KR20190039145A - 대체 면역요법으로서의 il-12의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명의 양상 및 실시양태는 대체 면역요법으로서 인터루킨 12(IL-12)을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 생리학적 용량의 외인성 IL-12를 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.

Description

대체 면역요법으로서의 IL-12의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 7월 18일자 출원된 미국 가 특허 출원 제62/363,648호의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 참고로 본원에 통합되었다.

분야

본 발명은 일반적으로 대체 면역요법에서 IL-12를 이용하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

배경

다음은 본 발명의 다양한 양상 및 실시양태를 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에서 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 또는 현재 기술되거나 또는 청구된 발명과 관련이 있거나, 또는 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 임의의 간행물 또는 문서가 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.

인터루킨-12(IL-12)는 p40 및 p35 서브유닛 모두를 포함하는 이종이량체 사이토카인이며, 이는 면역에서 그의 역할이 잘 알려져있다. 약 20년에 걸친 수많은 보고서에서, IL-12는 염증 반응, 감염에 대한 선천적 저항성, 및 적응성 면역을 조절함에 의해 면역의 선천적 및 적응성 아암 간의 상호작용에서 필수적인 역할을 갖는 것으로 나타났다. 내인성 IL-12는 많은 병원균 및 이식 가능하고 화학적으로 유도된 종양에 대한 저항성이 필요하다. 면역에서 IL-12의 특징적인 효과는 자연 살해(NK) 세포, 대식 세포 및 T 세포로부터 인터페론-감마(IFN-γ)의 생성을 자극하는 능력이다. 또한, 90년대 초반에서 중반의 여러 시험관 내 연구는 IL-12가 다른 사이토카인과 상승작용으로 조혈을 자극할 수 있다고 보고하였다. IL-12의 조혈 촉진 활성은 이들 연구가 고도로 정제된 전구세포 또는 심지어 단일 세포를 사용함으로써 골수 줄기세포에 대한 직접적인 작용에 기인하는 것으로 나타났다. IL-12의 조혈 활성에서 IFN-γ의 역할은 여러 연구가 IFN-감마에 대한 조혈의 촉진 및 억제 양자가 연계되기 때문에 명확하지 않다.

IL-12는 전신 방사선에 노출되기 전 또는 직후에 사용될 때 방사선 보호 기능을 갖는 것으로 나타났다. IL-12는 골수를 보호하고 장관을 이온화 방사선에 민감하게 한다. IL-12는 이온화 방사선 후에 내인성 조혈의 회복 및 줄기세포의 생착 양자를 용이하게 한다.

IL-12는 잘 특성화된 사이토카인이다. 1989년에, IL-12는 제네틱스 인스티튜트, 인코포레이티드(Genetics Institute, Inc.)와 더 위스타 인스티튜트 오브 언애토미 엔 바이오롤지(The Wistar Institute of Anatomy and Biology)에 의해 자연 살해자극 인자(NKSF)로서 독립적으로 확인되었다. 1990년에, IL-12는 호프만 라 로슈, 인코포레이티드(Hoffmann-La Roche, Inc.)에 의해 세포독성 림프구 성숙 인자(CLMF)로서 독립적으로 확인되었다. 1991년에, 제네틱스 인스티튜트, 인코포레이티드에서 IL-12 cDNA를 클로닝하고 인터루킨-12로 명명하였다. 1993년에, 선천 및 적응성 면역을 조절 및 브리징하는 IL-12의 중심적 역할이 발견되었다. 1995년에, IL-12의 항 혈관형성 성질을 발견하였다. 1996년에, IL-12 수용체는 호프만 라 로슈, 인코포레이티드에 의해 특성화되었다. 1993년에서 2002년까지, 흑색종, 유방 암종, 결장 암종, 신장 암종, 및 육종을 포함하는 뮤린 모델에서 IL-12의 항종양 및 항전이 활성을 광범위하게 밝혀내었다. 1997년에서 2004년까지, 암 환자에서의 IL-12 단독요법이 주로 연구되었다. CTCL, AIDS 관련 카포시 육종, NHL 및 흑색종을 제외하고는 단일 약제로서의 효능이 미미하였다. 암 환자에서의 제한된 임상 효능에 대한 이유는 이용된 고용량 및 반복 용량 양생법으로 인해, 타키필락시스(탈감작)로 이어지기 때문이다.

2003년에서 2007년까지, 뉴메디슨즈 인코포레이티드(Neumedicines Inc.)는 IL-12의 단일 저용량이 마우스에서 치사 이온화 방사선 후 내인성 조혈의 회복을 용이하게한다는 것을 발견하였다. 2005년에서 2008년까지, 뉴메디슨즈, 인코포레이티드는 골수 억제, 종양 보유의 뮤린 모델 시스템에서 프로-조혈 및 항종양 활성 (조혈 면역 치료 효과) 모두를 입증하였다. 2008년에서 현재까지, 뉴메디슨즈-BARDA 협력은 방사선 의료 대책으로서 IL-12를 개발하기 시작하였다. 2009년에서 2014년까지, 뉴메디슨즈 인코포레이티드는 원숭이에서의 방사선 의료 대책으로 IL-12의 효능(조혈 효과)을 입증하였으며, 건강한 지원자의 안전성을 입증하였다.

근본적인 면역 억제를 사용하여 다양한 질환 및 상처를 치료하는 방법이 기술 분야에서 필요하며, 이것은 내인성 IL-12의 발현 억제를 초래한다는 것과 관련된다.

발명의 요약

본 발명은 (a) 내인성 IL-12 발현의 억제를 초래하는 질환 또는 상처를 앓고 있는, 필요로 하는 피험자를 확인하는 단계; 및 (b) 피험자에게 하나 이상의 생리학적 용량의 외인성 IL-12를 투여하는 단계를 포함하는 대체 면역요법으로서 IL-12를 투여하는 방법을 제공한다. 내인성 IL-12 발현의 억제는 항원 제시 세포 및 수지상 세포를 포함하는 억제 핵심 면역 세포의 억제를 초래할 수 있다.

본 발명의 한 양상에서, 하나 이상의 생리학적 용량의 외인성 IL-12를 투여하기 전에, 치료될 환자 집단은 약 5 pg/ml 미만 또는 약 1 pg/ml 미만의 IL-12 발현 수준을 갖는다. 일반적으로 치료될 환자는 1 pg/ml 미만의 IL-12 발현 수준을 갖거나 또는 검출 하한(LLOD: 검출 하한)보다 낮은 발현 수준을 가질 것이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 생리학적 용량의 외인성 IL-12의 투여는 내인성 IL-12 발현과 관련된 다면발현성 수복(pleiotropic reparative), 항감염 및 항종양 반응을 포함하는 내인성 IL-12 다면발현성 면역 및 조혈 효과를 복원한다. 또한, 생리학적 용량의 외인성 IL-12의 투여는 만성 질환 및 상처가 있는 피험자에 대하여 개선된 성과를 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 외인성 IL-12의 생리학적 용량은 IL-12 p70에 대한 표준 ELISA에 의해 측정시 약 5 피코그램/ml 초과 및 약 200 피코그램/ml 미만인 말초 혈액에서의 NM-IL-12의 범위를 얻는다. 피험자의 말초 혈액에서의 IL-12의 측정가능한 수준은 또한 말초 혈액에서의 IFN-γ의 수반되는 증가를 나타낼 수 있고, 더욱이, 투약 후 IFN-감마의 수반되는 수준은 약 20 pg/ml 내지 약 1000 pg/ml의 범위일 수 있다.

또한, 외인성 IL-12의 생리학적 용량은 약 1 ㎍ 초과 및 약 20 ㎍ 미만, 약 8 ㎍ 초과 및 최대 약 15 ㎍, 또는 약 10 ㎍ 초과 및 최대 약 12 ㎍일 수 있다.

여전히 또 다른 실시양태에서, 질환 또는 상처에 대한 치료 과정 동안, 피험자에게 치료 용량 및 유지 용량의 2가지 생리학적 용량 수준의 IL-12를 제공할 수 있다. 2가지 유형의 용량은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, IL-12의 치료 용량은 약 1 ㎍ 초과 및 약 20 ㎍ 미만일 수 있으며; 및/또는 IL-12의 유지 용량은 약 1 ㎍ 초과 및 약 10 ㎍ 미만일 수 있다. 또한, IL-12의 치료 용량은 약 2주마다, 약 3주마다, 또는 약 4주마다 제공될 수 있으며; 및/또는 IL-12의 유지 용량은 약 1개월마다, 약 2개월마다, 또는 약 3개월마다 제공될 수 있다.

IL-12의 하나 이상의 생리학적 용량은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 국소, 피하, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 경막 외 또는 비경구를 포함하는 임의의 약학적으로 허용가능한 수단으로 투여될 수 있다.

NM-IL-12는 재조합 인간 IL-12, 예컨대, rHuIL-12일 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 피험자는 만성 신장 질환을 가지며, 외인성 IL-12의 투여는 신장의 복구 및 재생을 유도하며, 이에 의해 CKD의 진행을 둔화시킨다. CKD의 진행의 둔화는 피험자에서의 크레아티닌 감소, 혈중 요소 질소(BUN) 감소, 알부민뇨 감소, 또는 사구체 여과율(GFR) 증가 중 하나 이상에 의해 입증될 수 있다. 예를 들어, 외인성 NM-IL-12의 투여는 외인성 IL-12 투여의 부재시에 관찰되는 진행과 비교하여, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% CKD의 진행을 둔화시킬 수 있다. 외인성 IL-12의 투여는 CKD에 대한 종래의 치료와 조합하여 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 피험자는 상처를 가지며, 외인성 IL-12의 투여는 조직으로의 세포 이동을 용이하게 하여 상처 치유 및 조직 복구를 돕고 이에 따라 상처의 치유를 가속화시키도록 한다. 피험자는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 노령 피험자, 당뇨병 피험자 또는 외과적 상처가 있는 피험자를 포함하는 상처가 있는 모든 피험자 일 수 있다. 다른 실시양태에서, 피험자는 노령자이며 욕창(pressure ulcer)을 갖거나, 또는 피험자는 당뇨병 환자이며 족부 궤양을 갖는다. 외인성 NM-IL-12의 투여는 외인성 IL-12의 투여의 부재시에 관찰되는 치유의 속도와 비교하여, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 상처 치유의 가속화를 유도할 수 있다. 외인성 IL-12의 투여는 상처에 대한 종래의 치료와 조합하여 이용될 수 있다.

한 실시양태에서, 피험자가 연령 관련 황반 변성(AMD)을 가지며, 외인성 IL-12의 투여는 AMD 진행의 둔화 또는 역전을 유도한다. 예를 들어, AMD의 진행은 (i) IL-12가 다중 혈관형성 인자(angiogenic factor)에 대해 광범위한 항 혈관형성 효과를 갖기 때문에 혈관신생(neovascularization)을 감소시키며; 및/또는 (ii) 노화 대식세포의 보충에 의한 면역 균형을 복원하는 IL-12의 효과에 의해 둔화되거나 역전될 수 있다. 외인성 IL-12의 투여는 AMD에 대한 종래의 치료와 조합하여 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 외인성 IL-12의 투여는 외인성 IL-12 투여의 부재시에 관찰되는 것과 비교하여, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% AMD 진행의 둔화 또는 역전을 유도한다. 또 다른 실시양태에서, IL-12는 (i) 임의의 경로를 통해; (ii) 안구 내 이외의 임의의 경로를 통해, (iii) 피하 주사를 통해, 또는 (iv) 안구 내 주사를 통해 투여될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 피험자는 골다공증을 앓고 있으며, 외인성 IL-12를 투여하면 조혈 줄기세포가 유발되어 골수 내에서 세포를 재생 및 이동시키게 된다. 외인성 IL-12의 투여는 골 손실 감소 및/또는 파골세포 형성 감소를 유도할 수 있다. 예를 들어, 외인성 IL-12의 투여는 외인성 IL-12 투여의 부재시에 관찰되는 것과 비교하여, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 골 손실 감소 및/또는 파골세포 형성 감소를 유도할 수 있다. 외인성 IL-12의 투여는 골다공증에 대한 종래의 치료와 조합하여 이용될 수 있다.

본원에서 기술되고 청구된 본 발명은 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 이러한 간략한 요약에서 설명되거나 기술되거나 또는 참조한 것을 포함하여 많은 특질 및 실시양태를 갖는다. 모든 것을 포함 시키고자 하는 것은 아니며, 본원에서 기술되고 청구된 발명은 설명 만의 목적으로만 포함되고 제한을 위한 것이 아닌 이러한 간략한 요약에서 확인된 특징 또는 실시양태에 의해 제한되는 것은 아니다. 추가적인 실시양태는 하기의 상세한 설명에서 개시될 수 있다.

