CN116406426A - 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途，涉及一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含使所述TIL的一种或多种目标基因，例如白介素‑12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。还涉及使用肿瘤浸润淋巴细胞预防和/或治疗肿瘤的方法。
Description
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途。
使用过继性自体转移肿瘤浸润淋巴细胞治疗肿瘤是一种治疗预后不良患者的有效方法。但是过继性自体转移肿瘤浸润淋巴细胞治疗肿瘤需要大量的肿瘤浸润淋巴细胞，而且目前来自患者肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞的扩增能力弱，杀伤靶细胞的能力不强。
因此如何提供一种稳健可靠的肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法是亟待解决的问题。
发明内容
本申请提供了一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途，具体提供一种稳健可靠的肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法，所述培养方法可以具有选自以下组的一种或多种的效果：使TIL细胞的数量改善，使TIL细胞的分泌能力提高，使TIL细胞的杀伤能力提高，使NK细胞比例增加，改变TIL细胞的比例，使CD4
+细胞的比例增加，使CD8
+细胞的比例降低，使中心记忆T细胞比例增加，使调节性T细胞的比例降低，使活化T细胞比例增加，使肿瘤特异性T细胞比例增加，和使干细胞样T细胞比例增加。
一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，所述方法包含：使所述TIL与所述饲养细胞共培养之后，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
在一种实施方式中，所述方法包含：使所述TIL与所述饲养细胞共培养之前，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
在一种实施方式中，所述方法包含：在所述TIL与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触之后且在所述TIL与所述饲养细胞共培养之前使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
在一种实施方式中，所述方法包含：在所述TIL与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触基本上同时使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增 强。
在一种实施方式中，所述方法包含：在所述TIL与所述饲养细胞共培养基本上同时使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
在另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中所述TIL包含与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养获得的TIL。
在另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中所述TIL包含使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
在一种实施方式中，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
在一种实施方式中，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
在一种实施方式中，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
在一种实施方式中，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
在一种实施方式中，其中编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
在一种实施方式中，其中所述载体包含病毒载体。
在一种实施方式中，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
在一种实施方式中，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含膜锚定的IL-12和/或分泌的 IL-12。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p40结构域。
在一种实施方式中，所述p40结构域包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p35结构域。
在一种实施方式中，所述p35结构域包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述p40结构域与所述p35结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述间接连接包含通过连接子连接。
在一种实施方式中，所述连接子包含选自以下组所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：43-49、(SEQ ID NO：50)
l、(SEQ ID NO：51)
m、(SEQ ID NO：52)
n、(SEQ ID NO：53)
p、和(SEQ ID NO：54)
q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含信号肽结构域。
在一种实施方式中，所述信号肽结构域包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述信号肽结构域与所述p40结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含跨膜结构域。
在一种实施方式中，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域包含如SEQ ID NO：56-61和66-70中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域与所述信号肽结构域和/或所述p35结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含胞内结构域。
在一种实施方式中，所述胞内结构域包含如SEQ ID NO：62-65中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述胞内结构域与所述跨膜结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12的所述功能活性片段包含如SEQ ID NO：42和/或55所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12包含如SEQ ID NO：34-40中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段的表达提高包含所述IL-12和/或其功能活性片段的合成和/或分泌提高。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相 比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
在一种实施方式中，所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
在一种实施方式中，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，所述第一阶段体外扩增进行至少约7天。
在一种实施方式中，所述第一阶段体外扩增进行约7天至约14天。
在一种实施方式中，所述第二阶段体外扩增进行至少约7天。
在一种实施方式中，所述第二阶段体外扩增进行约7天至约14天。
在一种实施方式中，使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树 突状细胞和人工抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种：分化簇80(CD80)、CD86、CD276、4-1BB配体(4-1BBL)、CD27、CD30、CD134、CD275、CD40、CD258、以及它们的功能活性片段。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、疱疹病毒进入介质(HVEM)、CD40L、OX40和4-1BB。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含CD28激动剂。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，所述使TIL与所述T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；和(3)将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约30ng/mL。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约30ng/mL-约300ng/mL。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
在一种实施方式中，所述固相介质包含聚合物。
在一种实施方式中，每mg所述固相介质中包含的每一种所述T细胞激活剂的量各自独立地至少为约25μg。
在一种实施方式中，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，使所述TIL基本上同时与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
在一种实施方式中，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
在一种实施方式中，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
在一种实施方式中，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
在另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在一种实施方式中，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
在一种实施方式中，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
在一种实施方式中，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
在一种实施方式中，所述步骤(B)进行约7天至约14天。
在另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
使所述第三TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群。
在另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
(B)使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群。
在一种实施方式中，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
在一种实施方式中，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
在一种实施方式中，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
在一种实施方式中，所述步骤(B)进行约0天至约8天。
在一种实施方式中，所述步骤(C)进行约5天至约14天。
在另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群；
(D)使所述第四TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(D)得到第五TIL群。
在另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
使所述第三TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群；
使所述第四TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(D)得到第五TIL群。
在一种实施方式中，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
在一种实施方式中，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
在一种实施方式中，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
在一种实施方式中，所述步骤(B)进行约0天至约4天。
在一种实施方式中，所述步骤(C)进行约0天至约4天。
在一种实施方式中，所述步骤(D)进行约5天至约14天。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
在一种实施方式中，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
在一种实施方式中，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
在一种实施方式中，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
在一种实施方式中，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
在一种实施方式中，其中编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
在一种实施方式中，其中所述载体包含病毒载体。
在一种实施方式中，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
在一种实施方式中，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含膜锚定的IL-12和/或分泌的IL-12。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p40结构域。
在一种实施方式中，所述p40结构域包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p35结构域。
在一种实施方式中，所述p35结构域包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述p40结构域与所述p35结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述间接连接包含通过连接子连接。
在一种实施方式中，所述连接子包含选自以下组所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：43-49、(SEQ ID NO：50)
l、(SEQ ID NO：51)
m、(SEQ ID NO：52)
n、(SEQ ID NO：53)
p、和(SEQ ID NO：54)
q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含信号肽结构域。
在一种实施方式中，所述信号肽结构域包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述信号肽结构域与所述p40结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含跨膜结构域。
在一种实施方式中，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域包含如SEQ ID NO：56-61和66-70中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域与所述信号肽结构域和/或所述p35结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含胞内结构域。
在一种实施方式中，所述胞内结构域包含如SEQ ID NO：62-65中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述胞内结构域与所述跨膜结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12的所述功能活性片段包含如SEQ ID NO：42和/或55所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12包含如SEQ ID NO：34-40中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段的表达提高包含所述IL-12和/或其 功能活性片段的合成和/或分泌提高。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
在一种实施方式中，所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种：分化簇80(CD80)、CD86、CD276、4-1BB配体(4-1BBL)、CD27、CD30、CD134、CD275、 CD40、CD258、以及它们的功能活性片段。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、疱疹病毒进入介质(HVEM)、CD40L、OX40和4-1BB。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含CD28激动剂。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，所述使TIL与所述T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；和(3)将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约30ng/mL。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约30ng/mL-约300ng/mL。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
在一种实施方式中，所述固相介质包含聚合物。
在一种实施方式中，每mg所述固相介质中包含的每一种所述T细胞激活剂的量各自独立地至少为约25μg。
在一种实施方式中，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，使所述TIL基本上同时与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL- 12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
在一种实施方式中，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
在一种实施方式中，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
在一种实施方式中，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触。
在一种实施方式中，所述方法包含：使所述TIL与CD28激动剂接触之后，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
在一种实施方式中，所述方法包含：使所述TIL与CD28激动剂接触之前，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中所述TIL包含与CD28激动剂接触获得的TIL。
一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL与CD28激动剂接触，其中所述TIL包含使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
在一种实施方式中，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
在一种实施方式中，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤 特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
在一种实施方式中，与在体外扩增阶段未曾与所述CD28激动剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与所述CD28激动剂接触过的所述TIL显示出改善的基因编辑效果。
在一种实施方式中，所述改善的基因编辑效果包含提高的基因敲除效率。
在一种实施方式中，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
在一种实施方式中，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
在一种实施方式中，其中编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
在一种实施方式中，其中所述载体包含病毒载体。
在一种实施方式中，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
在一种实施方式中，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含膜锚定的IL-12和/或分泌的IL-12。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p40结构域。
在一种实施方式中，所述p40结构域包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p35结构域。
在一种实施方式中，所述p35结构域包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述p40结构域与所述p35结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述间接连接包含通过连接子连接。
在一种实施方式中，所述连接子包含选自以下组所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：43-49、(SEQ ID NO：50)
l、(SEQ ID NO：51)
m、(SEQ ID NO：52)
n、(SEQ ID NO：53)
p、和(SEQ ID NO：54)
q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含信号肽结构域。
在一种实施方式中，所述信号肽结构域包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述信号肽结构域与所述p40结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含跨膜结构域。
在一种实施方式中，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域包含如SEQ ID NO：56-61和66-70中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域与所述信号肽结构域和/或所述p35结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含胞内结构域。
在一种实施方式中，所述胞内结构域包含如SEQ ID NO：62-65中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述胞内结构域与所述跨膜结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12的所述功能活性片段包含如SEQ ID NO：42和/或55所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12包含如SEQ ID NO：34-40中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段的表达提高包含所述IL-12和/或其功能活性片段的合成和/或分泌提高。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
在一种实施方式中，所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
在一种实施方式中，其中，使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与CD28激动剂接触。
在一种实施方式中，其中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使经所述第一阶段体外扩增的TIL与所述CD28激动剂接触。
在一种实施方式中，所述第一阶段体外扩增进行至少约7天。
在一种实施方式中，所述第一阶段体外扩增进行约7天至约14天。
在一种实施方式中，所述第二阶段体外扩增进行至少约7天。
在一种实施方式中，所述第二阶段体外扩增进行约7天至约14天。
在一种实施方式中，所述CD28激动剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段、和/或CD86和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述CD28激动剂之外的其它T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，所述其它T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。
在一种实施方式中，所述其它T细胞激活剂包含CD3激动剂。
在一种实施方式中，所述其它T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，所述使TIL与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；(3)将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少约30ng/mL。
在一种实施方式中，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为约30ng/mL-约300ng/mL。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
在一种实施方式中，所述固相介质包含聚合物。
在一种实施方式中，每mg所述固相介质包含至少约25μg的所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂。
在一种实施方式中，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL在与CD28激动剂接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与CD28激动剂接触且使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述CD28激动剂以及所述T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及所述T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
在一种实施方式中，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
在一种实施方式中，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
在一种实施方式中，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
在另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经 所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在一种实施方式中，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
在一种实施方式中，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
在一种实施方式中，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
在一种实施方式中，所述步骤(B)进行约7天至约14天。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
在一种实施方式中，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
在一种实施方式中，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
在一种实施方式中，与在体外扩增阶段未曾与所述CD28激动剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与所述CD28激动剂接触过的所述TIL显示出改善的基因编辑效果。
在一种实施方式中，所述改善的基因编辑效果包含提高的基因敲除效率。
在一种实施方式中，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
在一种实施方式中，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/ 或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
在一种实施方式中，其中编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
在一种实施方式中，其中所述载体包含病毒载体。
在一种实施方式中，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
在一种实施方式中，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含膜锚定的IL-12和/或分泌的IL-12。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p40结构域。
在一种实施方式中，所述p40结构域包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p35结构域。
在一种实施方式中，所述p35结构域包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述p40结构域与所述p35结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述间接连接包含通过连接子连接。
在一种实施方式中，所述连接子包含选自以下组所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：43-49、(SEQ ID NO：50)
l、(SEQ ID NO：51)
m、(SEQ ID NO：52)
n、(SEQ ID NO：53)
p、和(SEQ ID NO：54)
q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含信号肽结构域。
在一种实施方式中，所述信号肽结构域包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述信号肽结构域与所述p40结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含跨膜结构域。
在一种实施方式中，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域包含如SEQ ID NO：56-61和66-70中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域与所述信号肽结构域和/或所述p35结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段包含胞内结构域。
在一种实施方式中，所述胞内结构域包含如SEQ ID NO：62-65中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述胞内结构域与所述跨膜结构域直接或间接连接。
在一种实施方式中，所述IL-12的所述功能活性片段包含如SEQ ID NO：42和/或55所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12包含如SEQ ID NO：34-40中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述IL-12和/或其功能活性片段的表达提高包含所述IL-12和/或其功能活性片段的合成和/或分泌提高。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
在一种实施方式中，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
在一种实施方式中，所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
在一种实施方式中，所述CD28激动剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段、和/或CD86和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，所述其它T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。
在一种实施方式中，所述其它T细胞激活剂包含CD3激动剂。
在一种实施方式中，所述其它T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，所述使TIL与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；(3)将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少约30ng/mL。
在一种实施方式中，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为 约30ng/mL-约300ng/mL。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
在一种实施方式中，所述固相介质包含聚合物。
在一种实施方式中，每mg所述固相介质包含至少约25μg的所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂。
在一种实施方式中，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及所述T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
在一种实施方式中，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
在一种实施方式中，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
在一种实施方式中，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
在另一方面，本申请还提供一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述TIL经过本申请的方法获得。
在另一方面，本申请还提供一种组合物，其包含本申请的TIL。
在另一方面，本申请还提供一种药物组合物，其包含本申请的TIL和/或本申请的组合物，以及任选地药学上可接受的载体。
在另一方面，本申请还提供一种影响肿瘤细胞生长的方法，包含向受试者施用本申请的TIL、本申请的组合物和/或本申请的药物组合物。
在另一方面，本申请还提供本申请的TIL、本申请的组合物和/或本申请的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
根据本申请的应用，其中，所述肿瘤为实体瘤。
根据本申请的应用，其中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是，对于来源于供者A的TIL细胞，各组中CD4
+细胞的IL-12转导效率。
图2显示的是，对于来源于供者A的TIL细胞，各组中CD8
+细胞的IL-12转导效率。
图3显示的是，对于来源于供者B的TIL细胞，各组TIL细胞的标准化扩增率。
图4显示的是，对于来源于供者C的TIL细胞，各组TIL细胞的增殖能力。
图5、图6、图7和图8分别显示的是，对于来源于供者D的TIL细胞，各组TIL细胞在CD3抗体刺激后的细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-10分别的分泌情况。
图9、图10、图11和图12分别显示的是，对于来源于供者E的TIL细胞，各组TIL细胞在transACT刺激后的细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α和IL-10分别的分泌情况。
图13、图14、图15、图16和图17分别显示的是，对于来源于供者F的TIL细胞，各组TIL细胞的细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10分别的分泌情况。
图18、图19和图20分别显示的是，对于来源于供者G的TIL细胞撤去IL-2进行培养，各组TIL细胞的细胞因子IFN-γ、IL-6和IL-10分别的分泌情况。
图21显示的是，对于来源于供者H的TIL细胞，以效靶比0.3:1与肿瘤细胞共培养的杀伤能力检测结果。
图22显示的是，对于来源于供者H的TIL细胞，以效靶比1:1与肿瘤细胞共培养的杀伤能力检测结果。
图23显示的是，以效靶比1:1或1:3与肿瘤细胞共培养的来源于供者H的TIL细胞的细胞因子IL-2分泌情况结果。
图24显示的是，以效靶比1:1或1:3与肿瘤细胞共培养的来源于供者H的TIL细胞的细胞因子IL-6分泌情况结果。
图25显示的是，以效靶比1:1或1:3与肿瘤细胞共培养的来源于供者H的TIL细胞的细胞因子IFN-γ分泌情况结果。
图26显示的是，以效靶比1:1或1:3与肿瘤细胞共培养的来源于供者H的TIL细胞的细胞因子IL-10分泌情况结果。
图27显示的是，以效靶比1:1或1:3与肿瘤细胞共培养的来源于供者H的TIL细胞的细胞因子TNF-α分泌情况结果。
图28显示的是，对于来源于供者I的TIL细胞，转导后的第8天的CD8
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性。
图29显示的是，对于来源于供者I的TIL细胞，转导后的第26天的CD8
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性。
图30显示的是，对于来源于供者I的TIL细胞，转导后的第8天的CD4
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性。
图31显示的是，对于来源于供者I的TIL细胞，转导后的第26天的CD4
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性。
图32，图33，图34，图35和图36分别显示的是，注射TIL细胞后第6天和第21天各个组织和/或肿瘤中T细胞的数量。
图37显示的是，饲养细胞不同添加时间培养的TIL的增殖能力分析结果。
图38和图39显示的是，加入OKT3和IL-2后0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD45RA
-CCR7
+中心记忆T细胞(Tcm)比例。
图40显示的是，加入OKT3和IL-2后0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD4
+CD25
+Foxp3
+调节性T细胞(Treg)比例。
图41和图42显示的是，加入OKT3和IL-2后0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞比例。
图43显示的是，加入OKT3和IL-2后0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD103
+CD39
+肿瘤特异性T细胞比例。
图44显示的是，加入OKT3和IL-2后0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的TCF1
+干细胞样T细胞比例。
图45显示的是，添加不同形式的CD28激动剂的试验组以及对照组的增殖能力分析结果。
图46和图47分别显示的是，对于不同供者来源的TIL，混合抗体组与对照组培养所得的TIL细胞的T细胞亚群比例。
图48和图49分别显示的是，对于不同供者来源的TIL，磁珠组与对照组培养所得的TIL细胞的T细胞亚群比例。
图50显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞的T细胞亚群比例。
图51显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞的细胞杀伤能力。
图52显示的是，混合抗体组与对照组培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。
图53、图54、图55和图56分别显示的是，对于不同供者来源的TIL，磁珠组与对照组培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。
图57显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。
图58显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞的细胞因子分泌检测结果。
图59显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞与肿瘤细胞共同孵育后的细胞因子分泌检测结果。
图60和图61分别显示的是，对于不同供者来源的TIL，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞的基因敲除效率结果。
图62、图63和图64分别显示的是，对于不同供者来源的TIL，在终末刺激阶段中，以不同方式进行体外扩增的试验组的增殖能力分析结果。
图65显示的是，转导IL-12的TIL细胞可以显示出更强的连续杀伤能力。
图66显示的是，转导IL-12的TIL细胞可以显示出更强的肿瘤体积抑制能力。
图67显示的是，转导IL-12的TIL细胞可以显示出更高和更为持久的IFN-γ分泌能力。
图68显示的是，各组TIL细胞的扩增后的荧光量。
图69显示的是，基因转导c-Jun(例如转导编码SEQ ID NO：71所述的核酸片段)后的TIL细胞以效靶比3:1与肿瘤细胞共培养的杀伤能力检测结果。
图70显示的是，各组TIL细胞的细胞因子分泌检测结果。结果表明，本申请的基因转导c-Jun的TIL细胞可以具有更高的细胞因子分泌能力。
图71显示的是，各组TIL细胞的扩增后的荧光量。
图72A显示的是，基因转导(例如转导SEQ ID NO：74所述的核酸片段)后的TIL细胞以效靶比1:1与肿瘤细胞共培养的杀伤能力检测结果。图72B显示的是，基因转导(例如转导SEQ ID NO：75所述的核酸片段)后的TIL细胞以效靶比3:1与肿瘤细胞共培养的杀伤能力检测结果。
图73显示的是，各组TIL细胞的细胞因子分泌检测结果。
图74A显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞增殖能力结果图。
图74B显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD45RA
-CCR7
+中心记忆T细胞(Tcm)比例结果图。
图74C显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的TCF1
+干细胞样T细胞比例。
图74D显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD4
+CD25
+Foxp3
+调节性T细胞(Treg)比例。
图74E显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(PD-1
+)比例。
图74F显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD103
+CD39
+肿瘤特异性T细胞比例。
图74G显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(CD28
+)比例。
图74H显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(41BB
+)比例。
图74I显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(CD25
+)比例。
图74J显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。
图74K显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞因子分泌检测结果。
图74L显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞增殖能力结果图。
图74M显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD8
+T细胞比例。
图74N显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD45RO
+CD62L
+T细胞比例。
图74O显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的NK T细胞比例。
图74P显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD4
+CD25
+Foxp3
+调节性T细胞(Treg)比例。
图74Q显示的是加入OKT3和IL-2的48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞杀伤能力结果。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“白介素”或“白细胞介素”通常是指一种细胞因子。例如，白介素可以激活与调节免疫细胞，介导T细胞、B细胞活化、增殖或分化，以及可以在炎症反应中起重要作用。本申请中，白介素可以涵盖未加工的白介素、任何形式加工的白介素、白介素的变体或包含白介素的功能活性片段的物质。
在本申请中，术语“白介素-12”或“IL-12”通常是指细胞因子的一种。例如，IL-12可以见于GenBank登记号P29459或P29460。本申请的IL-12蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含IL-12的功能活性片段的物质。例如，本申请的IL-12可以包含IL-12的功能活性片段以及其它任意的结构域。
在本申请中，术语“p40结构域”通常是指IL-12的功能活性片段的部分结构域。例如，本申请的p40结构域可以涵盖IL-12的分子量约为40kDa的部分，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含p40结构域的功能活性片段的物质。例如，p40结构域也可以称为IL-12β亚单位或IL-12B，例如，p40结构域可以见于GenBank登记号P29460。例如，本申请包含p40结构域的物质可以具有IL-12调节免疫细胞的功能。例如，本申请p40结构域可以与p35结构域一同组成IL-12或其片段，也可以单独组成IL-12或其片段。
在本申请中，术语“p35结构域”通常是指一种IL-12的功能活性片段的部分结构域。例如，本申请的p35结构域可以涵盖IL-12的分子量约为35kDa的部分，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含p35的功能活性片段的物质。例如，p35结构域也可以称为IL-12α亚单位或IL-12A，例如，p35结构域可以见于GenBank登记号P29459。例如，本申请包含p35结构域的物质可以具有IL-12调节免疫细胞的功能。例如，本申请p35结构域可以与p40结构域一同组成IL-12或其片段，也可以单独组成IL-12或其片段。
在本申请中，术语“跨膜结构域”通常是指跨膜结构域横跨细胞膜的部分。例如，位于细胞膜中的部分，例如可以是各种多肽的跨膜区。跨膜结构域的片段可以包含野生型跨膜结构域的功能活性片段、截短体和/或突变变体。例如，本申请跨膜结构域可以具有使包含跨膜结构域的物质结合于细胞膜的功能。
在本申请中，术语“胞内结构域”通常是指位于细胞膜内侧的胞内部分。例如，本申请的胞内结构域可以包含野生型胞内结构域的功能活性片段、截短体和/或突变变体。例如，本申请的胞内结构域可以不具有任何胞内信号传递功能或可以具有任意胞内信号传递功能。例如，本申请的胞内结构域可以具有使得、维持和/或促进整体结构稳定性的作用。
在本申请中，术语“跨膜胞内结构域”通常是指包含跨膜结构域与胞内结构域的部分。
在本申请中，术语“信号肽结构域”通常是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链。例如，本申请的信号肽结构域可以包含野生型信号肽结构域的功能活性片段、截短体和/或突变变体。例如，本申请的信号肽结构域可以具有引导包含信号肽结构域的物质跨膜转移的功能。例如，本申请的信号肽结构域可以与信号肽结合物质结合，使得包含信号肽结构域的物质的全部或部分转移到细胞膜外侧的胞外区域。
在本申请中，术语“c-Jun”通常是指一种转录因子。例如，c-Jun可以具有调节基因表达的功能。例如，本申请的c-Jun可以提高细胞的和/或细胞杀伤活性。例如，本申请的c-Jun可以在细胞和组织的生长、发育、分化中起关键作用。例如，c-Jun的NCBI Gene登录号可以是3725。本申请中，c-Jun可以涵盖未加工的c-Jun、任何形式加工的c-Jun、c-Jun的变体或包含c-Jun的片段的物质。
在本申请中，术语“微小RNA”通常是指一种小的非编码RNA分子。例如，微小RNA可以具有调节基因表达的功能。例如，本申请的微小RNA可以提高细胞的增殖能力和/或细胞杀伤活性。例如，本申请的miR155可以在细胞和组织的生长、发育、分化中起关键作用。例如，miR155的NCBI Gene登录号可以是406947。本申请中，miR155可以涵盖未加工的miR155、任何形式加工的miR155、miR155的变体或包含miR155的片段的物质。
在本申请中，术语“CD80”通常是指一种细胞刺激分子。例如，CD80可以是CD28的配体。例如，CD80可以见于GenBank登记号P33681。本申请的CD80蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含CD80的功能活性片段的物质。例如，本申请的CD80可以包含CD80的功能活性片段以及其它任意的结构域。
在本申请中，术语“CD86”通常是指一种细胞刺激分子。例如，CD86可以是CD28的配体。例如，CD86可以见于GenBank登记号P42081。本申请的CD86蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含CD86的功能活性片段的物质。例如，本申请的CD86可以包含CD86的功能活性片段以及其它任意的结构域。
在本申请中，术语“膜锚定”通常是指一种物质可以以定位于细胞膜的形式存在。例如，膜锚定的物质可以是指该物质可以分布在细胞膜上。例如，膜锚定的物质可以部分或全部镶 嵌在细胞膜中或内外两侧。例如，膜锚定的物质可以贯穿细胞膜，膜锚定的物质可以通过离子键、氢键或其它相互作用与细胞膜的成分相结合，膜锚定的物质也可以与其它物质相互作用，间接与膜结合。例如，可以通过细胞流式仪或其它检测细胞的方法检测一种物质是否是膜锚定的物质。例如，膜锚定的物质可以在一段时间内和/或以一定比例以膜锚定的形式存在。
在本申请中，术语“分泌”通常是指一种物质可以定位于细胞的胞外。例如，分泌的物质可以在细胞内合成之后，被运送到细胞的胞外空间。例如，可以通过酶联免疫吸附剂测定或其它检测方法检测一种物质是否是分泌的物质。
在本申请中，术语“病毒载体”通常是指可以用于递送核酸的病毒。例如，病毒载体可以用于感染靶细胞，将目标核酸递送到靶细胞内，可以使得靶细胞可以表达目标核酸编码的基因。例如，病毒载体可以是慢病毒载体。
在本申请中，术语“逆转录病毒载体”通常是指衍生自逆转录病毒基因组的至少一部分的载体。例如，逆转录病毒载体可以在逆转录酶的作用下将RNA转变成cDNA，在感染靶细胞后，可以在该靶细胞内表达包含在异源核酸序列内的一个或多个转基因。例如，可以在临床中可以使用逆转录病毒载体，也可以使用包括但不限于慢病毒载体。在本申请中，术语“慢病毒载体”通常是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体。例如，慢病毒包膜蛋白可以包含编码env蛋白或其部分的基因。例如，可以用转移载体和一个或多个包装载体对宿主细胞进行转染，以产生病毒，该病毒可以用于感染靶细胞来在该靶细胞内表达包含在异源核酸序列内的一个或多个转基因。
在本申请中，术语“引入”通常是指将核酸掺入真核或原核细胞中。例如，引入可以是指将异源或分离的核酸掺入真核或原核细胞中，其中该核酸可以掺入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转变为自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。例如，引入可以通过“感染”、“转染”、“转化”和“转导”等方法实现。例如，可采用各种方法将核酸引入原核细胞中，包括电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质介导、病毒载体转导的转染。
在本申请中，术语“表达提高”通常是指产物表达量的提高。例如，细胞合成该产物的量提高。例如，当该物质为分泌的物质时，细胞分泌该物质的量提高。例如，当该物质为膜锚定的物质时，细胞膜包含该物质的细胞比例提高，或者细胞膜包含的该物质的量提高。
在本申请中，术语“活性”通常是指物质的生物学功能。例如，细胞因子的活性可以是指对于细胞活化、增殖或分化的影响能力。
