KR19990082027A - 인체 hiv 계통의 표현형적 약제 감수성에 기초한 hiv 양성 환자에 대한 화학 요법적 처치법 - Google Patents

인체 hiv 계통의 표현형적 약제 감수성에 기초한 hiv 양성 환자에 대한 화학 요법적 처치법

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Abstract

HIV 양성 환자에 대한 HIV 화학 요법적 처치법이, 환자로 부터 입수한 HIV의 pol 유전자로 부터의 서열 및 상기한 서열이 결실된 HIV-DNA 구성물로 HIV에 의해 감염되기 쉬운 세포계를 트랜스펙션시키고, 키메라 비루스 스톡을 창출하기 위하여 상기한 트랜스펙션된 세포를 배양하며, HIV의 pol 유전자에 의하여 암호화된 상기한 효소의 저해제에 대한 상기한 키메라 비루스의 표현형적 감수성을 평가하고 그에 대해 값을 부여하며, 키메라 비루스 감수성에 대한 상기한 값 및 HIV의 키메라 야생형 계통에 대한 상응하는 값으로 구성되는 데이터 세트를 구성하고, 적어도 2 종 이상의 다른 저해제에 대한 감수성 평가를 반복하여 전체적으로 적어도 3 종의 이러한 데이터 세트를 구성하며, 각각의 데이터 세트의 경우에 있어서 키메라와 야생형의 감수성 사이의 차이가 문제의 저해제에 의한 치료를 위한 키메라 스톡의 내성에 관한 가시적 척도를 제공하게 하는 방식으로 2차원적 또는 3차원적 그래프 형태로 상기한 데이터 세트를 나타내고, 이렇게 측정된 내성에 관한 그래프적 표현에 기초하여 최적한 저해제를 선발하는 것으로 구성된다. 이 방법은 개개의 HIV 감염 환자에 대한 표현형적 정보를 대규모로 경제적이고도 신속하게 산출한다. 이 방법은 모든 현재 유용한 화학 요법적 양생법에 대해서 적용 가능하며, 미래의 화학 요법적 양생법에 대해서도 한결같이 적용할 것으로 기대된다.

Description

인체 ＨＩＶ 계통의 표현형적 약제 감수성에 기초한 ＨＩＶ 양성 환자에 대한 화학 요법적 처치법
현재까지, 몇가지 화학 요법적 양생법이 HIV 감염 환자의 치료를 위해 개발되어 왔다. 이들 양생법중 어떠한 것은 임상학적 사용이 승인되어 있으나, 다른 어떤 것들은 임상학적 시도가 진행중이다. 승인된 화학 요법적 양생법의 수는 가까운 장래에 꾸준히 증가할 것으로 추정될 수 있다. 치료 요법중 약제 내성을 갖는 HIV 변이주의 출현으로 인하여, 조합적 요법 또는 다수 약제 치료 요법은 점점 더 증가적으로 사용되고 있다. 비록 이들 화학요법적 양생법들은 HIV 질환의 바이러스학적(바이러스의 로딩 : viral load), 면역학적 및 임상학적 매개 변수들에 대하여 효과를 발휘하는 것으로 나타나 있기는 하지만, 실제적인 경험에 의하면 이들 효과는 일시적이다. 특히, 환자를 치료하고 있는 약제 또는 약제의 조합에 대하여 감소된 감수성을 나타내기 시작한 잠시 후에 HIV 계통이 개개의 환자를 감염시킨다는 사실이 알려져 있다. 이러한 화학 요법의 효능 소실은 환자에 따라, 약제에 따라, 또는 약제 조합에 따라 변화될 수 있다. 특정한 유형의 화학 요법에 대한 이러한 효능 소실은 환자를 감염시킨 HIV 계통의 게놈내 유전자형 패턴의 아미노산 변화와 연관될 수 있다는 사실이 잘 확립되어 있다. 이것은 아마도 이들 HIV 계통이 화학 요법에 감수성이 작다는 사실을 나타낸다. HIV 감염 환자가 연장된 기간 동안 몇 가지의 화학 요법적 양생법에 노출됨에 따라, 감염된 HIV 계통의 게놈 내에 보다 복잡한 유형의 아미노산 변화가 발생하며, 이는 감염 환자에 대한 더 이상의 치료를 위한 합리적인 시도를 좌절시킨다. 전술한 설명 중에 함축되어 있는 바와 같이, 단일 또는 다수의 항-HIV 약제를 포함하는 상이한 화학 요법적 양생법에 노출된 HIV 계통 내에 발생하는 유전자형 변화를 정례적인 방법으로 정량할 수는 있으나, 화학 요법을 처방하는 담당 의사로서는 특정한 화학 요법적 양생법을 시작하거나 또는 계속함에 있어서 감수성이 있는지 없는지의 여부를 이들 자료 정보로부터 추론하기는 지금까지 대단히 어려운 것으로 판명되어 있다. 달리 언급하면, 제한된 규모에서 유용한 유전자형 정보는, 환자가 바람직하게 따라야만 하는 화학 요법에 관하여 담당 의사가 중차대한 결정을 내릴 수 있게 하는 표현형 정보로 정례적으로 해독될 수는 없다. 또한, 문제는 약제-내성 HIV 계통에 감염되어진 약제-내이브성(drug-naive) 환자에 대해서도 존재한다.
비루스 로드(load) 모니터링은 HIV 치료의 정례적인 양태가 되어 가고 있다. 그러나, 비루스 로드 수효 단독으로는 어떤 약제를 단독 또는 조합하여 사용할 것인가를 결정하기 위한 근거로서 사용될 수는 없다.
조합적 치료 요법은 화학 요법적 양생법의 선택을 증대시키고 있다. 조합적 약제를 사용하고 있는 환자가 약제 처방 실패(drug failure)를 경험하기 시작하는 경우, 조합된 약제중의 어느 것이 더 이상 활성적이지 않은가를 아는 것은 불가능하다. 의사는 약제 모두를 단순히 대체할 수는 없으며, 그 이유는 현재 제한된 수효의 약제만이 유용하기 때문이다. 더욱이, 의사가 전체적인 화학 요법적 양생법을 대체한다면, 그 의사는 그 특정한 환자에 대하여 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 약제를 폐기하는 것이 될 수도 있다. 더욱이, 이것은 특정한 저해제에 대하여 내성을 나타내는 비루스가 다른 저해제에 대한 다양한 정도의 상호-내성을 나타내게 하는 것도 가능하다.
따라서, 이상적으로는, 항상 환자를 비루스 로드 테스트하여 비루스 로드 증가가 검지 되는 경우, 약제 감수성/내성 테스트를 또한 수행하여야만 한다. 효과적인 치료 요법이 개발되기까지 HIV 질병의 처치는 이러한 테스트를 요구할 것이다.
최근, 공여자 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 존재 하에 혈장으로부터의 비루스 분리 및, 후속 하는 상기한 세포내의 표현형 결정에 기초한 표현형 결정법(phenotyping method)이 존재한다(Japour, A,J., et al.(1993) Antimicrobial Agents and Chemotheraphy : Vol. 37, No. 5, p 1095-1101). AIDS 임상 시험 그룹(AIDS Clinical Trial Group : ACTG)에 의하여 주창된 이러한 공동-배양법(co-cultivation method), 특히 AZT(이하, 지도부딘/레트로비르(Retrovir는 상표임)와 동의어임) 내성에 대한 표현형 결정은 시간 소모적이고, 비용이 많이 들며, 정례적인 토대 하에 사용하기에는 너무 복잡하다.
역전사 효소(reverse transcriptase : RT) 저해제에 대한 HIV 타입 1 분리주의 약제 감수성 평가를 위한 표현형 재조합 비루스 검정법이 Kellam, P. 및 Larder, B.A.에 의해 개발되어 졌다(Antimicrobial Agents and Chemotheraphy (1994) VOl. 38, No. 1, p23-30). 이 방법은 RT-결실의 비감염성 프로비루스 클론, pHIV△RTBstEII내로 RT 암호화 서열의 PCR-유도 풀의 상동 재조합에 의하여 생비루스가 발생되게 한다. 지도부딘(zidovudine) 치료 요법 과정중의 2 명의 환자에 대한 분석 결과는 이 시도가 최초로 감염된 PBL DNA의 그것과 동일한 종류의 유전자형 및 표현형을 정확하게 나타내는 비루스들을 산출한다는 것을 보여 주었다. 그러나, 이 방법은 공여자의 PBMCs와 함께 환자의 혈장 또는 환자의 PBMCs의 공동-배양에 의한 환자 비루스의 분리를 포함한다. 이러한 비루스의 사전 배양은 최초의 비루스 조성을 왜곡시킬 수 있다. 더욱이, 이 방법은 각종 저해제에 대한 분리주의 감수성을 정량 가능하게 하기는 하지만, 의사로 하여금 현존하는 화학 요법적 양생법을 계속할 것인지 또는 치료 요법을 변경할 것인 지의 여부에 관한 정보를 제공하는 것은 아니다.
또한, pol 유전자중의 단 하나의 효소가 조사되는 경우, 이 방법은 통상적으로 한 종류의 프로테아제와 2 종류의 RT 저해제의 사용을 포함하는 조합적 치료 요법에 대한 정례적인 표현형 평가에 적합하게 하기가 용이하지 않다.
재조합 비루스 검정법에 사용되는 안착형(nested) PCR(폴리머라제 연쇄 반응)법은, 그 재조합 비루스가 HIV 계통으로 감염된 조사 대상 환자에서의 상황을 올바르게 반영하지 않는 상황으로 이끌 수 있다. 이 문제는 DNA 서열 상동성 및 포유류 세포 내에서의 상동 재조합에 요구되는 최소량의 상동성에 기인한다(C. Rubnitz, J. 및 Subramini, S. (1984) Molecular and Cellular Biology Vol. 4, No. 11, p2253-2258). 따라서, 재조합 비루스 접근법에 기초한 표현형 검정법은 어느 것이나 환자로부터 유래하는 물질이 가능한 많이 증폭되어 최대량의 재조합물이 확실하게 존재하도록 시도되어져야 한다.
따라서, 사용되는 RNA 추출법 및 안착형 PCR법은, 증폭된 물질이 조사 대상 환자 내에서의 비루스의 유전적 다양성을 최대로 반영하도록 하는 바와 같은 방식으로 비루스 유전 물질이 확실하게 증폭되게 하여야만 한다.
따라서, 최근의 임상학적 프랙티스에 있어서는, (a) 특정한 환자를 감염시킨 HIV 계통의 표현형적 약제 감수성을 정례적인 토대하에 신속하게 정량하고, (b) 이렇게 얻은 데이터를 용이하게 이해할 수 있는 정보로 가공 처리하며, (c) 상기한 정보에 기초하여 상기한 특정한 환자에 처방된 화학 요법을 개시, 계속, 또는 조정하고자 하는 강한 필요성이 존재한다.