도 1: NM-IL-12가 재생(줄기세포 및 전구세포를 통해, 모든 혈액 세포 계통을 보충하는 기능), 근절(선천적(NK 세포) 및 적응성 면역(CD8+ 및 CD4+ 세포)을 통해 바이러스, 세균, 및 종양), 및 복구(상처 치유, 조직 복구, 및 면역 감시)하는 줄기세포, 조혈 및 면역 세포 인자임을 그래픽으로 설명하는 것이다.
도 2: 세포 재생이 유의하게 향상되었음을 입증하는(도 2b), 방사선 노출(예컨대, 골수 절제)(도 2a) 후 NM-IL-12를 평가한 비 인간 영장류에서의 비 임상 연구 사진을 나타낸다. 또한, NM-IL-12는 장루 복구술(stoma takedown) 환자에서 조직 손상(도 2c)의 복구를 입증하는 임상적 성공을 갖는 것으로, 그 분자는 외과 절개로 야기된 조직 손상의 유의하게 가속된 봉합(100 %)을 입증한다(도 2d). 마지막으로, NM-IL-12는 종양 성장을 근절하는 임상적 성공을 나타내는 것으로, IL-12는 피부 T 세포 림프종 환자(도 2e)를 치료하기 위해 사용되어 근절 및 완전 지속형 반응을 유도한다(도 2f).
도 3: NM-IL-12가 CD34+ 세포, 줄기세포, 전구세포, 거핵구, 림프아구, 과립아구, 미성숙 NK 세포, 및 망상적혈구와 같은 골수 내의 세포를 자극하여 어떻게 조혈을 자극하는 지를 그래픽으로 묘사한다. NM-IL-12는 또한 혈액으로부터 조직으로의 세포의 이동을 용이하게 하여 상처 치유 및 조직 복구를 돕는다.
도 4: 당뇨병성 족부 궤양(DFU), 만성 신장 질환(CKD) 및 골다공증의 3가지 예시적인 질환 상태에서 재생, 근절 및 복구를 유도할 때 NM-IL-12의 효과를 그래픽으로 나타낸다.
도 5: 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL) 및 연령 관련 황반 변성(AMD)의 2가지 예시적인 질환 상태에서 재생, 근절, 및 복구 NM-IL-12를 유도할 때 NM-IL-12의 효과를 그래픽으로 나타낸다.
도 6: 만성 질환 또는 노화가 핵심 면역 세포, 즉 항원 제시/수지상 세포를 억제하고, IL-12 생성을 저해하여 면역 적격을 어떻게 감소시키는지를 그래픽으로 나타낸다.
도 7: 도 6에서 제시된 문제에 대한 해결책을 그래픽으로 나타내며, 이것은 외인성 NM-IL-12로서 IL-12의 사용은 핵심 면역 적격을 복원하여 다면발현성 수복, 항감염 및 항종양 반응을 다시 일으키고 이에 의해 만성 질환, 암, 감염 및 노화가 있는 환자에 대한 성과를 개선한다.
도 8: 대체 면역요법으로서 NM-IL-12가 모든 핵심 성숙 면역 이펙터 세포 및 골수의 미성숙 전구 및 줄기세포에서 발견되는 고유의 IL-12 수용체와의 상호작용을 통해 내인성 IL-12 다면발현성 면역 및 조혈 효과(문헌[Lasek et al., Cancer Immunol. Immunother., 63:419 (2014)]에서 택함)를 어떻게 복원하는 지를 시각적으로 묘사한다.
도 9: EPO의 발현이 신장 수질 세관에서 발생하는 것으로 표시되는 것을 나타낸다. 인간 피질 및 수질에서의 슬라이드가 붉은털 원숭이(Rhesus monkey) 수질에서의 슬라이드와 함께 나타내었으며, 인간 피질 세관이 아닌, 인간 및 붉은털 원숭이의 수질, 세관에서 IL-12Rβ2의 발현을 설명한다.
도 10: 단일, 저용량의 NM-IL-12가 붉은털 원숭이에서 EPO를 유발하고 적혈구의 전구체인 망상적혈구 증가를 유도함을 나타낸다. EPG(pg/mL) 대 시간은 3개의 처리 군에 대해 나타낸다: 1군 = 0 ng/kg NM-IL-12(n = 3); 2군 = 50 ng/kg NM-IL-12(n = 3); 3군 = 500 ng/kg NM-IL-12(n = 4). 또한 도면에서 동일한 3개의 처리 군에 대한 망상적혈구(% 변화)대 시간의 그래프를 나타낸다.
도 11: 단일 저용량의 NM-IL-12(12 μg)는 인간에서 직접적으로 EPO를 유발함을 나타낸다. 묘사된 이 그래프는 두 처리 군에 대한 EPO(pg/mL)를 나타낸다: 1군 = 12 ㎍의 NM-IL-12 투여 SC, 단일 용량, n = 4 피험자; 2군 = 플라세보, n =8 피험자.
도 12: NM-IL-12의 단일, 저용량 SC 주사가 인체에서 필요에 따라 조직 복구 및 재생을 위해 순환하는 성숙 말초 혈액 세포 및 미성숙 CD34+ 조혈 전구 세포를 이동시키는 것이 발견되었음을 나타낸다. 도 12a-f는 도 12a = 망상적혈구, 도 12b = 혈소판, 도 12c = CD34+ 세포, 도 12d = 림프구, 도 12e = 호중구, 및 도 12f = NK 세포로 건강한 지원자에서 12 ㎍ NM-IL-12(48명의 피험자) 또는 플라세보(12명의 피험자)에 의한 혈액학적 변화를 나타낸다.
도 13: 당뇨병 환자와 치유되지 않은 상처를 가진 노령자에서 둔화 치유되는 상처 봉합의 가속화에서 IL-12의 예상 유용성을 시각적으로 묘사한다.
도 14: 상처 치유의 자극에서 IL-12에 대한 이전에 확인되지 않은 역할은 정상적인 도 14a 및 상처를 입은, 조사된 피부 조직에서 입증된다(도 14b 및 14c). 조사된 피부에서, IL-12Rβ2 수용체는 진피의 기저막(BM) 및 모낭 밑에 있는 피지(SE)선의 전구 세포에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다.
도 15: 수컷 및 암컷 마우스 모두에게 비히클 또는 재조합 뮤린 IL-12(15 ng)를 국소 투여하여 얻어진 결과의 비교로, 상처 영역(0일의 %로서 표현됨) 대 손상 후 일자의 그래프를 나타낸다. 전신 조사(TBI, 500 cGy) 및 전체 두께 피부 손상된 수컷 및 암컷 마우스에 손상 당시 및 손상 3일 및 6일 후 재조합 뮤린 IL-12(rMuIL-12, 15ng, 국소) 투여는 비히클 처리 마우스와 비교하여 상처 치유가 유의하게 가속화되었으며 완전한 상처 봉합을 제공하였다. 스튜던트 t 테스트에 의한 통계 분석, ^*p≤0.05, ^**p≤0.01.
도 16: 당뇨병 배경이 있는 주커 쥐(Zucker rat)에서, 비히클의 국소 투여와 재조합 뮤린 IL-12의 2가지 상이한 복용량(rMuIL-12, 15 및 474ng, 국소)으로 얻은 결과를 비교한 것으로, 상처 영역(0일의 %로 표시됨) 대 손상 후 일자의 그래프를 나타낸다. rMuIL-12의 단일 투여는 전체 두께 손상의 치유가 유의하게 가속되었다. 스튜던트 t 테스트에 의한 통계 분석, *p≤0.05, **p≤0.01.
도 17: 비히클 (국소), 15 ng rMuIL-12 국소 3x/일, 15 ng rMuIL-12 국소 1x/일, 및 20 ng rMuIL-12 피하(SC) 1x/일의 4가지 처리 군에 대한 상처 영역(0 일의 %로 표시됨) 대 손상 후 일자의 그래프를 나타낸다. 20 ng rMuIL-12 SC 1x/일을 수용하는 동물은 유의하게 가장 빠른 상처 치유를 나타내었으며, 15 ng rMuIL-12 국소 3x/일을 수용하는 동물은 다음으로 가장 빠른 치유 속도를 나타내었다. 스튜던트 t 테스트에 의한 통계 분석, *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001.
도 18: 도 18a는 비히클의 국소 적용 후의 상처의 사진을 나타내며, 한편 상처의 현저한 치유를 나타내는 도 18b는 SC rMuIL-12(20ng, 도 17의 데이터로부터 생성됨)로 얻어진 결과를 묘사한다.
도 19: 형광 수명 현미경을 사용하여 치유하는 동안 상처가 있는 피부의 대사 활성의 동역학을 나타낸다. 형광 수명(ps) 대 연구 일자의 그래프는 치유하는 동안 상처가 있는 피부에서 대사 활성의 동역학을 나타낸다. SC rMuIL-12 + 상처 군은 2 일차의 상처가 있는 플라세보 군에 비해 유의하게 더 긴 형광 수명을 갖는다(^‡, p <0.05). SC rMuIL-12 + 상처 군은 3 일차의 상처가 없는 군에 비해 유의하게 더 긴 형광 수명을 갖는다(^‡, p <0.05). 마지막으로, rMuIL-12 + 상처 군은 0일과 비교하여 2일 및 3일 차에 유의하게 더 긴 형광 수명을 갖는다(^*, p <0.05).
도 20: 대체 면역요법으로서 NM-IL-12가 감염과의 싸움 및 상처 치유를 위해 내인성 IL-12의 다면발현성 면역 및 조혈 효과를 어떻게 복원하는지를 그래픽으로 묘사한다(문헌[Lasek et al., Cancer Immunol . Immunother., 63 : 419 (2014)]에서 택함).
도 21: (i) IL-12가 다중 혈관형성 인자에 대한 광범위한 항 혈관형성 효과를 가짐으로 인한 혈관신생 감소; (ii) 눈에서 "면역 멜트다운(immune meltdown)"의 핵심 매개체인 IL-17 억제; 및 (iii) 노화 대식세포의 보충에 의한 면역 균형 복원에 의해 AMD에서 NM-IL-12의 다면발현성 효과가 어떻게 진행을 역전 시킬 것으로 예상되는지를 그래픽으로 묘사한다.
도 22: 염기성 섬유모세포 성장 인자 유도된(펠릿 P) 마우스 각막 혈관신생에 대한 재조합 뮤린 IL-12의 효과를 나타낸다. 도 22a-f는 염기성 섬유모세포 성장 인자 펠릿(P)의 주입 5일 후 비히클 처리(대조) C57 BL/6 마우스(도 22a), SCID 마우스(도 22b), 및 베이지 마우스(도 22c) 또는 12-처리 C57BL/6 마우스(도 22d), SCID 마우스(도 22e), 및 베이지 마우스(도 22f)의 각막을 나타내는 사진을 묘사한다. 도면은 rMuIL-12가 혈관형성의 저해제임을 나타낸다.
도 23: 레이저 유도된 눈 손상 모델(실험적 맥락막 혈관신생)에서 평균 병변 부피에 대한 안구 내 재조합 뮤린 IL-12의 용량 반응을 나타낸다. rMuIL-12는 0.1 및 1 ng/눈에서 평균 혈관 병변 부피(형광 표지된 항 콜라겐 IV 항체 염색의 분석으로부터 결정됨)를 유의하게 감소시켰다. 스튜던트 t 테스트에 의한 통계분석, 0.1 및 1ng/eye rMuIL-12 양자에 대한 비히클 단독과 비교하여 *p≤0.02.
도 24: 레이저 유도된 눈 손상 모델에서, 비히클 또는 용량의 재조합 뮤린 IL-12의 안구 내 투여 후 형광 혈관 병변의 시각화를 나타낸다(도 24a=비히클; 도 24b=0.1 ng IL-12; 도 24c=0.1 ng IL-12; 및 도 24d=1 ng IL-12).
도 25: 레이저 유도된 눈 손상 모델에서 비히클(약 2.6), 항 VEGF 항체(약 1.7), 및 rMuIL-12(약 1.75) 처리 후 평균 혈관 병변 부피(㎛3 x 106)의 그래프를 나타낸다. rMuIL-12 및 항 VEGF 항체는 유사한 혈관형성의 유의한 저해를 제공한다. 스튜던트 t 테스트에 의한 통계분석, 비히클 단독과 비교하여 *p≤0.05.
도 26: 레이저 유도된 눈 손상 모델에서 비히클(약 112), 항 VEGF(약 60), 및 IL-12(약 60) 처리 후 평균 Iba-1 포지티브 부피(㎛3 x 103)의 그래프를 나타낸다. rMuIL-12 및 항 VEGF 항체는 유사한 혈관형성의 유의한 저해를 제공한다. 스튜던트 t 테스트에 의한 통계분석, 비히클 단독과 비교하여 *p≤0.05.
도 27: NM-IL-12가 시험관 내에서 IL-17을 유의하게 억제한다. PBMC에 첨가된 NM-IL-12는 병원성 Th17/IL-17 반응을 제한하는데 효과적이다. 이 연구에서 인간 PBMC를 2일 동안 0, 1 및 10pM의 NM-IL-12로 배양하였다. 용해물을 제조하고 IFN-γ 및 IL-17의 mRNA에 대하여 탐침(PCR)하였다. 데이터는 평균 ± SEM이고 p 값은 스튜던트 t 테스트이다. 예측된 바와 같이, IL-12 처리는 항 혈관형성 IFN-γ를 유의하게 증가시키고(도 27a), 파괴 IL-17을 유의하게 감소시키는 것을 나타낸다(도 27b).
도 28: 안구 혈관신생에서 정상 대 노화 대식세포의 역할을 나타낸다. 망막의 레이저 유도된 손상 후, 대식세포 침윤은 어린(< 2개월) 및 노령(> 18 개월) 마우스 모두에서 발생한다. 노령의 마우스에서 감소된 IL-12와 증가된 IL-10은 눈에서 손상 유도된 혈관 신생을 감소시키는 능력을 제한한다.
도 29: NM-IL-12가 어떻게 RANKL의 자연 저해제로서 골 소실을 감소시키고, 골수에서 골아세포를 증가시키며, 항원 제시를 용이하게 하고 종양으로의 세포 트래픽킹을 향상시킬뿐만 아니라 CD8+ 및 NK 세포를 활성화시킴으로써 항종양 효과를 갖는지를 그래픽으로 묘사한다.
도 30: TRAP 수 - 대퇴골, 예컨대 비인간 영장류에서 두 처리군(0 ng/kg 및 250 NM-IL-12 ng/kg)에 대한 총 대퇴골 영역의 TRAP(tartrate resistant acid phosphatase)분획을 나타낸다. NM-IL-12의 SC 투여는 대퇴골에서 측정된 파골세포 형성을 유의하게 감소시켰다. 스튜던트 t 테스트에 의한 통계 분석, 비히클과 비교하여 *p≤0.01.
도 31: 유사하게, 도 31은 TRAP 수 - 늑골, 예컨대, 비인간 영장류에서 두 처리군(0 ng/kg 및 250 IL-12 ng/kg)에 대한 총 늑골 영역의 TRAP 분획을 나타낸다. NM-IL-12의 SC 투여는 늑골에서 측정된 파골세포 형성을 유의하게 감소시켰다. 스튜던트 t 테스트에 의한 통계 분석, 비히클에 비해 *p≤0.05.
도 32: 뮤린 IL-12는 조사된 마우스에서 조혈 회복을 촉진한다. IL-12Rβ2에 대하여 염색된 비 조사된, 처리되지 않은 마우스로부터의 대퇴 골수의 대표적인 절편을 도 32a 및 32b에 나타낸다. 동물은 TBI(8.0Gy)를 수행하고 후속하여 조사 후 표시된 시간에서 비히클(도 32c 및 32d) 또는 rMuIL-12(20 ng/마우스)를 피하로 수용하게 하였다(도 32e 및 도 32f). 대퇴 골수를 조사 12일 후 IL-12Rβ2(주황색)에 대해 면역조직화학적으로 염색하였다. 비히클로 처리된 마우스(도 32c 및 d)의 골수는 IL-12Rβ2-발현 세포가 결핍되었고 조혈 재생의 징후가 나타나지 않았지만, rMuIL-12로 처리된 마우스(도 32e 및 f)는 조혈 재구성 및 IL-12Rβ2-발현 거핵구, 골수 전구 세포 및 골아세포의 존재를 나타내었다. 배율 = 100x.
도 33: 골수에서의 IL-12, IFN-γ 및 IL-18-유도된 파골세포 세포자멸의 메커니즘을 시각적으로 묘사하며, 이에 의해 골 손실이 감소한다.
도 34: 건강한 인간 피험자에게 NM_IL-12 또는 플라세보를 SC 투여한 후 시간에 대한 IFN-γ 및 IL-18 양자의 순환 수준의 그래프를 나타낸다. IL-12와 그의 유도된 하류 인자인 IFN-γ 및 IL-12는 RANKL의 자연 저해제이며, 이에 의해 골 손실을 감소시킨다. ^*플라세보 처리된 피험자에서 IFN-γ의 순환 수준은 정량 한계 미만이었다.
도 35: IL-12 및 IFN-γ 베이스라인 수준을 나타낸다. 도 35a 및 35b에서 제시된 박스 및 위스커 플롯(box-and-whiskers plot)은 베이스 라인 값의 5 내지 95 백분위 수를 커버하는 110명의 피험자의 IL-12(35A) 및 IFN-γ(35B) 베이스라인 수준을 위스커로 기술한다. IL-12 베이스라인 수준은 키트 표준 곡선을 사용하여 정의하였다. 도 35a에서 나타낸 바와 같이, 110명의 피험자에 대한 모든 예비 용량 IL-12 수준은 정량 한계 미만(BLQ)(LLOQ = 0.367 pg/ml)이었다. 도 35b에서 나타낸 바와 같이, 거의 모든 IFN-γ 수준은 LLOQ(LLOQ = 1.08 pg/ml) 위로 정량할 수 있었고, 대부분은 낮은 pg/ml 범위이었다. 피험자 1033 및 1055를 포함하는 5개의 상한 이상치(high end outlier)는 IFN-γ> 23 pg/ml의 베이스라인 수준을 나타내었다.

상세한 설명

I. NM - IL -12: 대체 면역요법

본 발명 이전의 존재하는 문제점은 만성 질환, 손상 또는 상처, 노화, 감염 질환 및 암과 같은 질환과 관련이 있는 외견상으로 다양한 조건이 IL-12 발현의 억제를 초래하는 상태와 관련이 있으며, 이로 인해 무수히 많은 바람직하지 않은 효과가 초래된다는 것을 인식하지 못하였다는 것이다. 놀랍게도, 내인성 IL-12의 생성 결핍과 관련된 바람직하지 않은 효과는 IL-12의 생리학적 용량을 투여함으로써 해결될 수 있음이 발견되었다. 구체적으로, 만성 질환, 손상 또는 상처와 같은 질환 및 노화는 핵심 면역 세포, 즉 항원 제시/수지상 세포를 억제하고, IL-12 생성을 저해한다. 도 6. 이 문제에 대한 해결책은 외인성 NM-IL-12의 생리학적 용량이 다면발현성 수복, 항감염 및 항종양 반응을 다시 일으켜 핵심 면역 효과를 복원하고 이에 의해 질환 및 상처가 있는 환자에 대한 성과를 개선하기 때문에, 생리학적 용량의 외인성 IL-12를 투여하는 것이다. 도 7. 또한 대체 면역요법으로서 NM-IL-12가 내인성 IL-12 다면발현성 면역 및 조혈 효과를 어떻게 복원시키는가를 시각적으로 묘사한 도 8도 참조한다. 결론적으로, NM-IL-12는 건강하였을 때 신체에서 전달할 수 있는 것을 되돌려주는 대체 면역요법이다. 많은 질환 상태, 손상 및 노화는 내인성 IL-12를 생성하는 세포가 기능장애가 되고 더 이상 IL-12를 생성할 수 없게 한다. 본 발명은 많은 다양한 질환 상태에서 대체 면역요법으로서 작용할 수 있는 핵심 인자로서 IL-12의 발견에 관한 것이다.

본 발명의 한 양상에서, 외인성 IL-12의 하나 이상의 생리 학적 용량을 투여하기 전에, 치료될 환자 집단은 약 5 pg/ml 미만, 약 4 pg/ml 미만, 약 3 pg/ml 미만, 약 2 pg/ml 미만 또는 약 1 pg/ml 미만의 IL-12 발현 수준을 갖는다. 일반적으로 환자 집단은 검출 또는 정량 한계(LLPQ)보다 낮은 IL-12 수준을 가질 것이다. 만성 질환 또는 상처와 같은 질환을 갖는 환자 집단에서의 이러한 IL-12 발현 수준은 피험자가 원하거나 또는 필요한 수준의 내인성 IL-12를 생성하지 못하는 것을 나타낸다.

내인성 인자의 대체제로서 작용하는 획기적인 단백질 약물은 인슐린(1960년대에 도입), 인간 성장 호르몬(HGH)(1980년대에 도입), 및 EPO(1990년대에 도입)를 포함한다. NM-IL-12는 독립형 치료 또는 만성 질환, 손상 및 노화에 대한 표준적인 캐어 치료와 조합하여 2020년대에 동일한 역할이 작용할 것으로 예상된다.

복구, 재생, 및 근절( eradication ): 몇몇 모델의 표시가 복구, 재생, 및 근절에서 IL-12의 폭을 입증하고 유용한 대체 면역요법으로서 기능을 할 수 있다. 특히, 복구 및 재생은 연령 관련 황반 변성(AMD), 만성 신장 질환(CKD), 상처 치유, 및 골다공증의 치료에서 IL-12의 효능에 의해 입증될 수 있다(하기에서 상세히 설명됨). 수지상 세포는 체내에서 IL-12의 주요 생산자이지만, 이들 세포는 기능 장애가되어 특정 질환 상태에서 더 이상 IL-12를 방출하지 않거나 또는 불충분한 양으로 방출한다. 외인성 IL-12는 AMD, 상처 치유, 골다공증, 및 CKD의 치료와 같은 생체 내 IL-12 생성의 결핍으로 고통받는 상태에서 복구 및 재생을 자극하기 위해 내인성 IL-12(예컨대, "대체 면역 치료제")를 대체할 수 있다.

안전성: IL-12는 독자적인 사이토카인이다. 재조합 인간 IL-12(또한 본원에서 "NM-IL-12", "IL-12" 및 헤마맥스(HemaMax)™(rHuIL-12)로도 지칭됨)는 안전한 것으로 입증되었다. 예를 들어, IL-12의 안전성은 3건의 연구에서 >200명의 건강한 지원자와 여러 임상 시험의 환자에게서 입증되었다. 예컨대, (i) ClinicalTrials.gov 식별자 번호 NCT02542124, "NM-IL-12 in Cutaneous T-Cell Lymphoma (CTCL) Undergoing Total Skin Electron Beam Therapy(TSEBT)"(진행중인 임상 시험); (ii) ClinicalTrials.gov 식별자 번호 NCT02544061, "NM-IL-12 (rHuIL-12) in Subjects with Open Surgical Wounds"(진행중인 임상 시험); (iii) ClinicalTrials.gov 식별자 번호 NCT02343133, "Safety Study of HemaMax^TM(rHuIL-12) to Treat Acute Radiation Syndrome"(완료된 임상 시험); 및 (iv) ClinicalTrials.gov 식별자 번호 NCT01742221, "Safety and Tolerability of HemaMax^TM(rHuIL-12) as Radiation Countermeasure"(완료된 임상 시험)를 참조한다. NM-IL-12는 범혈구감소증에 강력한 영향을 갖는 것으로 입증된 유일한 분자로, 골수 재생을 통한 골수 절제 후 생존율을 유의하게 향상시킨다. 또한, IL-12는 감염 및 출혈을 감소시키고, 헤드 투 헤드 연구에서 뉴포젠^®보다도 생존 이점을 제공하며, 현재 3상 임상 연구 중이다. 미국 생물학적 제제 품목허가 신청(BLA) 승인을 위해 효능 연구는 완료되었다.