在本申请中，术语“T细胞受体”或“TCR”通常是指响应于抗原的呈递参与T细胞的活化的膜蛋白的复合体。TCR可以负责识别结合至主要组织相容性复合体分子的抗原。TCR可以由alpha(α)和beta(β)链的异二聚体组成，或由gamma和delta(γ/δ)链构成。TCR可以以α/β和γ/δ形式存在，其是结构上相似的，但是具有独特的解剖学位置和功能。例如，TCR可以是在表达TCR的任何细胞上被修饰的TCR。例如，TCR的种类可以通过TCR亚型分析试剂进行分析。
在本申请中，术语“克隆多样性”通常是指某种物质具有多种克隆型。例如，TCR的克隆多样性可以是指TCR可以具有不同序列结构和/或抗原识别能力。例如，TCR具有的多样性常用β链亚型来区分，可以包括Vβ 23、Vβ 7.2、Vβ 5.2、Vβ 11、Vβ 16、Vβ 3等，当一个T细胞群具有更多的β链亚型时，可以认为该T细胞群具有更高的克隆多样性。
在本申请中，“CD4
+细胞”通常是指CD4阳性的细胞，例如可以是T细胞。术语“CD4
+细胞”，“CD4阳性细胞”可以同义使用。这些细胞可通过本领域知道的方法来鉴定，例如通过用荧光标记的针对CD4的抗体对细胞染色和使用荧光激活细胞分选。例如，已有的数据可以证明，CD4
+细胞比例的提高可以使得细胞群分泌IFN-γ和/或TNF的能力提高，并可以提高T细胞群的促进肿瘤抑制的效果。例如，请见Tay,R.E.,Richardson,E.K.等人(2020).Cancer Gene Therapy,1-13.但是，本领域缺少一种提高CD4
+细胞比例的方法，本申请可以提供一种影响CD4
+细胞比例的方法。
在本申请中，“CD8
+细胞”通常是指CD8阳性的细胞，例如可以是T细胞。术语“CD8
+细胞”，“CD8阳性细胞”可以同义使用。这些细胞可通过本领域知道的方法来鉴定，例如通过用荧光标记的针对CD8的抗体对细胞染色和使用荧光激活细胞分选。
在本申请中，术语“IC
50值”或“IC50值”通常是指目标物获得生物学过程50％抑制需要的浓度。可以使用Cheng-Prusoff方程(Biochem.Pharmacol.(1973)22:3099)将IC50值换算成绝对抑制常数(Ki)。
在本申请中，术语“K
D值”或“KD值”通常是指解离常数，其可通过表面等离子体共振进行测定。通常，表面等离子体共振分析使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)，通过表面等离子体共振(SPR)，测量配体(固定化于生物传感器基质上的物质)和分析物(溶液中的物质)之间的实时结合相互作用。也可以通过固定化分析物(生物传感器基质上的物质)和呈递配体，进行表面等离子体分析。
在本申请中，术语“编码”通常是指能够根据基本上确定的规则，由一种分子的结构或组成信息，直接或间接推断出与其相关的另一类分子的结构或组成信息。例如，可以根据氨基 酸的序列推断出其核苷酸序列，例如根据脱氧核糖核酸转录互补核酸的特性，包括能翻译成多肽的核酸。例如，脱氧核糖核酸可编码从脱氧核糖核酸转录的RNA。脱氧核糖核酸可类似地编码从脱氧核糖核酸所转录的RNA翻译的多肽。
在本申请中，术语“小分子化合物”通常是指肽、肽模拟物、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000克/摩尔的有机或无机物(即包括异源有机物和有机金属化合物)、分子量小于约5,000克/摩尔的有机或无机物、分子量小于约1,000克/摩尔的有机或无机物、分子量小于约500克/摩尔的有机或无机物，以及这类药物的盐、酯和其它药学上可接受的形式。
在本申请中，术语“NK细胞”也称为“自然杀伤细胞”，通常是指一种细胞质中具有大颗粒的细胞。NK细胞由骨髓淋巴样干细胞发育而成，可以依赖于骨髓或胸腺微环境分化、发育。在本申请中，TIL细胞中的NK细胞的比例可以通过本申请的方法加以改变。
在本申请中，术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本申请的目的，术语“抗体”也包括抗体片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原结合功能(例如，特异性结合CD3)的其它抗体片段。通常，这样的片段应当包括抗原结合结构域。基本的4链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元与另外一个称为J链的多肽组成，且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包括2-5个可以与J链相结合聚合形成多价组合的基本4链单元。就IgG而言，4链单元一般为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个取决于H链同种型的二硫键相互连接。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫化桥键。每个H链在N末端具有可变结构域(VH)，对于α和γ链各自继之以三个恒定结构域(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH结构域。每个L链在N末端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对应，且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)相对应。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对一起形成单个抗原结合位点。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型中的一种，称为κ和λ。根据重链(CH)恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别或同种型。目前存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常指具有特异结合抗原(例如，CD3)能力的一个或多个多肽片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)
2、Fv片段、F(ab’)
2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在本申请中，术语“固相介质”或“介质”通常是指结合功能的固相材料。例如，本申请固相介质可以是指通过共价结合和/或非共价结合的作用，将一种或一种以上的物质结合在介质内和/或介质表面的材料。例如，本申请的固相介质可以是指通过共价结合和/或非共价结合的作用将CD28抗体或其抗原结合片段以及CD3抗体或其抗原结合片段结合在介质内和/或介质表面的材料。例如，本申请的固相介质可以是聚合物材料。
在本申请中，术语“表达”通常是指编码目标多肽的基因在细胞内发生的转录和/或翻译过程。可以通过测量存在于细胞中的相应mRNA的量来确定宿主细胞中编码目标多肽的基因的转录水平。例如，可通过PCR或通过RNA杂交对编码目标多肽的基因转录的mRNA进行定量测量。可以通过多种方法测量编码目标多肽的基因的翻译水平，例如通过ELISA，通过多肽生物活性测试，或通过蛋白质印迹或放射免疫测试法。在本申请中，术语“表达”通常也可以是指产物发生的转录和/或翻译过程。例如，细胞因子的表达可以是细胞转录和/或翻译该细胞因子的过程。例如，细胞因子的表达可以通过检测存在于细胞中的相应mRNA的量或检测通过细胞生产的该细胞因子的量，或两者进行确定。
在本申请中，术语“一个阶段的体外扩增”、“单个阶段的体外扩增”、或“第一阶段体外扩增”等中的“阶段”通常是指TIL在体外经过的一段扩增过程。例如，每一个阶段之间可以是通过TIL细胞数量的变化来划分的，例如，当TIL细胞的数量增加至少约1倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一些实施方式中，当TIL细胞的数量增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，每一个阶段之间也可以是通过TIL细胞培养的条件来划分的。例如，当细胞培养基中添加了或补充添加了T细胞激活剂和/或T细胞生长因子后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，当TIL细胞进行了离心和/或细胞洗涤后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，每一个阶段之间也可以是通过TIL细胞培养的天数来划分的。例如，当TIL细胞体外培养约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、 约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约30天、约40天、约50天或约100天后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。
在本申请中，术语“第一阶段体外扩增”通常是指从组织中获得初级TIL后，使用T细胞生长因子进行扩增的阶段。例如，本申请的组织可以选自以下组：肿瘤组织和胸腔积液，本申请的胸腔积液可以是有转移癌的患者的胸腔积液。例如，本申请的扩增可以是自体或者异体进行的体内扩增，或者可以是体外扩增。本申请的第一阶段体外扩增也可以称为preREP(快速扩增前)阶段。例如，源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL可以称为第一TIL群。例如，在两步骤法划分的本申请的培养方式中经过第一阶段体外扩增获得的TIL可以称为第二TIL群。
在本申请中，术语“第二阶段体外扩增”通常是指从受试者体内取出的组织并进行扩增后，再次进行扩增的阶段。例如，与经第一阶段体外扩增的TIL相比，本申请的经第二阶段体外扩增的TIL细胞数量增加，例如，可以增加至少约10倍(或至少约20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或者例如细胞的数量可以增加至少约100倍。例如，第二阶段体外扩增可以与第一阶段体外扩增的培养条件不同，例如加入的培养物质可以不同。例如，在两步骤法划分的本申请的培养方式中第二阶段体外扩增也可以称为REP(快速扩增)阶段。例如，在两步骤法划分的本申请的培养方式中经过第二阶段体外扩增获得的TIL可以称为第三TIL群。
在本申请中，术语“体内”通常是指发生在受试者体内的事件。
在本申请中，术语“体外”通常是指在受试者体外发生的事件。
在本申请中，术语“离体”通常是指涉及对已从受试者体内移除的细胞、组织和/或器官进行治疗或进行手术的事件。例如，该细胞、组织和/或器官可以通过手术或治疗方法返回到受试者的身体。
在本申请中，术语“分泌”通常是指细胞将表达的多肽或蛋白转移到细胞外环境。
在本申请中，术语“分泌能力”通常是指细胞表达多肽或蛋白并将本申请的多肽或蛋白转移到细胞外环境的能力。
在本申请中，术语“辐照”通常是指通过射线对物质进行的处理。例如，例如，辐照可以是指通过X射线、α射线、β射线或γ射线对物质进行辐照。
在本申请中，术语“工程化细胞”通常是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的细胞。例如，工程化细胞可以经过基因修饰以表达本申请的T细胞激活剂和/或T细胞生长因子的TIL。
在本申请中，术语“共培养”通常是指将两个或更多个不同群体的细胞在它们之间有一定程度的接触的情况下培养。本申请的两个或更多个不同群体的细胞的“接触”，例如可以通过直接接触，即其中一个群体的细胞与另一个群体的细胞直接物理接触。或者例如可以通过共用培养基所介导的间接接触。本申请的共用的培养基可以含有由共培养细胞的至少一个群体所产生和释放的代谢产物，并用于培养另一个群体的细胞。
在本申请中，术语“接触”通常是指两个或更多个不同类型的物质以任何顺序、任何方式以及任何时长接触在一起。例如可以通过直接接触，例如可以将一种或多种饲养细胞、T细胞激活剂和/或T细胞生长因子加入TIL细胞的培养基，例如可以将包含一种或多种饲养细胞、T细胞激活剂和/或T细胞生长因子的培养基加入和/或替换TIL细胞的培养基，例如，可以将包含一种或多种饲养细胞、T细胞激活剂和/或T细胞生长因子的培养基用于TIL细胞的培养；例如可以通过间接接触，例如可以将饲养细胞产生和释放的代谢产物，用于培养TIL细胞。
在本申请中，术语“混合物”通常是指两个或更多个不同物质的组合。例如，本申请的CD28抗体或其抗原结合片段以及CD3抗体或其抗原结合片段可以在混合后作为混合物加入细胞培养基。
在本申请中，术语“同时接触”、“共同接触”、“与...接触同时”、“同时”和“共同”通常是指向受试者和/或细胞施用两种以上物质，使得物质同时存在于受试者和/或细胞培养的环境中。同时接触可以包括以不同的组合物同时施用、以不同的组合物在不同时间施用，或以其中存在两种以上活性药物成分的组合物施用。例如，本申请中“同时接触”通常可以是指基本上同时接触。
在本申请中，术语“扩增”通常是指在一段时间内细胞的数量增加若干倍。例如细胞的数量可以增加至少约3倍(或4、5、6、7、8或9倍)，例如细胞的数量可以增加至少约10倍(或20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或者例如细胞的数量可以增加至少约100倍。在本申请中，术语“经扩增”通常是指本申请的细胞经过上述一种或多种扩增。
在本申请中，术语“聚合物”通常是指由连接在一起的单独化学部分组成的分子，本申请的聚合物部分可相同或不同。例如，术语“聚合物”可以指尾尾相连而形成线性分子的单独化学部分，以及以分支(如“多臂”或“星型”)结构形式连接在一起的单独化学部分。例如聚合物可以包括例如多糖、葡聚糖、水凝胶、聚乙二醇、或泊洛沙姆。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其具有聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中央疏水链，侧连两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷)) 亲水链。本申请包含的物质可以与本文所描述的或本领域已知的任何聚合物一起配制，或与它们一起给予。
在本申请中，术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”通常是指鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，可以建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，可以根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，可以在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。
在本申请中，术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，通常是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库。
在本申请中，术语“全人源抗体”、“全人抗体”或“完全人源抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区可以都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。本申请所述抗体或配体可以为全人源单克隆抗体。全人抗体制备的相关技术可以为：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phage display)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个B细胞抗体制备技术等。
在本申请中，术语“CDR”通常是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一可以由Kabat E.A.等人，Chothia等人和MacCallum等人提供。如本申请中使用的，CDR的Kabat定义可以应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR H1、CDR H2、CDR H3或H1、H2、H3)。
在本申请中，术语“抗CD3抗体”通常是指靶向CD3的抗体或其变体，例如单克隆抗体，包括人、人源化、嵌合或鼠抗体，其针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体。抗CD3抗体可以包括OKT-3。抗CD3抗体可以包括SP34。抗CD3抗体还可以包括其他抗CD3抗体包括例如otelixizumab、teplizumab和visilizumab。
在本申请中，术语“IL-2”或“IL2”通常是指称为白细胞介素2的T细胞生长因子，并包括所有形式的IL-2，可以包括在例如本申请中人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖型修饰或变体，或其活性片段。编码IL-2基因的GeneID可以为3558。
在本申请中，术语“抗原呈递细胞”、“抗原递呈细胞”、或“APC”通常是指，在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原的免疫系统细胞，如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC可以加工抗原并将其递呈至T细胞。例如，抗原呈递细胞可以包括选自以下组：外周单个核细胞，树突状细胞，和人工抗原呈递细胞。
在本申请中，术语“TIL特性”通常是指TIL细胞经过本申请培养方法获得的特性。TIL特性的变化可以包含：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量，或它们的任何组合。本申请的变化可以是提高或者降低。
在本申请中，术语“存续”通常是指细胞在受试者体内的存在。例如，TIL细胞存续能力的增加，可以是指TIL细胞在体内存在的时间增加。例如，存续能力增加可以是指细胞在受试者组织内，例如肿瘤、脾脏、骨髓、肺组织及血液中存在的时间的增加。
在本申请中，术语“纳米颗粒”通常是指至少一个尺寸小于100nm的微观颗粒。通常，纳米颗粒具有50nm至500nm(即0.05μm至0.5μm)范围内的直径；在生理环境中结构稳定；且可以容纳更小的分子(如药物或其他生物活性剂)，然后可以将该分子递送至希望的部位。例如，本申请的纳米颗粒可以包含CD28抗体或其抗原结合片段。例如，本申请的纳米颗粒可以包含CD28抗体或其抗原结合片段以及CD3抗体或其抗原结合片段。例如，抗CD3抗体可以包括OKT3。例如，抗CD28抗体可以包括15E8。
在本申请中，术语“人工抗原呈递细胞”通常是指人工构建的用于呈递外源抗原的免疫细胞，例如，呈递外源抗原的方式可以是人工抗原呈递细胞的表面包含外源抗原与主要组织相容性复合物(MHC)的复合物。在一个实施方案中，可以包括分离的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其可以包含表达HLA-A/B/C(编码其的基因GeneID可以为3105、3106或3107)、CD64(编码其的基因GeneID可以为2209)、CD80(编码其的基因GeneID可以为941)、ICOS-L(编码其的基因GeneID可以为23308)和CD58(编码其的基因GeneID可以为965)的细胞，并可以被修饰以表达一种以上T细胞激活剂，本申请的以上可以包含本数。
在本申请中，术语“融合蛋白”通常是指含有第一多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物的氨基酸序列和异源多肽或蛋白质(即，不同于第一多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物的第二多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物，或者通常不是第一多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物的一部分)的氨基酸序列的多肽或蛋白质。在某些情形中，融合蛋白可包 含与异源蛋白、多肽或肽融合的预防性或治疗性药物。其中，本申请的异源蛋白、多肽或肽可以是或不是不同类型的预防性或治疗性药物。例如，可将具有免疫调节活性的两种不同蛋白质、多肽或肽融合到一起形成融合蛋白。在某些情形中，与异源蛋白、多肽或蛋白质融合前的初始多肽或蛋白质的活性相比，融合蛋白可以保留或提高了活性。例如，本申请的融合蛋白可以是融合了CD28抗体或其抗原结合片段以及CD3抗体或其抗原结合片段的融合蛋白。
在本申请中，术语“杀伤能力”通常是指通过使本申请的细胞接触有效量的物质从而杀伤靶细胞来实现。在一个实施方案中，本申请的物质可以是TIL细胞。本申请的杀伤可以包括通过自身或者促进其它细胞或物质的CDC、凋亡、ADCC、和/或吞噬作用，或通过两种或更多种这些机制的组合以杀伤细胞。
在本申请中，术语“施用”通常是指通过本领域已知的任意途径，将物质递送给有此需要的受试者。药用载体和制剂或组合物也是本领域众所周知的。给药途径可以包括：静脉内的、肌肉内的、真皮内的、皮下的、透皮的、粘膜的、瘤内的和/或粘膜的。
在本申请中，术语“试剂盒”通常是指一起被包装在容器、接受器或其它容器中的两种或更多种组分，其中一种对应于本申请的物质。例如，包含本申请的TIL细胞。
在本申请中，术语“受试者”通常是指细胞或动物，可以是哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(家禽如鸡和鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。受试者包括动物疾病模型，例如肿瘤动物模型，和本领域技术人员已知的其它动物模型。
在本申请中，术语“饲养细胞(feeder)”通常是指可以用于支持培养另一种所关注的细胞生长的培养细胞。例如，可以通过体外生长和分泌至少一种因子至培养基。例如，饲养细胞可以包括抗原呈递细胞。
在本申请中，术语“特异性结合”通常是指识别特异性靶点物质，但是基本不识别或结合样品中其它分子的结合物质。例如，如果一种结合物质可以特异性结合来自一个物种的本申请的特异性靶点物质，则本申请的结合物质还可以特异性结合来自其它的一个或多个物种的本申请的靶点物质或同源靶点物质。这种种间反应性本身可以不会改变结合物质作为特异性的分类。在某些情形中，特异性结合至靶点物质的结合物质还可以结合至靶点物质的不同等位形式。
在本申请中，术语“完整的培养过程”通常是指将细胞从患者体内分离的肿瘤组织中分离开始，经过一次或一次以上的扩增，最终获得可以施用于受试者的细胞的完整过程。
在本申请中，术语“细胞培养基”通常是指细胞例如哺乳动物细胞在其中生长的营养液。细胞培养基的配制在本领域中是熟知的。典型地，细胞培养基包括缓冲液、盐、碳水化合物、氨基酸、维生素以及必要的微量元素。细胞培养基可以含有或不含有血清、蛋白胨、和/或蛋白质。细胞培养基可以补充有另外的组分或浓度增加的组分，如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲液、抗生素、脂质、微量元素等，这取决于有待培养的细胞的要求和/或所希望的细胞培养参数。
在本申请中，术语“药物组合物”或“药物制剂”通常是指一种制备物，本申请的制备物可以允许有效成分的生物活性有效，并且可以不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。这类制剂是无菌的。“可药用的”赋形剂(载体、添加物)是可以合理地施用至受试哺乳动物以提供有效剂量的所用有效成分的那些赋形剂。
在本申请中，术语“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”通常是指最初作为白细胞获得的细胞群，本申请的细胞已经离开受试者的血流并迁移到肿瘤中。TIL可以包括但不限于CD8
+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4
+T细胞、天然杀伤细胞、树突细胞和M1巨噬细胞。TIL可以包括初级TIL和次级TIL。“初级TIL”可以是从受试者组织样品获得的那些TIL细胞，“次级TIL”可以是本申请中已扩增或经扩增的任何TIL群。在一些实施方式中，本申请的肿瘤浸润淋巴细胞可以是未经分离纯化的，或者可以是与肿瘤细胞相互浸润的。例如，本申请的TIL可以是指TIL群。
在本申请中，术语“中心记忆T细胞”通常是指具有长期记忆性的，并能够接受抗原再刺激的T细胞。中心记忆T细胞可以具有CD45RA
-CCR7
+的表型，例如可以是通过CD45RA
-和CCR7
+来鉴定中心记忆T细胞。中心记忆T细胞可以相比普通T细胞具有更强的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“调节性T细胞”通常是指一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群。调节性T细胞可以具有CD4
+CD25
+Foxp3
+的表型，例如可以是通过CD4
+、CD25
+和Foxp3
+来鉴定调节性T细胞。调节性T细胞可以具有抑制T细胞的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“活化T细胞”通常是指经过活化而可以具有抗肿瘤生长的能力的T细胞。活化T细胞可以具有PD1
+、LAG3
+或CD28
+的表型，例如可以是通过PD1
+、LAG3
+或CD28
+来鉴定活化T细胞。活化T细胞可以具有抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“肿瘤特异性T细胞”通常是指可以特异性抗肿瘤生长的T细胞。肿瘤特异性T细胞可以具有CD103
+CD39
+的表型，例如，可以是通过CD103
+和CD39
+来鉴定肿瘤特异性T细胞。肿瘤特异性T细胞可以相比普通T细胞具有更特异性的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“干细胞样T细胞”通常是指可以具有自我增殖和/或分化的潜能的一类T细胞。干细胞样T细胞可以具有TCF1
+的表型，例如可以是通过TCF1
+来鉴定干细胞样T细胞。肿瘤特异性T细胞可以相比普通T细胞具有更强和/或更长期的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语肿瘤“碎片”通常是指从受试者体内取出肿瘤组织后，可以通过机械破碎、酶解和/或其它破碎方法，形成的肿瘤碎片。
在本申请中，术语“组合物”或“药物组合物”通常是指至少一种细胞以及至少一种和任选多于一种的其他药学上可接受的化学组分如运载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载体”通常是指不干扰活性成分的一种或多种非毒性材料。例如，药学上可接受的载体可以不干扰扰活性成分的生物活性；例如，药学上可接受的载体可以不干扰扰活性成分所具有的生物活性的有效性。这类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、以及任选地其他治疗剂。这类药学上可接受的制剂还可以含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可以用于在此所描述的配制品中的其他设想的载体、赋形剂、和/或添加剂可以包括：例如，调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)等等。适合用于在此所描述的配制品中的这些和另外已知的药物载体、赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的。本申请中，“药学上可接受的载体(carrier)”可以理解为不包含基因工程用到的核酸形式的载体(vector)。
在本申请中，术语“功能活性片段”通常是指具有全长蛋白质或核酸的部分区域，但保留或部分保留全长蛋白质或核酸的生物活性或功能的片段。例如，功能活性片段可以保留或部分保留全长蛋白质结合另一种分子的能力。例如，生长因子IL-2的功能活性片段，可以保留或部分保留全长IL-2的引起细胞增殖的生物活性功能。
在本申请中，术语“T细胞激活剂”通常是指与T细胞上的相应结合受体结合，并介导T细胞共刺激反应的物质。T细胞激活剂可以是T细胞产生有效免疫应答所需的除抗原受体之外的物质。T细胞激活剂可以是指T细胞共刺激分子。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含其变体、同源物或包含其功能活性片段的任何物质。T细胞激活剂可以包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、NK细胞活化受体、BTLA(编码其的基因GeneID可以为151888)、Toll配体受体、OX40(编码其的基因GeneID可以为7293)、CD2(编码其的基因GeneID可以为914)、CD7(编码其的基因GeneID可以为924)、CD27(编码其的基因GeneID可以为939)、CD28(编码其的基因GeneID可以为940)、CD30(编码其的基因GeneID可以为943)、CD40(编码其的基因GeneID可以为958)、CDS、ICAM-1(编码其的基因GeneID可以为3383)、LFA-1(CD11a/CD18)(编码其的基因GeneID可以为3689)、4-1BB(CD137)(编码其的基因GeneID可以为3604)、B7-H3(编码其的基因GeneID可以为80381)、ICOS(CD278)(编码其的基因GeneID可以为29851)、GITR(编码其的基因GeneID可以为8784)、BAFFR(编码其的基因GeneID可以为115650)、LIGHT(编码其的基因GeneID可以为8740)、HVEM(LIGHTR)(编码其的基因GeneID可以为8764)、KIRDS2、SLAMF7(编码其的基因GeneID可以为57823)、NKp80(KLRF1)(编码其的基因GeneID可以为51348)、NKp44(编码其的基因GeneID可以为9436)、NKp30(编码其的基因GeneID可以为259197)、NKp46(编码其的基因GeneID可以为9437)、CD19(编码其的基因GeneID可以为930)、CD4(编码其的基因GeneID可以为920)、CD8α(编码其的基因GeneID可以为925)、CD8β(编码其的基因GeneID可以为926)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL7Rα(编码其的基因GeneID可以为)、ITGA4(编码其的基因GeneID可以为3676)、VLA1(编码其的基因GeneID可以为3672)、CD49a(编码其的基因GeneID可以为3672)、IA4(编码其的基因GeneID可以为3732)、CD49D(编码其的基因GeneID可以为3676)、ITGA6(编码其的基因GeneID可以为3655)、VLA-6(编码其的基因GeneID可以为3655)、CD49f(编码其的基因GeneID可以为3655)、ITGAD(编码其的基因GeneID可以为3681)、CD11d(编码其的基因GeneID可以为3681)、ITGAE(编码其的基因GeneID可以为3682)、CD103(编码其的基因GeneID可以为3682)、ITGAL(编码其的基因GeneID可以为3683)、CD11a(编码其的基因GeneID可以为3683)、LFA-1(编码其的基因GeneID可以为3683)、ITGAM(编码其的基因GeneID可以为3684)、CD11b(编码其的基因GeneID可以为3684)、ITGAX(编码其的基因GeneID可以为3687)、CD11c(编码其的基因GeneID可以为3687)、ITGB1(编码其的基因GeneID可以为3688)、CD29(编码其的基因GeneID可以为3688)、ITGB2(编码其的基因GeneID可以为3689)、CD18(编码其的基因GeneID可以为3689)、LFA-1(编码其的基因GeneID可以为3689)、ITGB7(编码其的基因GeneID可以为3695)、NKG2D(编码其的基因GeneID可以为22914)、NKG2C(编码其的基因GeneID可以为3822)、TNFR2(编码其的基因GeneID可以为7133)、TRANCE/RANKL(编码其的基因GeneID可以为8600)、DNAM1(CD226)(编码其的基 因GeneID可以为10666)、SLAMF4(CD244、2B4)(编码其的基因GeneID可以为51744)、CD84(编码其的基因GeneID可以为8832)、CD96(Tactile)(编码其的基因GeneID可以为10225)、CEACAM1(编码其的基因GeneID可以为634)、CRTAM(编码其的基因GeneID可以为56253)、Ly9(CD229)(编码其的基因GeneID可以为4063)、CD160(BY55)(编码其的基因GeneID可以为11126)、PSGL1(编码其的基因GeneID可以为6404)、CD100(SEMA4D)(编码其的基因GeneID可以为10507)、CD69(编码其的基因GeneID可以为969)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)(编码其的基因GeneID可以为114836)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)(编码其的基因GeneID可以为6504)、BLAME(SLAMF8)(编码其的基因GeneID可以为56833)、SELPLG(CD162)(编码其的基因GeneID可以为6404)、LTBR(编码其的基因GeneID可以为4055)、LAT(编码其的基因GeneID可以为27040)、GADS(编码其的基因GeneID可以为9402)、SLP-76(编码其的基因GeneID可以为3937)、PAG/Cbp(编码其的基因GeneID可以为55824)、CD19a、和特异性结合CD3的配体、特异性结合CD28的配体、特异性结合HVEM的配体、特异性结合CD40L的配体、特异性结合OX40的配体、和特异性结合4-1BB的配体。共刺激胞内信号传导结构域可以是指T细胞激活剂的胞内部分。胞内信号传导结构域可以包含从中衍生的分子的完整胞内部分或完整天然胞内信号传导结构域或其功能性片段。
在本申请中，术语“T细胞生长因子”通常是指引起细胞增殖的生物活性多肽或小分子化合物。例如，本申请的T细胞生长因子可以包含其变体、同源物或包含其功能活性片段的任何物质。例如，T细胞生长因子可以选自以下组的一种或多种：IL-2(编码其的基因GeneID可以为3558)、IL-4(编码其的基因GeneID可以为3565)、IL-6(编码其的基因GeneID可以为3569)、IL-7(编码其的基因GeneID可以为3574)、IL-10(编码其的基因GeneID可以为3586)、IL-12(编码其的基因GeneID可以为3592或3593)、IL-15(编码其的基因GeneID可以为3600)、IL-21(编码其的基因GeneID可以为59067)、TNF-α(编码其的基因GeneID可以为100137091)、γ干扰素(编码其的基因GeneID可以为3458)等等。
在本申请中，术语“基本上同时”通常是指接触过程的一段时间内TIL可以与两种以上的物质同时接触，但是可以不限于在整个接触过程中TIL总是与两种以上的物质同时接触。例如，基本上同时可以是指一段时间内TIL可以与至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的两种以上的物质的每种物质同时接触。
在本申请中，术语“固相介质”或“介质”通常是指具有结合功能的固相材料。例如，本申请固相介质可以是指通过共价结合和/或非共价结合的作用，将一种或一种以上的物质结合在介质内和/或介质表面的材料。例如，本申请的固相介质可以结合一种或一种以上的T细胞激活 剂。例如，本申请的固相介质可以是指通过共价结合和/或非共价结合的作用将CD28抗体或其抗原结合片段以及CD3抗体或其抗原结合片段结合在介质内和/或介质表面的材料。例如，本申请的固相介质可以是包含OKT3抗体和15E8抗体的直径为约500纳米至约10微米的微球。例如，本申请的固相介质可以是聚合物材料。例如，本申请的固相介质可以是直径至少约500纳米的微球。例如，本申请的固相介质可以是纳米基质。例如，本申请的固相介质可以是包含OKT3抗体和15E8抗体的直径为约1纳米至约500纳米的纳米基质。
在本申请中，术语“纳米基质”通常是指一种直径在约1纳米到约500纳米的材料。在本申请中，纳米基质可以具有结合功能，例如，本申请的纳米基质可以结合一种或一种以上的T细胞激活剂。在本申请中，纳米基质可以包含聚合物，例如，本申请的纳米基质可以包含可降解聚合物。在本申请中，纳米基质可以包含多糖、和/或葡聚糖。
在本申请中，术语“树突状细胞”通常是指存在于体内、体外、离体或宿主或受试者内的或可衍生自造血干细胞或单核细胞的抗原递呈细胞。树突状细胞及其前体可以从各种淋巴器官例如脾脏、淋巴结以及骨髓和外周血分离。本申请的树突状细胞可以具有特征形态，例如在树突细胞体的多个方向上延伸的薄层(板状伪足)。通常，树突细胞可以表达高水平的MHC和共刺激(例如B7-1和B7-2)分子。树突状细胞可以在体外诱导T细胞的抗原特异性分化，并且能够在体外和体内引发原代T细胞应答。
在本申请中，术语“体外扩增”通常是指经过培养以产生细胞的数量的变化，经扩增的细胞也可以产生细胞的数量和/或比例变化，分泌能力变化，杀伤能力变化或表达能力的变化，或它们的任何组合。本申请的变化可以是提高或者降低。在本申请中，体外扩增可以是为了扩增目的；为了检测TIL细胞的功能，例如检测TIL细胞释放细胞因子能力，而对TIL细胞进行的操作步骤(例如向TIL细胞的培养基中加入一种或一种以上物质以检测TIL细胞释放细胞因子能力)，可以不属于本申请的体外扩增。
在本申请中，术语“外周单个核细胞”或“外周血单个核细胞”通常是指外周血中具有单个核的细胞。例如，在本申请中，本申请的外周血单个核细胞可以包括淋巴细胞、单核细胞和/或树突状细胞。
在本申请中，术语“细胞因子”通常是指由一个细胞群释放的对另一个细胞起细胞间调节剂作用的蛋白。本申请的细胞因子可以是淋巴细胞因子(lymphokines)、单核细胞因子(monokines)和多肽激素。本申请的细胞因子可以包括白细胞介素(ILs)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、IL-21、和/或IL-12。在本申请中，术语细胞因子可以包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白，天然序列细胞 因子的生物活性等价物，以及其功能活性片段。
在本申请中，术语“直径”通常是指本申请物质的截面的直径。例如，当本申请的物质不是球形时，则术语“直径”通常是指本申请物质的最大截面的最大直径和/或平均直径。确定物质的直径的方法可以是本领域通用的方法，例如透射电子显微镜。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指任何新的病理性的组织增生。本申请的肿瘤可能是良性的，也可能是恶性的。本申请的肿瘤可能是实体的，也可能是血液的。术语“肿瘤”可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
在本申请中，术语“肿瘤组织”通常是指来自对象中的肿瘤，包括对象中的任何实体肿瘤和/或非实体肿瘤的任何组织的样品。
在本申请中，术语“CD28激动剂”通常是指结合细胞表面CD28蛋白并且在细胞中引发应答的化合物。例如，本申请的CD28激动剂可以是结合CD28的小分子制剂。例如，本申请的CD28激动剂可以是结合CD28的抗体或其抗原结合片段。
在本申请中，术语“T细胞亚群比例”通常是指根据不同T细胞亚群占TIL细胞或TIL群中的比例。例如，本申请不同的T细胞亚群具有不同的免疫活性和/或分化能力。例如，本申请的T细胞亚群可以根据T细胞表面标志物进行区分。例如，中心记忆T细胞可以具有CD45RA
-CCR7
+的表型。例如，调节性T细胞可以具有CD4
+CD25
+Foxp3
+的表型。例如，活化T细胞可以具有CD25
+、CD28
+、TIM3
+、PD1
+或41BB
+的表型。例如，肿瘤特异性T细胞可以具有CD103
+CD39
+的表型。例如，干细胞样T细胞可以具有TCF1
+的表型。
在本申请中，术语“TIL细胞数量”通常是指本申请的TIL细胞中细胞数量。在本申请中，TIL细胞数量可以是指本申请任一阶段获得的TIL群中的细胞数量。例如，TIL细胞数量可以是指源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群的细胞数量。例如，TIL细胞数量可以是指经第一阶段体外扩增的第二TIL群的细胞数量。例如，TIL细胞数量可以是指经第二阶段体外扩增的第三TIL群的细胞数量。例如，TIL细胞数量可以是指本申请任意一种培养方法最终获得的TIL的细胞。在本申请中，TIL细胞数量可以通过本领域常用的方法测量，例如可以包括但不限于细胞计数板手动细胞计数和/或自动细胞计数器计数。
在本申请中，术语“约”和“大约”通常是指在统计上有意义的数值范围内。这样的范围可以在给定值或范围的一个数量级内，可以包括在50％内，可以包括在20％内，可以包括在10％内，可以包括在5％内。术语“约”或“大约”所包含的可允许变化可以取决于所研究的特定系统，并且本领域普通技术人员可以容易地理解。术语“以上”、“以下”、“至多”和“至少”可以包括本 数。
发明详述
一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法可以包含：使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。其中，本申请的细胞因子可以是白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段。
例如，所述方法可以包含：使所述TIL与所述饲养细胞共培养之后，使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强。例如，所述方法可以包含：使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强之后，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。例如，所述方法可以包含：在所述TIL与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触之后且在所述TIL与所述饲养细胞共培养之前使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强。
例如，所述方法可以包含：在所述TIL与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触基本上同时使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强。
例如，所述方法可以包含：在所述TIL与所述饲养细胞共培养基本上同时使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强。
另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法可以包含：使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，其中所述TIL包含与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养获得的TIL。其中，本申请的细胞因子可以是白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段。
另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法可以包含：使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中所述TIL包含使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强获得的TIL。其中，本申请的细胞因子可以是白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段。
另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法可以包含：使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触。
另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法可以包含：使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，其中所述TIL包含与CD28激动剂接触获得的TIL。
另一方面，本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法可以包含： 使所述TIL与CD28激动剂接触，其中所述TIL包含使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强获得的TIL。
例如，所述CD28激动剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段，以及上述物质的重组蛋白。
例如，与细胞因子的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强获得的TIL可以显示出改善的TIL特性。例如，细胞因子的表达和/或活性未改变的TIL可以是指源自同一供体的且未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的TIL细胞。例如，细胞因子的表达和/或活性未改变的TIL可以是指源自同一供体的且使所述TIL的细胞因子以外的物质(例如绿色荧光蛋白)的表达提高和/或活性增强的TIL细胞。
例如，未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL可以是指源自同一供体的经过同样方式分离的且未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的TIL细胞。例如，未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL可以是指源自同一供体的同一肿瘤来源的且未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的TIL细胞。例如，未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL可以是指源自同一供体的同一肿瘤来源的经过同样方式分离的且未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的TIL细胞。例如，未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL可以是指将源自同一供体的TIL细胞分为两组，其中一组未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的TIL细胞可以为未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL。例如，未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL可以是指将源自同一供体的经过同样方式分离的TIL细胞分为两组，其中一组未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的TIL细胞可以为未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL。例如，未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL可以是指将源自同一供体的同一肿瘤来源的TIL细胞分为两组，其中一组未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的TIL细胞可以为未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL。例如，未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL可以是指将源自同一供体的同一肿瘤来源的经过同样方式分离的TIL细胞分为两组，其中一组未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的TIL细胞可以为未曾使所述TIL的至少一种细胞 因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL。例如，至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强可以是指天然的细胞可以不表达该细胞因子，经过本申请的处理，可以使得该细胞表达各种形式的该细胞因子，即细胞因子的表达提高可以是使天然细胞从不表达该细胞因子转变为表达一定量的该细胞因子。其中，本申请的细胞因子可以是白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段。
例如，本申请的改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
例如，本申请的提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量可以是指与在体外扩增阶段未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的本申请TIL的细胞在肿瘤组织、血液组织、骨髓组织、肺组织和/或脾组织的T细胞数量可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。
例如，本申请的改善的TIL细胞数量是指与在体外扩增阶段未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的本申请TIL的细胞数量可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，改善的TIL细胞数量可以表现为TIL细胞活率的增加。例如，本申请的增加的TIL细胞数量可以是指与在体外扩增阶段未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的本申请TIL的细胞数量可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至 少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。
例如，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指TIL细胞的选自以下组的细胞因子分泌能力提高：CD107a、GZMB、IL-2、TNF-α和IFN-γ。例如，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强过的本申请TIL的细胞因子分泌能力可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强过的本申请TIL的细胞因子分泌能力可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。例如，本申请的TIL的细胞因子分泌能力的测定可以是通过测量TIL细胞的细胞因子表达能力。例如，本申请的TIL的细胞因子分泌能力通过测量TIL细胞的细胞因子释放能力以测定。例如，本申请的TIL的细胞因子分泌能力是通过CBA法(Cytometric Bead Array)测定。
例如，本申请的增加的NK细胞比例可以是TIL细胞中NK细胞的比例的增加。例如，在TIL细胞中NK细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。
例如，本申请的提高的肿瘤细胞杀伤能力可以是指与在体外扩增阶段未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强过的本申请TIL的肿瘤细胞杀伤率可 以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，本申请的提高的肿瘤细胞杀伤能力可以是指与在体外扩增阶段未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强过的本申请TIL的肿瘤细胞杀伤率可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。例如，本申请的TIL的肿瘤细胞杀伤率可以通过CFSE和DAPI染色法测量。例如，本申请的TIL的肿瘤细胞杀伤率可以通过使用IncuCyte系统测量Caspase-3/7活性测量。例如，本申请的TIL的肿瘤细胞杀伤可以是指TIL杀伤实体瘤细胞的能力。例如，本申请的TIL的肿瘤细胞杀伤可以是指TIL杀伤宫颈癌细胞的能力。
例如，本申请的提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性可以包含在长期培养的过程中，与在体外扩增阶段未曾使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强过的本申请TIL细胞群中表达的TCR的种类更多，例如，可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。
例如，本申请的改善的T细胞亚群比例可以包含选自以下组的一种或多种：增加的CD4
+细胞比例，降低的CD8
+细胞比例，增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
例如，本申请的增加的CD4
+细胞比例可以是TIL细胞中CD4阳性细胞的比例的增加。例如，在TIL细胞中CD4
+细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约 19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。
例如，本申请的降低的CD8
+细胞比例可以是TIL细胞中CD8阳性细胞的比例的降低。例如，在TIL细胞中CD8
+细胞比例可以降低至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。
例如，本申请的增加的中心记忆T细胞比例可以是TIL细胞中CD45RA
-CCR7
+细胞的比例的增加。例如，在TIL细胞中中心记忆T细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。
例如，本申请的减少的调节性T细胞的比例可以是TIL细胞中CD4
+CD25
+Foxp3
+细胞的比例的减少。例如，在TIL细胞中调节性T细胞比例可以减少至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。
例如，本申请的增加的活化T细胞比例可以是TIL细胞中CD25
+、CD28
+、TIM3
+、PD1
+或41BB
+细胞的比例的增加。例如，在TIL细胞中活化T细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约 8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，在TIL细胞中CD25
+细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，在TIL细胞中CD28
+细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，在TIL细胞中TIM3
+细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、 至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，在TIL细胞中PD1
+细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，在TIL细胞中41BB
+细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。
例如，本申请的方法中所述使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强可以包含将编码所述细胞因子的核酸引入所述TIL中。其中，细胞因子可以是白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段。
