HU226203B1 - Method for determining of the chemotherapy of patients who are hiv positive based on the phenotypic drug sensitivity of human hiv strains - Google Patents
Method for determining of the chemotherapy of patients who are hiv positive based on the phenotypic drug sensitivity of human hiv strains Download PDFInfo
- Publication number
- HU226203B1 HU226203B1 HU9902618A HUP9902618A HU226203B1 HU 226203 B1 HU226203 B1 HU 226203B1 HU 9902618 A HU9902618 A HU 9902618A HU P9902618 A HUP9902618 A HU P9902618A HU 226203 B1 HU226203 B1 HU 226203B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- hiv
- inhibitors
- patient
- chimeric
- sensitivity
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 68
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims description 65
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 65
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title claims description 40
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 title claims description 37
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 69
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 60
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 38
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 34
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 17
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 14
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 claims description 13
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 12
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 11
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 11
- 229940124524 integrase inhibitor Drugs 0.000 claims description 9
- 239000002850 integrase inhibitor Substances 0.000 claims description 9
- CJPLEFFCVDQQFZ-UHFFFAOYSA-N loviride Chemical compound CC(=O)C1=CC=C(C)C=C1NC(C(N)=O)C1=C(Cl)C=CC=C1Cl CJPLEFFCVDQQFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims description 9
- ZNFFMCYSMBXZQU-NSHDSACASA-N 5-chloro-8-methyl-7-(3-methyl-but-2-enyl)-6,7,8,9-tetrahydro-2h-2,7,9a-triaza-benzo[cd]azulene-1-thione Chemical compound C1N(CC=C(C)C)[C@@H](C)CN2C(=S)NC3=CC=C(Cl)C1=C32 ZNFFMCYSMBXZQU-NSHDSACASA-N 0.000 claims description 8
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 229960001936 indinavir Drugs 0.000 claims description 8
- CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N indinavir Chemical compound C([C@H](N(CC1)C[C@@H](O)C[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H]2C3=CC=CC=C3C[C@H]2O)C(=O)NC(C)(C)C)N1CC1=CC=CN=C1 CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N 0.000 claims description 8
- 229950006243 loviride Drugs 0.000 claims description 8
- NQDJXKOVJZTUJA-UHFFFAOYSA-N nevirapine Chemical compound C12=NC=CC=C2C(=O)NC=2C(C)=CC=NC=2N1C1CC1 NQDJXKOVJZTUJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 8
- NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N Ritonavir Natural products C=1C=CC=CC=1CC(NC(=O)OCC=1SC=NC=1)C(O)CC(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960000311 ritonavir Drugs 0.000 claims description 7
- NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N ritonavir Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N 0.000 claims description 7
- 229950011282 tivirapine Drugs 0.000 claims description 7
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 6
- SWUARLUWKZWEBQ-VQHVLOKHSA-N phenethyl caffeate Chemical compound C1=C(O)C(O)=CC=C1\C=C\C(=O)OCCC1=CC=CC=C1 SWUARLUWKZWEBQ-VQHVLOKHSA-N 0.000 claims description 6
- SWUARLUWKZWEBQ-UHFFFAOYSA-N phenylethyl ester of caffeic acid Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C=CC(=O)OCCC1=CC=CC=C1 SWUARLUWKZWEBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 230000001788 irregular Effects 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 229960000689 nevirapine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N Mecamylamine hydrochloride Chemical compound Cl.C1CC2C(C)(C)C(NC)(C)C1C2 PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 2
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 claims 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003239 susceptibility assay Methods 0.000 claims 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 75
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 28
- 229960002555 zidovudine Drugs 0.000 description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 13
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- XNKLLVCARDGLGL-JGVFFNPUSA-N Stavudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1C=C[C@@H](CO)O1 XNKLLVCARDGLGL-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 11
- WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N Zalcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- BXZVVICBKDXVGW-NKWVEPMBSA-N Didanosine Chemical compound O1[C@H](CO)CC[C@@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 BXZVVICBKDXVGW-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 229960001852 saquinavir Drugs 0.000 description 7
- QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N saquinavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN1C[C@H]2CCCC[C@H]2C[C@H]1C(=O)NC(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C1=CC=CC=C1 QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N 0.000 description 7
- 101150104269 RT gene Proteins 0.000 description 6
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- WHBIGIKBNXZKFE-UHFFFAOYSA-N delavirdine Chemical compound CC(C)NC1=CC=CN=C1N1CCN(C(=O)C=2NC3=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C3C=2)CC1 WHBIGIKBNXZKFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940124821 NNRTIs Drugs 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 4
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002259 anti human immunodeficiency virus agent Substances 0.000 description 3
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229960002656 didanosine Drugs 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- -1 ddl Chemical compound 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 2
- 229940063627 rescriptor Drugs 0.000 description 2
- 229940064914 retrovir Drugs 0.000 description 2
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 229940098802 viramune Drugs 0.000 description 2
- ZDSRFXVZVHSYMA-CMOCDZPBSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZDSRFXVZVHSYMA-CMOCDZPBSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AWGBKZRMLNVLAF-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-n,2-dihydroxybenzamide Chemical compound ONC(=O)C1=CC(Br)=CC(Br)=C1O AWGBKZRMLNVLAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010010369 HIV Protease Proteins 0.000 description 1
- 229940099797 HIV integrase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010016183 Human immunodeficiency virus 1 p16 protease Proteins 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 102220570933 N-acetylgalactosamine-6-sulfatase_M41L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 244000126002 Ziziphus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000008529 Ziziphus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019700 dicalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000003084 hiv integrase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 description 1
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- WTTIBCHOELPGFK-LBPRGKRZSA-N r82150 Chemical compound C1N(CC=C(C)C)[C@@H](C)CN2C(=S)NC3=CC=CC1=C32 WTTIBCHOELPGFK-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102200131341 rs267607614 Human genes 0.000 description 1
- 102220011161 rs727504317 Human genes 0.000 description 1
- 102200069353 rs8103142 Human genes 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960001203 stavudine Drugs 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 108010068794 tyrosyl-tyrosyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 229960000523 zalcitabine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
- Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány HIV-pozitív betegek kemoterápiájának meghatározására szolgáló in vitro eljárásra vonatkozik, az ilyen betegeket kezelő orvosok használatára. Ez az eljárás humán HIV-törzsek gyógyszerérzékenységén alapul, amely a HIV-pol-gén egy vagy több enzimének inhibitoraival szemben alakul ki. Vonatkozik még a találmány a HIV-pol-gén egy vagy több enzimének inhibitoraival szemben kialakult gyógyszerérzékenység egyidejű meghatározására.
Máig számos kemoterápiás protokollt dolgoztak ki a HIV-fertőzött betegek kezelésére. Néhány ilyen protokoll klinikai használatát már jóváhagyták, mások pedig még folyamatban lévő klinikai kipróbálás alatt állnak. Feltételezhető, hogy a jóváhagyott kemoterápiás protokollok száma a közeljövőben állandóan növekedni fog. Egyre nő a kombinált terápia vagy az összetett gyógyszerkezelési protokollok használata, minthogy gyógyszerrezisztens HIV-variánsok alakulnak ki a terápia folyamán. Jóllehet bebizonyosodott, hogy ezek a kemoterápiás protokollok hatást gyakorolnak a HlV-betegség virológiái (vírusterhelés), immunológiai és klinikai paramétereire, gyakorlati tapasztalatból azonban tudjuk, hogy ezek a hatások átmenetiek. Pontosabban azt találjuk, hogy a HIV-törzsek, amelyek egy adott beteget megfertőztek, egy idő után csökkent érzékenységet kezdenek mutatni a gyógyszerrel vagy a gyógyszerkombinációval szemben, amellyel az említett beteget kezelik. A kemoterápia hatásosságának elvesztése betegről betegre, gyógyszerről gyógyszerre, vagy gyógyszer-kombinációról gyógyszer-kombinációra változhat. Jól megállapított tény, hogy egy meghatározott típusú kemoterápia hatásosságának megszűnése összefügghet az aminosavváltozások genotípusos képével, amely a beteget megfertőző HIV-törzsek genomjában alakul ki. Valószínűleg az teszi ezeket a HIV-törzseket kevésbé érzékennyé a kemoterápiára.
Minthogy egy HIV-fertőzött beteg számos kemoterápiás protokollnak van kitéve hosszú időn át, a fertőző HIV-törzsek genomjában az aminosavváltozások összetettebb képe jelenik meg, és ez jelenleg meghiúsítja a megfertőzött beteg további kezelésének racionális megközelítését. Mint az előző magyarázat is utal rá, rutinszerűen meghatározhatók az olyan HlV-törzsekben előforduló genotípusos változások, amelyek ki vannak téve egy vagy több anti-HIV-gyógyszert magában foglaló különböző kemoterápiás protokollnak, de mindeddig nagyon nehéznek bizonyult ezekből az adatokból olyan információt kapni, amely felhatalmazná a kemoterápia előírásáért felelős orvost, vajon célszerű-e vagy sem megindítania vagy folytatnia egy sajátos kemoterápiás protokollt. Más szavakkal, a genotípusról kapott információt, amely korlátozottan áll rendelkezésre, nem lehet rutinszerűen olyan fenotípusra vonatkozó információra lefordítani, amely felhatalmazza a kezelőorvost olyan döntő elhatározás meghozatalára, hogy a betegnek milyen kemoterápiát kell követnie. Ez a probléma olyan, nem gyógyszereit betegeknél is fennáll, akiket gyógyszerrezisztens HIV-törzsek fertőztek meg.
A vírusterhelés monitorozása a HIV-beteg-ellátás rutin vonatkozásává vált. Azonban egyedül a vírusterheiés számát nem lehet alapul venni annál az elhatározásnál, hogy milyen gyógyszereket használjunk egyedül vagy kombinálva.
A választott kemoterápiás protokollban egyre több a kombinált terápia. Amikor egy gyógyszer-kombinációt használó beteg kezdi észrevenni a gyógyszer eredménytelenségét, lehetetlen biztonsággal megállapítani, hogy a kombinációban melyik gyógyszer az, amelyik már nem aktív. Nem lehet az összes gyógyszert egyszerűen kicserélni, mivel a jelenleg rendelkezésre álló gyógyszerek száma korlátozott. Ezenkívül, ha valaki a teljes kemoterápiás protokollt lecseréli, eldobhat egy vagy több olyan gyógyszert, amelyek ennél az adott betegnél aktívak. Ezenkívül vírusoknál, amelyek rezisztenciát mutatnak egy adott inhibitorral szemben, előfordulhat, hogy különböző fokú keresztrezisztenciát mutatnak más inhibitorokkal szemben is.
Ideális esetben tehát, hogyha egy beteget bármikor vírusterhelésre tesztelnek, és a teszt a vírusterhelés növekedését mutatja ki, el kell végezni egy gyógyszer érzékenységi/rezisztencia tesztet is. Ameddig nincs kifejlesztve hatékony gyógyítóterápia, a HIV-betegség ellátása ilyen tesztelést igényel.
Létezik jelenleg egy olyan fenotipizáló eljárás, amely plazmából történő vírusizoláláson alapul, donor perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC-k) jelenlétében, és ezután végzik a fenotipizálást az említett sejtekben [A. J. Japour et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37,1095-1101 (1993)]. Ez az együtttenyésztési eljárás, amelyet az AIDS Clinical Trial Group (ACTG főként az AZT- [a zidovudine/Retrovir (a Retrovir egy védjegy) szinonimája] rezisztencia fenotipizálására javasol, időigényes, költséges és túl komplikált a rutinszerű használathoz.
Az 1 típusú HIV-vírus-minták reverztranszkriptáz(RT) inhibitorokkal szembeni gyógyszerérzékenységének megállapítására egy fenotípusos rekombinánsvírus-assay-t fejlesztett ki Kellam és Larder [P. Kellam, B. A. Larder, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38, 23-30, (1994)]. Ez az eljárás élő vírus képződését teszi lehetővé, mégpedig RT-kódoló szekvenciák PCRrel előállított poolja és egy RT-re kimerített, nem fertőző provitális klón pHINARtBetEII homológ rekombinációja révén. Két betegnél zidovudine-terápia folyamán végzett analízis azt mutatta, hogy ez a próbálkozás olyan vírusokat hozott létre, amelyek pontosan ugyanazt a genotípust és fenotípust mutatták, mint az eredetileg fertőzött PBL-DNS-é. Azonban ez az eljárás a betegből való vírusizolálást úgy oldja meg, hogy együtt tenyésztik a beteg plazmáját vagy a beteg-PBMC-t a donor-PBMC-kkel. A vírusnak ezen előzetes tenyésztése eltorzíthatja az eredeti vírusösszetételt. Ezenfelül ez az eljárás, bár lehetővé teszi a minták érzékenységének a különböző inhibitorokkal szembeni meghatározását, mégsem nyújt az orvosnak olyan információt, hogy folytassa-e a meglévő kemoterápiás protokollt vagy változtasson a terápián.