NM-IL-12는 안전하고 내약성이 우수하지만, 제약 분야의 종래의 지식은 IL-12가 독성이 있다는 것이다. 이것은 주로 2명의 환자의 사망을 초래한 2상 시험 설계의 오류로 인한 것이지만, 반면 NM-IL-12에 대한 최대 내약 용량 및 투약 일정을 결정한 1상 시험은 성공적으로 완료되었다. 초기 약제 연구자들은 IL-12 생물학을 이해하지 못했기 때문에, 시험 설계의 오류로 이어졌다. 결과적으로, IL-12는 40개 초과의 임상 시험에서 조사자에 의해 평가되었으며 내약성이 우수한 것으로 밝혀졌다(1389명의 환자).

손상/복구/재생에서의 신규 효과: IL-12는 면역 및 조혈의 지배적인 조절인자(master regulator)이다. 이것이 지배적인 조절인자 이기 때문에, IL-12는 체내에서 본질적으로 생성되지 않는다. IL-12는 손상시 필요할 때에만 생성되므로, IL-12는 체내에서 고도로 조절된다. 그러나 노화, 손상 및 많은 질환 상태, 예컨대 암 및 전염병, 및 특히 만성 질환 상태는 IL-12를 생성하는 세포에 영향을 미치고 그의 생성을 저해한다. 따라서 CKD, 골다공증, AMD 및 당뇨병 환자의 상처 치유와 같은 만성 질환, 손상 및 노령자에서, 외인성 IL-12는 손상된 조직을 복구하는 내인성 인자에 대한 대체로서 기능할 수 있다.

NM-IL-12는 방사선 노출(예컨대, 골수 절제)에서 임상적으로 성공하여, 유의하게 향상된 생존을 입증하였다(도 2). 또한, NM-IL-12는 조직 손상의 복구를 입증하는 임상적 성공을 갖는 것으로, 그 분자는 외과 절개로 야기된 조직 손상의 봉합(100 %)이 유의하게 가속되었음을 입증한다(도 2). 마지막으로, NM-IL-12는 암 성장을 근절하는 임상적 성공을 나타낸 것으로, IL-12는 피부 림프종을 치료하기 위해 사용되어 근절 및 완전 지속형 반응을 유도한다(도 2).

NM-IL-12는 독자적인 작용 메커니즘을 갖는다. 구체적으로, IL-12는 조혈 줄기세포의 수준에서 골수 내의 세포를 재생하고 골수에서부터 말초 혈액 및 손상된 조직과 기관으로 이들 전구세포 및 줄기세포를 이동시킨다. 또한, 이 분자는 핵심 세포 독성 면역 세포인 CD8+ 및 NK 세포를 증식 및 활성화시켜 감염 및 암과 같은 병리학적 침입자와 싸우게 한다. 그러므로 NM-IL-12는 골수의 조혈 재생과 함께 강력한 항 감염 및 항종양 효과를 독자적으로 제공한다. 또한, 독자적인 IL-12 수용체가 성숙한, 면역 이펙터 세포, CD8+, CD4+, NK 및 B 세포 양자와 미성숙 골수 전구 세포 및 줄기 세포에 있다는 사실은, 골수에서 나오는 새로운 전구체 세포를 반복된 라운드의 면역 활성을 위한 성숙한 이펙터 세포로 유도되도록 허용하는 체내에서의 그의 중요성을 강조하는 것이다.

도 1에서 나타낸 바와 같이, NM-IL-12는 (모든 혈액 세포계통을 보충하는 기능을 하는 줄기세포 및 전구세포를 통한) 재생, (선천적 (NK 세포) 및 적응성 면역 (CD8+ 및 CD4+ 세포)을 통한 바이러스, 세균, 및 종양) 근절, 및 복구(상처 치유, 조직 복구 및 면역 감시)하는 줄기세포, 조혈 및 면역 세포 인자이다. 따라서, NM-IL-12는 CD34+ 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 거핵구, 림프아구, 과립아구, 미성숙 NK 세포 및 망상적혈구와 같은 골수 내의 세포를 자극하여 조혈을 자극한다. NM-IL-12는 또한 상처 치유 및 조직 복구를 돕기 위해 조직으로의 세포 이동을 용이하게 한다. 도 3 참조.

대체 면역요법으로서의 IL-12의 효능의 예로서, NM-IL-12는 당뇨병성 족부 궤양(DFU)에서 상처 치유를 가속화하고, 만성 신장 질환(CKD)의 진행을 둔화시키며, 골다공증에서 골 손실을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

구체적으로, DFU에서 NM-IL-12는 (i) 면역 세포, 혈소판, 줄기세포 및 전구세포를 재생(예컨대, 재생), (ii) 감염 감소(예컨대, 근절), 및 (iii) 상처 봉합 개선, 상처 부위에서 대사 활성 증가, 및 콜라겐 침착 증가(예컨대, 복구)하는 것으로 밝혀졌다. 유사하게, CKD에서, NM-IL-12는 (i) 면역 세포, 줄기세포, 및 전구세포를 재생(예컨대, 재생), (ii) CKD 관련 빈혈 감소, 및 EPO 저항성 감소(예컨대, 근절), 및 (iii) IL-12Rβ2 포지티브 세관 세포로부터 EPO 증가 및 신장 복구와 재생 증가(예컨대, 복구)시키는 것으로 밝혀졌다. 마지막으로, 골다공증 치료에서, NM-IL-12는 (i) 골아세포증식 유발(예컨대, 재생); (ii) 골 손실 감소(예컨대, 근절), 및 (iii) NF-κB 리간드(RANKL) 저해 증가 및 골아세포 수 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 도 4 참조.

NM-IL-12는 또한 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL 또는 DLBL)에서 치료율을 증가시키고 화학 요법 관련 독성을 낮추며 연령 관련 황반변성(AMD)의 진행을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, DLBCL에서, IL-12는 (i) 복원 면역 적격, 조혈 증가, 및 면역 세포 이동(예컨대, 재생); (ii) B 세포 림프종 감소, 항원 제시 및 T 세포 클론 증가, 및 세포독성 증가(예컨대, 방사); 및 (iii) 완전한 반응 증가 및 혈액학적 독성 감소(예컨대, 복구)시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, AMD와 관련하여, NM-IL-12는 (i) 면역 균형 증가 및 노화 대식세포의 대체 증가(예컨대, 재생); (ii) IL-17 생성 감소 및 혈관형성 및 혈관신생 감소(예컨대, 근절); 및 (iii) 시력 손실 최소화 및 IL-17-유발된 망막 세포사 감소(예컨대, 복구) 시키는 것으로 밝혀졌다. 도 5 참조.

따라서, NM-IL-12는 3가지 주요 효과가 있는 혁신적인 재생 접근을 제공한다: 재생, 근절 및 복구. 혈액학에서, NM-IL-12는 예를 들어 범혈구감소증, 호중구감소증(neutropenia), 빈혈, 혈소판감소증, 및/또는 림프구 감소증(동시에 또는 이들의 임의의 조합)을 치료할 수 있다. IL-12는 일차 요법에 의해 야기된 혈액학적 독성을 완화 시킬 뿐만 아니라, IL-12는 또한 종양학 환자들에게도 상승적인, 근절(항종양) 반응을 제공한다. 환자는 조합 치료를 사용하는 경우 일차 요법보다도 독성이 거의 없거나 전혀 없는 추가 이점을 얻는다. NM-IL-12를 사용한 치료는 일차 요법 단독보다도 생존 이점을 얻을 것으로 예측된다. 이러한 혁신적인 효과를 갖는 것으로 알려진 다른 인자는 없다.

대체 면역요법으로서 외인성 IL-12의 투여는 치료될 상태에 대한 임의의 종래의 치료와 조합될 수 있다. 병용 요법은 시간, 일, 주 또는 개월을 포함하는 임의의 바람직한 기간으로 분리된 순차적 투여, 동시 투여 또는 공동 투여를 포함할 수있다.

A. 만성 신장 질환

상기에서 언급한 바와 같이, CKD는 대체 면역요법으로 IL-12의 유용성을 입증하는 모델 표시이다. 현재까지 CKD 시장이나 파이프라인에는 실제로 CKD의 진행을 둔화시킬 수 있는 약물은 없다. 따라서 NM-IL-12는 기술분야에서 충족되지 않은 요구를 제공한다. NM-IL-12는 내인성 EPO 생성을 유도하고, 정상적인 인간과 원숭이의 망상 적혈구 및 적혈구를 증가시키며, 비인간 영장류의 치사 방사선 후 망상 적혈구 및 적혈구를 증가시킨다. 그러나 NM-IL-12는 적혈구 집단을 증가시키기 위해 EPO를 전달하는 것 이상을 한다 -- NM-IL-12의 다면발현성 효과는 또한 신장의 복구 및 재생을 유도하여 CKD의 진행을 둔화시킬 것으로 예상된다. 예비 데이터는 NMD-IL-12가 CKD 환자, 특히 CKD의 진행을 둔화시킬 수 있는 초기 단계 환자에서 신장 빈혈에 대한 새로운 치료이다. CKD에서 NM-IL-12의 다면발현성 효과는 복구 및 재생을 위하여, 특히 골수에서의 줄기세포 활성 및 골수에서부터 말초 조직으로의 줄기세포 예컨대 CD34 + 및 중간엽 세포를 이동시키는 그의 능력으로 인해 CKD 진행을 둔화시킬 것으로 예상된다. NM-IL-12는 또한 IL-12Rβ2+ve 신장 세관 세포로부터 EPO 방출을 유도하고 CKD 관련 빈혈을 감소시킨다. 또한, NM-IL-12는 조혈 전구세포 및 줄기세포 및 성숙 면역 세포를 이동시켜 신장의 복구 및 재생을 유도한다. 마지막으로 NM-IL-12는 면역 균형을 복원하고, EPO 저항성을 감소시키며 감염률을 감소시킨다.

NM-IL-12를 사용하여 CKD를 성공적으로 치료하기 위한 측정 가능한 종말점은 CKD 진행을 둔화시킨다. 대안적으로, EPO의 생성 및 헤모글로빈 수준과 같은 혈액 매개 변수의 관련된 변화도 또한 임상 종말점으로서 이용 가능하다. CKD의 진행의 둔화는 예를 들어, 피험자에서 하나 이상의 하기에 의해 입증될 수 있다: 크레아티닌의 감소, 혈중 요소 질소(BUN)의 감소, 알부민뇨의 감소, 또는 사구체 여과율(GFR)의 증가. 본 발명의 한 실시양태에서, NM-IL-12를 사용한 치료는 예컨대, 신장 기능의 측정, 크레아티닌 측정, 헤모글로빈 수준, EPO, BUN, GFR, 알부민뇨의 생성 - 또는 이의 임의의 조합 - 에 의해 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% CKD의 진행을 둔화시킨다.

하기 표 1은 각 단계와 관련된 기술 및 증상뿐만 아니라 각 단계에서 남아있는 신장 기능의 양을 포함하는 만성 신장 질환의 5 단계를 상세히 설명한다.

만성 신장 질환의 5 단계

	단계 1	단계 2	단계 3	단계 4	단계 5
각 단계에 남아있는 신장 기능의 양	90% 초과	60 내지 89%	30 내지 59%	15 내지 29%	15% 미만
각 단계의 설명	정상 또는 심지어 증가된 기능을 갖는 초기 신장 손상.	감소된 기능을 갖는 악화된 신장 손상.	더 적은 기능을 갖는 더욱 악화된 신장 손상.	신장이 간신히 사람을 살아있을 수 있게 하는 정도로 불량한 기능을 갖는 것으로 신장 손상이 매우 심하다.	최종 단계 신장 질환: 신장 기능이 심각하게 손상된다. 신장은 사람을 살아 있게 할 만큼 충분히 잘 작동하지 않는다.
증상	증상이 관찰되지 않는다. 요소 및 크레아티닌 수준은 정상이다.	증상이 관찰되지 않는다. 요소 및 크레아티닌 수준은 정상이거나, 경미하게 상승한다.	초기 증상이 발생하고 피로, 식욕 부진 및 가려움을 포함할 수 있다. 크레아티닌 수준이 상승하고, 과잉 요소가 존재하며 빈혈이 발생하기 시작할 수 있다.	피로, 식욕 부진, 및 가려움이 더 악화될 수 있다.	증상은 야간의 수면 불량, 호흡 곤란, 가려움, 및 잦은 구토를 포함할 수 있다. 높은 수준의 크레아티닌 및 요소가 존재한다.
eGFR (추정된 사구체 여과율)	90 ml/분 이상	60-89 ml/분	30-59 ml/분	15-29 ml/분	15 ml/분 이하
치료 옵션*	원인을 확인하고 이를 반전시키려고 한다.	크레아티닌 수준, 혈압, 및 일반적인 건강 및 웰빙을 모니터링한다. 신장 기능의 악화를 정지 또는 둔화시키고자 노력한다.	신장 기능의 악화를 정지 또는 둔화시키고자 계속 노력한다. 환자는 질환 및 치료 옵션에 대해 더 학습한다.	투석을 위한 접근 부위를 계획하고 고안한다. 가능한 이식에 대한 평가를 받는다.	신장 대체 요법 시작: 투석 또는 이식.

상기한 바와 같이, CKD 진행의 둔화는 예를 들어, 대상의 크레아티닌 감소, 혈중 요소 질소(BUN)의 감소, 알부민뇨 감소 또는 사구체 여과율(GFR)의 증가와 같은 하나 이상에 의해 입증될 수 있다. 하기 표 2는 GFR 및 알부민뇨 카테고리에 의해 결정된 바의 CKD에 대한 예후를 상세히 설명한다.

IL-12 수용체 (IL-12Rb2)의 독자적인 서브유닛이 인간 및 붉은털 원숭이의 신장 수질 세관 세포 상에서 발현된다. IL-12Rβ2는 네프론을 포함하는 수질 세관 세포(그러나 피질 신장 세관아님)에서 심하게 염색된다. 이는 EPO의 발현이 신장 수질 세관에서 발생하는 것으로 표시된다는 점에서 중요하다. 도 9. 단일, 저 용량 의 NM-IL-12는 붉은털 원숭이에서 EPO를 유도하며 적혈구의 전구체인 망상 적혈구의 증가로 이어진다. 도 10. 또한, 단일, 저 용량의 NM-IL-12는 지원하는 캐어의 부재시에 원숭이에서 골수절제(치사 방사선) 후 주요 혈액 세포 유형의 최하점(nadir)을 유의하게 감소시킨다. NM-IL-12는 조혈 줄기세포에서의 활성을 통한 독자적인 다중 계통 재생 효과, 및 적혈구 형성에 대한 포지티브 효과를 나타낸다. 표 3 참조.

더욱이, 단일 저 용량의 NM-IL-12(12 mg)는 인간에서의 EPO를 직접적으로 유도한다. 도 11. NM-IL-12의 단일, 저 용량 SC 주사는 체내에서 필요에 따라 조직 복원 및 재생을 위해 모든 성숙 말초 혈액 세포 및 미성숙 CD34 + 조혈 전구세포를 이동시키는 것으로 밝혀졌다. 도 12. 이들 결과는 NM-IL-12에 대해 독자적인 다분화능 및 일관된 이동 효과를 입증한다. 따라서, EPO는 현재 CKD에 대한 표준 치료이지만, NM-IL-12는 CKD에서 EPO에 보다도 광범위하고 독자적인 다면발현성 이점을 제공한다. 표 4.

본 발명의 한 실시양태에서, NM-IL-12는 EPO와 같은 종래의 CKD 치료와 조합하여 사용된다.

본원에서 상세히 설명된 바의 IL-12 활성을 입증하는 예시적인 문헌 지원은 예컨대 (1) 문헌 ["Erythropoietin enhances immunostimulatory properties of immature dendritic cells," Clin . and Exp . Immunology , 165: 202-210(2011); 및"Role of cytokines in response to erythropoietin in hemodialysis patients," Kidney International , 54:1337-43 (1998)]을 포함하는 IL-12 및 EPO가 내인성 피드백 루프에 있으며 낮은 IL-12 수준 및 EPO 저항성 간의 네거티브 상관관계가 있음을 교시하는 간행물; (2) 문헌 ["Characteristics and causes of immune dysfunction related to uremia and dialysis." Proceedings Of The 3rd Asian Chapter Meeting Of The ISPD, 28(3) June 2008, and Kidney International , 54:1337-43 (1998)]을 포함하는 요독증 독성이 면역 기능 장애를 유도하는 IL-12의 적응성 및 선천적 면역 반응 및 방출을 손상시킴을 교시하는 간행물; 및 (3) 문헌["Cytokine patterns and survival in haemodialysis patients," Nephrol. Dial. Transplant, 25: 1239-1243 (2010)]을 포함하는 내인성 IL-12를 발현할 수 있는 투석 환자가 더 긴 생존 기간을 가짐을 교시하는 간행물을 포함한다.