例如，本申请的方法中所述使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强可以包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中，所述核酸编码一种或多种细胞因子。例如，本申请的方法中编码所述细胞因子的核酸可以被整合到所述TIL的基因组中。例如，当编码所述细胞因子的核酸可以被整合到所述TIL的基因组时，所述细胞因子可以长期和/或持续在所述TIL中表达。
例如，本申请的方法中所述载体可以包含病毒载体。例如，本申请的方法中所述病毒载体可以包含逆转录病毒载体。例如，本申请的方法中所述逆转录病毒载体可以包含慢病毒载体。
例如，本申请的方法中所述细胞因子可以包含白介素(IL)。例如，本申请的方法中所述细胞因子可以包含白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段。
例如，本申请的方法中所述IL-12可以包含膜锚定的IL-12和/或分泌的IL-12。例如，所述L-12可以包含多种结构域。例如，本申请的IL-12中可以不限于只包含IL-12结构域。例如，本申请的IL-12结构域可以包含p40结构域和/或p35结构域。
例如，本申请的方法中所述IL-12和/或其功能活性片段可以包含但不限于p40结构域。例如，本申请的方法中所述p40结构域可以包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
例如，本申请的方法中所述IL-12和/或其功能活性片段可以包含但不限于p35结构域。例如，本申请的p35结构域的作用可以是和本申请的p40结构域连接用于构建IL12结构域。例如，本申请的方法中所述p35结构域可以包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
例如，本申请的方法中所述p40结构域可以与所述p35结构域直接或间接连接。例如，本申请的方法中所述间接连接可以包含但不限于通过连接子连接。例如，本申请的方法中所述连接子可以包含选自以下组所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：43-49、(SEQ ID NO：50)
l、(SEQ ID NO：51)
m、(SEQ ID NO：52)
n、(SEQ ID NO：53)
p、和(SEQ ID NO：54)
q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q可以各自独立地至少为1。例如，l、m、n、p和q为各自序列的重复单元数，当该序列可以为重复序列时，重复单元数表示该序列重复的个数。例如，l可以为1、2、3、4、5、或10，m可以为1、2、3、4、5、或10，n可以为1、2、3、4、5、或10，p可以为1、2、3、4、5、或10，q可以为1、2、3、4、5、或10。
例如，本申请的方法中所述IL-12可以包含但不限于信号肽结构域。例如，本申请的方法中所述信号肽结构域可以包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。例如，本申请的方法中所述信号肽结构域可以与所述p40结构域直接或间接连接。
例如，本申请的方法中所述IL-12可以包含但不限于跨膜结构域。例如，本申请的跨膜结构域可以使得本申请的IL-12可以结合在细胞膜上。例如，本申请的方法中所述IL-12可以包含但不限于跨膜结构域与胞内结合域。例如，本申请的方法中所述跨膜结构域可以包含如SEQ ID NO：56-61中任一项所示的氨基酸序列。例如，本申请的方法中所述跨膜胞内结构域可以包含如SEQ ID NO：66-70中任一项所示的氨基酸序列。例如，本申请的方法中所述跨膜结构域可以与所述信号肽结构域直接或间接连接。例如，本申请的方法中所述跨膜结构域可以与所述p35结构域直接或间接连接。
例如，本申请的方法中所述IL-12可以包含但不限于胞内结构域。例如，本申请的方法中所述胞内结构域可以包含如SEQ ID NO：62-65中任一项所示的氨基酸序列。例如，本申请的 方法中所述胞内结构域可以与所述跨膜结构域直接或间接连接。
例如，本申请的方法中所述IL-12的所述功能活性片段可以包含如SEQ ID NO：42和/或55所示的氨基酸序列。
例如，本申请的方法中所述IL-12可以包含如SEQ ID NO：34-40中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的方法中所述细胞因子的表达提高可以包含所述细胞因子的合成和/或分泌提高。
例如，本申请的方法中与细胞因子的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达细胞因子的细胞比例可以提高。
例如，本申请的方法中与细胞因子的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达细胞因子的细胞比例可以提高至少约5％以上。例如，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例可以提高至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、或至少约5％。例如，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例可以从0％到可以观测的细胞比例。例如，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例可以提高到至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、或至少约1％。例如，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例可以通过细胞流式仪进行检测。
例如，本申请的方法中所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达细胞因子的细胞比例可以为至少约5％以上。例如，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例可以为至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、或至少约5％。例如，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例可以通过细胞流式仪进行检测。
例如，本申请的方法还可以包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个 阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的本申请体外扩增中，可以使本申请TIL与饲养细胞共培养。
例如，在单个阶段的本申请体外扩增中，可以使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强且与本申请饲养细胞共培养，例如，单个阶段的本申请体外扩增可以指在同一个阶段的本申请的体外扩增，例如，可以同在本申请的第一阶段体外扩增、同在本申请的第二阶段体外扩增、或同在本申请的第三阶段体外扩增等。
例如，本申请的第一阶段体外扩增中，可以使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强且与本申请饲养细胞共培养。例如，本申请的在本申请第二阶段体外扩增中，可以使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强且与本申请饲养细胞共培养。例如，本申请的在本申请第三阶段体外扩增中，可以使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强且与本申请饲养细胞共培养。
例如，每一个阶段体外扩增之间可以是通过TIL细胞数量的变化来划分的，例如，当TIL细胞的数量增加至少约1倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一些实施方式中，当TIL细胞的数量增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍、或者至少约1000倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，每一个阶段的体外扩增之间也可以是通过TIL细胞培养的条件的变化来划分的。例如，当细胞培养基中添加了或补充添加了T细胞激活剂和/或T细胞生长因子后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，当细胞培养基中添加了或补充添加了IL-2后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，当细胞培养基中添加了或补充添加了饲养细胞后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，当TIL细胞进行了离心和/或细胞洗涤的操作后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，每一个阶段之间也可以是通过TIL细胞培养的天数来划分的。例如，当TIL细胞体外培养约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约30天、约40天、约50天或约100天后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。
例如，所述第二阶段体外扩增可以进行至少约7天。例如，所述第二阶段体外扩增可以 进行至少约9天。例如，所述第二阶段体外扩增可以进行至多约14天。例如，所述第二阶段体外扩增可以进行至多约13天。例如，所述第二阶段体外扩增可以进行约7天至约14天、约9天至约14天、约7天至约13天或约9天至约13天。例如，本申请的第二阶段体外扩增可以进行至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、或至少约14天。例如，本申请的第二阶段体外扩增可以进行约9天至约14天，例如，本申请的第二阶段体外扩增可以进行约9天至约14天、约10天至约14天、约11天至约14天、约12天至约14天、约13天至约14天、约9天至约13天、约10天至约13天、约11天至约13天、约12天至约13天、约9天至约12天、约10天至约12天、约11天至约12天、或约10天至约11天。例如，本申请的第二阶段体外扩增可以认为是REP(rapid expansion protocol)阶段。
例如，所述第一阶段体外扩增可以进行至少约7天。例如，所述第一阶段体外扩增可以进行约7天至约14天。例如，本申请的第一阶段体外扩增可以进行至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、或至少约14天。例如，本申请的第一阶段体外扩增可以进行约7天至约14天、约8天至约14天、约9天至约14天、约10天至约14天、约11天至约14天、约12天至约14天、约13天至约14天、约9天至约13天、约10天至约13天、约11天至约13天、约12天至约13天、约9天至约12天、约10天至约12天、约11天至约12天、或约10天至约11天。例如，本申请的第一阶段体外扩增可以认为是preREP阶段。
例如，本申请第二阶段体外扩增进行的天数可以是从第二阶段体外扩增的开始时刻进行计算。例如，第二阶段体外扩增开始的当时，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约0天。例如，第二阶段体外扩增开始后进行了约24小时，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约1天。例如，第二阶段体外扩增开始的当天，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约0天。例如，本申请第二阶段体外扩增进行的天数可以是通过第二阶段体外扩增进行的天数进行计算。例如，第二阶段体外扩增开始后的第二天，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约1天。
例如，本申请培养方法可以按照两步骤划分方式进行划分。例如，(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。例如，所述步骤(A)可以进行约7天至约14天。例如，所述步骤(B)可以进行约7天至约14天。
例如，本申请培养方法可以按照三步骤划分方式进行划分。例如，(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，且可以使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)可以使所述第三TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群。例如，所述步骤(A)可以进行约7天至约14天。例如，所述步骤(B)可以进行约0天至约8天。例如，所述步骤(C)可以进行约5天至约14天。
例如，本申请培养方法可以按照四步骤划分方式进行划分。例如，(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)可以使所述第三TIL群的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群；(D)可以使所述第四TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(D)得到第五TIL群。例如，所述步骤(A)可以进行约7天至约14天。例如，所述步骤(B)可以进行约0天至约4天。例如，所述步骤(C)可以进行约0天至约4天。例如，所述步骤(D)可以进行约5天至约14天。
例如，本申请的培养方式的步骤(A)是从复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群。例如，所述体外TIL群可以包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群。例如，所述体外TIL群可以包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。例如，所述体外TIL群可以包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。例如，所述体外TIL群可以包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子且冷冻保存获得的TIL群。例如，当本申请的步骤(A)为是从复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群时，此时步骤(A)可以进行约2小时至约4天。
例如，在单个阶段的本申请体外扩增中，可以使本申请TIL与本申请一种或多种T细胞激活剂和/或一种或多种T细胞生长因子接触一定时间之后，再与本申请饲养细胞共培养。例如，本申请的一定时间可以为至少约2小时。例如，本申请的一定时间可以为至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时、至少约12小时、至少约13小时、至少约14小时、至少约15小时、至少约16小时、至少约17小时、至少约18小时、至少约19小时、至少约20小时、至少约21小时、至少约22小时、至少约23小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约60小时或至少约72小时。例如， 本申请的一定时间可以为约6小时至约72小时。例如，本申请的一定时间可以为约6小时到约7小时、约6小时到约8小时、约6小时到约9小时、约6小时到约10小时、约6小时到约11小时、约6小时到约12小时、约6小时到约13小时、约6小时到约14小时、约6小时到约15小时、约6小时到约16小时、约6小时到约17小时、约6小时到约18小时、约6小时到约19小时、约6小时到约20小时、约6小时到约21小时、约6小时到约22小时、约6小时到约23小时、约6小时到约24小时、约6小时到约36小时、约6小时到约48小时、约6小时到约60小时或约6小时到约72小时。例如，本申请的一定时间可以为约12小时到约13小时、约12小时到约14小时、约12小时到约15小时、约12小时到约16小时、约12小时到约17小时、约12小时到约18小时、约12小时到约19小时、约12小时到约20小时、约12小时到约21小时、约12小时到约22小时、约12小时到约23小时、约12小时到约24小时、约12小时到约36小时、约12小时到约48小时、约12小时到约60小时或约12小时到约72小时。例如，本申请的一定时间可以为约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时或约72小时。
例如，本申请的饲养细胞可以包含抗原呈递细胞。例如，本申请的饲养细胞可以包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞，和人工抗原呈递细胞。例如，本申请的饲养细胞可以为外周单个核细胞。例如，本申请的饲养细胞可以为经过辐照的饲养细胞。例如，本申请的饲养细胞可以为分离的人工抗原呈递细胞(aAPC)，本申请的人工抗原呈递细胞可以包含表达HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L和/或CD58的细胞，并可以被修饰以表达一种以上本申请的T细胞激活剂。例如，本申请的饲养细胞可以经过辐照，例如，可以经过伽马射线辐照，或可以经过X射线辐照。
例如，本申请的TIL与本申请的饲养细胞共培养可以包含使本申请的饲养细胞的表面与本申请的TIL的表面相接触。例如，本申请的TIL与本申请的饲养细胞共培养包含将本申请的饲养细胞添加至本申请的TIL的细胞培养基中。
例如，本申请可以以约40:1-约400:1的本申请饲养细胞与本申请TIL的比例，将本申请饲养细胞添加至本申请TIL的细胞培养基中。例如，本申请可以以约40:1-约400:1、以约40:1-约300:1、以约40:1-约200:1、以约40:1-约100:1、以约40:1-约90:1、以约40:1-约80:1、以约40:1-约70:1、以约40:1-约60:1、以约40:1-约50:1、以约50:1-约400:1、以约60:1-约400:1、 以约70:1-约400:1、以约80:1-约400:1、以约90:1-约400:1、以约100:1-约400:1、以约200:1-约400:1、或以约300:1-约400:1的本申请饲养细胞与本申请TIL的比例，将本申请饲养细胞添加至本申请TIL的细胞培养基中。
例如，本申请的方法还可以包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的本申请体外扩增中，使本申请TIL与一种或多种T细胞激活剂接触。
例如，在单个阶段的本申请的体外扩增中，使所述TIL与所述一种或多种T细胞激活剂接触。例如，T细胞激活剂可以包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。例如，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强且与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。例如，在本申请第一阶段体外扩增中，可以使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强且与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。例如，在本申请第二阶段体外扩增中，可以使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强且与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。例如，在本申请第三阶段体外扩增中，可以使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强且与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。
例如，在单个阶段的本申请的体外扩增中，可以基本上同时使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强以及使TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。例如，在单个阶段的本申请的体外扩增中，可以先使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，例如，可以提前2小时、提前4小时、提前8小时、提前12小时、提前24小时、或提前48小时等，再与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。例如，在单个阶段的本申请的体外扩增中，可以使本申请的TIL先与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触，例如，可以提前2小时、提前4小时、提前8小时、提前12小时、提前24小时、或提前48小时等，再使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强。
例如，在本申请第一阶段体外扩增中，可以基本上同时使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强以及使TIL接触本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。例如，在本申请第二阶段体外扩增中，可以基本上同时使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强以及使TIL接触本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。例如，在本申请第三阶段体外扩增中，可以基本上同时使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强以及使TIL接触本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。
例如，本申请的T细胞激活剂可以包含选自以下组的一种或多种：CD80、CD86、B7-H3、 4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT、以及它们的功能活性片段。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含选自以下组：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB的抗体以及它们的抗原结合片段。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含CD3激动剂。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段，例如可以是Miltenyi Biotech的OKT3，可以是BD的SP34。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含CD28激动剂。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段，例如可以是Merck的15E8，本申请的T细胞激活剂可以包含CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段，以及上述物质的重组蛋白。
例如，本申请的T细胞激活剂可以包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段，例如可以包含Miltenyi Biotech的OKT3的轻链VL和重链VH，可以包含BD的SP34的轻链VL和重链VH。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含CD28激动剂。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段，例如可以包含Merck的15E8的轻链VL和重链VH。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段，例如可以包含Miltenyi Biotech的OKT3的轻链LCDR1-3和重链HCDR1-3，可以包含BD的SP34的轻链LCDR1-3和重链HCDR1-3，本申请的抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段可以具有CD3结合能力。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含CD28激动剂。例如，本申请的T细胞激活剂可以包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段，例如可以包含Merck的15E8的轻链LCDR1-3和重链HCDR1-3，本申请的抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段可以具有CD28结合能力。在本申请中，本申请抗体或其抗原结合蛋白包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR。本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的，本申请CDR可以是根据Chothia定义的，或本申请CDR可以是根据Kabat定义的。
例如，本申请的CD3激动剂可以为CD3抗体或其抗原结合蛋白。
在本申请中，本申请抗体或其抗原结合蛋白包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR。本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的，本申请CDR可以是根据Chothia定义的，或本申请CDR可以是根据Kabat定义的。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR1，且本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：2和12中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR2，且本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：3和13中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR3，且本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：4和14中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：2和12中任一项所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：3和13中任一项所示的氨基酸序列，且本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：4和14中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与OKT3相同的HCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，且本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与SP34相同的HCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，且本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
在本申请中，本申请抗体或其抗原结合蛋白包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR。本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的，或本申请CDR可以是根据Kabat定义的。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR1，且本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：5和15中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR2，且本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：6和16中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的； 本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR3，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：7和17中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR1-3，其中本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：5和15中任一项所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：6和16中任一项所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：7和17中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与OKT3相同的LCDR1-3，其中本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与SP34相同的LCDR1-3，其中本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR1-3和LCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：2和12中任一项所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：3和13中任一项所示的氨基酸序列，本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：4和14中任一项所示的氨基酸序列，本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：5和15中任一项所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：6和16中任一项所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：7和17中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与OKT3相同的HCDR1-3和LCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含 SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与SP34相同的HCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链可变区VH，且本申请VH可包含SEQ ID NO：8和18中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与OKT3相同的VH，且本申请VH可包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与SP34相同的VH，且本申请VH可包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含轻链可变区VL，且本申请VL可包含SEQ ID NO：9和19中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与OKT3相同的VL，且本申请VL可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与SP34相同的VL，且本申请VL可包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链可变区VH和轻链可变区VL，且本申请VH可包含SEQ ID NO：8和18中任一项所示的氨基酸序列，本申请VL 可包含SEQ ID NO：9和19中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与OKT3相同的VH和VL，且本申请VH可包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，本申请VL可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与SP34相同的VH和VL，且本申请VH可包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，本申请VL可包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：10和20中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与OKT3相同的重链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与SP34相同的重链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含轻链，且本申请轻链可包含SEQ ID NO：11和21中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与OKT3相同的轻链，且本申请轻链可包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与SP34相同的轻链，且本申请轻链可包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链和轻链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：10和20中任一项所示的氨基酸序列，本申请轻链可包含SEQ ID NO：11和21中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与OKT3相同的重链和轻链，且本申请 重链可包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，本申请轻链可包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与SP34相同的重链和轻链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列，本申请轻链可包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD3结合能力。
在一种实施方式中，本申请的CD28激动剂可以为CD28抗体或其抗原结合蛋白。
在本申请中，本申请抗体或其抗原结合蛋白包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR。本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的，或本申请CDR可以是根据Kabat定义的。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR1，且本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR2，且本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR3，且本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，且本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与15E8相同的HCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，且本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
在本申请中，本申请抗体或其抗原结合蛋白包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR。本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的，或本申请CDR可以是根据Kabat定义的。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR1，且本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR2，且本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR3，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR1-3，其中本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与15E8相同的LCDR1-3，其中本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR1-3和LCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与15E8相同的HCDR1-3和LCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：27所示的氨 基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链可变区VH，且本申请VH可包含SEQ ID NO：28和29中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与一种15E8相同的VH，且本申请VH可包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与另一种15E8相同的VH，且本申请VH可包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含轻链可变区VL，且本申请VL可包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与15E8相同的VL，且本申请VL可包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链可变区VH和轻链可变区VL，且本申请VH可包含SEQ ID NO：28和29中任一项所示的氨基酸序列，本申请VL可包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与一种15E8相同的VH和VL，且本申请VH可包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，本申请VL可包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与另一种15E8相同的VH和VL，且本申请VH可包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，本申请VL可包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：31和32中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与一种15E8相同的重链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与另一种15E8相同的重链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含轻链，且本申请轻链可包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与15E8相同的轻链，且本申请轻链可包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链和轻链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：31和32中任一项所示的氨基酸序列，本申请轻链可包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与一种15E8相同的重链和轻链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，本申请轻链可包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与另一种15E8相同的重链和轻链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，本申请轻链可包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有CD28结合能力。
例如，使本申请的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触可以包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将本申请的T细胞激活剂添加至本申请的TIL的细胞培养基中；(2)将表达本申请的T细胞激活剂的工程化细胞添加至本申请的TIL的细胞培养基中；(3)将包含本申请的T细胞激活剂的固相介质添加至本申请的TIL的细胞培养基中。例如，使本申请的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触可以包含将包含本申请的T细胞激活剂的固相介质添加至本申请的TIL的细胞培养基中。例如，使本申请的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触可以包含将包含本申请的CD28抗体与CD3抗体的固相介质添加至本申请的TIL的细胞培养基中。
例如，所述T细胞激活剂在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约30ng/mL。 例如，本申请的CD28抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约30ng/mL；例如，本申请的CD3抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约30ng/mL。例如，本申请的CD28抗体初始浓度的选择可以与本申请的CD3抗体初始浓度的选择相互独立；例如，本申请的CD28抗体与本申请的CD3抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以任意组合。例如，本申请的CD28抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以任意选自约30ng/mL-约300ng/mL。例如，本申请的CD3抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以任意选自约30ng/mL-约300ng/mL。例如，本申请的CD28抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以任意选自约30ng/mL-约300ng/mL，且本申请的CD3抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以任意选自约30ng/mL-约300ng/mL，本申请的CD28抗体初始浓度的选择可以与本申请的CD3抗体初始浓度的选择相互独立。例如，本申请的固相介质的直径可以为约500纳米至约10微米。例如，本申请的固相介质的直径可以通过透射电子显微镜测量。例如，本申请的固相介质的直径可以为约1纳米至约500纳米。例如，本申请的固相介质的直径可以为约100纳米至约500纳米。例如，本申请的固相介质的直径可以为约200纳米至约500纳米。例如，本申请的固相介质的直径可以通过透射电子显微镜测量。
例如，本申请的固相介质可以包含聚合物。例如，本申请的固相介质可以包含葡聚糖。
例如，每mg本申请的固相介质包含至少约25μg的本申请的T细胞激活剂。
例如，以约1:100-约1:2000的本申请固相介质与本申请TIL的比例，将包含本申请T细胞激活剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。例如，以约2:1-约1:2的本申请固相介质与本申请TIL的比例，将包含本申请T细胞激活剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。
例如，当本申请的固相介质的直径为约100纳米至约500纳米时，可以以约2:1-约1:2的本申请固相介质与本申请TIL的比例，将包含本申请T细胞激活剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。例如，当本申请的固相介质的直径为约100纳米至约500纳米时，可以以约2:1-约1:2、以约2:1-约1:1、或以约1:1-约1:2的本申请固相介质与本申请TIL的比例，将包含本申请T细胞激活剂，例如CD3激动剂和/或CD28激动剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。
例如，当本申请的固相介质的直径为约100纳米至约500纳米时，可以以约1:100-约1:2000的本申请固相介质与本申请TIL的比例，将包含本申请T细胞激活剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。例如，当本申请的固相介质的直径为约100纳米至约500纳 米时，可以以约1:100-约1:2000、以约1:200-约1:2000、以约1:300-约1:2000、以约1:400-约1:2000、以约1:500-约1:2000、以约1:600-约1:2000、以约1:700-约1:2000、以约1:800-约1:2000、以约1:900-约1:2000、以约1:1000-约1:2000、以约1:1200-约1:2000以约1:1400-约1:2000、以约1:1600-约1:2000、或以约1:1800-约1:2000的本申请固相介质与本申请TIL的比例，例如可以将包含本申请CD28激动剂和CD3激动剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。
例如，本申请的方法还可以包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的本申请体外扩增中，使本申请TIL与一种或多种T细胞生长因子接触。
例如，在单个阶段的本申请体外扩增中，可以使本申请的TIL与本申请的T细胞激活剂接触且与本申请的一种或多种T细胞生长因子接触。例如，在本申请第一阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL与本申请的T细胞激活剂接触且与本申请的一种或多种T细胞生长因子接触。例如，在本申请第二阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL与本申请的T细胞激活剂接触且与本申请的一种或多种T细胞生长因子接触。例如，在本申请第三阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL与本申请的T细胞激活剂接触且与本申请的一种或多种T细胞生长因子接触。
例如，在单个阶段的本申请体外扩增中，可以基本上同时使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强以及使TIL与T细胞生长因子接触。例如，在单个阶段的本申请的体外扩增中，可以基本上同时使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强以及使TIL与T细胞生长因子接触。例如，在单个阶段的本申请的体外扩增中，可以先使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，例如，可以提前2小时、提前4小时、提前8小时、提前12小时、提前24小时、或提前48小时等，再使本申请的TIL与本申请的一种或多种T细胞生长因子接触。例如，在单个阶段的本申请的体外扩增中，可以使本申请的TIL先与本申请的一种或多种T细胞生长因子接触，例如，可以提前2小时、提前4小时、提前8小时、提前12小时、提前24小时、或提前48小时等，再使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强。
例如，在本申请第一阶段体外扩增中，可以基本上同时使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强以及使TIL与T细胞生长因子接触。例如，在本申请第二阶段体外扩增中，可以基本上同时使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强以及使TIL与T细胞生长因子接触。例如，在本申请第三阶段体外扩增中，可以基本上同时使所述 TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强以及使TIL与T细胞生长因子接触。
例如，本申请的T细胞生长因子可以选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。例如，本申请的T细胞生长因子可以包含IL-2和/或其功能活性片段。例如，IL-2的功能活性片段可以包含本领域已知的可以与T细胞的IL-2受体结合的IL-2的片段。
例如，本申请的TIL与本申请一种或多种T细胞生长因子接触可以包含将本申请T细胞生长因子添加至本申请TIL的细胞培养基中。例如，本申请的T细胞生长因子在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约300IU/mL。例如，本申请IL-2在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约350IU/mL、至少约400IU/mL、至少约500IU/mL、至少约600IU/mL、至少约700IU/mL、至少约800IU/mL、至少约900IU/mL、至少约1000IU/mL、至少约1100IU/mL、至少约1200IU/mL、至少约1300IU/mL、至少约1400IU/mL、至少约1500IU/mL、至少约2000IU/mL、至少约2500IU/mL、至少约2600IU/mL、至少约2700IU/mL、至少约2800IU/mL、至少约2900IU/mL、至少约3000IU/mL、至少约3100IU/mL、至少约3200IU/mL、至少约3300IU/mL、至少约3400IU/mL、至少约3500IU/mL、至少约4000IU/mL、至少约4500IU/mL、至少约5000IU/mL、至少约5500IU/mL、至少约6000IU/mL、至少约6500IU/mL、至少约7000IU/mL、至少约7500IU/mL、至少约8000IU/mL、至少约8500IU/mL、或至少约9000IU/mL。
例如，本申请的TIL可以为源自本申请的肿瘤组织的碎片的TIL。例如，可以通过将肿瘤组织处理成肿瘤碎片获得本申请的TIL。例如，本申请的肿瘤碎片的体积约为1-27立方毫米。例如，本申请的肿瘤碎片的体积约为约1立方毫米、约2立方毫米、约3立方毫米、约4立方毫米、约5立方毫米、约6立方毫米、约7立方毫米、约8立方毫米、约9立方毫米、约10立方毫米、约11立方毫米、约12立方毫米、约13立方毫米、约15立方毫米、约17立方毫米、约19立方毫米、约20立方毫米、约21立方毫米、约23立方毫米、约24立方毫米、约25立方毫米、约26立方毫米或约27立方毫米。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。例如，本申请的细胞因子可以是白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由第一TIL群体外扩增获得的TIL群，所述第一TIL群为源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL群；(B)使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。例如，本申请的细胞因子可以是白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段。
例如，可以先将在一定的时间和/或一定位置的源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL群与T细胞生长因子接触，得到体外TIL群，一方面可以继续培养所述体外TIL群，进行步骤(B)，另一方面可以先冷冻保存所述体外TIL群，在有需要的时候复苏所述体外TIL群，进行步骤(B)。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。例如，本申请的细胞因子可以是白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。例如，本申请的细胞因子可以是白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段。