Amennyiben a pol-génnek csak az egyik enzime kerül vizsgálatra, az eljárás a kombinációs terápia amely rendszerint egy proteáz- és két RT-inhibitor
HU 226 203 Β1 használatát tartalmazza - rutin fenotípusos meghatározására szintén nem könnyen alkalmas.
A rekombinánsvírus-assay-ben használt „fészkes” PCR (nested PCR: polymerase chain reaction: polimeráz-láncreakció) egy olyan helyzetet eredményezhet, amelyben a rekombináns vírus nem tükrözi helyesen a vizsgált beteget fertőző HIV-törzsekkel kialakult helyzetet. Ez a probléma a DNS-szekvencia homológiájában rejlik, és az emlőssejtekben bekövetkező homológ rekombinációhoz szükséges homológja minimális mennyiségében [C. Rubnitz, S„ Subramini, Molecular and Cellular Biology, 4, 2253-2258 (1984)}. Tehát minden, rekombináns vírus használatán alapuló, fenotípusára irányuló assay-nek arra kell törekednie, hogy biztosítsa, amennyire lehetséges a betegből származó anyag sokszorozását és a maximális rekombinációt.
Tehát az RNS-extrakcióval és az alkalmazott „fészkes” (nested) PCR-eljárásokkal biztosítani kell, hogy a virális genetikai anyagot olyan módon sokszorozzuk fel, hogy a sokszorozott anyag maximálisan tükrözze a virális genetikai változatokat a vizsgálandó betegben.
A jelenlegi klinikai gyakorlatban tehát igen erős igény van arra, hogy (a) gyorsan és rutinszerűen határozzák meg azon HIV-törzsek fenotípusos gyógyszerérzékenységét, amelyekkel egy adott beteg megfertőződött, hogy (b) az így kapott adatok könnyen érthető információvá legyenek feldolgozva, és hogy (c) az említett információ alapján kezdjék, folytassák vagy beállítsák az említett, adott beteg számára előírt kemoterápiát.
A találmány egy első szempontja szerint HlV-pozitív betegek HIV-kemoterápiájának meghatározására alkalmas in vitro eljárást bocsátunk rendelkezésre, amely tartalmazza a következőket: egy HlV-fertőzésre érzékeny sejtvonalat egy betegből izolált HlV-pol-génből származó szekvenciával és egy HIV-DNS-szerkezettel - amelyből az említett szekvenciát töröltük transzfektálunk, az említett transzfektált sejteket tenyésztjük, és így kiméravírusok egy állományát hozzuk létre, meghatározzuk a kiméravírusok fenotípusos érzékenységét az említett, HIV-pol-gén által kódolt enzim egy inhibitorával szemben, és erre meghatározunk egy értéket, majd egy olyan adatsort szerkesztünk, amely magában foglalja a kiméravírusra megállapított érzékenység értékét és egy kiméra vad típusú HIV-törzs megfelelő értékét, az érzékenység meghatározását legalább két további inhibitor vonatkozásában megismételjük, és ezáltal legalább összesen három adatot tartalmazó sort hozunk létre, az említett adatsorokat kétdimenziós vagy háromdimenziós grafikus formában úgy ábrázoljuk, hogy mindhárom adatsor esetében a kiméra- és vad típusú érzékenység közötti különbség azon rezisztencia vizuális mértékéül szolgáljon, amelyet a kiméraállomány a szóban forgó inhibitorral való kezeléssel szemben tanúsít, és kiválasztjuk az optimális inhibitor(oka)t az ilyen módon mért rezisztencia grafikus ábrázolása alapján.
A találmány szerinti eljárás nagyszámú individuális HlV-fertőzött betegről ad fenotípusra vonatkozó információt, gazdaságosan és gyorsan. Az eljárás minden, jelenleg rendelkezésre álló kemoterápiás protokollra alkalmazható, és valószínűleg a jövőbeni kemoterápiás protokollokra is alkalmazható lesz.
A találmány szerinti eljárás a beteg HIV-törzseinek fenotípusára vonatkozóan olyan adatokkal szolgál az orvosnak, amelyeket azonnal fel tud használni annak meghatározására, hogy szükséges-e elkezdeni, folytatni vagy módosítani egy egyéni kemoterápiás protokollt.
Előnyös, ha az adatsorokat egy sokszögű vagy egy kvázi kör alakú grafikonon ábrázoljuk, amelyben
a) egy középpontból (origóból) több korrigált tengely indul ki, mindegyik tengely egy adatsornak vagy inhibitornak - vagy ezek kombinációjának - felel meg,
b) a tengelyeket úgy korrigáljuk, hogy a vad típusú HIV-érzékenységi értékeit a különböző inhibitorokkal szemben minden tengelyen egyenlőnek visszük fel, a vad típusú HIV-re vonatkozó adatpontokat tetszés szerint ábrázoljuk, és ezeket úgy kötjük össze, hogy szabályos sokszöget kapjunk, amelynek a csúcsai a tengelyeken vannak, és középpontját az origó határozza meg,
c) minden tengelyre felviszünk egy olyan adatpontot, amely a kiméra-HIV állománynak az említett tengelyeknek megfelelő inhibitorral szembeni érzékenységét reprezentálja, a kiméra adatpontokat adott esetben összekötjük, miáltal egy szabályos vagy szabálytalan sokszöget kapunk, amelynek az alakja a kiméraállomány rezisztenciáját jeleníti meg egy sor inhibitorral szemben.
Egy sokszögű vagy kvázi kör alakú ábra azzal az előnnyel jár, hogy a betegnek egy sor gyógyszerrel szembeni rezisztenciáját a beteg kiméra-HIV-állományának megfelelő sokszög és a vad típusú törzset képviselő sokszög közötti eltérés fokával fejezzük ki. A sokszögek területei általában egyes területeken jobban el fognak térni, mint más területeken, ami minden esetben azt mutatja, hogy a rezisztencia foka azzal az inhibitorral szemben, amelynek a tengelye a szóban forgó területen áthalad, nagyobb vagy kisebb.
A találmány szerinti eljárás szerint tehát egy kiméra-HIV-állományt alkalmazunk, és elkészítjük ezen állomány egy sor inhibitorral szembeni rezisztenciájának a térképét. Ilyen módon a térkép, vagy diagram a kiméraállomány egy sajátosságáról olyan technikai jellemzést ad, amelyet hagyományos mérésekkel nem kapunk meg.
Egy előnyös kiviteli alakban a korrigált tengelyek egymással azonos szöget zárnak be.
Előnyös továbbá, ha a tengelyeken logaritmikus beosztás van.
Ezenkívül előnyös, ha a kimérasokszögben az ábrázolt adatpontok excentrikusán helyezkednek el, azok olyan inhibitorokat azonosítanak, amelyeknek a használhatóságáról feltételezhető, hogy a betegnél kevés vagy semmiféle jó eredményt nem adnak, míg ha az adatpontok belül helyezkednek el, a vad típusú sokszögön vagy közvetlenül ezenkívül, ezek olyan inhibitorokat azonosítanak, amelyeknek a hasznosságáról feltételezhető, hogy a betegnél valóságos jótékony hatást fejtenek ki.
HU 226 203 Β1
Amennyiben a legrosszabb eseti értékeket a kiméra- és vad típusú HIV-vel együtt ábrázoljuk, egy rendszerint szabálytalan sokszög veszi körül a kiméra- és vad típusú sokszögeket. A fent használt „excentrikus” meghatározás egy olyan adatpontot jelöl, amely viszonylag közel esik a legrosszabb eseti határhoz és viszonylag távol a vad típusú sokszögtől. Hasonlóan, a közvetlenül a vad típusú sokszögön kívül kifejezés a vad típusú sokszöghöz való viszonylagos közelségre vonatkozik, ha a legrosszabb eseti határtól való távolsággal hasonlítjuk össze.
A fentiekben meghatározott eljárás abban az értelemben korlátozott, hogy az inhibitorral szembeni mérhető rezisztencia a használt inhibitor koncentrációinak adott mértékétől függ. Törekedni kell arra is, hogy csökkentsük a biológiai variabilitás hatásait. Ennek megfelelően kívánatos, hogy a maximálisan vagy legrosszabb esetre mérhető rezisztenciára egy olyan értéket kapjunk, amelynél feltételezhető, hogy az adott inhibitornak nincs hatása. Ez a koncentráció - például 100 μΜ - általában az a maximális koncentráció, amely gyakoriatilag tesztelhető, de származhat például farmakológiai, toxikológiai vagy farmakokinetikai vizsgálatokból is. A vizsgálat alatt álló beteg rezisztenciaszintjének és a maximális mérhető rezisztenciának az összehasonlítása határozza meg, hogy a vizsgált betegnél milyen a szignifikáns rezisztenciaszint. A maximálisan mérhető rezisztencia és az aktuális rezisztencia megfelelő módon mutatható be egy alább leírt oszlopos diagramon.
A találmány egy további kiviteli alakjában az említett három vagy több adatsor tartalmaz még egy értéket a legrosszabb esetben mérhető rezisztenciára a szóban forgó inhibitor vonatkozásában, s az említett legrosszabb eseti értékeket úgy mutatják be az említett grafikus ábrák, hogy a kiméraállomány adatpontját mind a vad típusú, mind a legrosszabb eseti HIV-hez lehet hasonlítani, s ez egy adott esetben az inhibitor relatív értékének megállapítására nyújt lehetőséget.
A több mint 150 betegből vett mintával végzett kísérletek szoros összefüggést fedtek fel a rezisztencia kialakulása és a terápiás előzmények között, mind ezt a példákban még ismertetjük. Szoros összefüggést találtunk a találmánynak megfelelően kapott adatok és a klasszikus vírusizolálási és -fenotipizálási technikákkal kapott adatok között.
A találmány szerinti eljárás tehát a HlV-kemoterápia egyénre szabott és ésszerűbb menedzselésére használható. Ennélfogva, a találmány szerinti eljárás használata, kombinálva az anti-HIV-gyógyszerek helyes alkalmazásával, a HIV-vírussal fertőzött betegek megfelelőbb kezelését és jobb túlélését eredményezi.
A találmány szerinti eljárás alkalmazásának akkor van különös jelentősége, amikor egy beteg sok különböző gyógyszert kapott, és a kezelőorvos nehezen tudja értelmezni mutációs motívumát.
A találmány egy további szempontja szerint a HIVpozitív betegek HIV-kemoterápiájának meghatározására az alábbi lépéseket tartalmazó eljárást ismertetjük:
(a) időszakosan megállapítjuk egy beteg HlV-törzsének a fenotípusos érzékenységét egy fent leírt eljárással;
(b) a kemoterápiának a kiválasztott inhibitorral való fenntartására vonatkozó instrukciót adunk, ameddig a beteg HIV-törzsei érzékenyek maradnak a választott kemoterápiára;
(c) másik inhibitort választunk, ha és amikor az eredeti inhibitorral szembeni érzékenység csökken.
A leírásban ismertetett klinikai eszközre az „Antivirogram” (védjegy) kifejezést alkottuk meg, és a részletes leírásban ezután ezt a kifejezést fogjuk használni. Ez az eszköz a különböző inhibitorokkal szembeni relatív változásokról és érzékenységekről ad egyértelmű felvilágosítást az orvosnak, mégpedig, hogy mely inhibitorokat használja vagy mely inhibitorokat használhatja az egyes HIV-fertőzött betegek klinikai protokolljában.
HIV-en általában HIV-1-et értünk. A találmány azonban HIV-2 esetén is alkalmazható.
Előnyös, ha az említett kiméravírusok legalább két - HIV-pol-gén által kódolt - enzim inhibitorával szembeni fenotípusos érzékenységét egyszerre állapítjuk meg.
A találmány egy következő vonatkozása, hogy eljárást bocsátunk rendelkezésre egy betegben lévő egyedi HIV-törzsek legalább két - HIV-gén által kódolt - enzim inhibitorával szembeni gyógyszerérzékenységének a meghatározására, amelynek során egy betegből származó biológiai anyagmintából vírus-RNS-t izolálunk és a HIV-pol-gén egy kívánt szakaszát reverz transzkripcióval átírjuk, a kapott szekvenciával és egy HIV-DNS-szerkezettel amelyből az említett szekvenciát töröltük - egy HIV-fertőzésre fogékony sejtvonalat transzferálunk, a transzfektált sejtek tenyésztésével kiméravírusok egy állományát állítjuk elő, meghatározzuk a kiméravírusok érzékenységét a HIV-pol-gén által kódolt enzimek inhibitoraival szemben.
A pol-génből származó kívánt szekvenciát annak a betegnek a biológiai anyagából vett mintából izoláljuk, akinek a fenotípusos gyógyszerérzékenységét meg óhajtjuk határozni. A biológiai anyagok széles választékát használhatjuk a kívánt szekvencia izolálására.