B. 상처 면역요법

IL-12는 또한 조직 복구, 및 특히 상처 치유를 돕고 개선하기 위해 유용한 것이다. 조직 복구에서 IL-12의 유용성을 입증하기 위하여 사용된 모델 손상은 당뇨병 환자와 노령 환자의 상처이며, 이들은 특히 치료하기 어려울 수 있다. 다른 실시양태에서, 피험자는 노령자이며 욕창이 있거나, 또는 피험자는 당뇨병환자이며 족부 궤양이 있다. 현재까지 당뇨병 환자 및 노령 환자에서 둔화 치유되는 상처를 유의하게 개선하는 약물은 없다. 본원에 기재된 새로운 발견은 IL-12 수용체가 피부의 전구세포에서 발견되며 이 수용체가 상처 표면에서 상향 조절되고 뮤린 IL-12가 면역 손상 및 당뇨병 뮤린 모델에서 상처 봉합을 가속한다는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 일반적으로 상처 면역요법에서, 특히 당뇨병 환자와 노령자에서 발견되는 둔화 치유되는 상처에서 NM-IL-12를 사용하는 방식을 진행할 수 있게 한다. 예컨대 당뇨병 환자 및 노령자에서 둔화 치유되는 상처의 봉합 가속화에서 IL-12의 예상되는 유용성을 시각적으로 도시하는 도 13을 참조한다. 특히, IL-12는 (i) NK 세포, 세포 독성 T 세포(CTL) 및 대식세포와 같은 면역 세포에 대한 핵심 효과를 통해 감염을 감소; (ii) 상처 부위에서 콜라겐 침착 및 대사 활성 증가; 및 (iii) 면역 세포, 혈소판 및 골수 전구세포 및 줄기세포를 상처로 이동시키는 것으로 예상된다.

장루 복구술 환자의 수술 후 치유하는 가속화된 상처는 당뇨병성 족부 궤양 환자(DFU)에서 2b 상 시험을 위한 방법을 진행할 수 있게 하는 상처 면역요법에서 NM-IL-12의 효과에 대한 개념 증명을 나타낸다. 당뇨병성 족부 궤양을 효과적으로 예방하거나 치료할 수 있는 유용한 약물은 없다. DFU 환자에서 개선된 상처 봉합의 임상 종말점은 높은 충족되지 않은 요구가 제공된 가속된 조건부 승인을 받을 수 있다.

발명의 한 실시양태에서, 외인성 IL-12의 투여는 외인성 IL-12 투여의 부재시에 관찰되는 치유의 속도와 비교하여 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 상처 치유의 가속화를 유도한다.

상처 면역요법에서 과학적 지원: IL-12 수용체는 진피 및 피지선의 전구 세포에서 발현되며, 상처 및 방사선 후에 상처 표면에서 상향 조절된다. 상처 치유의 자극에서 IL-12에 대한 이전에 확인되지 않은 역할은 정상적인 도 14a 및 상처를 입은, 조사된 피부 조직(도 14b 및 14c)에서 입증된다. 정상적인, 손상되지 않은 피부에서, IL-12 수용체는 진피의 기저막(BM) 및 모낭 밑에 있는 피지(SE) 선의 전구 세포에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 이들 전구 세포는 피부 손상 후 재상피화의 주요 매개체이다. 3도 화상과 동등한 전체 두께 손상 후, IL-12 수용체는 상처 표면에서 발현이 고도로 상향 조절되는 것으로 보인다. 이들 데이터는 피부 손상 후 NM-IL-12에 의한 상처 치유 자극에 대한 기초를 제공한다.

또한, 국소 NM-IL-12는 면역억제 뮤린 모델의 전체 두께에서 상처 치유를 가속화하는 것으로 밝혀졌다. 도 15 참조. 특히, 도 15는 수컷 및 암컷 마우스 모두에 대하여, 비히클(수컷 및 암컷) 및 재조합 뮤린 IL-12(15 ng)의 국소 투여로 얻은 결과를 비교하여 상처 영역(0일의 %) 대 손상 후 일자의 그래프를 나타낸다. TBI(500 cGy) 및 전체 두께 피부 손상이 제공된 수컷 및 암컷 마우스에게 rMuIL-12(15ng, 국소)의 투여는 손상 당시 및 손상 3일 및 6일 차에, 비히클 처리 마우스와 비교하여 상처 치유가 가속화되었으며 완전한 상처 봉합을 제공하였다.

추가 데이터는 국소 NM-IL-12가 전체 두께의 당뇨병 뮤린 모델에서 상처 치유를 가속화시킨다는 것을 나타낸다. 구체적으로, 도 16에서 나타낸 바와 같이, 전체 두께의 피부 손상을 갖는 당뇨병 쥐에게 rMuIL-12(15ng 및 474ng, 국소)의 투여는, 손상 당시, 비히클 처리된 쥐와 비교하여 상처 치유를 가속화한다(도 16은 국소 투여의 비히클 및 2가지 상이한 복용량의 재조합 뮤린 IL-12로 얻어진 결과 간의 비교가 있는, 상처 영역(0일의 %) 대 손상 후 일자의 그래프를 나타낸다.)

상처 치유 데이터는 국소 투여로 제한되는 것은 아니다. 특히, 뮤린 NM-IL-12의 단일 SC 주사는 전체 두께의 뮤린 모델에서 상처 치유를 가속화하는 것으로 밝혀졌으며 국소 투여가 더 우수하다. 예컨대, 도 17 및 18 참조. 전체 두께 피부 손상 24시간 후 rMuIL-12(20ng)의 단일 투여(sc) 또는 rMuIL-12의 3회 투여(국소)(15ng, 손상 후 24시간, 3일, 및 5일)는 비히클의 단일 투여(국소)와 비교하여 상처 치유가 가속화된다. 도 17은 비히클, 15 ng rMuIL-12 국소 3x/일, 15 ng rMuIL-12 국소 1x/일, 및 20 ng rMuIL-12 SC 1x/일의 4군에 대한 상처 영역(0일의 %) 대 손상 후 일자의 그래프를 나타낸다. 20 ng rMuIL-12 SC 1x/일을 수용하는 동물은 가장 빠른 상처 치유를 나타내었으며, 15 ng rMuIL-12 국소 3x/일을 수용하는 동물은 다음으로 가장 빠른 치유 속도를 갖는다. 도 18a는 비히클의 국소 적용 후의 상처의 사진을 나타내며, 한편 상처의 현저한 치유를 나타내는 도 18b는 SC rMuIL-12로 얻어진 결과를 묘사한다.

또한 뮤린 NM-IL-12의 단일 주사는 전체 두께 뮤린 절제 상처에서 유의하게 더 신속하고 더 큰 대사 반응을 유발한다는 것을 밝혀내었다. 형광 수명(ps) 대 연구 일자의 그래프를 나타내는 도 19는, 치유하는 동안 상처가 있는 피부의 대사 활성의 동역학을 나타낸다. (^‡)rMuIL-12 + 상처 군은 2 일차의 상처가 있는 플라세보 군에 비해 유의하게 더 긴 형광 수명을 갖는다(p <0.05). (^‡)rMuIL-12 + 상처 군은 3 일차의 상처가 없는 군에 비해 유의하게 더 긴 형광 수명을 갖는다(p <0.05). 마지막으로, (*)rMuIL-12 + 상처 군은 0일과 비교하여 2일 및 3일 차에 유의하게 더 긴 형광 수명을 갖는다(p<0.05). 예컨대, 문헌[Li et al., Biomedical Optics Express, 6:243477 (2015)] 참조.

현재 결장조루술 복구술 후 개방 외과적 상처가 있는 환자의 2a상, 개념 증명 연구가 진행 중이다. 결장조루술 복구술 후 개방 외과적 상처가 있는 피험자는 2차 의도로 치유를 허용한다. 이 연구는 수술 후 24-36 시간에 SC 투여된 단일 12 μg 유닛을 이용한다. 이차 종말점은 50 % 초과의 외과 스토마 부위(상처) 봉합까지의 중간 시간이다. 도 20은 대체 면역요법으로서 NM-IL-12가 상처 치유를 위해 내인성 IL-12의 다면발현성 면역 및 조혈 효과를 어떻게 복원하는지를 그래픽으로 묘사한다(문헌 [Lasek et al., Cancer Immunol. Immunother ., 63:419 (2014)]에서 택함).

다른 연구는 상처 치유, 특히 둔화 치유되는 상처를 돕고 가속화할 때, IL-12의 유용성과 효능에 대한 분석 및 결론을 지원한다. 예컨대, (1) 문헌 ["Interleukin-12 in infectious diseases," Clin . Microbiology Rev., 10(4):611-36 (1997)]을 포함하는, IL-12가 강력한 항 감염 효과가 있다고 상세하게 설명하는 참고 문헌; (ii) 문헌 ["Single low-dose rHuIL-12 safely triggers multilineage hematopoietic and immune-mediated effects," Exp . Hematology & Oncology, 3:11 (2014)]을 포함하는, NM-IL-12가 CD34 + 골수 세포를 포함한 모든 주요 말초 혈액 세포를 조직으로 이동시킨다는 점에서 독자적인 것임을 상세하게 설명하는 참고 문헌; (iii) 문헌 ["Granulocyte-colony stimulating factors as adjunctive therapy for diabetic foot infections," Cochrane Database of Systematic Reviews, Issue 8. Art. No.: CD006810. DOI: 10.1002/14651858.CD006810.pub3 (2013)]을 포함하는 G-CSF 이동이 감염 또는 상처 치유에는 영향을 미치지 않지만 DFU에서 하지 외과적 개입 감소를 나타냄을 상세하게 설명하는 참고 문헌; (iv) 문헌 ["Recombinant interleukin-12, but not G-CSF, improves survival in lethally irradiated nonhuman primates in the absence of supportive care," 22 May 2014 in Wiley Online Library(wileyonlinelibrary.com) DOI: 10.1002/ajh.23770]을 포함하는, NM-IL-12가 치사 방사선에 노출된 후 골수를 재생시키는데 강력한 효과를 나타내는 것임을 상세하게 설명하는 참고 문헌; 및 (v) 문헌 ["Effect of rIL-12 on murine skin regeneration and cell dynamics using in vivo multimodal microscopy," Biomedical Optics Express , 6(11) (Nov. 2015) DOI:10.1364/BOE.6.004277]을 포함하는, 뮤린 IL-12가 전체 두께의 상처 후 증가된 대사 활성 및 콜라겐 침착을 나타내는 것임을 상세하게 설명하는 참고 문헌을 참조한다.

C. 연령 관련 황반 변성

연령 관련 황반 변성(AMD), 특히 습성 AMD는 노화하는 눈에서 혈관의 이상 성장(혈관형성)에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 습성 AMD에서 현재 승인된 제품은 항 VEGF 항체(루센티스(Lucentis), 아일리아(Eylea))이다. 이들 약물들은 효능이 제한적이며 치료된 집단의 3 분의 1은 불량한 성과와 시력 저하로 남아있는 것으로 나타났다. 개발중인 습성 AMD 제품의 후속 제품은 관련 항 혈관형성 인자, 즉 항 PDGF 항체와의 PDGF를 또한 타겟화하고 있다.

IL-12는 암 모델 및 암 환자(VEGF 및 관련 인자 감소)에서 혈관형성 감소 및 몇몇 모델 시스템에서 각막 혈관신생(습윤 AMD) 감소에 활성임을 나타내는 강력한 항 혈관형성 효과를 갖는다. 또한 IL-12의 생성에서 노화 대식세포의 감소와 함께, 면역 기능장애가 AMD의 코어에 있을 수 있다는 보고도 있다. 따라서 NM-IL-12는 단일 약제로서 또는 다른 약물과의 조합으로 AMD 환자를 치료하는 추가적인 메커니즘을 유도하는 매력적인 새로운 약물이다. 도 21에서 시각적으로 묘사된 바와 같이, AMD에서의 NM-IL-12의 다면발현성 효과는 (i) IL-12가 다중 혈관형성 인자에 대한 광범위한 항 혈관형성 효과를 가짐으로 인한 혈관신생 감소; 및 (ii) 노화 대식세포의 보충에 의한 면역 균형 복원에 의해 진행을 둔화 또는 역전시킬 것인지가 예측된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 외인성 IL-12의 투여는, 외인성 IL-12 투여의 부재시에 관찰되는 것과 비교하여, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% AMD 진행의 둔화 또는 역전을 유도한다. 다른 실시양태에서, IL-12는 (i) 안구 내 이외의 임의의 경로를 통해, (ii) 피하 주사를 통해, 또는 (iii) 안구 내 주사를 통해 투여될 수 있다.

AMD의 개선된 치료에 대한 중요한 필요성이 있다. 구체적으로, 라니비주맙(ranibizumab) 요법 ~7년 후, 장기간 평가는, 환자의 3 분의 1이 불량한 성과를 나타냈다. 또한 베이스라인과 비교하였을 때, 약 절반의 눈이 안정되었지만 1/3이 15 글자 이상 감소하였다. 문헌 ["Seven-Year Outcomes in Ranibizumab-Treated Patients in ANCHOR, MARINA, and HORIZON." Ophthalmology , 1e8 (2013).] 따라서, 치료 과정의 후기 단계에서도, 삼출 AMD 환자는 상당한 시력 저하의 위험이 남아있다. 습성 AMD를 위한 현재 승인된 약물은 VEGF의 저해를 통한 혈관형성을 타겟으로 한다. 분명히, 이 접근법은 모든 환자에게 도움이 되지는 못하며, 새로운 약물에 대한 크게 충족되지 않은 요구를 남겨두고 있다. NM-IL-12는 습성 AMD의 치료에 있어 새로운 방향과 독자적이고 새로운 작용 메커니즘을 제공하여, 다면발현성 면역 및 조혈 효과와 함께 항 혈관형성 효과를 제공하며; 이들 총 효과는 VEGF 저해제 또는 임의의 단일 타겟 요법의 기계론적 범위 밖에 있다.

다른 데이터는 IL-12가 AMD의 치료 및 개선에 유용하다는 본원에서 제시된 분석 및 결론을 지원한다. 구체적으로, 암에서의 혈관형성의 역할을 처음으로 밝힌 유다 폴크만(Judah Folkman)은 1995년에 각막 혈관신생 모델에서 IL-12가 혈관형성의 강력한 저해제라는 증거를 제공하였다. 염기성 섬유모세포 성장 인자 유도된 마우스 각막 혈관신생에 대한 재조합 뮤린 IL-12의 효과를 나타내는 도 22a-f를 참조한다. 도 22a-f는 염기성 섬유모세포 성장 인자 펠릿(P)의 주입 5일 후 비히클 처리(대조) C57 BL/6 마우스(도 22a), SCID 마우스(도 22b), 및 베이지 마우스(도 22c) 또는 12-처리 C57BL/6 마우스(도 22d), SCID 마우스(도 22e), 및 베이지 마우스(도 22f)의 각막을 나타내는 사진을 묘사한다. 대조 각막에는 눈에 띄는 새로운 혈관이 있지만, IL-12로 처리 후에는 혈관 반응이 거의 나타나지 않는다. 문헌 [J. of the National Can . Institute, 87(8)(1995년 4월 19일)]. 거의 20년 후에, 본 발명은 뮤린 IL-12가 눈 당 0.1ng의 단일 저용량을 사용하여 레이저 유도된 눈 손상(실험 맥락막 혈관신생)에 대하여 보호할 수 있음을 나타낸다. 도 23은 평균 병변 부피에 대한 뮤린 IL-12의 용량 반응을 나타낸다. 도 24a-d는 뮤린 IL-12의 제공된 용량에서, 병변의 시각화를 나타낸다(도 24a=비히클; 도 24b=0.1 ng IL-12; 도 24c=0.1 ng IL-12; 및 도 24d=1 ng IL-12).

본 발명자들은 실험적 맥락막 혈관신생 뮤린 모델에서 뮤린 IL-12(0.1ng/눈)가 항 VEGF(15mcg/눈)와 동등한 레이저 유도된 눈 손상의 효과를 감소시킬 수 있음을 밝혀내었다. 루센티스®(라니비주맙 주사) 또는 아일리아®(애플리버셉트)와 같은 종래의 AMD 치료제와 NM-IL-12의 조합은 시너지 효과 또는 적어도 부가적인 효과를 제공할 것으로 예상된다. 예컨대, 비히클(약 2.6), 항 VEGF(약 1.7), 및 IL-12(약 1.75) 처리 후 평균 혈관 병변 부피(㎛³ x 10⁶)의 그래프를 나타내는 도 25를 참조한다. 또한, 비히클(약 112), 항 VEGF(약 60), 및 IL-12(약 60)로 처리 후 평균 Iba-1 포지티브 부피(㎛³ x 10³)의 그래프를 나타내는 도 26을 참조한다.

NM-IL-12 유의하게 시험관 내에서 IL-17을 억제한다. PBMC에 첨가된 NM-IL-12는 병원성 Th17/IL-17 반응을 제한하는데 효과적이다. 이 연구에서, 인간 PBMC는 0, 1 및 10pM의 NM-IL-12로 2일 동안 배양하였다. 용해물을 제조하고 IFN-γ 및 IL-17의 mRNA에 대하여 탐침(PCR)하였다. 데이터는 평균 ± SEM이고 p 값은 스튜던트 t 테스트이다. 예측된 바와 같이, IL-12 처리는 항 혈관형성 IFN-γ를 유의하게 증가시키고(도 27a), 파괴 IL-17을 유의하게 감소시키는 것을 나타내며(도 27b); 이들 효과는 생체 내에서 혈관형성을 감소시키고 면역 균형을 복원시키는 것으로 예상된다.

따라서 IL-12는 노령자 눈에서의 "미싱 링크(missing link)"이며; 외인성 NM-IL-12에 의한 면역 균형 복원은 선행 기술의 AMD 치료에서 접하는 문제점을 해결한다. 도 28은 안구 혈관신생에서 정상 대 노화 대식세포의 역할을 나타낸다. 망막의 레이저 유도된 손상 후, 대식세포 침윤은 어린(< 2개월) 및 노령(> 18 개월) 마우스 모두에서 발생한다. 그러나 이 대식세포의 침윤은 더 노령의 마우스에서만 혈관신생과 관련이 있다. 노령 마우스의 망막으로부터 단리된 대식세포의 RT-PCR 분석은 어린 마우스의 망막에서의 대식세포에서보다 IL-12, TNF-α, FasL 및 IL-6의 발현 수준이 더 낮은 것으로 나타났다. IL-10 발현의 증가는 모든 마우스의 망막에서 관찰되었지만, 베이스라인 수준은 노령의 마우스에서 더 높았다. 이들 데이터는 노령 마우스 에서와 같이, 증가된 IL-10 발현 및 변경된 사이토카인 발현은 눈에서 손상 유도된 혈관신생을 조절하는 노화 대식세포의 능력을 제한하는 것임을 암시한다. 하기 표 5에 요약된 바와 같이, NM-IL-12는 현재 시판되는 제품에 비해 AMD에서 광범위하고 독자적인 기계론적 이점을 제공한다.