例如本申请的术语中，本申请的第一阶段体外扩增可以与以上方面的方法中的步骤(A)任意替换使用。例如本申请的术语中，本申请的第二阶段体外扩增可以与以上方面的方法中的步骤(B)任意替换使用。例如本申请的术语中，本申请的经第一阶段体外扩增的TIL可以与经以上方面的方法中步骤(A)得到的第二TIL群任意替换使用。例如本申请的术语中，本申请的经第二阶段体外扩增的TIL可以与经以上方面的方法中步骤(B)得到的第三TIL群任意替换使用。例如本申请的术语中，如有需要，本申请的第三阶段体外扩增可以与以上方面的方法中任意增加的步骤(C)任意替换使用。例如本申请的术语中，如有需要，本申请的经第三阶段体外扩增的TIL可以与经以上方面的方法中任意增加的步骤(C)得到的第四TIL 群任意替换使用。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与多种T细胞生长因子接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与多种T细胞生长因子接触、与多种T细胞激活剂接触、使所述TIL的至少一种细胞因子的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。例如，本申请的细胞因子可以是白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与多种T细胞生长因子接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与多种T细胞生长因子接触、与多种T细胞激活剂接触、使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与多种T细胞生长因子接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与多种T细胞生长因子接触、与多种T细胞激活剂接触、使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，且使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与多种T细胞生长因子接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与多种T细胞生长因子接触、与多种T细胞激活剂接触、使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，且在至少2小时后使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与多种T细胞生长因子接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与多种T细胞生长因子接触、与多种T细胞激活剂接触、使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，且在至少2小时后使所述TIL与饲养细胞共培养，所述饲养细胞可以包含外周单个核细胞，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与多种T细胞生长因子接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与多种T细胞生长因子接触、与多种T细胞激活剂接触、使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，且在至少2小时后使所述TIL与饲养细胞共培养，所述饲养细胞可以包含外周单个核细胞，可以以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触、与多种T细胞激活剂接触、使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，且在至少2小时后使所述TIL与饲养细胞共培养，所述饲养细胞可以包含外周单个核细胞，可以以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触，所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约300IU/mL；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触，所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约300IU/mL、与CD3抗体接触，CD3抗体在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度至少约30ng/mL、使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，且在至少2小时后使所述TIL与饲养细胞共培养，所述饲养细胞可以包含外周单个核细胞，可以以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触、与包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质接触、使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，且使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触；其中，经所述步骤(A)得 到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触、与包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质接触，所述纳米基质的直径可以为约1纳米至约500纳米，每mg所述纳米基质可以分别包含CD3抗体以及CD28抗体各为约25μg、使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，且使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触、与包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质接触，所述纳米基质的直径可以为约1纳米至约500纳米，每mg所述纳米基质可以分别包含CD3抗体以及CD28抗体各为约25μg，可以以约1:100-约1:2000的所述纳米基质与所述TIL的比例添加至所述TIL的细胞培养基中、使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，且使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触，所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约300IU/mL；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触，所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约300IU/mL、与包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质接触，所述纳米基质的直径可以为约1纳米至约500纳米，每mg所述纳米基质可以分别包含CD3抗体以及CD28抗体各为约25μg，可以以约1:100-约1:2000的所述纳米基质与所述TIL的比例添加至所述TIL的细胞培养基中、使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，且使所述TIL与饲养细胞共培养，所述饲养细胞可以包含外周单个核细胞，可以以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法。从受试者组织样品获得的TIL细胞的方法可以是患者手术取得原位肿瘤样本或转移肿瘤样本，重量可以至少约1g，也可以多块组织合并。肿瘤组织在样本运输液，例如可以是商业常用的肿瘤组织运输液、肿瘤组织保存液或肿瘤组织转运液，内约2-8度运输，48小时内处理。组织块可以机械破碎至每块约1-27立方毫米大小，转移入透气培养袋或Grex中，加入T细胞无血清培养基和浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2培养 约3-14天。可以将收获的TIL细胞冻存后再复苏，也可以直接收集培养基中细胞，转移入透气培养袋、或Grex、或Xuri设备，T细胞无血清培养基可以添加本申请的CD28抗体、CD3抗体以及CD28抗体、包含CD3抗体以及CD28抗体的磁珠(例如Dynabeads)和/或包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质(例如transACT)、浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2，以及用携带IL-12和/或其功能活性片段的逆转录病毒进行转导使所述TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的TIL细胞比例提高至少5％，活化本申请的TIL一定时间后，添加辐照PBMC(TIL与PBMC按照比率约1:40-约1:400)，扩增培养约3-14天。可以使用细胞处理系统收集培养基中细胞，清洗冻存，并检测。最终产品CD3比例可以大于80％，细胞活率可以大于50％，大于80％的T细胞可以为记忆效应T细胞和效应T细胞。经刺激后可以分泌IFN-γ，和/或可以具有活化T细胞比例上调的特征。
一方面，本申请提供一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，本申请的TIL可以根据本申请的培养方法培养得到。例如，本申请提供的TIL可以包含一种或一个批次的本申请的培养方法培养得到TIL。例如，本申请提供的TIL可以包含多种或多个批次的本申请的培养方法培养得到并以任意比例组合的TIL。
在一些实施方式中，可以将使用本申请方法扩增的TIL作为药物组合物施用于患者。在一些实施方式中，药物组合物可以是TIL在无菌缓冲液中的悬液。使用本申请的PBMC扩增的TIL可以通过本领域已知的任何合适途径施用。在一些实施方式中，T细胞可以以单次动脉内或静脉内输注施用，输注可以持续约30至60分钟。其他合适的施用途径可以包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
在一些实施方式中，可以施用任何合适剂量的TIL。在一些实施方式中，例如当肿瘤是黑色素瘤时，可以施用约2.3×10
9至约13.7×10
10个TIL。在一些实施方式中，可以施用约1×10
9至约12×10
10个TIL。在一些实施方式中，可以施用约1.2×10
10至约4.3×10
10个TIL。在一些实施方式中，可以施用约3×10
10至约12×10
10个TIL。在一些实施方式中，可以施用约4×10
10至约10×10
10个TIL。在一些实施方式中，可以施用约5×10
10至约8×10
10个TIL。在一些实施方式中，可以施用约6×10
10至约8×10
10个TIL。在一些实施方式中，可以施用约7×10
10至约8×10
10个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约2.3×10
9至约13.7×10
10。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约1×10
9至约12×10
10个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约1.2×10
10至约4.3×10
10个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约3×10
10至约12×10
10个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约4×10
10至约10×10
10个TIL。 在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约5×10
10至约8×10
10个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约6×10
10至约8×10
10个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约7×10
10至约8×10
10个TIL。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的数量可以为约1×10
6、约2×10
6、约3×10
6、约4×10
6、约5×10
6、约6×10
6、约7×10
6、约8×10
6、约9×10
6、约1×10
7、约2×10
7、约3×10
7、约4×10
7、约5×10
7、约6×10
7、约7×10
7、约8×10
7、约9×10
7、约1×10
8、约2×10
8、约3×10
8、约4×10
8、约5×10
8、约6×10
8、约7×10
8、约8×10
8、约9×10
8、约1×10
9、约2×10
9、约3×10
9、约4×10
9、约5×10
9、约6×10
9、约7×10
9、约8×10
9、约9×10
9、约1×10
10、约2×10
10、约3×10
10、约4×10
10、约5×10
10、约6×10
10、约7×10
10、约8×10
10、约9×10
10、约1×10
11、约2×10
11、约3×10
11、约4×10
11、约5×10
11、约6×10
11、约7×10
11、约8×10
11、约9×10
11、约1×10
12、约2×10
12、约3×10
12、约4×10
12、约5×10
12、约6×10
12、约7×10
12、约8×10
12、约9×10
12、约1×10
13、约2×10
13、约3×10
13、约4×10
13、约5×10
13、约6×10
13、约7×10
13、约8×10
13，或约9×10
13。在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL数量的范围可以为约1×10
6至5×10
6、约5×10
6至1×10
7、约1×10
7至5×10
7、约5×10
7至1×10
8、约1×10
8至5×10
8、约5×10
8至1×10
9、约1×10
9至5×10
9、约5×10
9至1×10
10、约1×10
10至5×10
10、约5×10
10至1×10
11、约5×10
11至1×10
12、约1×10
12至5×10
12，或约5×10
12至1×10
13。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度可以小于组合物的例如约100％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％、约0.01％、约0.009％、约0.008％、约0.007％、约0.006％、约0.005％、约0.004％、约0.003％、约0.002％、约0.001％、约0.0009％、约0.0008％、约0.0007％、约0.0006％、约0.0005％、约0.0004％、约0.0003％、约0.0002％，或约0.0001％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度可以大于组合物的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19.75％、约19.50％、约19.25％、约19％、约18.75％、约18.50％、约18.25％、约18％、约17.75％、约17.50％、约17.25％、约17％、约16.75％、约16.50％、约16.25％、约16％、约15.75％、约15.50％、约15.25％、约15％、约14.75％、约14.50％、约14.25％、约14％、约13.75％、约13.50％、 约13.25％、约13％、约12.75％、约12.50％、约12.25％、约12％、约11.75％、约11.50％、约11.25％、约11％、约10.75％、约10.50％、约10.25％、约10％、约9.75％、约9.50％、约9.25％、约9％、约8.75％、约8.50％、约8.25％、约8％、约7.75％、约7.50％、约7.25％、约7％、约6.75％、约6.50％、约6.25％、约6％、约5.75％、约5.50％、约5.25％、约5％、约4.75％、约4.50％、约4.25％、约4％、约3.75％、约3.50％、约3.25％、约3％、约2.75％、约2.50％、约2.25％、约2％、约1.75％、约1.50％、约125％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％、约0.01％、约0.009％、约0.008％、约0.007％、约0.006％、约0.005％、约0.004％、约0.003％、约0.002％、约0.001％、约0.0009％、约0.0008％、约0.0007％、约0.0006％、约0.0005％、约0.0004％、约0.0003％、约或0.0002％，或者约0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度范围可以为组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％，或约1％至约10％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度范围可以为组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、或约0.1％至约0.9％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的量可以等于或小于约10g、约9.5g、约9.0g、约8.5g、约8.0g、约7.5g、约7.0g、约6.5g、约6.0g、约5.5g、约5.0g、约4.5g、约4.0g、约3.5g、约3.0g、约2.5g、约2.0g、约1.5g、约1.0g、约0.95g、约0.9g、约0.85g、约0.8g、约0.75g、约0.7g、约0.65g、约0.6g、约0.55g、约0.5g、约0.45g、约0.4g、约0.35g、约0.3g、约0.25g、约0.2g、约0.15g、约0.1g、约0.09g、约0.08g、约0.07g、约0.06g、约0.05g、约0.04g、约0.03g、约0.02g、约0.01g、约0.009g、约0.008g、约0.007g、约0.006g、约0.005g、约0.004g、约0.003g、约0.002g、约0.001g、约0.0009g、约0.0008g、约0.0007g、约0.0006g、约0.0005g、约0.0004g、约0.0003g、约0.0002g，或者约0.0001g。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的量可以大于约0.0001g、约0.0002g、 约0.0003g、约0.0004g、约0.0005g、约0.0006g、约0.0007g、约0.0008g、约0.0009g、约0.001g、约0.0015g、约0.002g、约0.0025g、约0.003g、约0.0035g、约0.004g、约0.0045g、约0.005g、约0.0055g、约0.006g、约0.0065g、约0.007g、约0.0075g、约0.008g、约0.0085g、约0.009g、约0.0095g、约0.01g、约0.015g、约0.02g、约0.025g、约0.03g、约0.035g、约0.04g、约0.045g、约0.05g、约0.055g、约0.06g、约0.065g、约0.07g、约0.075g、约0.08g、约0.085g、约0.09g、约0.095g、约0.1g、约0.15g、约0.2g、约0.25g、约0.3g、约0.35g、约0.4g、约0.45g、约0.5g、约0.55g、约0.6g、约0.65g、约0.7g、约0.75g、约0.8g、约0.85g、约0.9g、约0.95g、约1g、约1.5g、约2g、约2.5g、约3g、约3.5g、约4g、约4.5g、约5g、约5.5g、约6g、约6.5g、约7g、约7.5g、约8g、约8.5g、约9g、约9.5g，或者约10g。
在一些实施方式中，TIL可以单剂量施用。此种施用可以通过注射，例如可以静脉内注射。在一些实施方式中，TIL可以多剂量施用。剂量可以是每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。剂量可以是每月一次、每两周一次、每周一次或每2天一次。在一些实施方式中，TIL的施用可以连续施用。
一方面，本申请提供一种药物组合物。在一些实施方式中，其可以包含本申请的TIL和/或本申请的组合物，与药学上可接受的载体。
一方面，本申请提供一种试剂盒，本申请的试剂盒可以包含本申请培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)方法的T细胞激活剂、T细胞生长因子和/或饲养细胞与记载本申请培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)方法的步骤的说明书。一方面，本申请提供一种试剂盒，本申请试剂盒可以包含本申请的TIL和/或本申请的药物组合物。
一方面，本申请提供一种影响肿瘤细胞生长的方法，可以包括向受试者施用本申请的TIL和/或本申请的药物组合物。在一些实施方式中，影响肿瘤生长可以包含肿瘤的体积减少到施用前的例如约99％、约95％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％。
一方面，本申请提供本申请的TIL和/或本申请的药物组合物在制备药物中的应用，本申请的药物可以用于预防和/或治疗肿瘤。在一些实施方式中，本申请的肿瘤选自实体瘤。在一些实施方式中，本申请的肿瘤可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
一方面，本申请提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，可以包括向受试者施用本申请的TIL 和/或本申请的药物组合物。在一些实施方式中，本申请的肿瘤选自实体瘤。在一些实施方式中，本申请的肿瘤可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
一方面，本申请提供一种本申请的TIL和/或本申请的药物组合物，其可以用于预防和/或治疗肿瘤。在一些实施方式中，本申请的肿瘤选自实体瘤。在一些实施方式中，本申请的肿瘤可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
使TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强
1.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
2.根据技术方案1所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与所述饲养细胞共培养之后，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
3.根据技术方案1-2中任一项所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与所述饲养细胞共培养之前，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
4.根据技术方案1-3中任一项所述的方法，所述方法包含：在所述TIL与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触之后且在所述TIL与所述饲养细胞共培养之前使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
5.根据技术方案1-4中任一项所述的方法，所述方法包含：在所述TIL与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触基本上同时使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
6.根据技术方案1-5中任一项所述的方法，所述方法包含：在所述TIL与所述饲养细胞共培养基本上同时使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
7.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中所述TIL包含与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养获得的TIL。
8.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中所述TIL包含使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL。
9.根据技术方案1-8中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
10.根据技术方案9所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
11.根据技术方案10所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
12.根据技术方案1-11中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述转录因子和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
13.根据技术方案12所述的方法，其中所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
14.根据技术方案12-13中任一项所述的方法，其中编码所述转录因子和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
15.根据技术方案13-14中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
16.根据技术方案15所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
17.根据技术方案16所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
18.根据技术方案1-17中任一项所述的方法，所述转录因子和/或其功能活性片段包含激活性转录因子。
19.根据技术方案1-18中任一项所述的方法，所述转录因子包含c-Jun和/或其功能活性片段。
20.根据技术方案1-19中任一项所述的方法，所述转录因子包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列。
21.根据技术方案1-20中任一项所述的方法，编码所述转录因子的核苷酸序列选自以下组：SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73。
22.根据技术方案1-21中任一项所述的方法，所述转录因子和/或其功能活性片段的表达提高包含所述转录因子和/或其功能活性片段的合成量提高。
23.根据技术方案1-22中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
24.根据技术方案1-23中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
25.根据技术方案1-24中任一项所述的方法，所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
26.根据技术方案1-25中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
27.根据技术方案26所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
28.根据技术方案26-27中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
29.根据技术方案26-28中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
30.根据技术方案29所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行至少约7天。
31.根据技术方案29-30中任一项所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行约7天至约14天。
32.根据技术方案29-31中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行至少约7天。
33.根据技术方案29-32中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行约7天至约14天。
34.根据技术方案1-33中任一项所述的方法，使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
35.根据技术方案1-34中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或 所述T细胞生长因子接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
36.根据技术方案1-35中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
37.根据技术方案1-36中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
38.根据技术方案1-37中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
39.根据技术方案1-38中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
40.根据技术方案1-39中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
41.根据技术方案1-40中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
42.根据技术方案1-41中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
43.根据技术方案1-42中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
44.根据技术方案43所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
45.根据技术方案1-44中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
46.根据技术方案45所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
47.根据技术方案45-46中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
48.根据技术方案45-47中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
49.根据技术方案1-48中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种：分化簇80(CD80)、CD86、CD276、4-1BB配体(4-1BBL)、CD27、CD30、 CD134、CD275、CD40、CD258、以及它们的功能活性片段。
50.根据技术方案1-49中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、疱疹病毒进入介质(HVEM)、CD40L、OX40和4-1BB。
51.根据技术方案1-50中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。
52.根据技术方案1-51中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂。
53.根据技术方案1-52中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
54.根据技术方案1-53中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD28激动剂。
55.根据技术方案1-54中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段。
56.根据技术方案1-55中任一项所述的方法，所述使TIL与所述T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；和(3)将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
57.根据技术方案56所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约30ng/mL。
58.根据技术方案56-57中任一项所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约30ng/mL-约300ng/mL。
59.根据技术方案56-58中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
60.根据技术方案56-59中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
61.根据技术方案59-60中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
62.根据技术方案56-61中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
63.根据技术方案56-62中任一项所述的方法，每mg所述固相介质中包含的每一种所述T细胞激活剂的量各自独立地至少为约25μg。
64.根据技术方案56-63中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述 TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
65.根据技术方案56-64中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
66.根据技术方案1-65中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
67.根据技术方案66所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
68.根据技术方案66-67中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
69.根据技术方案66-68中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
70.根据技术方案1-69中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
71.根据技术方案1-70中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
72.根据技术方案1-71中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
73.根据技术方案1-72中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
74.根据技术方案1-73中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
75.根据技术方案1-74中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
76.根据技术方案75所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
77.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强， 且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
78.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
(B)使所述第二TIL群的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
79.根据技术方案78所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
80.根据技术方案78-79中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
81.根据技术方案77-80中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
82.根据技术方案77-81中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约7天至约14天。
83.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群。
84.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
(B)使所述第二TIL群的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群。
85.根据技术方案84所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
86.根据技术方案84-85中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
87.根据技术方案83-86中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
88.根据技术方案83-87中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约0天至约8天。
89.根据技术方案83-88中任一项所述的方法，所述步骤(C)进行约5天至约14天。
90.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群；
(D)使所述第四TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(D)得到第五TIL群。
91.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
(B)使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群；
(D)使所述第四TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(D)得到第五TIL群。
92.根据技术方案91所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
93.根据技术方案91-92中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
94.根据技术方案90-93中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
95.根据技术方案90-94中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约0天至约4天。
96.根据技术方案90-95中任一项所述的方法，所述步骤(C)进行约0天至约4天。
97.根据技术方案90-96中任一项所述的方法，所述步骤(D)进行约5天至约14天。
98.根据技术方案77-97中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
99.根据技术方案98所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
100.根据技术方案99所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
101.根据技术方案77-100中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述转录因子和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
102.根据技术方案101所述的方法，其中所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
103.根据技术方案101-102中任一项所述的方法，其中编码所述转录因子和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
104.根据技术方案102-103中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
105.根据技术方案104所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
106.根据技术方案105所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
107.根据技术方案77-106中任一项所述的方法，所述转录因子和/或其功能活性片段包含激活性转录因子。
108.根据技术方案77-107中任一项所述的方法，所述转录因子包含c-Jun和/或其功能活性片段。
109.根据技术方案77-108中任一项所述的方法，所述转录因子包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列。
110.根据技术方案77-109中任一项所述的方法，编码所述转录因子的核苷酸序列选 自以下组：SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73。
111.根据技术方案77-110中任一项所述的方法，所述转录因子和/或其功能活性片段的表达提高包含所述转录因子和/或其功能活性片段的合成量提高。
112.根据技术方案77-111中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
113.根据技术方案77-112中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
114.根据技术方案77-113中任一项所述的方法，所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
115.根据技术方案77-114中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
116.根据技术方案77-115中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
117.根据技术方案77-116中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
118.根据技术方案77-116中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
119.根据技术方案77-118中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
120.根据技术方案77-119中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
121.根据技术方案77-120中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
122.根据技术方案77-121中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
123.根据技术方案77-122中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
124.根据技术方案77-123中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
125.根据技术方案77-124所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
126.根据技术方案77-125中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种：分化簇80(CD80)、CD86、CD276、4-1BB配体(4-1BBL)、CD27、CD30、CD134、CD275、CD40、CD258、以及它们的功能活性片段。
127.根据技术方案77-126中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、疱疹病毒进入介质(HVEM)、CD40L、OX40和4-1BB。
128.根据技术方案77-127中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。
129.根据技术方案77-128中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂。
130.根据技术方案77-129中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
131.根据技术方案77-130中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD28激动剂。
132.根据技术方案77-131中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段。
133.根据技术方案77-132中任一项所述的方法，所述使TIL与所述T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；和(3)将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
134.根据技术方案133所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约30ng/mL。
135.根据技术方案133-134中任一项所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约30ng/mL-约300ng/mL。
136.根据技术方案133-135中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
137.根据技术方案133-136中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
138.根据技术方案136-137中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
139.根据技术方案133-138中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
140.根据技术方案133-139中任一项所述的方法，每mg所述固相介质中包含的每一种所述T细胞激活剂的量各自独立地至少为约25μg。
141.根据技术方案133-140中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
142.根据技术方案133-141中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
143.根据技术方案77-142中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
144.根据技术方案77-143中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
145.根据技术方案77-144中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
146.根据技术方案77-145中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
147.根据技术方案77-146中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
148.根据技术方案77-147中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
149.根据技术方案148所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
150.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触。
151.根据技术方案150所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与CD28激动剂接触之后，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
152.根据技术方案150-151中任一项所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与CD28激动剂接触之前，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
153.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中所述TIL包含与CD28激动剂接触获得的TIL。
154.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL与CD28激动剂接触，其中所述TIL包含使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL。
155.根据技术方案150-154中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
156.根据技术方案155所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
157.根据技术方案156所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
158.根据技术方案150-157中任一项所述的方法，与在体外扩增阶段未曾与所述CD28激动剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与所述CD28激动剂接触过的所述TIL显示出改善的基因编辑效果。
159.根据技术方案158所述的方法，所述改善的基因编辑效果包含提高的基因敲除效率。
160.根据技术方案150-159中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述转录因子和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
161.根据技术方案160所述的方法，其中所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
162.根据技术方案160-161中任一项所述的方法，其中编码所述转录因子和/或其功 能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
163.根据技术方案161-162中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
164.根据技术方案163所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
165.根据技术方案164所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
166.根据技术方案150-165中任一项所述的方法，所述转录因子和/或其功能活性片段包含激活性转录因子。
167.根据技术方案150-166中任一项所述的方法，所述转录因子包含c-Jun和/或其功能活性片段。
168.根据技术方案150-167中任一项所述的方法，所述转录因子包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列。
169.根据技术方案150-168中任一项所述的方法，编码所述转录因子的核苷酸序列选自以下组：SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73。
170.根据技术方案150-169中任一项所述的方法，所述转录因子和/或其功能活性片段的表达提高包含所述转录因子和/或其功能活性片段的合成量提高。
171.根据技术方案150-170中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
172.根据技术方案150-171中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
173.根据技术方案150-172中任一项所述的方法，所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
174.根据技术方案150-173中任一项所述的方法，其中，使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与CD28激动剂接触。
175.根据技术方案174所述的方法，其中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使经所述第一阶段体外扩增的TIL与所述CD28激动剂接触。
176.根据技术方案175所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行至少约7天。
177.根据技术方案175-176中任一项所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行约7天至约14天。
178.根据技术方案175-177中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行至少约7天。
179.根据技术方案175-178中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行约7天至约14天。
180.根据技术方案150-179中任一项所述的方法，所述CD28激动剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段、和/或CD86和/或其功能活性片段。
181.根据技术方案150-180中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述CD28激动剂之外的其它T细胞激活剂接触。
182.根据技术方案181所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
183.根据技术方案181-182中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
184.根据技术方案181-183中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
185.根据技术方案181-184中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触。
186.根据技术方案181-185中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。
187.根据技术方案181-186中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含CD3激动剂。
188.根据技术方案181-187中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
189.根据技术方案181-188中任一项所述的方法，所述使TIL与所述CD28激动剂以 及所述其它T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；(3)将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
190.根据技术方案189所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少约30ng/mL。
191.根据技术方案189-190中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为约30ng/mL-约300ng/mL。
192.根据技术方案189-191中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
193.根据技术方案181-192中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
194.根据技术方案192-193中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
195.根据技术方案189-194中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
