾病的治疗，实验证明它可以代替激素治疗例如眼表面非感染性炎症、抑制角膜新生血管生成、防止角膜移植后排异反应。

根据本发明提出的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂在制备治疗眼部疾病的药物中的用途，所述眼部疾病包括眼表非感染性炎症和感染性炎症，例如沙眼、角膜病和眼外伤，尤其是用于治疗眼表面非感染性炎症、角膜移植后排异反应和抑制角膜新生血管等。

根据本发明的另一方面，提供了一种治疗眼部疾病有效的药物，即一种含有治疗有效量的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂和药剂学上可接受的辅剂的药物组合物。

用于述治疗眼部疾病，本发明提供的药物优选为滴眼剂，其每1000毫升中包括缓冲物90-120克、甘露醇50-70克、人血白蛋白0.5-2克、重组人白细胞介素-1受体拮抗剂40-70毫克、和余量注射用水。其中，所述缓冲物包括：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钾。

如前面所述，本发明提供的治疗眼部疾病的药物物中，活性成分为rhIL-1ra为以基因重组技术所制备出的蛋白质，其编码基因源自人外周血淋巴细胞cDNA文库。成熟分子由153个氨基酸组成，分子量为17-20KD，等电点pI＝5.2-5.4，rhIL-1ra水溶性较好，在pH7.0缓冲液中稳定。

由于rhIL-1ra能特异地与IL-1受体结合，从而阻断IL-1所介导的炎症过程，故可用于治疗多种非感染性炎性疾病。可以证明，rhIL-1ra可用于治疗非感染性外眼部炎症，抑制角膜新生血管形成和角膜移植后抗排异反应。

根据本发明提供的药物，除rhIL-1ra作为主成分外，所选辅料均为体液中所含电解质和人体自有成份。

根据本发明的滴眼剂，所含各种离、甘露醇及白蛋白，均可起到维持渗透压的作用。经测定，依据本发明提供的制剂的渗透压与人体体液渗透压相近(280-320mOsmol)。

为减少对眼睛的刺激，本发明所选缓冲可维持本品的pH为7.0与人体体液pH值相同。

作为蛋白类药物，需较长时间保持其生物学活性的稳定性，本发明加入少量人血白蛋白和甘露醇，以起到稳定rhIL-1ra空间构象，保护其生物学活性的作用，还可以用于调节药液的黏度和张力。

本发明的组成中不含抑菌剂和抗氧剂，故，可用于外眼非感染性炎症和角膜移植。

用于实现本发明目的的rhIL-1ra可以来自任何已知技术的不同制备过程，本发明没有特别限定，例如，一种重组人白介素-1受体拮抗剂上游构建过程可以简述如下：

1、从含有人白介素-1受体拮抗剂基因的基因文库中克隆出人白介素-1受体拮抗剂基因；

2、将人白介素-1受体拮抗剂基因连接到适当的表达载体上；

3、以表达载体转化(转染)宿主细胞；

4、使带有人白介素-1受体拮抗剂基因表达载体的宿主细胞繁殖；(如以大肠杆菌为宿主细胞，此过程可通过发酵手段实现)。

所以，本发明的实施为眼部疾病的治疗提供了新的有效药物来源，同时也拓宽了rhIL-1ra的应用领域。

本发明的技术方案和应用效果通过以下实验和实施例进一步说明。

药效学试验

本发明人以日本大耳白兔及Wistar大鼠角膜损伤模型观察了rhIL-1ra的治疗效果，并与地塞米松(目前临床治疗眼表面损伤的常用药物)做了对照。结果表明，rhIL-1ra对日本大耳白兔及Wistar大鼠角膜受碱烧伤和激光烧伤有明显的治疗作用：

(1)角膜裂隙灯观察结果表明，rhIL-1ra能减轻角膜烧伤后充血、水肿等炎症反应；抑制角膜新生血管的形成。

(2)病理组织学观察结果表明，rhIL-1ra可明显减轻角膜基质水肿，抑制炎性细胞浸润，并有利于角膜上皮细胞再生。

(3)OD值测定结果表明，rhIL-1ra有利于角膜透光率的恢复。

(4)形态计量学参数统计表明，rhIL-1ra有利于角膜透明度的恢复以及角膜烧伤混浊斑的缩小。

(5)MTT结果表明，rhIL-1ra对碱烧伤和激光烧伤角膜上皮细胞活力的恢复均有明显的促进作用。

(6)IL-1 ELISA测定结果表明，rhIL-1ra对IL-1有明显的抑制作用。

(7)在本实验模型中，对受试药rhIL-1ra与临床用药地塞米松的疗效进行比较，结果表明，地塞米松有一定疗效，而受试药物rhIL-1ra对角膜碱烧伤和激光烧伤的治疗作用更明显。

毒理学试验

一、急性毒性

由于小鼠眼内无法满足大剂量给药，所以采用皮下注射。结果：

rhIL-1ra经皮下注射的LD₅₀＞34428.6μg/kg。临床上每日结膜囊注射0.1ml(1000μg/ml)的受试物，按60kg体重/人则为1.67μg/kg，本实验给予小鼠剂量相当人用药量的20166倍。

二、单次局部毒性

方法：

1.将家兔左侧眼睑轻轻拉下，将受试物0.1ml滴入结膜囊内，滴药后使眼闭合5-10秒，右眼滴入生理盐水做对照。

2.观察给药后第1，24，48，72小时至7天眼睛局部反应情况。

3.每次观察后均按＂眼损伤程度评分，对每只家兔不同时间的眼角膜，虹膜和结膜的刺激反应程度进行评分，然后再按＂眼刺激分级＂判断受试物眼刺激程度。

结果：

家兔眼内滴入rhIL-1ra后分别于1，24，48，72小时，7天观察受试物对动物的刺激反应，结果显示，眼结膜无充血、水肿、分泌物，虹膜正常，也无角膜混浊。根据眼刺激反应评分标准，其积分为0，属无刺激性物质。

三、局部毒性(多次)

实验方法：

1.给药时间：14天。

2.分组：将家兔随机分为2组，每组4只。

    (1)组为正常眼结膜刺激组。

    (2)组为破损眼结膜刺激组。

3.给药剂量：实验组给予rhIL-1ra原液，每次0.1ml。

            对照组为生理盐水，每次0.1ml。

4.实验步骤：

4.1实验前检查家兔眼有无异常。

4.2正常眼结膜刺激组：将家兔左侧眼睑轻轻下拉，将0.1ml原液滴入结膜囊中，立即轻轻闭合眼睑约5-10秒。右眼滴生理盐水为对照。一日一次，连续14天。

破损眼结膜组：先将家兔左侧眼结膜用针头划伤至出血，然后滴入0.1ml原液于结膜囊中，立即轻轻闭合眼睑约5-10秒，每日划痕一次，给药一次，连续14天。右眼作为对照。

4.3于实验前及实验后，用裂隙灯，眼底镜检察眼睛及眼底的情况。每日观察眼刺激情况，并根据眼刺激反应评分标准进行评分。且停药后24h剖杀部分动物取眼睑及眼球作病理观察，其它动物继续观察7天。

结果：

1.正常眼结膜组：动物连续给药14天后，给药眼睛结膜未见充血、水肿、分泌物增多；角膜未发现上皮性炎症、水肿、角膜后沉浊物；前房清亮，虹膜正常，晶状体透明；眼底、视乳头及血管走向正常，视网膜也未见肿胀，充血。病理解剖后，镜下观察睑结膜少量炎细胞浸润，属轻度慢性炎，其程度与对照相比无异常改变，推测其轻度慢性炎是由于双侧眼机械刺激造成(翻眼皮滴药)。根据眼刺激评分标准，其眼刺激最高平均积分为0，根据眼刺激强度评分标准为无刺激性。

2、破损眼结膜组：每日将兔眼一侧皮肤划伤出血后给药0.1ml，连续观察14天结果显示，肉眼看结膜轻度充血，划伤部位恢复较好，裂隙灯和眼底镜检察结膜轻度充血，但无水肿和分泌物增多现象，角膜无上皮性炎症、水肿、角膜后沉浊物，前房清亮，虹膜正常，晶状体透明，眼底视乳头及血管走向正常，视网膜也未见肿胀充血。病理镜下可见睑结膜上皮下可见局部多量淋巴细胞聚集，个别已形成淋巴集结为慢性炎，而对照组睑结膜上皮细胞下局部亦有少量淋巴细胞浸润，为轻度慢性炎，测其轻度慢性炎由于每日机械刺激造成。

四、长期毒性

1、狗的长期毒性

以112，28，7μg/kg剂量(相当于人临床用药量1.67μg/kg的64、16、4倍)分别给狗皮下注射rhIL-1ra，连续6周。实验期间观察动物的一般反应，生长发育和进行尿液、血液学、血液生化学、免疫等各项指标测定和分析，并于给药后6周及停药后两周活杀部分动物。取心、肝、脾、肺、肾等23种组织作组织病理组织学检查。

rhIL-1ra给狗连续6周皮下注射结果表明，该药对狗的毒性随给药量增加而加重，有一定的毒效关系。实验显示，以112μg/kg的rhIL-1ra给Beagle狗连续皮下注射6周，可以产生一定的毒性反应，主要表现为动物一过性尿胆红素量增加，白血球升高，骨髓早幼红细胞数目减少，但是上述为可逆变化，可以恢复。给药6周后，脾脏增大，而停药恢复2周后，胸腺也呈增高趋势。

rhIL-1ra 28μg/kg组WBC一过性较对照组升高，超过正常值，脾脏器系数增高。

rhIL-1ra 7μg/kg在各项指标中未见明显毒性反应，可认为7μg/kg长期皮下注射对狗是安全剂量。

2、兔的长期毒性

将中国药物检定所提供的大耳白家兔分成两组，每组10只，雌雄各半。实验组动物双侧眼睛每日滴入rhIL-1ra原液约为120μg/kg(相当临床用药量的72倍)，连续给药6周，对照组给生理盐水。给药后按照大鼠长期毒性实验的要求，定期进行血液及生化各项指标的检测以及眼睛和眼底的观察，并于给药后6周和停药后2周剖杀半数动物，分别做病理组织学观察。

给家兔眼内滴入rhIL-1ra原液，连续6周，用裂隙灯、眼底镜观察结果显示，动物眼结膜、角膜、虹膜正常，前房清亮，晶状体透明，眼底：视乳头、血管走向、视网膜等未见异常改变。

家兔连续滴眼6周，于给药2周后家兔体内即可检测到rhIL-1ra抗体复合物，雌性动物抗体水平明显高于雄性动物，随给药时间的增加rhIL-1ra抗体水平增加，给药后4周雌性动物，给药后5周雄性动物体内的rhIL-1ra抗体水平较对照组差异显著，停药后动物体内抗体较末次给药时明显升高，停药80天后抗体水平下降到给药2周时水平，100天抗体消失。实验期间，给药组中雌性或雄性家兔的凝血时间，白细胞、中间细胞，BUN，心、肾脏器系数，骨髓细胞中的部分粒细胞间断性低于或高于对照组，均在正常范围内，停药两周后恢复正常水平。

3、大鼠的长期毒性

以200、40、8μg/kg，(相当人临床用药量1.67μg/kg的120、24、5倍)，给大鼠皮下注射rhIL-1ra，连续6周。实验期间每日观察动物的一般反应、生长发育、死亡等情况，并于给药3周、6周及停药后2周观察动物的尿液中亚硝酸盐(NIT)、pH、葡萄糖(GLU)、蛋白质(PRO)、隐血(OB)、酮体(KET)、胆红素(BIL)、尿胆原(URO)，血液学：白细胞+分类(WBC+DC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、血色素(Hb)、凝血时间(CT)，血液生化学：天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(T-BIL)、肌苷(Crea)和总胆固醇(T-CHO)及免疫等指标的变化，并于给药后6周及停药后2周活杀部分动物，取心、肝、脾、肺、肾等23种组织作病理组织学检查。

实验结果表明：rhIL-1ra高剂量组给大鼠连续皮下注射6周，可以产生较明显的毒性反应，其主要毒性反应为给药6周后，URO、BIL、OB、GLU高于对照组。雌性动物血小板数量增多，TP、ALB下降，雄性动物的ALT、ALP明显升高，停药二周后脾脏器系数明显高于对照组，Glu雄性动物间歇性升高，超过正常值范围。结果表明：给大鼠长期皮下注射200μg/kg是有较明显的毒性剂量关系。

rhIL-1ra中剂量组给大鼠长期皮下注射，可产生较轻度的毒性反应，实验6周时，URO、OB高于对照组，雌性动物TP、ALB下降，雄性动物ALP升高，脾脏器系数升高，并超过正常值。低剂量组在本实验中，未见对大鼠产生明显的毒性反应，可以认为8μg/kg长期皮下注射对大鼠是安全剂量，该剂量为临床用药量的5倍。

哺乳动物培养细胞染色体畸变试验

rhIL-1ra受试浓度为200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml及1600ng/ml，非活化组作用24h时，染色体畸变率分别为2.0％、0.5％、0.5％及0.5％，作用48h时，染色体畸变率分别为1.0％、1.0％、1.0％及1.5％。活化组作用6h后换液培养至24h收获细胞，以上四个浓度组染色体畸变率分别为0.0％、0.5％、1.0％及3.0％。经统计学处理，无论是否代谢活化，白细胞介素1受体拮抗剂各浓度组染色体畸变率与阴性对照组比较均无显著性差异(p＞0.05)，根据新药(西药)临床前研究指导原则汇编中的标准判断，在本试验浓度范围内，染色体畸变试验结果为阴性。

微生物回复突变试验

rhIL-1ra受试剂量为6μg/皿、12μg/皿、24μg/皿、60μg/皿、120μg/皿时，加或不加混合功能氧化酶条件下，Ames试验的TA97、TA98、TA100及TA102四个菌株的回复突变数均未超过自发回变的两倍，为阴性结果。

啮齿类动物微核试验

昆明种小鼠皮下注射rhIL-1ra，给药剂量为5、50、150μg/kg，24h处死动物取骨髓检查，微核率分别为0.8‰、0.8‰、2.3‰，为阴性结果。

一般药理

观察全身和局部应用rhIL-1ra对动物各重要生命指征和神经系统的影响。

实验方法：

rhIL-1ra对小鼠精神神经系统的影响：

48只小鼠随机分为4组，分别静脉注射(iv)磷酸盐缓冲液(PBS)，IL-1ra0.35μg/kg，0.7μg/kg及3.5μg/kg，直接观察小鼠一般行为表现。

rhIL-1ra对大鼠心率、血压、心电图及呼吸的影响：

32只大鼠随机分为4组，分别iv磷酸盐缓冲液(PBS)，rhIL-1ra0.25μg/kg，0.5μg/kg及2.5μg/kg。ip戊巴比妥纳(40mg/kg)麻醉后，颈总动脉插管测血压，用心电图机描记II导联心电图，用生理多道记录仪同步观察和记录血压和呼吸的变化。

结果：

1.iv rhIL-1ra0.35μg/kg，0.7μg/kg及3.5μg/kg对小鼠的一般行为没有明显影响。

2.iv rhIL-1ra0.25μg/kg，0.5μg/kg及2.5μg/kg对戊巴比妥钠麻醉大鼠的血压、心率及II导心电图无显著影响。

3.iv rhIL-1ra0.25μg/kg，0.5μg/kg及2.5μg/kg对戊巴比妥钠麻醉大鼠的呼吸频率和幅度无明显影响。

注：用上述剂量点眼对小鼠的一般行为无明显影响。对戊巴比妥钠麻醉大鼠的血压、II导心电图、呼吸频率和呼吸幅度也无显著影响。

滴眼液制备实施例

一、制剂处方

NaCl       80.0g    0.8％

Na₂HPO₄ 14.4g    0.144％

KH₂PO₄  2.4g     0.024％

KCl        2.0g     0.02％

甘露醇     60.0g    0.6％

人血白蛋白 1.0g     0.01％

rhIL-1ra   50.0mg

灭菌注射用水至  1000ml

二.制备工艺

1.配液

A.按需分装成品量和工艺处方要求，精确称取NaCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、KCl。

B.按需分装量和工艺处方中标明的最终浓度，量取20％甘露醇注射液和20％人血白蛋白。

C.将所称量之NaCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄溶于少量无菌无热源注射用水中，使其完全溶解。

D.依次加入所量取之甘露醇和人血白蛋白。

2.加入主料

A.准确测定主药原液之蛋白浓度。

B.按成品中主药终浓度和成品分装量，准确量取主药量。

C.将量取之主药加入已配制之稀释液中，并精确测定全液体积。

D.补足少量无菌、无热源注射用水至最终容积。

3.混匀：将加入主料并定容后之液体倒入经无菌、无热源处理之容器中，使之充分混匀。

4.分装

A.将分注器之装量刻度按分装需要调整(本品为3ml±0.3)。

B.将分注器进液管(经无菌、无热源处理)插入混匀后药液中。

C.将灭菌处理后之滴眼剂瓶，排列于托盘中，置于分注器出液口处之工作台上。

D.开动分注器，使药液按分装量依次注入滴眼剂瓶中。

5.保存：密封后成品置于2-10℃冰箱保存。

6.检定：自密封后成品中，随机抽样进行下列指标检定。

A.外观：无破损，无漏液，封口完好。

B.澄明度：瓶内药液应无色、透明、无混浊、无沉淀。

C.pH值：7.0±0.2。

D.渗透压：280-320mOsmol。

E.生物学活性：1.5×10⁴U/支。

Claims (10)

1、重组人白细胞介素-1受体拮抗剂在制备治疗眼部疾病的药物中的用途。

2、权利要求1所述的用途，其中，所述眼部疾病包括眼表非感染性炎症。

3、权利要求1所述的用途，其中，所述眼部疾病包括沙眼、角膜病和眼外伤。

4、权利要求1-3任一项所述的用途，其中，所述治疗眼部疾病的药物为含有治疗有效量的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂和药剂学上可接受的辅剂的药物组合物。

5、权利要求4所述的用途，其中，所述治疗眼部疾病的药物为滴眼剂，其每1000毫升中包括缓冲物90-120克、甘露醇50-70克、人血白蛋白0.5-2克、重组人白细胞介素-1受体拮抗剂40-70毫克、和余量注射用水。

6、权利要求5所述的用途，其中，所述缓冲物包括：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钾。

7、权利要求4或5所述的用途，所述滴眼剂的组成每1000毫升中包括：

    NaCl             80.0g

    Na₂HPO₄       14.4g

    KH₂PO₄        2.4g

    KCl              2.0g

    甘露醇           60.0g

    人血白蛋白       1.0g

    rhIL-1ra         50.0mg

    灭菌注射用水至   1000ml。

8、治疗眼部疾病的药物，包括治疗有效量的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂和药剂学上可接受的辅剂

9、权利要求9的药物，其为滴眼剂，每1000毫升中包括缓冲物90-120克、甘露醇50-70克、人血白蛋白0.5-2克、重组人白细胞介素-1受体拮抗剂40-70毫克、和余量注射用水。

10、权利要求9所述的药物，所述滴眼剂的组成每1000毫升中包括：

    NaCl             80.0g

    Na₂HPO₄       14.4g

    KH₂PO₄        2.4g

    KCl              2.0g

    甘露醇           60.0g

    人血白蛋白       1.0g

    rhIL-1ra         50.0mg

    灭菌注射用水至   1000ml。