D. 골다공증

암 치료, 즉 방사선, 화학 요법 및 스테로이드는 골밀도를 감소시킬 수 있다. 또한, 특정 약물을 복용하는 노령자 및 피험자와 같은 다른 환자 집단은 감소된 골밀도 및 골다공증으로 고통받을 수 있다. 본 발명자들은 저 용량 NM-IL-12의 단일 주사가 고 용량 전신 조사(TBI) 후 원숭이 뼈에서 파골 세포 수준을 유의하게 감소시킬 수 있고, 마우스에서 TBI 후 IL-12 수용체가, 재생 효과를 암시하는, 골수 내의 골아세포에서 발견된다는 것을 밝혀내었다. IL-12는 골아세포형성을 증가시키고 강한 저해제 파골 세포 형성으로 보고되어 있으며, 이에 의해 IL-12가 골 형성의 핵심 조절 인자가 될 수 있음을 암시한다. 그러나 노화와 평생 동안의 항원 및 산화 스트레스에 대한 노출의 효과는 골 흡수를 저해하기 위해 IL-12의 방출을 허용하는 생리학적 카운터 조절 면역 과정을 손상시킨다. 발명자들의 데이터는 노화 또는 다른 인자로 인한 골 질량의 결핍이 있는 환자뿐만 아니라 암 치료를 진행하고 있는 환자에서의 NM-IL-12의 사용을 제안한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 외인성 IL-12의 투여는 외인성 IL-12 투여의 부재시에 관찰되는 것과 비교하여, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 골 손실 감소 및/또는 파골세포 형성 감소를 유도한다.

도 29에서 그래픽으로 묘사된 바와 같이, NM-IL-12는 RANKL의 자연 저해제로서 골 소실을 감소시키고, 골수에서 골아세포를 증가시키며, 항원 제시 및 종양으로의 트래픽킹, 뿐만아니라 CD8+ 및 NK 활성화에서 항종양 효과를 갖는다.

암 환자는 암 치료, 즉 방사선, 화학 요법 및 스테로이드뿐만 아니라 기저 질환으로 인해 더 높은 골 손실률을 경험한다. NM-IL-12는 (1) 골 손실 및 골절을 감소시키며, 한편 (2) 암 치료, 즉 방사선 또는 화학 요법과 상승 작용하는 항종양 메커니즘을 제공하는 암 치료를 받는 암 환자에게 이중 이점을 가질 것으로 예측된다. 골절률 감소를 위한 대리 종말점으로서 골반 부위에 방사선을 받는 암 환자의 골 손실 감소의 임상 종말점은 가속화를 위해 조건부 승인을 받을 수 있다. 암에서의 수반되는 항종양 효과와 함께 감소된 골 손실의 이중 이점을 제공할 수 있는 약물에 대한 충족되지 않은 요구는 시장으로의 비교적 짧은 경로가 NM-IL-12에 이용 가능할 수 있을 것으로 예측된다.

방사선은 파골세포 형성을 유도한다. 저 용량 NM-IL-12의 단일 SQ 주사는 대조군에 비해 원숭이에서 골 손상 용량의 TBI 후 파골 세포 형성을 감소시킨다. TRAP 수 - 대퇴골, 예컨대 두 처리군(0 ng/kg 및 250 NM-IL-12 ng/kg)에 대한 총 대퇴골 영역의 TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) 분획을 나타내는 도 30을 참조한다. TRAP는 파골세포의 효소 마커이다. 유사하게, 도 31은 TRAP 수 - 늑골, 예컨대, 두 처리군(0 ng/kg 및 250 IL-12 ng/kg)에 대한 총 늑골 영역의 TRAP 분획을 나타낸다. IL-12의 투여는 대퇴골 및 늑골 모두에서 측정된 파골세포 형성을 유의하게 감소시켰다(도 30 및 31).

IL-12Rβ2는 골수에서 정상 뮤린 골아세포에서 발견되며 수용체는 치사 방사선 후에 존재한다; 그러나 수용체는 방사선을 받은 대조 마우스에는 존재하지 않으며, 이는 방사선 후 NM-IL-12가 그의 수용체를 통해 골아세포를 활성화/증식시킬 수 있음을 암시한다. 예컨대, IL-12Rβ2에 대하여 염색된 대퇴 골수의 대표적인 절편을 나타내는 도 32를 참조한다. 도 32는 mNM-IL-12가 조사된 마우스에서 조혈 회복을 촉진하는 것임을 나타낸다. 구체적으로, 도 32a 및 b는 가시적인 후골수구와 함께, 성숙 및 미성숙 거핵구가 있는 비 조사된 및 처리되지 않은 정상 대퇴골 절편을 나타낸다. 도 32c 및 32d는 조사 및 비히클로 처리 후 대퇴골 절편을 나타낸다. 마지막으로, 도 32e 및 32f는 조사 및 mNM-IL-2로 처리 후 대퇴골 절편을 나타낸다. 골아세포는 도 32e에서 명확하게 가시적이다. 조사된 마우스에서, mNM-IL-12는 조혈 재구성 및 IL-12Rβ2 +ve 거핵구, 전구세포 및 골아세포의 존재를 제공하였다.

IL-12 및 그의 유도된 하류 인자, IFN-γ 및 IL-18은 RANKL의 자연 저해제이다. 도 33은 골수에서 IL-12, IFNγ 및 IL-18-유도된 파골세포 세포자멸의 메커니즐을 시각적으로 묘사한다. 건강한 인간에서 NM-IL-12(12 mg)의 단일, SQ 주사는 INF-γ 및 IL-18 모두를 유도할 수 있으며, 따라서 IL-12 만이 RANKL을 저해하기 위해 필요하다. 하기 처리군: 플라세보 및 NM-IL-12에 대한 IFN-γ 대 시간, 및 동일한 처리군에 대한 IL-12 대 시간의 그래프를 나타내는 도 34를 참조한다. 따라서, 표 6에서 요약된 바와 같이, NM-IL-12는 암 환자에서 수반되는 항종양 효과와 함께 골 보존의 이중 이점을 독자적으로 제공한다. 또한 암 치료를 받지 않은 피험자에서, IL-12는 골다공증의 초기 단계에서 말기 단계에 있는 피험자의 골 손실을 예방하거나 감소시키기 위헤 제공될 수 있다.

II. NM - IL -12

NM-IL-12(헤마맥스™(rHuIL-12)로도 또한 공지되어 있음)는 디술피드 결합으로 연결된 2개의 서브유닛으로 구성된 이종이량체 단백질이다. 2개의 서브유닛은 각기 p35 및 p40으로 지칭되는 A 및 B 서브유닛이다. 이종이량체 IL-12는 503개의 아미노산을 함유한다. 이 단백질은 약 75.0 kDa의 전체 분자량을 갖는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 재조합 단백질 생성 기술로 생성될 수 있으며, 내인성 IL-12와 마찬가지로 최종 형태의 당 단백질이다. NM-IL-12의 글리코실화 패턴은 내인성 IL-12와 상이하다. NM-IL-12는 시험관 내 인간 면역 세포에서 및 시험관 내 및 생체 내 모두에서의 비 인간 영장류(붉은털 원숭이)에서 약력학적 반응(인터페론-γ[IFN-γ])을 강력하게 유도한다. 표 7은 NM-IL-12의 연구 제품 복용량/투여를 제공한다.

NM - IL -12(rHuIL-12)): NM-IL-12는 혈소판 회복, 뮤린 모델에서 골수 억제 또는 골수파괴 요법, 뿐만 아니라 골수파괴 처리 후의 비인간 영장류(NHP) 모델에서의 회복을 포함하는 우수한 혈액 세포 회복을 입증하였다. 사실상, 개념 증명, 치사 방사선 NHP 연구에서, 비히클 처리된 원숭이의 80 %는 혈소판 수혈을 필요로하는 반면, NM-IL-12 처리된 원숭이의 25 %만이 혈소판 수혈을 필요로하였다(p <0.007, 카이 제곱 분석). NM-IL-12의 작용 메커니즘(MOA)은 조혈 줄기세포(HSC)의 수준에서 조혈을 재생시키는 것을 포함한다. 이 MOA를 지원하기 위해, 뉴메디슨즈는 IL-12 수용체가 CD 34, c-Kit 및 KDR과 같은 공지의 줄기세포 마커와 함께 동시 발현되기 때문에 인간 HSC의 몇몇 핵심 하위집단에서 IL-12 수용체를 밝혀내었다.

헤마맥스의 작용 메커니즘과 공지된 조혈 성장 인자 간의 작용 메커니즘은 중복이 없다. 헤마맥스의 작용 메카니즘은 다른 조혈 인자의 활성의 상류에서 조혈 줄기 세포의 활성화를 포함한다. 결과적으로, 헤마맥스는 절제 후 조혈 및 면역 시스템을 보충 및 재생할 수 있으며, 한편 이들 하류 작용 인자는 전구체 세포를 타겟으로 하여 단일 혈액 세포 유형을 얻을 수 없다. 이러한 초기 작용(상류) 메커니즘을 통해, 원시 조혈 줄기세포의 헤마맥스 활성화는 모든 주요 혈액 세포 유형을 복원시킬 수 있다.

독자적인 IL-12 수용체는 골수의 전구 세포 및 줄기세포 상에 있으며, 또한 성숙 면역 이펙터 세포 예컨대, CD8+, CD4+, NK 및 B 세포 및 호산구와 같은 다른 세포 상에도 있다. 이 독자적인 수용체는 또한 많은 조직의 세포 상에 있으며, 도 14에서 묘사된 상처 치유 환경에서 관찰된 것과 같은 조직 및 기관의 손상시에 존재할 것이다. 외인성 IL-12와 상호 작용하는 독자적인 IL-12 수용체의 역할은 대체 면역요법으로서 IL-12의 코어에 있다. 전체적으로 체내의 필요에 따라 근절, 복구 및 재생을 위한 외인성 IL-12의 전달과 결합하여, 예컨대 손상 후 또는 질환 동안 체내에서 필요시에 IL-12 수용체의 상향 조절은 본 발명의 기초가 된다.

한 양상에서, 헤마맥스 (rMuIL-12)에 대한 뮤린 카운터파트는 준치사 또는 치사 전신 조사(TBI)에 노출된 정상 및 종양 보유 마우스 모두에서 백혈구와 적혈구 및 혈소판을 포함하는 완전한 계통 혈액 세포회복을 촉진한다. 헤마맥스의 활성은 골수 구획에 존재하는 원시 세포(조혈 및 비 조혈 줄기 세포)의 수준에서 시작된다. 이들 원시 세포의 활성화는 방사선 또는 화학 요법에 의해 야기된 골수 절제 또는 골수 억제 후 골수 구획의 재생을 유도한다.

"인터루킨-12(IL-12)"는 현재 당업계에 공지되어 있거나 또는 미래에 개발될 임의의 방식으로 생산되는, 현지 공지되어 있지 않거나 또는 미래에 개발될 천연 IL-12 분자, 변이체 11-12 분자 및 공유결합으로 변형된 IL-12 분자를 포함하여, 본원에서 개시된 조혈 성질 중 적어도 하나를 생성하는 IL-12 분자를 의미한다.

IL-12 분자는 실질적으로 단리된 형태로 존재할 수 있다. 생성물은 생성물의 의도된 목적을 방해하지 않고 여전히 실질적으로 단리된 것으로 간주되는 캐리어 또는 희석제와 혼합될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 생성물은 또한 실질적으로 정제된 형태 일 수 있으며, 이 경우 일반적으로 예를 들어 펩티드 또는 제제의 건조 중량의 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 적어도 약 99 %를 비롯한, 약 80 %, 85 % 또는 90 %를 포함 할 것이다.

일반적으로, 본 발명의 실시양태에서 사용되는 IL-12 분자의 아미노산 서열은 본 발명의 방법에 의해 치료되는 특정 포유동물로부터 유래된다. 따라서, 설명을 위해, 인간의 경우, 일반적으로 인간 IL-12, 또는 재조합 인간 IL-12가 본 발명의 방법에서 인간에게 투여될 것이고, 유사하게 고양이과 동물에 대하여, 예를 들어 고양이과 동물 IL-12, 또는 재조합 고양이과 동물 IL-12는 본 발명의 방법에서 고양이과 동물에게 투여될 것이다.

또한 본 발명에 포함되는 것은, 그러나 IL-12 분자가 본 발명의 치료 방법의 피험자인 포유동물로부터의 그의 아미노산 서열을 유도하지 않는 특정 실시양태이다. 예시를 위해, 인간 IL-12 또는 재조합 인간 IL-12는 고양이과 포유동물에서 이용될 수 있다. 본 발명의 여전히 다른 실시양태는 IL-12의 천연 아미노산 서열이 천연 서열로부터 변경되는 IL-12 분자를 포함 하나, IL-12 분자는 본원에 개시된 IL-12의 조혈 성질을 생성하는 기능을 한다. IL-12의 천연, 종 특이적 아미노산 서열로부터의 변경은 IL-12의 일차 서열에서의 변화를 포함하고, 일차 아미노산 서열에 대한 결실 및 부가를 포함하여 변이체 IL-12 분자를 생성한다. 고도로 유도체화된 IL-12 분자의 예는 막시젠, 인코포레이션(Maxygen, Inc.)(Leong S R, et al., Proc. Natl . Acad . Sci ., USA., 100 (3): 1163-8 (2003))에 의해 제조된 재설계된 IL-12 분자이며, 여기에서 변이체 IL-12 분자는 DNA 셔플링 방법에 의해 생성된다. 본 발명의 방법, 예컨대 그의 보존수명, 반감기, 효능, 용해도, 전달, 등을 증가시킨 IL-12 분자에 대한 공유결합 변형, 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에서 진술한 방식의 폴리에틸렌 글리콜기, 폴리프로필렌 글리콜, 등의 첨가도 또한 포함되는 변형된 IL-12 분자도 또한 포함된다. IL-12 분자의 공유결합 변형의 한 유형은 IL-12 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C- 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 IL-12 폴리펩티드의 타겟화된 아미노산 잔기를 반응시킴으로써 분자에 도입된다. 천연 서열 IL-12 및 IL-12의 아미노산 서열 변이체 모두는 공유결합으로 변형될 수 있다. 또한, 본원에서 언급된 바와 같이, IL-12 분자는 재조합 방법을 포함하여 당 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 포함된 다른 IL-12 변이체는 표준 서열이 번역 후 변형된 것, 예를 들어, 글리코실화된 것이다. 특정 실시양태에서, IL-12는 포유동물 발현 시스템 또는 세포주에서 발현된다. 한 실시양태에서, IL-12는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현에 의해 생산된다.

변이체 IL-12 폴리펩티드의 특성을 사전에 예측하는 것이 종종 어렵기 때문에, 최적 변이체를 선택하기 위해 회수된 변이체의 일부 스크리닝이 필요할 것이라는 것을 이해할 것이다. 변이체 IL-12 분자의 혈액학적 자극 또는 증강 성질의 변화를 평가하는 바람직한 방법은 하기 개시된 치사 조사 구조 프로토콜을 통해서이다. 산화 환원 또는 열 안정성, 소수성, 단백질 분해에 대한 감수성, 또는 캐리어와 또는 다량체에 응집하는 경향과 같은 단백질 또는 폴리펩티드 성질의 다른 강력한 변형은 당업계에 공지된 방법으로 어세이된다.

일반적으로 IL-12의 생성은 INF-γ의 생성을 자극하여 차례로 IL-12의 생성을 증강시켜서 포지티브 피드백 루프를 형성한다. 시험관 내 시스템에서, 초기 조혈 전구세포의 증식 및 분화를 자극하기 위해 IL-12가 다른 사이토카인(예를들어 IL-3 및 SCF)과 상승 작용할 수 있다고 보고되어 있다(Jacobsen S E, et al., 1993, J. Exp Med 2: 413-8; Ploemacher R E, et al., 1993, Leukemia 7: 1381-8; Hirao A, et al., 1995, Stem Cells 13: 47-53)

NM - IL -12의 투여 방법

본 발명은 요망되는 치료 효과를 달성하는 기간 동안 IL-12의 하나 이상의 생리학적 용량(들)을 피험자에게 투여함에 의한 치료 방법을 제공한다. 피험자는 바람직하게는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등과 같은 동물을 포함하는 포유동물이며 가장 바람직하게는 인간이다.

NM-IL-12의 "생리학적 용량"은 투여 경로에 관계없이, 말초 혈액에서 IL-12 p70에 대한 표준 ELISA에 의해 측정된 약 1 피코그램/ml 초과, 그러나 바람직하게는 약 10 내지 약 100 피코그램/ml의 범위인 NM-IL-12의 범위를 생성하는 용량이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 외인성 IL-12의 생리학적 용량은 말초 혈액에서 약 1 피코그램/ml 초과, 또는 약 10 pg/ml 초과, 및 약 100 미만, 약 95 미만, 약 90 미만, 85 미만, 약 80 미만, 약 75 미만, 약 70 미만, 약 65 미만, 약 60 미만, 약 55 미만, 약 50 미만, 약 45 미만, 약 40 미만, 약 35 미만, 약 30 미만, 약 25 미만, 약 20 미만, 약 15 미만, 약 10 미만, 또는 약 5 피코그램/ml 미만, 또는 이의 임의의 조합, 예컨대, 약 1 pg/ml 초과 및 약 50 pg/ml 미만; 또는 약 1 pg/ml 초과 및 약 15 pg/ml 미만; 또는 약 1 pg/ml 초과 및 약 10 pg/ml 미만; 또는 약 10 pg/ml 초과 및 약 50 pg/ml 미만; 또는 약 10 pg/ml 초과 및 약 20 pg/ml 미만 등의 NM-IL-12의 양을 생성한다.