본 발명은 HIV 양성 환자에 대한 화학 요법적 처치법 뿐만 아니라, 이러한 환자를 치료하는 내과 의사가 사용하기 위한 HIV의 pol 유전자의 하나 또는 그 이상의 효소의 저해제에 대한 인체 HIV 계통의 표현형적 약제 감수성에 기초한 임상학적 처리 장치외에, 저해제에 대한 HIV의 pol 유전자의 둘 또는 그 이상의 표현적 약제 감수성에 대한 동시적 정량 방법에 관한 것이다.
도 1 은 플라스미드 pGEMT3-△PRT의 구성에 대한 개략 표시도이다.
도 2 는 플라스미드 pGEMT3-△PRT의 구성에 대한 다른 보충적인 개략 표시도이다.
도 3 은 프로테아제 및 RT 유전자를 포함하는 HIV-HXB2D 서열의 상기한 유전자 부분의 개략 표시도이다.
도 4A-H 는 프로테아제 및 RT 유전자를 포함하는 HIV-HXB2D 서열의 상기한 유전자 부분에 대한 완전한 서열도이다.
도 5 는 실시예 5 에 기재된 바와 같은 3TC 내성 HIV 계통을 갖고 있는 환자에 대한 앤티비로그램(Antivirogram)이다.
도 6 은 실시예 6 에 기재된 바와 같은 야생형 유사 HIV 계통을 갖고 있는 환자에 대한 앤티비로그램이다.
도 7A 는 실시예 7 에서의 환자에 대한 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프도이다.
도 7B 는 실시예 7 의 피검 환자에 대한 앤티비로그램이다.
도 8A 는 실시예 8 에서의 환자에 대한 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프도이다.
도 8B 는 실시예 8 의 피검 환자에 대한 앤티비로그램이다.
도 9A 는 실시예 9 에서의 환자에 대한 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프도이다.
도 9B 는 실시예 9 의 피검 환자에 대한 앤티비로그램이다.
도 10A 는 실시예 10 에서의 환자에 대한 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프도이다.
도 10B 는 실시예 10 의 피검 환자에 대한 앤티비로그램이다.
도 11A 는 실시예 11 에서의 환자에 대한 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프도이다.
도 11B 는 실시예 11 의 피검 환자에 대한 앤티비로그램이다.
도 12A 는 실시예 12 에서의 환자에 대한 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프도이다.
도 12B 는 실시예 12 의 피검 환자에 대한 앤티비로그램이다.
(실시예)
하기한 실시예들에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.
본 발명을 실시하기 위한 양태
실시예 1
프로토콜
1. 비루스 RNA의 추출 및 증폭
RNA를 Boom, R. et al. (1990, 상동)에 의해 기술된 방법에 따라 100㎕의 혈장으로 부터 분리하였으며, HIV-1 특이적 하류 프라이머 OUT3 : 5´-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATC-3´(서열 확인 번호 : 1)를 사용하여 제조자에 의해 기재된 GeneAmp 역전사효소 키트(Perkin Elmer)로 역전사하였다. 역전사된 RNA에 대한 PCR은 Kellam, P. 및 Larder, B.A. (1994, 상동)에 의해 기재된 바와 같은 내부 및 외부 프라이머로 수행되었다. 클로로포름 추출 및 Centricon 100 columns 상에서의 원심분리 또는 음이온-교환 스핀 컬럼(Quiagen) 상에서의 원심분리후, 분리된 PCR 생성물을 트랜스펙션 반응에 사용하기 위하여 준비하였다.
2. 플라스미드의 생성 및 분리
pHIV△RT(MCR) 플라스미드의 생성은 제조자에 의해 명명된 것으로서의 Quiagen 컬럼을 사용하여 하룻밤 동안의 대장균 배양물로 부터 분리된 대장균 플라스미드 DNA로 수행되었다. 분리된 플라스미드의 수율은 A260/280 측정(λ= 260 및 280 nm에서의 광학 밀도 측정)에 의해 흡광 광도적으로 측정되었다. 약 250㎍의 초정제 플라스미드 DNA가 500ml의 세균 배양액으로 부터 얻어졌다. 분리된 플라스미드의 동일성(identity)은 제한 효소 분석법을 사용하여 확인하였다. 이어서, 분리된 플라스미드 DNA는 BstEII로 선형화되었으며 전형적인 페놀/클로로포름 추출에 의하여 재정제되었다.
3. 세포에 대한 트랜스펙션
MT4 세포를 트랜스펙션에 앞서 250,000 세포/ml의 밀도로 계대 배양하였다(대수증식기). 세포들을 펠릿화시키고 3.1×106세포/ml의 농도로 인산 완충 식염수용액(PBS)중에 재현탁시켰다. 0.8 ml 부분(2.5×106세포/ml)을 각각의 트랜스펙션에 사용하였다. 트랜스펙션은 0.4 cm의 전극 큐벳을 사용하는 Bio-Rad Gene 맥동기를 사용하여 수행하였다. 세포들은 10㎍의 선형화된 pHIV△RT 플라스미드 및 약 5㎍의 RT PCR 생성물의 존재하에서, 250㎌ 및 300V로 일렉트로포레이션하였으며, 이어서 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 이어서, 10ml의 신선한 배양 배지를 세포 현탁액에 첨가하였으며, 5% CO2의 습한 분위기하, 37℃에서 인큐베이션을 수행하였다.
4. 트랜스펙션된 세포의 배양 및 추적
트랜스펙션에 이어서 7 내지 10일 동안, 세포 변성 효과(cytopathogenic effect : CPE)의 출현 여부에 대하여 세포들을 모니터하였다. 이러한 세포 변성 효과가 없을시에는, 세포들을 다른 플라스크중에서 계대 배양하였다. 이어서, 트랜스펙션된 세포들의 배양 상청액을 재조합 비루스의 스톡을 생성시키는 데 사용하였으며, -70℃에서 1.5 ml 씩의 분주액(aliquots)으로 보관하였다.
5. 환자의 비루스 RNA로 부터의 재조합 비루스의 분석
새로운 비루스에 대한 타이트레이션(titration)후, 이 스톡을 다른 HIV 저해제들의 순차 희석액의 존재중에서 항비루스 실험에 사용하였다. 수거된 상청액의 타이터(titre)를 MT4 세포중의 비루스의 제한된 순차 희석 타이트레이션을 이용하여 정량하였다.
유용한 타이터를 갖는 비루스들을 항비루스 실험에 사용하였다. 이 목적을 위해서, 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 100㎕의 완전 배양 배지로 채웠다. 후속하여, 화합물의 스톡 용액을 쌍을 이루는 일련의 웰에 25㎕ 부피로 첨가하였다. HIV- 및 모의(mock)-감염 세포 시료들에 각각의 약제(또는 약제의 조합)를 포함시켰다. 이어서, 대수적으로 증식하는 MT4 세포들을 150,000 세포/ml의 밀도로 마이크로타이터 플레이트에 옮겼다. 이어서, 세포 배양물을 5% CO2의 습한 분위기하, 37℃에서 인큐베이션하였다. 감염후 5 일째에, 모의(mock)- 및 HIV-감염 세포들의 생존도를 이하의 항목 6에 기재된 바와 같은 MTT법(Pauwels, R. et al.- J. Virol. Meth. (1988), 20 : 309-321)에 의해 흡광광도적으로 조사하였다.
6. MTT 검정법
마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 20㎍의 MTT 용액(PBS중의 7.5 mg/ml)을 첨가하였다. 이 플레이트를 1 시간동안 37℃에서 더욱 인큐베이션시켰다. 그 다음, 포마잔(formazan) 결정을 포함하는 MT4 세포 클루스터를 교란시키지 않게 150㎕의 배지를 제거하였다. 포마잔 결정의 가용화는 산성화된 이소프로파놀(5 ml의 진한 염산/1ℓ 용매)중의 100㎕의 5% 트리톤 X-100을 첨가하는 것에 의하여 수행되었다. 플레이트를 플레이트 진탕기상에 10분간 위치시킨 후, 포마잔 결정이 완전히 용해되었다. 마지막으로, 2 파장(540 nm 및 690 nm)에서 흡광도를 읽었다. 이들 광학 밀도(흡광도 : OD) 데이터로 부터, 50% 저해(IC50) 및 50% 세포 장해(CC50) 농도를 유도하였다.
실시예 2
HIV-1 프로테아제 및 역전사효소 유전자가 결실된 pHIV△RTBstEII-돌연변이체의 구성
관심있는 HIV pol 유전자의 서열이 RT 및 프로테아제를 암호화하는 것이며 제조된 구성물이 이하에 기술하는 바와 같은 pGEMT3-△PRT인 것을 제외하고는, 실시예 1 에 기재한 프로토콜을 반복하였다. 실시예 1 에서 설명한 절차와 관련한 다른 변형에 대해서는 이하에서 설명하기로 한다.
비루스 RNA의 증폭을 위하여, RNA로 부터 DNA로의 역전사를 OUT3 프라이머를 사용하여 다시 수행하였다. 그러나, 안착형 PCR법을 위한 사용 프라이머는 도 3 에 나타낸 바와 같다. 따라서, 안착형 PCR법이 외부 프라이머로서 RVP5 및 OUT3를 사용하며, 내부 프라이머로서 RVP5 및 IN3를 사용한다는 것이 관측될 수 있을 것이다. 따라서, 이 안착형 PCR법은 실제적으로는 반안착형(hemi-nested) PCR법이다.
pGEMT3-△PRT의 생성 및 분리
최종적인 pGEMT3-△PRT 구성물은 pGEM9-Zf(-)(Promega)의 유도체이다.
짧게 말하면, pGEMT3-△PRT 구성물은 원하는 삽입 HIV-HXB2(플랭킹(flanking) 인간 서열을 포함하는, 프로테아제 및 역전사효소-결실 프로비루스 HIV -1 클론)를 벡터 pGEM9-Zf(-)의 Xbal 제한 부위내로 도입시키는 것에 의해 만들어진다. 프로비루스 게놈은 프로테아제 유전자(아미노산 9를 에워쌈)내의 AhdI 부위로 부터 pHIV△RTBstEII 구성물(MRC 기탁 참조 번호 : ADB 231)의 BstEII 부위까지 결실되어 있다. △ProRT의 접합부에서는, 트랜스펙션에 앞서 프로비루스 구성물의 선형화에 사용될 수 있는 결실 Smal 및 BstEII 부위가 위치된다. pGEMT3-△PRT 의 구성물을 도 1 및 도 2에 개략적으로 나타낸다. pGEMT3-△PRT의 수율은 500ml의 세균 배양물로 부터 약 1mg이다.
위에서 지적한 바와 같이, 플라스미드 pGEMT3-△PRT는 1996. 11. 8일자로 Belgian Coordinated Collections of Microorganisms-BCCM LMBP-Collection에 기탁 번호 LMBP3590으로 기탁되어 있다.