196.根据技术方案189-195中任一项所述的方法，每mg所述固相介质包含至少约25μg的所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂。
197.根据技术方案189-196中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
198.根据技术方案189-197中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
199.根据技术方案150-198中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL在与CD28激动剂接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
200.根据技术方案199所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
201.根据技术方案199-200中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与CD28激动剂接触且使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
202.根据技术方案199-201中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
203.根据技术方案199-202中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
204.根据技术方案199-203中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
205.根据技术方案199-204中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
206.根据技术方案199-204中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
207.根据技术方案199-206中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
208.根据技术方案199-207中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
209.根据技术方案199-208中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
210.根据技术方案199-209中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
211.根据技术方案199-210中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
212.根据技术方案199-211中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
213.根据技术方案199-212中任一项所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
214.根据技术方案150-213中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
215.根据技术方案214所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
216.根据技术方案214-215中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使 所述TIL与所述CD28激动剂以及所述T细胞生长因子接触。
217.根据技术方案214-216中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
218.根据技术方案214-217中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及所述T细胞生长因子接触。
219.根据技术方案214-218中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
220.根据技术方案214-219中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
221.根据技术方案214-220中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
222.根据技术方案214-221中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
223.根据技术方案150-222中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
224.根据技术方案223所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
225.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
226.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
(B)使所述第二TIL群的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
227.根据技术方案226所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
228.根据技术方案226-227中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
229.根据技术方案225-228中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
230.根据技术方案225-229中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约7天至约14天。
231.根据技术方案225-230中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
232.根据技术方案231所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
233.根据技术方案232所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
234.根据技术方案225-233中任一项所述的方法，与在体外扩增阶段未曾与所述CD28激动剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与所述CD28激动剂接触过的所述TIL显示出改善的基因编辑效果。
235.根据技术方案234所述的方法，所述改善的基因编辑效果包含提高的基因敲除效率。
236.根据技术方案225-235中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述转录因子和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
237.根据技术方案236所述的方法，其中所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
238.根据技术方案236-237中任一项所述的方法，其中编码所述转录因子和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
239.根据技术方案237-238中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
240.根据技术方案239所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
241.根据技术方案240所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
242.根据技术方案225-241中任一项所述的方法，所述转录因子和/或其功能活性片段包含激活性转录因子。
243.根据技术方案225-242中任一项所述的方法，所述转录因子包含c-Jun和/或其功能活性片段。
244.根据技术方案225-243中任一项所述的方法，所述转录因子包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列。
245.根据技术方案225-244中任一项所述的方法，编码所述转录因子的核苷酸序列选自以下组：SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73。
246.根据技术方案225-245中任一项所述的方法，所述转录因子和/或其功能活性片段的表达提高包含所述转录因子和/或其功能活性片段的合成量提高。
247.根据技术方案225-246中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
248.根据技术方案225-247中任一项所述的方法，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
249.根据技术方案225-248中任一项所述的方法，所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
250.根据技术方案225-249中任一项所述的方法，所述CD28激动剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段、和/或CD86和/或其功能活性片段。
251.根据技术方案225-250中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及其它T细胞激活剂接触。
252.根据技术方案251所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。
253.根据技术方案251-252中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含CD3激动剂。
254.根据技术方案251-253中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
255.根据技术方案251-254中任一项所述的方法，所述使TIL与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；(3)将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
256.根据技术方案255所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少约30ng/mL。
257.根据技术方案255-256中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为约30ng/mL-约300ng/mL。
258.根据技术方案255-257中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
259.根据技术方案255-258中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
260.根据技术方案258-259中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
261.根据技术方案255-260中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
262.根据技术方案255-261中任一项所述的方法，每mg所述固相介质包含至少约25μg的所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂。
263.根据技术方案255-262中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
264.根据技术方案255-263中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
265.根据技术方案225-264中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触至少约2小时之后与饲养细胞共培养。
266.根据技术方案265所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
267.根据技术方案265-266中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
268.根据技术方案265-267中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
269.根据技术方案265-268中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
270.根据技术方案265-269中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
271.根据技术方案265-270中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
272.根据技术方案265-271中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
273.根据技术方案265-272中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
274.根据技术方案265-273中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
275.根据技术方案265-274中任一项所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
276.根据技术方案225-275中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及T细胞生长因子接触。
277.根据技术方案225-276中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
278.根据技术方案225-277中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
279.根据技术方案225-278中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
280.根据技术方案225-279中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
281.根据技术方案225-280中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
282.根据技术方案281所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫 米。
283.一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述TIL经过技术方案1-282中任一项所述的方法获得。
284.一种组合物，其包含技术方案283所述的TIL。
285.一种药物组合物，其包含技术方案283所述的TIL和/或技术方案284所述的组合物，以及任选地药学上可接受的载体。
286.一种影响肿瘤细胞生长的方法，包含向受试者施用技术方案283所述的TIL、技术方案284所述的组合物和/或技术方案285所述的药物组合物。
287.技术方案283所述的TIL、技术方案284所述的组合物和/或技术方案285所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
288.根据技术方案287所述的应用，其中，所述肿瘤为实体瘤。
289.根据技术方案287-288中任一项所述的应用，其中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
例如，本申请的方法中使TIL的至少一种目标基因的表达提高和/或活性增强可以包含，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述转录因子和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
例如，其中所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强可以包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。例如，其中编码所述转录因子和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。例如，当所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段可以长期和/或持续在所述TIL中表达。
例如，其中所述载体包含病毒载体。例如，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。例如，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
例如，所述转录因子和/或其功能活性片段包含使免疫细胞增殖能力和/或细胞杀伤活性提高的转录因子。
例如，所述转录因子和/或其功能活性片段包含c-Jun或其功能活性片段。
例如，所述转录因子包含如SEQ ID NO：71所示的序列。
例如，编码所述转录因子的核苷酸序列选自以下组：SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73。
例如，所述转录因子和/或其功能活性片段的表达提高包含所述转录因子和/或其功能活性片段的合成量提高。例如，本申请的方法中与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性 未改变的TIL相比，使所述TIL的至少一种转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例可以提高至少约5％以上。例如，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例可以提高至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、或至少约5％。例如，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例可以从0％到可以观测的细胞比例。例如，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例可以提高到至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、或至少约1％。例如，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例可以通过细胞流式仪对共同表达的标记物进行检测。
例如，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
例如，与转录因子和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。例如，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例可以提高至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、或至少约5％。
例如，所述使所述TIL的转录因子和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。例如，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例可以为至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、 或至少约5％。例如，表达转录因子和/或其功能活性片段的细胞比例可以通过细胞流式仪对共同表达的标记物进行检测。
使TIL的微小RNA和/或其功能活性片段
的表达提高和/或活性增强
1.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
2.根据实施方案1所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与所述饲养细胞共培养之后，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
3.根据实施方案1-2中任一项所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与所述饲养细胞共培养之前，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，所述方法包含：在所述TIL与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触之后且在所述TIL与所述饲养细胞共培养之前使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，所述方法包含：在所述TIL与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触基本上同时使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，所述方法包含：在所述TIL与所述饲养细胞共培养基本上同时使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
7.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中所述TIL包含与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养获得的TIL。
8.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中所述TIL包含使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
10.根据实施方案9所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提 高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
11.根据实施方案10所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述微小RNA和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
13.根据实施方案12所述的方法，其中所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
14.根据实施方案12-13中任一项所述的方法，其中编码所述微小RNA和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
15.根据实施方案13-14中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
16.根据实施方案15所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
17.根据实施方案16所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段包含使免疫细胞增殖能力和/或细胞杀伤活性提高的微小RNA。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段包含miR155或其功能活性片段。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，所述微小RNA包含如SEQ ID NO：74、75、79和/或82所示的序列。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，所述微小RNA与标记序列直接或间接连接，所述标记序列在细胞中表达为细胞表面的标记物。
22.根据实施方案21所述的方法，所述标记序列编码EGFR或其截短体。
23.根据实施方案21-22中任一项所述的方法，所述标记序列编码EGFR的胞外结构域和/或跨膜域。
24.根据实施方案21-23中任一项所述的方法，所述标记序列编码的表达产物不包含EGFR的胞内结构域。
25.根据实施方案21-24中任一项所述的方法，所述标记序列包含如SEQ ID NO：78和/或80所示的序列。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高包含所述微小RNA和/或其功能活性片段的合成量提高。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
29.根据实施方案1-28中任一项所述的方法，所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
31.根据实施方案30所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
32.根据实施方案30-31中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
33.根据实施方案30-32中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
34.根据实施方案33所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行至少约7天。
35.根据实施方案33-34中任一项所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行约7天至约14天。
36.根据实施方案33-35中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行至少约7天。
37.根据实施方案33-36中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行约7天至约14天。
38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
39.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
41.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
42.根据实施方案1-41中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
46.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
47.根据实施方案1-46中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
48.根据实施方案47所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
49.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
50.根据实施方案49所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
51.根据实施方案1-50中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述 TIL与所述T细胞激活剂接触。
53.根据实施方案1-52中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种：分化簇80(CD80)、CD86、CD276、4-1BB配体(4-1BBL)、CD27、CD30、CD134、CD275、CD40、CD258、以及它们的功能活性片段。
54.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、疱疹病毒进入介质(HVEM)、CD40L、OX40和4-1BB。
55.根据实施方案1-54中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。
56.根据实施方案1-55中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂。
57.根据实施方案1-56中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
58.根据实施方案1-57中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD28激动剂。
59.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段。
60.根据实施方案1-59中任一项所述的方法，所述使TIL与所述T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；和(3)将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
61.根据实施方案60所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约30ng/mL。
62.根据实施方案60-61中任一项所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约30ng/mL-约300ng/mL。
63.根据实施方案60-62中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
64.根据实施方案60-63中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
65.根据实施方案63-64中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
66.根据实施方案60-65中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
67.根据实施方案60-66中任一项所述的方法，每mg所述固相介质中包含的每一种所述T细胞激活剂的量各自独立地至少为约25μg。
68.根据实施方案60-67中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
69.根据实施方案60-68中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
70.根据实施方案1-69中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
71.根据实施方案70所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
72.根据实施方案70-71中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
73.根据实施方案70-72中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
74.根据实施方案1-73中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
75.根据实施方案1-74中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
76.根据实施方案1-75中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
77.根据实施方案1-76中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
78.根据实施方案1-77中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
79.根据实施方案1-78中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
80.根据实施方案79所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
81.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
82.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
(B)使所述第二TIL群的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
83.根据实施方案82所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
84.根据实施方案82-83中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
85.根据实施方案81-84中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
86.根据实施方案81-85中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约7天至约14天。
87.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群。
88.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
(B)使所述第二TIL群的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B) 得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群。
89.根据实施方案88所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
90.根据实施方案88-89中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
91.根据实施方案87-90中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
92.根据实施方案87-91中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约0天至约8天。
93.根据实施方案87-92中任一项所述的方法，所述步骤(C)进行约5天至约14天。
94.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群；
(D)使所述第四TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(D)得到第五TIL群。
95.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
(B)使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群；
(D)使所述第四TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(D)得到第五TIL群。
96.根据实施方案95所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
97.根据实施方案95-96中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
98.根据实施方案94-97中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
99.根据实施方案94-98中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约0天至约4天。
100.根据实施方案94-99中任一项所述的方法，所述步骤(C)进行约0天至约4天。
101.根据实施方案94-100中任一项所述的方法，所述步骤(D)进行约5天至约14天。
102.根据实施方案81-101中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
103.根据实施方案102所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
104.根据实施方案103所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
105.根据实施方案81-104中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述微小RNA和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
106.根据实施方案105所述的方法，其中所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
107.根据实施方案105-106中任一项所述的方法，其中编码所述微小RNA和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
108.根据实施方案106-107中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
109.根据实施方案108所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
110.根据实施方案109所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
111.根据实施方案81-110中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段包含使免疫细胞增殖能力和/或细胞杀伤活性提高的微小RNA。
112.根据实施方案81-111中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段包含miR155或其功能活性片段。
113.根据实施方案81-112中任一项所述的方法，所述微小RNA包含如SEQ ID NO：74、75、79和/或82所示的序列。
114.根据实施方案81-113中任一项所述的方法，所述微小RNA与标记序列直接或间接连接，所述标记序列在细胞中表达为细胞表面的标记物。
115.根据实施方案114所述的方法，所述标记序列编码EGFR或其截短体。
116.根据实施方案114-115中任一项所述的方法，所述标记序列编码EGFR的胞外结构域和/或跨膜域。
117.根据实施方案114-116中任一项所述的方法，所述标记序列编码的表达产物不包含EGFR的胞内结构域。
118.根据实施方案114-117中任一项所述的方法，所述标记序列包含如SEQ ID NO：78和/或80所示的序列。
119.根据实施方案81-118中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高包含所述微小RNA和/或其功能活性片段的合成量提高。
120.根据实施方案81-119中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
121.根据实施方案81-120中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
122.根据实施方案81-121中任一项所述的方法，所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
123.根据实施方案81-122中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
124.根据实施方案81-123中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
125.根据实施方案81-124中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂 和/或所述T细胞生长因子接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
126.根据实施方案81-124中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
127.根据实施方案81-126中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
128.根据实施方案81-127中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
129.根据实施方案81-128中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
130.根据实施方案81-129中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
131.根据实施方案81-130中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
132.根据实施方案81-131中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
133.根据实施方案132所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
134.根据实施方案81-133中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种：分化簇80(CD80)、CD86、CD276、4-1BB配体(4-1BBL)、CD27、CD30、CD134、CD275、CD40、CD258、以及它们的功能活性片段。
135.根据实施方案81-134中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、疱疹病毒进入介质(HVEM)、CD40L、OX40和4-1BB。
136.根据实施方案81-135中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。
137.根据实施方案81-136中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂。
138.根据实施方案81-137中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
139.根据实施方案81-138中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD28激动剂。
140.根据实施方案81-139中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段。
141.根据实施方案81-140中任一项所述的方法，所述使TIL与所述T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；和(3)将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
142.根据实施方案141所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约30ng/mL。
143.根据实施方案141-142中任一项所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约30ng/mL-约300ng/mL。
144.根据实施方案141-143中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
145.根据实施方案141-144中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
146.根据实施方案144-145中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
147.根据实施方案141-146中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
148.根据实施方案141-147中任一项所述的方法，每mg所述固相介质中包含的每一种所述T细胞激活剂的量各自独立地至少为约25μg。
149.根据实施方案141-148中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
150.根据实施方案141-149中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
151.根据实施方案81-150中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
152.根据实施方案81-151中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
153.根据实施方案81-152中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
154.根据实施方案81-153中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
155.根据实施方案81-154中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
156.根据实施方案81-155中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
157.根据实施方案156所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
158.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触。
159.根据实施方案158所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与CD28激动剂接触之后，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
160.根据实施方案158-159中任一项所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与CD28激动剂接触之前，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
161.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中所述TIL包含与CD28激动剂接触获得的TIL。
162.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL与CD28激动剂接触，其中所述TIL包含使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL。
163.根据实施方案158-162中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
164.根据实施方案163所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
165.根据实施方案164所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细 胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
166.根据实施方案158-165中任一项所述的方法，与在体外扩增阶段未曾与所述CD28激动剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与所述CD28激动剂接触过的所述TIL显示出改善的基因编辑效果。
167.根据实施方案166所述的方法，所述改善的基因编辑效果包含提高的基因敲除效率。
168.根据实施方案158-167中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述微小RNA和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
169.根据实施方案168所述的方法，其中所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
170.根据实施方案168-169中任一项所述的方法，其中编码所述微小RNA和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
171.根据实施方案169-170中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
172.根据实施方案171所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
173.根据实施方案172所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
174.根据实施方案158-173中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段包含使免疫细胞增殖能力和/或细胞杀伤活性提高的微小RNA。
175.根据实施方案158-174中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段包含miR155或其功能活性片段。
176.根据实施方案158-175中任一项所述的方法，所述微小RNA包含如SEQ ID NO：74、75、79和/或82所示的序列。
177.根据实施方案158-176中任一项所述的方法，所述微小RNA与标记序列直接或间接连接，所述标记序列在细胞中表达为细胞表面的标记物。
178.根据实施方案177所述的方法，所述标记序列编码EGFR或其截短体。
179.根据实施方案177-178中任一项所述的方法，所述标记序列编码EGFR的胞外结构域和/或跨膜域。
180.根据实施方案177-179中任一项所述的方法，所述标记序列编码的表达产物不包含EGFR的胞内结构域。
181.根据实施方案177-180中任一项所述的方法，所述标记序列包含如SEQ ID NO：78和/或80所示的序列。
182.根据实施方案158-182中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高包含所述微小RNA和/或其功能活性片段的合成量提高。
183.根据实施方案158-182中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
184.根据实施方案158-183中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
185.根据实施方案158-184中任一项所述的方法，所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
186.根据实施方案158-185中任一项所述的方法，其中，使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与CD28激动剂接触。
187.根据实施方案186所述的方法，其中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使经所述第一阶段体外扩增的TIL与所述CD28激动剂接触。
188.根据实施方案187所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行至少约7天。
189.根据实施方案187-188中任一项所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行约7天至约14天。
190.根据实施方案187-189中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行至少约7天。
191.根据实施方案187-190中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行约7天至约14天。
192.根据实施方案158-191中任一项所述的方法，所述CD28激动剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段、和/或CD86和/或其功能活性片段。
193.根据实施方案158-192中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织 且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述CD28激动剂之外的其它T细胞激活剂接触。
194.根据实施方案193所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
195.根据实施方案193-194中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
196.根据实施方案193-195中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
197.根据实施方案193-196中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触。
198.根据实施方案193-197中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。
199.根据实施方案193-198中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含CD3激动剂。
200.根据实施方案193-199中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
201.根据实施方案193-200中任一项所述的方法，所述使TIL与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；(3)将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
202.根据实施方案201所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少约30ng/mL。
203.根据实施方案201-202中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为约30ng/mL-约300ng/mL。
204.根据实施方案201-203中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
205.根据实施方案201-204中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至 约500纳米。
206.根据实施方案204-205中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
207.根据实施方案201-206中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