A biológiai anyag lehet plazma, szérum vagy egy sejtmentes testfolyadék, amelyet az ondó vagy a hüvelyi folyadék közül választunk ki. Különösen előnyös a plazma, amely - mint fent leírtuk - az eddigiek folyamán használt TBMC-khez viszonyítva előnyösebb.
A biológiai anyag lehet még teljes vér, amelyhez RNS-stabilizátort adtunk.
Egy további kiviteli alakban a biológiai anyag lehet szilárd szöveti anyag, például agyszövet, nyirokmirigyszövet, vagy biopsziával kapott más szövet.
Mint alább bemutatjuk, amennyiben olyan biológiai anyagot használunk a kívánt szekvencia izolálásához, mint a plazma, minimális plazmamennyiséget használhatunk, általában körülbelül 100-250 μ-t, pontosabban 200 μΙ körüli mennyiséget.
Ezenkívül előnyös, ha a két enzimet a HIV-RT, -proteáz és -integráz közül választjuk ki.
HU 226 203 Β1
A vírus-RNS könnyen izolálható ismert eljárásokkal, ilyen például Boom és munkatársai eljárása [R. Boom et al., J. Clin. Microbiol., 28., 495-503 (1990)].
Plazma, szérum és szérummentes testfolyadékok esetében használhatjuk a QIAamp (védjegy) virálisRNS-készletet (kitet) is, amelyet a Qiagen csoport forgalmaz.
A HIV-fertőzésre fogékony sejtvonal előnyösen egy CDH+ T-sejtvonal.
Előnyös ezenkívül, ha a CDH+ T-sejtvonal az MTHsejtvonal vagy a HeLa CDH+ sejtvonal.
A reverz transzkripció kivitelezéséhez kereskedelmi kitet használhatunk, ilyen a Perkin-Elmer cég által forgalmazott GeneAmp (védjegy) Reverse Transcriptase Kit.
A beteg pol-génje kívánt szakaszának reverz transzkripcióját előnyösen egy specifikus 3’ primer használatával végezhetjük.
Abban az esetben, amelyben a reverz transzkriptázt vagy reverz transzkriptázt és proteázt kódoló szekvencia, előnyös, ha a 3' primer az OUT3: 5-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-3' (1. sz. szekvencia).
Egy különösen előnyös kiviteli alakban a HIV-RTgén és HIV-proteáz-gén reverz transzkripcióját a HIV-1-specifikus OUT primer használatával és egy genetikailag manipulált, RNáz H aktivitásmentes reverz transzkriptázzal végezzük úgy, hogy az átírandó összes RNS degradálás nélkül alakuljon át cDNS-sé. Ilyen genetikailag manipulált reverz transzkriptáz az Expand (az Expand egy védjegy) reverz transzkriptáz, amely a Boehringer Mannheim GmbH-tól beszerezhető.
Az Expand™ reverz transzkriptáz egy RNS-re ható DNS-polimeráz. Ez az enzim a Moloney Murine Leukaemia Vírus Hoesz transzkriptáz (M-Mu +V-RT) egy genetikailag manipulált változata. Az RNáz H szekvencián belüli pontmutáció a kimutathatósági szint alá csökkenti az RNáz H aktivitását. Ennek a genetikailag manipulált reverz transzkriptáznak a használata lehetővé teszi, hogy nagyobb mennyiségű teljes hosszúságú cDNS-átiratokat kapjunk.
A reverz transzkripció után az átírt DNS-t PCRtechnika használatával sokszorozzuk fel.
Előnyös, ha a reverz transzkripció termékét fészkes PCR- (nested PCR) technikával sokszorozzuk.
Abban az esetben, ha a szóban forgó szakasz az RT-szakasz, előnyösen a „fészkes PCR-technikát alkalmazzuk, Kellam és Larder szerint. [P. Kellam, B. A. Larder, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38, 23-30 (1994)], belső és külső primereket használva. Amennyiben a szóban forgó szakasz átéri az RT- és a proteázgént, akkor előnyösen az OUTS/INS (3’) és RVP5 (5') kombinációt használjuk specifikus primerek gyanánt.
Az RPV5 primer [B. Maschera et al., J. Virol., 69, 5431-5436 (1995)] szekvenciája a következő: 5’-G-GG-AAGATCTGG-CC TTCCTACAAGGG-3’ (2. sz. szekvencia).
A felsokszorozást a 3. ábrán mutatjuk be vázlatosan és a 2. példában ismertetjük nagyobb részletességgel.
A proteáz cDNS sokszorozása ténylegesen egy féloldali fészkes PCR- (himinested PCR) eljárást tartalmaz, ami a 3. ábrából kitűnik.
A „fészkes PCR-technikának az az előnye az ismert, egyszerű PCR-technikákhoz képest, hogy lehetővé teszi, hogy sokkal specifikusabb PCR-terméket kapjunk.
Mindazonáltal, hogy a PCR folyamán még nagyobb pontosságot és kitermelést érjünk el, igénybe vehetünk egy hőstabil polimerázokból álló keveréket [(W. M. Barnes, Proc. Natl., Acad. Sci., 91, 22316-2220 (1994)]. Ilyen polimerázkeverék a Boehringer Mannheim GmbH cégtől szerezhető be Expand (az Expand egy védjegy) nagy pontosságú PCR-rendszer (Sexpand high fidelity PCR system) néven. Ennek a rendszernek az alkalmazásával megnövekedett érzékenységet kaptunk, mégpedig olyan érzékenységet, amely tízszer nagyobb, mint ami egy hagyományos PCR-eljárással - egyedül Taq polimerázt használva - érhető el.
Amennyiben a pol-gén-szakasz felöleli mind az RT-, mind a proteázgént, előnyös az a HIV-DNS-szerkezet, amelyből az RT- és a proteázgént töröltük, és ez a pGENT3-APRT plazmid, amelyet 1996. november 8-án helyeztünk letétbe a Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMBP Collection - intézményben LMBP3590 szám alatt.
Mindazonáltal számos megoldás alkalmazható egy olyan HIV-1 provírust tartalmazó plazmid előállítására, amelyben mind a proteáz-, mind az RT-gén deletált. Az egyik lehetőség, hogy a kívánt deléciót oligonukleotidközvetített mutagenezissel vezetjük be. Az alábbi 2. példában követett eljárás azonban a kívánt szerkezetet specifikus restrikciós enzimek és szubklónozási eljárások használatával hozza létre, mint a későbbiekben leírjuk. Bár a végső eredmények a rendelkezésre álló restrikciós helyektől függnek, az eljárás nagy előnye az, hogy ezzel gyorsan megbízható eredményeket kaphatunk.
Annak érdekében, hogy biztosítsuk a transzfekció leghatékonyabb végeredményét, a transzfektált PCRterméket tisztítanunk kell, ideálisan anioncserélő centrifugálható oszlopokon, ismert módon. Megfelelő kit erre a célra a Qiagen csoport által forgalmazott QIAquick (védjegy) PCR Purification Kit.
A transzfekciót végrehajthatjuk elektroporációval vagy más módon, lipidek, főként kationos lipidek, DEAE dextrán, kalcium-hidrogén-foszfát stb. használatával.
Lipides transzfekció esetében használhatjuk a PERFECT (a PERFECT egy védjegy) transzfekciós kitet, amelyet az Invitrogen BV cég (Leek, Hollandia) forgalmaz.
Tehát a HIV-DNS-szerkezetet, amelyből töröltük a kiválasztott, pol-gén-eredetű gént vagy géneket, a felsokszorozás után kapott termékekkel együtt használjuk a transzfekcióhoz.
Ha csak az RT-gén deletált, a szerkezet a pH IVART-plazmid (kapható a Medical Research Council - (MRC) -tói) lehet. Ha mind az RT-, mind a proteázgén deletált, akkor a megfelelő szerkezet az itt leírt
HU 226 203 Β1 pGEMTS-ÁPRT plazmid, amely egy magas másolatszámú vektor. Az ilyen plazmidokat transzfekció előtt ismert eljárásokkal linearizáljuk.
Különösen előnyös egy olyan szerkezet használata, amely egynél több pol-gén-enzimet kódol, például a ÁPRT-szerkezet, mivel az a szerkezet többet tartalmaz az eredeti beteg anyagából, mintha egyetlen gént használnánk, így a sokszorozott anyag nagyobb mértékben tükrözi a vizsgálat alatt álló konkrét betegben a virális genetikai különbségeket.
Megítélhető annak előnye, hogy a „fészkes” PCRhez választott specifikus primerek a sokszorozandó és vizsgálandó célenzimek szekvenciáinak főrészén kívül helyezkednek el. Úgy ítéljük meg továbbá, hogy az RT és a proteáz kombinációja valószínűleg jobb eredményeket ad az RT vizsgálatához, mint egyedül az RT; mivel a csak RT használatával kialakult helyzethez képest így negyvennél több aminosav származik a betegből. A proteáz vizsgálatánál tudni kell, hogy a proteáz első kilenc aminosava még a szerkezet (pGEMT3ÁPRT) vad típusú gerincéből származik.
Amennyiben a sejtek transzfekcióját elektroporációval végezzük, a választott paramétereket úgy optimalizáljuk, hogy jó sejtnövekedést és vírustermelést érjünk el. Az elektroporáció megfelelően kivitelezhető 250 pF és 300 V mellett. Előnyös, ha az elektroporációt körülbelül 10 pg linearizált plazmid például pHIVÁRTBstEII - és körülbelül 5 pg sokszorozott PCR-termék - például RT-PCR-termék - jelenlétében végezzük. Eredményes intracelluláris homológ rekombináció esetén 5-10 napon belül új kiméra-HIV képződik. Ismert technikák esetén a tenyésztési idő általában 12-14 nap, mielőtt kiméra-HIV képződik. A tenyészet-felülúszók részleteit -70 °C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten tároljuk.
Könnyen belátható, hogy a fenti eljárások felhasználhatók más HIV-gének - például az integrázgén vagy egynél több HIV-gén - például RT- és integrázgén - izolálására és sokszorozására és egy CD4+ T-sejtnek az illető integráz- vagy RT/integráz PCR-termékekkel és egy megfelelő linearizált HIV-DNS-szerkezettel - amelyből a szóban forgó gént (vagy géneket) töröltük együtt való transzfektálására.
Az újonnan képződött kiméravírusokat megtitráljuk, majd a különböző pol-gén-enziminhibitorokkal szembeni fenotipusos érzékenységüket (azaz fogékonyságukat), előnyösen egy automatizált, sejtre alapozott assay-ben analizáljuk.
A kiméravírusok és a vad HIV-törzs - amely alkalmasan egy rekombináns vad HIV-törzs - egy vagy több RT-, proteáz- vagy integrázinhibitorral szemben megnyilvánuló gyógyszerérzékenységét előnyösen gátlókoncentrációban (IC=inhibitory concentration) fejezzük ki.
A kiméravírusok és a vad típusú HIV-törzs egy vagy több RT-inhibitorral és/vagy egy vagy több proteázinhibitorral és/vagy egy vagy több integrázinhibitorral szembeni érzékenysége például 50%-os vagy 90%-os gátlókoncentrációként (IC50 vagy IC90 értékek) fejezhető ki.
Előnyös, ha az RT-inhibitorokat az AZT, ddl [didanosine/Videx (a Videx egy védjegy)], ddC (zalcitabine), 3TC (lamivudine), d4T (stavudine) nukleozid RT-inhibitorok közül, és a delavirdene [U 9051125 (BMAP)/Rescriptor (a Rescriptor egy védjegy)], loviride (alfa-APA), nevirapine [B1-RG-587/Viramune (a Viramune egy védjegy)] és tivirapine [8-CI-TIBO(R86183)j nemnukleozid RT-inhibitorok közül választjuk ki, a proteázinhibitorok közül a saquinavirt, indinavirt és ritonavirt és az integrázinhibitorok közül a koffeinsav-fenil-etil-észtert (CAPE) választjuk.
A következő alkalmas RT- és/vagy proteázinhibitorok és/vagy integrázinhibitorok közül választunk: nukleozid RT-inhibitor az AZT, ddl, ddC, 3TC, d4T, 1592V89 és hasonlók, nemnukleozid RT-inhibitor a loviride, nevirapine, delaviridine, ateviridine és tivirapine (8-CI TIBO) és hasonlók, proteázinhibitor a saquinavir, indinavir és ritonavir, és integrázinhibitor a koffeinsavfenil-etil-észter (CAPE) és a WO 95/0 8540 számú nemzetközi szabadalmi leírásban és a GB 2,271,566 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetett típusú HIV-integráz-inhibitorok.
A találmány szerinti eljárás tartalmazhat olyan lépést, amelyben összehasonlítjuk a betegek HlV-törzseinek a fenotipusos gyógyszerérzékenységét a vad típusú HIV-törzs egy vagy több RT-inhibitorral és/vagy egy vagy több proteázinhibitorral és/vagy egy vagy több integrázinhibitorral szembeni fenotipusos érzékenységével. A vizsgált különböző gyógyszervegyületekkel (vagy kombinációkkal) szembeni érzékenységben történő relatív változások könnyen érthető ábrázolása végett egy Antivirogram diagramot szerkesztünk.