다른 벡터(pIB120 대신에 pGEM9-Zf(-))내로의 프로비루스 게놈의 도입이 중요한 문제를 야기할지도 모른다는 사실은 예상치 못했었다. pIB120, pEMBL8(-)의 유도체(Kodak Scientific Imaging Systems에 의해 제공된 정보에 따름) 및, pGEM9 -Zf(-)는 유사한 벡터이다. 그럼에도 불구하고, 프로비루스 벡터 pIB120HIV는 recA＋대장균 숙주 세포(Maschera, B., et al. J. Virol. (1995) 69, 5431-5436)중에서 불안정하다. 따라서, pGEMT3-△PRT 구성물의 안정성은 매번 새로운 플라스미드의 제조후 확증되어져야만 한다.
HIV-HXB2 서열
HIV-HXB2D 서열(1800 에서 4400 뉴클레오티드)내의 관심 영역을 도 3 에 개략적으로 나타내며, 도 4 에 완전한 서열을 나타낸다. 몇 개의 유전자, 제한 부위, 프라이머 및 결실부(△Pro, △RT, △ProRT)의 위치도 나타나 있다.
HIV-1(분리체 HXB2, 참조 게놈, 9718 bp)의 서열은 ENTREZ 문서 저장 시스템을 경유하여 National Institute of Health, National Library of Medicine, the National Center for Biotechnology Information (NCBI)로 부터 입수하였다.
유전자 은행명 : HIVHXB2CG
유전자 은행 접속 번호 : Ø3455
NCBI 서열 확인 번호 : 327742
재조합 영역
RVP5 및 OUT3/IN3 프라이머에 의해 생성된 RT-PCR 단편과 조합하여, pGEMT3-△PRT 벡터가 실시예 1의 항목 3에 기재된 바와 같은 MT4 세포를 트랜스펙션시키기 위하여 사용될 수 있다. △ProRT의 5′-말단에서의 재조합을 위한 영역은 188 뉴클레오티드를 포함한다. △ProRT의 3′-말단에서의 재조합을 위한 영역은 앞서 언급한 것(Kellam, P. 및 Lader, B.A. (1994) 상동)과 유사하며 130 뉴클레오티드를 포함한다.
재조합을 위한 이들 영역의 길이는 중요하지 않은 것이 아니다. 앞서의 데이터(Bandyopadhyay, P.K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1984) 81, 3476-3480 ; Rubnitz, J. 및 Subramani, S. (1984) 상동)는, 서열 상동성이 214 염기짝으로 부터 163 염기짝으로 감소하는 경우 재조합 빈도가 10 배 감소한다는 사실을 입증하고 있다.
더우기, 생성된 비루스의 표현형이 치료받고 있는 HIV-양성 환자중에 존재하는 의사종(擬似種 : quasi-species)을 신뢰성 있게 반영한다는 사실을 보증하기 위해서는, 일렉트로포레이션된 세포내에서 충분한 재조합이 일어나야만 한다. 재조합 결과의 최적화는 표적 세포의 일렉트로포레이션을 위해 사용되는 RT-PCR 단편에 대한 선형화된 프로비루스 벡터의 비율을 조절하는 것에 의해서 우선적으로 달성될 수 있다. 따라서, 성과에 대한 전형적인 결과를 나타내는 표준법은 이미 Kellam, P. 및 Lader, B.A. (1994, 상동)에 의해 기술되어 있다. 결과적으로, 약 2㎍의 PCR 생성물(10㎍의 벡터에 대한 것임)의 초기 투입량을 약 5㎍ 또는 그 이상으로 증가시킬 것을 결정하였다. 그 결과는, 트랜스펙션된 세포 배양물중에서 가시적인 비루스 증식(세포 변성 효과)의 더욱 신속한 출현을 나타냈다.
재조합 결과의 최적화에 대한 다른 선택은 더욱 긴 재조합 서열로 귀결되는 프라이머의 설계이다.
그럼에도 불구하고, 트랜스펙션 반응중에의 실제적인 투입은 PCR후의 수율에 항상 의존적이다. 트랜스펙션 반응중에 증폭된 물질이 더욱 높은 투입량을 갖게 되면(재조합 효율에 있어서의 더욱 양호한 결과), 그 결과로서 시료들은 높은 수율을 나타낸다. 그러나, 낮은 재조합 효율에도 불구하고, 낮은 수율을 갖는 시료들도 트랜스펙션될 수 있으며, 비루스 개체군에 대한 신뢰성 있는 반영을 나타내는 생비루스를 생성시키게 될 것이다.
실시예 3
ProRT 서열의 RT-PCR을 위한 선택적 프라이머
실시예 2 에서 사용된 프라이머와 관련하여 새로운 프라이머(A-D)를 설계하였으며, 이들은 ProRT 영역의 5′및 3′말단 모두에 더욱 긴 재조합 서열을 만들게 된다. 안착형 PCR을 가능하게 하는 각각의 영역의 5′및 3′말단 모두에 대한 2 종의 프라이머를 설계하였다. 도 3 및 도 4 에 표시되어 있는 바와 같이, ProRT 영역의 5′말단에 나타나는 동방향조반배열(同方向繰返配列 : direct repeat)을 각각의 프라이머 설계시 고려하였다. 새로운 프라이머들은 다음과 같다 :
A PRTO-5 : 5′-GCCCCTAGGA-AAAAGGGCTG-TTGG (서열 확인 번호 : 3)
B PRTI-5 : 5′-TGAAAGATTG-TACTGAGAGA-CAGG (서열 확인 번호 : 4)
C PRTI-3 : 5′-GATATTTCTC-ATGTTCATCT-TGGG (서열 확인 번호 : 5)
D PRTO-3 : 5′-AGGTGGCAGG-TTAAAATCAC-TAGC (서열 확인 번호 : 6)
실시예 4
선택적 △ProRT 벡터의 구성
위에서 언급한 바와 같이, 선택적 ProRT 결실 벡터의 구성은 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이 유발에 의해서 달성될 수 있다. 그러나, 이것은 또한 현재의 3′-말단으로 부터 3 RT 유전자내의 인접한 KpnI 부위(하류쪽으로 40 염기쌍)까지 ProRT 결실부를 확장시키는 것에 의해서도 가능하다. 클레노우(Klenow)-처리 BstEII 부위에 대한 클레노우-처리 KpnI 부위의 연결은 최초의 BstEII 인식 서열을 회복시킬 것이다. 이와 같이 하는 것에 의하여, 이 선택적 벡터는 실시예 2 에 기재된 바와 같은 pGMT3-△PRT와 유사하게 행동하나, 약간 더 큰 RT 결실부를 갖는다.
실시예 5
1989년 12월 부터 실증되지 않은 후일 까지 AZT 처방을 받았고 1994년 2월 부터 1995년 10월 까지 AZT＋3TC(1:1)의 조합된 화학 요법으로의 전환 처방을 받은 HIV 감염 환자가 혈장을 제공하였으며, 이 혈장의 수 많은 RT 저해제에 대한 감수성을 상기한 실시예 1 의 프로토콜에 따라 정량하였다. 재조합 야생형 HIV 계통 recIIIB를 참조 HIV 비루스로서 상기한 프로토콜에 사용하였다. 표 1 은 측정된 IC50값(μM) 및 상기한 값들의 비를 나타낸다.
약 제 항-HIV-1 활성 IC50(μM)
실험 1 실험 2 평 균 (1) recIIIB 참조(2) 비율 (1)/(2)
로비리데 티비라핀 AZT 3TC d4T ddI ddC AZT＋3TC (1:1) 0.1 0.019 0.001 31.6 0.07 2.0 0.2 0.001 0.12 0.018 0.002 100 0.49 0.8 0.2 0.001 0.11 0.019 0.002 65.8 0.06 1.4 0.2 0.001 0.05 0.01 0.004 0.56 0.12 2.83 0.38 0.002 2 1.5 0.4 118 0.5 0.5 0.5 0.5
상기한 데이터로 부터, 3TC를 이용한 단일 화학 요법은 상기한 특정한 환자에 대해서는 이득이 없을 것이라는 사실을 확정할 수 있다. 그러나, AZT＋3TC의 조합 요법(현재의 치료 요법)은 여전히 긍정적인 효과를 발휘할 수 있을 것이다.
실시예 6
수 많은 RT 저해제에 대해 감수성을 나타내는, 약제-내이브(drug-naive) HIV-감염 환자 제공 혈장을 상기한 실시예 1 의 프로토콜에 따라 정량하였다. 재조합 야생형 HIV 계통 recIIIB를 참조 HIV 비루스로서 상기한 프로토콜에 사용하였다. 표 2 는 측정된 IC50값(μM) 및 상기한 값들의 비를 나타낸다. 앤티비로그램을 작성하였으며 도 6 에 나타낸다.
약 제 항-HIV-1 활성 IC50(μM)
실험 1 실험 2 평 균 (1) recIIIB 참조(2) 비율 (1)/(2)
3TC ddI ddC AZT d4T AZT＋3TC (1:1) DDC＋D4T (1:1) 3TC＋d4T (1:1) 1.81 3.07 1.45 0.04 1.31 0.05 0.62 0.42 2.02 4.47 1.47 0.05 0.97 0.04 0.44 0.44 1.91 3.77 1.46 0.05 1.14 0.05 0.53 0.43 3.08 8.58 2.21 0.06 1.74 0.02 0.77 1.11 1 0.4 1 1 1 3 1 0.4
상기한 데이터로 부터, 이 환자는 야생형 HIV와 밀접하게 닮은 HIV 계통으로 감염되었다는 사실을 확증할 수 있다. 약제 양생법의 어느 것도 배제되지 않을 것이며, 따라서 AZT, 3TC와 같은 약제 또는 긍정적인 증거 기록을 나타내는 기타의 약제를 사용하여 화학 요법을 개시할 수 있다.
실시예 7
수 많은 RT 저해제에 대해 감수성을 나타내는, 약제-내이브(drug-naive) HIV-감염 환자 제공 혈장을 상기한 실시예 1 에서 설명한 프로토콜에 따라 정량하였다. 재조합 야생형 HIV 계통 recIIIB를 참조 HIV 비루스로서 사용하였다. 표 3 은 측정된 IC50값(μM) 및 상기한 값들의 비를 나타낸다. 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프를 도 7A 에 나타낸다. 앤티비로그램을 작성하였으며 도 7B 에 나타낸다.
약 제 항-HIV-1 활성 IC50(μM)
실험 1 실험 2 평 균 (1) recIIIB 참조(2) 비율 (1)/(2)
AZT 3TC ddI ddC d4T 로비리데 티비라핀 0.052 2.173 0.475 1.042 1.142 0.035 0.042 0.050 ND 0.429 1.389 1.657 0.025 0.049 0.051 2.173 0.452 1.216 1.399 0.030 0.046 0.023 1.381 0.648 1.616 1.368 0.024 0.021 2 2 0.7 0.8 1 1 2
상기한 데이터로 부터, 이 환자는 야생형 HIV와 밀접하게 닮은 HIV 계통으로 감염되었다는 사실을 확증할 수 있다. 어떠한 약제 양생법도 배제되지 않으며, 따라서 긍정적인 증거 기록을 갖는 AZT, 3TC 또는 기타와 같은 약제를 사용하여 화학 요법을 개시할 수 있다.