208.根据实施方案201-207中任一项所述的方法，每mg所述固相介质包含至少约25μg的所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂。
209.根据实施方案201-208中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
210.根据实施方案201-209中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
211.根据实施方案158-210中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL在与CD28激动剂接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
212.根据实施方案211所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
213.根据实施方案211-212中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与CD28激动剂接触且使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
214.根据实施方案211-213中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
215.根据实施方案211-214中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
216.根据实施方案211-215中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
217.根据实施方案211-216中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
218.根据实施方案211-216中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培 养。
219.根据实施方案211-218中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
220.根据实施方案211-219中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
221.根据实施方案211-220中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
222.根据实施方案211-221中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
223.根据实施方案211-222中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
224.根据实施方案211-223中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
225.根据实施方案211-224中任一项所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
226.根据实施方案158-225中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
227.根据实施方案226所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
228.根据实施方案226-227中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述CD28激动剂以及所述T细胞生长因子接触。
229.根据实施方案226-228中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
230.根据实施方案226-229中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及所述T细胞生长因子接触。
231.根据实施方案226-230中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
232.根据实施方案226-231中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
233.根据实施方案226-232中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子 接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
234.根据实施方案226-233中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
235.根据实施方案158-234中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
236.根据实施方案235所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
237.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
238.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；
(B)使所述第二TIL群的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
239.根据实施方案238所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
240.根据实施方案238-239中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
241.根据实施方案237-240中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
242.根据实施方案237-241中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约7天至约14天。
243.根据实施方案237-242中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
244.根据实施方案243所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比 例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
245.根据实施方案244所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
246.根据实施方案237-245中任一项所述的方法，与在体外扩增阶段未曾与所述CD28激动剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与所述CD28激动剂接触过的所述TIL显示出改善的基因编辑效果。
247.根据实施方案246所述的方法，所述改善的基因编辑效果包含提高的基因敲除效率。
248.根据实施方案237-247中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述微小RNA和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
249.根据实施方案248所述的方法，其中所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
250.根据实施方案248-249中任一项所述的方法，其中编码所述微小RNA和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
251.根据实施方案249-250中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
252.根据实施方案251所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
253.根据实施方案252所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
254.根据实施方案237-253中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段包含使免疫细胞增殖能力和/或细胞杀伤活性提高的微小RNA。
255.根据实施方案237-254中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段包含miR155或其功能活性片段。
256.根据实施方案237-255中任一项所述的方法，所述微小RNA包含如SEQ ID NO：74、75、79和/或82所示的序列。
257.根据实施方案237-256中任一项所述的方法，所述微小RNA与标记序列直接或间接连接，所述标记序列在细胞中表达为细胞表面的标记物。
258.根据实施方案257所述的方法，所述标记序列编码EGFR或其截短体。
259.根据实施方案257-258中任一项所述的方法，所述标记序列编码EGFR的胞外结 构域和/或跨膜域。
260.根据实施方案257-259中任一项所述的方法，所述标记序列编码的表达产物不包含EGFR的胞内结构域。
261.根据实施方案257-260中任一项所述的方法，所述标记序列包含如SEQ ID NO：78和/或80所示的序列。
262.根据实施方案237-261中任一项所述的方法，所述微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高包含所述微小RNA和/或其功能活性片段的合成量提高。
263.根据实施方案237-262中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
264.根据实施方案237-263中任一项所述的方法，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
265.根据实施方案237-264中任一项所述的方法，所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
266.根据实施方案237-265中任一项所述的方法，所述CD28激动剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段、和/或CD86和/或其功能活性片段。
267.根据实施方案237-266中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及其它T细胞激活剂接触。
268.根据实施方案267所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。
269.根据实施方案267-268中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含CD3激动剂。
270.根据实施方案267-269中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
271.根据实施方案267-270中任一项所述的方法，所述使TIL与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述CD28激动剂 以及所述其它T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；(3)将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
272.根据实施方案271所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少约30ng/mL。
273.根据实施方案271-272中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为约30ng/mL-约300ng/mL。
274.根据实施方案271-273中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
275.根据实施方案271-274中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
276.根据实施方案274-275中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
277.根据实施方案271-276中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
278.根据实施方案271-277中任一项所述的方法，每mg所述固相介质包含至少约25μg的所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂。
279.根据实施方案271-278中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
280.根据实施方案271-279中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
281.根据实施方案237-280中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触至少约2小时之后与饲养细胞共培养。
282.根据实施方案281所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
283.根据实施方案281-282中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
284.根据实施方案281-282中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培 养。
285.根据实施方案281-284中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
286.根据实施方案281-285中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
287.根据实施方案281-286中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
288.根据实施方案281-287中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
289.根据实施方案281-288中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
290.根据实施方案281-289中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
291.根据实施方案281-290中任一项所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
292.根据实施方案237-291中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及T细胞生长因子接触。
293.根据实施方案237-292中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
294.根据实施方案237-293中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
295.根据实施方案237-294中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
296.根据实施方案237-295中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
297.根据实施方案237-296中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
298.根据实施方案297所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
299.一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述TIL经过实施方案1-298中任一项所述的方法获得。
300.一种组合物，其包含实施方案299所述的TIL。
301.一种药物组合物，其包含实施方案299所述的TIL和/或实施方案300所述的组合物，以及任选地药学上可接受的载体。
302.一种影响肿瘤细胞生长的方法，包含向受试者施用实施方案299所述的TIL、实施方案300所述的组合物和/或实施方案301所述的药物组合物。
303.实施方案299所述的TIL、实施方案300所述的组合物和/或实施方案301所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
304.根据实施方案303所述的应用，其中，所述肿瘤为实体瘤。
305.根据实施方案303-304中任一项所述的应用，其中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
例如，本申请的方法中使TIL的至少一种目标基因的表达提高和/或活性增强可以包含，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述微小RNA和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
例如，其中所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强可以包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。例如，其中编码所述微小RNA和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。例如，当所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段可以长期和/或持续在所述TIL中表达。
例如，其中所述载体包含病毒载体。例如，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。例如，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
例如，所述微小RNA和/或其功能活性片段包含使免疫细胞增殖能力和/或细胞杀伤活性提高的微小RNA。
例如，所述微小RNA和/或其功能活性片段包含miR155或其功能活性片段。
例如，所述微小RNA包含如SEQ ID NO：74、75、79和/或82所示的序列。
例如，本申请的微小RNA包含miR155或其功能活性片段，例如所述miR155或其功能活性片段可以如SEQ ID NO：74和/或82所示。
例如，本申请的目标基因还可以包含调控翻译起始的元件。例如，本申请的调控翻译起始的元件可以包含IRES。例如，本申请的目标基因还可以包含如SEQ ID NO：77所示核酸片段。
例如，本申请的目标基因还可以包含启动子。例如，本申请的启动子可以包含U6启动子。例如，本申请的目标基因还可以包含如SEQ ID NO：76所示核酸片段。
例如，本申请的目标基因还可以包含增加目标基因表达量的元件。例如，本申请的增加目标基因表达量的元件可以包含WPRE。例如，本申请的目标基因还可以包含如SEQ ID NO：81所示核酸片段。
例如，所述微小RNA可以与标记序列直接或间接连接，所述标记序列可以在细胞中表达为细胞表面的标记物。例如，所述标记序列编码EGFR或其截短体。例如，所述标记序列编码EGFR的胞外结构域和/或跨膜域。例如，所述标记序列编码的表达产物不包含EGFR的胞内结构域。例如，所述标记序列包含如SEQ ID NO：78和/或80所示的序列。
例如，本申请的目标基因可以包含如SEQ ID NO：74所示核酸片段、如SEQ ID NO：76所示核酸片段、如SEQ ID NO：77所示核酸片段和如SEQ ID NO：78所示核酸片段。例如，本申请的目标基因可以包含如SEQ ID NO：75所示核酸片段。
例如，本申请的目标基因可以包含如SEQ ID NO：80所示核酸片段、如SEQ ID NO：81所示核酸片段和如SEQ ID NO：82所示核酸片段。例如，本申请的目标基因可以包含如SEQ ID NO：79所示核酸片段。
例如，所述微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高包含所述微小RNA和/或其功能活性片段的合成量提高。例如，本申请的方法中与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的至少一种微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例可以提高至少约5％以上。例如，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例可以提高至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、或至少约5％。例如，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例可以从0％到可以观测的细胞比例。例如，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例可以提高到至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、或至少约1％。例如，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例可以通过细胞流式仪对共同表达的标记物进行检测。
例如，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL 的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
例如，与微小RNA和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。例如，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例可以提高至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、或至少约5％。
例如，所述使所述TIL的微小RNA和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。例如，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例可以为至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、或至少约5％。例如，表达微小RNA和/或其功能活性片段的细胞比例可以通过细胞流式仪对共同表达的标记物进行检测。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞的培养方法
1.1饲养细胞接收及制备
1.1.1单采血接收
记录单采血信息，批号及体积，并复温至室温。
1.1.2 PBMC(外周血单个核细胞)手动分离及冻存
使用75％酒精消毒血袋，转移至生物安全柜内。使用无菌剪刀剪开血袋后，将单采血转移至50mL离心管内，使用20mL注射器注入20mL PBS或生理盐水清洗血袋，将洗涤液一并转入50mL离心管内。每个50mL离心管内液体体积可以不超过30mL。将单采血3000g离心10分钟。离心过程中准备6-8支50mL离心管，加入已复温的淋巴细胞分离液(天津灏 洋Ficoll)，20mL/支。离心结束后，弃掉上层血浆，使用PBS或生理盐水稀释细胞沉淀，将稀释后的血细胞混合液缓慢滴加上淋巴细胞分离液上层，可以不破坏界面，每管约加25mL样品，可以不超过28mL。
离心使用水平转子，500-600g离心15-30分钟，温度18-22℃，离心结束后得到的白膜层将处于生理盐水及淋巴细胞分离液Ficoll的分界面处。吸弃上层血浆及生理盐水，用移液管吸取中间白膜层至另一干净的50mL离心管内。使用PBS或生理盐水稀释收集到的白膜层，600g离心10分钟，室温。离心结束后弃上清，PBS或生理盐水清洗细胞一次，500g离心5分钟，室温。
如红细胞较多，离心结束后可以进行裂红，按照细胞沉淀体积与红细胞裂解液1:2至1:3加入红细胞裂解液，混匀，室温裂解10分钟中，中间轻柔混匀离心管2-3次，保证裂解效果，裂解完成后加入PBS或生理盐水清洗细胞。裂红后清洗细胞两次，400g离心6分钟，最后一次离心前取样计数。
弃上清，基础培养基重悬细胞，调整细胞密度约2-3×10
7个细胞/mL，液面高度可以不超过1厘米，每T225培养瓶中体积可以低于200mL；平铺状态下，X射线辐照50Gy。离心弃上清，根据计数结果冻存细胞，约1-2×10
8个细胞/mL，1-2mL/支；将细胞放入程序降温盒内转移至﹣80℃冰箱内冻存。
1.1.3 PBMC自动分离及冻存
将血袋的管路与cpro分离套件(Cytiva)输入端无菌接管。若血量大于120mL，进行预浓缩步骤，可以将血液体积浓缩至120mL以内。可以使用neatcell程序进行PBMC分离及洗涤，洗涤液为生理盐水，中间体积20mL；重悬液为基础培养基，添加80mL/批。分离后每供者PBMC为一袋100mL，在平铺状态下，液面高度可以不超过1厘米，X射线辐照50Gy。辐照后取样计数，使用culture wash程序收集细胞并洗涤三次，洗涤液为生理盐水；设置中间体积及终体积，使得每1×10
9个细胞不少于2mL；加入等量至2倍冻存液混匀。使用1倍冻存液调整细胞密度约为1×10
7个细胞/mL至2×10
8个细胞/mL，分装20mL/袋，程序降温仪内冻存，液氮保存。
1.2肿瘤组织接收及处理
1.2.1组织接收
接收供者的肿瘤组织及血样，核对样品信息并记录，打印相应样品标签。
1.2.2组织处理及培养
使用75％酒精消毒样品管及采血管，转移至生物安全柜内。根据上述PBMC手动分离及 冻存操作程序分离血样中PBMC细胞并进行冻存。取一种具有透气表面的培养瓶或培养袋，例如培养袋(Origen)，加入300mL已复温的完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，并添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2。取数个10厘米培养皿，加入适量培养基，使用无菌眼科镊从样品管中取出肿瘤组织于10厘米培养皿中，培养基量以刚没过肿瘤组织为准，观察组织形态并记录。洗涤组织并更换培养皿。使用眼科剪及眼科镊将进行初步剪切，去除脂肪组织及坏死组织，每块组织块继续剪碎至约27立方毫米大小。取非悬浮肿瘤组织块，使用20mL注射器去除内部活塞后，与培养袋连接，使用移液管将约1g组织块通过注射器转入培养袋内。将培养袋放入二氧化碳培养箱内进行培养。清理剪刀及镊子，并用75％酒精进行初步消毒后，超声清洗后进行灭菌，得到第一TIL群。
1.3步骤(A)体外扩增及收获
1.3.1步骤(A)体外扩增
根据细胞生长状态，每3-7天补液或半量换液，保证细胞营养。使用完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，并添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2(双鹭)。步骤(A)的3-14天，例如可以第13或14天时取样计数，若细胞数目处于5×10
5至5×10
8之间时进入步骤(A)的收获步骤。
1.3.2步骤(A)的收获
收集步骤(A)体外扩增结束细胞，离心，弃去培养基，使用PBS或生理盐水洗涤细胞一次，获得经步骤(A)体外扩增的TIL(第二TIL群)，并取样计数留取约5×10
5至2×10
8个细胞进入后续体外扩增步骤；取约5×10
5个细胞可以进行质量控制检测；其余细胞加入冻存液冻存，作为冻存的preREP TIL体外细胞。
1.4步骤(B)TIL活化
继续培养经步骤(A)体外扩增的TIL(第二TIL群)，或者对冻存的preREP TIL体外细胞进行细胞复苏，进行步骤(B)的TIL活化。
使用完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，调整细胞密度为5×10
5至2×10
6个细胞/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔， 添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2。各TIL细胞群的培养基中同时可以添加T细胞激活剂，例如添加CD3激动剂和/或CD28激动剂，例如，约30ng/mL的CD3抗体(Miltenyi Biotech，OKT3)、约30ng/mL的CD28抗体(Merck，15E8)、以约1:2-2:1的磁珠与TIL的比例加入磁珠(直径约1至10μm Dynabeads，Thermo Fisher)和/或以约1:100-1:2000的transACT(直径约100至500nm，Miltenyi)与TIL的比例加入transACT。培养约0-4天，获得第三TIL群。
1.5步骤(C)TIL细胞转导
转导前1天使用终浓度为15μg/mL的重组人纤维蛋白片段(Retronectin，Takara)包被24孔悬浮培养板，24孔板每孔250μL。避光，4℃过夜备用。取出包被好的24孔板，吸弃包被液，加入含2％BSA封闭液500μL室温封闭30分钟。吸弃封闭液，用含2.5％HEPES的洗板液500μL/孔洗板2次，吸弃洗板液。试验组用携带IL-12(氨基酸序列可以包含如SEQ ID NO：34-40中任一项所示的氨基酸序列)的逆转录病毒进行转导，GFP对照组用携带GFP的逆转录病毒进行转导。
携带IL-12的逆转录病毒的质粒构建可以是合成本申请的IL-12基因片段，用EcoRI+NotI酶切，回收外源片段IL-12。用EcoRI+NotI酶切质粒MP71，回收载体片段。用T4Ligase连接外源片段与载体片段，得到携带IL-12的逆转录病毒的质粒。携带GFP的逆转录病毒的质粒的构建采用类似的方法。
每孔加0.25-2mL逆转录病毒液，32℃，2000g，离心2小时，阴性对照组不进行细胞转导。弃去24孔板上清液，24孔板每孔加入第三TIL群，体积300-500μL，细胞浓度约为1×10
6个/mL。30-32℃，1000g，离心10分钟。离心完毕后，将培养板置于37℃，5％CO
2培养箱中培养，得到转导后细胞。转导后培养约0-4天，获得第四TIL群。
1.6步骤(D)TIL细胞转导后培养
在第四TIL细胞群中加入饲养细胞进行培养。TIL与饲养细胞接触的时间需要在步骤(B)的TIL与IL-2以及T细胞激活剂接触后的若干时间T
n以后(各个试验组的T
n可以取0小时到12天，例如24小时或48小时)。首先复苏1-5名供者混合的饲养细胞；将活化的TIL细胞、饲养细胞按照TIL细胞：饲养细胞约为1:200的比例混合，转入G-Rex100培养瓶或者透气袋内，补充完全培养基，每1-3天取样计数，并根据细胞状态补液或半量换液直至细胞总数大于1×10
9或步骤(D)体外扩增培养约5天至约14天，终止步骤(D)体外扩增的培养。
1.7肿瘤浸润淋巴细胞的收获
取步骤(D)扩增的细胞，离心后弃去培养基上清，并使用PBS或生理盐水或复方电解 质溶液清洗三次，获得经步骤(D)扩增的TIL(第五TIL群)，第三次清洗时取样计数，根据计数结果，最后一次离心后弃上清，取3×10
6细胞送质量控制检测；其余全部细胞加入冻存液，调整细胞密度1-3×10
8个细胞/mL冻存。
实施例2 TIL细胞的转导效率检测
转导后的第14天开始，每隔3天用流式细胞仪(Beckman CouLter)检测本申请TIL细胞的转导效率。
图1显示的是，对于来源于供者A的TIL细胞，各组中CD4
+细胞的IL-12转导效率；
图2显示的是，对于来源于供者A的TIL细胞，各组中CD8
+细胞的IL-12转导效率。结果表明本申请的IL-12可以在TIL细胞中取得较高的转导效率，而且IL-12的转导效率显著高于GFP对照组。
实施例3 TIL细胞的扩增效率的检测
IL-2是调节T细胞生长的重要因子，本实施例检测本申请转导了IL-12的TIL细胞是否可以不依赖于IL-2而依然可以存活和/或扩增。
转导后的第8天开始，各组TIL细胞以相同的细胞总数重新铺板，并换用不含有IL-2的细胞培养基培养，即撤去IL-2进行培养。每隔3天用细胞计数仪分析TIL细胞的扩增效率及活率。其中扩增效率以标准化扩增率表示：将撤去IL-2当天(第0天)的细胞总数作为100％，第n天的标准化扩增率为第n天的细胞总数/第0天的细胞总数×100％；活率表示存活细胞数量占总细胞数量的百分比。
图3显示的是，对于来源于供者B的TIL细胞，各组TIL细胞的标准化扩增率；
结果表明，即使撤去IL-2，本申请的转导了IL-12的TIL细胞仍然可以具有更显著的扩增能力。
实施例4 TIL细胞的扩增情况检测
转导后的第8天开始，各组TIL细胞以相同的细胞总数重新铺板，3天后，进行扩增情况的检测。
根据CTG试剂盒(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay，Promega)的说明书，将CTG底物(CellTiter-Glo Substrate)与CTG缓冲液(CellTiter-Glo Buffer)混合制备CTG反应液。将检测细胞悬液加入96孔微孔板中，50μL/孔，设置仅含培养基的孔作为荧光的背景值。每孔加入等体积的CTG反应液，水平摇床震摇2分钟并室温静置10分钟使荧光信号 稳定后，读取荧光值。
图4显示的是，对于来源于供者C的TIL细胞，各组TIL细胞的增殖能力。*表示p<0.05。结果表明，转导了IL-12的TIL细胞可以具有更显著的扩增能力。
实施例5 TIL细胞的细胞因子分泌情况检测
转导后的第8天开始，各组TIL细胞以相同的细胞总数重新铺板，同时加入CD3抗体(同立海源)对TIL细胞进行刺激。24小时后取上清进行细胞因子分泌检测。
细胞因子分泌检测方法可以参照细胞因子检测试剂盒(BD)的说明书，将人Th1/Th2/Th17细胞因子标准品冻干粉(BD)使用2mL Assay Diluent稀释液(BD)复溶(标准品原液各细胞因子浓度均为5000pg/mL)并按顺序：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512，1:1024梯度稀释，标记为“标准品管”。取1管仅含有Assay Diluent稀释液作为参照。按照2μL/Beads/孔加入每种Capture Beads(BD)，然后按照10μL/孔加入PE Detection Reagent检测试剂(BD)并混合配制为混合物(mix)，按照22μL/孔加入V底96孔板内，随后按照10μL/孔加入各标准品和实验组的上清并混合，室温下避光孵育3小时。
孵育结束，每孔加入200μL Wash Buffer(BD)，500g离心3分钟。离心结束，每孔加入100μL Wash Buffer(BD)重悬，进行流式分析。
图5、图6、图7和图8分别显示的是，对于来源于供者D的TIL细胞，各组TIL细胞在CD3抗体刺激后的细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-10分别的分泌情况。****表示p<0.0001，***表示p<0.001，**表示p<0.01。结果表明，转导了IL-12的TIL细胞在CD3抗体刺激后可以具有更显著的细胞因子分泌能力。
转导后的第8天开始，各组TIL细胞以相同的细胞总数重新铺板，同时加入transACT(包含CD3抗体和CD28抗体的纳米材料，Miltenyi)对TIL细胞进行刺激。24小时后取上清进行细胞因子分泌检测。
图9、图10、图11和图12分别显示的是，对于来源于供者E的TIL细胞，各组TIL细胞在transACT刺激后的细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α和IL-10分别的分泌情况。**表示p<0.01。结果表明，转导了IL-12的TIL细胞在CD3抗体和CD28抗体刺激后可以具有更显著的细胞因子分泌能力。
转导后的第8天开始，各组TIL细胞以相同的细胞总数重新铺板，对TIL细胞不进行刺激。24小时后取上清进行细胞因子分泌检测。
图13、图14、图15、图16和图17分别显示的是，对于来源于供者F的TIL细胞，各组TIL细胞的细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10分别的分泌情况。****表示p<0.0001， ***表示p<0.001，**表示p<0.01。结果表明，转导了IL-12的TIL细胞可以具有更显著的细胞因子分泌能力。
转导后的第8天开始，各组TIL细胞以相同的细胞总数重新铺板，并换用不含有IL-2的细胞培养基培养，即撤去IL-2进行培养。撤去IL-2继续培养后的第15天取上清进行细胞因子分泌检测。
图18、图19和图20分别显示的是，对于来源于供者G的TIL细胞撤去IL-2进行培养，各组TIL细胞的细胞因子IFN-γ、IL-6和IL-10分别的分泌情况。****表示p<0.0001，***表示p<0.001。结果表明，转导了IL-12的TIL细胞在IL-2撤去的情况下可以具有更显著的细胞因子分泌能力。
实施例6 TIL细胞杀伤能力检测
转导后的第7天开始，将A375肿瘤细胞系以2×10
4/孔铺于96孔板中。次日，将各组TIL细胞以效靶比(TIL细胞：肿瘤细胞)为0.3:1或1:1的比例与上述A375细胞共培养。
根据细胞凋亡检测试剂(Incucyte Caspase-3/7 Green Dye for Apoptosis，Sartorius)的说明书，按照0.2μL/孔加入
Caspase-3/7 Green Dye for Apoptosis，并按照25μL/孔加入培养基稀释Caspase 3/7 Green Dye。使用Incucyte记录仪(Sartorius)记录Caspase 3/7的活性来分析TIL对肿瘤细胞的杀伤能力，每3小时记录1次，总记录时长约5天。
图21显示的是，对于来源于供者H的TIL细胞，以效靶比0.3:1与肿瘤细胞共培养的杀伤能力检测结果。****表示p<0.0001。
图22显示的是，对于来源于供者H的TIL细胞，以效靶比1:1与肿瘤细胞共培养的杀伤能力检测结果。****表示p<0.0001。结果表明，转导了IL-12的TIL细胞可以具有更显著的细胞杀伤能力。
在共培养后的第24小时，取上清进行细胞因子分泌检测。
图23显示的是，以效靶比1:1或1:3与肿瘤细胞共培养的来源于供者H的TIL细胞的细胞因子IL-2分泌情况结果。***表示p<0.001。
图24显示的是，以效靶比1:1或1:3与肿瘤细胞共培养的来源于供者H的TIL细胞的细胞因子IL-6分泌情况结果。*表示p<0.05。
图25显示的是，以效靶比1:1或1:3与肿瘤细胞共培养的来源于供者H的TIL细胞的细胞因子IFN-γ分泌情况结果。****表示p<0.0001。
图26显示的是，以效靶比1:1或1:3与肿瘤细胞共培养的来源于供者H的TIL细胞的细胞因子IL-10分泌情况结果。***表示p<0.001，*表示p<0.05。
图27显示的是，以效靶比1:1或1:3与肿瘤细胞共培养的来源于供者H的TIL细胞的细胞因子TNF-α分泌情况结果。**表示p<0.01，*表示p<0.05。结果表明，转导了IL-12的TIL细胞在与肿瘤细胞接触时可以具有更显著的细胞因子分泌能力。
实施例7 TIL细胞的TCR克隆多样性检测
转导后的第8天开始，各组TIL细胞以相同的细胞总数重新铺板，并换用不含有IL-2的细胞培养基培养，即撤去IL-2进行培养。在转导后的第8天和第26天对TIL中T细胞受体(TCR)克隆多样性进行分析。
根据TCR谱系试剂盒(Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit，Beckman Coulter)的说明书，在A管至H管的8个管中分别加入4μL的Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit Tube A-H抗体，并在每个管中加入1μL的BV510标记的CD3抗体(BD)、1μL的PerCP-cy5.5标记的CD8抗体(BD)、1μL的PE-cy7标记的CD4抗体(BD)和0.01μL的eFluor 780标记的死活细胞染料(eBioscience)。将待测细胞分为8份，分别加入A管至H管，混合均匀，4℃孵育30分钟。染色结束，离心并弃去上清，使用PBS重悬洗涤1次，用于流式细胞仪检测。
按照TCR谱系试剂盒(Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit，Beckman Coulter)的说明书对TIL细胞的TCR多样性进行鉴定。表1显示的是，A管至H管的荧光与TCR Vβ克隆的对应关系。
表1 A管至H管的荧光与TCR Vβ克隆的对应关系
表2和图28显示的是，对于来源于供者I的TIL细胞，转导后的第8天的CD8
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性。
表2转导后的第8天的CD8
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性
表3和图29显示的是，对于来源于供者I的TIL细胞，转导后的第26天的CD8
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性。其中TCR Vβ克隆为其它，可以是指该比例下的T细胞没有TCR谱系试剂盒可以鉴定的TCR Vβ。
表3转导后的第26天的CD8
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性
表4和图30显示的是，对于来源于供者I的TIL细胞，转导后的第8天的CD4
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性。
表4转导后的第8天的CD4
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性
表5和图31显示的是，对于来源于供者I的TIL细胞，转导后的第26天的CD4
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性。其中TCR Vβ克隆为其它，可以是指该比例下的T细胞没有TCR谱系试剂盒可以鉴定的TCR Vβ。
表5转导后的第26天的CD4
+T细胞TCR Vβ克隆的多样性
结果表明，未转导的TIL细胞在第26天时，CD8
+T细胞Vβ18、Vβ7.2、Vβ11、Vβ5.2、Vβ16、Vβ3、Vβ20、Vβ23、Vβ13.1、Vβ4、Vβ22、Vβ21.3、Vβ17、Vβ5.1、Vβ5.3和Vβ2消失，CD4
+T细胞Vβ7.2、Vβ5.2、Vβ11、Vβ16和Vβ20消失，意味着TCR克隆多样性的降低；转导了IL-12的TIL细胞可以保持更多的β链亚型，可以显著地长期保持TCR克隆的多样性，从而可以有助于实现对于肿瘤细胞更强的抗原识别和免疫应答能力。
实施例8 TIL细胞的体内存续以及分布检测
对免疫缺陷鼠(NOG小鼠，维通利华，品系代码408)进行皮下接种A375细胞，接种数量约为1×10
6个细胞/只。接种7天后，在肿瘤体积到达50-80mm
3左右，根据肿瘤体积大小对小鼠进行随机分组(如表6所示)。
表6分组情况
各组尾静脉注射来源于供者J的TIL(未转导IL-12的TIL，未转导IL-12的TIL+IL-2，转导IL-12的TIL，等体积PBS作为空白对照)，剂量为5×10
6个细胞/只，注射TIL细胞当日记为第0天。对于对照组2，同时进行腹腔注射IL-2，每12小时一次，连续6次，IL-2的注射剂量为1×10
5IU/次。注射TIL细胞后第6天和第21天，取出小鼠肿瘤、脾脏、骨髓、肺组织及血液(抗凝处理)，用流式仪分析T细胞数量和组织动态分布。
图32，图33，图34，图35和图36分别显示的是，注射TIL细胞后第6天和第21天各个组织和/或肿瘤中T细胞的数量。结果表明，转导了IL-12的TIL细胞可以具有更长的体内存续时间，而且在肿瘤组织部位，转导了IL-12的TIL细胞可以具有更强的浸润和/或扩增能力。
实施例9饲养细胞不同添加时间培养的TIL增殖能力对比
实施例1的加入IL-2与不同形式的T细胞激活剂后的若干时间T
n以后(T
n可以取0小时到14天)，将饲养细胞与肿瘤浸润淋巴细胞共培养。本实施例中T
n选取0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、5天、7天、和9天获得饲养细胞不同添加时间培养的TIL，并进行细胞计数的对比试验。
图37显示的是，饲养细胞不同添加时间培养的TIL的增殖能力分析结果。饲养细胞不同添加时间培养TIL的各组图中纵坐标的数值表示，体外扩增结束后相比于体外扩增开始前，TIL细胞数量扩增至的扩增倍数。4名供者来源的TIL增殖结果显示，加入OKT3和IL-2后的0小时后(即同时)添加饲养细胞培养的TIL，增殖能力弱于加入OKT3和IL-2后的24小 时或48小时后加饲养细胞培养的TIL。
实施例10饲养细胞不同添加时间培养的TIL流式检测对比
在实施例1的加入IL-2与不同形式的T细胞激活剂后的若干时间T
n以后(T
n可以取0小时到14天)，将饲养细胞与肿瘤浸润淋巴细胞共培养。本实施例中T
n选取0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、5天、7天、和9天获得饲养细胞不同添加时间培养的TIL，并进行流式检测的对比试验。
TIL流式检测试验材料的来源
转录因子缓冲组(Transcription Factor Buffer Set)，厂家BD，货号562574；V底96孔板，厂家Corning，货号3894；流式管，厂家Corning，货号352052。
本实施例流式抗体购自BD或Biolegend。将每组1×10
5至5×10
5个细胞样品，加入流式管或V底96孔板内。600g离心3分钟，弃上清。PBS清洗一次，流式管1mL/管，96孔板250μL/孔，弃上清。加入配制好的抗体工作液进行细胞表面染色，抗体(BD或Biolegend)浓度为1:100至1:200，含活性检测染料1:10000。流式管100μL/管，96孔板50μL/孔染色，2-8℃避光孵育30分钟。染色过程中配制转录因子染色所需试剂：使用转录因子缓冲组(BD，Transcription Factor Buffer Set)稀释4×固定破膜液(BD，Fixation/Permeabilization)为1×工作液A；使用双蒸水稀释5×通透清洗液(BD，Perm/Wash Buffer)为1×工作液B，四度预冷待用。染色结束后加入适量PBS清洗细胞2次(96孔板250μL/次，流式管1mL/次)，600g离心3分钟，离心后弃上清。细胞固定、破膜：充分重悬细胞，加入适量(96孔板100μL/孔，流式管1mL/管)1×工作液A进行固定破膜，2-8℃避光孵育40-50分钟。固定破膜结束，加入1×工作液B清洗细胞(96孔板250μL/次，流式管2mL/次)，2-8℃离心，350g离心6分钟，清洗两次。使用1×工作液B配制胞内抗体，抗体浓度为1:100至1:200，96孔板50μL/孔，流式管100μL/管，2-8℃避光染色30分钟。染色结束后，加入1×工作液B清洗细胞(96孔板250μL/次，流式管2mL/次)，2-8℃离心，350g离心6分钟，清洗两次。表面染色结束后，PBS清洗细胞一次(96孔板250μL/次，流式管1mL/次)，室温600g离心3分钟，离心后弃上清。使用100-500μL PBS重悬细胞，进行流式上机检测。
饲养细胞不同添加时间培养的TIL的流式结果分析如图38到图44所示。
图38和图39显示的是，加入OKT3和IL-2后0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD45RA
-CCR7
+中心记忆T细胞(Tcm)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高中心记忆T细胞的比例。
图40显示的是，加入OKT3和IL-2后0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD4
+CD25
+Foxp3
+调节性T细胞(Treg)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更少的调节性T细胞的比例。
图41和图42显示的是，加入OKT3和IL-2后0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的活化T细胞的比例，例如PD1
+、LAG3
+和/或CD28
+细胞比例更高。
图43显示的是，加入OKT3和IL-2后0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD103
+CD39
+肿瘤特异性T细胞比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的肿瘤特异性T细胞的比例。
图44显示的是，加入OKT3和IL-2后0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的TCF1
+干细胞样T细胞比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的干细胞样T细胞的比例。
实施例11加入CD28激动剂刺激的TIL增殖能力检测
对于实施例1中各个试验组培养获得的TIL群进行细胞计数。
图45显示的是，添加不同形式的CD28激动剂的试验组以及对照组的增殖能力分析结果。图中纵坐标的数值表示，各个试验组体外扩增获得的TIL群相比于体外扩增开始前的TIL群，TIL细胞数量扩增至的扩增倍数。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)的体外扩增添加CD28抗体，获得的TIL增殖能力强于对照组(不添加CD28抗体)培养的TIL。
实施例12加入CD28激动剂刺激的TIL流式检测
对于实施例1中各个试验组体外扩增培养获得的TIL群进行流式检测。
添加不同形式的CD28激动剂的TIL的流式结果分析如图46到图50所示。
图46显示的是，混合抗体组与对照组培养所得的TIL细胞的T细胞亚群比例。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有改善的T细胞亚群比例。例如，更高的活化T细胞(CD28
+、TIM3
+或41BB
+)的比例，更低的调节性T细胞(Treg，例如CD4
+CD25
+Foxp3
+)比例，更高的干细胞样T细 胞(TCF1
+)比例，和/或更高的中心记忆T细胞(Tcm，例如CD45RA
-CCR7
+)的比例。
图47显示的是，混合抗体组与对照组培养所得的TIL细胞的T细胞亚群比例。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有改善的T细胞亚群比例。例如，更高的肿瘤特异性T细胞(CD103
+CD39
+)比例，更高的活化T细胞(CD25
+)的比例，和/或更低的调节性T细胞(Treg，例如CD4
+CD25
+Foxp3
+)比例。
图48显示的是，磁珠组与对照组培养所得的TIL细胞的T细胞亚群比例。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的磁珠)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有改善的T细胞亚群比例。例如，更高的活化T细胞(CD28
+、TIM3
+、PD1
+或41BB
+)的比例，更高的干细胞样T细胞(TCF1
+)比例，和/或更高的中心记忆T细胞(Tcm，例如CD45RA
-CCR7
+)的比例。
图49显示的是，磁珠组与对照组培养所得的TIL细胞的T细胞亚群比例。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的磁珠)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有改善的T细胞亚群比例。例如，更高的干细胞样T细胞(TCF1
+)比例，更高的活化T细胞(41BB
+)的比例，更高的中心记忆T细胞(Tcm，例如CD45RA
-CCR7
+)的比例，更低的调节性T细胞(Treg，例如CD4
+CD25
+Foxp3
+)比例，和/或更高的肿瘤特异性T细胞(CD103
+CD39
+)比例。
图50显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞的T细胞亚群比例。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的transACT)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有改善的T细胞亚群比例。例如，更高的肿瘤特异性T细胞(CD103
+CD39
+)比例，更高的活化T细胞(CD25
+或PD1
+)的比例，和/或更高的中心记忆T细胞(Tcm，例如CD45RA
-CCR7
+)的比例。
实施例13加入CD28激动剂刺激的TIL细胞杀伤能力检测
对于实施例1中各个试验组四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增培养获得的TIL群进行细胞杀伤能力检测。
细胞准备
准备用于检测的各个试验组获得的TIL和用于共培养的靶细胞(例如Hela肿瘤细胞)。
检测步骤
用CFSE(5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，Sigma，21888-25MG-F)标记肿瘤细胞：用PBS清洗肿瘤细胞，重悬肿瘤细胞于500μL的PBS中；将CFSE加入500 μL的PBS中，与500μL的肿瘤细胞PBS重悬液混合，至CFSE的终浓度为0.5μmol/L。37℃孵育6分钟后，加含10％FBS的培养基清洗，600g离心5分钟，用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基重悬肿瘤细胞浓度为5×10
5个细胞/mL。对各个试验组的TIL细胞600g离心5分钟，按照效靶比(TIL细胞与肿瘤细胞的比例)3:1重悬TIL细胞(即重悬TIL细胞浓度为1.5×10
6个细胞/mL)。于U底96孔板(Corning)中加入肿瘤细胞和TIL细胞各100μL，每组设置三个复孔。同时设置一组只包含肿瘤细胞的对照组并按照实验不同分组加入不同试剂。将孔板200g离心1分钟，置于37℃孵育4小时至过夜。
孵育完成后，600g离心3分钟，弃上清，每孔加入20μL胰酶，37℃培养箱内孵育3-5分钟消化肿瘤细胞，消化完成后加入180μL含10％FBS的培养基终止消化。将Dapi(碧云天，C0060)用1:100稀释，然后每孔加入20μL稀释后的Dapi。进行流式上机检测。
杀伤率％＝Dapi
+CFSE
+细胞数/总CFSE
+×100％。
图51显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞的细胞杀伤能力。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的transACT)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有更高的细胞杀伤能力。
实施例14加入CD28激动剂刺激的TIL胞内因子表达检测
对于实施例1中各个试验组四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增培养获得的TIL群进行胞内因子表达检测。
试验准备
配制胞内因子表达检测所需培养基：取T细胞培养基，按照体积比1:500添加CD107a抗体(BD)。
检测步骤
取各个试验组的TIL离心后，使用600μL上述胞内因子表达检测所需培养基重悬为1×10
6个细胞/mL，加入96孔板内，100μL/孔，置于37℃培养箱孵育过夜。
孵育结束后，200μL/孔PBS洗涤一次，600g离心3分钟，弃上清。配制抗体混合工作液进行细胞表面染色CD3/CD4/CD8(BD)，抗体浓度为1:100，viability(1:10000)，50μL/组染色，2-8℃避光孵育30分钟。染色结束后清洗细胞，使用PBS重悬，进行流式上机检测。
图52显示的是，混合抗体组与对照组培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有更高的胞内因子表达能力。例如，更高的CD107a表达能力。
图53显示的是，磁珠组与对照组培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的磁珠)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有更高的胞内因子表达能力。例如，更高的CD107a表达能力。
图54显示的是，磁珠组与对照组培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的磁珠)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有更高的胞内因子表达能力。例如，更高的CD107a表达能力。
图55显示的是，磁珠组与对照组培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的磁珠)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有更高的胞内因子表达能力。例如，更高的CD107a表达能力。
图56显示的是，磁珠组与对照组培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的磁珠)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有更高的胞内因子表达能力。例如，更高的CD107a表达能力。
图57显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的transACT)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有更高的胞内因子表达能力。例如，更高的CD107a表达能力、更高的IFN-γ表达能力或更高的GZMB表达能力。
实施例15加入CD28激动剂刺激的TIL细胞因子分泌检测
对于实施例1中各个试验组四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增培养获得的TIL群进行细胞因子分泌检测。
图58显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞的细胞因子分泌检测结果。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的transACT)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有更高的细胞因子分泌能力。例如，更高的IL-2分泌能力、更高的TNF分泌能力、或更高的IFN-γ分泌能力。
取各个试验组获得的TIL与肿瘤细胞过夜孵育，孵育结束后取上清液参照本实施例检测 步骤进行细胞因子分泌检测。
图59显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞与肿瘤细胞共同孵育后的细胞因子分泌检测结果。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的transACT)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有更高的细胞因子分泌能力。例如，更高的IL-2分泌能力、更高的TNF分泌能力、或更高的IFN-γ分泌能力。
实施例16加入CD28激动剂刺激的TIL基因敲除效率检测
取实施例1中各个试验组在四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增培养48小时后的TIL细胞，进行基因敲除效率检测。
用Nuclease-free water(商业来源：上海右凡生物科技有限公司；RT121-02)配制sgRNA(序列如SEQ ID NO:1所示，GGAGAATGACGAGTGGACCC)，调节浓度至50μmol/L。取2μL gRNA加入PCR管中，Nuclease-free water作为阴性对照，在PCR仪中95℃孵育2分钟后，室温冷却10分钟。
按照体积比sgRNA:P3 Buffer:Cas9核酸酶＝2:2:1，在含有sgRNA的PCR管中依次加入P3 Buffer(商业来源：Lonza；V4XP-3032)及61.7μmol/L Cas9核酸酶(商业来源：苏州克睿基因生物科技有限公司；C01-2019-11-001)，将PCR管放入PCR仪，25℃孵育10分钟以形成RNP，放入4℃备用。
按照1mL/孔加入T细胞培养基，放置于CO
2培养箱中预热。取实施例1中各个试验组在四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增培养48小时后的TIL细胞，混匀后进行计数，每个试验组样品取5×10
5个细胞加入P3 Buffer(20μL)，混匀细胞；将细胞加入新的PCR管中，与5μL的RNP混合；将细胞与RNP的混合物加入电转条板中，在电转仪(Lonza)中进行电转(human T cell stimulated(E0115))。电转程序结束后，立即加入预热的180μL的T细胞培养基，将全部体积转移到24孔悬浮板中，放置于CO
2培养箱中进行培养。24小时后进行细胞计数，按照TIL：饲养细胞＝1:200比例加入饲养细胞(辐照后的PBMC细胞)，放置于CO
2培养箱中继续培养72小时。取培养结束后的各个试验组的TIL细胞进行细胞计数，每个试验组取2×10
5个细胞，500g离心3分钟，离心后吸弃上清。
配制流式检测混合抗体：取Fixable Viability Dye eFluor 780(商业来源：eBioscience；65-0865-18)在PBS中稀释10000倍；取100μL稀释后的Fixable Viability Dye eFluor 780的PBS溶液，分别加入1μL的TCR-αβ-APC(商业来源：eBioscience；17-9986-42)、1μL的BB515 Mouse Anti-Hu CD8(商业来源：BD Pharmingen；564526)、1μL的PE-Cy7 Mouse Anti-Hu CD4(商业来源：BD Pharmingen；557852)，混合均匀。
每个试验组的TIL细胞样品加入100μL上述流式检测混合抗体，混合均匀后冰上孵育30分钟；孵育结束后，500g离心3分钟，离心后吸弃上清，加入200μL PBS重悬。流式细胞仪行进检测，利用Flowjo软件分析TCRβ敲除效率。
图60显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞的基因敲除效率结果。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的transACT)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有改善的基因敲除效率能力。例如，提高的TCRβ基因敲除效率。
图61显示的是，纳米基质组与对照组培养所得的TIL细胞的基因敲除效率结果。结果显示，四步骤划分法中的步骤(B)体外扩增添加CD28抗体(例如添加包含CD3抗体和CD28抗体的transACT)，相比对照组(不加入CD28抗体)，所得的TIL具有改善的基因敲除效率能力。例如，提高的TCRβ基因敲除效率。
实施例17 REP阶段结束后添加CD28激动剂的TIL增殖能力检测
参考实施例1得到源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群，将第一TIL群经过相同方式的四步骤划分法中的步骤(A)、步骤(B)、步骤(C)和步骤(D)得到第五TIL群。将第五TIL群随机分为3组，各个试验组的T细胞培养基加入IL-2的同时，其中空白组不添加任何T细胞激活剂，未添加CD28激动剂组添加CD3抗体约30ng/mL，添加CD28激动剂组添加CD3激动剂和CD28激动剂，例如以约1:100-1:2000的transACT与TIL的比例加入transACT。培养3天得到的TIL(终末刺激细胞群)，通过细胞活力检测方法使用CellTiter-Glo试剂盒(商业来源：Promega)的进行TIL细胞增殖能力的检测。
图62、图63和图64分别显示的是，对于不同供者来源的TIL，终末刺激阶段以不同方式进行体外扩增的试验组的增殖能力分析结果。图中纵坐标荧光值反映了各个试验组以不同方式进行终末刺激的TIL细胞的增殖能力。结果显示，终末刺激添加CD28激动剂，与终末刺激不添加CD28激动剂相比，具有类似的TIL增殖能力。
实施例18 TIL细胞的连续杀伤能力检测
1、TIL转导IL-12(氨基酸序列可以本申请任一项IL-12所示的氨基酸序列)后的第7天开始，将A375肿瘤细胞系以2e4/孔铺于96孔板中。
2、次日，将各组TIL细胞(NT：对照TIL和转导IL-12的TIL细胞)以效靶比(TIL细胞：肿瘤细胞)4:1的比例与上述肿瘤细胞共培养。
3、按照1.5μL/孔加入SuperView
TM 488 Caspase-3/7，使用Incucyte记录仪(Sartorius)记录Caspase 3/7的活性来分析TIL对肿瘤细胞的杀伤能力，每3小时记录1次，总记录时长约3天，本次杀伤记为R1。
4、三天后，提前将A375肿瘤细胞系以2e4/孔铺于96孔板中。收集上一轮以组为单位收集各孔中的TIL，500g离心弃上清，适量培养液重悬TIL后计数。按照4:1的效靶比，向新鲜铺板的肿瘤细胞中加入等量TIL。
5、重复步骤3，本次杀伤记为R2。
6、重复4，5步骤，本次杀伤记为R3。
图65显示的是，转导IL-12的TIL细胞可以显示出更强的连续杀伤能力。
实施例19 TIL细胞的体内效果检测
对免疫缺陷鼠(NOG小鼠，维通利华，品系代码408)进行皮下接种A375细胞，接种数量为1×10
6个细胞。约7天后，在肿瘤体积到达50-80mm
3左右根据肿瘤体积大小对小鼠进行随机分组(如下表)。每只通过尾静脉注射对照TIL和转导IL-12的TIL细胞注射液，等体积PBS作为阴性对照，记为D0。NT+IL-2组进行腹腔注射IL-2，每天2次，连续6次。
各组小鼠每周测量两次肿瘤体积，转导IL-12的TIL细胞组显示出更为显著的抑瘤能力，抑瘤效果明显强于NT+IL-2组。同时，各组小鼠分别在多个时间点取外周血，用CBA法分析血清中的IFN-γ分泌。结果表明，转导IL-12的TIL细胞组比NT+IL-2组表现出更高和更为持久的IFN-γ分泌，与其更好的抑瘤效果一致。
| 组别 | 回输剂量 | IL-2注射量(IU) | 小鼠数量 |
| PBS | \ | \ | 8 |
| NT+IL-2 | 5×10 7 | 2×10 4×3×BID | 8 |
| 转导IL-12的TIL | 5×10 7 | \ | 8 |
图66显示的是，转导IL-12的TIL细胞可以显示出更强的肿瘤体积抑制能力。图67显示的是，转导IL-12的TIL细胞可以显示出更高和更为持久的IFN-γ分泌能力。
实施例20
1.1饲养细胞接收及制备
1.1.1单采血接收
记录单采血信息，批号及体积，并复温至室温。
1.1.2 PBMC(外周血单个核细胞)手动分离及冻存
使用75％酒精消毒血袋，转移至生物安全柜内。使用无菌剪刀剪开血袋后，将单采血转移至50mL离心管内，使用20mL注射器注入20mL PBS或生理盐水清洗血袋，将洗涤液一并转入50mL离心管内。每个50mL离心管内液体体积可以不超过30mL。将单采血3000g离心10分钟。离心过程中准备6-8支50mL离心管，加入已复温的淋巴细胞分离液(天津灏洋Ficoll)，20mL/支。离心结束后，弃掉上层血浆，使用PBS或生理盐水稀释细胞沉淀，将稀释后的血细胞混合液缓慢滴加上淋巴细胞分离液上层，可以不破坏界面，每管约加25mL样品，可以不超过28mL。
离心使用水平转子，500-600g离心15-30分钟，温度18-22℃，离心结束后得到的白膜层将处于生理盐水及淋巴细胞分离液Ficoll的分界面处。吸弃上层血浆及生理盐水，用移液管吸取中间白膜层至另一干净的50mL离心管内。使用PBS或生理盐水稀释收集到的白膜层，600g离心10分钟，室温。离心结束后弃上清，PBS或生理盐水清洗细胞一次，500g离心5分钟，室温。
如红细胞较多，离心结束后可以进行裂红，按照细胞沉淀体积与红细胞裂解液1:2至1:3加入红细胞裂解液，混匀，室温裂解10分钟中，中间轻柔混匀离心管2-3次，保证裂解效果，裂解完成后加入PBS或生理盐水清洗细胞。裂红后清洗细胞两次，400g离心6分钟，最后一次离心前取样计数。
弃上清，基础培养基重悬细胞，调整细胞密度约2-3×10
7个细胞/mL，液面高度可以不超过1厘米，每T225培养瓶中体积可以低于200mL；平铺状态下，X射线辐照50Gy。离心弃上清，根据计数结果冻存细胞，约1-2×10
8个细胞/mL，1-2mL/支；将细胞放入程序降温盒内转移至﹣80℃冰箱内冻存。
1.1.3 PBMC自动分离及冻存
将血袋的管路与cpro分离套件(Cytiva)输入端无菌接管。若血量大于120mL，进行预浓缩步骤，可以将血液体积浓缩至120mL以内。可以使用neatcell程序进行PBMC分离及洗涤，洗涤液为生理盐水，中间体积20mL；重悬液为基础培养基，添加80mL/批。分离后每供者PBMC为一袋100mL，在平铺状态下，液面高度可以不超过1厘米，X射线辐照50Gy。辐照后取样计数，使用culture wash程序收集细胞并洗涤三次，洗涤液为生理盐水；设置中间体积及终体积，使得每1×10
9个细胞不少于2mL；加入等量至2倍冻存液混匀。使用1倍冻存液调整细胞密度约为1×10
7个细胞/mL至2×10
8个细胞/mL，分装20mL/袋，程序降温仪内 冻存，液氮保存。
1.2肿瘤组织接收及处理
1.2.1组织接收
接收供者的肿瘤组织及血样，核对样品信息并记录，打印相应样品标签。
1.2.2组织处理及培养
使用75％酒精消毒样品管及采血管，转移至生物安全柜内。根据上述PBMC手动分离及冻存操作程序分离血样中PBMC细胞并进行冻存。取一种具有透气表面的培养瓶或培养袋，例如培养袋(Origen)，加入300mL已复温的完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，并添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2。取数个10厘米培养皿，加入适量培养基，使用无菌眼科镊从样品管中取出肿瘤组织于10厘米培养皿中，培养基量以刚没过肿瘤组织为准，观察组织形态并记录。洗涤组织并更换培养皿。使用眼科剪及眼科镊将进行初步剪切，去除脂肪组织及坏死组织，每块组织块继续剪碎至约27立方毫米大小。取非悬浮肿瘤组织块，使用20mL注射器去除内部活塞后，与培养袋连接，使用移液管将约1g组织块通过注射器转入培养袋内。将培养袋放入二氧化碳培养箱内进行培养。清理剪刀及镊子，并用75％酒精进行初步消毒后，超声清洗后进行灭菌，得到第一TIL群。
1.3步骤(A)体外扩增及收获
1.3.1步骤(A)体外扩增
根据细胞生长状态，每3-7天补液或半量换液，保证细胞营养。使用完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，并添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2(双鹭)。步骤(A)的3-14天，例如可以第13或14天时取样计数，若细胞数目处于5×10
5至5×10
8之间时进入步骤(A)的收获步骤。
1.3.2步骤(A)的收获
收集步骤(A)体外扩增结束细胞，离心，弃去培养基，使用PBS或生理盐水洗涤细胞一次，获得经步骤(A)体外扩增的TIL(第二TIL群)，并取样计数留取约5×10
5至2×10
8个细胞进入后续体外扩增步骤；取约5×10
5个细胞可以进行质量控制检测；其余细胞加入冻存液冻存，作为冻存的preREP TIL体外细胞。
1.4步骤(B)TIL活化
继续培养经步骤(A)体外扩增的TIL(第二TIL群)，或者对冻存的preREP TIL体外细胞进行细胞复苏，进行步骤(B)的TIL活化。
使用完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，调整细胞密度为5×10
5至2×10
6个细胞/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔，添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL或6000IU/mL)的IL-2。各TIL细胞群的培养基中同时可以添加T细胞激活剂，例如添加CD3激动剂和/或CD28激动剂，例如，约30ng/mL的CD3抗体(Miltenyi Biotech，OKT3)、约30ng/mL的CD28抗体(Merck，15E8)、以约1:2-2:1的磁珠与TIL的比例加入磁珠(直径约1至10μm Dynabeads，Thermo Fisher)和/或以约1:100-1:2000的transACT(直径约100至500nm，Miltenyi)与TIL的比例加入transACT。培养约0-4天，获得第三TIL群。
1.5步骤(C)TIL细胞转导
转导前1天使用终浓度为15μg/mL的重组人纤维蛋白片段(Retronectin，Takara)包被24孔悬浮培养板，24孔板每孔250μL。避光，4℃过夜备用。取出包被好的24孔板，吸弃包被液，加入含2％BSA封闭液500μL室温封闭30分钟。吸弃封闭液，用含2.5％HEPES的洗板液500μL/孔洗板2次，吸弃缓冲液。试验组用携带本申请的目标核酸片段(氨基酸序列可以如SEQ ID NO:71所示，核苷酸序列可以如SEQ ID NO:72和/或73所示)的逆转录病毒进行转导，GFP对照组可以用携带GFP的逆转录病毒进行转导。
携带目标核酸片段的逆转录病毒的质粒构建可以用EcoRI+NotI酶切，回收外源片段。用EcoRI+NotI酶切质粒MP71，回收载体片段。用T4 Ligase连接外源片段与载体片段，得到携带目标核酸片段的逆转录病毒的质粒。携带GFP的逆转录病毒的质粒的构建采用类似的方法。
每孔加0.25-2mL逆转录病毒液，32℃，2000g，离心2小时，阴性对照组可以不进行细胞转导。弃去24孔板上清液，24孔板每孔加入第三TIL群，体积300-500μL，细胞浓度约为1×10
6个/mL。30-32℃，1000g，离心10分钟。离心完毕后，将培养板置于37℃，5％CO
2培养箱中培养，得到转导后细胞。转导后培养约0-4天，获得第四TIL群。
1.6步骤(D)TIL细胞基因转导后培养
在第四TIL细胞群中加入饲养细胞进行培养。TIL与饲养细胞接触的时间需要在步骤(B)的TIL与IL-2以及T细胞激活剂接触后的若干时间T
n以后(各个试验组的T
n可以取0小时到12天，例如24小时或48小时)。首先复苏1-5名供者混合的饲养细胞；将活化的TIL细 胞、饲养细胞按照TIL细胞：饲养细胞约为1:100至1:200的比例混合，转入G-Rex100培养瓶或者透气袋内，补充完全培养基，每1-3天取样计数，并根据细胞状态补液或半量换液直至细胞总数大于1×10
9或步骤(D)体外扩增培养约5天至约14天，终止步骤(D)体外扩增的培养。
1.7肿瘤浸润淋巴细胞的收获
取步骤(D)扩增的细胞，离心后弃去培养基上清，并使用PBS或生理盐水或复方电解质溶液清洗三次，获得经步骤(D)扩增的TIL(第五TIL群)，第三次清洗时取样计数，根据计数结果，最后一次离心后弃上清，取3×10
6细胞送质量控制检测；其余全部细胞加入冻存液，调整细胞密度1-3×10
8个细胞/mL冻存。
实施例21 TIL细胞的扩增情况的检测
基因转导(例如转导编码SEQ ID NO：71所述的核酸片段，例如SEQ ID NO：72所述的核酸片段)后的第13天开始，各组TIL细胞以相同的细胞总数重新铺板。3天后用CTG试剂盒(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay，Promega)分析TIL细胞的扩增效率。NT表示未进行基因转导的对照组。
图68显示的是，各组TIL细胞的扩增后的荧光量。结果表明，本申请的基因转导c-Jun的TIL细胞可以显著提高扩增能力。
实施例22 TIL细胞杀伤能力检测
基因转导(例如转导编码SEQ ID NO：71所述的核酸片段，例如SEQ ID NO：72所述的核酸片段)后的第13天开始，将A375肿瘤细胞系铺于96孔平底板中。次日，将各组TIL细胞以效靶比(TIL细胞：肿瘤细胞，E：T)为3:1的比例与上述肿瘤细胞共培养。肿瘤细胞和TIL细胞各100μL，每组设置三个复孔，同时设置一组只包含肿瘤细胞的对照组。根据细胞凋亡检测试剂(Incucyte Caspase-3/7 Green Dye for Apoptosis，Sartorius)的说明书，按照0.2μL/孔加入细胞凋亡检测试剂，并按照25μL/孔加入培养基稀释Caspase 3/7 Green Dye。使用Incucyte记录仪(Sartorius)记录Caspase 3/7的活性来分析TIL对肿瘤细胞的杀伤能力，每3小时记录1次，总记录时长约5天。
图69显示的是，基因转导c-Jun(例如转导编码SEQ ID NO：71所述的核酸片段)后的TIL细胞以效靶比3:1与肿瘤细胞共培养的杀伤能力检测结果。结果表明，基因转导的TIL细胞可以具有更显著的肿瘤细胞杀伤能力。
实施例23 TIL细胞因子分泌检测
基因转导(例如转导编码SEQ ID NO：71所述的核酸片段，例如SEQ ID NO：72所述的核酸片段)后的第13天开始，各组TIL细胞以相同的细胞总数重新铺板，24小时后取上清液进行细胞因子分泌检测。细胞因子分泌检测方法可以参照细胞因子检测试剂盒(BD)的说明书，将人Th1/Th2/Th17细胞因子标准品冻干粉(BD)使用2mL Assay Diluent稀释液(BD)复溶(标准品原液各细胞因子浓度均为5000pg/mL)并按顺序：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512，1:1024梯度稀释，标记为“标准品管”。取1管仅含有Assay Diluent稀释液作为参照。按照2μL/Beads/孔加入每种Capture Beads(BD)，然后按照10μL/孔加入PE Detection Reagent检测试剂(BD)并混合配制为混合物(mix)，按照22μL/孔加入V底96孔板内，随后按照10μL/孔加入各标准品和试验组的上清并混合，室温下避光孵育3小时。孵育结束，每孔加入200μL Wash Buffer(BD)，500g离心3分钟。离心结束，每孔加入100μL Wash Buffer(BD)重悬，进行流式分析。NT表示未进行基因转导的对照组。
图70显示的是，各组TIL细胞的细胞因子分泌检测结果。结果表明，本申请的基因转导c-Jun的TIL细胞可以具有更高的细胞因子分泌能力。例如，更高的IL-2、IFN-γ分泌能力。
实施例24
1.1饲养细胞接收及制备
1.1.1单采血接收
记录单采血信息，批号及体积，并复温至室温。
1.1.2 PBMC(外周血单个核细胞)手动分离及冻存
使用75％酒精消毒血袋，转移至生物安全柜内。使用无菌剪刀剪开血袋后，将单采血转移至50mL离心管内，使用20mL注射器注入20mL PBS或生理盐水清洗血袋，将洗涤液一并转入50mL离心管内。每个50mL离心管内液体体积可以不超过30mL。将单采血3000g离心10分钟。离心过程中准备6-8支50mL离心管，加入已复温的淋巴细胞分离液(天津灏洋Ficoll)，20mL/支。离心结束后，弃掉上层血浆，使用PBS或生理盐水稀释细胞沉淀，将稀释后的血细胞混合液缓慢滴加上淋巴细胞分离液上层，可以不破坏界面，每管约加25mL样品，可以不超过28mL。
离心使用水平转子，500-600g离心15-30分钟，温度18-22℃，离心结束后得到的白膜层将处于生理盐水及淋巴细胞分离液Ficoll的分界面处。吸弃上层血浆及生理盐水，用移液管吸取中间白膜层至另一干净的50mL离心管内。使用PBS或生理盐水稀释收集到的白膜 层，600g离心10分钟，室温。离心结束后弃上清，PBS或生理盐水清洗细胞一次，500g离心5分钟，室温。
如红细胞较多，离心结束后可以进行裂红，按照细胞沉淀体积与红细胞裂解液1:2至1:3加入红细胞裂解液，混匀，室温裂解10分钟中，中间轻柔混匀离心管2-3次，保证裂解效果，裂解完成后加入PBS或生理盐水清洗细胞。裂红后清洗细胞两次，400g离心6分钟，最后一次离心前取样计数。
弃上清，基础培养基重悬细胞，调整细胞密度约2-3×10
7个细胞/mL，液面高度可以不超过1厘米，每T225培养瓶中体积可以低于200mL；平铺状态下，X射线辐照50Gy。离心弃上清，根据计数结果冻存细胞，约1-2×10
8个细胞/mL，1-2mL/支；将细胞放入程序降温盒内转移至﹣80℃冰箱内冻存。
1.1.3 PBMC自动分离及冻存
将血袋的管路与cpro分离套件(Cytiva)输入端无菌接管。若血量大于120mL，进行预浓缩步骤，可以将血液体积浓缩至120mL以内。可以使用neatcell程序进行PBMC分离及洗涤，洗涤液为生理盐水，中间体积20mL；重悬液为基础培养基，添加80mL/批。分离后每供者PBMC为一袋100mL，在平铺状态下，液面高度可以不超过1厘米，X射线辐照50Gy。辐照后取样计数，使用culture wash程序收集细胞并洗涤三次，洗涤液为生理盐水；设置中间体积及终体积，使得每1×10
9个细胞不少于2mL；加入等量至2倍冻存液混匀。使用1倍冻存液调整细胞密度约为1×10
7个细胞/mL至2×10
8个细胞/mL，分装20mL/袋，程序降温仪内冻存，液氮保存。
1.2肿瘤组织接收及处理
1.2.1组织接收
接收供者的肿瘤组织及血样，核对样品信息并记录，打印相应样品标签。
1.2.2组织处理及培养
使用75％酒精消毒样品管及采血管，转移至生物安全柜内。根据上述PBMC手动分离及冻存操作程序分离血样中PBMC细胞并进行冻存。取一种具有透气表面的培养瓶或培养袋，例如培养袋(Origen)，加入300mL已复温的完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，并添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2。取数个10厘米培养皿，加入适量培养基，使用无菌眼科镊从样品管中取出肿瘤组织于10厘米培养皿中，培养基量以刚没过肿瘤组 织为准，观察组织形态并记录。洗涤组织并更换培养皿。使用眼科剪及眼科镊将进行初步剪切，去除脂肪组织及坏死组织，每块组织块继续剪碎至约27立方毫米大小。取非悬浮肿瘤组织块，使用20mL注射器去除内部活塞后，与培养袋连接，使用移液管将约1g组织块通过注射器转入培养袋内。将培养袋放入二氧化碳培养箱内进行培养。清理剪刀及镊子，并用75％酒精进行初步消毒后，超声清洗后进行灭菌，得到第一TIL群。
1.3步骤(A)体外扩增及收获
1.3.1步骤(A)体外扩增
根据细胞生长状态，每3-7天补液或半量换液，保证细胞营养。使用完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，并添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2(双鹭)。步骤(A)的3-14天，例如可以第13或14天时取样计数，若细胞数目处于5×10
5至5×10
8之间时进入步骤(A)的收获步骤。
1.3.2步骤(A)的收获
收集步骤(A)体外扩增结束细胞，离心，弃去培养基，使用PBS或生理盐水洗涤细胞一次，获得经步骤(A)体外扩增的TIL(第二TIL群)，并取样计数留取约5×10
5至2×10
8个细胞进入后续体外扩增步骤；取约5×10
5个细胞可以进行质量控制检测；其余细胞加入冻存液冻存，作为冻存的preREP TIL体外细胞。
1.4步骤(B)TIL活化
继续培养经步骤(A)体外扩增的TIL(第二TIL群)，或者对冻存的preREP TIL体外细胞进行细胞复苏，进行步骤(B)的TIL活化。
使用完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，调整细胞密度为5×10
5至2×10
6个细胞/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔，添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL或6000IU/mL)的IL-2。各TIL细胞群的培养基中同时可以添加T细胞激活剂，例如添加CD3激动剂和/或CD28激动剂，例如，约30ng/mL的CD3抗体(Miltenyi Biotech，OKT3)、约30ng/mL的CD28抗体(Merck，15E8)、以约1:2-2:1的磁珠与TIL的比例加入磁珠(直径约1至10μm Dynabeads，Thermo Fisher)和/或以约1:100-1:2000的transACT(直径约100至500nm，Miltenyi)与TIL的比例加入transACT。培养约0-4天，获得第三TIL群。
1.5步骤(C)TIL细胞转导
转导前1天使用终浓度为15μg/mL的重组人纤维蛋白片段(Retronectin，Takara)包被24孔悬浮培养板，24孔板每孔250μL。避光，4℃过夜备用。取出包被好的24孔板，吸弃包被液，加入含2％BSA缓冲液500μL室温封闭30分钟。吸弃封闭液，用含2.5％HEPES的洗板液500μL/孔洗板2次，吸弃缓冲液。试验组用携带本申请的目标核酸片段(核苷酸序列可以如SEQ ID NO:74、75和/或79所示)的逆转录病毒进行转导，GFP对照组可以用携带GFP的逆转录病毒进行转导。
携带目标核酸片段的逆转录病毒的质粒构建可以用EcoRI+NotI酶切，回收外源片段。用EcoRI+NotI酶切质粒MP71，回收载体片段。用T4 Ligase连接外源片段与载体片段，得到携带目标核酸片段的逆转录病毒的质粒。携带GFP的逆转录病毒的质粒的构建采用类似的方法。
每孔加0.25-2mL逆转录病毒液，32℃，2000g，离心2小时，阴性对照组可以不进行细胞转导。弃去24孔板上清液，24孔板每孔加入第三TIL群，体积300-500μL，细胞浓度约为1×10
6个/mL。30-32℃，1000g，离心10分钟。离心完毕后，将培养板置于37℃，5％CO
2培养箱中培养，得到转导后细胞。转导后培养约0-4天，获得第四TIL群。
1.6步骤(D)TIL细胞基因转导后培养
在第四TIL细胞群中加入饲养细胞进行培养。TIL与饲养细胞接触的时间需要在步骤(B)的TIL与IL-2以及T细胞激活剂接触后的若干时间T
n以后(各个试验组的T
n可以取0小时到12天，例如24小时或48小时)。首先复苏1-5名供者混合的饲养细胞；将活化的TIL细胞、饲养细胞按照TIL细胞：饲养细胞约为1:100至1:200的比例混合，转入G-Rex100培养瓶或者透气袋内，补充完全培养基，每1-3天取样计数，并根据细胞状态补液或半量换液直至细胞总数大于1×10
9或步骤(D)体外扩增培养约5天至约14天，终止步骤(D)体外扩增的培养。
1.7肿瘤浸润淋巴细胞的收获
取步骤(D)扩增的细胞，离心后弃去培养基上清，并使用PBS或生理盐水或复方电解质溶液清洗三次，获得经步骤(D)扩增的TIL(第五TIL群)，第三次清洗时取样计数，根据计数结果，最后一次离心后弃上清，取3×10
6细胞送质量控制检测；其余全部细胞加入冻存液，调整细胞密度1-3×10
8个细胞/mL冻存。
实施例25 TIL细胞的扩增情况的检测
基因转导(例如转导SEQ ID NO：75所述的核酸片段)后的第13天开始，各组TIL细胞以相同的细胞总数重新铺板。3天后用CTG试剂盒(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay，Promega)分析TIL细胞的扩增效率。NT表示未进行基因转导的对照组。
图71显示的是，各组TIL细胞的扩增后的荧光量。结果表明，本申请的基因转导的TIL细胞可以显著提高扩增能力。
实施例26 TIL细胞杀伤能力检测
基因转导(例如转导SEQ ID NO：74或75所述的核酸片段)后的第13天开始，将A375肿瘤细胞系或A375-aCD3肿瘤细胞系铺于96孔平底板中。次日，将各组TIL细胞以效靶比(TIL细胞：肿瘤细胞，E：T)为1:1或3:1的比例与上述肿瘤细胞共培养。肿瘤细胞和TIL细胞各100μL，每组设置三个复孔，同时设置一组只包含肿瘤细胞的对照组。根据细胞凋亡检测试剂(Incucyte Caspase-3/7 Green Dye for Apoptosis，Sartorius)的说明书，按照0.2μL/孔加入细胞凋亡检测试剂，并按照25μL/孔加入培养基稀释Caspase 3/7 Green Dye。使用Incucyte记录仪(Sartorius)记录Caspase 3/7的活性来分析TIL对肿瘤细胞的杀伤能力，每3小时记录1次，总记录时长约5天。
图72A显示的是，基因转导(例如转导SEQ ID NO：74所述的核酸片段)后的TIL细胞以效靶比1:1与肿瘤细胞共培养的杀伤能力检测结果。图72B显示的是，基因转导(例如转导SEQ ID NO：75所述的核酸片段)后的TIL细胞以效靶比3:1与肿瘤细胞共培养的杀伤能力检测结果。结果表明，基因转导的TIL细胞可以具有更显著的肿瘤细胞杀伤能力。
实施例27 TIL细胞因子分泌检测
基因转导(例如转导SEQ ID NO：75所述的核酸片段)后的第13天开始，各组TIL细胞以相同的细胞总数重新铺板，24小时后取上清液进行细胞因子分泌检测。细胞因子分泌检测方法可以参照细胞因子检测试剂盒(BD)的说明书，将人Th1/Th2/Th17细胞因子标准品冻干粉(BD)使用2mL Assay Diluent稀释液(BD)复溶(标准品原液各细胞因子浓度均为5000pg/mL)并按顺序：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512，1:1024梯度稀释，标记为“标准品管”。取1管仅含有Assay Diluent稀释液作为参照。按照2μL/Beads/孔加入每种Capture Beads(BD)，然后按照10μL/孔加入PE Detection Reagent检测试剂(BD)并混合配制为混合物(mix)，按照22μL/孔加入V底96孔板内，随后按照10μL/孔加入各标准品和试验组的上清并混合，室温下避光孵育3小时。孵育结束，每孔加入200μL Wash Buffer(BD)，500g离心3分钟。离心结束，每孔加入100μL Wash Buffer(BD)重悬，进行流式分析。NT表示未进行基因转导的对照组。
图73显示的是，各组TIL细胞的细胞因子分泌检测结果。结果表明，本申请的基因转导 的TIL细胞可以具有更高的细胞因子分泌能力。例如，更高的IL-2分泌能力。
实施例28饲养细胞不同添加时间培养的TIL特性
饲养细胞不同添加时间培养的TIL的结果统计
在实施例1的1.4的第二阶段扩增的TIL活化中，取第一阶段扩增的细胞量，调整细胞密度为5×10
5至2×10
6/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔，添加CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL，添加浓度约为1000～9000IU/mL的IL-2，例如3000或6000IU/mL的IL-2。加入上述OKT3和IL-2后的0小时、24小时、48小时以后，将饲养细胞加入肿瘤浸润淋巴细胞的培养环境中。其中，TIL与饲养细胞可以按照比率1:40-1:400加入，第二阶段扩增培养约9-14天后收集全部细胞，检测和统计培养所得TIL的结果。
增殖能力检测
对于上述饲养细胞不同添加时间培养获得的TIL进行细胞计数。
不同供者肿瘤来源的TIL作为各自不同的批次；将各个批次的加入OKT3和IL-2同时(0h组)加入饲养细胞的试验组的数据作为基准1，将同批次其它时间点试验组的数据进行标准化处理，统计各试验组在第二阶段扩增相对于0h组的相对增殖能力。
图74A显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞增殖能力结果图。相比于加入OKT3和IL-2后的0小时后(即同时)添加饲养细胞培养的TIL，加入OKT3和IL-2后的24小时或48小时后加饲养细胞培养的TIL增殖能力显著增强。
流式检测TIL细胞组成
对于上述饲养细胞不同添加时间培养获得的TIL群进行流式检测。
不同供者肿瘤来源的TIL作为各自不同的批次；将各个批次的加入OKT3和IL-2同时(0h组)加入饲养细胞的试验组的数据作为基准1，将同批次其它时间点试验组的数据进行标准化处理，统计各试验组在第二阶段扩增相对于0h组的细胞组成比例。
流式检测的试验流程可以参照本申请实施例3的内容。
图74B显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD45RA
-CCR7
+中心记忆T细胞(Tcm)比例结果图。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高CD8
+中和/或CD4
+中的中心记忆T细胞的比例。
图74C显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的TCF1
+干细胞样T细胞比例。结果显示，24小时或48小时 后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高CD8
+中的干细胞样T细胞的比例。
图74D显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD4
+CD25
+Foxp3
+调节性T细胞(Treg)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更少的调节性T细胞的比例。
图74E显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(PD-1
+)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的活化T细胞的比例，例如CD8
+中和/或CD4
+中的PD-1
+细胞比例更高。
图74F显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD103
+CD39
+肿瘤特异性T细胞比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的CD8
+中和/或CD4
+中的肿瘤特异性T细胞的比例。
图74G显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(CD28
+)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的活化T细胞的比例，例如CD8
+CD28
+细胞比例更高。
图74H显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(41BB
+)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的活化T细胞的比例，例如CD8
+中和/或CD4
+中的41BB
+细胞比例更高。
图74I显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(CD25
+)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的活化T细胞的比例，例如CD8
+中和/或CD4
+中的CD25
+细胞比例更高。
胞内因子表达检测
试验准备
配制胞内因子表达检测所需培养基：取T细胞培养基，按照体积比1:500添加CD107a抗体(BD)。
检测步骤
取各个试验组的TIL离心后，使用600μL上述胞内因子表达检测所需培养基重悬为1×10
6个细胞/mL，加入96孔板内，100μL/孔，置于37℃培养箱孵育过夜。
孵育结束后，200μL/孔PBS洗涤一次，600g离心3分钟，弃上清。配制抗体混合工作液进行细胞表面染色CD3/CD4/CD8(BD)，抗体浓度为1:100，viability(1:10000)，50μL/组染色，2-8℃避光孵育30分钟。染色结束后清洗细胞，使用PBS重悬，进行流式上机检测。
图74J显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的胞内因子表达能力。例如，更高的CD3
+中、CD8
+中和/或CD4
+中的CD107a表达能力。
细胞因子分泌检测
细胞因子分泌检测方法可以参照细胞因子检测试剂盒(BD)的说明书，将人Th1/Th2/Th17细胞因子标准品冻干粉(BD)使用2mL Assay Diluent稀释液(BD)复溶(标准品原液各细胞因子浓度均为5000pg/mL)并按顺序：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512，1:1024梯度稀释，标记为“标准品管”。取1管仅含有Assay Diluent稀释液作为参照。按照2μL/Beads/孔加入每种Capture Beads(BD)，然后按照10μL/孔加入PE Detection Reagent检测试剂(BD)并混合配制为混合物(mix)，按照22μL/孔加入V底96孔板内，随后按照10μL/孔加入各标准品和试验组的上清并混合，室温下避光孵育3小时。
孵育结束，每孔加入200μL Wash Buffer(BD)，500g离心3分钟。离心结束，每孔加入100μL Wash Buffer(BD)重悬，进行流式分析。
图74K显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞因子分泌检测结果。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的细胞因子分泌能力。例如，更高的TNF-α分泌能力、或更高的IFN-γ分泌能力。
饲养细胞不同添加时间培养的TIL的结果统计
在实施例1的1.4的第二阶段扩增的TIL活化中，取第一阶段扩增的细胞量，调整细胞密度为5×10
5至2×10
6/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔，添加CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL，添加浓度约为1000～9000IU/mL的IL-2，例如3000或6000IU/mL的IL-2。加入上述OKT3和IL-2后的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天以后，将饲养细胞加入肿瘤浸润淋巴细胞的培养环境中。其中，TIL与饲养细胞可以按照比率 1:40-1:400加入，例如1:200，第二阶段扩增培养约9-14天后收集全部细胞，检测和统计培养所得TIL的结果。
增殖能力检测
对于上述饲养细胞不同添加时间培养获得的TIL进行细胞计数。
图74L显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞增殖能力结果图。相比于加入OKT3和IL-2后的0小时后(即同时)添加饲养细胞培养的TIL，加入OKT3和IL-2后的12小时或更多时间后加饲养细胞培养的TIL增殖能力显著增强。
流式检测TIL细胞组成
对于上述饲养细胞不同添加时间培养获得的TIL群进行流式检测。
不同供者肿瘤来源的TIL作为各自不同的批次；将各个批次的加入OKT3和IL-2同时(0h组)加入饲养细胞的试验组的数据作为基准1，将同批次其它时间点试验组的数据进行标准化处理，统计各试验组在第二阶段扩增相对于0h组的细胞组成比例。
流式检测的试验流程可以参照本申请实施例3的内容。
图74M显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD8
+T细胞比例。结果显示，加入OKT3和IL-2后的12小时或更多时间后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的CD8
+T细胞的比例。
图74N显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD45RO
+CD62L
+T细胞比例。结果显示，加入OKT3和IL-2后的12小时或更多时间后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的记忆T细胞(Tcm，CD45RO
+CD62L
+)的比例。
图74O显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的NK T细胞比例。结果显示，加入OKT3和IL-2后的12小时或更多时间后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的NK T细胞的比例。
图74P显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD4
+CD25
+Foxp3
+调节性T细胞(Treg)比例。结果显示，加入OKT3和IL-2后的12小时或更多时间后添加饲养 细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更少的调节性T细胞的比例。
本申请培养的TIL的杀伤能力检测
对于实施例1的1.4的第二阶段扩增的TIL活化中，取第一阶段扩增的细胞量，调整细胞密度为5×10
5至2×10
6/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔，添加CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL，添加浓度约为1000～9000IU/mL的IL-2，例如3000或6000IU/mL的IL-2。加入上述OKT3和IL-2后的12小时至14天后，例如48小时以后，将饲养细胞加入肿瘤浸润淋巴细胞的培养环境中。其中，TIL与饲养细胞可以按照比率1:40-1:400加入，第二阶段扩增培养约9-14天后收集全部细胞，检测和统计培养所得TIL的细胞杀伤能力检测。
细胞准备
准备用于检测的各个试验组获得的TIL和用于共培养的靶细胞(例如A375黑色素瘤细胞和/或Hela宫颈癌细胞)。
检测步骤
用CFSE(5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，Sigma，21888-25MG-F)标记肿瘤细胞：用PBS清洗肿瘤细胞，重悬肿瘤细胞于500μL的PBS中；将CFSE加入500μL的PBS中，与500μL的肿瘤细胞PBS重悬液混合，至CFSE的终浓度为0.5μmol/L。37℃孵育6分钟后，加含10％FBS的培养基清洗，600g离心5分钟，用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基重悬肿瘤细胞浓度为1×10
6个细胞/mL。对各个试验组的TIL群600g离心5分钟，按照效靶比(TIL细胞与肿瘤细胞的比例)3:1重悬TIL细胞(即重悬TIL细胞浓度为3×10
6个细胞/mL)。于U底96孔板(Corning)中加入肿瘤细胞和TIL细胞各100μL，每组设置三个复孔。同时设置一组只包含肿瘤细胞的对照组。将孔板200g离心1分钟，置于37℃孵育4小时至过夜。其中，TIL与肿瘤细胞共培养时，可以不加激活TIL细胞的物质作为无激活组，或者加入transACT(Miltenyi，包含CD3抗体和CD28抗体的纳米基质材料)作为激活组。
孵育完成后，600g离心3分钟，弃上清，每孔加入20μL胰酶，37℃培养箱内孵育3-5分钟消化肿瘤细胞，消化完成后加入180μL含10％FBS的培养基终止消化。将Dapi(碧云天，C0060)用1：100稀释，然后每孔加入20μL稀释后的Dapi。进行流式上机检测。
杀伤率％＝Dapi
+CFSE
+细胞数/总CFSE
+×100％，或杀伤率可以通过Dapi
+细胞数/总肿瘤细胞数表示。
图74Q显示的是，加入OKT3和IL-2的48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞杀伤能力结果。结果显示，加入OKT3和IL-2后的48小时后添加饲养细 胞培养的TIL均具有显著的肿瘤细胞杀伤能力，例如黑色素瘤和/或宫颈肿瘤。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
Claims (349)
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的白介素-12(IL-12)和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
- 根据权利要求1所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与所述饲养细胞共培养之后，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
- 根据权利要求1-2中任一项所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与所述饲养细胞共培养之前，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法包含：在所述TIL与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触之后且在所述TIL与所述饲养细胞共培养之前使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
- 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法包含：在所述TIL与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触基本上同时使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
- 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，所述方法包含：在所述TIL与所述饲养细胞共培养基本上同时使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中所述TIL包含与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养获得的TIL。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中所述TIL包含使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL。
- 根据权利要求1-8中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
- 根据权利要求9所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
- 根据权利要求10所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比 例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
- 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
- 根据权利要求12所述的方法，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
- 根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
- 根据权利要求13-14中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
- 根据权利要求15所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
- 根据权利要求16所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
- 根据权利要求1-17中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含膜锚定的IL-12和/或分泌的IL-12。
- 根据权利要求1-18中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p40结构域。
- 根据权利要求19所述的方法，所述p40结构域包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-20中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p35结构域。
- 根据权利要求21所述的方法，所述p35结构域包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求21-22中任一项所述的方法，所述p40结构域与所述p35结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求23所述的方法，所述间接连接包含通过连接子连接。
- 根据权利要求24所述的方法，所述连接子包含选自以下组所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：43-49、(SEQ ID NO：50) l、(SEQ ID NO：51) m、(SEQ ID NO：52) n、(SEQ ID NO：53) p、和(SEQ ID NO：54) q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
- 根据权利要求1-25中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含信号肽结构域。
- 根据权利要求26所述的方法，所述信号肽结构域包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求26-27中任一项所述的方法，所述信号肽结构域与所述p40结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求1-28中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含跨膜结构域。
- 根据权利要求29所述的方法，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域包含如SEQ ID NO：56-61和66-70中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求29-30中任一项所述的方法，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域与所述信号肽结构域和/或所述p35结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求1-31中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含胞内结构域。
- 根据权利要求32所述的方法，所述胞内结构域包含如SEQ ID NO：62-65中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求32-33中任一项所述的方法，所述胞内结构域与所述跨膜结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求1-34中任一项所述的方法，所述IL-12的所述功能活性片段包含如SEQ ID NO：42和/或55所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-35中任一项所述的方法，所述IL-12包含如SEQ ID NO：34-40中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-36中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段的表达提高包含所述IL-12和/或其功能活性片段的合成和/或分泌提高。
- 根据权利要求1-37中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
- 根据权利要求1-38中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
- 根据权利要求1-39中任一项所述的方法，所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例 为至少约5％以上。