A diagramot a következőképpen kell értelmezni: az excentrikus adatpontok az antivirogramban olyan kemoterápiás protokollokra utalnak, amelyek valószínűleg többé már nem használnak a HIV-fertőzött betegnek, míg azok az adatpontok, amelyek a referenciasokszögön belül vagy rajta vannak, vagy csak kevéssé lépik túl a sokszöget, olyan kemoterápiás protokollokra utalnak, amelyek valószínűleg jótékonyan hatnak a HIV-fertőzött betegre.
Az anti-HIV-gyógyszerek pontos alkalmazásával kombinálva a találmány szerinti eljárásokat, ezek végül jobb kezelést, javított életminőséget és a HIV-fertőzött betegeknek kedvezőbb túlélést kell eredményezzenek; azaz a hatástalan kezelés (rezisztens HIV-törzsek jelenléte vagy felbukkanása következtében) megelőzhető vagy abbahagyható, és a hatásos kemoterápia időben megindítható.
Az ábrák rövid ismertetése
1. ábra: a pGEMT3-ÁPRT plazmid szerkesztésének vázlatos bemutatása;
2. ábra: a pGEMT3-ÁPRT plazmid szerkesztésének további és kiegészítő vázlatos bemutatása;
3. ábra: a HIV-HXB2D szekvencia proteáz- és
RT-gént tartalmazó részének vázlatos bemutatása;
HU 226 203 Β1
4A-H. ábrák: a HIV-HXB2D szekvencia proteázés RT-gént tartalmazó részének teljes szekvenciája;
5. ábra: 3TC-rezisztens HIV-törzseket tartalmazó beteg Antivirogramja (védjegy), az
5. példában leírtak szerint;
6. ábra: vadtípus-szerű HIV-törzseket tartalmazó nem gyógyszereit beteg Antivirogramja (védjegy), a 6. példában leírtak szerint;
7A. ábra: a 7. példában említett beteg gyógyszerérzékenységében bekövetkező relatív változást bemutató oszlopos diagram;
7B. ábra: a 7. példában említett beteg Antivirogramja (védjegy);
8A. ábra: a 8. példában említett beteg gyógyszerérzékenységének relatív változását bemutató oszlopos diagram;
8B. ábra: a 8. példában említett beteg Antivirogramja (védjegy);
9A. ábra: a 9. példában említett beteg gyógyszerérzékenységének relatív változását bemutató oszlopos diagram;
9B. ábra: a 9. példában említett beteg Antivirogramja (védjegy);
IOA. ábra: a 10. példában említett beteg gyógyszerérzékenységének relatív változását bemutató oszlopos diagram;
IOB. ábra: a 10. példában említett beteg Antivirogramja (védjegy);
IIA. ábra: a 11. példában említett beteg gyógyszerérzékenységének relatív változását bemutató oszlopos diagram;
IIB. ábra: a 11. példában említett beteg Antivirogramja (védjegy);
12A. ábra: a 12. példában említett beteg gyógyszerérzékenységének relatív változását bemutató oszlopos diagram;
12B. ábra: a 12. példában említett beteg Antivirogramja (védjegy).
A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük, azonban ezekkel a példákkal nem óhajtjuk korlátozni a találmány oltalmi körét.
1. példa
Protokoll
1. A vírus-RNS izolálása és sokszorozása
Az RNS-t 100 pl plazmából izoláltuk Boom és munkatársai [R. Boom et al., J. Clin. Microbiol., 28, 495-503 (1990)] eljárása szerint, majd reverz transzkripcióval írtuk át GeneAmp (védjegy) reverztranszkriptáz-kit (Perkin-Elmer) használatával - az előállító cég előírása szerint - és egy HIV-1-specifikus 3’ primer (OUT3: 5-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATC-3’; 1. számú szekvencia) használatával. A reverz átírt RNS PCR-sokszorozását belső és külső primerekkel végeztük Kellam és Larder [P. Keltám, B. A. Larder, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38, 23-30 (1994)] leírása szerint. Kloroformos extrahálás és Centricon 100 oszlopokon való centrifugálás vagy anioncseréiő centrifugaoszlopokon (Qiagen) való centrifugálás után az izolált PCR-termék kész a transzfekciós reakciókban való felhasználásra.
2. A plazmid termelése és izolálása
A pHIVART- (MCR) plazmid termelését E. coliban végeztük. A plazmid DNS-t egyéjszakás tenyészetekből izoláltuk Qiagen oszlopokat használva, ahogyan a gyártó leírta. Az izolált plazmid kitermelését spektrofotometriásán határoztuk meg A260/280 mérésével (optikai sűrűségmérés λ=260 és 280 nm-en). Körülbelül 250 pg ultratiszta plazmid DNS-t kaptunk 500 ml baktériumtenyészetből. Az izolált plazmid azonosságát restrikciós analízissel igazoltuk. Ezután az izolált DNS-t BstEII-vel linearizáltuk, majd egy klasszikus fenol/kloroform extrahálással újból tisztítottuk.
3. A sejtek transzfekciója
MT4 sejteket tenyésztettünk szubkultúrában 250 000 sejt/ml sűrűségig a transzfekció előtt (exponenciális növekedési fázis). A sejteket lecentrifugáltuk és foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban (PBS) reszuszpendáltuk úgy, hogy a szuszpenzió koncentrációja 3,1 *106 sejt/ml legyen. Minden egyes transzfekcióhoz 0,8 ml-t (2,5*106 sejt/ml) használtunk. A transzfekciót Bio-Rad Gene pulserkészülékkel, 0,4 cm-es elektródküvetták használatával végeztük. A sejtek elektroporációját 10 pg linearizált pHIVÁRT-plazmid és körülbelül 5 pg RT-PCR-termék jelenlétében, 250 pF és 300 V mellett végeztük. Ezután 30 perces szobahőmérsékleten való inkubálás következett. A sejtszuszpenzióhoz ezután 10 ml friss táptalajt adtunk, és az inkubálást 37 °C-on, 5% szén-dioxid-tartalmú nedves atmoszférában végeztük.
4. A transzfektált sejtek tenyésztése és ellenőrzése
Transzfekció után a sejteket 7-10 napon át monitoroztuk citopatogén hatás (CPE=cytopathogenic effect) megjelenése szempontjából. Amennyiben ilyen hatást nem észleltünk, a sejteket különböző palackokban tenyésztettük. Ezután a transzfektált sejtek tenyészetének felülúszóit használtuk fel egy rekombináns vírusállomány létrehozásához, amelyet 1,5 ml-es részletenként 70 °C-on tároltunk.
5. Betegeredetű virális RNS-ből származó rekombináns vírus analízise
Az új vírusok titrálása után az állományokat használtuk antivirális kísérletekhez, a különböző HlV-inhibitorok sorozathígításai jelenlétében. A learatott felülúszók titerét MT4 sejteken határhígításos (véghígításos) titrálással határoztuk meg.
A használható titerű vírusokat használtuk az antivirális kísérletekben. Erre a célra 96 tartályos mikrotitrálólemezek tartályaiba 100 pl teljes táptalajt töltöttünk. Ezután a vegyületek törzsoldataiból 25 μΙ-eket mértünk be a tartályok párhuzamos soraiba. Mindegyik gyógyszernél (vagy gyógyszer-kombinációnál) HIV-vel és vakkal fertőzött sejtmintákat alkalmaztunk. Ekkor exponenciális növekedésben lévő MT4 sejteket vittünk a mikrotitrálólemezekre 150 000 sejt/ml sűrűségben. A sejttenyészeteket ezután 37 °C-on, 5% szén-dioxidtartalmú, párásított atmoszférában inkubáltuk. A befertőzés után 5 nappal MTT-eljárással [R. Pauwels et al.,
HU 226 203 Β1
J. Virol. Meth., 20, 309-321 (1988)] spektrofotometriásán vizsgáltuk - az alábbi 6. pontban leírtak szerint - a vak- és HIV-fertőzött sejtek életképességét.
6. MTT-assay
A mikrotitrálólemezek tartályaiba 20 μΙ MTT (tiazolilkék) oldatot (7,5 mg MTT/ml PBS) mértünk. A lemezeket ezután 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Ezután a tartályokból kiveszünk 150 μΙ táptalajt anélkül, hogy a formazánkristályokat tartalmazó MT4 sejtcsomót felzavarnánk. A formazánkristályok feloldása végett 100 μΙ 5%-os Triton Χ-100-at - savanyított izopropanolban (5 ml koncentrált sósav per 1 liter oldószer) - mérünk be. A formazánkristályok teljes oldódását úgy érjük el, hogy a lemezeket 10 percre lemezrázó gépre helyezzük. Végül két hullámhosszúság (540 és 690 nm) mellett olvassuk le az abszorpciót. Az optikai sűrűségre (OD) vonatkozó adatokból vezetjük le az 50%-os gátló- (IC50) és az 50%-os citotoxikus (CC50) koncentrációkat.
2. példa
HÍV—1 -proteáz és reverz transzkriptáz-géndeléciót tartalmazó pHIVARTBstEII-variáns szerkesztése
Az 1. példában tesírt protokoll szerint jártunk el, kivéve, hogy a szóban forgó HIV-pol-génszekvencia az RT- és proteázkódoló szekvencia volt, és az előállított szerkezet az alább leírt pGEMT3-APRT plazmidnak felelt meg. Amennyiben más módosításokra került sor az 1. példában előadott eljáráshoz képest, azokat az alábbiakban ismertetjük.
A virális RNS sokszorozása céljából az RNS reverz transzkripcióját DNS-sé ugyancsak az OUT3 primerrel végeztük. Azonban a „fészkes PCR- (nested PCR) eljáráshoz a 3. ábrán bemutatott primereket használtuk. Tehát megjegyezzük, hogy a „fészkes” PCR- (nested PCR) eljárás külső primerek gyanánt az RVP5-öt és OUT3-at és belső primerek gyanánt az RVP5-öt és IN3-at használja. Ennélfogva ez a „fészkes” eljárás (nested procedure) valójában egy „félfészkes” PCR(hemi-nested PCR) eljárás.
A pGEMT3-APRT termelése és izolálása
A végső pGEMT3-APRT szerkezet a pGEM9-Zf(-) (Promega) származéka.
Röviden kifejtve, a pGEMT3-APRT szerkezetet úgy építettük fel, hogy a kívánt HIV-HXB2 inszertumot (egy proteáz és reverz transzkriptáz deletált provirális HÍV—1-klón, amelyet humán szekvenciák szegélyeznek) a pGEM9-Zf(-) vektor Xbal restrikciós helyére építettük be. A provirális genomot a proteázgénen belüli Ahdl helytől (körülveszi a 9-es aminosavat) a pHIVARTBstEII szerkezet (MRC-letét hivatkozási száma: ADB231) BstEII helyéig töröltük. A AProRT-deléció csatlakozásánál a Smal és BstEII hely helyezkedik el, amelyeket fel lehet használni a provirális szerkezet linearizálására a transzfekció előtt. A pGEMT3-APRT szerkesztését az 1. és 2. ábrán mutatjuk be vázlatosan. A pGEMT3-APRT kihozatala körülbelül 1 mg volt 500 ml baktériumtenyészetből.
Mint fent említettük, a pGMT3-APRT plazmidot 1996. november 8-án helyeztük letétbe a Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMBP Collection intézményben LMBP3590 számon.
Nem tartottuk valószínűnek, hogy a provirális genom bevezetése más vektorba [plB120 helyett pGEM9-Zf(-)] nagyobb problémát okozna. A plB120, amely a pEMBL8(-) (a Kodak Scientific Imaging Systems-től kapott információ szerint) egy származéka és a pGEM9-Zf(-) hasonló vektorok. Mindazonáltal a plB120HIV provirális vektor recA+ E. coli-gazdasejtekben instabil lehet [B. Maschera, et al., J. Virol., 69, 5431-5436 (1995)]. Ezért a pGEMT3-APRT szerkezet stabilitásáról meg kell győződni minden új plazmid előállítása után.
HIV-HXB2 szekvencia
A HIV-HXB2D szekvencián (1800-tól 4400-ig terjedő nukleotidok) belüli lényeges szakaszt a 3. ábrán (vázlatosan) és a 4. ábrán (teljes szekvencia) mutatjuk be. Számos gén, restrikciós hely, primer és deléció (APro, ART, AProRT) helyzetét is jelöljük.
A HIV-1-szekvenciát (HXB2-izolálás, referenciagenom, 9718 bp) a National Center fór Biotechnology Information (CNCBI), National Library of Medicine, National Institutes of Health intézménytől szereztük be, az ENTREZ Document Retrieval System útján.