실시예 8
수 많은 RT 저해제에 대해 감수성을 나타내는, AZT, 3TC 및 로비리데를 포함하는 치료 내력을 갖고 있는 HIV-감염 환자 제공 혈장을 상기한 실시예 1 에서 설명한 프로토콜에 따라 정량하였다. 재조합 야생형 HIV 계통 recIIIB를 참조 HIV 비루스로서 사용하였다. 표 4 는 측정된 IC50값(μM) 및 상기한 값들의 비를 나타낸다. 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프를 도 8A 에 나타낸다. 앤티비로그램을 작성하였으며 도 8B 에 나타낸다.
약 제 항-HIV-1 활성 IC50(μM)
실험 1 실험 2 평 균 (1) recIIIB 참조(2) 비율 (1)/(2)
AZT 3TC ddI ddC d4T 로비리데 티비라핀 18.264 ＞100.000 26.861 9.290 7.500 ＞100.000 1.626 22.251 ＞100.000 15.435 8.506 7.097 ＞100.000 1.604 20.257 ＞100.000 21.148 8.898 7.298 ＞100.000 1.615 0.084 6.304 1.586 1.931 5.465 0.037 0.021 241 ＞ 16 13 5 1 ＞ 2717 78
상기한 데이터로 부터, 이 환자는 조사된 대부분의 뉴클레오시드 및 비뉴클레오시드 항레트로비루스 약제에 대하여 감소된 감수성을 나타내는 HIV 계통으로 감염되었다는 사실을 확증할 수 있다. 치료 요법은 여전히 D4T 또는 DDC를 사용하여 개시될 수 있다. 치료 요법에 프로테아제-저해제를 포함시킬 지의 여부를 고려할 수 있다.
실시예 9
수 많은 RT 저해제에 대해 감수성을 나타내는, 다수의 뉴클레오시드 동족체(analogue) RT-저해제를 포함하는 치료 내력을 갖고 있는 HIV-감염 환자 제공 혈장을 상기한 실시예 1 에서 설명한 프로토콜에 따라 정량하였다. 재조합 야생형 HIV 계통 recIIIB를 참조 HIV 비루스로서 사용하였다. 표 5 는 측정된 IC50값(μM) 및 상기한 값들의 비를 나타낸다. 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프를 도 9A 에 나타낸다. 앤티비로그램을 작성하였으며 도 9B 에 나타낸다.
약 제 항-HIV-1 활성 IC50(μM)
실험 1 실험 2 평 균 (1) recIIIB 참조(2) 비율 (1)/(2)
AZT 3TC ddI ddC d4T 로비리데 티비라핀 ＞100.000 ＞100.000 ＞100.000 60.079 ＞100.000 0.064 0.052 ND ＞100.000 ＞100.000 73.049 ＞100.000 0.058 0.043 ＞100.000 ＞100.000 ＞100.000 66.564 ＞100.000 0.061 0.048 0.291 16.670 4.757 3.444 12.030 0.065 0.042 ＞ 344 ＞ 6 ＞ 21 19 ＞ 8 0.9 1
상기한 데이터로 부터, 이 환자는 모든 뉴클레오시드 동족체 항레트로비루스 약제에 대하여 감소된 감수성을 나타내는 HIV 계통으로 감염되었다는 사실을 확증할 수 있다. 비뉴클레오시드 항레트로비루스 약제는 치료 요법으로 부터 배제시켜서는 안된다. 여기서도, 치료 요법에 프로테아제-저해제를 포함시킬지의 여부를 고려할 수 있다.
실시예 10
수 많은 RT 저해제 및 프로테아제 저해제에 대해 감수성을 나타내는, 약제-내이브 HIV-감염 환자 제공 혈장을 상기한 실시예 1 에서 설명한 프로토콜에 따라 정량하였다. 재조합 야생형 HIV 계통 recIIIB를 참조 HIV 비루스로서 사용하였다. 표 6 은 측정된 IC50값(μM) 및 상기한 값들의 비를 나타낸다. 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프를 도 10A 에 나타낸다. 앤티비로그램을 작성하였으며 도 10B 에 나타낸다.
약 제 항-HIV-1 활성 IC50(μM)
실험 1 실험 2 평 균 (1) recIIIB 참조(2) 비율 (1)/(2)
AZT 3TC 사퀴나비르 리토나비르 인디나비르 0.019 1.525 0.003 0.022 0.013 0.019 1.718 0.003 0.017 0.013 0.019 1.622 0.003 0.019 0.013 0.041 4.608 0.006 0.033 0.016 0.5 0.4 0.4 0.6 0.8
상기한 데이터로 부터, 이 환자는 야생형 HIV와 밀접하게 닮은 HIV 계통으로 감염되었다는 사실을 확증할 수 있다. 약제 양생법의 어느 것도 배제되지 않을 것이며, 따라서 AZT, 3TC와 같은 약제 또는 긍정적인 증거 기록을 나타내는 기타의 약제를 사용하여 화학 요법을 개시할 수 있다.
실시예 11
수 많은 RT 저해제 및 프로테아제 저해제에 대해 감수성을 나타내는, RT 및 프로테아제 저해제를 포함하는 치료 내력을 갖고 있는 HIV-감염 환자 제공 혈장을 상기한 실시예 1 에서 설명한 프로토콜에 따라 정량하였다. 재조합 야생형 HIV 계통 recIIIb를 참조 HIV 비루스로서 사용하였다. 표 7 은 측정된 IC50값(μM) 및 상기한 값들의 비를 나타낸다. 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프를 도 11A 에 나타낸다. 앤티비로그램을 작성하였으며 도 11B 에 나타낸다.
약 제 항-HIV-1 활성 IC50(μM)
실험 1 실험 2 평 균 (1) recIIIB 참조(2) 비율 (1)/(2)
AZT 3TC 사퀴나비르 리토나비르 인디나비르 ND ＞100.000 0.014 1.198 0.229 0.015 93.962 0.015 1.739 0.416 0.015 96.981 0.014 1.468 0.323 0.047 5.178 0.012 0.062 0.027 0.3 19 1 24 12
상기한 데이터로 부터, 이 환자는 RT-저해제 3TC 및 프로테아제 저해제 인디나비르 및 리토나비르에 대하여 감소된 감수성을 나타내는 HIV 계통으로 감염되었다는 사실을 확증할 수 있다. 따라서, 화학 요법은 긍정적인 증거 기록을 나타내는 AZT 또는 사퀴나비르와 같은 약제로 조절될 수 있다.
실시예 12
수 많은 RT 저해제 및 프로테아제 저해제에 대해 감수성을 나타내는, RT 및 프로테아제 저해제를 포함하는 치료 내력을 갖고 있는 HIV-감염 환자 제공 혈장을 상기한 실시예 1 에서 설명한 프로토콜에 따라 정량하였다. 표 8 은 측정된 IC50값(μM) 및 상기한 값들의 비를 나타낸다. 약제 감수성에 있어서의 상대적 변화를 나타내는 막대 그래프를 도 12A 에 나타낸다. 앤티비로그램을 작성하였으며 도 12B 에 나타낸다.
약 제 항-HIV-1 활성 IC50(μM)
실험 1 실험 2 평 균 (1) recIIIB 참조(2) 비율 (1)/(2)
AZT 3TC 사퀴나비르 리토나비르 인디나비르 3.833 ＞100.000 0.350 1.610 0.124 3.355 ＞100.000 0.352 1.530 ND 3.594 ＞100.000 0.351 1.570 0.124 0.041 4.608 0.006 0.033 0.016 88 22 56 47 8
상기한 데이터로 부터, 이 환자는 RT-저해제 3TC 및 프로테아제 저해제 인디나비르 및 리토나비르 및 사퀴나비르에 대하여 감소된 감수성을 나타내는 HIV 계통으로 감염되었다는 사실을 확증할 수 있다.
실시예 13
유전자형 결정과 관련한 표현형 결정의 비교
오랜 기간에 걸쳐 비뉴클레오시드 RT 저해제(NNRTI)의 단일 요법을 받아온 HIV-감염 환자로 부터 혈장 시료를 입수하였다. 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 HIV-RNA를 추출하고, 역전사하였으며, 증폭시켰다. 양성인 시료의 외부 PCR 물질로 부터 출발하여, RT 유전자의 처음 785 뉴클레오시드를 증폭시켰으며 이 물질을 유전자형 결정에 사용하였다.
간략하게 언급하면, 785 뉴클레오시드 단편을 Amersham(cat# RPN2438)으로 부터의 7-데아자-dGTP를 사용하는 ThemoSequenase(ThemoSequenase는 상표임) 형광 표지 프라이머 순환 서열 결정 키트를 사용하여 순환 서열 결정 반응시켰다. RT 유전자의 뉴클레오티드 27 로 부터 뉴클레오티드 681 까지 양방향으로 서열 결정할 수 있도록 선택된 4 종의 서열 결정용 프라이머를 각각의 시료에 대하여 사용하였다. 이 반응은 ALF(ALF는 상표임) 자동 서열 분석기(Pharmacia)로 분석되었다.
생성된 서열에 관한 정보는 파워 매킨토시로 보내지고 GeneWork 2.5 소프트웨어(Oxford Molecular Group Inc.)로 더욱 분석하였다. 결과로서 얻어진 아미노산 서열을 실험실 HIV-1 클론 HXB2D의 대응하는 서열과 비교하였으며, 내성-관련 돌연변이가 환자로 부터 유래하는 물질중에서 확인되었다. 그 결과를 표 9 에 나타내며, 여기서는 1 문자 아미노산 코드를 사용하였다.
P 내성 관련 돌연변이 내성 배수
M 41 D 67 K 70 A 98 K101 K103 V108 E138 Y181 M184 G190 T215 K219 AZT 3TC NNRTI 1 NNRTI 2
1 N 1 1 56 437
2 S 1 0.4 102 53
3 N 0.4 1 36 87
4 0.3 0.1 1 0.4
5 1 0.4 4 3
6 N 1 0.3 103 245
7 S 1 0.04 112 57
8 N 1 1 30 81
9 C 2 1 ＞1432 12
10 N 0.4 0.1 53 172
11 L N R N V F Q 94 ＞8 321 669
12 L Y 28 2 1 3
13 E K/N A G/A NotDet 1 1 ＞1466 455
14 N 1 1 93 349
15 N 2 1 ＞2424 449
16 N V 1 ＞8 21 115
17 N 1 1 29 102
18 S 1 1 95 181
19 N 1 1 78 260
20 G 0.4 1 22 25
21 N 1 0.4 47 68
22 I 1 0.4 3 3
23 N 0.2 0.2 9 9
24 Q 1 1 7 59
P = 환자
표 9 의 맨 윗줄은 야생형 서열중에서 발견된 아미노산(AA) 및 그 위치를 나타낸다. 이들 위치에서의 아미노산 변화를 이하의 열에서 각각의 환자에 대해 나타낸다. 환자로 부터 유래하는 물질에서 변화가 관찰되는 그 위치만을 나타낸다. 표 9 의 오른쪽 부분은 각각의 환자 시료를 본 발명에 따른 방법으로 측정한 것으로서의 상이한 RT 저해제에 대한 내성의 배수를 나타낸다. NNRTI 1 은 환자에게 투여되었던 비뉴클레오시드 RT 저해제이다. NNRTI 2 는 첫번째 것에 대한 상호 내성이 어느 정도 관찰된 다른 비뉴클레오시드 RT 저해제이다.