다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 본 발명의 방법, 예컨대, 리포솜, 미세 입자, 마이크로 캡슐, IL-12를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도 시토시스(예를 들어, 문헌[Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262 : 4429-4432] 참조), 레트로 바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 IL-12에 대한 유전자를 포함하는 핵산의 구축 등에 따라 IL-12를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입 방법은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 진피 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비강 내, 경막 외, 및 경구 경로를 포함한다.

IL-12는 임의의 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막 피부 라이닝(예컨대, 구강 점막, 직장 및 장 점막)을 통한 흡수에 의해 투여 될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 일 수 있다. 국소 전달의 예는 AMD의 예에서 안구 전달이다. 또한, 뇌 실내(intraventricular) 및 척수강 내 주사를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 IL-12를 포함하는 약학 조성물을 중추 신경계에 도입하는 것이 바람직할 수 있으며; 뇌실 내 주사는 예를 들어 옴마야 리저버(Ommaya reservoir)와 같은 리저버에 부착된 심실 내 카테터에 의해 용이하게 될 수 있다. 폐 투여는 또한 예컨대 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용 및 에어로졸화제와의 배합에 의해 사용될 수 있다. 치료를 필요로 하는 영역에 국소적으로 IL-12를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 국소 적용, 주사, 카테터, 좌약 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있고, 상기 임플란트는 시알라스틱(sialastic) 막과 같은 막 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비 다공성 또는 젤라틴 물질이다.

IL-12 투여의 다른 방식은 소포, 특히 리포솜에서의 전달을 포함한다(문헌 [ Langer, Science 249:1527-1533(1990): Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp. 353-365(1989); Lopez-Berestein, ibid ., pp. 317-327] 참조; 일반적으로 같은 문헌 참조)

여전히 IL-12 투여의 다른 방식은 제어된 방출 시스템에서의 전달을 포함한다. 특정 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다(문헌 [Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)] 참조). 추가적으로 중합체 물질이 사용될 수 있다(문헌 [Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres, Boca Raton, Fla.(1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds.), Wiley. N.Y. (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61(1983; 또한 문헌 [Levy et al., Science 228:190(1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351(1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)] 참조, 또는 제어 방출 시스템은 치료 타겟, 즉 뇌에 근접하여 배치될 수 있으며, 따라서 전신 용량의 일부만을 필요로 한다(예컨대, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조). 다른 제어된 방출 시스템은 랭거(Langer)에 의한 리뷰에서 논의된다(Science 249:1527-1533 (1990)).

한 양상에서, IL-12의 하나 이상의 유효 용량은 국소, 피하, 진피 내, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 경막 외, 비경구, 안구 내, 비강 내 및/또는 두개 내로 투여된다.

NM - IL -12의 형태 및 복용량

본 발명의 실시양태에서 사용하기 위한 NM-IL-12의 적합한 제형은 본질적으로 비독성 및 비 치료성인 생리학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함한다. 이러한 캐리어의 예로는 이온 교환체, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충액 물질 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염, 또는 전해질 예컨대 프로타민 술페이트, 인산 수소 이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스 기재 물질, 및 PEG를 포함한다. IL-12 폴리펩티드의 국소 또는 겔 기재 형태를 위한 캐리어는 폴리사카라이드 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 또는 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, PEG 및 목재 왁스 알콜을 포함한다. 모든 투여에 대하여, 종래의 데포 형태가 적합하게 사용된다. 이러한 형태는 예를 들어, 마이크로 캡슐, 나노 캡슐, 리포솜, 플라스터, 흡입 형태, 코 스프레이, 설하 정제 및 서방성 제제를 포함한다.

서방성 제제의 적합한 예는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 조형 품의 형태, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐이다. 서방성 매트릭스의 예는 위의 랭거 등 및 위의 랭거에 의해 기술된 바의 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(위의 시드만(Sidman) 등), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(위의 랭거 등), 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 루프론 데포™(Lupron Depot™)(락트산-글리콜산 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 분자를 방출할 수 있지만, 특정 하이드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 IL-12 폴리펩티드가 장시간 체내에 남아있을 때, 37℃에서 수분에 노출된 결과 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 손실을 초래하고 면역원성이 변화할 수 있다. 관련 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오 디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술티드릴기 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결 건조하며, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하며, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.

서방성 IL-12 함유 조성물은 또한 리포솜으로 포획된 폴리펩티드를 포함한다. IL-12 폴리펩티드를 함유하는 리포솜은 예컨대 문헌 [Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기재된 바와 같은, 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 통상적으로, 리포솜은 지질 함량이 약 30 몰% 초과의 콜레스테롤이며, 선택된 비율은 최적의 Wnt 폴리펩티드 요법을 위해 조정되는 작은(약 200-800 옹스트롬) 유니라멜라 유형이다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포솜은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어있다.

질환의 치료를 위해, IL-12 폴리펩티드의 적절한 복용량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 이전의 요법, 환자의 임상 병력 및 본원에서 개시된 IL-12 치료 방법에 대한 반응 및 담당의의 재량에 의존할 것이다. 본 발명에 따라, IL-12는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.

체중 기반 또는 고정 NM - IL -2 투약: 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 10 ng/kg 내지 2000 ng/kg의 IL-12는 예를 들어, 하나 이상의 별개 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 복용량이다. 대안적으로, 약 40 ㎍, 약 35 ㎍, 약 30 ㎍, 약 25 ㎍, 약 20 ㎍, 약 19 ㎍, 약 18 ㎍, 약 17 ㎍, 약 16 ㎍, 약 15 ㎍, 약 14 ㎍, 약 13 ㎍, 약 12 ㎍, 약 11 ㎍, 약 10 ㎍, 약 9 ㎍, 약 8 ㎍, 약 7 ㎍, 약 6 ㎍, 약 5 ㎍, 약 4 ㎍, 약 3 ㎍, 약 2 ㎍, 또는 약 1 ㎍와 같은 고정된 용량의 NM-IL-12가 이용될 수 있다. 예시적인 투약 범위는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 (i) 약 1 ㎍ 초과 및 약 20 ㎍ 미만; (ii) 약 8 ㎍ 내지 약 15 ㎍; 및 (iii) 약 10 ㎍ 내지 약 12 ㎍를 포함한다. 초기 투여 후 NM-IL-12의 예시적인 유지 용량은 약 5㎍ 내지 약 10㎍이지만, 본원에 기재된 임의의 복용량은 초기 또는 유지 용량을 위해 사용될 수 있다. 인간은 약 500 ng/kg의 반복 복용량을 안전하게 견딜 수 있지만, 약 200 ng/kg까지의 단일 복용량은 독성 부작용을 일으키지 않아야 한다. 예를 들어, 용량은 G-CSF, GM-CSF 및 EPO와 같은 다른 사이토카인에 대한 것과 동일할 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할때 까지 치료는 지속 된다. 그러나 다른 복용량 양생법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 종래의 기술 및 어세이에 의해 용이하게 모니터링된다.

본 발명의 또 다른 양상은 대체 면역요법으로서 외인성 IL-12를 필요로 하는 피험자를 확인하는 방법에 관한 것이다. 체내의 세포, 조직 또는 기관의 근절, 복구 또는 재생에 대한 필요성이 확인된 피험자는 본원에서 기재된 바와 같이 외인성 IL-12를 수용하기에 적합하다. 그러나 필요로 하는 피험자는 약 5 pg/ml 미만, 또는 약 3 pg/ml 미만, 또는 약 1 pg/ml 미만의 IL-12 발현의 베이스라인 수준을 갖는다. 일반적으로, 필요로 하는 피험자는 IL-12 p70의 검출을 위해 본원에 기재된 바와 같이, 검증된 어세이를 사용하여 검출 한계 미만인 베이스라인 수준을 갖는다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 방법으로부터 이점을 얻는 특정 환자 집단을 확인하였다.

본 발명의 한 양상에서, 치료 방법은 (i) IL-12의 치료 용량 및 (ii) IL-12의 유지 용량에 대해 상이하거나 동일할 수 있는 2가지 생리학적 용량 수준의 IL-12를 사용하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 IL-12 용량이 치료 IL-12 용량으로 사용될 수 있지만, IL-12의 치료 용량은 약 1㎍ 초과 및 약 20㎍ 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 IL-12 용량이 유지 IL-12 용량으로 사용될 수 있지만, IL-12의 유지 용량은 약 1 ㎍ 초과 및 약 10 ㎍ 미만이다. 예시적인 실시양태에서, IL-12의 치료 용량은 예컨대 일주일에, 약 2주마다, 약 3주마다, 약 4주마다, 약 5주마다, 또는 약 6주마다 약 1회 외인성 IL-12의 투여 개시에서 주기적으로 제공될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, IL-12의 유지 용량은 초기 투여 기간의 완료 후 제공될 수 있으며, 약 1개월마다, 약 2개월마다, 약 3개월마다, 약 4개월마다, 약 5개월마다 또는 약 6개월마다와 같은 빈도로 제공된다.

본 발명의 또 다른 양상에서, 필요로 하는 피험자에게 투여된 외인성 IL-12의 생리학적 용량은 IL-12 p70에 대한 표준 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 약 1 피코그램/ml 초과 및 약 200 피코그램/ml 미만인 말초 혈액 중의 NM-IL-12의 범위를 생성한다. 말초 혈액에서 IL-12 p70의 200 pg/ml를 초과하는 수준이 유익하지 않을 수 있다는 것은 주목할만하다. 다른 실시양태에서, 말초 혈액 중의 NM-IL-12의 범위는 약 1 pg/ml 초과 및 약 200 pg/ml 미만, 약 175 pg/ml 미만, 약 150 pg/ml 미만, 약 125 pg/ml 미만, 약 100 pg/ml 미만, 약 75 pg/ml 미만, 약 50 pg/ml 미만, 약 25 pg/ml 미만, 약 15 pg/ml 미만, 또는 약 10 pg/ml 미만일 수 있다. 여전히 본 발명의 또 다른 양상에서, IL-12의 투여 후, 피험자의 말초 혈액에서 IL-12의 측정 가능한 수준 이외에, 말초 혈액에서 IFN-γ의 증가가 또한 수반될 것이며; 및/또는 피험자의 말초 혈액에서 IL-12의 측정 가능한 수준은 또한 말초 혈액에서의 IFN-g의 증가를 나타내며, 여기에서 IL-12 투약 후의 IFN-γ의 수반되는 수준은 약 20 pg/ml 내지 약 1000 pg/ml 범위이다. 다른 양상에서, IL-12 투약 후 IFN-γ의 범위는 약 1000 pg/ml 이하, 약 900 pg/ml 이하, 약 800 pg/ml 이하, 약 700 pg/ml 이하, 약 600 pg/ml 이하, 약 500 pg/ml 이하, 약 400 pg/ml 이하, 약 300 pg/ml 이하, 약 200 pg/ml 이하, 약 100 pg/ml 이하, 약 75 pg/ml 이하, 또는 약 50 pg/ml 이하일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 말초 혈액에서 IL-12p70 및 IFN-γ 모두의 수반되는 수준이 대체 면역요법으로서 효능의 마커로 간주 될 수 있다는 것이다. NM-IL-12 투약 후 혈액 중 초기 수준에서 두 가지 인자 중 하나의 수준이 실질적으로 감소하면, 대체 효능이 덜 치료적일 수 있다. 이 경우, NM-IL-12의 후속 용량은 감소될 수 있다.

하기 표 8은 12 ㎍의 단일 IL-12 투약 후 환자의 혈액에서 관찰된 IL-12 양의 범위를 나타낸다.(이것은 건강한 피험자에서 수행된 약동학/약력학 분석의 일부이었다.)

임의의 종래의 어세이는 인간 혈장 중 IL-12의 농도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예로서, 및 제한하고자 함이 없이, 인간 혈장에서의 IL-12(예컨대, NM-IL-12)의 농도는 효소 결합 면역흡착 어세이(ELISA) 또는 전기화학발광 면역측정법(MSD)에 의해 검출될 수 있다. ELISA: 이 방법은 인간 K2 EDTA 혈장에서 NM-IL-12의 농도를 측정하기 위해 정량적 샌드위치 효소 결합 면역흡착 어세이(ELISA)을 이용한다. NM-IL-12를 함유하는 표준, 대조 및 테스트 샘플을 IL-12 포획 항체로 예비 코팅된 96 웰 플레이트와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 결합되지 않은 물질을 세척 제거하고, NM-IL-12를 인간 IL-12 검출 항체 접합체(Detection Antibody Conjugate)로 검출한다. 인큐베이션 후, 결합되지 않은 물질을 그 후 세척 제거하고, 기질 용액을 웰에 첨가한다. 마지막으로, 증폭 용액을 모든 웰에 첨가하고 초기 단계에서 결합된 NM-IL-12의 양에 비례하여 발색시킨다. 발색을 멈추고 650 nm로 설정된 파장 보정으로 490 nm에서 색의 강도를 측정한다. MSD : 예시적인 어세이에서, 50 마이크로리터의 표준 및 검증 샘플을 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) V-플렉스 인간 IL-12p70 플레이트 상의 적절한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고 실온에서 대략 2 시간 동안 플레이트 셰이커(2-4로 설정) 상에서 인큐베이션 하였다. 플레이트를 그 후 웰당 대략 300μL의 MSD 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 25 마이크로리터의 검출 항체를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고 실온에서 대략 2 시간 동안 플레이트 셰이커(2-4로 설정) 상에서 인큐베이션 하였다. 검출 항체와 함께 인큐베이션 후, 플레이트를 웰당 대략 300 μL의 MSD 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 2x 판독 완충액 T를 플레이트의 각각의 웰에 분배하였다. 플레이트를 섹터 이미저(Sector Imager) 6000(메조 스케일 디스커버리) 플레이트 판독기에서 즉시 판독하였다. 표준 곡선은 log10 변환 데이터의 4-파라미터 로지스틱 곡선 맞춤(젠 5 시큐어 소프트웨어, 바이오텍 인스트루먼츠)을 사용하여 생성되었다.

또한, 임의의 종래의 어세이를 본 발명의 방법에 사용하여 IFN-γ 수준을 측정할 수 있다. 예를 들면 하기와 같다: 전기화학발광 면역측정법( MSD )에 의한 IFN -γ 검출. 표준 및 인간 혈장 샘플 50 마이크로리터를 메조 스케일 디스커버리 전염증성 패널 1(인간) 플레이트 상의 적절한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고 실온에서 대략 2시간 동안 플레이트 셰이커(2-4로 설정) 상에서 인큐베이션 하였다. 플레이트를 그 후 웰당 대략 300μL의 MSD 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 25 마이크로 리터의 SULFO-TAG 항 hu-IFN-γ 항체 검출 항체를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고 실온에서 대략 2시간 동안 플레이트 셰이커(2-4로 설정) 상에서 인큐베이션하였다. 검출 항체와 함께 인큐베이션한 후, 플레이트를 웰당 대략 300μL의 MSD 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 2x 판독 완충액 T를 플레이트의 각 웰에 분배하였다. 플레이트를 섹터 이미저 6000(메조 스케일 디스커버리) 플레이트 판독기에서 즉시 판독하였다. 표준 곡선은 log10 변환 데이터의 4-파라미터 로지스틱 곡선 맞춤(젠 5 시큐어 소프트웨어, 바이오텍 인스트루먼츠)을 사용하여 생성되었다.

IL-12는 직접 공동 투여 또는 순차적 투여에 의해 다른 사이토카인과 함께 투여될 수 있다. 하나 이상의 사이토카인이 IL-12와 함께 공동투여되는 경우, IL-12보다 적은 용량이 사용될 수 있다. 다른 사이토카인, 즉 IL-12 이외의 적합한 용량은 약 1 ㎍/kg 내지 약 15 mg /kg의 사이토카인이다. 예를 들어, 용량은 G-CSF, GM-CSF 및 EPO와 같은 다른 사이토카인의 용량과 동일할 수 있다. 다른 사이토카인(들)은 IL-12의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 사이토카인(들) 및 IL-12는 조합되어 포유동물에게 동시 투여하기 위한 약학 조성물을 형성할 수 있다. 특정 실시 양태에서, IL-12 및 사이토카인의 양은 IL-12 및 다른 사이토카인의 투여시에 포유동물에서 혈액 세포의 상승적인 재증식(또는 조혈 세포의 증식 및/또는 분화의 상승적 증가)이 발생하도록 한다. 다시 말해, 혈액 세포의 재증식(또는 조혈 세포의 증식/분화)과 관련하여 2 이상의 약제(즉, IL-12 및 하나 이상의 사이토카인(들))의 통합 작용은 이들 분자의 개별 효과의 합보다 더 크다.

IL-12의 치료 배합물은 원하는 순도를 갖는 IL-12를 동결건조된 케익 또는 수용액의 형태로 임의의 생리학적으로 허용 가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed., (1980))와 혼합하여 저장을 위해 제조된다. 허용 가능한 캐리어, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 복용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저 분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디카사라이드 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및/또는 트윈®, 플루로닉^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제를 포함한다.

본원에서 사용된 바의 용어 "완충액(buffer)"은 약학적 제제의 pH를 안정화시키는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 나타낸다. 적합한 완충액은 당 업계에 공지되어 있으며 문헌에서 찾을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 완충액은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 히스티딘 완충액, 시트레이트 완충액, 숙시네이트 완충액, 아세테이트 완충액, 포스페이트 완충액, 아르기닌 완충액 또는 이의 혼합물을 포함한다. 상술한 완충액은 일반적으로 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM 내지 약 50 mM 및 약 10-20 mM의 양으로 사용된다. 완충 용액의 pH는 적어도 4.0, 적어도 4.5, 적어도 5.0, 적어도 5.5 또는 적어도 6.0일 수 있다. 완충 용액의 pH는 7.5 미만, 7.0 미만, 또는 6.5 미만일 수 있다. 완충 용액의 pH는 당업계에 공지된 산 또는 염기, 예컨대 염산, 아세트산, 인산, 황산 및 시트르산, 수산화나트륨 및 수산화칼륨과 약 4.0 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 5.0 내지 약 6.5, 및 약 5.5 내지 약 6.5일 수 있다. 본원에서 사용되는 바의 pH를 기술할 때, "약"은 ± 0.2 pH 단위를 의미한다.