Génbank név: HIVHXB2CG
Génbank lajstromszám: 03455
NCBI szekvenciaszám: 327742
Rekombinációs szakaszok
A pGEMT3-APRT vektort, az RVP5 és OUT3/IN3 primerek segítségével előállított RT-PCR-fragmentumokkal kombinálva használhatjuk az MT4 sejtek transzfektálására az 1. példa 3. pontjában leírtak szerint. A APRT 5’ végén lévő rekombinációs szakasz 188 nukleotidot tartalmaz. A AProRT 3’ végén lévő, rekombinációhoz szolgáló szakasz hasonló a korábban leírt [P. Kellam, B. A. Larder, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38, 23-30 (1994)] szakaszhoz, és 130 nukleotidot tartalmaz.
A rekombinációhoz szolgáló ezen szakaszok hossza fontos. Előzőleg kapott adatok [P. K. Bandiopadhyay, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 81, 3476-3480 (1984) J. Rubnitz, S. Subramani, Molecular and Cellular Biology, 4, 2253-2258 (1984)] mutatják, hogy a rekombináció gyakoriságában tízszeres csökkenés következhet be, ha a szekvenciahomológia 214 bázispártól 163 bázispárra csökken. Ezenkívül elegendő rekombinációs eseménynek kell történnie az elektroporációval kezelt sejtben annak biztosítására, hogy a képződött virális fenotípus a kezelt HIV-pozitív betegben jelen lévő kvázispecies-t megbízhatóan tükrözze vissza. A rekombinációs események optimalizálását egyrészt úgy érhetjük el, hogy beállítjuk a linearizált provirális vektor arányát a célsejtek elektroporációjához használt RT-PCR-fragmentumhoz. Az ehhez szükséges standardeljárást - a jellemző végeredményekkel - előzőleg Kellam és Larder [P. Kellam, B. A. Larder, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38, 23-30 (1994)] írták le. Végeredményben elhatározás született, hogy a PCR-termékből a körülbelül 2 pg (10 pg
HU 226 203 Β1 vektorral) kezdeti bevitel körülbelül 5 pg-ra vagy többre emelendő. Ennek az eredménye a transzfektált sejtek tenyészetében a látható vírusnövekedés (citopatogén hatás) gyorsabb megjelenésében nyilvánult meg.
A rekombinációs események optimalizálását szolgáló másik választás lenne olyan primerek tervezése, amelyek hosszabb rekombinációs szekvenciákat eredményeznek.
Ámbár a transzfekciós reakcióba való bevitel mindig a PCR után kapott kihozataltól függ. Bizonyos mintáknak magas a kihozatala, és ennek eredményeként több sokszorozott anyag vihető be a transzfekciós reakcióba (a rekombináció hatékonyságára jobb eredményeket kapunk). Azonban az alacsonyabb rekombinációs hatékonyság ellenére, az alacsonyabb kihozatalt adó mintákat is transzferálhatjuk, és ez a víruspopuláció megbízható visszatükröződését eredményezi az élő vírusban.
3. példa
A ProRT-szekvencia alternatív RT-PCR-primerei
Olyan új primereket (A-D) terveztünk a 2. példában használt primerekhez képest, amelyeknek hosszabb rekombinációs szekvenciákat kell eredményezniük a ProRT-szakasznak mind az 5’, mind a 3’ végén. Kétkét prímért terveztünk az illető szakasz 5’ és 3’ végére, a „fészkes” PCR (nested PCR) kivitelezéséhez. Mint a 3. és a 4. ábrában jelezzük, az illető primerek tervezésénél figyelembe vettük a ProRT-szakasz 5' végén lévő direkt ismétlődést. Az új primerek a következők:
A PRTO-5: 5’-GCCCCTAGGA-AAAAGGGCTG-TTGG (3. sz. szekvencia),
B PRTI-5: 5'-TGAAAGATTG-TACTGAGAGA-CAGG (4. sz. szekvencia),
C PRTI-3: 5’-GATATTTCTC-ATGTTCATACT-TGGG (5. sz. szekvencia),
D PRTO-3: 5'-AGGTGGCAGG-TTAAAATCAC-TAGC (6. sz. szekvencia).
4. példa
Alternatív AProRT-vektor szerkesztése
Mint fent említettük, egy alternatív ProRT deletált vektor szerkesztése oligonukleotidközvetített mutagenezissel valósítható meg. Az is lehetséges azonban, hogy kiszélesítjük a ProRT-deléciót a meglévő 3’-végtől az RT-génben lévő legközelebbi Kpul helyig (40 bázis15 pár tovább 3’ felé). Egy Klenow-kezelt Kpul hely ligálása egy Klenow-kezelt BstEII helyhez, helyreállítja az eredeti BstLII felismerőszekvenciát. Ez az alternatív vektor a 2. példában leírt pGMT3-APRT vektorhoz hasonlóan viselkedik, de kissé nagyobb RT-deléciót tartalmaz.
5. példa
Egy HIV-fertőzött beteg - aki 1989. decemberétől egy nem dokumentált későbbi időpontig AZT-t kapott, és akit 1994 februártól 1995. októberig AZT+3TC (1:1) 25 kombinált terápiára fogtak - leadott plazmájának egy sor RT-inhibitorral szembeni érzékenységét az 1. példában leírt technológia szerint határoztuk meg. Rekombináns vad típusú HIV-reclllB törzset használtunk az említett technológiában referencia-HIV-vírus gya30 nánt. Az 1. táblázat a mért IC50-értékeket (μΜ) és az említett értékek hányadosát mutatja. Az Antivirogramot (védjegy) az 5. ábra mutatja.
1. táblázat
| Gyógyszer | Anti-HIV-1 -aktivitás ICjoígM) | ||||
| Vizsg. 1. | Vizsg. 2. | Középérték (1) | reclllB ref (2) | (1)/(2) hányados | |
| Loviride | 0,1 | 0,12 | 0,11 | 0,05 | 2 |
| Tivirapine | 0,019 | 0,018 | 0,019 | 0,01 | 1,5 |
| AZT | 0,001 | 0,002 | 0,002 | 0,004 | 0,4 |
| 3TC | 31,6 | 100 | 65,8 | 0,56 | 118 |
| d4T | 0,07 | 0,49 | 0,06 | 0,12 | 0,5 |
| ddl | 2,0 | 0,8 | 1,4 | 2,83 | 0,5 |
| ddC | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,38 | 0,5 |
| AZT+3TC(1:1) | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,5 |
Ezekből az adatokból megállapítható, hogy a 3TCvel való monoterápia valószínűleg nem használ az adott betegnek. Az AZT+3TC-vel végzett kombinált terápiának (a folyó terápia) valószínűleg még pozitív hatása van.
6. példa
Egy nem gyógyszereit betegtől levett plazmának számos RT-inhibitorral szembeni érzékenységét az 1.
példában fent leírt technológia szerint határoztuk meg. Referencia-HIV-vírusként a rekombináns vad típusú HIV-reclllB törzset használtuk az említett technológiákban. A 2. táblázat a mért IC50-értékeket (μΜ) és az említett értékek hányadosát mutatja. Antivirogramot (védjegy) készítettünk, amelyet a 6. ábra mutat.
HU 226 203 Β1
2. táblázat
| Gyógyszer | Anti-HIV-1 -aktivitás ICgoíüM) | ||||
| Vizsg. 1. | Vizsg. 2. | Középérték (1) | reclllB ref (2) | (1)/(2) hányados | |
| 3TC | 1,81 | 2,02 | 1,91 | 3,08 | 1 |
| ddl | 3,07 | 4,47 | 3,77 | 8,58 | 0,4 |
| ddC | 1,45 | 1,47 | 1,46 | 2,21 | 1 |
| AZT | 0,04 | 0,05 | 0,05 | 0,06 | 1 |
| d4T | 1,31 | 0,97 | 1,14 | 1,74 | 1 |
| AZT+3TC(1:1) | 0,05 | 0,04 | 0,05 | 0,02 | 3 |
| ddC+d4T (1:1) | 0,62 | 0,44 | 0,53 | 0,77 | 1 |
| 3TC+d4T (1:1) | 0,42 | 0,44 | 0,43 | 1,11 | 0,4 |
Az adatokból megállapítható, hogy a beteg olyan HIV-törzsekkel fertőződött, amelyek nagyon hasonlóak a vad típusú HIV-hez. Egyetlen gyógyszer-adagolási séma sem kizárt, tehát a kemoterápia elkezdhető egy olyan gyógyszerrel, mint az AZT, amely pozitív előzménnyel (track record) rendelkezik.
7. példa
Egy nem gyógyszereit betegtől levett plazma több
RT-inhibitorral szembeni érzékenységét az 1. példában 30 ismertetett technológia szerint határoztuk meg. Referencia-HIV-vírusként a rekombináns vad típusú HlV-reclIIB törzset használtuk. A 3. táblázat a mért IC50-értékeket (μΜ) és az említett értékek hányadosát mutatja. 25 A 7A. ábrán látható oszlopos diagram a gyógyszerérzékenységben bekövetkező relatív változást mutatja. Antivirogramot (védjegy) is készítettünk, amelyet a 7B. ábra mutat be.
3. táblázat
| Gyógyszer | Anti-HIV-1 -aktivitás ICgo (μΜ) | ||||
| Vizsg. 1. | Vizsg. 2. | Középérték (1) | reclllB ref. (2) | (1)/(2) hányados | |
| AZT | 0,052 | 0,050 | 0,051 | 0,023 | 2 |
| 3TC | 2,173 | ND | 2,173 | 1,381 | 2 |
| ddl | 0,475 | 0,429 | 0,452 | 0,648 | 0,7 |
| ddC | 1,042 | 1,389 | 1,216 | 1,616 | 0,8 |
| d4T | 1,142 | 1,657 | 1,399 | 1,368 | 1 |
| Loviride | 0,035 | 0,025 | 0,030 | 0,024 | 1 |
| Tivirapine | 0,042 | 0,049 | 0,046 | 0,021 | 2 |
Az adatokból megállapítható, hogy a beteg olyan HIV-törzzsel fertőződött, amely nagyon hasonló a vad típusú HIV-hez. Egyetlen gyógyszer-adagolási séma sem kizárt, tehát a kemoterápia elkezdhető egy olyan gyógyszerrel, mint az AZT, 3TC vagy mások, amelyek 55 pozitív előzménnyel (track record) rendelkeznek.
8. példa
Egy HIV-fertőzött betegtől - olyan terápiás előzménnyel, amely AZT-t, 3TC-t és loviride-et tartalmazott
- levett plazma több RT-inhibitorral szembeni érzékenységét az 1. példában ismertetett technológia szerint határoztuk meg. Referencia-HIV-vírusként a rekombináns vad típusú HIV-reclllB törzset használtuk. A 4. táblázat a mért IC50-értékeket (μΜ) és az említett értékek hányadosát mutatja. A 8A. ábrán látható oszlopos diagram a gyógyszerérzékenység relatív változását ábrázolja. Antivirogramot (védjegy) is készítettünk, amelyet a 8B. ábra mutat be.
HU 226 203 Β1
4. táblázat
| Gyógyszer | Anti-H IV—1 -aktivitás IC50 (μΜ) | ||||
| Vizsg. 1. | Vizsg. 2. | Középérték (1) | reclllB ref. (2) | (1)/(2)hányados | |
| AZT | 18,264 | 22,251 | 20,257 | 0,084 | 241 |
| 3TC | >100,000 | >100,000 | >100,000 | 6,304 | >16 |
| ddl | 26,861 | 15,435 | 21,148 | 1,586 | 13 |
| ddC | 9,290 | 8,506 | 8,898 | 1,931 | 5 |
| d4T | 7,500 | 7,097 | 7,298 | 5,465 | 1 |
| Loviride | >100,000 | >100,000 | >100,000 | 0,037 | >2717 |
| Tivirapine | 1,626 | 1,604 | 1,615 | 0,021 | 78 |
Ezekből az adatokból megállapítható, hogy a beteg olyan HIV-törzzsel fertőződött, amely a legtöbb vizsgált 20 nukleozid és nemnukleozid antiretrovirális gyógyszerrel szemben csökkent érzékenységet mutat. A terápia még megkezdhető d4T-vel vagy ddC-vel. Megfontolandó proteázinhibitoroknak a terápiába való bevonásának a lehetősége.
9. példa
Egy HIV-fertőzött betegtől - akinél a terápiás előzményben számos nukleozidanalóg RT-inhibitor szere25 pelt- levett plazma több RT-inhibitorral szembeni érzékenységét az 1. példában ismertetett technológia szerint határoztuk meg. Referencia-HIV-vírusként a rekombináns vad típusú HIV-reclllB törzset használtuk. Az 5. táblázat a mért IC50 (μΜ) értékeket és az említett értékek hányadosát tartalmazza. A 9A. ábrán látható oszlopos diagram a gyógyszerérzékenység relatív változását mutatja. A 9B. ábrán bemutatjuk az elkészített Antivirogramot (védjegy) is.