뉴클레오시드 동족체 RT 저해제 내성에 관한 유전자형 결정 결과는 다음과 같다 :
- M41L, D67N, K70R, T215F/Y 및 K219Q/E는 AZT 내성-관련 돌연변이이다(Larder, B. 및 Kemp, S. (1989) Science 246, 1155-1158; Kellam, P. et al. (1992) PNAS 89, 1934-1938). 환자 유래 물질로 부터 분리된 HIV의 게놈중에 개별적 또는 상이한 조합으로의 이들 존재는 만들어진 앤티비로그램에 의해 측정된 바와 같은 표현형적 내성과 상관 관계를 가진다(환자 11 및 12).
- 약제에 대한 표현형적 내성을 나타내는 환자에 있어서만 관찰되는 M184V 돌연변이와 관련된 3TC에 대한 내성에 대해서도 동일한 사실이 적용된다(환자 11 및 16).
NNRTI들과 관련한 유전자형 결정 결과는 다음과 같다 :
- 세 환자(3, 4 및 12)는 NNRTI 내성-관련 돌연변이가 전혀 없었으며 약제에 대하여 표현형적으로 감수성이다.
- NNRTI들에 대한 표현형적 내성을 나타내는 환자들의 대부분은 위치 103 에서 NNRTI 내성-관련 돌연변이를 가진다(K103N/S).
- 한 환자(9)는 Y181C NNRTI 내성-관련 돌연변이를 가지며 NNRTI 1에 대해 높은 표현형적 내성(＞1432 배)을 나타낸다.
- 환자 13 은 몇개의 NNRTI 내성-관련 돌연변이를 가진다(K101E, 부분적으로 K103N 및 부분적으로 G190A). 이 환자는 또한, NNRTI 1에 대한 높은 표현형적 내성(＞1466 배)을 나타낸다. 이 시료에서 관찰된 E138A 돌연변이는 지금까지 내성과 관련되어 있지 않다. 그러나, 이와 동일한 위치에서의 다른 돌연변이, 즉 E138K는 TSAO 화합물들에 대한 내성에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 증명되어 있다(Balzarini, J. et al. (1993) PNAS 90, 6952-9656). E138A 돌연변이의 역할은 앞으로 평가될 필요가 있다.
- 환자 20 번은 A98G NNRTI 내성-관련 돌연변이를 가지며 시험된 NNRTI들에 대해 표현형적 내성을 나타낸다.
- 환자 22 번은 V108I NNRTI 내성-관련 돌연변이를 가지나, 시험된 NNRTI들에 대해 어떠한 표현형적 내성도 나타내지 않는다.
- 환자 24 번은 어떠한 NNRTI 내성-관련 돌연변이도 나타내지 않으나(K101Q 돌연변이가 몇몇 HIV-1 야생형 게놈내에서 발견된다), 시험된 NNRTI들에 대해 표현형적으로 내성을 가진다.
서열 목록
(1) 일반적 정보:
(i) 출원인
(A) 명칭: 비르코 엔.브이.
(B) 거리: 드리에 에이켄스트라트 661
(C) 도시: 에드젬
(E) 국가: 벨기에
(F) 우편 번호(ZIP): B-2650
(A) 성명: 드 베쑤네, 마리-피에르
(B) 거리: 트윌류웬스트라트 15
(C) 도시: 에버부르그
(E) 국가: 벨기에
(F) 우편 번호 (ZIP): B-3078
(A) 성명: 헤르토그스, 쿠르트
(B) 거리: 신트 빈센티우스트라트 53
(C) 도시: 앤트워펜
(E) 국가: 벨기에
(F) 우편 번호 (ZIP): B-2018
(A) 성명: 파우웰스, 루디
(B) 거리: 댐스트라트 166
(C) 도시: 위르데
(E) 국가: 벨기에
(F) 우편 번호 (ZIP): B-1982
(ii) 발명의 명칭: 인체 HIV 계통의 표현형적 약제 감수성에 기초한 HIV 양성 환자에 대한 화학 요법적 처치법
(iii) 서열의 수효: 6
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 기록매체 타입: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: 호환성 IBM PC
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(vi) 선행 출원 데이터:
(A) 출원 번호: EP 96200175.6
(B) 출원일: 1996. 1. 26.
(2) 서열 확인 번호 1 에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정: 없음
(vi) 원래의 출처원:
(A) 유기체: 인체 면역결핍 비루스 타입 1
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 1:
CATTGCTCTC CAATTACTGT GATATTTCTC ATG 33
(2) 서열 확인 번호 2 에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정: 없음
(vi) 원래의 출처원:
(A) 유기체: 인체 면역결핍 비루스 타입 1
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 2:
GGGAAGATCT GGCCTTCCTA CAAGGG 26
(2) 서열 확인 번호 3 에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정: 없음
(vi) 원래의 출처원:
(A) 유기체: 인체 면역결핍 비루스 타입 1
(xi) 서열 확인 번호 3 에 대한 설명:
GCCCCTAGGA AAAAGGGCTG TTGG 24
(2) 서열 확인 번호 4 에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정: 없음
(vi) 원래의 출처원:
(A) 유기체: 인체 면역 결핍 비루스 타입 1
(xi) 서열 확인 번호 4 에 대한 설명:
TGAAAGATTG TACTGAGAGA CAGG 24
(2) 서열 확인 번호 5 에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정: 없음
(vi) 원래의 출처원:
(A) 유기체: 인체 면역결핍 비루스 타입 1
(xi) 서열 확인 번호 5 에 대한 설명:
GATATTTCTC ATGTTCATCT TGGG 24
(2) 서열 확인 번호 6 에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정: 없음
(vi) 원래의 출처원:
(A) 유기체: 인체 면역결핍 비루스 타입 1
(xi) 서열 확인 번호 6 에 대한 설명:
AGGTGGCAGG TTAAAATCAC TAGC 24
벨기에 미생물 정리 기탁 기관 (BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS)-BCCM LMBP-COLLECTIONS
BCCM/LMBP/BP/4/96-07 서식의 1 면 최초 기탁 경우의 수령증
-------------------------------------------------------------------
특허절차상 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약
다음면 하단에서 확인되는 국제기탁기관 BCCM/LMBP에 의해
령 7.1에 의거하여 최초의 기탁 경우에 발행하는 수령증
국제서식 BCCM/LMBP/BP/4/96-07
---------------------------------
수신 : 기탁자 성명 : 비르코 엔.브이.
주소 : 드리에 에이켄스트라트, 661, 2650 에드젬
I. 미생물의 확인:
I.1 기탁자가 정한 확인용 참조 부호:
pGEMT3△PRT
I.2 국제기탁기관에 의해 부여된 기탁 번호:
LMBP3590
벨기에 미생물 정리 기탁 기관 (BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS)-BCCM LMBP-COLLECTIONS
BCCM/LMBP/BP/4/96-07 서식의 2 면 최초 기탁 경우의 수령증
-------------------------------------------------------------------
II. 특별한 설명 및/또는 제안된 분류계급 지정
본인은 과학적 기재에 의하여 미생물을 확인함:
III. 수령 및 수임
본 국제기탁기관은 상기한 I. 로 확인된 미생물을 1996. 11. 8일자(최초 기탁일)로 수령하였기에 이의 기탁을 수임함.
IV. 국제기탁기관
벨기에 미생물 수집 정리 기탁 기관 (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms : BCCM)
분자생물학 연구소 (Laboratorium voor Moleculaire Bioogie-Plasmidencollectie : LMBP)
젠트 대학(Universiteit Gent)
K.L. Ledeganckstraat 35
B-9000 Gent, Belgium
국제기탁기관을 대표할 권한을 가진 자 또는 권한을 위임받은 서기관의 서명:
(서명)
일자 : 1996. 11. 19. 릭 마틴 반호우케
본 발명의 첫 번째 양태에 따르면, HIV 양성인 환자에 대한 HIV 화학 요법적 처치법이 제공되며, 이 처치법은, 환자로부터 입수한 HIV의 pol 유전자로부터의 서열 및 상기한 서열이 결실된 HIV-DNA 구성물(construct)로 HIV에 의해 감염되기 쉬운 세포계(cell line)를 트랜스펙션(transfection)시키고, 키메라(chimera) 비루스의 스톡(stock)을 창출하기 위하여 상기한 트랜스펙션된 세포를 배양하며, HIV의 pol 유전자에 의하여 암호화된 상기한 효소의 저해제에 대한 상기한 키메라 비루스의 표현형적 감수성을 평가하고 그에 대해 값을 부여하며, 키메라 비루스 감수성에 대한 상기한 값 및 HIV의 키메라 야생형 계통에 대한 상응하는 값으로 구성되는 데이터 세트를 구성하고, 적어도 2 종 이상의 다른 저해제에 대한 감수성 평가를 반복하여 전체적으로 적어도 3 종의 이러한 데이터 세트를 구성하며, 각각의 데이터 세트의 경우에 있어서 키메라와 야생형의 감수성 사이의 차이가 문제의 저해제를 사용한 치료를 위한 키메라 스톡의 내성에 관한 가시적 척도를 제공하게 하는 방식으로 2차원적 또는 3차원적 그래프 형태로 상기한 데이터 세트를 나타내고, 이렇게 측정된 내성에 관한 그래프적 표현에 기초하여 최적한 저해제를 선발하는 것으로 구성된다.
본 발명에 따른 방법은 개개의 HIV 감염 환자에 대한 큰 규모로 경제적이고도 신속하게 표현형적 정보를 산출한다. 이 방법은 현재의 모든 유용한 화학 요법적 양생법에 적용가능하며, 장래의 화학 요법적 양생법에 대해서도 동등하게 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에 따른 방법은 특정한 화학 요법적 양생법이 개시, 계속, 또는 조정되어져야 하는지의 여부를 결정하기 위하여 즉각적으로 사용될 수 있는 환자의 HIV 계통에 관한 표현형적 데이터를 의사에게 제공한다.
바람직하게는, 이 데이터 세트는 하기한 사항을 포함하는 다각형 또는 의사(擬似) 원형으로 나타내진다 :
(a) 다수의 표준화된 축이 원점으로부터 방사상으로 연장되며, 각 축은 하나의 데이타 세트 또는 저해제 또는 그 조합에 대응하고;
(b) 각종 저해제에 대한 야생형 HIV의 감수성 값이 각각의 축상에서 균등하게 되도록 축이 표준화되고, 선택적으로 나타내지는 야생형 HIV에 대한 데이터 점들은 중심이 원점에 위치하고 각정(角頂)이 축상에 놓여지는 정다각형을 형성하도록 연결되며;
(c) 각 축상에는, 상기한 축에 대응하는 저해제에 대한 키메라 HIV 스톡의 감수성 값을 나타내는 데이터 점이 도시되며, 키메라 데이터 점은 일련의 저해제에 대한 키메라 스톡의 내성을 나타내는 정다각형 또는 불규칙 다각형 형상을 형성하도록 선택적으로 연결된다.
정다각형 또는 의사(擬似) 원형 그래프는, 수 많은 약제에 대한 환자의 내성이 환자의 키메라 HIV 스톡과 야생형 계통이 나타내는 다각형 사이의 뷸일치도에 의하여 특징지워지는 장점을 제공한다. 이 다각형의 영역은 특정한 영역에서 다른 영역 보다 전체적으로 더 벗어나게 될 것이며, 이것은 축이 문제의 영역을 관통하는 각 경우에 있어서 저해제에 대한 내성이 더 크거나 작은 정도를 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 키메라 HIV 스톡을 사용하며, 저해제의 유효 범위에 교차하는 이 스톡의 내성에 관한 지도를 제공한다. 이 방법에 있어서는, 통상적인 정량법에 의해서는 얻어지지 않는 키메라 스톡에 대한 기술적 특징 양태가 지도 또는 그래프에 의하여 제공된다.
바람직한 일구체예에 있어서는, 표준화된 축이 상호간에 등각이다.
더우기, 바람직하게는, 각 축은 로그 스케일이다.
더우기, 바람직하게는, 키메라 다각형내에 편심적 데이터 점들이 나타난다면, 이것은 저해제들이 그 환자에 대해서 이득이 전혀 없거나 거의 없는 것으로 추정될 수 있다는 유용한 사실을 확인해 주는 것인 반면, 야생형 다각형내, 그 선 위, 또는 인접한 외부에 놓여 있는 데이터 점들은 그 환자에 대해서 상당한 이득이 있는 것으로 추정될 수 있다는 유용한 사실을 확인해 주는 것이다.
최악의 사례값이 키메라 및 야생형 HIV를 따라 나타나는 경우, 통상적으로 불규칙한 다각형이 키메라 및 야생형 다각형을 에워싸게 된다. 위에서 사용된 바와 같은 "편심적"이라는 용어의 의미는 데이터 점들이 상기한 최악의 사례에 있어서의 경계선에 비교적 근접하게 위치하며 야생형 다각형으로 부터는 비교적 멀리 위치하는 것을 지칭한다. 이와 유사하게, "야생형 다각형의 인접한 외측"이라는 용어는 최악의 사례에 있어서의 경계선으로 부터의 거리와 비교시 야생형 다각형에 대한 상대적인 근접도를 지칭한다.
위에서 정의된 바와 같은 방법은, 저해제에 대한 측정 가능한 내성은 사용되는 저해제의 특정한 농도 범위에 의존적이라는 의미에서 제한적이다. 또한, 측정자는 생물학적 가변성의 영향을 감소시키기 위하여 노력하여야 한다. 따라서, 최대의 내성값 또는 소정의 저해제가 전혀 효과를 나타내지 않는 것으로 추정되는 최악의 사례에 있어서의 측정 가능한 내성값을 얻는 것이 바람직하다. 예컨대, 100 μM의 농도는 실제적으로 테스트 가능한 일반적인 최대 농도이나, 예컨대, 약학적, 독물학적 또는 약물동력학적 연구로 부터 유래되는 농도일 수도 있다. 조사 대상 환자의 내성 수준 비교 및 측정 가능한 최대 내성은 조사 대상 환자에 대한 의미있는 중요한 수준의 내성이 어느 정도인지를 결정할 수 있게 한다. 측정 가능한 최대 내성 및 실제의 내성은 후술하는 바와 같은 막대 그래프로 적절히 나타내 질 수 있다.
본 발명에 있어서 여전히 더욱 바람직한 일구체예에 있어서는, 상기한 셋 또는 그 이상의 데이터 세트들의 각각이 문제의 저해제에 대한 최악의 사례에 있어서의 측정 가능한 내성값을 포함하며, 상기한 최악의 사례에 있어서의 내성값은 키메라 스톡에 대한 데이터 점들이 야생형 및 최악의 사례에 있어서의 HIV 양자와 비교할 수 있도록 하는 방식의 그래프적 표현으로 나타나고, 이에 의해서 특정한 사례에 있어서의 저해제에 대한 상대값 평가를 제공한다.
150 개의 환자 시료를 상회하는 시료를 갖고 수행한 실험은, 후술하는 실시예에서 설명하는 바와 같이, 내성 발달 및 치료 요법 적용 내력 사이에 밀접한 상관 관계를 나타냈다. 전형적인 비루스 분리 및 표현형 결정 기술에 의하여 산출된 데이터에 비하여 본 발명에 따라 산출된 데이터로 부터 이러한 밀접한 상관 관계가 발견되었다.
본 발명에 따른 방법은, 따라서, HIV 화학 요법에 대한 개별화되고 더욱 합리적인 처치를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 항-HIV 약제의 적절한 투여와 조합된 본 발명에 따른 방법의 사용은 HIV 비루스로 감염된 환자에 대해 더욱 양호한 치료 및 생존으로 이끌게 된다.
본 발명에 따른 방법은 개개의 환자가 상이한 많은 종류의 약제를 투여받아 와서 그의 돌연변이 패턴을 참여 의사가 용이하게 해석할 수 없는 경우 특별한 적용성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, HIV 양성인 환자의 HIV 화학 요법을 처치하는 방법이 제공되며, 이 처치 방법은 다음의 단계들로 구성된다 :
(a) 전술한 바와 같은 방법으로 환자의 HIV 계통의 표현형적 감수성을 주기적으로 평가하고;
(b) 환자의 HIV 계통이 선택된 화학 요법에 대하여 감수성이 남아있는 동안은 그 선택된 저해제로 그 화학 요법을 지속하며;
(c) 최초의 저해제의 감수성이 감소되는 경우 또는 감소된다면, 다른 저해제를 선택한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, HIV 양성인 환자의 화학 요법 처치에 사용하기 위한 임상적 처치 장치가 제공되며, 상기한 장치는 위에서 정의된 바와 같은 다수의 데이터 세트에 대한 도식 표시가 들어 있다.
우리는 본 발명에 따른 임상적 처치 장치에 대해 "앤티비로그램(Antivirogram)"이라는 용어를 새로 만들어 냈으며, 이 용어는 이하의 명세서중에서 사용될 것이다. 이 장치는 개개의 HIV-감염 환자의 임상적 처치에 사용되거나 또는 사용될 수 있는 상이한 종류의 저해제들에 대한 상대적인 변화 및 감수성에 관한 명확한 표시를 의사에게 제공한다.
본 명세서중에서의 HIV는 전반적으로 HIV-1을 의미한다. 그러나, 본 발명은 또한 HIV-2에도 적용할 수 있다.
바람직하게는, HIV의 pol 유전자에 의해 암호화되어 있는 적어도 2 종의 효소의 저해제들에 대한 상기한 키메라 비루스의 표현형적 감수성이 동시적으로 평가되는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서는, HIV의 pol 유전자에 의해 암호화되어 있는 적어도 2 종의 효소의 저해제들에 대한 환자에 있어서의 개개의 HIV 계통의 표현형적 약제 감수성을 정량하는 방법이 제공되며, 이 방법은 환자로 부터 입수된 HIV의 pol 유전자로 부터의 서열과 상기한 서열이 결실되어 있는 HIV-DNA 구성물로 HIV에 의해 감염되기 쉬운 세포계를 트랜스펙션시키고, 키메라 비루스의 스톡을 산출하기 위하여 상기한 트랜스펙션된 세포를 배양하며, HIV의 pol 유전자에 의해 암호화된 상기한 효소의 저해제에 대한 상기한 키메라 비루스의 표현형적 감수성을 평가하는 것으로 구성된다.
pol 유전자로 부터의 원하는 서열은 표현형적 약제 감수성이 정량되는 환자로 부터 입수된 생물학적 물질 시료로 부터 분리된다. 생물학적 물질의 폭 넓은 가변성은 원하는 서열의 분리를 위하여 사용될 수 있다.
따라서, 생물학적 물질은 혈장, 혈청, 또는 정액 및 질액으로 부터 선택되는 세포 유리 체액으로 부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 것은 혈장이며, 상기한 종래의 기술에서 사용되는 바와 같은 PBMCs의 사용에 비하여 특히 유리하다.
선택적으로, 생물학적 물질은 RNA 안정제가 첨가된 전혈(whole blood)일 수 있다.
또 다른 일구체예에 있어서는, 생물학적 물질이 뇌 조직 또는 림프절 조직, 또는 생체 조직 절편 검사법에 의하여 입수된 다른 조직으로 부터 선택되는 고체 조직일 수 있다.
이하에서 설명하는 바와 같이, 혈장과 같은 생물학적 물질이 원하는 서열의분리에 이용되는 경우, 혈장의 최소 부피가 사용될 수 있으며, 이는 전형적으로는 약 100∼250 ㎕, 더욱 특별하게는 200 ㎕ 정도이다.
더우기, 선택되는 2 종의 효소가 HIV RT, 프로테아제 및 인테그라제로 부터 선택되는 것이 바람직할 것이다.
통상적으로, 비루스 RNA는 공지된 그 자체의 방법, 예컨대, Boom, R. et al. 의 방법(Journal of Clinical Microbiology (1990) Vol. 28, No. 3, p.495∼503)에 의해 본 발명에 따라 분리된다.
혈장, 혈청 및 세포 제거 체액의 경우에 있어서는, Qiagen group of companies에 의해 시판되는 QIAamp 비루스 RNA 키트를 사용할 수도 있다.
바람직하게는, HIV에 의해 감염되기 쉬운 세포계가 CD4＋T-세포계이다.
더욱 바람직하게는, CD4＋T-세포계가 MT4 세포계 또는 HeLa CD4＋세포계이다.
역전사는 Perkin Elmer에 의해 시판되는 GeneAmp 역전사 효소 키트와 같은 상업적 키트를 이용하여 수행될 수 있다.
환자의 pol 유전자의 원하는 영역은 특이적인 하류 프라이머(downstream primer)를 사용하여 역전사하는 것이 바람직하다.
역전사될 서열이 역전사 효소 또는 역전사 효소 및 프로테아제를 암호화하는 경우, 하류 프라이머는 OUT3 : 5´-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-3´(서열 확인 번호 : 1)인 것이 바람직하다.
특히 바람직한 일구체예에 있어서는, 환자의 HIV RT 유전자 및 HIV 프로테아제 유전자가 HIV-1 특이적 OUT3 프라이머 및 유전적으로 조작된 역전사 효소를 사용하여 역전사되며, 이 역전사 효소는 전사될 전 RNA가 분해되는 일 없이 cDNA로 변환되도록 RNase H 활성이 결여되어 있다. 이와 같이 유전적으로 조작된 역전사 효소인 Expand(Expand는 상표임) 역전사 효소는 Boehringer Mannheim GmbH로 부터 입수할 수 있다.
Expand 역전사 효소는 일종의 RNA 명령 DNA 폴리머라제이다. 이 효소는 몰로니 뮤린 백혈병 비루스(Moloney Murine Leukaemia Virus) 역전사효소(M- MuLV-RT)를 유전적으로 조작한 변형체이다. RNase H 서열내의 점 돌연변이는 RNase H 활성을 검출 가능한 수준 이하로 감소시킨다. 이 유전자 조작된 역전사효소를 사용하면, 많은 양의 완전한 길이의 cDNA 전사체를 얻을 수가 있다.
역전사에 이어서, 전사된 DNA는 PCR 기술을 사용하여 증폭된다.
역전사 생성물은 안착형 PCR 기술을 사용하여 증폭시키는 것이 바람직하다.
관심있는 영역이 RT 영역인 경우, Kellam, P. 및 Lader, B. A. (1994 상동)에 의해서 기술된 바와 같은 내부 및 외부 프라이머를 이용한 안착형 PCR 기술을 사용하는 것이 바람직하다. 관심있는 영역이 RT 및 프로테아제 유전자에 걸쳐있는 경우에는, 사용되는 특이적 프라이머가 OUT 3 / IN 3 (하류) 및 RVP 5 (상류)의 조합인 것이 바람직하다.
프라이머 RVP 5(Maschera, B., et al. Journal of Viology, 69, 5431-5436)는 서열 5´-GGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGG-3´(서열 확인 번호 : 2)를 갖는다.
도 3 에 증폭에 대한 개략적 도식이 나타나 있으며 실시예 2 에 그 상세한 사항이 설명되어 있다.
프로테아제 cDNA의 증폭은 도 3 으로 부터 명백한 바와 같이 헤미안착형 (heminested) PCR 법을 포함한다.
안착형 PCR 기술은 공지의 단순한 PCR 기술에 비하여 가장 특이적인 PCR 생성물을 얻을 수 있다는 장점을 갖는다.
그러나, PCR 중에 균일하게 더욱 높은 정확도 및 수율을 얻기 위해서는 열안정성 폴리머라제의 혼합물(Barnes, W. M. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 2216-2220)을 사용할 수 있다. 이러한 폴리머라제 혼합물은 Expand(Expand는 상표임) 고정확도 PCR 시스템이라는 상품명으로 Boehringer Mannheim GmbH로 부터 구입할 수가 있다. 이 시스템을 사용하면 증대된 감도, 즉 Taq 폴리머라제를 단독으로 사용하는 통상적인 PCR 법을 사용하여 얻어지는 것 보다 10 배 또는 그 이상의 감도를 얻을 수가 있다.
pol 유전자 영역이 RT 및 프로테아제 유전자를 포함하고 있는 경우에는, HIV-DNA 구성물이 RT 및 프로테아제 유전자가 결실된 것으로서, the Belgian Coordinated Collections of Microorganisms-BCCM LMBP-Collection에 기탁 번호 LMBP3590으로 1996. 11. 8일자로 기탁된 바와 같은 플라스미드 pGEMT3-△PRT인 것이 바람직하다.
그러나, RT 유전자 뿐만 아니라 프로테아제 유전자에 대한 결실을 수반하는 HIV-1 프로비루스를 포함하는 플라스미드를 생성시키기 위한 몇가지 시도가 채택될 수 있다. 한 가지 가능성은 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발에 의하여 원하는 결실을 도입하는 것이다. 그러나, 후술하는 실시예 2 에서 채택된 방법은 특이적인 제한 효소의 사용 및 서브클로닝법에 의하여 원하는 구성물을 생성시키는 것을 포함하며, 이에 대해서는 후술한다. 최종 결과는 유용한 제한 부위에 의존적이기는 하지만, 본 방법의 주요한 장점은 신속하게 확정적인 결과를 얻을 수 있다는 것이다.
트랜스펙션을 위한 가장 유효한 성과를 보장하기 위해서는, 트랜스펙션되는 PCR-생성물을 그 자체가 공지된 방식인 음이온 스핀 컬럼에 의해 이상적으로 정제하여야 한다. 바람직한 키트는 Qiagen group of companies에 의해 시판되는 QIAquick PCR 정제 키트이다.
트랜스펙션은 일렉트로포레이션에 의해 수행될 수 있으며, 선택적으로는, 지질, 특히 양이온성 지질, DEAE 데스트란, CaHPO4등을 사용할 수도 있다.
지질 트랜스펙션의 경우에 있어서는, 네덜란드 리크(Leek)의 Invitrogen B.V.
에 의해 시판되는 PERFECT(PERFECT는 상표임) 트랜스펙션 키트의 사용이 유용할 수 있다.
따라서, 트랜스펙션을 위해서는, pol 유전자로 부터 선택된 유전자(들)가 결실되어 있는 HIV-DNA 구성물은 후속하는 증폭에 의하여 얻어지는 생성물과 결합하여 사용된다.
만일 결실된 것이 RT 유전자 뿐이라면, 상기한 구성물은 플라스미드 pHIV△RT(Medical Research Council (MRC)로 부터 입수 가능함)일 수 있다. RT 및 프로테아제 유전자가 함께 결실되어 있는 경우에 있어서의 적절한 HIV DNA 구성물은 본 병세서중에 기재되어 있는 고복사 벡터인 플라스미드 pGEMT-△PRT이다. 이러한 플라스미드는 그 자체 공지된 방법에 따라 트랜스펙션에 앞서 선형화된다.
하나 이상의 pol 유전자 효소를 암호화하는 구성물, 예컨대, △PRT 구성물을 사용하는 특별한 장점은, 단 하나의 유전자가 사용되는 경우 보다 구성물중에 환자로 부터의 최초의 물질을 더 많이 포함시키기에 더욱 용이하다는 것이며, 그리하여 증폭된 물질이 특정한 조사 대상 환자에 있어서의 비루스의 유전형적 다양성을 더욱 큰 정도로 반영시키게 된다.
안착형 PCR을 위해 선택되는 특이적인 프라이머는 증폭되어 조사될 표적 효소의 바디 서열 바깥에 위치되는 것이 바람직하다는 사실을 인지하여야 할 것이다. 또한, RT 및 프로테아제의 조합은 RT 단독의 경우보다 RT를 조사함에 있어서 더욱 양호한 결과를 제공하기 쉽다는 사실도 인지하여야 할 것이며, 그 이유는 RT 단독인 상황에 비하여 40 개 보다 많은 아미노산이 환자로 부터 산출되기 때문이다.
프로테아제를 연구함에 있어서, 이 프로테아제의 맨앞의 9 개 아미노산은 여전히 구성물(pGEMT-△PRT)의 야생형 백본으로 부터 유래된다는 것을 인식하여야 한다.
세포의 트랜스펙션이 일렉트로포레이션(electroporation)을 통하여 달성되는 경우, 선택되는 매개변수들은 양호한 세포 증식 및 비루스 생산을 달성하기에 최적하다. 일렉트로포레이션은 대략 250㎌ 및 300V 으로 수행하는 것이 편리하다. 바람직하게는, 일렉트로포레이션이 약 10㎍의 선형 플라스미드, 예컨대, pHIV△RTBst EII 및 약 5㎍의 증폭된 PCR 생성물, 예컨대, RT PCR 생성물의 존재하에서 수행된다. 성공적인 세포내 상동 재조합후, 새로운 키메라 HIV는 5 내지 10일내에 형성된다. 공지의 기술을 이용한 전형적인 배양 시간은 키메라 HIV가 형성되기 전 12-14 일이다. 배양 상청액 분액(supernant aliquot)은 약 70℃ 또는 그 이하의 온도에서 보관된다.
다른 HIV 유전자, 예컨대, 인테그라제 유전자, 또는 하나 이상의 HIV 유전자, 예컨대, RT 및 인테그라제 유전자의 양자를 분리하여 증폭시키고, CD44T-세포를 관련 유전자(들)가 결실된 적절한 선형화된 HIV-DNA 구성물과 합동하는 각각의 인테그라제 또는 RT/인테그라제 PCR 생성물로 트랜스펙션시킴에 있어서도 상기한 방법을 사용할 수 있다는 것은 용이하게 알 수 있다.
새롭게 형성된 키메라 비루스는 타이트레이션(titration)된 다음, 상이한 pol 유전자 효소 저해제에 대한 표현형적 감수성(즉, 감수성(susceptibility))이 분석되며, 바람직하게는 자동화 세포계 검정법(cellular-based assay)에 의하여 분석된다.
바람직하게는, 하나 또는 그 이상의 RT, 프로테아제 또는 인테그라제 저해제(들)에 대한 야생 HIV 계통(적절하게는 재조합 야생 HIV 계통) 및 키메라 비루스의 표현형적 약제 감수성은 저해 농도(inhibitory concentration : IC값)로 표현된다.
하나 또는 그 이상의 인테그라제 저해제 및/또는 하나 또는 그 이상의 프로테아제 저해제 및/또는 하나 또는 그 이상의 인테그라제 저해제에 대한 키메라 비루스 및 야생형 HIV 계통의 감수성은, 예컨대, 50% 또는 90% 저해 농도(IC50또는 IC90값)로 표시될 수 있다.
바람직하게는, RT 저해제가 AZT, ddI(디다노신/Videx(Videx는 상표임)), ddC(잘시타빈), 3TC(라미뷰딘), d4T(스타뷰딘)과 같은 뉴클오시드 RT 저해제, 델라비르딘(U 9051125(BMAP)/Rescriptor(Rescriptor는 상표임), 로비리데(알파-APA), 네비라핀(B1-RG-587/Viramune(Viramune은 상표임)) 및 티비라핀(8-Cl-TIBO (R86 183))과 같은 비뉴클레오시드 RT 저해제, 사퀴나비르, 인디나비르 및 리토나비르와 같은 프로테아제 저해제 및, 카페인산 페닐에틸 에스테르(CAPE)와 같은 인테그라제 저해제로 부터 선택된다.
적절한 RT 및/또는 프로테아제 저해제 및/또는 인테그라제 저해제는 AZT, ddI, ddC, 3TC, d4T, 1592U89 등과 같은 뉴클오시드 RT 저해제, 로비리데, 네비라핀, 델라비리딘, 아테비리딘 및, 티비라핀(8-Cl TIBO) 등과 같은 비뉴클레오시드 RT 저해제, 사퀴나비르, 인디니비르 및 리토나비르 등과 같은 프로테아제 저해제 및, 카페인산 페닐에틸 에스테르(CAPE)와 같은 인테그라제 저해제 및 WO 95/08540 및 GB 2,271,566에 기재된 타입의 HIV 인테그라제 저해제로 부터 선택되는 것이다.