본원에서 사용된 바의 용어 "계면활성제"는 교반 및 전단과 같은 기계적 응력에 대하여 단백질 배합물을 보호하기 위해 사용되는 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 계면활성제의 예는 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(트윈), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(브리즈(Brij)), 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에테르(트리톤-엑스(Triton-X)), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(폴록사머, 플루로닉), 및 소듐 도데실 술페이트 (SDS)를 포함한다. 적합한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄-지방산 에스테르 예컨대 폴리소르베이트 20, (상표 트윈 20®으로 판매됨) 및 폴리소르베이트 80(상표 트윈 80®으로 판매됨)을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체는 명칭 플루로닉® F68 또는 폴록사머 188®로 판매되는 것들이다. 적합한 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 상표 브리즈®로 판매되는 것들이다. 적합한 알킬페놀폴리옥시에틸렌 에테르는 상표 트리톤-X로 판매된다. 폴리소르베이트 20(트윈 20®) 및 폴리소르베이트 80(트윈 80®)은 약 0.001 내지 약 1%, 약 0.005 내지 약 0.2% 및 약 0.01% 내지 약 0.1% w/v(중량/부피) 범위의 농도로 일반적으로 사용된다.

본원에서 사용된 바의 용어 "안정화제"는 제조, 저장 및 적용 중에 화학적 및/또는 물리적 분해로부터 활성 약학적 성분 및/또는 배합물을 보호하는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 단백질 의약품의 화학적 및 물리적 분해 경로는 문헌 [Cleland et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 70(4):307-77 (1993); Wang, Int. J. Pharm., 7S5(2): 129-88 (1999); Wang, Int. J. Pharm., 203(1-2): 1-60 (2000); and Chi et al, Pharm. Res., 20(9): 1325-36 (2003)]에서 리뷰된다. 안정화제는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 당(sugar), 아미노산, 폴리올, 시클로덱스트린, 예컨대 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 술포부틸에틸-β-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜, 예컨대 PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 6000, 알부민, 인간 혈청 알부민(HSA), 소 혈청 알부민(BSA), 염, 예컨대 염화 나트륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 이후에 정의되는 바의 킬레이트제, 예컨대, EDTA를 포함한다. 전술한 바와 같이, 안정화제는 약 10 내지 약 500 mM의 양, 약 10 내지 약 300 mM의 양 또는 약 100 mM 내지 약 300 mM의 양으로 배합물 내에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예시적인 IL-12는 안정한 적절한 약학적 배합물 내에 용해될 수 있다.

IL-12는 또한 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민, 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자, 및 나노캡슐) 내에서, 또는 마크로에멀션 내에서 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합(예를 들어, 각기 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트)마이크로캡슐)에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에서 포획될 수 있다. 이러한 기술은 위의 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences]에 개시되어있다.

생체 내 투여에 사용될 IL-12는 멸균되어야 한다. 이것은 동결 건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. IL-12는 동결건조된 형태 또는 용액으로 저장된다. 치료용 IL-12 조성물은 일반적으로 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 정맥 내 용액 백 또는 바이알과 같은 멸균 접근 포트를 갖는 용기에 놓인다.

국소적으로 투여될 때, IL-12는 캐리어 및/또는 애주번트와 같은 다른 성분과 적합하게 조합된다. 이들 성분의 의도된 투여를 위해 생리학적으로 허용 가능하고 효과적이어야하며, 조성물의 활성 성분의 활성을 저하시킬 수 없다는 점을 제외하고는, 이러한 다른 성분의 성질에는 제한이 없다. 적합한 비히클의 예는 정제된 콜라겐이 있거나 없는 연고, 크림, 겔 또는 현탁액을 포함한다. 조성물은 또한 경피 패치, 플라스터 및 붕대에, 바람직하게는 액체 또는 반 액체 형태로 함침될 수 있다.

겔 배합물을 얻기 위해, 액상 조성물로 배합된 IL-12는 유효량의 수용성 폴리사카라이드 또는 PEG와 같은 합성 중합체와 혼합되어 국소적으로 적용되는 적절한 점도의 겔을 형성할 수 있다. 사용될 수 있는 폴리사카라이드는 예를 들어, 알킬 셀룰로오스, 히드록시알킬 셀룰로오스, 및 알킬히드록시알킬 셀룰로오스, 예를 들어, 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 및 히드록시프로필 셀룰로오스를 포함하는 에테르화된 셀룰로오스 유도체와 같은 셀룰로오스 유도체; 전분 및 분별된 전분; 한천; 알긴산 및 알기네이트; 아라비아 검; 풀루란; 아가로오스; 카라기난; 덱스트란; 덱스트린; 프룩탄; 이눌린; 만난; 크실란; 아라비난; 키토산; 글리코겐; 글루칸; 및 합성 생체고분자; 뿐만 아니라 검 예컨대 크산탄 검; 구아 검; 로커스트 빈 검; 아라블 검(gum arable); 트라가칸트 검; 카라야 검; 및 이의 유도체 및 혼합물을 포함한다. 본원에서 바람직한 겔화제는 생물학적 시스템에 대해 비활성이며, 비독성이고, 제조가 간단하며, 너무 유동성이 아니거나 또는 점성이 없고, 그 안에 보유된 IL-12 분자를 불안정하게 하지 않을 것이다.

바람직하게는 폴리사카라이드는 에테르화된 셀룰로오스 유도체, 더 바람직하게는 잘 정의되어 있고, 정제되었으며, USP에 열거되어있는 것, 예컨대, 메틸셀룰로오스 및 히드록시알킬 셀룰로오스 유도체, 예컨대 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 및 히드록시프로필 메틸셀룰로오스이다. 본원에서 가장 바람직한 것은 메틸셀룰로오스이다.

겔화에 유용한 폴리에틸렌 글리콜은 전형적으로 적절한 점도를 얻기 위해 저 분자량 및 고 분자량 PEG의 혼합물이다. 예를 들어, 분자량 400-600인 PEG와 분자량이 1500인 PEG의 혼합물은 페이스트를 얻기 위해 적절한 비율로 혼합될 때 이러한 목적에 효과적일 것이다.

폴리사카라이드 및 PEG에 적용되는 바의 용어 "수용성"은 콜로이드 용액 및 분산액을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 셀룰로오스 유도체의 용해도는 에테르기의 치환도에 의해 결정되며, 본원에서 유용한 안정화 유도체는 유도체가 수용성이 되도록 셀룰로오스 사슬 내의 무수글루코오스 단위당 충분한 양의 이러한 에테르 기를 가져야 한다. 무수 글루코오스 단위당 적어도 0.35의 에테르 기의 에테르 치환도가 일반적으로 충분하다. 또한, 셀룰로오스 유도체는 알칼리 금속염, 예를 들어 Li, Na, K 또는 Cs 염의 형태 일 수 있다.

메틸셀룰로스가 겔에서 사용된다면, 바람직하게는 이것은 겔의 약 2 내지 5 %, 더 바람직하게는 약 3 %를 포함하고 IL-12는 겔의 ml 당 약 300 내지 1000 mg의 양으로 존재한다.

치료적으로 사용되는 IL-12의 유효량은 예를 들어 치료 목적, 투여 경로 및 환자의 상태에 의존할 것이다. 따라서, 치료자는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 복용량을 적정하고 필요에 따라 투여 경로를 변형하는 것이 필요하다. 전형적으로, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 복용량에 도달할 때까지 IL-12를 투여할 것이다. 전신 치료를 위한 전형적인 복용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 10 ng/kg에서 2000 ng/kg 까지 또는 그 이상의 범위이다. 일부 실시양태에서, 용량 범위는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 내지 약 20; 내지 약 30; 내지 약 50; 내지 약 100, 내지 약 200, 내지 약 300 또는 내지 약 500 ng/kg일 수 있다. 한 양상에서, 용량은 500 ng/kg 미만이다. 또 다른 양상에서, 용량은 300 ng/kg 미만이다. 또 다른 양상에서, 용량은 약 200 ng/kg 미만이다. 또 다른 양상에서, 용량은 약 100 ng/kg 미만이다. 또 다른 양상에서, 용량은 약 50 ng/kg 미만이다. 다른 양상에서, 용량은 약 10 내지 300 ng/kg, 20 내지 40 ng/kg, 25 내지 35 ng/kg, 50 내지 100 ng/kg 범위일 수 있다.

한 양상에서, 본원에서 기재된 예시적인 치료 조성물은 분별된 용량으로 투여될 수 있다. 한 실시 양태에서, 치료적 유효 용량은 각각의 분획 전에 제공된다. 한 실시양태에서, 치료적 유효 용량은 각각의 화학 요법 용량 또는 용량 분획의 투여와 거의 동시에 제공된다. 한 실시양태에서, 치료적 유효 용량은 각 분획 전에, 각 분획 전 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 또는 60분 범위; 또는 각 분획 후 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 시간; 또는 각 분획 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일에 제공된다. 한 실시양태에서, 치료적 유효 용량은 각 분획 후에, 각 분획 후 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 60 분 범위; 또는 각 분획 후 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12시간; 또는 각 분획 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일; 또는 화학 요법 및/또는 화학 요법/방사선 치료의 조합 동안 또는 후에, 1 회, 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 7 회로 매주, 격주 또는 격월로 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 예시적인 IL-12의 용량은 약 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60분, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일에 각각의 화학 요법 용량 전 및 후 모두에서 투여(1 내지 100 ng/kg) 된다.

대안적인 일반적인 제안으로서, IL-12 수용체를 배합하고 약 0.1 ng/cc 초과의 IL-12 수준을 유효하지만 과도하게 독성이 아닌 최대 용량까지 조직 내에서 확립할 수 있는 복용량으로 타겟 부위 또는 조직으로 전달된다. 이러한 조직 내부 농도는 가능하다면 연속 주입, 서방형, 국소 적용 또는 경험적으로 결정된 빈도의 주사를 포함하여 투여 체계에 의해 유지되어야 한다. 이 요법의 진행은 종래의 어세이로 용이하게 모니터링할 수 있다.

"치료 투여 시간 근처(near the time of administration of the treatment)"는 치료의 투여 전 및/또는 후에 임의의 합리적인 시간 간격으로 예컨대 약 1개월, 약 3주, 약 2주, 약 1주, 수 일, 약 120시간, 약 96시간, 약 72시간, 약 48시간, 약 24시간, 약 20시간, 수 시간, 약 1시간 또는 분으로 IL-12를 투여하는 것을 의미한다. 치료 투여 시간 근처는 또한 치료제 및 IL-12를 동시에 또는 거의 동시에, 즉 수분 내지 1일 내에 투여하는 것을 의미할 수 있다.

III. 정의

본 발명의 개시 목적을 위해, 하기의 정의는 전체적으로 기술 용어를 정의하고 청구항에서 보호하고자 하는 물질의 조성의 범위를 정의하는데 사용될 것이다.

본원에서 사용된 바의, 용어 "약"은 당업자에 의해 이해될 것이며, 그것이 사용되는 문맥에 따라 어느 정도 변할 것이다. 이것이 사용된 문맥에서 당업자에게 명확하지 않은 용어의 사용이 있는 경우, "약"은 특정 용어의 최대 ±10 %를 의미할 것이다.

"골수 보전(bone marrow preservation)"은 방사선, 화학요법, 질환 또는 독소에 의해 손상된 골수가 정상 상태 또는 정상 상태 근처에서 유지되는 과정을 의미하며; "골수 회복"은 방사선, 화학요법, 질환 또는 독소에 의해 손상된 골수가 정상 상태, 정상 상태 근처, 또는 골수 기능에서 임의의 측정 가능한 개선이 얻어지도록 복원되는 과정을 의미하고; 골수 기능은 조혈(혈액) 줄기 세포에서 적절한 수준의 다양한 혈액 세포 유형 또는 계통을 생성하는 과정이다.

"골수 부전(bone marrow failure)"은 방사선, 화학요법, 질환 또는 독소에 의해 손상된 골수가 정상으로 복원될 수 없고, 따라서 포유동물에서 적절한 조혈을 유지하기에 충분한 혈액 세포를 생성하지 못하는 병리학적 과정이다.

"화학 요법"은 현재 의학 분야에서 알려지거나 또는 개발된 천연 또는 합성 약제가 포함된 모든 요법을 의미한다. 화학 요법의 예는 현재 이용 가능한 수많은 암 약물을 포함한다. 그러나 화학 요법은 질환 상태를 치료하고자 하는 임의의 천연 또는 합성 약물도 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 화학 요법은 질환 상태를 치료하고자 하는 몇몇 당 업계 약물의 투여를 포함할 수 있다. 예로는 두부의 진행 편평 세포 암종이 있는 환자를 위한 도세탁셀, 시스플라틴, 및 5-플루오로우라실(Tsukuda, M. et al., Int J Clin Oncol. 2004 June; 9 (3): 161-6), 및 난치성 및 재발성 무통 림프종에서 플루다라빈 및 벤다무스틴(Konigsmann M, et al., Leuk Lymphoma. 2004; 45 (9): 1821-1827) 과의 조합된 화학요법을 포함한다.

"방사선 요법(Radiation therapy)"은 임의의 형태의 방사선이 질환 상태를 치료하기 위해 사용되는 임의의 요법을 의미한다. 방사선 요법을 위한 방사선을 생성하는 기기는 현재 이용 가능하거나 미래에 이용가능한 기기이다.

본원에서 사용되는 바의, 방사선 요법 "치료 방식(treatment modality)"은 이온화 및 비 이온화 방사선 원 모두를 포함할 수 있다. 예시적인 이온화 방사선 치료 방식은 예를 들어, 외부 빔 방사선 요법; 강도 변조 방사선 요법(IMRT); 영상 유도 방사선요법(IGRT); X 조사(예컨대 광자 빔 요법); 전자 빔(예컨대 베타 조사); 양성자 조사; 높은 선형 에너지 전달(LET) 입자; 정위 방사선 수술(stereotactic radiosurgery); 감마 나이프; 선형 가속기 매개 무프레임 정위 방사선 수술; 로봇 암 제어 x 조사 전달 시스템; 기관 특이적 또는 암 세포 특이적 흡수를 위한 방사성 동위원소 방사선 요법; 종양 타겟화 방사선 요법(또는 방사면역요법, RIT)을 위한 단일클론 항체에 결합된 방사성 동위원소; 근접 요법(간질(interstitial) 또는 내강(intracavity)) 고 선량률 방사선 원 주입; 기관 특이적 선량 전달을 위한 영구 방사성 종자 주입을 포함할 수 있다.

"결핍의 개선(ameliorate the deficiency)"은 조혈 결핍의 감소, 즉 결핍의 향상, 또는 현재의 의학적 관행에 의해 정의된 정상 상태의 부분적 또는 완전한 복원을 의미한다. 따라서, 조혈 결핍의 개선은 일반적으로 또는 구체적으로 조혈의 증가, 자극, 향상 또는 촉진을 의미한다. 조혈 결핍의 개선은 일반적으로, 즉 2 이상의 조혈 세포 유형 또는 계통을 증가시키거나, 또는 특이적으로, 즉 하나의 조혈 세포 유형 또는 계통을 증가시키는 것으로 관찰될 수 있다.

"골수 세포"는 일반적으로 포유동물의 골수 구획에 상주 및/또는 복귀하는 세포를 의미한다. 용어 "골수 세포"에는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 조혈 재증식 세포(hematopoietic repopulating cell), 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포를 포함하는 조혈 세포 원뿐만 아니라 골수에서 유래 될 수 있는 임의의 세포, 예컨대 이것으로 제한되는 것은 아니지만 이들 및 다른 세포 유형 및 계통에 대한 관련된 줄기 및/또는 전구 세포를 포함하는, 내피 세포, 간엽 세포, 골 세포, 신경 세포, 지지 세포(기질 세포(stromal cell))를 포함한다.

"조혈 세포 유형"은 일반적으로 다양한 유형의 분화된 조혈 세포를 의미하지만, 특정 조혈 세포 유형이 줄기세포, 전구세포, 및 다양한 계통 세포, 예컨대 골수 세포, 림프계 세포, 등을 포함하는 혈액 세포 생성과 관련된 모든 세포 유형을 의미하는 다양한 모세포와 같은 것으로부터 유래하는 조혈 전구세포도 또한 포함할 수 있다.

"조혈 세포 계통(hematopoietic cell lineage)"은 일반적으로 골수 또는 림프와 같은 분화된 조혈 세포의 특정 계통을 의미하지만, 또한 수지상, 적혈구 등과 같은 더 분화된 계통을 의미할 수도 있다.

세포의 "IL-12 촉진 증식(IL-12 facilitated proliferation)"은 일반적으로 포유동물의 골수에 상주 또는 복귀하는 세포, 예컨대 조혈 전구세포 및/또는 줄기세포이지만, 골수 니치(niche)의 미세환경을 포함하는 다른 세포도 포함하는 세포에서 적어도 부분적으로 팽창, 또는 증가에 기인하는 조혈의 증가, 자극, 또는 향상을 의미한다.

"조혈의 자극 또는 향상"은 일반적으로 하나 이상의 조혈 세포 유형 또는 계통의 증가를 의미하며, 특히 포유동물이 하나 이상의 조혈 세포 유형 또는 계통에서 결핍을 갖는 경우 하나 이상의 조혈 세포 유형 또는 계통의 자극 또는 향상에 관한 것이다.

"조혈 장기 재증식 세포"는 일반적으로 골수에서 가장 원시적인 혈액 세포이며; 이들은 다양한 혈액 세포 유형 및 계통의 평생 생성을 제공하는 책임이 있는 혈액 줄기세포이다.

"조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell)"는 일반적으로 혈액 줄기세포이며; 상기 정의된 바의 "장기 재증식", 및 단기간(포유동물에 따라 수주, 수개월 또는 심지어 때때로 수년) 동안 "전구 세포"를 생성할 수 있는 "단기 재증식"의 두 가지 유형이 있다.

"조혈 전구 세포(hematopoietic progenitor cell)"는 일반적으로 혈액 줄기 세포로부터 분화 (즉, 성숙)되는 최초의 세포이며; 이들은 그 후 다양한 혈액 세포 유형 및 계통으로 분화(성숙)된다.

"조혈 지지 세포(hematopoietic support cell)"는 골수의 비 혈액 세포이며; 이들 세포는 혈액 세포 생성을 위한 "지원"을 제공한다. 이들 세포는 골수 기질 세포라고도 지칭된다.

본원에서 사용되는 바의 "피험자"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 의미한다. "동물"은 냉혈 및 온혈 척추 동물 및 비척추동물 예컨대 어류, 갑각류, 파충류 및 특히 포유동물을 포함한다. "포유동물"은 제한함이 없이 마우스; 쥐; 토끼; 기니피그; 개; 고양이; 양; 염소; 암소; 말; 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지, 유인원, 및 태아, 소아 및 성인을 포함한다.

본원에 사용된 바의, "방지하는" 또는 "보호하는"은 전체 또는 일부분을 방지하거나, 개선 또는 제어하는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바의, 용어 "치료하는(treating)"은 치료적 처리 및 예방 또는 방지 수단 모두를 의미하거나 또는 치료적 잠재력을 갖는 것으로 추측되는 약제를 투여하는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바의 용어 "약학적 유효량"은 치료되는 질환의 증상을 경감 또는 완화하는 것을 포함하는 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 추구되고 있는 조직, 시스템, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어내는 활성 화합물 또는 약학적 제제의 양을 의미한다.

본원에서 사용된 바의, 본 발명의 약학 조성물에서 언급된 "유효량"은 유용성을 가지며 원하는 치료적 종말점을 제공하기에 충분한 양을 의미한다.

한 실시양태에서, 치료 방식/양생법은 가속된 분별 요법이다. 가속된 분별 요법에서, 분획당 용량은 변화하지 않지만 일일 용량은 증가하고, 처리를 위한 총 시간은 감소된다.

조합(순차적 또는 동시) 요법은 공동 투여 또는 공동 배합일 수 있다.

실시예

본 발명은 하기의 실시예를 참고하여 이제 기술된다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며, 본 발명은 이들 실시예로 한정되지 않고 오히려 본원에서 제공된 교시의 결과로서 명백한 모든 변형을 포함한다.

실시예 1:

도 32는 뮤린 IL-12가 조사된 마우스에서 조혈 회복을 촉진하는 것을 기술한다. IL-12Rβ2에 대해 염색된(주황색) 비 조사된, 처리되지 않은 마우스로부터의 대퇴 골수의 대표적인 절편을 도 32a 및 32b에 나타낸다. 동물은 TBI(8.0Gy) 및 후속하여 조사 후 표시된 시간에서 비히클(도 32b 및 32c) 또는 rMuIL-12(20 ng/마우스)(도 32d 및 32e)를 피하로 수용하게 하였다. 대퇴 골수를 조사 12일 후 IL-12Rβ2에 대해 면역조직화학적으로 염색하였다(주황색). 비히클로 처리된 마우스로부터의 골수는 IL-12Rβ2 발현 세포가 결핍되었으며 조혈 재생의 징후가 나타나지 않은 반면(도 32c), rMuIL-12로 처리된 마우스는 조혈 재구성 및 IL-12Rβ2-발현 거핵구, 골수 전구 세포 및 골아세포의 존재를 나타내었다(도 32e 및 32f).

실시예 2:

예시적인 인간 대상 첫 번째(FIH) 임상 연구의 요약 및 설계

제목 "A Phase 1, Double Blind , Placebo - Controlled , Single Ascending Dose Study of the Safety , Tolerability , Pharmacokinetics , and Pharmacodynamics of HemaMax ^Tm ( rHuIL -12) in Healthy Adult Volunteers(IND 104,091)"의 이 연구는 건강한 성인 피험자에서 헤마맥스^TM의 단일 상승 피하(SC) 용량의 약동학 및 면역원성을 평가하기 위한 이차 목표로 안전성 및 내성 능력을 결정하기 위해 설계된 것이다.

최대 30명의 18-45세의 건강한 남성 및 여성의 성인 피험자를 각기 6명의 피험자의 4 연속 코호트로 등록하고, 감시 피험자를 각각의 용량 수준에서 사용하였다. 연구 제품(헤마맥스™ 또는 플라세보)의 단일 SC 주사를 2, 5, 10 및 20 μg의 용량으로 복부에 투여한다. 6명의 피험자의 코호트를 이중 맹검 방식으로 용량 수준(플라세보에 대하여 n = 2, 헤마멕스^TM에 대하여 n = 4)당 평가한다. n = 6 피험자 (2명 플라세보 및 4명 헤마맥스™)의 추가적인 확장 코호트를 연구의 상승 용량 부분으로 투여된 최고 용량(또는 플라세보)을 수용하는 것으로 등록할 수 있다.

실시예 3: NM-IL-12

약사는 헤마맥스™ 투약 용액을 피험자에게 주사하기 위해 충전된 주사기 형태로 준비한다. 이 시험에서, 연구 제품(IP)은 2 mL 투명 바이알 내의 헤마맥스(rHuIL-12) 약물 제품으로 구성된다. 헤마맥스(rHuIL-12) 약물 제품 바이알은 0.1%(w/v) 폴록사머 188(0.50 mL의 회수 부피)와 함께 10 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, pH 6.0 중의 0.65 mL의 20 ㎍/mL rHuIL-12 단백질을 함유한다. 이들 용액은 투명하고 무색이다.

냉장고에서 바이알을 꺼내어 용량을 준비하기 전에 적어도 15분 동안 실온에서 방치한다. 분리된 25G 5/8 바늘과 폴리프로필렌 배럴이 있는 BD 주사기 또는 BD 투베르쿨린 주사기(카탈로그 #305553, 27g 1/2 바늘 부착)는 호환 가능한 것으로 나타났다. 준비된 용액이 있는 주사기는 실온에서 6 시간 동안 보관할 수 있다. 더 긴 저장 시간이 필요할 경우 주사기를 2-8℃에서 24시간 동안 저장할 수 있다. 별도의 바늘이 있는 주사기를 사용하는 경우, 용량 주사기를 대략 0.1 mL 과도하게 충전하고, 그 후 바늘을 제거하며 새 바늘로 교체하고, 적절한 용량에 도달 할 때까지 부드럽게 배출시킨다.

실시예 4:

IL-12는 이 실시예에서 입증되 바와 같이 체내에서 본질적으로 생성되지 않는다. 110명의 피험자를 시험하였고, 정량 하한(LLOQ:Lower Limit of Quantification) 위의 IL-12 수준은 발견되지 않았다.

IL -12 및 IFN -γ 베이스라인 수준: 도 35a 및 35b에서 제시된 박스 및 위스커 플롯은 베이스라인 값의 5-95 백분위 수를 커버하는 위스커를 갖는 110 명의 피험자의 IL-12 및 IFN-γ 베이스 라인 수준을 기술한다. IL-12 베이스라인 수준은 키트 표준 곡선을 사용하여 정의하였다. 도 35a에서 나타낸 바와 같이, 110명의 피험자에 대한 모든 예비 용량 IL-12 수준은 정량 한계(BLQ)(LLOQ= 0.367 pg/ml) 아래이었다. 거의 모든 IFN-γ 수준은 LLOQ(LLOQ = 1.08 pg/ml) 초과로 정량할 수 있었고, 대부분은 낮은 pg/ml 범위이었다. 피험자 1033 및 1055를 포함하는 5개의 상한 이상치는 IFN-γ> 23 pg/ml의 베이스라인 수준을 나타내었다.

본 발명은 특정 실시양태를 참조하여 개시하고 있지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 실시양태 및 변형이 당업자에 의해 고안될 수 있음은 명백한 것이다. 첨부된 청구 범위는 이러한 모든 실시양태 및 등가의 변형을 포함한다.

* * *

본원에서 참조되거나 언급된 모든 특허, 간행물, 과학 논문, 웹 사이트 및 기타 문서 및 자료는 당업자의 기술 수준을 나타내며, 각각의 이러한 참조 문서 및 자료는 그의 전체가 전체적으로 개별적으로 참조로 또는 본원에서 설명에 의해 통합되는 것처럼 동일한 정도로 참조하여 본원에 통합된다. 출원인은 임의의 이러한 특허, 간행물, 과학 논문, 웹 사이트, 전자적으로 이용 가능한 정보 및 기타 참조 자료 또는 문서로부터의 임의의 및 모든 자료 및 정보를 이 명세서에 실제로 포함시킬 권리를 보유한다.

본원에서 기술된 특정 방법 및 조성물은 대표적인 바람직한 실시양태이며 예시적인 것이고 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 다른 목적, 양상 및 실시양태는 본 명세서를 고려할 때 당업자에게 주어질 것이며 청구 범위의 범주에 의해 정의된 본 발명의 사상 내에 포함된다. 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 본원에서 개시된 발명에 대해 다양한 치환 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 본원에서 예시적으로 기술된 본 발명은 본질적으로 본원에서 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 또는 제한 또는 제한들의 부재시에 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에서의 각각의 예에서, 본 발명의 실시양태 또는 실시예에서, 임의의 용어 "포함하는", "필수적으로 구성된" 및 "구성된"은 명세서에서 다른 두 용어 중의 하나로 대체될 수 있다. 또한, 용어 "포함하는", "함유하는", 등은 제한 없이 광범위하게 판독되어야 한다. 본원에서 예시적으로 기술된 방법 및 공정은 상이한 단계의 순서로 실시될 수 있으며, 본원 또는 청구 범위에서 표시된 단계의 순서로 반드시 제한될 필요는 없다. 또한 본원 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 바의, 단수 형태는 문맥상 명백히 다르게 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 어떠한 경우에도 특허는 본원에서 구체적으로 개시된 특정 실시예 또는 실시양태 또는 방법으로 제한되는 것으로 해석될 수 없다. 진술이 구체적이지 않으며 출원인에 의한 답변서 작성에서 명확하게 명시하고 자격을 부여하지 않는다면 어떠한 경우에도 심사관 또는 특허청(Patent and Trademark Office)의 모든 다른 공무원 또는 직원이 작성한 모든 진술에 의해 특허가 제한되는 것으로 해석될 수 없다.

사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로서 사용된 것이며 제한하는 것은 아니고, 나타내고 기술된 특징 또는 그의 일부분의 등가물을 배제하는 이러한 용어 및 표현을 사용하고자 하는 것은 아니지만, 청구된 바와 같이 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것은 이해할 것이다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태 및 선택적 특징들에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에서 개시된 개념의 변형 및 변화가 당업자에 의해 가능할 수 있고, 이러한 변형 및 변화가 첨부된 청구 범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주 됨을 이해할 것이다.

본 발명은 본원에서 광범위하고 일반적으로 기술되어 있다. 일반적인 개시 내용에 속하는 각각의 더 좁은 종 및 하위 부류의 군도 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이것은 절제된 물질이 본원에서 구체적으로 인용되는지의 여부에 관계없이 부류로부터 임의의 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 갖는 본 발명의 일반적인 기술을 포함한다.

다른 실시양태는 하기의 청구범위 내에 있다. 또한, 본 발명의 특징 또는 양상이 마커시 군으로 기술되는 경우, 당업자는 본 발명이 또한 이에 의해 마커시 군의 임의의 개별 구성원 또는 하위군의 구성원의 관점에서 기술된다는 것을 인식할 것이다.

Claims (24)

1. (a) 내인성 IL-12 발현의 억제를 초래하는 질환 또는 상처를 앓고 있는, 필요로 하는 피험자를 확인하는 단계; 및
   (b) 피험자에게 하나 이상의 생리학적 용량의 외인성 IL-12를 투여하는 단계
   를 포함하는, 대체 면역요법으로서 IL-12를 투여하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 생리학적 용량의 외인성 IL-12의 투여 전에, 필요로 하는 피험자가 약 5 pg/ml 미만의 IL-12 발현 수준을 갖는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 피험자가 약 3 pg/ml 미만 또는 약 1 pg/ml 미만의 IL-12 발현 수준을 갖는 것인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 IL-12의 생리학적 용량은 IL-12 p70에 대한 표준 ELISA에 의해 측정시 약 1 피코그램/ml 초과 및 약 200 피코그램/ml 미만인 피험자의 말초 혈액에서의 NM-IL-12의 범위를 생성하는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서,
   (a) 피험자의 말초 혈액에서의 IL-12의 측정 가능한 수준은 또한 말초 혈액에서의 IFN-γ의 증가를 나타내고/내거나;
   (b) 피험자의 말초 혈액에서의 IL-12의 측정 가능한 수준은 또한 말초 혈액에서의 IFN-γ의 증가를 나타내며, 여기서 IL-12 투약 후 IFN-γ의 수반되는 수준은 약 20 pg/ml 내지 약 1000 pg/ml의 범위인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 IL-12의 생리학적 용량이 약 1 ㎍ 초과 및 약 20 ㎍ 미만인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 IL-12의 생리학적 용량이 약 8 ㎍ 초과 및 최대 약 15 ㎍인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 IL-12의 생리학적 용량이 약 10 ㎍ 초과 및 최대 약 12 ㎍인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 상처의 치료 과정 동안, 피험자에게 IL-12의 2가지 생리학적 용량 수준, 즉 IL-12의 하나 이상의 치료 용량 및 IL-12의 하나 이상의 유지 용량이 제공되는 것인 방법.
10. 제9항에 있어서,
    (a) IL-12의 치료 용량이 약 1 ㎍ 초과 및 약 20 ㎍ 미만이며;
    (b) IL-12의 유지 용량이 약 1 ㎍ 초과 및 약 10 ㎍ 미만인 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    (a) IL-12의 치료 용량이 약 2주마다, 약 3주마다 또는 약 4주마다 제공되고/되거나;
    (b) IL-12의 유지 용량이 약 1개월마다, 약 2개월마다 또는 약 3개월마다 제공되는 것인 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) IL-12의 하나 이상의 생리학적 용량이 임의의 약학적으로 허용가능한 수단으로 투여되고/되거나;
    (b) IL-12의 하나 이상의 생리학적 용량이 국소, 피하, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 경막 외 또는 비경구로 투여되는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12가 rHuIL-12인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 내인성 IL-12 발현의 억제는 항원 제시 세포 및 수지상 세포를 포함한 핵심 면역 세포의 억제를 초래하고/하거나;
    (b) 외인성 IL-12의 투여는, 피험자의 필요에 기초하여, 내인성 IL-12 발현과 상관되는 다면발현성 수복(pleiotropic reparative), 항감염 및 항종양 반응을 포함한 내인성 IL-12 다면발현성 면역 및 조혈 효과를 복원하고/하거나;
    (c) 이 방법은 질환 및/또는 상처를 가진 피험자에게 개선된 성과를 유도하는 것인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자가 만성 신장 질환(CKD)을 가지며, 외인성 IL-12의 투여가 신장의 복구 및 재생을 유도하여, CKD의 진행을 둔화시키는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서,
    (a) CKD의 진행이 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 둔화되고/되거나;
    (b) CKD의 진행의 둔화는 피험자에서의 크레아티닌 감소, 혈중 요소 질소(BUN) 감소, 알부민뇨 감소 또는 사구체 여과율(GFR) 증가 중 하나 이상에 의해 입증되고/되거나;
    (c) 외인성 IL-12의 투여는 CKD에 대한 종래의 치료와 조합하여 이용되는 것인 방법.
17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자가 상처를 가지며, 외인성 IL-12의 투여는 조직으로의 세포의 이동을 용이하게 하여 상처 치유 및 조직 복구를 돕고 이에 따라 상처의 치유를 가속화시키는 것인 방법.
18. 제17항에 있어서,
    (a) 피험자가 노령자이고/이거나;
    (b) 피험자가 당뇨병 환자이고/이거나;
    (c) 피험자가 노령자이며 욕창을 갖고/갖거나;
    (d) 피험자가 당뇨병 환자이며 족부 궤양을 갖고/갖거나;
    (e) 상처가 외과적 상처인 방법.
19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    (a) 외인성 IL-12의 투여는 외인성 IL-12 투여의 부재 하에 관찰되는 치유 속도와 비교시 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 상처 치유를 가속화시키고/시키거나;
    (b) 외인성 IL-12의 투여는 상처에 대한 종래의 치료와 조합하여 이용되는 것인 방법.
20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자가 연령 관련 황반 변성(AMD)을 가지며, 외인성 IL-12의 투여는 AMD 진행의 둔화 또는 역전을 유도하는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서,
    (a) AMD의 진행은 (i) IL-12가 다중 혈관형성 인자에 대해 광범위한 항 혈관형성 효과를 갖기 때문에 혈관신생을 감소시키고/시키거나; (ii) 노화 대식세포의 보충에 의한 면역 균형을 복원하는 IL-12의 효과에 의해 둔화 또는 역전되고/되거나;
    (b) 외인성 IL-12의 투여는 외인성 IL-12 투여의 부재 하에 관찰되는 것과 비교시 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% AMD 진행의 둔화 또는 역전을 유도하고/하거나;
    (c) 외인성 IL-12의 투여는 AMD에 대한 종래의 치료와 조합하여 이용되는 것인 방법.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    (a) 피험자에게 안구 내 이외의 임의의 경로를 통해 IL-12를 투여하거나;
    (b) 피험자에게 피하 주사를 통해 IL-12를 투여하거나; 또는
    (c) 피험자에게 안구 내 주사를 통해 IL-12를 투여하는 것인 방법.
23. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자가 골다공증을 앓고 있고, 외인성 IL-12의 투여는 조혈 줄기세포가 골수 내의 세포를 재생 및 이동시키도록 유발시키는 것인 방법.
24. 제23항에 있어서,
    (a) 외인성 IL-12의 투여는 골 손실의 감소를 유도하고/하거나;
    (b) 외인성 IL-12의 투여는 파골세포 형성의 감소를 유도하고/하거나;
    (c) 외인성 IL-12의 투여는 외인성 IL-12 투여의 부재 하에 관찰되는 것과 비교시 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 골 손실의 감소 및/또는 파골세포 형성의 감소를 유도하고/하거나;
    (d) 외인성 IL-12의 투여는 골다공증에 대한 종래의 치료와 조합하여 이용되는 것인 방법.

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