5. táblázat
| Gyógyszer | Anti-HIV—1 -aktivitás 1¾ (μΜ) | ||||
| Vizsg. 1. | Vizsg. 2. | Középérték (1) | reclllB ref. (2) | (1)/(2) hányados | |
| AZT | >100,000 | ND | >100,000 | 0,291 | >344 |
| 3TC | >100,000 | >100,000 | >100,000 | 16,670 | >6 |
| ddl | >100,000 | >100,000 | >100,000 | 4,757 | >21 |
| ddC | 60,079 | 73,049 | 66,564 | 3,444 | 19 |
| d4T | >100,000 | >100,000 | >100,000 | 12,030 | >8 |
| Loviride | 0,064 | 0,058 | 0,061 | 0,065 | 0,9 |
| Tivirapine | 0,052 | 0,043 | 0,048 | 0,042 | 1 |
Ezekből az adatokból megállapítható, hogy a beteget egy olyan HIV-törzs fertőzte meg, amely minden nukleozidanalóg antiretrovirális gyógyszerrel szemben csökkent érzékenységet mutat. A nemnukleozid antiretrovirális gyógyszereket nem kellene kizárni a terá- 55 piából. Megfontolandó proteázinhibitorok bevonulásának lehetősége a terápiába.
10. példa
Az 1. példában ismertetett technológia szerint meghatároztuk egy nemgyógyszereit betegtől levett plazma érzékenységét számos RT-inhibitorral szemben. Referencia-H IV-vírusként a rekombináns vad típusú HlV-reclllB törzset használtuk. A 6. táblázat a mért IC50-értékeket (μΜ) és az említett értékek hányadosát mutatja. A 10A. ábrán látható oszlopos diagram a gyógyszerérzékenység relatív változását ábrázolja. A 10B. ábrán bemutatjuk az elkészített Antivirogramot (védjegy) is.
HU 226 203 Β1
6. táblázat
| Gyógyszer | Anti-HI V-1-aktivitás IC50 (μΜ) | ||||
| Vizsg. 1. | Vizsg. 2. | Középérték (1) | reclllB ref. (2) | (1)/(2) hányados | |
| AZT | 0,019 | 0,019 | 0,019 | 0,041 | 0,5 |
| 3TC | 1,525 | 1,718 | 1,622 | 4,608 | 0,4 |
| Saquinavir | 0,003 | 0,003 | 0,003 | 0,006 | 0,4 |
| Ritonavir | 0,022 | 0,017 | 0,019 | 0,033 | 0,6 |
| Indinavir | 0,013 | 0,013 | 0,013 | 0,016 | 0,8 |
Ezekből az adatokból megállapítható, hogy a beteg 15 olyan HIV-törzsekkel fertőződött, amelyek nagymértékben hasonlóak a vad típusú HIV-hez. Nem zárandó ki egyetlen gyógyszertípus sem, tehát a kemoterápia megkezdhető egy olyan gyógyszerrel, mint az AZT,
3TC vagy mások, amelyek pozitív előzménnyel (track 20 record) rendelkeznek.
11. példa
Egy HIV-fertőzött betegtől - akinél a terápiás előzményben RT- és proteázinhibitorok szerepeltek - levett 25 plazma érzékenységét számos RT-inhibitorral szemben, az 1. példában ismertetett technológia szerint határoztuk meg. Referencia-HIV-vírusként a rekombináns vad típusú HIV-reclllB törzset használtuk. A 7. táblázat a mért IC50-értékeket (μΜ) és az említett értékek hányadosát tartalmazza. A 11 A. ábrán látható oszlopos diagram a gyógyszerérzékenység relatív változását mutatja. A 11B. ábrán bemutatjuk az elkészített Antivirogramot (védjegy) is.
7. táblázat
| Gyógyszer | Anti-HIV-1 -aktivitás IC» (μΜ) | ||||
| Vizsg. 1. | Vizsg. 2. | Középérték (1) | reclllB ref. (2) | (1)/(2) hányados | |
| AZT | ND | 0,015 | 0,015 | 0,047 | 0,3 |
| 3TC | >100,000 | 93,962 | 96,981 | 5,178 | 19 |
| Saquinavir | 0,014 | 0,015 | 0,014 | 0,012 | 1 |
| Ritonavir | 1,198 | 1,739 | 1,468 | 0,062 | 24 |
| Indinavir | 0,229 | 0,416 | 0,323 | 0,027 | 12 |
Ezekből az adatokból megállapítható, hogy a beteg egy olyan HIV-törzzsel fertőzött, amely a 3TC RT-inhibitorral és az indinavir és ritonavir proteázinhibitorral szemben csökkent érzékenységet mutat. Ennek megfelelően a kemoterápia olyan gyógyszerekkel végezhető, mint az AZT vagy saquinavir, amelyek pozitív előzménnyel rendelkeznek.
12. példa
Egy HIV-fertőzött betegtől - akinél a terápiás előzményben RT- és proteázinhibitorok szerepeltek - el40 vett plazma számos inhibitorral szembeni érzékenységét az 1. példában leírt technológia szerint határoztuk meg. A 8. táblázat a mért IC5o-értékeket (μΜ) és az említett értékek hányadosát tartalmazza. A 12A. ábrán látható oszlopos diagram relatív válto45 zást mutat a gyógyszerérzékenységben. A 12B. ábrán bemutatjuk az elkészített Antivirogramot (védjegy)·
8. táblázat
| Gyógyszer | Anti-HIV-1 -aktivitás ICso (μΜ) | ||||
| Vizsg. 1. | Vizsg. 2. | Középérték (1) | reclllB ref. (2) | (1)/(2) hányados | |
| AZT | 3,833 | 3,355 | 3,594 | 0,041 | 88 |
| 3TC | >100,000 | >100,000 | >100,000 | 4,608 | 22 |
HU 226 203 Β1
8. táblázat (folytatás)
| Gyógyszer | Anti-HIV-1 -aktivitás ICjo (μΜ) | ||||
| Vizsg. 1. | Vizsg. 2. | Közópérték (1) | reclllB ref. (2) | (1)/(2) hányados | |
| Saquinavir | 0,350 | 0,352 | 0,351 | 0,006 | 56 |
| Ritonavir | 1,610 | 1,530 | 1,570 | 0,033 | 47 |
| Indinavir | 0,124 | ND | 0,124 | 0,016 | 8 |
Ezekből az adatokból megállapítható, hogy a beteg egy olyan HIV-törzzsel fertőzött, amely a 3TC és AZT RT-inhibitorral és az indinavir, virotravir és saquinavir proteázinhibitorral szemben csökkent érzékenységet mutat.
13. példa
A fenotipizálás összevetése a genotipizálással
Plazmamintákat vettünk olyan HIV-fertőzött egyénektől, akik hosszan tartó nemnukleozid RT-inhibitor (NNRTI) monoterápiában részesültek. A HIV-RNS-t extraháltuk, reverz transzkripcióval átírtuk és felsokszoroztuk az 1. példában leírtak szerint. A pozitív minták külső anyagából kiindulva, az RT-gén első 785 nukleotidját felsokszoroztuk, és a továbbiakban ezt az anyagot használtuk genotipizáláshoz.
Röviden: a 785 nukleotidból álló fragmentumot ciklikus szekvenálási reakcióknak vettettük alá, a ThermoSequenase (a ThermoSquenase egy védjegy) fluorescent labelled primer cycle sequencing kit és 7-deazadGTP (amersham, kát. szám: RPN2438) használatá15 val. Négy szekvenálóprimert használtunk minden mintához, hogy mindkét irányban - az RT-gén 27. nukleonjától a 681. nukleotidig - lehetővé váljék a szekvenciameghatározás. A reakciókat egy ALF (az ALF egy védjegy) automata szekvenátorral (Pharmacia) anali20 záltuk. A képződött szekvenciákat egy Power Macintosh (védjegy) gépre vittük ki, és tovább analizáltuk a GeneWork (védjegy) 2.5 software (Oxford Molecular Group Inc.) segítségével. A kapott aminosavszekvenciákat a laboratóriumi HXB2D HIV-1-klón megfelelő szekvenciájával hasonlítottuk össze, és a betegmintákban azonosítottuk a rezisztenciával összefüggő mutációkat.
Az eredményeket a 9. táblázat tartalmazza, amelyben az egybetűs aminosavkódokat használtuk.
9. táblázat
| P | Rezisztenciához társult mutációk | Rezisztencia foka | |||||||||||||||
| M 41 | D 67 | K 70 | A 98 | K 101 | K 103 | V 108 | E 138 | Y 181 | M 184 | G 190 | T 215 | K 219 | AZT | 3TC | NNRTI 1 | NNRTI 2 | |
| 1 | N | 1 | 1 | 56 | 437 | ||||||||||||
| 2 | S | 1 | 0,4 | 102 | 53 | ||||||||||||
| 3 | N | 0,4 | 1 | 36 | 87 | ||||||||||||
| 4 | 0,3 | 0,1 | 1 | 0,4 | |||||||||||||
| 5 | 1 | 0,4 | 4 | 3 | |||||||||||||
| 6 | N | 1 | 0,3 | 103 | 245 | ||||||||||||
| 7 | S | 1 | 0,04 | 112 | 57 | ||||||||||||
| 8 | N | 1 | 1 | 30 | 81 | ||||||||||||
| 9 | C | 2 | 1 | >1432 | 12 | ||||||||||||
| 10 | N | 0,4 | 0,1 | 53 | 172 | ||||||||||||
| 11 | L | N | R | N | V | F | Q | 94 | >8 | 321 | 669 | ||||||
| 12 | L | Y | 28 | 2 | 1 | 3 | |||||||||||
| 13 | E | K/N | A | G/A | NK | 1 | 1 | >1466 | 455 | ||||||||
| 14 | N | 1 | 1 | 93 | 349 | ||||||||||||
| 15 | N | 2 | 1 | >2424 | 449 | ||||||||||||
| 16 | N | V | 1 | >8 | 21 | 115 | |||||||||||
| 17 | N | 1 | 1 | 29 | 102 | ||||||||||||
| 18 | S | 1 | 1 | 95 | 181 | ||||||||||||
| 19 | N | 1 | 1 | 78 | 260 |
HU 226 203 Β1
9. táblázat (folytatás)
| P | Rezisztenciához társult mutációk | Rezisztencia foka | |||||||||||||||
| M 41 | D 67 | K 70 | A 98 | K 101 | K 103 | V 108 | E 138 | Y 181 | M 184 | G 190 | T 215 | K 219 | AZT | 3TC | NNRTI 1 | NNRTI 2 | |
| 20 | G | 0,4 | 1 | 22 | 25 | ||||||||||||
| 21 | N | 1 | 0,4 | 47 | 68 | ||||||||||||
| 22 | I | 1 | 0,4 | 3 | 3 | ||||||||||||
| 23 | N | 0,2 | 0,2 | 9 | 9 | ||||||||||||
| 24 | Q | 1 | 1 | 7 | 59 |
B=beteg
NK=nem kimutatható
A 9. táblázat felső sora a vad típusú szekvenciában talált aminosavakat (AA) és pozíciójukat tartalmazza.
A következő sorokban az egyes betegeknél ezekben a 20 pozíciókban észlelt aminosawáltozások vannak feltüntetve. Csak azokat a pozíciókat mutatjuk, amelyeknél változást kaptunk a beteg anyagában. A 9. táblázat jobb oldali része a különböző RT-inhibitorokkal szembeni rezisztencia fokát tartalmazza, amelyet az egyes 25 betegek mintáira vonatkozóan a találmány szerinti eljárással határoztunk meg. Az NNRTI 1 a betegeknek adott nemnukleozid RT-inhibitort jelenti. Az NNRTI 2 egy másik nemnukleozid inhibitor, amelynél bizonyos mértékű keresztreakciót észleltünk az egyessel. 30
A genotipizálás eredménye a nukleozidanalóg RT-inhibitorok rezisztenciáját illetően a következő:
- M41L, D67N, K70R, T215F/Y és K2190Q/E AZTrezisztenciával társult mutációk [B. Larder, S. Kemp, Science, 246, 1155-1158 (1989); P. Kel- 35 lám et al., PNAS, 89, 1934-1938 (1992)]. Ezeknek a jelenléte - egyedül vagy különböző kombinációkban - a betegből izolált HÍV genomjában a megszerkesztett Antivirogram (védjegy) által meghatározott fenotípusos rezisztenciával mutat 40 összefüggést (11-es és 12-es beteg).
- Ugyanez vonatkozik a 3TC-vel szembeni rezisztenciára, amely az M184V mutációval van kapcsolatban [M. Tisdale, PNAS, 90, 5653-5656 (1993)], és ezt csak azokban a betegekben figyeltük meg, 45 akik a gyógyszerrel szemben fenotípusos rezisztenciát mutattak (11-es és 16-os beteg).