본 발명에 따른 방법은 하나 또는 그 이상의 RT 저해제 및/또는 하나 또는 그 이상의 프로테아제 저해제, 및/또는 하나 또는 그 이상의 인테그라제 저해제에 대한 환자의 HIV 계통의 표현형적 약제 감수성을 야생형 HIV 계통의 경우와 비교하는 단계를 포함한다. 시험된 상이한 약제 화합물(또는 그 조합물)에 대한 감수성에 있어서의 상대적인 변화를 이해하기 쉬운 표시, 즉 앤티비로그램(Antivirogram)으로 작도된다.
이 그래프는 다음과 같이 해석되어져야 한다 : 앤티비로그램내의 편심적 데이터 점들은 HIV 감염 환자에 대해서 그 화학요법적 양생법이 더 이상 도움이 되지 않을 것이라는 사실을 확인하는 것이며, 반면에 참조 다각형내 또는 그 선상, 또는 참조 다각형을 단지 약간 넘어서는 위치의 데이터 점들은 HIV 감염 환자에 대해서 그 화학요법적 양생법이 도움이 될 것이라는 사실을 확인하는 것이다.
올바른 항-HIV 약제의 투여와 결부된 본 발명에 따른 방법은 궁극적으로HIV 환자에 대한 더욱 양호한 치료, 향상된 질의 삶 및 향상된 생존률로 이끌어야 한다. 즉, 비효과적인 치료(내성 HIV 계통의 존재 또는 출현에 기인)가 방지 내지 정지될 수 있으며, 효과적인 화학요법이 적절한 좋은 시기에 개시될 수 있다.
또한, 본 발명은 앞서 기술한 방법에 의해 얻어질 수 있는 앤티비로그램을 포함하는 HIV 감염 환자를 치료하는 의사가 사용하기 위한 임상적 처치 장치에 관한 것이다.

Claims (29)

  1. 환자로 부터 입수한 HIV의 pol 유전자로 부터의 서열 및 상기한 서열이 결실된 HIV-DNA 구성물(construct)로 HIV에 의해 감염되기 쉬운 세포계(cell line)를 트랜스펙션(transfection)시키고, 키메라(chimera) 비루스 스톡(stock)을 창출하기 위하여 상기한 트랜스펙션된 세포를 배양하며, HIV의 pol 유전자에 의하여 암호화된 상기한 효소의 저해제에 대한 상기한 키메라 비루스의 표현형적 감수성을 평가하고 그에 대해 값을 부여하며, 키메라 비루스 감수성에 대한 상기한 값 및 HIV의 키메라 야생형 계통에 대한 상응하는 값으로 구성되는 데이터 세트를 구성하고, 적어도 2 종 이상의 다른 저해제에 대한 감수성 평가를 반복하여 전체적으로 적어도 3 종의 이러한 데이터 세트를 구성하며, 각각의 데이터 세트의 경우에 있어서 키메라와 야생형의 감수성 사이의 차이가 문제의 저해제에 의한 치료를 위한 키메라 스톡의 내성에 관한 가시적 척도를 제공하게 하는 방식으로 2차원적 또는 3차원적 그래프 형태로 상기한 데이터 세트를 나타내고, 이렇게 측정된 내성에 관한 그래프적 표현에 기초하여 최적한 저해제를 선발하는 것으로 구성되는 HIV 양성 환자에 대한 HIV 화학 요법적 처치법.
  2. 제 1 항에 있어서, 데이터 세트가 하기한 사항을 포함하는 다각형 또는 의사(擬似) 원형으로 표시되는 HIV 화학 요법적 처치법 :
    (a) 다수의 표준화된 축이 원점으로 부터 방사상으로 연장되며, 각 축은 하나의 데이터 세트 또는 저해제 또는 그 조합에 대응하고;
    (b) 각종 저해제에 대한 야생형 HIV의 감수성 값이 각각의 축상에서 균등하게 되도록 축이 표준화되고, 선택적으로 나타내지는 야생형 HIV에 대한 데이터 점들은 중심이 원점에 위치하고 각정(角頂)이 축상에 놓여지는 정다각형을 형성하도록 연결되며;
    (c) 각 축상에는, 상기한 축에 대응하는 저해제에 대한 키메라 HIV 스톡의 감수성 값을 나타내는 데이터 점이 도시되며, 키메라 데이터 점은 일련의 저해제에 대한 키메라 스톡의 내성을 나타내는 정다각형 또는 불규칙 다각형 형상을 형성하도록 선택적으로 연결된다.
  3. 제 2 항에 있어서, 각 축이 로그 스케일인 HIV 화학 요법적 처치법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 키메라 다각형내에 편심적(eccentric) 데이터 점들이 나타나는 경우, 저해제가 환자에 대해 이득이 전혀 없거나 거의 없는 것으로 추정될 수 있다는 유용한 사실을 확인해 주는 반면, 야생형 다각형내, 그 선 위, 또는 인접한 외측에 놓여있는 데이터 점들은 환자에 대해 상당한 이득이 있는 것으로 추정될 수 있다는 유용한 사실을 확인해 주는 HIV 화학 요법적 처치법.
  5. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기한 셋 또는 그 이상의 데이터 세트가 문제의 저해제에 대한 최악의 사례(worst-case)의 측정가능한 내성값을 또한 포함하며, 상기한 최악의 사례에 있어서의 값은 키메라 스톡에 대한 데이터 점들이 야생형 및 최악의 사례의 HIV 양자와 비교할 수 있도록 상기한 그래프적 표시로 표현되고, 이에 의해서 특정한 사례에 있어서의 저해제의 상대값에 대한 평가를 제공하는 HIV 화학 요법적 처치법.
  6. 하기한 단계로 구성되는 HIV 화학 요법 처치법 :
    (a) 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 환자의 HIV 계통의 표현형적 감수성을 주기적으로 평가하고;
    (b) 환자의 HIV 계통이 선택된 화학 요법에 대하여 감수성이 남아있는 동안에는 그 선택된 저해제로 그 화학 요법을 지속하며;
    (c) 최초의 저해제의 감수성이 감소되는 경우 또는 감소된다면, 다른 저해제를 선택한다.
  7. 제 1 항에서 정의된 바와 같은 다수의 데이터 세트에 대한 그래프적 표시를 지닌 HIV 양성 환자에 대한 화학 요법 처치용 임상적 처치 장치.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서, HIV의 pol 유전자에 의해 암호화되는 적어도 2종의 효소의 저해제에 대한 상기한 키메라 비루스의 표현형적 감수성이 동시에 평가되는 HIV 화학 요법 처치법,
  9. 환자로 부터 입수된 HIV의 pol 유전자로 부터의 서열과 상기한 서열이 결실되어 있는 HIV-DNA 구성물로 HIV에 의해 감염되기 쉬운 세포계를 트랜스펙션시키고, 키메라 비루스의 스톡을 산출하기 위하여 상기한 트랜스펙션된 세포를 배양하며, HIV의 pol 유전자에 의해 암호화된 상기한 효소의 저해제에 대한 상기한 키메라 비루스의 표현형적 감수성을 평가하는 것으로 구성되는, HIV의 pol 유전자에 의해 암호화되는 적어도 2 종의 효소의 저해제들에 대한 환자의 개별적인 HIV 계통의 표현형적 약제 감수성의 정량 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항, 제 8 항 및 제 9 항중 어느 한 항에 있어서, pol 유전자로 부터의 상기한 서열이 표현형적 약제 감수성이 정량되는 환자로 부터 얻어지는 생물학적 물질 시료로 부터 분리되는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기한 생물학적 물질이 혈장, 혈청 또는 정액 및 질액으로 선택되는 세포-제거 체액으로 부터 선택되는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기한 생물학적 물질이 RNA 안정제가 첨가된 전혈(whole blood)인 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기한 생물학적 물질이 뇌 조직 또는 림프절 조직으로 부터 선택되는 조직물인 방법.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2 종의 효소가 HIV RT, 프로테아제 및 인테그라제로 부터 선택되는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 14 항에 있어서, HIV에 의해 감염되기 쉬운 세포계(cell-line)가 CD4＋T-세포계인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, CD4＋T-세포계가 MT4 세포계 또는 HeLa CD4＋세포계인 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 16 항에 있어서, 환자의 pol 유전자의 원하는 영역이 특이적인 하류 프라이머를 사용하여 역전사되는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 역전사되는 서열이 역전사효소 및 프로테아제를 암호화하는 것인 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 하류 프라이머가 OUT3 : 5´-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-3´(서열 확인 번호 : 1)인 방법.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항에 있어서, 역전사 생성물이 안착형(nested) PCR 기술을 사용하여 증폭되는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 20 항중 어느 한 항에 있어서, HIV-DNA 구성물이 벨기에 미생물 정리 기탁 기관 (BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS)-BCCM LMBP-기탁 기관(COLLEC- TIONS)에 1996. 11. 8일자로 기탁 번호 LMBP3590으로 기탁된 RT 및 프로테아제 유전자가 결실된 플라스미드 pGEMT3-△PRT인 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 21 항중 어느 한 항에 있어서, 트랜스펙션이 일렉트로포레이션(electroporation)의해 달성되는 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 21 항중 어느 한 항에 있어서, 트랜스펙션이 양이온 지질의 사용에 의해 달성되는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 있어서, 상이한 RT, 프로테아제 및 인테그라제 저해제에 대한 키메라 비루스의 표현형적 약제 감수성이 자동화된 세포계(cellular-based) 검정법에 의해 평가되는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 24 항중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 RT, 프로테아제 또는 인테그라제 저해제에 대한 키메라 비루스및 야생형 HIV 계통의 표현형적 약제 감수성이 저해 농도(IC값)로 표시되는 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 25 항중 어느 한 항에 있어서, RT 저해제가 AZT, ddI, ddC, 3TC, d4T와 같은 뉴클오시드 RT 저해제, 로비리데, 네비라핀 및 티비라핀과 같은 비뉴클레오시드 RT 저해제, 사퀴나비르, 인디나비르 및 리토나비르와 같은 프로테아제 저해제, 그리고 카페인산 페닐에틸 에스테르(CAPE)와 같은 인테그라제 저해제로 부터 선택되는 방법.
  27. 실질적으로 앞서 기재되고 예증된 바와 같은 HIV 양성 환자의 HIV 화학 요법 처치법.
  28. 앞서 특별한 언급에 의해 실질적으로 기재 및 예증되고 첨부 도면 도 1 내지 도 5 에 도시된 바와 같은 임상학적 처치 장치.
  29. 실질적으로 앞서 기재되고 예증된 바와 같은, HIV의 pol 유전자에 의해 암호화된 적어도 2 종의 효소의 저해제에 대한 환자의 개별적인 HIV 계통의 표현형적 약제 감수성의 정량 방법.
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