- 根据权利要求1-40中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求41所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求41-42中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求41-43中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求44所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行至少约7天。
- 根据权利要求44-45中任一项所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行约7天至约14天。
- 根据权利要求44-46中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行至少约7天。
- 根据权利要求44-47中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行约7天至约14天。
- 根据权利要求1-48中任一项所述的方法，使所述TIL在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求1-49中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求1-50中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求1-50中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求1-52中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
- 根据权利要求1-53中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多 种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
- 根据权利要求1-54中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
- 根据权利要求1-55中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
- 根据权利要求1-56中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
- 根据权利要求1-57中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求58所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求1-59中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
- 根据权利要求60所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
- 根据权利要求60-61中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
- 根据权利要求60-62中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂接触。
- 根据权利要求1-63中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种：分化簇80(CD80)、CD86、CD276、4-1BB配体(4-1BBL)、CD27、CD30、CD134、CD275、CD40、CD258、以及它们的功能活性片段。
- 根据权利要求1-64中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、疱疹病毒进入介质(HVEM)、CD40L、OX40和4-1BB。
- 根据权利要求1-65中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。
- 根据权利要求1-66中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂。
- 根据权利要求1-67中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/ 或其抗原结合片段。
- 根据权利要求1-68中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD28激动剂。
- 根据权利要求1-69中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段。
- 根据权利要求1-70中任一项所述的方法，所述使TIL与所述T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；和(3)将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求71所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约30ng/mL。
- 根据权利要求71-72中任一项所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约30ng/mL-约300ng/mL。
- 根据权利要求71-73中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
- 根据权利要求71-74中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
- 根据权利要求74-75中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
- 根据权利要求71-76中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
- 根据权利要求71-77中任一项所述的方法，每mg所述固相介质中包含的每一种所述T细胞激活剂的量各自独立地至少为约25μg。
- 根据权利要求71-78中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求71-79中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求1-80中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求81所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求81-82中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求81-83中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求1-84中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求1-85中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
- 根据权利要求1-86中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
- 根据权利要求1-87中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求1-88中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
- 根据权利要求1-89中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
- 根据权利要求90所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；(B)使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
- 根据权利要求93所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
- 根据权利要求93-94中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
- 根据权利要求92-95中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
- 根据权利要求92-96中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约7天至约14天。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)使所述第三TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；(B)使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)使所述第三TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群。
- 根据权利要求99所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
- 根据权利要求99-100中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
- 根据权利要求98-101中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
- 根据权利要求98-102中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约0天至约8天。
- 根据权利要求98-103中任一项所述的方法，所述步骤(C)进行约5天至约14天。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)使所述第三TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群；(D)使所述第四TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(D)得到第五TIL群。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；(B)使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)使所述第三TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群；(D)使所述第四TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(D)得到第五TIL群。
- 根据权利要求106所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
- 根据权利要求106-107中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群冷冻保存获得的TIL群。
- 根据权利要求105-108中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
- 根据权利要求105-109中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约0天至约4天。
- 根据权利要求105-110中任一项所述的方法，所述步骤(C)进行约0天至约4天。
- 根据权利要求105-111中任一项所述的方法，所述步骤(D)进行约5天至约14天。
- 根据权利要求92-112中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
- 根据权利要求113所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
- 根据权利要求114所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
- 根据权利要求92-115中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
- 根据权利要求116所述的方法，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
- 根据权利要求92-117中任一项所述的方法，其中编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
- 根据权利要求117-118中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
- 根据权利要求119所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
- 根据权利要求120所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
- 根据权利要求92-121中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含膜锚定的IL-12和/或分泌的IL-12。
- 根据权利要求92-122中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p40结构域。
- 根据权利要求123所述的方法，所述p40结构域包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求92-124中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p35结构域。
- 根据权利要求125所述的方法，所述p35结构域包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求125-126中任一项所述的方法，所述p40结构域与所述p35结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求127所述的方法，所述间接连接包含通过连接子连接。
- 根据权利要求128所述的方法，所述连接子包含选自以下组所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：43-49、(SEQ ID NO：50) l、(SEQ ID NO：51) m、(SEQ ID NO：52) n、(SEQ ID NO：53) p、和(SEQ ID NO：54) q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
- 根据权利要求92-129中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含信号肽结构域。
- 根据权利要求130所述的方法，所述信号肽结构域包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求130-131中任一项所述的方法，所述信号肽结构域与所述p40结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求92-132中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含跨膜结构域。
- 根据权利要求133所述的方法，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域包含如SEQ ID NO：56-61和66-70中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求133-134中任一项所述的方法，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域与所述信号肽结构域和/或所述p35结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求92-135中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含胞内结构域。
- 根据权利要求136所述的方法，所述胞内结构域包含如SEQ ID NO：62-65中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求136-137中任一项所述的方法，所述胞内结构域与所述跨膜结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求92-138中任一项所述的方法，所述IL-12的所述功能活性片段包含如SEQ ID NO：42和/或55所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求92-139中任一项所述的方法，所述IL-12包含如SEQ ID NO：34- 40中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求92-140中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段的表达提高包含所述IL-12和/或其功能活性片段的合成和/或分泌提高。
- 根据权利要求92-141中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
- 根据权利要求92-142中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
- 根据权利要求92-143中任一项所述的方法，所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
- 根据权利要求92-144中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求92-145中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求92-146中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求92-146中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求92-148中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
- 根据权利要求92-149中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
- 根据权利要求92-150中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
- 根据权利要求92-151中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
- 根据权利要求92-152中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
- 根据权利要求92-153中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包 含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求154所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求92-155中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种：分化簇80(CD80)、CD86、CD276、4-1BB配体(4-1BBL)、CD27、CD30、CD134、CD275、CD40、CD258、以及它们的功能活性片段。
- 根据权利要求92-156中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、疱疹病毒进入介质(HVEM)、CD40L、OX40和4-1BB。
- 根据权利要求92-157中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。
- 根据权利要求92-158中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂。
- 根据权利要求92-159中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
- 根据权利要求92-160中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含CD28激动剂。
- 根据权利要求92-161中任一项所述的方法，所述T细胞激活剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段。
- 根据权利要求92-162中任一项所述的方法，所述使TIL与所述T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；和(3)将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求163所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约30ng/mL。
- 根据权利要求163-164中任一项所述的方法，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约30ng/mL-约300ng/mL。
- 根据权利要求163-165中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
- 根据权利要求163-166中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至 约500纳米。
- 根据权利要求166-167中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
- 根据权利要求163-168中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
- 根据权利要求163-169中任一项所述的方法，每mg所述固相介质中包含的每一种所述T细胞激活剂的量各自独立地至少为约25μg。
- 根据权利要求163-170中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求163-171中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求92-172中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述T细胞激活剂以及所述T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求92-173中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
- 根据权利要求92-174中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
- 根据权利要求92-175中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求92-176中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
- 根据权利要求92-177中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
- 根据权利要求178所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触。
- 根据权利要求180所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与CD28激动剂接触之后，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
- 根据权利要求180-181中任一项所述的方法，所述方法包含：使所述TIL与 CD28激动剂接触之前，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，其中所述TIL包含与CD28激动剂接触获得的TIL。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包含：使所述TIL与CD28激动剂接触，其中所述TIL包含使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL。
- 根据权利要求180-184中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
- 根据权利要求185所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
- 根据权利要求186所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
- 根据权利要求180-187中任一项所述的方法，与在体外扩增阶段未曾与所述CD28激动剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与所述CD28激动剂接触过的所述TIL显示出改善的基因编辑效果。
- 根据权利要求188所述的方法，所述改善的基因编辑效果包含提高的基因敲除效率。
- 根据权利要求180-189中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
- 根据权利要求190所述的方法，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
- 根据权利要求190-191任一项所述的方法，其中编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
- 根据权利要求190-192中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
- 根据权利要求193所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
- 根据权利要求194所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
- 根据权利要求180-195中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含膜锚定的IL-12和/或分泌的IL-12。
- 根据权利要求180-196中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p40结构域。
- 根据权利要求197所述的方法，所述p40结构域包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求180-198中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p35结构域。
- 根据权利要求199所述的方法，所述p35结构域包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求199-200中任一项所述的方法，所述p40结构域与所述p35结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求201所述的方法，所述间接连接包含通过连接子连接。
- 根据权利要求202所述的方法，所述连接子包含选自以下组所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：43-49、(SEQ ID NO：50) l、(SEQ ID NO：51) m、(SEQ ID NO：52) n、(SEQ ID NO：53) p、和(SEQ ID NO：54) q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
- 根据权利要求180-203中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含信号肽结构域。
- 根据权利要求204所述的方法，所述信号肽结构域包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求204-205中任一项所述的方法，所述信号肽结构域与所述p40结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求180-206中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含跨膜结构域。
- 根据权利要求207所述的方法，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域包含如SEQ ID NO：56-61和66-70中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求207-208中任一项所述的方法，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域与所述信号肽结构域和/或所述p35结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求180-209中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含胞内结构域。
- 根据权利要求210所述的方法，所述胞内结构域包含如SEQ ID NO：62-65中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求210-211中任一项所述的方法，所述胞内结构域与所述跨膜结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求180-212中任一项所述的方法，所述IL-12的所述功能活性片段包含如SEQ ID NO：42和/或55所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求180-213中任一项所述的方法，所述IL-12包含如SEQ ID NO：34-40中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求180-214中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段的表达提高包含所述IL-12和/或其功能活性片段的合成和/或分泌提高。
- 根据权利要求180-215中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
- 根据权利要求180-216中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
- 根据权利要求180-217中任一项所述的方法，所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
- 根据权利要求180-218中任一项所述的方法，其中，使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与CD28激动剂接触。
- 根据权利要求219所述的方法，其中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使经所述第一阶段体外扩增的TIL与所述CD28激动剂接触。
- 根据权利要求220所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行至少约7天。
- 根据权利要求220-221中任一项所述的方法，所述第一阶段体外扩增进行约7天至约14天。
- 根据权利要求220-222中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行至少约7天。
- 根据权利要求220-223中任一项所述的方法，所述第二阶段体外扩增进行约7天至约14天。
- 根据权利要求180-224中任一项所述的方法，所述CD28激动剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段、和/或CD86和/或其功能活性片段。
- 根据权利要求180-225中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述CD28激动剂之外的其它T细胞激活剂接触。
- 根据权利要求226所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
- 根据权利要求226-227中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强且使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
- 根据权利要求226-228中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述其它T细胞激活剂接触。
- 根据权利要求226-229中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触。
- 根据权利要求226-230中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。
- 根据权利要求226-231中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含CD3激动剂。
- 根据权利要求226-232中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
- 根据权利要求226-233中任一项所述的方法，所述使TIL与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述CD28激动剂 以及所述其它T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；(3)将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求234所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少约30ng/mL。
- 根据权利要求234-235中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为约30ng/mL-约300ng/mL。
- 根据权利要求234-236中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
- 根据权利要求234-237中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
- 根据权利要求237-238中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
- 根据权利要求234-239中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
- 根据权利要求234-240中任一项所述的方法，每mg所述固相介质包含至少约25μg的所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂。
- 根据权利要求234-241中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求234-242中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求180-243中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL在与CD28激动剂接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
- 根据权利要求244所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求244-245中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与CD28激动剂接触且使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求244-246中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩 增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求244-247中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触至少约2小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求244-248中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求244-249中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求244-249中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求244-251中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
- 根据权利要求244-252中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
- 根据权利要求244-253中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
- 根据权利要求244-254中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
- 根据权利要求244-255中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
- 根据权利要求244-256中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求244-257中任一项所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求180-258中任一项所述的方法，所述方法还包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求259所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求259-260中任一项所述的方法，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述CD28激动剂以及所述T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求259-261中任一项所述的方法，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求259-262中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及所述T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求259-263中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
- 根据权利要求259-264中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
- 根据权利要求259-265中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求259-266中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
- 根据权利要求180-267中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
- 根据权利要求268所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
- 一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：(A)复苏和/或继续培养体外TIL群得到第二TIL群，其中，所述体外TIL群包含由源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群体外扩增获得的TIL群；(B)使所述第二TIL群的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强，且使所述TIL与CD28激动剂接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。
- 根据权利要求271所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一TIL群接触T细胞生长因子获得的TIL群。
- 根据权利要求271-272中任一项所述的方法，所述体外TIL群包含由所述第一 TIL群冷冻保存获得的TIL群。
- 根据权利要求270-273中任一项所述的方法，所述步骤(A)进行约7天至约14天。
- 根据权利要求270-274中任一项所述的方法，所述步骤(B)进行约7天至约14天。
- 根据权利要求270-275中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL显示出改善的TIL特性。
- 根据权利要求276所述的方法，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
- 根据权利要求277所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
- 根据权利要求270-278中任一项所述的方法，与在体外扩增阶段未曾与所述CD28激动剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与所述CD28激动剂接触过的所述TIL显示出改善的基因编辑效果。
- 根据权利要求279所述的方法，所述改善的基因编辑效果包含提高的基因敲除效率。
- 根据权利要求270-280中任一项所述的方法，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸引入所述TIL中。
- 根据权利要求281所述的方法，其中所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强包含将包含所述核酸的载体引入所述TIL中。
- 根据权利要求270-282中任一项所述的方法，其中编码所述IL-12和/或其功能活性片段的核酸被整合到所述TIL的基因组中。
- 根据权利要求282-283中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
- 根据权利要求284所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体。
- 根据权利要求285所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含慢病毒载体。
- 根据权利要求270-286中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含膜锚定的IL-12和/或分泌的IL-12。
- 根据权利要求270-287中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p40结构域。
- 根据权利要求288所述的方法，所述p40结构域包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求270-289中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含p35结构域。
- 根据权利要求290所述的方法，所述p35结构域包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求290-291中任一项所述的方法，所述p40结构域与所述p35结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求292所述的方法，所述间接连接包含通过连接子连接。
- 根据权利要求293所述的方法，所述连接子包含选自以下组所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：43-49、(SEQ ID NO：50) l、(SEQ ID NO：51) m、(SEQ ID NO：52) n、(SEQ ID NO：53) p、和(SEQ ID NO：54) q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
- 根据权利要求270-294中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含信号肽结构域。
- 根据权利要求295所述的方法，所述信号肽结构域包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求295-296中任一项所述的方法，所述信号肽结构域与所述p40结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求270-297中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包含跨膜结构域。
- 根据权利要求298所述的方法，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域包含如SEQ ID NO：56-61和66-70中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求298-299中任一项所述的方法，所述跨膜结构域和/或跨膜胞内结构域与所述信号肽结构域和/或所述p35结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求270-300中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段包 含胞内结构域。
- 根据权利要求301所述的方法，所述胞内结构域包含如SEQ ID NO：62-65中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求301-302中任一项所述的方法，所述胞内结构域与所述跨膜结构域直接或间接连接。
- 根据权利要求270-303中任一项所述的方法，所述IL-12的所述功能活性片段包含如SEQ ID NO：42和/或55所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求270-304中任一项所述的方法，所述IL-12包含如SEQ ID NO：34-40中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求270-305中任一项所述的方法，所述IL-12和/或其功能活性片段的表达提高包含所述IL-12和/或其功能活性片段的合成和/或分泌提高。
- 根据权利要求270-306中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高。
- 根据权利要求270-307中任一项所述的方法，与IL-12和/或其功能活性片段的表达和/或活性未改变的TIL相比，使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例提高至少约5％以上。
- 根据权利要求270-308中任一项所述的方法，所述使所述TIL的IL-12和/或其功能活性片段的表达提高和/或活性增强获得的TIL中，表达IL-12和/或其功能活性片段的细胞比例为至少约5％以上。
- 根据权利要求270-309中任一项所述的方法，所述CD28激动剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段、和/或CD86和/或其功能活性片段。
- 根据权利要求270-310中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及其它T细胞激活剂接触。
- 根据权利要求311所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。
- 根据权利要求311-312中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含CD3激动剂。
- 根据权利要求311-313中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂包含抗 CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
- 根据权利要求311-314中任一项所述的方法，所述使TIL与所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；(3)将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求315所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少约30ng/mL。
- 根据权利要求315-316中任一项所述的方法，所述其它T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为约30ng/mL-约300ng/mL。
- 根据权利要求315-317中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
- 根据权利要求315-318中任一项所述的方法，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
- 根据权利要求318-319中任一项所述的方法，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
- 根据权利要求315-320中任一项所述的方法，所述固相介质包含聚合物。
- 根据权利要求315-321中任一项所述的方法，每mg所述固相介质包含至少约25μg的所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂。
- 根据权利要求315-322中任一项所述的方法，以约2:1-约1:2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求315-323中任一项所述的方法，以约1:100-约1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述CD28激动剂以及所述其它T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求270-324中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触至少约2小时之后与饲养细胞共培养。
- 根据权利要求325所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时至约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求325-326中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂 接触约12小时至约48小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求325-326中任一项所述的方法，使所述TIL在与所述CD28激动剂接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
- 根据权利要求325-328中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
- 根据权利要求325-329中任一项所述的方法，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞和人工抗原呈递细胞。
- 根据权利要求325-330中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
- 根据权利要求325-331中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
- 根据权利要求325-332中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
- 根据权利要求325-333中任一项所述的方法，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求325-334中任一项所述的方法，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求325-335中任一项所述的方法，使所述TIL基本上同时与所述CD28激动剂以及T细胞生长因子接触。
- 根据权利要求270-336中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
- 根据权利要求270-337中任一项所述的方法，所述T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
- 根据权利要求270-338中任一项所述的方法，所述TIL与所述T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
- 根据权利要求270-339中任一项所述的方法，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300 IU/mL。
- 根据权利要求270-340中任一项所述的方法，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。
- 根据权利要求341所述的方法，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
- 一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述TIL经过权利要求1-342中任一项所述的方法获得。
- 一种组合物，其包含权利要求343所述的TIL。
- 一种药物组合物，其包含权利要求343所述的TIL和/或权利要求344所述的组合物，以及任选地药学上可接受的载体。
- 一种影响肿瘤细胞生长的方法，包含向受试者施用权利要求343所述的TIL、权利要求344所述的组合物和/或权利要求345所述的药物组合物。
- 权利要求343所述的TIL、权利要求344所述的组合物和/或权利要求345所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
- 根据权利要求347所述的应用，其中，所述肿瘤为实体瘤。
- 根据权利要求347-348中任一项所述的应用，其中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
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