A genotipizálás az NNRTI-k rezisztenciáját illetően a következőket eredményezte:
- Három betegnél (3-as, 4-es és 12-es beteg) nem 50 volt NNRTI-rezisztenciához kapcsolódó mutáció, és a gyógyszerrel szemben fenotípusos érzékenységet mutattak.
- Azoknál a betegeknél, akik az NNRTI-kkel szemben rezisztenciát mutattak, a 103-as pozícióban (K103N/S) NNRTI-rezisztenciával társult mutációt mutattunk ki.
Egy beteg (9-es), akinél Y181C NNRTI-rezisztenciához társult mutációt mutattunk ki, jelentős fenotípusos rezisztenciát (>1432-szeres) mutatott.
- A 13-as betegnél számos NNRTI-rezisztenciához társult mutációt (K101E, K103N részleges és G190A részleges) észleltünk. Ez a beteg az NNRTI 1 ellen is jelentős fenotípusos rezisztenciát (>1466-szoros) mutatott. A mintában kimutatott E138A mutáció eddig nem függött össze rezisztenciával. Azonban ugyanebben a pozícióban egy másik mutációról, az E138K-ról kimutatták, hogy fontos szerepet játszik a TSAO-vegyületekkel szembeni rezisztenciában [J. Balzarini et al., PNAS, 90, 6952-6956 (1993)]. Az E138A mutáció szerepét még tisztázni szükséges.
- A 20-as betegnél, aki fenotípusos rezisztenciát mutatott a tesztelt NNRTI-kkel szemben, az A98G NNRTI-rezisztenciához társult mutáció fordult elő.
- A 22-es betegnél a V108I NNRTI-rezisztenciához társult mutáció fordult elő, de a tesztelt NNRTIkkel szemben nem mutatott fenotípusos rezisztenciát.
- A 24-es betegnél nem találtunk NNRTI-rezisztenciához társult mutációt (a K101Q mutációt számos vad típusú HIV-1 genomjában kimutatták), de fenotípusos rezisztenciát mutatott a tesztelt NNRTI-kkel szemben.
SZEKVENCIAJEGYZÉK
Az 1. számú szekvencia adatai (I) A szekvencia jellemzői
A. Hosszúság: 33 bázispár
B. Típus: nukleinsav
C. Száltípus: egyszálú
D. Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: CDNS
HU 226 203 Β1 (iii) Hipotetikus: nem (vi) Eredeti származás
A. Organizmus: Humán immunelégtelenség-vírus, típus: 1 (xi) A szekvencia leírása: 1. sz. szekvencia
CATTGCTCTC CAATTACTGT GATATTTCTC ATG
A 2. számú szekvencia adatai (i) A szekvencia jellemzői
A. Hosszúság: 26 bázispár
B. Típus: nukleinsav
C. Száltípus: egyszálú
D. Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (vi) Eredeti származás
A. Organizmus: Humán immunelégtelenség-vírus, típus: 1 (xi) A szekvencia leírása: 2. sz. szekvencia
GGGAAGATCT GGCCTTCCTA CAAGGG
A 3. számú szekvencia adatai (i) A szekvencia jellemzői
A. Hosszúság: 24 bázispár
B. Típus: nukleinsav
C. Száltípus: egyszálú
D. Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (vi) Eredeti származás
A. Organizmus: Humán immunelégtelenség-vírus, típus: 1 (xi) A szekvencia leírása: 3. sz. szekvencia
GCCCCTAGGA AAAAGGGCTG TTGG
A 4. számú szekvencia adatai (i) A szekvencia jellemzői
A. Hosszúság: 24 bázispár
B. Típus: nukleinsav
C. Száltípus: egyszálú
D. Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (vi) Eredeti származás
A. Organizmus: Humán immunelégtelenség-vírus, típus: 1 (xi) A szekvencia leírása: 4. sz. szekvencia
TGAAAGATTG TACTGAGAGA CAGG
Az 5. számú szekvencia adatai (i) A szekvencia jellemzői
A. Hosszúság: 24 bázispár
B. Típus: nukleinsav
C. Száltípus: egyszálú
D. Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (vi) Eredeti származás
A. Organizmus: Humán immunelégtelenség-vírus, típus: 1
HU 226 203 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 5. sz. szekvencia
GATATTTCTC ATGTTCATCT TGGG
A 6. számú szekvencia adatai (i) A szekvencia jellemzői
A. Hosszúság: 24 bázispár
B. Típus: nukleinsav
C. Száltípus: egyszálú
D. Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (vi) Eredeti származás
A. Organizmus: Humán immunelégtelenség-vírus, típus: 1 (xi) A szekvencia leírása: 6. sz. szekvencia
AGGTGGCAGG TTAAAATCAC TAGC
Claims (23)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. In vitro eljárás HlV-pozitív betegek kemoterápiájának meghatározására, azzal jellemezve, hogy 25 egy betegből származó biológiaianyag-mintából vírusRNS-t izolálunk és a HIV-pol-gén egy kívánt szakaszát reverz transzkripcióval átírjuk, a kapott szekvenciával és egy HIV-DNS-szerkezettel, amelyből az említett szekvenciát töröltük, egy HIV-fer- 30 tőzésre fogékony sejtvonalat transzfektálunk, a transzfektált sejtek tenyésztésével kiméravírusok egy állományát állítjuk elő, meghatározzuk a kiméravírusok fenotípusos érzékenységét a HIV-pol-gén által kódolt enzim egy inhibitorával 35 szemben, és erre meghatározunk egy értéket, készítünk egy adatsort, amely a kiméravírusra megállapított érzékenység értékét és egy kiméra vad típusú HIV-törzs megfelelő értékét tartalmazza, legalább két további inhibitorral szemben megismétel- 40 jük az érzékenységi vizsgálatot, az adatsorokat kétdimenziós vagy háromdimenziós grafikus formában ábrázoljuk, a grafikus ábrázolás alapján kiválasztjuk az optimális inhibitor(oka)t. 45
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adatsort sokszögű, vagy kvázi kör alakú grafikonon ábrázoljuk, amelyben (a) egy középpontból (origóból) több normalizált tengely indul ki, mindegyik tengely egy adatsornak vagy in- 50 hibitornak, vagy ezek kombinációjának felel meg;(b) a tengelyek normalizálását úgy végezzük, hogy a vad típusú HÍV érzékenységi értékeit a különböző inhibitorokkal szemben minden tengelyen egyenlőnek tüntetjük fel, adott esetben ábrázoljuk a vad típusú HIV-re vo- 55 natkozó adatpontokat, és összekötve szabályos sokszöget képezünk, amelynek a csúcsai a tengelyeken vannak, és középpontját az origó határozza meg;(c) minden tengelyre felviszünk egy olyan adatpontot, amely a kiméra-HIV-állománynak az említett ten- 60 gelynek megfelelő inhibitorral szembeni érzékenységét jeleníti meg, a kiméraadatpontokat adott esetben összekötjük, a kapott szabályos vagy szabálytalan sokszög alakja a kiméraállomány rezisztenciáját ábrázolja egy sor inhibitorral szemben.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tengelyeken logaritmikus lépték van.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a három vagy több adatsor tartalmaz még egy értéket a szóban forgó inhibitornál a legrosszabb esetben mérhető rezisztenciára.
- 5. Eljárás HlV-pozitív betegek HlV-kemoterápiájának meghatározására, azzal jellemezve, hogy tartalmazza a következő lépéseket:(a) időszakosan megállapítjuk egy beteg HlV-törzsének a fenotípusos érzékenységét az 1-4. igénypontok bármelyike szerint;(b) a kemoterápiának a kiválasztott inhibitorral való fenntartására vonatkozó instrukciót adunk, ameddig a beteg HIV-törzsei érzékenyek maradnak a választott kemoterápiára;(c) másik inhibitort választunk, ha és amikor az eredeti inhibitorral szembeni érzékenység csökken.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiméravírusoknak legalább két - HIV-pol-gén által kódolt - enziminhibitorával szembeni érzékenységét egyszerre határozzuk meg.
- 7. Eljárás egy betegben lévő egyedi HIV-törzsek legalább két - HIV-gén által kódolt - enziminhibitorával szembeni gyógyszerérzékenységének a meghatározására, azzal jellemezve, hogy egy betegből származó biológiaianyag-mintából vírusRNS-t izolálunk, és a HIV-pol-gén egy kívánt szakaszát reverz transzkripcióval átírjuk, a kapott szekvenciával és egy HIV-DNS-szerkezettel amelyből az említett szekvenciát töröltük - egy HlV-fertőzésre fogékony sejtvonalat transzfektálunk, a transzfektált sejtek tenyésztésével kiméravírusok egy állományát állítjuk elő,HU 226 203 Β1 meghatározzuk a kiméravírusok fenotípusos érzékenységét a HIV-pol-gén által kódolt enzimek inhibitoraival szemben.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiai anyagot a következők közül választjuk: plazma, szérum, sejtmentes testfolyadék, például mag- és hüvelyfolyadék.
- 9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biológiai anyagként teljes vért alkalmazunk, amelyhez RNS-stabilizátort adtunk.
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biológiai anyagként szövetet alkalmazunk, amely lehet agyszövet vagy nyirokmirigyszövet.
- 11. A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HIV-RT, -proteáz és -integráz közül legalább két enzimet választunk ki.
- 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HIV-fertőzésre fogékony sejtvonalként egy CD4+ T-sejtvonalat alkalmazunk.
- 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy CD4+ T-sejtvonalként MT34 sejtvonalat vagy HeLa CD4+ sejtvonalat alkalmazunk.
- 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beteg pol-génjének kívánt szakaszát reverz transzkripcióval, egy specifikus 3' primer használatával írjuk át.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reverz transzkriptázt és proteázt kódoló szekvenciát írjuk át reverz transzkripcióval.
- 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3' primerként a következőt alkalmazzuk: OUT3: 5’-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-3' (1. számú szekvencia).
- 17. A 14-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reverz transzkripció termékét „fészkes” PCR- (nested PCR) technikával sokszorozzuk fel.
- 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HIV-DNS-szerkezet egy olyan szerkezet, amelyből az RT- és a proteázgént töröltük, és ez az 1996. november 8-án a Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMBP Collection intézményben, LMBP3590 számon letétbe helyezett pGEMT3-APRT plazmid.
- 19. Az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzfekciót elektroporációval végezzük.
- 20. Az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzfekciót kationos lipidek használatával végezzük.
- 21. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiméravírusoknak a különböző RT-, proteáz- és integrázinhibitorokkal szembeni fenotípusos gyógyszerérzékenységét automatizált, sejtre alapozott assay-ben határozzuk meg.
- 22. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiméravírusoknak és a vad típusú HIV-törzsnek egy vagy több RT-, proteázvagy integrázinhibitorral szembeni fenotípusos gyógyszerérzékenységét gátló koncentrációként (IC érték) fejezzük ki.
- 23. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az RT-inhibitorokat a nukleozid RT-inhibitorok közül - ilyenek az AZT, ddl, dolC, 3TC, d4T - a nemnukleozid RT-inhibitorok közül - ilyenek a loviride, nevirapine és tivirapine - választjuk ki, a proteázinhibitorokat a sasquinavir, indinavir és ritonavir közül választjuk, és az integrázinhibitorok közül, például a koffeinsav fenil-etil-észter (CAPE) választjuk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96200175 | 1996-01-26 | ||
| PCT/IB1997/000071 WO1997027480A1 (en) | 1996-01-26 | 1997-01-24 | Method of managing the chemotherapy of patients who are hiv positive based on the phenotypic drug sensitivity of human hiv strains |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9902618A2 HUP9902618A2 (hu) | 1999-12-28 |
| HUP9902618A3 HUP9902618A3 (en) | 2001-04-28 |
| HU226203B1 true HU226203B1 (en) | 2008-06-30 |
Family
ID=8223611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9902618A HU226203B1 (en) | 1996-01-26 | 1997-01-24 | Method for determining of the chemotherapy of patients who are hiv positive based on the phenotypic drug sensitivity of human hiv strains |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6221578B1 (hu) |
| EP (1) | EP0877937B1 (hu) |
| KR (1) | KR100495690B1 (hu) |
| CN (2) | CN1209875A (hu) |
| AT (1) | ATE217971T1 (hu) |
| AU (1) | AU717755B2 (hu) |
| BG (1) | BG102710A (hu) |
| BR (1) | BR9707204A (hu) |
| CZ (1) | CZ292899B6 (hu) |
| DE (1) | DE69712731T2 (hu) |
| ES (1) | ES2177922T3 (hu) |
| HU (1) | HU226203B1 (hu) |
| IL (1) | IL125442A (hu) |
| IS (1) | IS4799A (hu) |
| NO (1) | NO321329B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ325912A (hu) |
| PL (1) | PL186473B1 (hu) |
| SK (1) | SK283878B6 (hu) |
| TR (1) | TR199801443T2 (hu) |
| WO (1) | WO1997027480A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA97669B (hu) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5843946A (en) | 1992-08-25 | 1998-12-01 | G.D. Searle & Co. | α-and β-amino acid hydroxyethylamino sulfonamides useful as retroviral protease inhibitors |
| US20030220276A1 (en) * | 1995-05-16 | 2003-11-27 | Opendra Narayan | HIV vaccine and method of use |
| US6242187B1 (en) | 1996-01-29 | 2001-06-05 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| US20070010471A1 (en) * | 1997-05-02 | 2007-01-11 | Opendra Narayan | HIV DNA vaccine |
| WO1999006597A1 (en) * | 1997-07-30 | 1999-02-11 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| BR9911600A (pt) * | 1998-05-26 | 2001-02-13 | Virologic Inc | Recursos e métodos para monitoração de terapia antiretroviral inibidora de transcriptase reversa de não nucleosìdeo |
| DE60022036T2 (de) * | 1999-05-28 | 2006-06-08 | Virco N.V. | Neue mutationsprofile der hiv-1 reverse transcriptase in verbindung mit phänotypischem medikamentresistenz |
| US6800437B1 (en) | 1999-08-06 | 2004-10-05 | Tibotec Bvba | Method of monitoring a biological system by labeling with an apo metal binding protein |
| EP1109019A1 (en) * | 1999-12-15 | 2001-06-20 | BioStrands S.r.l. | Method to evaluate the sensitivity of HIV variants to drugs able to inhibit the HIV protease |
| AU2001233513A1 (en) * | 2000-02-04 | 2001-08-14 | K.U. Leuven Research And Development | Hiv-1 resistance assay |
| GB0009374D0 (en) * | 2000-04-14 | 2000-05-31 | Glaxo Group Ltd | Phenotyping assay and reagents therefor |
| DE60135366D1 (de) | 2000-04-18 | 2008-09-25 | Virco Bvba | Methode zur bestimmung der resistenz gegen medikamente |
| US6800463B1 (en) * | 2000-04-20 | 2004-10-05 | Virco Bvba | Method for mutation detection in HIV-1 using pol sequencing |
| CA2406830C (en) * | 2000-04-20 | 2012-10-02 | Virco Bvba | Method for mutation detection in hiv using pol sequencing |
| US6582901B2 (en) | 2000-04-26 | 2003-06-24 | Bruce K. Patterson | Cell specific anti-viral drug susceptibility test using tagged permissive target cells |
| US7058616B1 (en) | 2000-06-08 | 2006-06-06 | Virco Bvba | Method and system for predicting resistance of a disease to a therapeutic agent using a neural network |
| CN1446265A (zh) * | 2000-06-12 | 2003-10-01 | 病毒科学公司 | 检测抗反转录病毒治疗的方式与方法和在hiv/aids治疗中的指导治疗方案 |
| US6582920B2 (en) * | 2000-09-01 | 2003-06-24 | Gen-Probe Incorporated | Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations |
| BR0115132A (pt) | 2000-10-20 | 2004-06-15 | Virco Bvba | Perfis mutacionais em transcriptase reversa de hiv-1 correlacionados com resistência à droga fenotìpica |
| EP1340075B1 (en) * | 2000-10-20 | 2009-01-28 | Virco Bvba | Establishment of biological cut-off values for predicting resistance to therapy |
| EP1283272B1 (en) * | 2001-08-08 | 2013-11-13 | Janssen R&D Ireland | Methods and means for assessing HIV envelope inhibitor therapy |
| US6958211B2 (en) * | 2001-08-08 | 2005-10-25 | Tibotech Bvba | Methods of assessing HIV integrase inhibitor therapy |
| DE60225587T2 (de) | 2001-11-08 | 2009-04-02 | Aaron Diamond Aids Research Center | Protease assay zur kontrolle medikamentöser therapie |
| US7473524B2 (en) | 2002-07-01 | 2009-01-06 | Hilde Azijn | Mutational profiles in HIV-1 protease correlated with phenotypic drug resistance |
| DE60327768D1 (de) | 2002-07-01 | 2009-07-09 | Tibotec Pharm Ltd | Mutationsprofile bei mit phänotypischer medikamentenresistenz korrelierter hiv-1-protease |
| JP5213228B2 (ja) * | 2004-03-02 | 2013-06-19 | ビルコ・ビーブイビーエイ | 臨床的カット−オフ値の推測 |
| CA2631881C (en) | 2005-12-07 | 2015-03-24 | Tibotec Pharmaceuticals Ltd. | Methods, plasmid vectors and primers for assessing hiv viral fitness |
| CA2646586A1 (en) * | 2006-04-14 | 2007-10-25 | Tibotec Pharmaceuticals Ltd. | Methods and means for assessing hiv gag/protease inhibitor therapy |
| AU2008257703A1 (en) | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Tibotec Pharmaceuticals | New mutational profile in HIV-1 Gag cleavage site correlated with phenotypic drug resistance |
| WO2010040756A1 (en) * | 2008-10-06 | 2010-04-15 | Virco Bvba | Method for determining drug resistance mutations in any of the non-structural protein regions ns3 to ns5b of hepatitis c virus (hcv) for genotypes 1 to 6 |
| US20120064514A1 (en) * | 2009-05-12 | 2012-03-15 | Virco Bvba | Hiv-1-c resistance monitoring |
| CN107085093B (zh) * | 2017-03-24 | 2019-06-21 | 西藏诺迪康药业股份有限公司 | 重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法 |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3875396A (en) | 1973-11-12 | 1975-04-01 | Illuminite Corp | Illuminated clipboard |
| US4675147A (en) * | 1983-04-06 | 1987-06-23 | Westinghouse Electic Corp. | Generating an integrated graphic display of the safety status of a complex process plant |
| US5716826A (en) * | 1988-03-21 | 1998-02-10 | Chiron Viagene, Inc. | Recombinant retroviruses |
| US5665577A (en) | 1989-02-06 | 1997-09-09 | Dana-Farber Cancer Institute | Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof |
| CA2032158C (en) | 1989-05-25 | 2009-09-15 | Helmut Bachmayer | Multivalent repressor of gene function |
| US5401629A (en) | 1990-08-07 | 1995-03-28 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Assay methods and compositions useful for measuring the transduction of an intracellular signal |
| JPH05148202A (ja) * | 1991-04-10 | 1993-06-15 | Tsumura & Co | 新規な化合物およびその医薬としての用途 |
| AU4248593A (en) | 1992-05-14 | 1993-12-13 | Mark Holodniy | Polymerase chain reaction assays for monitoring antiviral therapy |
| US5733720A (en) | 1992-06-18 | 1998-03-31 | Washington University | Genetically engineered cell lines for detecting infectious herpesvirus and methods therefor |
| KR100300932B1 (ko) | 1992-07-06 | 2001-10-22 | 조이스 브린톤 | 리포터유전자에융합된세균의스트레스프로모터를이용하여독성을측정하는방법및진단키트 |
| US5344846A (en) | 1992-12-30 | 1994-09-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for inhibiting deoxyhypusine synthase and the growth of cells |
| US5591579A (en) | 1993-12-21 | 1997-01-07 | Washington University | Indicator cell line for detecting RNA viruses and method therefor |
| US6063562A (en) | 1994-09-16 | 2000-05-16 | Sepracor, Inc. | In vitro method for predicting the evolutionary response of HIV protease to a drug targeted thereagainst |
| US5569588A (en) | 1995-08-09 | 1996-10-29 | The Regents Of The University Of California | Methods for drug screening |
| EP0914607A2 (en) | 1995-09-15 | 1999-05-12 | Samir Chachoua | Method for the identification and therapeutic use of disease-associated organisms, elements and forces |
| US5885806A (en) * | 1995-11-28 | 1999-03-23 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods to prepare conditionally replicating viral vectors |
| AU732255B2 (en) | 1996-01-29 | 2001-04-12 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| US5837464A (en) | 1996-01-29 | 1998-11-17 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| US5945276A (en) | 1996-04-10 | 1999-08-31 | Signal Pharmaceuticals, Inc. | Reporter cell line system for detecting cytomegalovirus and identifying modulators of viral gene expression |
| US5939253A (en) | 1996-04-26 | 1999-08-17 | Diagnostic Hybrids, Inc. | Compositions and methods for detecting viral infection |
| ATE269975T1 (de) | 1997-04-07 | 2004-07-15 | Bioimage As | Verfahren zum screenen von substanzen die einen effekt auf intrazelluläre translokation haben |
| WO1998046796A1 (en) | 1997-04-11 | 1998-10-22 | The Regents Of The University Of California | A method of screening nucleotide sequences to identify disruptors or effectors of biological processes or pathways |
| AU8160298A (en) | 1997-06-23 | 1999-01-04 | Emory University | Human immunodeficiency viruses causing aids in a nonhuman primate |
| US5976813A (en) | 1997-12-12 | 1999-11-02 | Abbott Laboratories | Continuous format high throughput screening |
-
1997
- 1997-01-24 CN CN97191904A patent/CN1209875A/zh active Pending
- 1997-01-24 BR BR9707204-4A patent/BR9707204A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-01-24 AU AU13168/97A patent/AU717755B2/en not_active Ceased
- 1997-01-24 US US09/117,217 patent/US6221578B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-24 CN CNA2006101685069A patent/CN1991365A/zh active Pending
- 1997-01-24 IL IL12544297A patent/IL125442A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 ES ES97900712T patent/ES2177922T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-24 PL PL97328069A patent/PL186473B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 TR TR1998/01443T patent/TR199801443T2/xx unknown
- 1997-01-24 KR KR10-1998-0705747A patent/KR100495690B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 NZ NZ325912A patent/NZ325912A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 EP EP97900712A patent/EP0877937B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-24 DE DE69712731T patent/DE69712731T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-24 AT AT97900712T patent/ATE217971T1/de active
- 1997-01-24 WO PCT/IB1997/000071 patent/WO1997027480A1/en not_active Application Discontinuation
- 1997-01-24 CZ CZ19982335A patent/CZ292899B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 HU HU9902618A patent/HU226203B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 SK SK1002-98A patent/SK283878B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-12-27 ZA ZA9700669A patent/ZA97669B/xx unknown
-
1998
- 1998-07-16 NO NO19983300A patent/NO321329B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-07-20 IS IS4799A patent/IS4799A/is unknown
- 1998-08-20 BG BG102710A patent/BG102710A/xx unknown
-
2000
- 2000-12-14 US US09/735,487 patent/US6528251B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-01-15 US US10/342,188 patent/US20030152917A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU226203B1 (en) | Method for determining of the chemotherapy of patients who are hiv positive based on the phenotypic drug sensitivity of human hiv strains | |
| US7189505B2 (en) | Methods of assessing HIV integrase inhibitor therapy | |
| KR102663972B1 (ko) | 예비-면역화 단계가 없는 hiv 면역요법 | |
| Ambrose et al. | In vitro characterization of a simian immunodeficiency virus-human immunodeficiency virus (HIV) chimera expressing HIV type 1 reverse transcriptase to study antiviral resistance in pigtail macaques | |
| JP2008022861A (ja) | ヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ）の表現型特性の新規な分析法 | |
| EP1283272B1 (en) | Methods and means for assessing HIV envelope inhibitor therapy | |
| Jármy et al. | Phenotypic analysis of the sensitivity of HIV‐1 to inhibitors of the reverse transcriptase, protease, and integrase using a self‐inactivating virus vector system | |
| EP1285971B1 (en) | Methods for the phenotypic and genotypic assessment of the drug sensitivity of HIV integrase variants | |
| RU2174014C2 (ru) | Способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по вич, основанный на фенотипической лекарственной чувствительности человеческих штаммов вич | |
| CA2244735C (en) | Method of managing the chemotherapy of patients who are hiv positive based on the phenotypic drug sensitivity of human hiv strains | |
| Yang et al. | Human immunodeficiency virus type 2 capsid protein mutagenesis defines the determinants for Gag–Gag interactions | |
| Safari et al. | Functional and Structural Segregation of Overlapping Helices in HIV-1 | |
| US20070269797A9 (en) | Method for analysis of the phenotypic characteristics of the human immunodeficiency virus (HIV) | |
| US20020123036A1 (en) | Method for analysing human immunodeficiency virus (HIV) phenotypic characteristics | |
| JP2002159297A (ja) | プロテアーゼ活性の測定方法 | |
| CA2646586A1 (en) | Methods and means for assessing hiv gag/protease inhibitor therapy | |
| JP2007515386A (ja) | Ｈｉｖ感染個体の治療用免疫化 | |
| CN107058245A (zh) | 一种对逆转录酶抑制剂耐药的hiv‑1毒株及其制备方法和应用 | |
| CN108486161A (zh) | 一种hiv指示细胞系及其制备方法 | |
| RU98116294A (ru) | Способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по вич, основанный на фенотипической лекарственной чувствительности человеческих штаммов вич | |
| AU2007249129A1 (en) | Novel method for analysing phenotypic characteristics of human immunodeficiency virus (HIV) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |