KR100300932B1 - 리포터유전자에융합된세균의스트레스프로모터를이용하여독성을측정하는방법및진단키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 화합물의 독성을 측정하기 위한 방법 및 진단 킷트에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 진단 킷트는 다수의 세균 숙주들을 이용하며, 이 숙주들은 각각 분석가능한 생성물을 암호하는 유전자에 융합된 상이한 스트레스 프로모터를 암호하는 DNA서열을 갖고 있다. 이 스트레스 프로모터들은 각각 다른 종류의 세포 스트레스에 노출시 유도된다. 본 발명에 사용된 스트레스 프로모터들은 모두 산화환원 스트레스, DNA 스트레스, 단백질 스트레스, 에너지 스트레스 및 pH 스트레스에 대해 응답반응하는 프로모터들을 포함한다. 본 발명의 방법 및 진단킷트는 화합물의 독성을 특성규명하고 정량하며, 그 독성 작용의 세포 기작을 규명하는데 사용될 수 있다. 더우기, 본 발명의 방법은 아세포수준에서 화합물의 작용에 관한 정보를 산출한다. 이 정보는 독성인 것으로 밝혀진 화합물에 대한 항독소를 설계하고 활성 약물 설계에 이용될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
리포터 유전자에 융합된 세균의 스트레스 프로모터를 이용하여 독성을 측정하는 방법 및 진단 키트
[기술분야]
본 발명은 화합물의 독성을 측정하는 방법 및 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 진단 키트는 많은 세균 숙주를 이용하며, 이 숙주들은 각각 분석 가능한 생성물을 암호하는 유전자에 융합된 여러 스트레스 프로모터를 암호하는 DNA 서열을 갖고 있다. 이 스트레스 프로모터들은 각각 여러 종류의 세포성 스트레스에 대해 노출될 때 유도된다. 본 발명에 이용된 스트레스 프로모터들은 전부 산화 환원 스트레스, DNA 스트레스, 단백질 스트레스, 에너지 스트레스 및 pH 스트레스에 응답 반응하는 프로모터를 포함한다. 본 발명의 방법 및 진단 키트는 화합물의 독성을 특성규명하고 정량하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 화합물의 독성 작용의 세포 기작을 확인하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 방법은 아 세포 수준에서 화합물의 작용에 관한 정보를 제공한다. 이 정보는 독성인 것으로 밝혀진 화합물에 대한 항독소를 고안하고 활성 약물을 고안하는데 이용될 수 있다.
[발명의 배경]
현재 미국내에서는 55,000가지 이상의 화학 약품이 생산된다. 또한, 매년 2,000가지 이상의 신규 화학약품이 시장에 소개된다. 이런 화학약품의 단지 몇몇 가지만이 급성 또는 만성 독성에 대해 포괄적으로 시험된다. 예컨대, 시판용 화학 약품의 1% 미만이 완전한 건강 위험 평가 시험을 받는 것이다.
환경 보호청(EPA)은 화학약품이 상업적으로 생산되기 전에 독물학적 시험의 요구할 권한을 갖고 있으나, 그 권한이 사용되는 경우는 드물다. EPA는 신규 화학약품의 10% 미만을 세밀히 조사한다. 비용적인 측면과 시장에 빠르게 개방시키기 위해 EPA는 종종 신규 화학약품의 독성을 평가하는데 이전에 시험된 동종 화합물의 독성을 사용한다.
신규 약물의 잠복 독성은 식품 및 의약품국(FDA)이 감시한다. FDA는 신약신청(NDA)의 경우 일반적으로 2 종류 이상의 살아있는 동물에 대한 많은 일련의 독성 시험, 발암성 시험, 돌연변이성 시험 및 생식/번식 시험을 요구한다. 이 시험들은 1년까지 걸릴 수도 있다. 이 시험을 완료하는 데에는 거액의 비용이 든다. 예를 들면, 래트에 대한 통상적인 90일간의 노출 독성 시험은 약 10만 달러가 사용된다[Casarett and Doull's Toxicology, 4판, M.O.Amdur 등 편집, Pergamon Press, New York, New York, p. 37(1991)].
비용외에도, 동물 시험은 시간, 동물의 고통 및 정밀도 면에서 단점을 나타 낸다. 일반적인 독성 시험은 3 단계로 나눠진다 : 급성 독성 시험, 단기간 독성 시험 및 장기간 독성 시험. 한 화합물의 LD50(시험 동물의 50%가 치사되는 투여량)을 측정하는 급성 시험은 약 60 내지 100 마리의 동물, 및 LD50과 용량 응답 곡선을 측정하고 사망 이외의 다른 임상적 최종점을 조사하기 위한 일련의 시험을 필요로 한다. 단기간의 시험은 보통 적어도 24마리의 개와 90마리의 래트를 사용하고, 래트에 있어서는 90일간, 개에서는 6 내지 24개월간 지속시킨다. 단기간 시험에서는 체중, 음식 소모, 혈액, 요 및 조직 시료가 자주 측정된다. 또한, 죽은 동물은 검시한다. 장기간 시험은 단기간 시험과 유사하나, 래트에 있어서는 2년, 개나 원숭이에 있어서는 7년까지 지속시킨다.
동물 시험은 동물에게 가해지는 심한 고통으로 인해 동물 보호가 및 일반 대중에게 비판을 받아 왔다. 더욱이, 최근 동물 시험의 정밀도에 대한 증거가 의문을 제기하고 있다. 예를 들면, 동물 식이요법과 같은 변수는 발암성을 측정하기 위한 동물 시험의 예견성에 나쁜 영향을 미칠 수 있다[P.H. Abelson, "인간과 설치류에 있어서의 식이요법과 암", Science, 255, p.141 (1992)]. 기니아 피그 시험을 근거로 한 종래 디옥신 독성에 대한 판결은 현재 재평가되고 있다[B.J. Culliton, "미국정부의 지시에 따른 디옥신의 새로운 고찰", Nuture, 352, p.753(1991) ; L. Roberts, "디옥신 퍼즐에 있어서의 많은 부분들", Research News, October, 1991, p.377]. 따라서, 동물내의 독성 시험에 대해 신속하고 비용이 저렴하며 신뢰성 있는 대안책의 필요성이 급박하다는 것을 명백히 알 수 있다.
여러가지 대안적인 단기간 시험들이 사용 가능하다. 예를 들면, 에임스 분석법(Ames Assay)은 살로넬라 티피뮤리엄(Salmonella typhimurium)의 돌연변이 균주의 유전자의 격세 유전(genetic reversion)을 일으키는 발암 물질을 검출한다. 그러나, 에임스 분석법은 비돌연변이성 발암 물질이나 비발암원성 독소를 검출할 수 없다. 미국 특허 제4,997,757호에 기술된 효모의 발암원 분석 시스템은 에임스 분석법의 몇몇 결점을 보완하지만, 여전히 비발암원성 독소를 검출하지 못한다. 이 분석법들은 둘다 DNA 수준에 있어서의 돌연변이 및 변화만을 검출하도록 고안된 것이다. 따라서, 상기 종래 기술의 시험들은 단백질이나 지질막에 대해 직접적인 손상이나 DNA 합성의 저해제들을 검출할 수 없다. 더욱이, 현재 사용되는 어떤 단기간 시험들은 발암원, 돌연변이원 또는 독소가 영향을 미치는 세포 기작에 대한 어떤 정보도 제공하지 못한다. 따라서, 이러한 종래 기술의 분석법들은 독성인 것으로 밝혀진 화합물에 대한 중화제 또는 해독제를 선택하는데 있어서 도움이 되는 어떤 정보도 밝혀내지 못한다.
[발명의 개요]
본 출원인들은 각각의 DNA 구조물이 β-갈락토시다제와 같은 분석가능한 폴리펩티드를 암호하는 DNA 서열에 융합된 여러 스트레스 프로모터를 포함하는 다수의 DNA 작제물을 결합시키는 방법을 제공함으로써 전술한 문제점들을 해결하였다. 이러한 융합물들 중의 어느 하나를 함유하는 적절한 세균 숙주는 제공된 화합물이 그 균주가 갖고 있는 특정의 스트레스 프로모터를 유도하는지를 측정할 수 있는 생체내 진단 시약이다. 이러한 숙주를 제공된 화합물과 항온처리하고 검출가능한 폴리펩티드에 대해 분석함으로써, 특정의 스트레스 프로모터가 그 화합물에 의해 유도 또는 억제되는지를 신속하고 용이하게 결정할 수 있다. 이 절차를 상이한 스트레스 프로모터 유전자 융합물을 함유하는 일군의 숙주를 가지고 반복함으로써 화합물의 독성을 정량하고 세포에 손상을 입히는 방식에 의하여 특성을 규명할 수 있다.
본 발명은 독성을 분석하고 특성규명하기 위한 진단 키트의 형태로 전술한 숙주군을 제공한다. 이 키트는 동물 시험에 소모되는 수개월이나 수년 보다는 몇일내로 화합물의 독성을 측정하도록 적절히 고안된 것이다. 더욱이, 본 발명의 키트는 살아있는 동물에 대해 부당한 결과를 초래함이 없이 동물 시험에 드는 비용의 일부를 사용하여 그 결과를 달성할 수 있다. 본 발명의 진단 키트 및 방법은 종래 기술의 단기간 분석법이 제공하지 못하는 세포에 대한 독소 작용의 특성에 관한 정보를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 독성인 것으로 증명된 화합물에 대한 항독소를 규명하는 방법을 제공한다. 그리고, 본 발명은 활성 약물 디자인의 개선 방법을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 β-갈락토시다제 합성으로 측정되는 바와 같은, 메틸 수은의 농도 변화에 대한 merR, sfiA 및 sodA 프로모터의 유도 반응을 도시한 것이다.
제2도는 β-갈락토시다제 합성으로 측정되는 바와 같은, 4-니트로퀴놀린의 농도 변화에 대한 sfiA, ads-alkA, nfo 및 dinD 프로모터의 유도 반응을 도시한 것이다.
제3도는 β-갈락토시다제 합성으로 측정되는 바와 같은, 메틸 메타노설페이트의 농도 변화에 대한 sfiA, ada-alkA, nfo 및 dinD 프로모터의 유도 반응을 도시한 것이다.
제4도는 β-갈락토시다제 합성으로 측정되는 바와 같은, 플룸바진(plumbagin)의 농도 변화에 대한 soi17, soi19 및 soi28 프로모터의 유도 반응을 도시한 것이다.
제5도는 β-갈락토시다제 합성으로 측정되는 바와 같은, 염화 나트륨의 농도 변화에 대한 sodA, proU 및 soi17 프로모터의 유도 반응을 도시한 것이다.
제6도는 β-갈락토시다제 합성으로 측정되는 바와 같은, 2,2'-디피리딜의 농도 변화에 대한 fepB, sodA 및 sfiA 프로모터의 유도 반응을 도시한 것이다.
제7도는 β-갈락토시다제 합성으로 측정되는 바와 같은, 여러 pH에서의 aniG, sfiA 및 soi17 프로모터의 유도 반응을 도시한 것이다.
제8도는 β-갈락토시다제 합성으로 측정되는 바와 같은, 과산화수소의 농도 변화에 대한 soi17, soi19, soi28 및 katG 프로모터의 유도 반응을 도시한 것이다.
제9도는 β-갈락토시다제 활성의 수배 증가로 측정되는 바와 같은, 본 발명의 가장 바람직한 진단 키트중에 함유된 16가지 스트레스 프로모터들 각각의 유도 반응에 대한 메틸 메탄설포네이트의 농도 변화에 따른 효과를 도시한 것이다.
제10도는 β-갈락토시다제 활성의 수배 증가로 측정되는 바와 같은, 본 발명의 가장 바람직한 진단 키트중에 함유된 16가지 스트레스 프로모터들 각각의 유도 반응에 대한 염화수은의 농도 변화에 따른 효과를 도시한 것이다.
제11도는 β-갈락토시다제 활성의 수배 증가로 측정되는 바와 같은, 본 발명의 가장 바람직한 진단 키트중에 함유된 16가지 스트레스 프로모터들 각각의 유도 반응에 대한 니트로퀴놀린 옥사이드의 농도 변화에 따른 효과를 도시한 것이다.
제12도는 β-갈락토시다제 활성의 수배 증가로 측정되는 바와 같은, 본 발명의 가장 바람직한 진단 키트중에 함유된 16가지 스트레스 프로모터들 각각의 유도 반응에 대한 파라콰트의 농도 변화에 따른 효과를 도시한 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본원에 사용된 바와 같은 "스트레스" 및 "독성"이란 용어는 상호 교환적으로 사용되는 표현으로서, 세포의 생화학적 및 생체물리학적 생체항상성의 장애를 의미한다.
본원을 통해 사용된 바와 같은 "산화 환원 스트레스"란 용어는 세포의 일반적인 환원/산화 전위("산화환원") 상태와는 다른 상태를 의미한다. 산화환원 스트레스는 증가된 양의 초과산화물, 증가된 양의 과산화물(즉, 과산화수소 및 유기 과산화물), 감소된 양의 글루타치온 및 강한 환원제에 대한 노출과 같은 세포의 산화환원 전위를 변화시키는 다른 모든 상태를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "DNA 스트레스"란 용어는 데옥시리보핵산 또는 뉴클레오티드 전구체에 대한 변화를 의미한다. 예를 들면, DNA 스트레스는 DNA가닥의 파손, DNA 가닥의 가교, DNA 삽입제에 대한 노출, 복합나선성의 증가 및 감소, 산화적인 DNA 손상, DNA 알킬화, 뉴클레오티드 삼인산염의 산화 및 뉴클레오티드 삼인산염의 알킬화를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 이 용어는 또한 DNA 합성 및 복제의 저해를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "단백질 스트레스"란 용어는 단백질이나 각각의 아미노산에 대한 변화 뿐만 아니라 단백질의 세포내 수송의 교란을 의미한다. 이 용어는 단백질의 변성, 단백질의 부정접힘, 단백질 보조인자의 킬레이트화, 단백질의 가교, 사슬내 및 사슬간 결합의 산소 의존적 및 산소 독립적 산화, 단백질의 알킬화, 아미노산 각각의 산화 및 카드뮴과 같은 중금속에 대한 노출로 유발되는 단백질 손상을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
본원에서 "에너지 스트레스"란 용어는 세포내의 ATP 양에 영항을 미치는 상태를 포함하는데 사용된다. 에너지 스트레스의 예로는 산소 존재하의 강제 혐기적 대사, 전자 수송의 교란 및 산화적 인산화반응 저해제에 대한 노출이다.
본원에 사용된 바와 같은 "pH 스트레스" 란 용어는 세포내 pH의 교란을 유발하는 상태, 즉, 약 6.0 이하로 세포내 pH를 감소시키거나 약 7.5 이상으로 세포 내 pH를 증가시키는 상태를 의미한다. pH 스트레스는, 예컨대 세포를 이온 운반체 또는 다른 세포막 손상 성분에 대해 노출시키거나, 또는 페놀산과 같은 소수성의 약한 유기 산에 노출시켰을때 유발될 수 있다. 이 용어는 또한 세포막 손상과 기전적 전위의 유해한 변화를 포함한다.
"스트레스 프로모터 유도"란 용어는 분석가능한 유전자 생성물의 형질발현 정도를 감소시키거나 증가시키는 상태를 의미한다.
개개의 세포들은 부분적으로 특정 유전자를 활성화시킴으로써 독성 자극에 응답 반응하며, 이때 그 유전자의 단백질 생성물은 상기 자극을 해독시키거나 그 자극에 의해 유발된 손상을 수복시킨다. 포유동물 세포와 세균 세포는 손상과 스트레스에 대한 많은 유전자적 및 생화학적 응답 반응을 공유한다. 포유동물에서 발견되는 대부분의 스트레스 응답 유전자에 있어서, 밀접하게 관련된 유전자가 세균중에서 확인되었다. 예컨대, 세균의 DNA 수복 효소는 자신의 DNA 수복 효소가 결실된 인체 세포를 충분히 보완할 수 있다는 것이 증명된 바 있다[E. Friedberg, "DNA 수복", Microbiol. Review, 52, p.70(1988)]. 따라서, 스트레스에 대한 세균의 응답 반응은 고등 진핵생물에 존재 가능한 스트레스 응답 반응의 꽤 정확한 전조인자이다.
35가지 이상의 상이한 세균 스트레스 유전자가 이미 분리되어 특성규명된 바 있다. 이 유전자들은 다양한 화학적 스트레스나 세포 손상에 의해 유도된다. 이러한 분리된 유전자들을 하나 이상 유도하는 화학적 스트레스 중에는 세포를 수은, 중금속, 니트로옥사이드, 방향족 탄화수소, 산도, 염기도, 알킬화제, 과산화제, 가교제, 이온운반체, 산화환원 활성제 및 산화적 인산화 반응 해제제에 노출시키는 것이 포함된다. 이러한 분리된 유전자를 유도하는 세포 손상의 예는 지질 산화, DNA 가닥 파손, DNA 알킬화, DNA 가교, DNA 산화, 삼투압 불균형, 단백질 산화, 단백질의 잘못 접힘(misfolding), 단백질 알킬화, ATP 고갈, 막 투과성화, 및 글루타치온 고갈이다. 보다 많은 스트레스 유전자가 존재할 것으로 추정된다. 이러한 부가적인 스트레스 유전자의 분리 및 특성규명은 다양한 화학적 스트레스가 세포상에 어떤 영향을 미치는지를 이해하는데 매우 바람직하다.
본 발명은 화합물이 세포내에서 일으키는 손상의 종류, 즉, DNA 손상, 단백질 손상, 산화 환원 손상 등에 의한 그 화합물의 독성을 결정하고 특성 규명하는 진단 키트 및 방법을 제공한다. 본 발명의 각 진단 키트는 분석 가능한 생성물을 암호하는 유전자에 작동가능하게 연결된 세균의 스트레스 프로모터를 갖고 있는 다수의 세균 숙주를 함유한다. 이 구조물은 세균의 염색체나, 또는 플라스미드 같은 염색체외 인자중에 위치할 수도 있다. 이 구조물은 세균의 세포 염색체 중에 단일 복제물로서 존재하는 것이 바람직하다.
특정한 스트레스 프로모터의 유도 또는 억제 정도는 동일 숙주의 무처리 대조용 배양물과 비교하여 분석가능한 생성물의 양으로 측정한다. 본 발명의 방법 및 키트를 사용하여 화합물의 독성을 측정하고 화합물에 의해 유발된 세포 손상의 종류를 특성규명할 수 있다.
본 발명의 진단 키트와 방법에 사용된 스트레스 프로모터들은, 정상적으로는 조절되는 유전자가 응답 반응하는 스트레스의 특정 종류에 따라 선택하였다. 프로모터들은 유전자의 형질발현을 조절하기 때문에, 사실상 프로모터를 유도하는 것은 스트레스이다. 따라서, 프로모터가 다른 폴리펩티드를 암호하는 유전자에 융합된다면, 그 폴리펩티드의 형질발현은 상기 프로모터를 유도하는 특정 스트레스에 대한 노출에 의해 영향받을 수 있을 것이다.
따라서, 특정 스트레스 프로모터가 화합물에 의해 유도되는지를 측정하고, 특정 스트레스를 유발하는 것으로 공지된 화합물에 노출시켜 얻어진 표준 곡선과 그 결과를 비교함으로써, 그 화합물이 일으키는 세포 스트레스의 구체적인 종류를 예견하고 특성 규명할 수 있다. 이것은 한 화합물의 내성을 나타내는 흡수양을 결정하고 그 화합물의 독성과 관련이 있을 수 있는 증상을 예견하는데 중요하다. 보다 중요한 것은, 본 발명의 키트와 방법을 사용함으로써 얻을 수 있는 정보를 통해 독성 화합물에 대해 효과적인 항독소를 설계할 수 있고, 신약 설계에 최대한으로 활용될 수 있다.
본 발명의 진단 키트와 방법은 다수의 세근 숙주를 이용한다. 이 숙주들은 전부 산화환원 스트레스, DNA 스트레스, 단백질 스트레스, 에너지 스트레스, 및 pH 스트레스에 응답 반응하는 프로모터들을 포함한다.
본 발명의 방법 및 키트중에 있어서 산화환원 스트레스에 응답 반응하는 프로모터는 sodA, soi28, katG, ahp, rdc, gsh, zwf 및 micF 유전자의 프로모터 중에서 선택된 것이 바람직하다.
sodA 유전자는 초과산화물 디스뮤타제(dismutase)를 암호하고, 초과산화물 라디칼을 세포중에 산출시키는 화학약품, 즉, 파라콰트, 플룸바긴, 메나디온, 스트렙토니그린, 메틸렌 블루 및 페나진 메틸 설페이트에 세포가 노출되었을때 강하게 유도된다[4. Carlioz 등, EMBO J., 5, pp. 623-30(1986) ; T. Kogoma 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85, pp. 4799-803 (1988) ; D Touati, J. Bacteriol., 170, pp. 2511-20 (1988) ; F. Tsaneva 등, J Bacteriol,, 172, pp. 4197-205 (1990)]. 또한 sodA 유전자는 금속 킬레이트화제, 예컨대, 1, 10-페난트롤린, 2,2'-디피리딜 및 EDTA에 의해 유도된다[D. Touati, 상기 문헌 참조]. sodA 유전자의 유도는 정상상태에서 초과산화물 농도의 증가에 의존적이나, 초과산화물에 의해 유발되는 세포손상에 반드시 의존적인 것은 아니다.
soi28 유전자는 피쿠베이트 : 플라보독신 옥시도리덕타제를 암호한다. 이 유전자는 초과산화물-생성 시약에 의해서만 유도된다. 구체적으로, soi28 유전자는 2가지 작은 티올-함유 단백질인 플라보독신과 페레독신이 산화되기 시작하면 유도 된다. 이 단백질의 환원형이 DNA합성에 필요하다. 따라서, 심한 초과산화물 스트레스는 DNA 합성을 증지시킬 수 있다.
katG 유전자는 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[P.C. Loewen 등, J. Bacteriol. 162, pp. 661-67 (1985)]에 개시되어 있다. katG 유전자는 과산화수소-유도성 카탈라제 활성을 암호한다. 이것은 특히 H2O2, 또는 세포중에서 H2O2를 생산하는 화합물에 의해 유도될 수 있다. 그러나, katG 유전자는 초과산화물-발생 화합물에 대해 응답 반응하지 않는다.
ahp 유전자는 외인성이거나, 또는 단백질과 지방산의 과산화 반응으로 형성되는 과산화 수소와 유기 히드로과산화물에 의해 유도된다. ahp 유전자의 클로닝 및 서열결정은 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[G. Storz 등, J. Bacteriol. 171, pp. 2049-55(1989)]에 기술되어 있다. ahp 프로모터-lacZ 융합체는 이.콜리(E. Coil)의 지방산 합성 및 분해 돌연변이주 내로 그 작제물을 클로닝시킴으로써 지질 과산화 손상과 외인성 유기 히드로과산화물 간을 구별하는데 사용될 수 있다. fabB, fadE 유전자형으로 예시되는 상기 균주는 과산화-민감성 지방산을 함유하는 기질을 이용하여 증식시킴으로써 과산화-민감성 지방산이 세포막내로 병입된 균주로 만들 수 있다. 이와 같은 균주내에서 lacZ의 ahp 프로모터-조절된 형질발현이 유도된다면, 화합물이 지질 과산화를 유발시킴을 나타내는 것일 수 있다. 이것은 동일한 작제물을 함유하는 야생형의 이. 콜리 균주를 분석함으로써 확인할 수 있다. 야생형 이 균주내에서 동일 화합물이 β-갈락토시다제 형질발현을 유도하지 못하는 것은 그 화합물이 지질 과산하를 유발하는 것이지, 그 자체가 유기 과산화물이 아니라는 것을 확인시켜 준다.
rdc 프로모터는 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌(G. T. Javor 등, J. Bacteriol., 170, pp. 3291-95 (1988)]에 기술된 바 있는 티올-민감성 프로모터를 가리키는 본 출원인이 부친 명칭이다. 이 프로모터는 티오글리세롤 및 다른 강 환원제에 의해 유도된다.
gsh 유전자는 글루타치온 합성효소를 암호하고, N-에틸말레이미드와 같은 세포의 글루타치온 양을 고갈시키는 화합물에 의해 유도된다. gsh 유전자는 클로닝 및 서열결정된 바 있다[H. Gushima 등, Nucleic Acids Res., 12, pp. 9299-307 (1985), 이 문헌은 본원에 참고문헌으로 포함됨].
zwf 유전자는 글루코스-6-히드로게나제를 암호하고 초과산화물-생성 화합물 및 질산 산화물에 의해 유도된다[J. T. Greenberg 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, pp. 6181-85 (1990)]. zwf 유전자는 클로닝되고 서열결정된 바 있다[D. L. Rowley 등, J. Bacteriol., 173, pp, 968-77 (1991), 본원에 참고문헌으로 포함됨].
micF 유전자는 포린(porin) 유전자, ompF 의 해독을 차단하는 안티센스 RNA를 암호한다. 이 유전자는 파라콰트와 같은 초과산화물-생성 화합물에 의해 유도된다(J.T. Greenburg 등, 상기 문헌 참조). 또한 micF 유전자는 에탄올과 열충격에 의해 유도된다. micF 유전자는 글로닝되고 서열결정된 바 있다[T. Mizuno 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, pp. 1966-70 (1984), 그 명세서는 본원에 참고문헌으로 임용됨].
본 발명의 진단 키트 및 방법에 사용될 수 있는 기타 산화환원 스트레스 프로모터로는 초과산화물에 응답 반응하는 soi17 및 soi19를 포함한다[T. Kogoma 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 4799-803 (1988)].
본 발명의 방법과 키트에 유용한 DNA 스트레스에 응답 반응하는 프로모터는 dinD, ada, ada-alkA, leu-500, gyr, top, mutT 및 nfo 유전자들의 프로모터 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
dinD 유전자는 DNA 복제의 파괴에 응답 반응하는 큰 레굴론(regulon)의 부분인 S0S 레굴론이다. DNA 복제의 파괴는 가닥 절단 및 "시클로부탄 이량체"를 비롯하여 제한된 부류의 DNA 상해에 의해 유발되는 것이 대부분이다. dinD의 일반적인 유도인자는 미토마이신 C, 블레오마이신 및 4-니트로퀴놀린 옥사이드와 같은 화합물 뿐만 아니라 UV 조사에 대한 노출을 포함한다. dinD 프로모터는 세포가 매우 고농도의 H2O2에 노출되는 경우(DNA 가닥의 절단을 초래함)를 제외하고는 산화적인 DNA 손상에 응답 반응하지 않는다. 또한, dinD 프로모터는 일반적으로 알킬화된 DNA나 산화적으로 손상된 DNA에 의해 유도되지 않는다[S. Kenyon 등, Nature, 289, pp. 808-12 (1981)].
ada 유전자는 알킬화된 DNA에 특이적으로 응답 반응하는 단백질을 암호한다. 즉, ada 유전자 자체와 알킬화된 DNA의 수복과 관련이 있는 다른 유전자(alkA 및 alkB)를 조절한다. ads, a1kA 및 alkB 유전자는 모두 동일한 오페론의 일부이다. DNA에 대한 알킬화 손상에는 0-6-알킬구아닌 및 3-알킬아데닌의 생성도 포함된다. ada 유전자의 형질발현을 유도하는 공지된 알킬화제는 메틸메타노설페이트(MMS), 에틸메타노설페이트(EMS) 및 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG)을 포함한다[B. Demple, Bioessays, 6, pp. 157-60 (1987)] ada 유전자는 클로닝되고 서열결정 되었다[Y. Nakabeppu 등, J. Biol. Chem., 260, pp. 7281-88 (1985), 이 명세서는 본원에 참고문헌으로 인용됨].
leu-500 프로모터는 살모넬라 티피뮤리엄 로이신 생합성 오페론중의 돌연변이 프로모터이다. 이 프로모터의 기능은 세포중에 존재하는 DNA 초나선성을 증가시킴으로써 복구될 수 있다[D.M.L. Lilley 등, Molec. Microbiol. 5, 779-83(1991)]. 따라서 에스. 티피뮤리엄이나 이. 콜리 숙주내로 삽입시킨 leu-500-lacZ 융합체는 초나선성을 증가시키는 인자를 검출하는데 사용될 수 있다.
gyr 유전자는 이. 콜리중에 존재하는 헬리카제 효소들 중의 하나를 암호한다. 이 효소는 초나선성을 증가시켜 정확한 DNA 초나사선성의 정도를 조사하고 유지시킨다. 세포내에서 DNA의 초나사선성을 감소시키는 DNA 가닥 가교제 같은 인자는 gyr 프로모터를 유도한다[K. Drlica 등, Biochemistry. 27, pp. 2252-59 (1988)].
top 유전자는 지나치게 감겨진 DNA 중의 초나선을 제거하는 토포이소머라제를 암호한다(K. Drlica 등, 상기 문헌 참조). top 유전자의 전사는 초나사선성을 증가시키는 처리에 의해 자극된다[Y.-C. Tse-Dinh 등, J. Mol Biol., 202, pp. 735-42 (1988)]. 따라서, 초나선성을 감소시키는 처리에 의해 유도되는 gyr 유전자의 응답 반응과는 반대 방식으로 응답 반응한다. 효모에 있어서 top 유전자 형질발현을 유도하는 제제는 또한 재조합을 유도하며, 이것은 토포이소머라제에 의해 재조합이 용이해짐을 암시 하는 것이다. 따라서, 본 출원인은 top 유전자의 유도가 일반적으로 강한 발암원인 '재조합원성' 제제를 분리하는데 사용될 수 있다고 생략된다.
mutT 유전자는 8-옥소-dGTP를 GMP로 특이적으로 분해하는 15 킬로달톤의 단백질을 암호한다. 8-옥소-dGTP 는 X-선 조사, 뿐만 아니라 많은 자연 발생적인 산화에에 의해 생성된다[H. Maki 및 M. Sekiguchi, Nature. 355, p. 273-75(1992)]. 8-옥소-dGTP 의 세포 생성을 유발하는 인자와 상태는 mutT를 유도한다.
nfo 유전자는 산화적 손상에 특이적인 DNA 수복 효소를 암호한다. 구체적으로, 손상은 핵산의 이미다졸 고리를 파괴함으로써 형성되는 3' 글리콜레이트와 같은 3' 차단기가 형성되는 것이다[B. Demple 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, pp. 7731-35(1986)). 차른 DNA 수복 효소는 이러한 종류의 DNA 손상에 응답 반응하지 않는다[S. Saporito 등, J. Bacteriol., 170, pp. S141-45 (1988)]. Nfo 는 파라콰트 및 메나디온과 같은 산화환원 활성제에 의해 특이적으로 유도된다[S. Farr 등, Microbiol. Rev., 55, pp. 561-85 (1991)].
DNA 스트레스에 응답 반응하고 본 발명의 방법 및 키트에 사용될 수 있는 기타 프로모터로는 DNA 복제와 관련 있는 단백질을 암호하고 복제를 차단하는 인자에 의해 유도되는 dnaA [C. Kenyon 등, J. Mol. Biol., 160, pp. 445-57 (1982)] ; DNA의 절단 수복과 관련 있는 단백질을 암호하고 UV 조사에 노출시 유도되는 sfiA [P. Quillardet 등, J. Bacteriol., 157, pp. 36-38 (1984)] ; DNA 합성에 필요로 되는 단백질인 리보뉴클레오티드 리덕타제를 암호하고 DNA 합성을 저해하는 인자에 의해 유도되는 nrd [P. Reichard, Ann. Rev. Biochem., 57, pp, 349-74 (1988)] ; 기능은 공지되어 있지 않지만 DNA를 손상시키는 인자에 의해 유도되는 dinB [ G C. Walker 등, J. Mol. Biol, 160, pp. 445-57 (1982)] ; 단일 가닥 DNA 파손과 DNA 가교제에 의해 유도되는 recA [S. Caseragola 등, 185, pp. 430-39 (1982)] ; 및 부피가 큰 DNA 알킬화제에 의해 유도되는 aidC [R, Fram 등, Cancer Res., 48, pp. 4823-26 (1988)]를 포함한다.
본 발명의 방법 및 키트에 유용한 단백질 스트레스에 응답 반응하는 프로모터들은 rpoD, lon, clpB, merR, fepB-entC, metro 및 groE 유전자 중에서 선택된다.
rpoD 유전자는 RNA 폴리머라제 전효소(holoenzyme)의 일부분인 시그마 서브유니트를 암호한다. rpoD 프로모터는 열 충격 응답 반응을 유도하는 상태와 동일한 상태 전부에 응답 반응하는 강한 "열 충격" 프로모터이다[D.W. Cowing 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, pp. 2679-83(1985)]. 온도 증가 외에도, "열 충격" 응답 반응은 또한 거의 모든 알콜, 뿐만 아니라 약간의 중금속에 의해 유도된다. "열 충격"에 대한 세포 응답 반응은 사실상 잘못접힌 성숙 단백질과 펼쳐진 미성숙 단백질의 농도의 증가에 대한 응답 반응이다.
lon 유전자는 잘못접힌 단백질을 분해하는 ATP-의존적인 프로테아제를 암호한다[D.T. Chin 등, J. Biol. Chem., 263, pp. 11718-28 (1988)]. 이 유전자는 성숙 단백질의 잘못접힘을 유발하는 인자에 대해 응답 반응한다.
clpB 유전자 생성물은 프로테아제 활성을 갖고 있고 손상 단백질에 결합할 수 있다. 이 생성물은 세포가 많은 손상 단백질을 생성할 때 유도된다[M. Kitigawa 등, J. Bacteriol., 173, 4247-53 (1991)]. 잘못 접힌 단백질이 결절된 단백질은 clpB 유전자의 형질 발현을 유도한다.
merR 유전자는 원소 수은, 뿐만 아니라 대부분의 무기 수은 화합물에 응답 반응한다[W. Ross 등, J. Bacteriol., 171, pp. 4009-18 (1988)]. 수은은 단백질의 티올기의 변형을 유발하여 종종 효소기능의 저해를 유도하는 것으로 공지되어 있다. 또한, 수은은 세포막 중의 설프히드릴기를 변형시켜 막 투과성과 막 수송의 변화를 유발할 수 있다.
fepB-entC 유전자는 세포내로 철 수송에 필요로 되는 주변 세포질 단백질을 암호한다. fepB-entC 의 형질발현은 세포내에 존재하는 이용가능한 철의 함량에 의해 조절된다. 낮은 철 함량은 상기 유전자를 유도하는 반면, 높은 철 양은 상기 유전자의 전사를 차단한다[T.J. Brickman 등, J. Mol. Biol., 212, pp. 669-82 (1990)].
meto 유전자는 메티오닌 설폭사이드 리덕타제를 암호한다. 이 유전자는 산화된 메티오닌에 의해 유도된다.
groE 유전자는 세포 증식에 역할을 한다. groE 유전자의 생성물이 ATPase 활성을 가질지라도, 그것의 세포 기능은 아직 알려져 있지 않다. 또한 groE 유전자 생성물은 분자 차페론(chaperon) 단백질 처럼 작용하는 것으로 알려져 있다. groE 유전자는 단백질 잘못 접힘을 유발하는 인자에 의해 유도된다[D.W. Cowing 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, pp. 2679-83 (1985)].
groE 프로모터의 서열은 보고된 바 있다[D.W Cowing 등, J. Mol. Biol., 210, pp. 513-20 (1989), 이 명세서는 본원에 참고 문헌으로 인용됨].
단백질 스트레스에 응답 반응하고 본 발명의 방법 및 키트에 사용될 수 있는 다른 프로모터로는 단백질의 잘못접힘을 유발하는 인자에 의해 유도되는 dnak[D,W. Cowing 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, pp, 2679-83 (1985)] ; 및 해독을 저해하거나 방해하는 인자에 의해 유도되는 것으로 생각되는 rimK[W. Kang 등, Molec. Gen. Genetics, 217, pp. 281-88 (1989)]를 포함한다.
본 발명의 방법 및 키트에 유용한 에너지 스트레스에 응답 반응하는 프로모터는 sdh, cyo, cyd 및 unc 유전자의 프로모터 중에서 선택된다.
sdh 유전자는 숙시네이트에서 전자를 제거하고 이 전자를 시토크롬 옥시다제에 제공하는 효소인 숙시네이트 디히드로게나제를 암호한다[R, Poole 및 W. Engledew, "에세리히아 콜리 및 살모넬라 티피뮤리엄" 중에서, F.C, Neidhardt, ed., ASM Press, Washington, D.C., pp 170-200 (1987)]. sdh 유전자의 형질 발현은 세포내에 있는 산소의 존재에 의해 조절된다. 혐기성 상태 또는 전자 수송을 방해하는 상태하에서, sdh 유전자는 발현되지 않는다. 따라서, sdh-lacZ 융합체에 의해 조절되는 β-갈락토시다제의 형질 발현은 전자 수송에 영향을 미치는 독소의 존재하에 감소될 것이다.
cyo 및 cyd 유전자는 이. 콜리내에서 2가지 시토크롬 옥시다제 유전자를 암호한다. cyo 유전자는 세포가 정상적인 호기적 상태 하에서 증식할 때 강하게 형질발현되나, 혐기적 상태 또는 호흡을 저해하는 상태하에서는 억제된다[S. Iuchi 등, J. Bacteriol. 172, pp, 6020-6025 (1990)]. 따라서, 전술한 sdh 융합체와 같이, 분석가능한 생성물의 cyo 프로모터-조절된 형질 발현의 감소는 화합물이 독성임을 나타내는 것이다. 이와 반대로, cyd 유전자는 호흡을 억제하는 상태에서 유도되고 정상적인 호기적 증식 상태에서는 억제된다.
unc 유전자는 F1-ATPase 서브유니트중 한 서브유니트를 암호한다. 이 유전자는 산화적 인산화 반응 해제제 및 이온 운반체와 같은 세포의 에너지 전하 (ATP 양)를 감소시키는 제제에 의해 유도된다[K. Von Meyenberg 등, EMBO J., 4, pp. 2357-63 (1985)].
본 발명의 방법 및 키트에 유용한 pH 스트레스에 응답 반응하는 프로모터는 hag, katF, micF 및 aniG 유전자의 프로모터 중에서 선택된다.
hag 유전자는 세포 운동성과 관련된 단백질을 암호한다. 세포 운동성은 세포 막을 따라 편모 운동원까지 양성자 구배를 필요로 한다[M. J. Silverman 등, J. Bacteriol., 120, pp. 1196-1203 (1974)]. 세포 막을 따라 이온을 자유 유동시킴으로써 pH 구배를 붕괴시키는 임의의 화합물은 hag 유전자의 형질 발현을 유도하고, 따라서 hag 프로모터를 유도할 것이다.
katF 유전자는 이. 콜리내에 존재하는 2가지 카탈라제중 한 카탈라제 조절 인자를 암호한다[Triggs-Raine and Loewen, Gene, 52, pp, 121-28 (1987)]. 이 유전자는 페놀산과 같은 약한 유기산에 노출시키는 것처럼 세포내 pH를 변화시키는 상태에 의해 유도된다. 또한, 기아에 인해 유도된다.
또한, 산화 환원 스트레스 프로모터 부분에서 전술한 micF 유전자는 또한 막 손상 및 삼투압의 변화에 응답 반응한다[J.T. Greenberg 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 상기 문헌 참조], 에탄을 및 열 충격은 micF 유전자를 유도하는 것으로 공지되어 있다.
aniG 유전자는 세포내 pH 변화로 유도되는 에스. 티피뮤리엄 유전자이다[Z. Aliabadi 등, J. Bacteriol., 170, pp. 842-51 (1988)]. aniG 프로모터는 에스. 티피뮤리엄 숙주 또는 이. 콜리 숙주 중에서 본 발명의 키트와 방법에 사용될 수 있다.
pH 스트레스에 응답 반응하고 본 발명의 키트와 방법에 이용될 수 있는 다른 프로모터로는 협막의 다당류 합성 효소 유전자를 암호하고 세포막 손상에 의해 유도되는 cps[S. Gottesman 등, Molec. Microbiol., 5, pp. 1599-606 (1991)]; 삼투압의 증가에 의해 유도되는 proU[4, Barron 등, J. Bacteriol., 167, pp. 433-38 (1986)] ; 및 주변세포질 막 과당류의 합성과 관련있는 효소를 암호하고 막 손상 및 삼투압 스트레스에 의해 유도되는 mdoA [J.M, Lacroix 등, Molec, Microbiol., 5, pp 1745-53 (1991)].
전술한 프로모터 외에도, 새로 발견되어 특성 규명될 수 있는 신규한 스트레스 프로모터들도 본 말명의 방법 및 키트에 사용될 수 있다.
신규 스트레스 프로모터들을 동정하기 위해, Mu dX 파지 염색체 라이브러리 또는 플라스미드의 라이브러리를 제조하고 선별할 수 있다. 이러한 라이브러리의
제조는 문헌[T.A. Baker 등, J. Bacteriol., 156, pp. 970-74 (1983)]에 기술되어 있고, 이 명세서는 본원에 참고 문헌으로 인용된다.
염색체 라이브러리는 앰피실린-감수성 세균 균주, 바람직하게는 전체 lac 오페론이 결실된 이. 콜리를 Mu dX로 형질 감염시킴으로써 제조할 수 있다. lacZ 유전자를 운반하는 MudZ 파지는 숙주 염색체내로 무작위적으로 삽입된다. 이런 삽입체들 중 특정 삽입체는 스트레스 프로모터-lacZ 융합체를 생성한다. 이 융합체를 분리하기 위해, 특정 스트레스의 공지된 유도 인자를 사용하여 앰피실린-내성형질감염체에 의한 의해 β-갈락토시다제 형질 발현의 유도에 대해 선별한다.
플라스미드 Mu dX 라이브러리는 lac-세균 숙주, 바람직하게는 이. 콜리의 염색체 DNA를 분리한 후, 이것을 제한 효소로 분해시켜 작제한다. 그 후, 얻어지는 염색체 단편들(이들중 일부 단편이 스트레스 유전자와 이것의 프로모터를 전부 함유하거나 일부만을 함유할 것임)을, 앰피실린 내성 유전자는 운반하지 않으나, 바람직하게는 또다른 항생제 내성 유전자, 즉, 테트라사이클린 내성 유전자를 운반하는 상기와 유사하게 분해된 벡터에 클로닝시킨다. 그러한 벡터의 예는 pKT 328이다. 결과적으로 얻어지는 플라스미드 라이브러리를 이용하여 amps, ttts, lac-세균 균주를 형질 전환시킨다. AmpR, tetR 형질전환체를 분리하고 그 다음 Mu dX 파지로 형질감염시킨다. 이 형질감염체를 앰피실린과 테트라사이클린을 함유하는 배지에서 증식시킨다. 그 다음 플라스미드 DNA를 분리하고 이를 이용하여 amps, tets, lac-세균 균주를 형질 전환시킨다. 목적하는 형질전환체가 ampR 및 tetR 인 것은 제외하고 전술한 바와 같이 융합체를 선별한다.
플라스미드 라이브러리 방법은 치명적일 수도 있는 스트레스 유전자내로 Mu dX가 삽입되었는지를 검출할 수 있기 때문에 바람직하다. 단지 스트레스 유전자의 플라스미드 복제물만이 Mu dX 삽입체를 포함한다. 따라서, 스트레스 유전자의 염색체 복제물은 여전히 기능적이며 스트레스에 응답 반응할 수 있다.
신규 스트레스 프로모터를 분리하고 분석가능한 단백질을 암호하는 DNA에 융합시킨 융합체를 적제하는 또다른 방법으로서, 특이적으로 디자인 벡터내에 세균의 염색체 DNA를 절단한 무작위 제한 단편을 삽입시키는 방법을 포함한다. 그런 벡터들은 분석가능한 단백질을 암호하는 DNA 서열에 대해 5' 쪽에 위치한 다중클로닝 부위를 포함하고 있다. 이런 형태에 속하는 가장 바람직한 벡터는 pRS 415 이다. 이러한 벡터에 세균 염색체 단편을 산탄총법으로 삽입시켜, 얻어지는 재조합 DNA 분자는 전체 lac 오페론이 결실되어 있으나, 다른 모든 면에서는 야생형인 세균 균주를 형질전환시키는데 사용된다. 그 결과 얻어진 형질전환체는 공지된 스트레스를 일으키는 화합물로 선별된다. 이런 화합물의 존재하에서 분석가능한 단백질의 형질 발현이 변형된 형질전환체들이 목적하는 융합체를 함유하는 것이다.
본 발명의 진단 키트 및 방법은 분석가능한 유전자 생성물의 형질 발현을 변화시키는 특정 스트레스 프로모터의 유도 반응에 따라 좌우된다. 이러한 형질 발현율의 변화는 정량적·정상적으로 측정한다. 그런 키트와 방법에 유용하게 사용할 수 있도록, 특정 스트레스 프로모터는 분석가능한 생성물을 암호하는 유전자에 작동 가능하게 결합되어야만 한다. "작동적 결합"이란 용어는 분석가능한 생성물을 암호하는 유전자의 전사가 프로모터에 의해 조절되도록 그 유전자에 대한 프로모터의 위치화를 의미한다. 그런 위치화는 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 전사 종지 시그널이 프로모터와 전술한 유전자 앞의 샤인-달가노 부위 사이에 존재하지 않도록 상기 유전자의 상부(5')에 프로모터를 위치화하는 것을 포함한다.
또한, 분석가능한 생성물을 암호하는 유전자를 운반하는 DNA 부분은 그 유전자의 샤인-달가노 서열 및 해독 개시 코돈을 포함하는 것이 바람직하다. 이런 방식으로 스트레스 프로모터를 운반하는 DNA를 분석가능한 생성물을 암호하는 DNA에 결합시키는 경우에는, 적절한 리딩 프레임이 문제가 아니다. 또한, 프로모터 DNA가 샤인-달가노 서열 및 일부 스트레스 유전자 암호 영역을 운반하는 경우에도 마찬가지이다. 이런 작제물에서, 해독은 분석가능한 생성물 유전자의 샤인-달가노 서열에 의해 충분히 조절되고 그 유전자의 개시 코돈에서 개시되어 프로모터의 유도 반응을 검출할 수 있을 것이다.
또한, 분석가능한 유전자 생성물이 본래 스트레스 유전자 생성물의 N-말단부를 함유하는 융합 단백질인 작제물도 본 발명의 영역에 포함된다. 이 작제물 중에, 프로모터를 함유하는 DNA의 부분이 스트레스 유전자 생성물의 최소한 N-말단 아미노산을 암호하는 DNA를 포함한다. 이 작제물은 해독 단계에서 유전자 형질 발현에 영향을 미치는 스트레스를 검출하는데 유용하다. 이러한 작제시에는 프로모터와 스트레스 유전자 암호 영역 일부를 함유하는 DNA의 3' 말단에 분석가능한 생성물을 암호하는 DNA의 5' 말단을 연결시켜 스트레스 유전자 생성물의 N-말단 아미노산을 암호하는 DNA가 분석가능한 생성물을 암호하는 DNA와 동일한 리딩 프레임내에 위치되도록 하는 작동적 결합을 필요로 한다. 이런 작제물들에 있어서, 프로모터 DNA가 샤인-달가노 서열과 해독 개시 코돈을 포함하고, 분석가능한 생성물을 암호하는 DNA는 자신의 샤인-달가노 서열을 함유하지 않아야 한다는 것은 당업자에게는 명백한 것이다.
본 발명의 키트와 방법에 있어서, 스트레스 프로모터에 작동가능하게 연결시키기 위한 유전자의 선택 범위는 거의 제한이 없으며, 단, (1) 분석가능한 생성물을 암호하는 DNA 서열이 특성 규명되어 있어야 하고, (2) 그 유전자의 생성물이 검출될 수 있어야 한다. 충분한 특성 규명이란 전체 암호 서열의 규명,CDNA 분자의 유용성 또는 조작될 유전자가 스트레스 프로모터에 작동적 결합을 형성할 수 있도록 허용하는 DNA 서열내에 존재하는 충분한 수의 제한 부위에 대한 규명을 포함한다.
분석가능한 생성물은 β-갈락토시다제(lacZ 유전자에 의해 암호됨), 클로람페닐콜 아세틸 트란스퍼라제(cat 유전자에 의해 암호됨), 갈락토스 키나아제(galk 유전자에 의해 암호됨), β-글루코시다제(gus 유전자에 의해 암호됨), 글우타치온 트란스퍼라제 또는 루시퍼라아제(lux 유전자에 의해 암호됨)인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, lacZ 유전자이다.
본 발명의 진단 키트와 방법에 사용되는 숙주가 갖고 있는 스트레스 프로모터-분석가능한 생성물 융합체는 당업계에 공지된 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 기법의 선택은 그 균주에 사용될 특정 스트레스 프로모터에 대하여 알려진 정보에 따라 자우된다. 스트레스 유전자가 플라스미드 상에 클로닝된다면, 전술한 Mu dX 삽입법을 사용하여 스트레스 프로모터-분석가능한 유전자 생성물 융합체를 만들 수 있다. 이런 경우 Mu dX를 사용하는데 필요한 유일한 조건은 스트레스 유전자를 갖고 있는 플라스미드가 앰피실린 내성을 암호하지 않아야 한다는 것이다. 기능성 융합체를 선별하는 방법은 특정 스트레스 유전자를 유도하는 것으로 공지된 스트레스에 형질 감염체를 노출시키는 것이다. 전술한 임의의 Mu dX 형질감염 프로토콜에 있어서, 스트레스에 노출된 세균 균주는 lac 이외의 다른 모든 유전자가 야생형의 표현형을 나타내는 것이 바람직하다. 스트레스 프로모터-분석가능한 생성물 융합체를 수용하기에 바람직한 균주의 예는 이. 콜리 균주 SF1이다.
스트레스 유전자의 누클레오티드 서열이 알려져 있다면, 폴리머라제 사슬 반응 기법을 이용하여 lacZ 또는 다른 분석가능한 단백질 융합체를 작제할 수 있다. 구체적으로, 먼저 스트레스 유전자의 프로모터 부 중에서 5' 및 3' 말단에 상보적인 프라이머를 합성하고, 이 프라이머를 변성된 전체 세균 DNA와 적절한 조건하에서 하이브리드한 뒤, PCR을 수행한다. 이 방식으로, 서열 결정된 모든 스트레스 프로모터의 클로닝가능한 양을 얻을 수 있다. 스트레스 프로모터 DNA가 일단 얻어지면, lacZ 유전자의 바로 상류에 다중 클로닝 부위를 함유하는 pRS 415 같은 적절한 벡터내에 존재하는 분석가능한 단백질을 암호하는 DNA에 전술한 DNA를 연결시킨다[R. Simons 등, Gene, pp. 85-96 (1987)]. 이 방법들은 당업계에 공지되어 있다.
궁극적으로 특정 스트레스 프로모터-분석가능한 생성물 작제물을 수용시켜 본 발명의 방법 및 키트에 유용하도록 만드는 세균 균주는 단지 이 균주가 비형질 전환된 상태에서 분석가능한 생성물을 합성하지 못하다면 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는, 사용된 균주는 스트레스 프로모터와 상동성이어야만 한다. 또한, 이 균주는 다른 모든 유전자, 특히 스트레스 유전자가 야생형이어야만 한다. 이 방식으로, 스트레스에 적절하게 응답 반응할 수 있는 염색체화된 숙주 스트에스 유전자 외에도, 분석 가능한 생성물을 생성하도록 유도되는 스트레스 프로모터의 또다른 복제물이 제공된다. 바람직한 균주는 본 발명자에 의해 제조되고 하기 기술되는 이. 콜리 SF 1 이다.
본 발명의 키트와 방법에 포함되는 각종 스트레스 프로모터들의 유도율은 비교하기 위하여, 본 발명의 키트와 방법에 사용된 각 스트레스 프로모터-리포터 유전자 융합체 복제물의 개수는 동일한 것이 바람직하다. 이 융합체를 수용하고 있는 플라스미드들은 세포 당 복제물의 개수는 다양할 수 있기 때문에, 복제물의 개수를 동일하게 하기 위한 가장 바람직한 방법은 스트레스 프로모터-리포터 유전자 작제물을 세균 염색체내에 통합시키는 것이다. 이 방식에 의하면, 각 융합체는 단일 복제물로 존재할 것이다.
세균 염색체내로 통합시키기 위한 가장 바람직한 방법은 박테리오파지를 사용하는 것이다. 사용할 수 있는 박테리아파지는 융합체를 함유하는 벡터상에 DNA 2 분절과 상동성인 2 이상의 다른 DNA 영역들을 함유하는 모든 파지이다. 이러한 상동성을 지닌 이중 영역들은 벡터를 수용하는 세포가 파지에 의해 감염될 때 벡터와 파지 사이에 이중 재조합을 일으킨다. 따라서, 벡터가 파지 게놈내로 통합된다. 이런 박테리오파지의 예는 앰피실린 내성 유전자와 β-갈락토시다제에 상동성인 DNA 영역을 함유하는 용근성-결손 파지인 λRS 88 이다.
통합된 융합체를 함유하는 파지는 융합체내의 특정 스트레스 유전자를 유도하는 화합물의 존재하에 배양된 세균층 위에 파지를 접종한 후 리포터 유전자의 형질 발현에 대해 플라크를 분석하여 동정한다. 그 후, 양성 플라크를 분리하고 이 안의 파지를 이용하여 용원성 상태하에서 세균을 감염시킨다. 이 방법에 사용된 파지는 용균성 결손형인 것으로서, 즉, 파지 DNA가 정상적으로 용균 사이클을 유도하는 조건하에서 세균 염색체로부터 이탈할 수 없는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 키트 및 방법에 사용된 각 세균 숙주는 단지 1개 특정 스트레스 프로모터-분석가능한 유전자 생성물 융합체를 수용하고 있는 것이 바람직하다. 이런 양태에서, 한 화합물이 임의의 특정 숙주내에서 분석가능한 유전자 생성물의 형질발현을 유도한다면, 그 화합물에 의해 유발된 특정 종류의 스트레스는 분명하게 확인 할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법 및 키트에 사용될 수 있는 임의의 스트레스 프로모터들이 1 종류 이상의 스트레스에 응답 반응할 수 있다는 것은 당연한 것이다. 예를 들면, sodA 프로모터는 초과산화물 및 금속 킬레이트제에 의해 유도된다.
여러 종류의 스트레스에 응답 반응하는 프로모터가 본 발명의 키트와 방법에 사용될 때, 이 스트레스들 중의 하나에만 응답 반응하는 또다른 프로모터를 수용하는 숙주가 더 사용되는 것이 바람직하다. 이런 방식으로, 화합물에 의해 유발되는 스트레스의 성질은 보다 정확하게 결정될 수 있다. 즉, 초과산화물에 대해서만 응답 반응하는 soi28 프로모터-분석가능한 유전자 생성물 융합체를 수용하는 이. 콜리 숙주를 사용하는 경우에는 sodA 프로모터 융합체를 수용하는 숙주를 함께 사용할 수 있다. 이와 같이 숙주들을 혼합하면 후발 프로모터인 sodA 프로모터의 유도 반응이 초과산화물 형성에 의한 것인지, 아니면 금속 킬레이트화에 의한 것인지를 결정할 수 있다. 가장 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 키트 및 방법은 β-갈락토시다제에 융합된 다음의 프로모터들을 이용한다: soi28, dinD, hag, ada, gyr, katG, nfo, clpB, merR, top, cyd, micF, zwf, groE, katF 및 aniG. 각각의 스트레스 프로모터 융합체들은 다른 숙주의 세균 염색체내로 통합된 단일 복사물로서 존재한다. aniG를 제외한 융합체들은 모두 이. 콜리 균주 SF1 내에 존재하는 것이 바람직하다. aniG 융합체는 에스. 티피뮤리엄의 균주내에 존재하는 것이 바람직하다.
일부 화합물들은 천연 형태일 때는 포유동물에게 독성이 아니나, 간으로 진행된 후에는 독성이 된다고 알려져 있다. 그러므로 본 발명의 또다른 구체예에 따라, 본 발명의 방법과 키트로 시험될 화합물을 S9 간 추출물로 예비 처리한다. S9간 추출물("S9")을 제조하는 방법은 문헌[S. Vennitt 등, "돌연변이원성 시험-실제접근 중에서, S. Vennitt 등, eds., IRL Press, Oxford, England, pp. 52-57 (1984), 이 명세서는 본원에 참고 문헌으로 인용됨]에 기술되어 있다. S9는 실질적으로 저속 원심 분리에 의해 불용성 입자를 제거한 래트 간의 미정제 파쇄물이다. 이 S9를, 포유동물의 간에 의해 정상적으로 수행되는 화합물들의 Ⅰ단계 및 Ⅱ단계 생체변환을 모방하기 위해 NADP를 함유하는 칼륨 완충액 중에서 시험 화합물과 함께 항온처리한다.
본 발명의 방법 및 키트를 사용하여 미공지된 독성 화합물에 대한 분석을 실시하기 전에, 미공지된 화합물을 선별하기 위해 사용되는 각각의 특정 스트레스 프로모터를 유도하는 것으로 공지된 최소한 1종의 화합물, 바람직하게는 3종의 화합물을 사용하여 표준 곡선을 작도하는 것이 바람직하다. 공지된 화학약품은, 각각 유도되는 것으로 공지된 프로모터만이 아니고 모든 프로모터에 대하여 시험되는 것이 보다 바람직하다. 각 화학약품은 충분히 넓은 범위의 농도에 걸쳐서 분석되어 유용한 표준 곡선을 제공해야만 하며, 바람직한 범위는 1 피코몰 내지 1 밀리몰 범위가 바람이다.
표준 곡선이 작도되면, 이 곡선이 내장된 컴퓨터 데이타 베이스를 만든다.
그 다음, 이 데이타 베이스를 사용하여 시험될 화합물의 스트레스 프로모터-유도 프로파일을 표준 곡선 작도시 사용된 독소들의 프로파일과 비교한다. 따라서, 시험되지 않은 임의의 화합물에 대한 결과는 스트레스 프로모터들의 공지된 유도체 인자들과 비교된 상대적인 독성으로 표현된다.
본 발명의 특성 규명 및 독성 측정 방법 각각은 제1 단계로서 전술한 각 세균 숙주들을 별도로 배양하는 단계를 포함한다. 이 숙주들은 대수기 또는 정지기가 되도록 배양해야 한다. 증식은 최소 배지, 예컨대 글루코스 보강된 M9, 또는 LB 중에서, 사용된 세균 균주에 따라 앰피실린이나 테트라사이클린 등의 항생제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 수행할 수 있다. 사용된 증식 온도는 30℃ 내지 37℃로 하고, Mu dX와같은 감온성 파지 형질 감염을 통해 스트레스 프로모터-분석가능한 생성물 융합체가 얻어진다면 낮은 하한치의 온도 범위가 바람직하다. 숙주를 증식시킨 다음, 600nm에서 배양물의 흡광도(OD600)를 통해 세포 밀도를 측정한다.
OD6OO은 약 0.1 내지 0.2 사이가 가장 바람직하다.
이와 같은 초기 증식후, 각 배양물의 분취량에 시험될 화합물을 첨가한다. 초기 시험에는 화합물의 일련의 10배 희석물들을 밀리몰 내지 피코몰 농도의 범위로 사용해야 한다. 또한, 미리 S9 분획과 함께 예비 항온처리한 화합물의 또다른 일련의 희석물을 제조하여 각 배양물의 제2 분획에 첨가한다. 각 배양물의 제3 분획은 화합물에 노출시키지 않고, 세포의 전반적인 증식에 대한 화합물의 효과를 측정하기 위한 대조군 및 분석가능한 유전자 생성물의 기준선을 측정하기 위한 대조군으로서 사용한다. 화합물에 노출시키기 바로 전에 배양물의 OD600을 기록한다.
모든 배양물(대조군 및 노출시킨 군)을 그다음 5분 내지 24시간 범위의 일정 시간동안 정상적인 증식 온도에서 항온처리한다. 독성 화합물이나 시험 화합물에 대한 노출 시간은 약 2 내지 4시간인 것이 보다 바람직하다. 이 부가적인 항온처리 후, 노출된 배양물과 대조용 배양물의 일부를 사용하여 OD600을 측정함으로써 증식을 비교 측정한다. 대조군과 노출된 배양물의 또다른 일부를 사용하여 분석가능한 유전자 생성물의 양을 측정한다. 분석가능한 생성물이 세포질에 위치한다면 특정한 분석법을 실시하기 전에 숙주를 용균시켜야만 한다는 것은 당업자에게는 명백한 것이다. 세균을 용균시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있고 균질화와 같은 기계적 방법; 리소자임으로의 처리와 같은 효소적 방법; 및 톨루엔이나 클로로포름으로의 처리와 같은 세포벽 가용화 방법을 포함한다. 한편, 분석가능한 생성물이 숙주 세포로부터 분비된다면, 분석시 배양액만을 사용해야 한다.
분석가능한 생성물이 세포로부터 일단 방출되면, 이것을 정량할 수 있다.
정량법은 당업계에 공지된 많은 방법들로 수행할 수 있다. 예컨대, 형질 발현 생성물이 효소라면 비색 분석용 기질이 사용될 수 있다. 특정 효소에 대한 적당한 비색 분석용 기질은 당업계에 공지되어 있다. 대안적으로, RIA 또는 ELISA와 같이 특정 항체를 이용하는 분석법이 형질 발현 생성물을 검출하는데 사용될 수 있다. 노던 블롯과 같은 mRNA 양을 검출하는 분석법도 유도 반응을 검출하는데 사용될 수 있다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 형질 발현 생성물인 β-갈락토시다제는 비색 분석용 기질인 o-니트로페닐 갈락토스(ONPG)를 이용함으로써 분석된다. 이 반응은 420 nm 및 550 nm에서 흡광도를 측정하여 분광 분석법으로 정량된다.
사용된 분석법의 성질에 따라, 용균 배양물이나 상청액의 완충액 조건이 조정될 필요가 있다. 따라서, 용균 배양물이나 상청액에 적합한 완충액을 첨가하여 특정 분석법에 대한 최적 조건을 준성한다. 예를 들면, 분석 가능한 생성물을 RIA 또는 ELISA 분석법으로 검출하고자 하는 경우에, 완충액 조건은 중성 pH로 조정하여 항체-항원 복합체 형성을 최대화하고 비특이적인 항체 결합을 최소화한다. 이런 조건들은 당업계에 공지되어 있고, 예로써 50 mM 인산염 완충액, 15 OmM NaCl, pH 7.0의 최종 완충액 조건을 들 수 있다. 분석가능한 생성물이 효소이고 비색분석용 기질 분석법으로 검출되어야 한다면, 완충액 조건은 효소 활성을 최대화하고 기질의 비촉매적 절단을 최소화하도록 최적화 되어야 한다. 이 조건들은 통상적인 것이며, 분석될 효소에 따라 가변적이다.
직접적으로 효소 발현 생성물을 측정하기 위해 비색분석용 기질을 이용하는 분석법에 있어서 (비색분석용 기질을 간접적으로 이용하는 ELISA 분석법과는 반대임), 시간이 활성을 측정할 수 있는 요건이기 때문에 반응 시간은 기록되어야 한다. 따라서, 이 분석법에서, 모든 배양물 중에서 존재하는 형질 발현 생성물과 비색분석용 기질 사이의 반응은 동시에 정지시킬 필요는 없다. 그러나, 임의의 특정 대조용 시료 중의 반응은 상응하는 시험 시료와 동시에 정지될 것이 명백하다. 당업자라면 각종 효소/기질 반응을 정지시키는 방법은 명백히 알고 있다. 특히 다수의 시료들에 있어서 다중 웰 평판 판독기와 같은 장치를 사용하여 반응을 동시에 조사하는 것이 보다 바람직하다. 이런 장치를 이용하면, 흡광도 대 시간으로 플로팅된 곡선이 작도된다. 그 다음, 리포터 유전자 생성물 활성은 시간 경과에 대한 흡광도 변화, 즉 작도된 곡선의 직선부의 기울기로서 표현한다. 이러한 리포터 유전자 생성물의 활성을 측정하는 바람직한 방법을 사용하면 비색분석용 반응을 중지시켜야 하는 필요가 없어진다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에 의하면, 분석가능한 생성물은 β-갈락토시다제이고, 숙주 세포는 클로로포름의 첨가로 용균되며, 분석용 완충액 조건은 0.06M Na2HP04-7H2O, 0.04M NaH2PO4-H2O, 0.O1M KCI, 0.001M mg S04-H2O, 0.05M β-머캅토에탄올, pH 7.0이다. 필요하다면, 이 반응은 Na2CO3의 첨가로 정지시키는 것이 바람직하다.
전술한 측정들로부터 얻어진 데이타를 사용하여 시험 화합물의 농도 대 세포 증식(OD600 측정)의 플롯 및 시험 화합물의 농도 대 스트레스 프로모터 유도량(생성된 분석가능한 생성물의 양이나 속도로 측정)의 플롯을 도시할 수 있다.
첫번째 플롯은 본 발명의 키트 및 방법에 사용된 특정의 형질 전환 숙주가 고농도의 시험 화합물에 노출되면 치명적인 영향을 받을 수 있기 때문에 중요하다. 따라서, 이러한 농도의 시험 화합물 대해서는 스트레스 프로모터의 특이적인 유도를 정확히 판독할 수 없다. 그러나, 세포가 특정한 스트레스 프로모터를 동시적으로 유도함이 없이 사멸된다면, 틀림없이 그 시험 화합물은 독성이지만 상기 특정한 스트레스를 유발시키는 것은 아니다. 이것은 부가 융합체가 시험 화합물에 대해서 시험되어야만 한다는 것을 나타내는 것이다.
개개의 화합물은 독성이지 않지만, 이 비독성 화합물들이 혼합된 혼합물은 사실상 독성일 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 따라서, 본 발명의 키트 및 방법이, 또한 전술한 것과 동일한 방식으로 공지 및 미공지 화합물들의 혼합물이 갖는 강력한 독성을 측정하는데 사용될 수 있다.
또다른 구체예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 독성인 것으로 결정된 화합물에 대한 항독소를 분리하는 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이, 미공지 화합물에 대한 스트레스 프로모터 유도/억제 트로파일을 일단 작도하고, 이 프로파일을 데이타 베이스내의 공지 화합물의 프로파일과 비교한다. 미공지 화합물에 대한 강력한 항독소는 유사한 스트레스 프로모터 유도/억제 프로파일을 갖는 화합물에 공지된 해독제이다. 이런 항독소의 효능을 시험하기 위하여, 미공지 화합물에 의해 유도되거나 억제되는 스트레스 프로모터를 함유하는 숙주들만을 사용하여 스트레스 프로모터 분석법을 반복한다. 이 숙주들은 각각 유도/억제 농도의 미공지 화합물을 첨가하기 전에 다양한 농도의 제안된 항독소와 예비 배양한다. 제안된 항독소와의 예비 배양이 미공지 화합물의 효과를 감소시키거나 제거한다면, 그 항독소는 효과적인 것이다.
마지막으로, 본 발명은 활성 약물의 디자인을 개선하는 방법을 제공한다. 이 구체예에 따르면, 먼저 신약을 전술한 임의의 키트와 방법으로 시험한 다음, 그것의 독성을 측정한다. 상기 방법과 키트에 의해 제공된 정보는 약물의 독성이 갖는 세 포기작을 나타낸다. 그 다음, 나타난 특정한 세포 손상을 유발하는 것으로 추정되는 약물의 부분을 그 부분이 약물의 약학적 활성에 작용하는 역할에 따라 적절하게 변형시키거나 제거할 수 있다. 그 결과, 변형된 약물을 본 발명의 키트와 방법으로 재시험하여 약물의 독성이 충분하게 감소되거나 제거되었는지를 측정한다. 이 방법으로 개선되고 변형된 약물도 또한 본 발명의 영역에 속한다.
본원에 기술되는 본 발명을 보다 충분히 이해시키기 위해 다음의 실시예들을 예시한다. 물론 이 실시예들은 단지 예시용이며 어떤 방식으로 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
이하 기술되는 임의의 기본적인 분자 생물학 기법에 대해서는 상세히 설명하지 않았다. 이 기법들은 당업계에 공기되어 있고 본원에 참고 문헌으로 인용된 문헌[Molecular Cloning-A Laboratory Manual Second Edition, J. Sambrook 등, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)]에 기술되어 있다.
실시예 1
스트레스 프로모터-lacZ 융합체 형성을 위한 파지 Mu dX 의 사용
Mu dX 파지는 앰피실린 내성 유전자와 lacZ 및 lacY 유전자를 모두 운반한다. 이 파지는 이것이 운반하는 lacZ 및 lacY 유전자를, 몇몇 형질도입체에서 삽입이 일어난 유전자 또는 오페론의 프로모터 조절하에 위치시키는 방식으로 유전자 또는 오페론내에 무작위로 삽입시킨다. 이러한 생산적 삽입중 몇몇은 스트레스-유도성 유전자내에서도 일어날 것이다. 이런 삽입체는 스트레스 프로모터를 유도하는 조건하에서 lacZ 의 발현을 증가 또는 감소시키는 앰피실린 내성 형질도입체에 대해 분석함으로써 선별하였다. Mu dX 파지는 다소 감온성 이어서, 모든 배양물은 37℃가 아닌 30℃에서 증식시켰다.
1. Mu dK 용균물의 제조
Mu dX 용균물을 제조하기 위해, 참고로 본 명세서에 인용한 문헌(참조 : J.H. Krueger 등, Meth. Enzymol., 100, pp. 501-09(1983)]에 기술된 방법을 사용하였다. 구체적으로서, 염색체내에 Mu dX 박테리오파지 및 MuC 감온성 헬퍼 박테리오파지가 둘다 삽입되어 있는 이. 콜리 MAL103 세포를 28℃ 의 LB+앰피실핀(70 ㎍/㎖)내에서 밀도가 108세포수/㎖ 가 될 때까지 배양하였다.
그 다음, 증식 온도를 43℃로 변화시켜 20분 동안 배양한 뒤, 다시 37℃로 변화시켜 60분 동안 또는 용균이 명백하게 나타낼 때까지 배양하였다. 1% 부피/부피 클로로포름을 첨가하고 실온에서 추가로 5분 동안 배양하였다. 해양물을 8,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 멸균 튜브에 저장하고 펠렛은 신선한 LB에 재현탁시켰다. 현탁액을 8,000 rpm에서 5분 동안 재원심분리하고, 이어서 생성되는 상청액을 최초 상청액에 첨가한 뒤, 1% 부피/부피 클로로포름중에서 4℃하 에 저장하였다.
Ⅱ. Mu dK를 이용한 공지된 스트레스 프로모터와 lacZ 융합체의 작제
스트레스 유전자가 이미 동정되고 플라스미드상에 클로닝된 경우, 하기 기술을 사용하여 스트레스 프로모터-lacZ 융합체를 작제하였다. 먼저, 플라스미드를 운반하는 이. 콜리 균주는 Amps 이어야 하며, 플라스미드는 AmpR 이외의 다른 약제 내성 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 플라스미드를 운반하는 세포를 LB 내에서 30℃에서 109 세포/㎖의 농도까지 배양하였다. 세포를 원심 분리하고 최초 LB 부피의 1/2량 내에 펠렛을 재현탁시켰다. 최종 농도 2.5 mM로 CaCl2를 첨가하고 얼음상에 세포를 저장하였다.
전술한 제I부에 기재된 파지 용균물을 25 mM mgSO4, 1 mM CaC12로 연속 희석한 일련의 10배 희석액물을 4개 제조하였다. 각각의 파지 희석물 100㎕와 이. 콜리 세포 100㎕를 혼합하고 30℃에서 20분 동안 배양하였다. 세포를 원심 분리하고 상청액을 폐기하였다. 펠렛은 LB 2 ㎖ 내에 재현탁시키고 30℃에서 100분 동안 배양하였다. 배양물(최종 농도 15 ㎍/㎖로)에 플로람페니콜을 첨가하고 30℃에서 추가로 3시간 동안 배양하였다. 그 다음 플라스미드 미니-프렙(mini-prep)을 수행하였다. 그 결과 생성된 플라스미드는 미국, 메릴랜드, 베데스다에 소재하는 비알엘의 시판품인 셀-포레이터(일렉트로포레이션 장치)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 lac-, Amps 이. 콜리 균주를 형질 전환시키는데 사용하였다. 최초 플라스미드가 항생제 내성 유전자를 포함하는 경우, 임의로 적당한 항생제를 포함하는 LB + 앰피실린(70 ㎍/㎖) + X-gal(40 ㎍/㎖) 평판상에 형질전환체를 평판 배양하였다. 30℃에서 밤새 형질전환체를 배양한 후, 100개의 청색 콜로니를 채취하여, 상기와 동일한 배지를 함유하는 2개의 평판에 재도말하였으며, 이 중 1개의 평판에는 플라스미드 상에 함유된 특정 스트레스 유전자를 유도하거나 억제시키는 시약을 더 첨가하였다.
첨가한 시약이 스트레스 유전자의 유도를 유발하는 경우, 유도제를 함유하는 평판상에서 더 짙은 청색이 되는 콜로니가 lacZ 유전자와 클로닝된 스트레스 유전자의 프로모터 사이에 융합체를 포함하는 것으로 추정하였다. 역으로, 시약이 스트레스 유전자를 억제하는 경우에는, 시약-함유 평판상에서 현저히 밝은 청색이거나 백색인 콜로니를 목적하는 작제물을 포함하는 것으로서 선별했다. 이런 작제물의 확인은 하기하는 β-갈락토시다제 분석을 사용하여 이루어졌다.
Ⅲ. Mu dK를 이용한 미지의 스트레스 프로모터와 lacZ 융합체를 함유하는 라이브러리의 작제
하기 기술되는 2가진 방법을 사용하여 지금까지 미공지된 스트레스 프로모터를 발견할 수 있다.
4. 염색체 라이브러리
전술한 제Ⅱ부에 기술한 바와 같이, 감염 다중도가 0.1 내지 0.2인 파지 Mu dX로 전체 lac 오페론이 결여된 대수적으로 증식하는 이. 콜리 균주의 배양물을 감염시켰다. 30℃에서 LB + 앰기실린(70 ㎍/㎖) 평판상에서 성장시킴으로써 피형질도입체를 선별하였다. 이 피형질도입체를, 일정한 스트레스를 유도하는 제제의 존재 또는 부재하의 LB + X-gal(40 ㎍/㎖) 평판상으로 레플리카 평판 복사를 수행하고, 그 평판을 30℃에서 밤새 배양하였다. 시약 부재시와 비교하여 존재시에 색도가 현저히 다른 콜로니를 선별하였다.
선택한 콜소니의 배양물을 사용하여 후술하는 바와 같이 β-갈락토시다제 활성의 유도력 또는 억제력에 대해 분석하였다.
B. 플라스미드 라이브러리
이 방법은 전술한 것과 유사하나 Mu dX 파지를 스트레스 유전자에 삽입시켜 그 유전자를 불활성화시킴으로써 어떤 잠재적 치사성도 나타나지 못하게 하였다.
구체적으로, 플라스미드 pKT218(Amps,TetR)믄 플라스미드내 단일 부위를 절단하는 PStⅠ을 사용하여 완전히 분해하였다. 이 시료를 그다음 페놀/클로로포름으로 불활성화시키고, DNA는 아세트산 나트륨/EtOH를 사용하여 침전시켰다. 그 다음 벡터를 세균 알칼리성 포스파타제로 처리하여 자가-어닐링 (self-annealing)을 방지하였다.
다른 모든면에서는 야생형이나 lac 오페론 전체가 결여된 이. 콜리 균주로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 그 다음 분리된 DNA를 PstⅠ로 부분적으로 분해시켰다. 분해 후, 시료를 페놀/클로로포름으로 처리하여 효소를 불활성화시켰다. 제한 분해된 DNA는 아세트산나트륨/EtOH 법을 사용하여 침전시켰다.
분해된 염색체 DNA를 상응하게 분해한 벡터에 연결하였다. 연결 혼합물을 사용하여 일렉트로포세이션으로 이. 콜리 lac- 감응 세포를 형질전환시켰다. 형질 전환체를 LB + 테트라싸이클린중에서 30℃ 하에 정지기에 도달할 때까지 증식시켰다. 클로람페니콜(최종 농도 15 ㎍/㎖)을 첨가하고 배양물을 30℃에서 3시간 동안 더 배양하였다. 배양물로부터 플라스미드를 분리하고 일렉트로포레이션 기술을 사용하여 lac-, Tets 균주를 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환체를 LB + 테트라싸이클린내에서 대수기에 이를 때까지 증식하였다.
전술한 바와 같이, 감염 다중도가 0.1 내지 0.2인 Mu dX를 사용하여 형질 전환체는 감염시켰다. 피형질도입체를 LB + 앰피실린(70 ㎍/㎖) + 테트라 싸이클린 평판상에 도말하고 30℃에서 밤새 증식시켰다. 각각의 콜로니를 소정의 스트레스를 유도하는 시약의 존재 또는 부재하의 X-gal(40 ㎍/㎖) 평판상에 레플리카 평판 복사를 수행하고, 그 평판을 30℃에서 밤새 배양하였다. 시약 부재시와 비교하여 시약 존재시에 색이 현저하게 달라지는 콜로니를 선별하였다.
선택한 콜로니의 배양물을 사용하여 후술하는 바와 같이 β-갈락토시다제의 유도력 또는 억제력에 대해 분석하였다.
실시예 2
pRS415를 이용한 스트레스 프로모터-LacZ 융합체인 작제
Ⅰ. pRS415를 이용한 미지의 스트레스 프로모터를 지닌 스트레스 프로모터-LacZ 융합체의 작제
플라스미드 pRS415 는 lacZ 유전자 및 이 유전자의 상부에 인접한 다중 클로닝 부위를 포함한다. 이것은 본 명세서에 참고 인용한 문헌[참조 : R. Simons 등, Gene, pp 85-96 (1987)]에 기술되어 있다.
pRS415 내의 SmaⅠ 부위를 이용하여, 임의의 제한 효소로 절단하고 엑소뉴클레아제로 평활 말단화한 염색체 DNA를 산탄법으로 클로닝하였다. 후술하는 모든 기술은 분자 생물학 기술 분야에서 사용되는 표준 방법이며, 문헌[참조 : Molecular Cloning-A Laboratory Manual Second Edition, J. Sambrook 등 eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)]에 기술되어 있다.
구체적으로, 다른 모든면에서는 야생형이나 lac 오페론 전체가 결여된 이. 콜리 균주로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA를 4 개의 염기쌍 표적을 절단하는 임의의 제한 효소를 사용하여 부분적으로 분해하였다. 분해후, 시료를 페놀/클로로포름으로 처리하여 효소를 불활성화시켰다. 제한된 DNA는 아세트산나트륨/EtOH 법을 사용하여 침전시켰다. 필요하다면 시료를 S1 뉴클레아제를 사용하여 분해시켜 평활 말단을 형성한 후, 아세트산나트륨/ EtOH를 사용하여 재침전시켰다.
동시에, pRS415는 SmaⅠ을 사용하여 분해하였다. 시료를 페놀/클로로포름으로 불활성화시키고, 아세트산나트륨/EtOH를 사용하여 DNA를 침전시켰다. 벡터는 세균 알칼리성 포스파타제로 처리하여 자가-어닐링(self annealing)을 방지하였다.
분해한 염색체 DNA를 상응하게 분해한 벡터에 결합시켰다. 결합 혼합물을 사용하고, 셀-포레이터(CELL-PORATOR) 장치을 사용하여 일렉트로포레이션으로 이. 콜리 lac- 감응 세포를 형질 전환시켰다. 형질전환 후, 형질전환체를 희석하고, 1평판당 1000 콜로니 정도의 밀도로 LB + 앰피실린(70 ㎍/㎖) + 테트라 싸이클린 + X-gal(40 ㎍/㎖) 평판에 도달하였다. 37℃에서 밤새 증식시킨 후, 이 평판을 이것과 동일한 배지와 목적하는 스트레스를 생산하는 화합물을 첨가 또는 첨가하지 않은 2 개의 평판상에 레플리카 평판 복제하였다. pRS415 백터내에 삽입된, 유도성 프로모터를 포함하는 형질전환체는 대조용 평판에 비해 스트레스 화합물-함유 평판상에서 더 짙은 청색이 될 것이다. 역으로, 스트레스에 의해 억제되는 프로모터에 lacZ 융합체를 함유하는 형질전환체는 화합물-함유 평판상에서 더 밝은 청색이나 또는 백색이 될 것이다.
유도력 또는 억제력은 후술하는 β-갈락토시다제 분석법중의 하나를 사용하고, 스트레스-유도성 화합물의 농도를 변화시켜 개개의 양성 클론에 대하여 확인하였다.
Ⅱ. pRS415를 이용한 공지의 스트레스 프로모터를 지닌 스트레스 프로모터-LacZ 융합체의 작제
A. PCR 증폭을 이용한 공지 스트레스 프로모터 DNA 단편의 제조
스트레스 유전자의 서열이 이용 가능하고 프로모터 부위가 밝혀졌을 경우, PCR 방법을 이용하여 스트레스 프로모터를 증폭시킨다. 구체적으로, 스트레스 프로모터의 5' 및 3' 말단에 상보적인 1쌍의 프라이머를 제조하였다. 증폭될 부위는 보통 300 내지 800 염기쌍 범위이고, 프라이머의 길이는 약 15 내지 25 뉴클레오티드 범위이다.
일단 프라임러가 합성되면, 이것을 공지된 PCR 조건[참조 : Molecular Cloning-A Laboratory Manual Second Edition, J. Sambrook 등, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Press, New York (1989)]을 이용하여 게놈 DNA에 하이브리드시킨다. 구체적으로, PCR 반응은 하기 성분을 포함한다 :
게놈 DNA(0.5 ㎍), dNTPs(각각 200 μM), 프라이머(각각 30 pmol) 및 Taq 폴리머라제(2.5 유니트). 일반적으로, PCR 은 30 싸이클을 수행하며, 각 싸이클은 1분 동안 95℃로 가열, 15초 동안 54℃로 냉각 및 3분 동안 73℃로 재가결하는 것을 포함한다. 최종 싸이클의 마지막 단계에서는 3분 대신에 10분 동안 73℃로 가열한다.
PCR 반응이 완료된 후, 임의의 점착 말단을 평활말단화하기 위해 클리노우(Klenow) 단편를 첨가하였다.
B. pRS415 내에 존재하는 LacZ 유전자에 대한 공지의 스트레스 프로모터 DNA 단편의 융합
스트레스 프로모터를 함유하는 증폭된 DNA 단편을 정제한 후, 세균 알칼리성 포스파타제로 처리한 SmaⅠ-절단된 pRS415에 결합시켰. 결합 혼합물을 이용하여 일렉트로포레이션으로 의해 lac-, Amps 이. 콜리 세포를 형질 전환시켰다. 형질전환체를 LB + 앰피실린(70 ㎍/㎖) + X-gal(40 ㎍/㎖) 평판상에서 배양했다. 담청색 또는 암청색인 콜로니를 선별하고 2 개의 평판상에 레플리카 평판 복사했다. 1 개의 레플리카 평판은 LB + 앰피실린(70 ㎍/㎖) + X-gal(40 ㎍/㎖)을 포함하였다. 다른 1 개는 상기와 동일 성분에 특정 프로모터를 유도 또는 억제하는 것으로 공지된 화합물을 더 포함하였다. 스트레스-유도된 프로모터인 경우에 30℃에서 밤새 증식시킨 후 화합물-함유 평판상에서 더 짙은 청색이 되는 콜로니는 목적하는 프로모터-lacZ 융합체를 포함하는 것이다. 스트레스-억제된 프로 모터인 경우에, 화합물-함유 평판상에서 밝은 청색 또는 백색인 콜로니는 적당한 융합체를 포함하는 것이다.
실시예 3
이. 콜리 균주 SF1 의 작제
SF1은 이. 콜리 K12 균주 GC4468의 유도체이다. 모균주는 F-, thi, rpsL,(lac-pro)169 유전자형을 갖는다. thi 돌연변이로 인해, 모균주는 증식에 티아민을 필요로 한다. 본 발명의 바람직한 숙주는 lac을 제외하고 모든 유전자에 대해 야생형이어야 한다. 그러므로, M9 + 글루코스 배지를 함유하는 평판상에 GC4468 세포를 약 1010개 도말함으로써 SF1을 작제하였다. 그런 배지에서 성장 된 콜로니는 틀림없이 thi+유전자형으로 복귀변이된 것이다. 이런 콜로니를 선별하여 SF1 이라 칭하였다.
균주 SF1 시조는 1992년 6월 26일자로 미국 메릴랜드 20852, 록빌, 파아크런 드라이브 12301에 소재하는 미국 모식군 배양 수집소("ATCC")에 기탁하고 수탁 번호 55337을 부여받았다.
실시예 4
숙주 균주들 간에 스트레스 프로모터-LacZ 융합체를 이동시키기 위한 P1 용균물 방법
이 방법은 한 숙주 균주로부터 다른 숙주 균주로 스트레스 프로모터-lacZ 융합체를 이동시키는 것이다. 이 방법에서, 진단 키트내의 모든 스트레스 프로모터-lacZ 융합체는 동일한 숙주 세포내로 유입될 수 있다. 이 기술을 사용하여 모든 스트레스 프로모터기-lacZ 융합체를 균주 SF1 내에 위치시켰다.
P1 파지는 자신의 내인성 엔도뉴클레아제를 사용하여 숙주 세포 DNA를 무작위로 닉(nick) 절단하고, 이어서 생성되는 DNA 단편을 비리온내로 삽입시킨다. 이와같이 생성, 삽입된 임의의 DNA 단편은 목적하는 스트레스 프로모터-lacZ 융합체를 포함할 것이다.
P1 용균물은 하기와 같이 제조하였다. 플라스미드이나 또는 염색체내에 목적하는 스트레스 프로모터-lacZ 융합체를 함유하는 세포를 LB 중에서 30℃ 하에 초기 정지기까지 밤새 증식시켰다. 이 배양물 50 ㎕를 0.4% 글루코스 및 5 mM CaCl2를 함유하는 5 ㎖ LB 내에 접종하고 30℃에서 30분 동안 배양하였다. 다음에, 배양물에 P1 파지 0.1 ㎖(약 5×108 pfu/㎖)를 첨가하고, 세포 용해가 명백해질 때까지 2 내지 4시간 동안 계속 배양하였다. 클로로포름 0.1 ㎖를 첨가하고, 10초 동안 볼텍스한 뒤 원심 분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 상청액에 추가로 클로로포름 0.1 ㎖을 첨가하여 4℃에서 보관하였다.
그 다음, 수용체 균주 SF1의 형질 도입을 실행하였다. SF1을 LB 내에서 초기 정지기까지 증식시켰다. 세포을 원심 분리하고, 5 mM CaCl2및 10 mM mgSO42.5 ㎖내에 재현탁시켰다. 세포 현탁액 0.1 ㎖를 10 ㎕ 또는 100 ㎕의 P1 용균물과 각 튜브에서 혼합하였다. 또한, 대조용으로 단지 100 ㎕의 세포를 가진 튜브와 단지 100 ㎕의 P1 용균물을 가진 튜브를 사용하였다. 이들 튜브를 미교반 상태에서 정확히 20분 동안 30℃에서 배양하였다. 각각의 튜브에 1 M 의 구연산 나트륨 0.1 ㎖를 첨가하고, 원심 분리하여 세포클 펠렛화하였다. 스트레스 프로모터가 특정 화합물에 의해 유도되는 경우에는, 세포를 LB 50 ㎕ 내에 재현탁시키고, LB + 앰피실린(70 ㎍/㎖) + X-gal(40 ㎍/㎖) + 화합물상에서 평판 배양했다. 30℃에서 밤새 증식시킨 후 청색인 콜로니는 스트레스 프로모터-lacZ 융합체를 함유하였다. 스트레스 프로모터가 특정 화합물에 의해 억제되는 경우에는, 세포를 LB 50 ㎕에 재현낙시키고, LB + 앰피실린(70 ㎕/㎖) + X-gal(40 ㎕/㎖) 상에서 평판 배양했다. 청색 콜로니를 선별하고, 상기와 동일 배지나 또는 동일 배지와 억제 화합물의 혼합 배지 상에서 레플리카 평판 복사시켰다. 이 화합물-함유 평판상에서 밝은 청색이거나 백색인 콜로니는 목적하는 융합체를 포함하는 것이다.
실시예 5
독소-유도성 β-갈락토시다제 분석
다양한 화합물에 의해 유도된 스트레스 프로모터-결합된 β-갈락토시다제 발현의 변화를 측정하기 위해 동일한 분석법을 변형시킨 2가지 변형법을 사용하였다.
제1 분석법은 작은 시험관내에서 수행하였다. 스트레스 프로모터-lacZ 유전자 융합체를 함유하는 이. 콜리 숙주(들)를 앰피실린 70 ㎍/㎖로 보충된 LB 배지 또는 앰피실린 70 ㎍/㎖로 보충된 M9 + G 배지[H2O 180 ㎖, 10×M9 염(10×M9 염 = Na2HP0460 g, KH2P0430 g, NaCl 5 g, NH4Cl 10 g/ℓ) 20 ㎖, 40% 글루코스 2 ㎖, 1 M mgS040.4 ㎖, 1 M CaCl220 ㎕]내에서 교반 하면서 30℃에서 각각 하룻밤 증식시켰다. 다음날 아침, 각각의 배양물 1 방울을 각각 새 배지 1 ㎖를 포함하는 일련의 튜브내에 희석하였다. 이것으로 각 숙주에 대하여 일정 농도 범위의 화합물을 시험할 수 있었다. 그 다음, 세포를 600 nm에서의 광학 밀도(OD600)가 0.1 내지 0.2에 이를 때까지 30℃에서 증식시켰다.
이 시점에서, 각 스트레스 프로모터 함유 숙주가 들어 있는 1개의 튜브를 얼음상에 배치시키고 화합물을 첨가하기 전에 OD600을 측정하였다. 각각의 스트레스 프로모터-함유 숙주가 들어 있는 다른 튜브를 2 그룹으로 분리하여 한 그룹에는 검사할 화합물(보통 1 pM에서 1 mM까지 10배 증가치씩 첨가하고, 다른 그룹에는 화합물을 첨가하지 않았다. 화합물을 첨가하지 않은 튜브들은 세포 증식에 대한 상기 화합물 효과의 대조군과 β-갈락토시다제 발현 측정의 기준치로서 작용하였다.
배양물을 30℃에서 2시간 더 배양하였다. 각각의 배양물의 분취량 0.5 ㎖을 사용하여 OD600를 측정하였다. (OD600이 너무 높아 정확한 판독이 어려을 경우, 분취량 0.5 ㎖을 동일 부피의 새로운 배양 배지로 희석하여 그 시료의 OD600을 재 판독하고 판독값을 2배로 한다.) 각각의 해양물로부터 200 ㎕를 피펫으로 취하여, Z 완충 용액(Na2HP04-7H2O 16.1 g, NaH2P04-H2O 5.5 g, KCl 0.75 g, mg S04-7H2O 0.246 g, β-머캅토에탄올 2.7 ㎖/L, pH 7.0) 800 ㎕ 내로 투입하였다. 여기에 톨루엔 2방울을 적가하고, 10초 동안 배양액을 볼텍스하였다. 그 다음, Z 완충 용액을 더 첨가하여 최종 부피를 2 ㎖로 만들었다. 톨루엔/Z-완충 처리된 시료를 37℃ 수조에서 40분 동안 배양하였다. 시료를 28℃로 예열된 가열 블록내에 5분 동안 방치시켰다. 비색 반응을 개시하기 위해, 반응 시간을 정확히 기록하면서, o-니트로페닐 갈락토오즈(ONPG ; Z 완충 용액내 4 ㎎/㎖) 200 ㎕를 첨가하였다. 임의의 특정 시료 튜브가 연황색으로 변화된 경우에는, Na2CO30.5 ㎖을 첨가하여 반응을 정지시킬 뿐 아니라 상응하는 대조용 시료내의 반응도 정지지키고, ONPG 첨가에서부터 Na2CO3첨가까지의 정확한 경과 시간을 기록했다. 이 반응 시료와 대조군을 OD420및 OD550에서 분광 광도계로 판독하였다.
활성 유니트는 하기 식을 사용하여 계산했다.
상기 식에서, 시간은 ONPG 첨가시부터 Na2C03로 반응을 정지시킬 때 까지 경과된 시간(분)이며 ; 배양 부피는 분석에 사용된 부피(상기의 경우 0.2 ㎖)이며 ; OD420및 OD550은 독소 시료 및 대조용 시료 사이의 OD 값의 차이이며 ; 그리고 OD600은 배양후 독소-처리한 배양물로부터 수득한 판독값이다.
제2 유형의 분석법은 96 웰 미량 역가 평판에서 수행하였다. 이 분석에서는, 적당한 이. 콜리 숙주를 M9+G 배지 또는 LB 배지내에서 각각 30℃에서 밤새 증식시켰다. 어느 경우이든지, 배지는 앰피실린 70 ㎍/㎖로 보충하였다. 다음 날 세포를 새 배지로 20배 희석하고 OD600이 0.2 내지 0,4에 이를 때까지 30℃에서 증식시켰다. 각각의 숙주 세포 50 ㎕를 멸군한 96-웰 미량 역가 평판내의 2줄의 웰내에 피펫으로 투입하였다. 한줄에서는 β-갈락토시다제 발현에 대한 시험 화합물의 효과를 측정하였다. 나머지 한줄에서는 세포 증식에 대한 시험 화합물의 효과를 측정하였다.
검사할 화합물을 배양 배지로 연속 희석한 일련의 10배 희석액을 제조하고, 각각의 희석물 50 ㎕를 각 줄의 세포중에 2번에서 9번까지의 웰내의 세포에 첨가하였다(즉, 2번 웰에는 완전-농도의 화합물이 주입되고, 3번 웰에는 화합물의 1:10 희석물, 4번 웰에는 1:100 희석물 등이 주입된다). 각줄의 1번 웰내의 세포에는 단지 배지 50 ㎕만을 주입하였다. 모든 웰의 OD600측정은 시험 화합물에 의한 것으로 추정되는 임의의 흡광도를 평가하기 위해 수행하였다. 세포를 적당히 교반하면서 30℃에서 90분 동안 배양하였다. 배양후, 모든 웰의 OD600측정을 수행하였고, 1번 줄의 각 웰에는 클로로포름 1 방울과 1% SDS 10 ㎕를 첨가하였다. 1번 줄의 각 웰에는 Z 완충 용액 100 ㎕를 첨가하고 30℃에서 20분 동안 배양하였다.
그 다음, ONPG(Z 완충 용액내 4 ㎎/㎖) 40 ㎕를 1번 줄의 각 웰에 첨가 하고, 30℃에서 계속 항온처리한 뒤, 반응 시간을 측정하기 시작했다. 2번 줄의 세포는 계속 증식시켜, 보다 장시간에 걸친 세포 증식에 대한 시험 화합물의 효과를 확인하였다. ONPG를 주입한 웰 중에 임의의 웰에서 황색이 발색되면, 1 M Na2C03500 ㎕를 첨가하여 1번 줄에 있는 모든 웰내의 반응을 정지시키고, 시간을 주의깊게 기록하였다. 1번 줄에 있는 모든 웰의 0D420및 OD550을 판독하고 전술한 식으로 활성 유니트를 측정하였다. 2번 줄에 있는 세포는 최초 90분 배양 후 추가 90분 동안 더 증식시켰다. OD600측정은 세포 증식을 조사하기 위해 30분 마다 수행하였다.
스트레스 프로모터-조절된 β-갈락토시다제 발현의 억제가 분석되는 경우에는 동일안 2가지 분석법을 이용하였다. 단지 차이는 화합물-함유 시료 이전에 대조용 시료내에서 황색이 발색된다는 점이다. 일단 대조용 웰에서 황색이 발색되면, 대조용 및 화합물-함유 시료 둘 모두의 반응을 동시에 정지시켰다.
시험된 각 용량의 화합물 투여량에 대하여 β-갈락토시다제 활성 유니트 및 배양물 OD600을 플로팅하였다 이 플롯을 이용하여 화합물의 LD50을 결정하여 또한 이들 플롯은 특정 프로모터를 유도하지 못함에도 불구하고 (β-갈락토시다제 발현의 유도/억제하지 못함), 시험 화합물이 독성(화합물의 농도가 증가함에 따라 OD600이 감소함에 의해)임을 나타낼 수 있다.
실시예 6
특정 스트레스 프로모터-lacZ 융합체의 작제
1. sodA
다니엘 투아티 박사로부터 sodA-lacZ 융합 유전자를 얻었다. 그는 전술한 실시예 1, 제 Ⅲ 부에 기재한 파지 Mu dX 염색체 무작위 삽입 기술을 사용하여 융합체를 형성시켰다. 피형질도입체는 파라콰트의 존재하에 β-갈락토시다제 발현의 특이적 유도 반응으로 선별하였다. 본 발명자는 실시예 3에 기재한 바와 같이 P1-매개의 형질 도입법으로 sodA-lacZ 융합체를 균주 SF1 내로 도입시켰다.
sodA 의 서열은 공지되어 있다[참조:D, Touati, J. Bacteriol., 170, pp. 2511-20(1988) ; 및 H. M. Hassan 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, pp. 3217-21 (1992), 참고로 본 명세서에 인용함]. 그러므로, sodA-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기재한 PCR 기술 및 프라이머 5'-ACGAAAAGTACGGCATTGAT-3' [서열 번호 :1] 및 5-GCTCATATTCATCTCCAGTA-3' [서열 번호 : 2]를 사용하여 작제할 수 있다. 목적하는 융합체를 포함하는 형질전환체는 파라콰트 또는 금속 킬레이터의 존재하에 β-갈락토시다제 발현의 유도성으로 동정하였다.
Ⅱ. soi28
soi28-lacZ 융합체는 전술한 실시예 1, 제 Ⅲ에 기재한 무작위 Mu dX 파지 염색체 삽입 기술을 사용하여 작제하였다. 이 작제법은 참고로 본 명세서에 인용한 문헌[ 참조 : T. Kogoma 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 4799-803 (1988)]에 기술되어 있다. 티. 코고마 등의 문헌(상기 문헌 참조)에서 기술된 바와 같이, 피형질도입체는 파라콰트로 유도시켰을 때 β-갈락토시다제를 발현하는 성질로 선별하였다.
대안적으로, soi28-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅲ부 에 기술한 PCR 기술 및 프라이머:5'-GCTATGTGTGTGATGTGAGC-3'[서열 번호 : 3] 및 5'-TGATGACAGATGTCGCCCCA-3'[서열 번호 : 4]를 사용하여 제조할 수 있다. 목적하는 융합체는 파라콰트 존재하에 β-갈락토시다제 발현의 유도성으로 동정하였다.
Ⅲ. katF
katF 유전자는 참고로 본 명세서에 인용된 문헌[참조 : P. C. Loewen 등, J. Baceriol., 162, pp. 661-67 (1985)]에 개시되어 있다. katF 유전자는 과산화수소-유도성 카탈라제 활성을 암호한다. katF-lacZ 융합체는 실시예 1, 제 Ⅱ부에서 기재한 바와 같이 플라스미드상에 클로닝된 katF 유전자내로 Mu dX를 삽입시켜 작제하였다.
대안적으로, katF-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술 및 프라이머:5'-CAGGTGCGTTGTAGTGAGTT-3'[서열 번호 : 5] 및 5'-CAATAAACGAGATAACTCTCC-3' [서열 번호 : 6]를 사용하여 작제하였다. 작제물을 페놀산 또는 다른 약 유기산으로 β-갈락토시다제 발현의 유도성에 대해 시험하였다.
Ⅳ. katG
katG 유전자는 문헌[P. C. Loewen 등, J. Bacteriol., 상기 문헌 참조]에 기술되어 있다. katG-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술된 PCR 기술 및 프라이머 : 5'-AAGCTTAATTAAGATCAATTTG-3'[서열 번호 : 7] 및 5'-GCCGCAGAAAGCGGTTCGCC-3' [서열 번호 : 8 ]를 사용하여 작제할 수 있다. 목적하는 융합체를 함유하는 형질전환체는 H2O2 존재하에 β-갈락토시다제의 유도성으로 동정하였다.
Ⅴ. ahP
ahP 유전자의 클로닝 및 서열 결정은 참고로 본 명세서에 인용한 문헌 [참조 : G. Storz 등, J. Bacteriol., 171, pp. 2049-55(1989) ; 및 L. 4. Tartag1ia 등, J. Mol. Biol., 210, pp. 709-19(1989)]에 기술되어 있다. ahs-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술 및 프라이머 : 5'-ATCGGGTTGTTAGTTAACGC-3' [서열 번호 : 9] 및 5'-CTATACTTCCTCCGTGTTTTCG-3' [서열 번호 : 10]를 사용하여 작제할 수 있다. 목적하는 융합체는 쿠멘 히드로과산화물 또는 tert-부틸 히드로과산화물의 존재하에 β-갈락토시다제 발현의 유도력에 의해 검출하였다.
aha-lacZ 융합체를 본 발명의 방법 및 키트에 사용하는 경우, 상기 작제물은 야생형 이. 콜리 및 지방산을 합성 또는 분해할 수 없는 이 콜리의 돌연변이 균주(fabB, fadE 균주) 둘 모두에 존재해야 한다. 돌연변이 균주는 지질 과산화를 야기하는 화합물을 동정할 수 있는 능력을 제공한다. 리놀렌산 및 리놀레산 같은 과산화-민감성, 포유 동물 세포-특이적 지방산은 이 지방산을 함유하는 배지내에서 균주를 증식시킴으로써 그 균주의 세균 막내로 삽입시킬 수 있다. 돌연변이 균주의 형질전환체는 화합물에 의해 β-갈락토시다제를 발현하도록 유도되나, 야생형 형질전환체는 유도되지 않는 경우, 상기 당해의 화합물은 지질 과산화를 유발시켜야만 한다.
aha-lacZ 융합 작제물을 최초 균주로부터 다른 균주로 이동시키는 방법은 실시예 3에 기술한 P1 용균물 방법으로 실행할 수 있다.
Vl. nfo
nfo 유전자는 핵산의 이미다졸환을 파괴하는 산화적 손상에 특이적인 DNA 수복 효소를 암호한다. 이것은 초과산화물 라디칼 형성을 유발시키는 것과 같은 산화 환원 반응 활성제에 의해 유도된다. nfo 유전자는 참고로 본 명세서에 인용한 문헌[참조 : R, Cunningham 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, pp. 474-78(1985)]에 기술되어 있다. nfo-lacZ 작제물은 본 명세서에 참고 인용한 문헌[참조 : S. Saporito 등, J. Bacteriol., 170, pp. 5141-45 (1988)]에 기술 된 바와 같이 제조되었다. 본 발명자는 이 작제물을 리차드 커닝햄 박사에게 얻었다.
nfo-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술 및 프라이머 : 5'-CATCGCATAAACCACTACAT-3' [서열 번호 : 11] 및 5'-GTTACTGCCCTGACCGGCGG-3' [서열 번호 : 12]를 사용하여 작제할 수 있다. 융합체는 파라콰트 존재하에서 β-갈락토시다제 발현의 유도성으로 선별하였다.
VⅡ. sdh
sdh 유전자의 발현은 산소 결핍 또는 전자 수송 억제에 의해 저해된다. 따라서, sdh 유도 검출은 분석 가능한 생성물 발현의 감소에 의해 나타난다.
실시예 1, 제Ⅱ부 에 기술된 바와 같이, 영국 쉐필드 대학의 존 게스트 박사로부터 제공받은 플라스미드 상에 함유된 sdh 유전자내로 Mu dX를 삽입시켜 sdh-lacZ 융합체를 제조했다. 형질전환체를 혐기성 조건하에서 배양함으로써 분석 하였다.
sdh 의 서열은 참고로 본 명세서에 인용한 문헌[참조 . S. S. Ner 등, Biochemistry, 22, pp. 5243-48(1983)]에 공개되어 있다. sdh-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술 및 프라이머 : 5'-GAATTCGACCGCCATTGCGC-3' [서열 번호 : 13] 및 5'-AAGTCGGTATTTCACCTAAG-3' [서열 번호 : 14]를 사용하여 작제할 수 있다. 형질전환체는 혐기성 조건하에서 β-갈락토시다제 발현의 억제로 융합체의 존재에 대해 분석하였다.
Ⅷ. dinD
본 명세서에 참고로 인용한 문헌[참조 : S. Kenyon 등, Nature, 289, pp. 808-12(1981)]에 기술된 바와 같이 dinD 융합체를 제조한 그라함 워커로부터 이 작제물을 수득하였다. 이 작제물은 실시예 1, 제 Ⅲ 부에 기술된 것과 동일한 Mu dX 삽입 방법에 의해 제조된 것이다. 이 융합체를 함유하는 피형질도입체를 미토마이신 C 존재하에서 β-갈락토시다제의 발현으로 동정하였다.
dinD-lacZ 융합체를 실시예 3에 기술한 P1 형질도입 기술을 사용하여 큔주 SF1 으로 이동시켰다. 이어서 생성되는 dinD-lacZ 융합체를 함유하는 균주는 SF 923 이라 칭하였다.
SF 923의 시료는 1992년 6월 26일자로 미국, 메릴랜드 208520, 록빌, 파아크런 드라이브 12301에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)에 기탁하고, 수탁 번호 55336을 부여받았다.
Ⅸ. rpoD
실시예 1의 제 Ⅲ 부에 기술한 Mu dX 염색체 삽입 기술을 사용하여 제조한 rpoD-lacZ 융합체를 다른 공급처에서 입수하였다. rpoD-lacZ 융합체를 실시 예 3에 기술한 바와 같은 P1 형질 도입법으로 이. 콜리 균주 SF1 내로 이동시켰다.
대안적으로, rpoD-lacZ 융합체는 실시예 2, 제 Ⅱ부에 기술한 PCR 기술과 프라이머:5'-AAGCTTGCATTGAACTTGTG-3'[서열 번호 : 15] 및 5'-GTTTGCCGCCTGCTCTTCCC-3'[서열 번호 : 16]를 사용하여 작제할 수 있다. 목적하는 융합체는 에탄올 존재하에 β-갈락토시다제 발현성으로 검출하였다.
hag-lacZ 융합체는 실시예 1, 제Ⅱ부 에 치술한 바와 같이 클로닝된 hag 유전자를 함유하는 플라스미드내로 Mu dX 삽입하여 작제하였다. 형질전환체는 CCCP 존재하에서 β-갈락토시다제 발현의 억제로 선별하였다.
hag 유전자의 서열은 공지되어 있다[참조 : G. Kuwajima 등, J. Bacteriol., 168, pp. 1479-83(1987), 참고로 본 명세서에 인용함]. 따라서, hag-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술 및 프라이머 : 5'-AAGCTTCCTTGTCAGCGAAA-3'[서열 번호 : 20]를 사용하여 제조할 수 있다. 형질전환체는 MMS 의 존재하에서 β-갈락토시다제 발현의 유도성으로 목적하는 융합체의 존재에 대해 시험하였다.
ⅩII. gyr
gyr-lacZ 융합체는 실시예 1, 제Ⅱ부에 기술한 바와 같이 gyr 유전자를 함유하는 플라스미드에 대해 Mu dX 삽입법을 사용하여 작제되었다. 결과로 생성된 형질)] 감염체는 나리딕스산의 존재하에서 β-갈락토시다제 발현의 유도로 선별하였다.
gyrA 유전자의 서열은 본 명세서에 참고 인용한 문헌[참조: H. Yoshida등, Mol. Gen. Genet., 211, pp. 1-7(1988)]에 기술되어 있다. gyr-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부에 기술한 PCR 기술 및 프라이머: 5'-CTACGTTATGGTTTACCGGC-3'[서열 번호 : 21] 및 5'-AAGTACGCGACGGTGTACCG-3'[서열 번호 : 22]를 사용하여 작제할 수 있다. 목적하는 융합체를 함유하는 형질전환체는 나리딕스산의 존재하에 β-갈락토시다제 발현의 유도성으로 동정하였다.
ⅩIII. top
실시예 1, 제Ⅱ부에 기술된 Mu dX 염색체 삽입 기술을 사용하여 라이브러리를 제조하고, 이것으로 부터 top-lacZ 융합체를 선별하였다. 이 라이브러리는 아크리딘 오렌지의 존재하에 β-갈락토시다제 발현의 유도로 선별하여 목적하는 융합체를 함유하는 클론을 분리하였다.
top 유전자는 본 명세서에 참고 인용한 문헌[참조: T-D. Dinh 등, J. Mol. Biol., 191, pp. 321-31(1986)]에 서열 결정되어 있다. 대안적으로, top-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부에 기술한 PCR 기술 및 프라이머: 5'-GCATCAACGCAGGTTGCGC-3'[서열 번호 : 23] 및 5'-CACCGGCGTCACGCAGCGTA-3'[서열 번호 : 24]를 사용하여 작제할 수 있다. 목적하는 융합체를 함유하는 형질전환체는 아크리딘 오렌지 또(는 에티디움 브로마이드- 같은 DNA 삽입제의 존재하에서 β-갈락토시다제 발현의 유도성으로 동정하였다.
ⅩⅣ. clpB
실시예 1, 제Ⅱ부 에 기술된 Mu dX 삽입 기술을 사용하여 clpB 유전자를 함유하는 플라스미드로부터 clpB-lacZ 융합체를 작제하였다. 피형질도입체는 절단 단백질을 생성하는 것으로 공지된 화합물인 푸로마이신의 존재하에서 β-갈라고시다제 발현의 유도성으로 선별하였다.
clpB는 최근에 서열이 결정되었다[참조: C. L. Squires 등, J. Bacteriol., 173, pp. 4254-62(1991), 본 명세서에 참고 인용함]. 대안적으로, clpB-lacZ 융합체는 실시에 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술 및 프라이머: 5-GATCCGGTACGCGTGATTT-3'[서열 번호 : 25] 및 5'-CCAGACGCATAACTCCTCCC-3'[서열 번호 : 26]를 사용하여 작제할 수 있다. 카나바닌, 푸로마이신 또는 열에 노출시 β-갈락토시다제를 발현시키도록 유도 될 수 있는 형질전환체는 clpB-lacZ 융합체를 포함한다.
ⅩⅤ. merR
merR 유전자는 본 명세서에 참고 인용한 문헌[참조: W. Ross 등, J. Bzcteriol., 171, pp. 4009-18(1989)]에 기술되어 있다. merR-lacZ 융합체를 Ross 박사의 실험실에 근무하는 앤 섬머스 박사로부터 입수하였다.
대안적을, merR-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술 및 프라이머: 5'-CGCTTGACTCCGTACATGAG-3'[서열 번호 : 27] 및 5'-TGGATAGCGTAACCTTACTT-3'[서열 번호 : 28]를 사용하여 작제할 수 있다. 메틸 수은에 노출시 β-갈락토시다제를 발현시키는 형질전환체는 목적하는 융합체를 포함한다.
ⅩⅥ. fepB-entC
플라스미드-암호된 fepB-entC 유전자내로 Mu dX를 삽입시켜 fepB-entC-lacZ 융ㅎ바체를 작제하였다. 그 결과 얻어진 형질전환체를 금속 킬레이터인 EGTA를 사용하여 처리함으로써 유도성을 측정하였다.
대안적으로, 본 명세서에 참고 인용한 문헌[참조: M. F. Elkins 등, J. Bacteriol., 171, pp. 5443-51(1989)]에 보고된 fepB 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하고, 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술 및 프라이머: 5-CCACAAGATGCAACCCCGAG-3'[서열 번호 : 29] 및 5'-GACGTATCCATATCATCCTCC-3'[서열 번호 : 30]를 사용하여 fepB-entC-lacZ 융합체를 작제할 수 있다. 혀질전환체는 본 명세서에 참고 인용한 문헌[참조: T. J. Brickman 등, J. Mol. Biol., 212, pp. 669-82(1990)]에 기술된 바와 같이 목적하는 융합체의 존재에 대해 선별하였다.
ⅩⅨ. mutT
mutT-lacZ 융합체를 실시예 1, 제Ⅱ부에 기술된 바와 같이 mutT 유전자의 플라스미드-암호된 변형체를 이용하여 Mu dX 삽입 기술로 제조하였다. 형질전환체를 X-선에 노출시킨 후 β-갈락토시다제 발현에 대해 선별하였다.
mutT 유전자의 서열은 본 명세서에 참고 인용한 문헌[참조: M. Akiyama mutT-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술과 프라이머: 5'-CTGCACTGGCGGCGCAAACC-3'[서열 번호 : 35] 및 5'-ATAAGACGCGGACAGCGTCG-3'[서열 번호 : 36]를 사용하여 대안적으로 작제할 수 있다. 목적하는 작제물을 함유하는 형질전환체는 X-선에 노출후 β-갈락토시다제 발현에 대해 선별하였다.
ⅩⅩ. nuc
클로닝된 nuc 유전자를 함유하는 플라스미드를 이용하여 Mu dX 삽입 기술로 unc-lacZ 융합체를 작제하였다. 형질전환체를 2,4-디니트로페놀 존재하에 β-갈락토시다제 발현에 대해 선별하였다.
unc 오페론의 부분 서열은 에이취. 카나자와 등에 의해, 참고로 본 명세서에 참고 인용한 문헌[참조: Biochem. Biophys. Res. Commun., 103, pp. 604-12(9181)]에 공개되어 있다. 따라서, unc-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부에 기술한 PCR 기술 및 프라이머: 5'-AAAGCAAATAAATTTAATTTTT-3'[서열 번호 : 37] 및 5'-GGCCACCCGGCCTTTCGCTG-3'[서열 번호 : 38]를 사용하여 작제할 수 있다. 형질전환체는 2,4-디니트로페놀 존재하에 β-갈락토시다제 발현의 유도성에 대해 선별하였다.
ⅩⅩⅠ. rdc
쥐. 티. 자보박사로부터 rdc-lacZ 융합체를 함유하는 균주를 입수하였다. 이 융합체는 실시예 1, 제ⅢA부에 기술된 무작위 Mu dX 삽입 기술을 사용하여 제조된 것이다. 형질감염체는 티오글리세롤의 존재하에 X-gal 평판상에서 배양함으로써 융합체의 존재에 대해 선별하였다. 이 분석에서 청색을 나타내는 콜로니는 목적하는 융합체를 포함한 것이다.
rdc-lacZ 융합체를 실시예 4에 기술한 P1 형질 도입 기술을 사용하여 전이시켰다. 원 균주로부터 SF1 균주로 이 융합체를 함유하는 균주를 SF924로 표시하였다.
SF924 시료는 1992. 6. 26자로 미국 메릴랜드 20852, 록빌, 파크론 애비뉴 12301에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)에 기탁하고 수탁 번호 55335를 부여받았다.
ⅩⅩⅡ. lon
lon 유전자의 서열 및 그 프로모터의 위치는 본 명세서에 참고 인용한 문헌[참조: T. A. Phillips 등, J. Bacteriol., 159, pp. 283-87(1984)]에 기술되어 있다. lo..0000000333n-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술 및 프라이머: 5'-TCTCGGCGTTGAATGTGGG-3'[서열 번호 : 30] 및 5'-CGACGTCTTCCATGGACGGC-3'[서열 번호 : 40]를 사용하여 작제할 수 있다. 형질전환체는 나리딕스산 또는 쿠메르마이신의 존재하에 β-갈락토시다제 발현의 유도성에 대해 선별하였다.
XXIV. meto
metro 유전자의 서열은 본 명세서에 참고 인용한 엠. 라하만등의 젠 뱅크/EMBL 데이타베이스, 승인 번호 M89992를 통해 최근 보고되었다.
metro-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술과 프라이머: 5'-AAGCTTACACAGCATAACTG-3'[서열 번호 : 43] 및 5'-CCAGGCAGGGCATCGGCGGGGG-3'[서열 번호 : 44]를 사용하여 작제할 수 있다. 형질전환체는 N-에틸말레이미드의 존재하에 β-갈락토시다제 발현의 유도성에 대해 선별하였다.
실시예 7
다양한 스트레스 프로모터를 사용한 공지 발암 물질의 분석
다수의 화학약품을 가지고 전술한 각종 스트레스 프로모터-lacZ 융합체의 발현을 유도하는 능력이 있는지에 대해 분석하였다. 이 분석에 사용된 화학 약품은 메틸 수은(0 내지 lμM), 4-니트로퀴놀린 옥사이드("4-NQO")(0 내지 100pM), MMS(0 내지 40nM), 파라콰트(0 내지 50μM), 플룸바긴(0 내지 160μM), 미토마이신(5 ㎍/㎖), 2,2'-디피리딜(0 내지 160μM), H2O2(0 내지 1600μM) 및 삼투압 스트레스를 위한 NaCl(0 내지 0.8M)이었다. 또한, pH 및 증식 온도를 변화시켜 임의의 스트레스 프로모터-lacZ 융합체를 처리하였다.
이들 결과는 다양한 스트레스 프로모터를 유도하는 화합물 유형에 대한 중요한 식견을 제공하였다. 예를 들어, 제1도는 수은이 특이적으로 merR 프로모터는 유도하나 sfiA 또는 sodA 프로모터는 유도하지 않음을 예시하고 있다. 따라서, 수은은 DNA 복제(sfiA 프로모터를 유도하는 스트레스)에 영향을 미치지 않고 초과 산화물의 형성(sodA를 유도하는 스트레스)을 유발하지 않는 것으로 결론지을 수 있다.
제2도는 4-NQO가 DNA 복제 손상(sfiA 및 dinD 프로모터의 유도), 특히 DNA 쇄 파열(dinD 프로모터)에 의한 DNA 복제 손상을 유발하나 DNA 알킬화 (adaA 프로모터)에 의한 DNA 손상은 유발하지 않음을 예시한다. 미소하지만 용량-의존적인 nfo 프로모터의 유도는 4-NQO에 의해 유발된 DNA 손상이 산소-의존적임을 암시 한다.
MMS는 DNA를 쇄파열(dinD 프로모터)에 의한 것이 아니라, 알킬화 (adaA 프로모터의 유도)함으로써 DNA 손상을 유발시킴이 명백하다 MMS에 의해 유발된 알킬화는 산소-의존성이 아니다(nfo 프로모터). 이들 결과는 제3도에 도시하였다.
파라콰트(참조: 하기 표) 및 플룸바긴(참조: 제4도)은 둘다 soi28 프로모터를 유도한다. 또한, 파라콰트는 nfo 프로모터를 유도하였는데, 이것은 이 화합물이 산소-의존적 DNA 손상을 야기함을 나타낸다. 파라콰트는 혐기생활- 및 전이 금속-민감성 ndh 프로모터를 유도하는데 거의 영향을 미치지 않는다. 파라콰트 및 플룸바긴을 사용한 결과는 특히 의미가 있는데, 왜냐하면 두 화합물 모두 통용되는 에임스 분석법에서 양성 응답 반응을 나타내지 않기 때문이다.
표 1
파라콰트에 의한 스트레스 프로모터-조절된 β-갈락토시다제 발현의 유도
* 실시예 5에 기술한 바와 같이, 다양한 프로모터의 유도는 β-갈락토시다제 활성으로 측정하여 유니트(units)로 표시하였다.
미토마이신 분석을 위해, 상기 화합물을 단지 한가지 농도로 사용하였으나 노출 시간을 0 내지 55분으로 변화시켰다. 하기 표에 나타낸 결과는 미토마이신에 노출시킨지 55분후, dinD 프로모터가 약 4 배 유도되었음을 나타내었다. 이것은 미토마이신이 DNA 쇄 파열을 초래함을 나타내는 것이다.
표 2
dinD 조절된 β-갈락토시다제 발현에 대한 미토마이신 C의 효과
예상되는 바와 같이, 삼투압 증가(NaCl 농도 증가)는 proU 프로모터를 유도하나 초과산화물을 형성하지는 않았다(sodA 또는 soi17 유도 못함)(제5도). 이와 대조적으로, 2,2'-디피리딜은 초과산화물 형성(sodA 유도)을 유발할 뿐만 아니라 금속 킬레이트화(fepB 유도)를 초래하였다. DNA 복제(sfiA 프로모터)에는 2,2'-디피리딜의 효과는 없었다. 이것은 제6도에 나타냈다.
숙주가 열충격에 반응한 rpoD 프로모터를 숙주가 어떻게 보유하는지 알아보기 위해, 0 내지 50분 동안 30℃ 대신에 43℃에서 그 숙주들을 배양하였다. 이 분석 결과는 표 3에 나타내었으며 20분 후 rpoD 프로모터가 3배 유도됨을 알 수 있다. 30분과 50분후에 관찰된 유도의 감소는 유도 파기에 의한 것이 아니라, 세포 사멸의 증가에 기인하는 것이었다.
표 3
β-갈락토시다제의 rpoD 프로모터 조절된 발현에 대한 증가된 배양 온도의 영향
최종적으로, pH가 5 내지 8인 배지내에서 다른 스트레스 프로모터-lacZ 융합체를 보유하는 숙주를 배양한 효과를 분석하였다. 제7도에 도시한 결과는 sfiA 및 soi17 프로모터가 여러 pH에서 전혀 유도되지 않음을 예시하고 있다. aniG 프로모터는 pH 6.0에서 최대 유도를 보였으며 그보다 높거나 낮은 pH에서 유도는 직선형으로 감소함을 보였다.
실시예 8
항독소의 동정
미지의 화합물을 스트레스 프로모터 조절된 β-갈락토시다제 발현의 유도 또는 억제에 근거하여 독소인 것으로 밝힌 후, 동일한 방법을 이용하여 잠재적인 항독소 동정에 이용할 수 있다.
미지의 화합물은 dinD-lacZ 작제물을 보유하는 숙주 및 katG-lacZ 작제물을 보유하는 숙주 둘다에서 β-갈락토시다제 발현을 유도하는 것으로 입증되었다.
이것은 상기 화합물이 DNA 쇄 파열(dinD 유도)을 야기시키기에 충분히 높은 농도로 과산화수소의 형성(katG 유도)을 유발한다는 것을 나타낸다. 아스코르브산은 과산화수소로 유도되는 DNA 쇄 파열의 수를 감소시키는 것으로 알려져 있으며, 따라서 전술한 미지의 화합물에 대한 잠재적 항독소이다.
katG-lacZ를 포함하는 숙주 및 dinD-lacZ를 포함하는 숙주를 각각 96웰 미량역가 접시내 8개의 웰내에 주입하였다. 각각의 웰을 여러 희석률의 아스코르브산과 함께 30℃에서 30분동안 항온처리하였다. 첫번째 웰은 대조군으로서, 아스코르브산을 첨가하지 않았다. 각각의 웰을 미리 특정된 최대 β-갈락토시다제 유성 최적 농도의 미지 화합물에 노출시켰다. 이 분석은 실시예 5에 기술한 바와 동일하게 수행하였다. 아스코르브산-처리한 웰내의 숙주가 대조용 웰의 숙주보다 더 낮은 수준으로 β-갈락토시다제를 발현하는 경우, 아스코르브산은 항독소로 간주된다.
실시예 9
개선된 독소-유도성 β-갈락토시다제 분석
2개의 96웰 미량 역가 평판을 사용하여 각 화합물을 분석하였다. 1개의 평판은 "강한" 프로모터: gyrA, katG, micF, topA, ada, cyd(ampR), hag(ampR) 및 zwf(ampR)에 대한 융합체를 보유하는 균주를 포함하고 있었다. 다른 1개의 평판은 "약한" 프로모터: groE, clpB, katF, merR, soi28(ampR), dinD(ampR), aniG(kanR) 및 ufo(kanR)에 대한 융합체를 보유하는 균주를 포함하고 있었다(괄호 안은 균주의 임의의 약제 내성을 나타냄).
상기 균주 각각의 배양물은 필요하다면 적당한 항생제(100 ㎍ 앰피실린 또는 50 ㎍ 카나마이신)를 포함하는 LB 육즙 배지 1 ㎖ 중에서 양호한 통기 하에 37℃에서 각각 밤새 증식시켰다. 그 다음 각 배양물의 1:117 희석액 250 ㎕를 각 줄의 2 내지 11번째 웰내에 주입하였다. 각 줄의 1번 웰에는 LB + 항생제 혼합 물 225 ㎕를 첨가했다. 각 줄의 12번 웰에는 희석하지 않은 밤새 배양한 배양물 25 ㎕와 LB + 항생제 혼합물 300 ㎕를 첨가하였다. 평판을 37℃에서 2시간 동안 적당한 통기 하에 항온처리하였다. 2시간 후, 배양물의 OD600을 측정하고 기록 하였다.
검사할 화학약품을 최소 부피의 용매(바람직하게는 물)에 용해시켰다. 각각의 화학 약품은 5배 희석율의 범위에 걸쳐 시험하였다. 적당한 희석액 25μl를 각 줄의 소정 웰(즉, 각 줄의 2번 웰에는 희석되지 않은 화학약품 25μl첨가 각 줄의 3번 웰에는 1:5 희석액 25μl 첨가, 각 줄의 4번 웰에는 1:25 희석액 25μl 첨가 등)에 첨가하였다. 각 줄의 1번 웰에는 멸균수 25μl를 첨가하였다. 검사할 화학 약품을 첨가한 후 웰의 OD600을 재측정하였다. 평판을 37℃에서 2시간 동안 적당한 통기 하에 항온처리하였다.
화학 약품과 함께 항온처리한 후, 각각의 웰의 OD600을 측정하고 기록하였다. 이 OD600판독값은 β-갈락토시다제 활성을 계산하는데 사용하였다. 각각의 웰로부터 세포 200μl를 피펫팅하여 클로로포름-내성 폴리프로필렌 96웰 미량 역가 평판의 상응하는 웰에 첨가하였다. 흄후드내에서 클로로포름 50μl를 각 웰에 첨가 하고 피펫팅을 이용하여 혼합하였다. 평판을 실온에 15분 동안 방치시켜 세포를 투과성화시켰다. 1번 웰에 Z 완충용액 210μl 및 ONPG 용액 40μl를 첨가하였다.
세포를 투과성화시키는 동안 2개의 96웰 미량역가 평판("반응 평판") 2번 내지 13번 웰 각각에 Z 완충 용액 170μl 및 ONPG 40μl(Z 완충용액내 4 ㎎/㎖mf)를 주입하였다. 각 웰의 투과성화된 세포 40μl(클로로포름이 모두 제거되지 않도록 주의함)를 피펫팅하여 반응 평판의 상응하는 웰에 주입하고 피펫팅을 이용하여 혼합 하였다. 모든 웰이 충전되었을 때, 평판을 세레스(Ceres) 900 미량역가 판독기 (미국, 버몬프, 버링톤에 소재하는 바이오테크사 제품)내로 위치시키고 30분동안 매분마다 OD420을 측정함으로써 분석하였다. 각 줄의 1번 웰은 공백으로 두었다. 30분이 종료될시, 각각의 웰의 OD550을 기록하여 활성 계산에 사용하였다. 각각의 웰에 대하여 시간 경과에 따른 0D420을 플로팅하고, 이와 같이 작도된 곡선의 직선 부분의 기울기를 계산하였다. β-갈락토시다제 활성은 하기 식으로 계산하였다.
상기 식에서, t0는 ONPG에 세포 첨가시와 평판을 판독기에 위치시킬 때의 시간 사이의 지체 시간이고, tX는 ONPG에 세포 첨가시와 분단위 판독의 종료시까지의 총시간이며 ; C1은 판독기로부터의 최초 OD420판독간이며 ; "부피"는 세포 부피(40 ㎕)를 반응웰내의 총 부피(210μl)로 나눈 값이다. 얻어진 활성을 화학약품 부재시에 배양된 각 균주의 β-갈락토시다제 활성과 비교하여 유도율(fold induction) 값을 얻었다.
그 결과들을 3차원 막대 그래프로 플로팅하여, 각각의 화학 약품 농도에서 각 스트레스 프로모터의 유도율을 나타냈다. 이런 막대 그래프의 예는 제9도 내지 제12도에 도시하였다.
실시예 10
추가의 스트레스 프로모터-lacZ 융합체의 작제
ⅩⅩⅤ. micF
micF-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술과 프라이머: 5'-ATATGAATTCGTCGGCAAGTCCATTCTCCCC-3'(서열 번호 : 45) 및 5'-ATATGGATCCGCGGGAGTTATTCTAGTTGCC-3'(서열 번호 : 46)를 사용하여 작제하였다.
형질전환체는 에탄올의 존재하에서 β-갈락토시다제 발현의 유도성으로 선별 하였다.
ⅩⅩⅥ. ada
개선된 ads-lacZ 융합체를 하기와 같이 작제하였다. ada 프로모터의 상부 쇄와 하부쇄의 부분을 나타내는 2개의 올리고뉴클레보티드를 합성하였다: 5'-TATAGAATTCCCTTGTCAGCGAAAAAAATTAAAGCGCAAGATTGTTGGTTTTTGCGTGATGGTGACCGGGCAGCCTAAAGGCTATCC-3'[서열 번호 : 47] 및 5'-ATATGGATCCAATCAGCTCCCTGGTTAAGGATAGCCTTTAGGCTGCCCGGTCACCATCACGC-3'(서열 번호 : 48).
2개의 올리고뉴클레오티드는 30개의 염기쌍이 상동 중첩하였다. 올리고뉴 클레오티드를 어닐링하고 클리노우 단편과 함께 배양하여 이본쇄 프로모터의 합성을 완료하였다. 이본쇄 프로모터를 EcoRI 및 BamHI을 사용하여 분해하였다. 분해된 프로모터를 EcoRI/BamHI 분해된 pRS415내로 클로닝하였다. MMS 및 X-gal 존재하에서 증식후 청색인 양성 형질전환체를 분리하였다.
ⅩⅩⅦ. cyd
세균 염색체내에 통합된 cyd-lacZ 융합체를 함유하는 이. 콜리 균주를 얻었다.
cyd 프로모터의 뉴클레오티드 서열 문[G. N. Green등, J. Biol. Chem., 263, pp. 13138-143(1988), 본원에 참고 인용됨]에 보고되어 있다. 따라서, cyd-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술과 프라이머: 5'-CGCCGAATTCGCGGCGTAATATATACGTCCCATC-3' [서열 번호 : 49] 및 5'-CGCGGGATCCCATGACTCCTTGCTCATCGCATGAAGACTCCG-3' [서열 번호 : 50]를 사용하여 작제하였다.
형질전환체는 혐기성 조건하에서 균주를 배양하여 나타내는 β-갈락토시다제 발현의 유도성으로 선별하였다.
ⅩⅩⅧ. zwf
세균 염색체내에 통합된 zwf-lacZ 융합체를 함유하는 이. 콜리 균주를 얻었다.
zwf-lacZ 융합체는 실시예 2, 제Ⅱ부 에 기술한 PCR 기술 및 프라이머: 5'-CGCCGAATTCTGCCGCAGTTTGCGCGCTTTTCCCG-3' [서열 번호 : 51] 및 5'-GCGCGGATCCGTCATTCTCCTTAAGTTAACTAACCCGG-3' [서열 번호 : 52]를 사용하여 작제하였다.
형질전환체는 파라콰트 같은 초과산화물-형성 화합물의 존재나, 또는 산화물산의 존재하에서 균주를 배양하여 나타내는 β-갈락토시다제 발현의 유도성으로 선별한다.
ⅩⅩⅨ. groE
세균 염색체내의 통합된 groE-lacZ을 함유하는 이. 콜리 균주를 얻었다.
groE-lacZ 융합체는 먼저 groE 프로모터의 상부쇄 및 하부쇄 부분을 나타내는 하기 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 작제할 수 있다:
5'-CGCCGAATTCATCAGAATTTTTTTTCTTTTTCCCCCTTGAAGGGGCGAAGCCTCATCCCCATTTCTCTGGTCACCAGCCGGG-3' [서열 번호 : 53] 및 5'-GCGCGGATCCCGGAGCTTACGTGGTTT CCCGGCTGGTGACCAGAGAAATGGGGATGAGGCTTCGCCCCTTCAAGG-3' [서열 번호 : 54].
2개의 올리고뉴클레오티드를 서로 어닐링한 뒤 클리노우 단편과 함께 항온처리하여 이본쇄 프로모터의 합성을 완료하였다. 이본쇄 프로모터를 EcoRI 및 BamHI을 사용하여 분해하였다. 분해된 프로모터를 그 다음 EcoRI/BamHI 분해한 pRS415 내로 클로닝하였다. 양성의 형질전환체는 X-gal 존재하에서 증식시켜 배양물의 증식 온도를 30분 동안 37℃로부터 42℃로 증가시킨 후 청색에 의해 동정하였다.
ⅩⅩⅩ. aniG
사우스 알라바마 의과대학의 존 포스터 박사와 캐빈 카렘 박사로부터 이. 콜리 균주 JF 1295(aniG1072::Mu dJ)를 입수하였다. 이 균주는 세균 염색체내에 anig-lacZ 융합체의 단일 복사물을 포함한다. 이 균주의 작제는 참고로 본 명세서에 인용한 문헌[참조: Z. Aliabadi 등, J. Bacteriol., 170, pp. 842-51(1988)]에 기술되어 있다.
실시예 11
세균 염색체내로 프로모터-lacZ 융합체의 단일 복사물을 통합시키는 방법
각 프로모터의 유도성을 서로 비교하기 위해서는, 각 프로모터 융합 작제물의 복제수를 표준화하는 것이 필요하다. 이것은 재조합 람다 파지를 사용하여 세균 염색체내로 융합체의 단일 복사물을 통합시킴으로써 얻어졌다.
플라스미드에 스트레스 포로모터-lacZ 융합체를 운반하는 이. 콜리 균주 SF1을 5㎖의 람다 육즙 배지[1%(중량/부피) 트립톤, 0.1%(중량/부피) 효모 추출물, 0.2%(중량/부피) 말토오즈 및 0.25%(중량/부피) Nal]내에서 37℃하에 세포 농도가 5×108/㎖ 에 이를 때까지 증식시켰다. 세포를 원심분리하고 세포 펠렛을 10mM ㎎SO45㎖ 내에 재현탁시키고, 교반하면서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
이 세포 200 ㎕에 SM 완충용액으로 연속 희석한 λRS88[참조: R. W. Simons 등, Gene, 53, pp. 85-96(1987)]의 일련의 희석액 100㎕를 첨가하였다. 혼합물을 교반하면서 37℃에서 15-20분동안 배양하였다. 총 300μl를 45℃로서 유지시킨 상부 한천 배지[1%(중량/부피) 트립톤, 0.1%(중량/부피) 효모 추출물, 0.2%(중량/부피) 말토오즈, 0.25%(중량/부피) NaCl 및 0.65%(중량/부피)한천] 3 ㎖에 첨가하고, 혼합물을 람다 한천 평판[1%(중량/부피) 트립톤, 1%(중량/부피) 한천 및 0.25%(중량/부피) NaCl]에 쏟아 부었다.
부피) 한천 및 0.25%(중량/부피) NaCl]에 쏟아 부었다. 평판을 37℃에서 가시적인 플라크가 형성될 때까지 배양하였다. 거의 전면 플라크를 포함하는 평판을 다음 단계에 사용하였다.
이 평판에 SM 완충용액 5 ㎖를 첨가하여, 상부 아가와 함께 긁어 용액을 조심스럽게 긁어내어 유리 튜브내로 투입하였다. 이것에 클로로포름 1 ㎖를 첨가 하고 10초 동안 볼텍스하였다. 혼합물을 원심 분리하여 상청액의 상층을 제거하고, 분리된 상청액에 클로로포름 0.5 ㎖을 첨가하여 4℃에서 보관하였다. 최종 파지 용균물은 106 내지 1010 파지/㎖을 포함하였다. 스트레스 프로모터 융합체를 함유하는 재조합 파지의 빈도수는 104 파지당 약 1개였다.
다음으로 세균 염색체내로 스트레스 프로모터 융합체의 단일 복사물을 통합시키는 단계를 수행하였다. SF1 세포를 람다 육즙 배지 5 ㎖ 내에서 37℃하에 5 × 108 세포/㎖의 농도로 증식시켰다. 그 다음 세포를 원심 분리하여 얻은 펠렛을 10mM mgSO4 5 ㎖ 내에 재현탁시킨 뒤, 교반하면서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이 세포 200 ㎕에 SM 완충용액으로 연속 희석한 λRS88 모액의 일련의 희석액 100ul를 첨가하였다. 혼합물을 교반하면서 37℃에서 15 내지 20분 동안 배양하였다. 이 배양물 총 300 ㎕를, X-gal 400 ㎍/㎖를 포함하고 45℃에서 유지시킨 상부 한천 3 ㎖에 첨가하였다. 이 혼합물을 람다 한천 평판상에 쏟아 붓고 평판을 가시적인 플라크가 형성될 때까지 37℃에서 배양하였다. 멸균 피펫의 뒷 단부로 한천을 천공함으로써 청색 플라크를 채집하여, 이 한천 채집물을 SM 완충용액 200 ㎕와 클로로포름 50㎕ 내로 첨가하였다. 한천 덩어리가 파괴될 때까지 혼합물을 볼텍스하였다. 튜브를 원심분리한 후, 상청액을 클로로포름 50 ㎕를 포함하는 튜브로 옮기고 이 튜브를 4℃에서 보관하였다. 채집된 플라크를 다시 한번 재정제한 후, 거의 전면 플라크를 포함하는 평판으로 부터 보관 균주를 제조하였다.
세균 염색체 내에 통합푄 스트레스 프로모터 융합체를 포함하는 세균 균주를 제조하기 위해, 전술한 플라크 보관 균주를 사용하여 SF1 세포를 전술한 바와 같이 감염시켰다. 청색 플라크의 중심에 존재하는 세균 콜로니를 멸균 파스쳐 피펫을 사용하여 채집해 LB 0.5 ㎖에 첨가하였다. 37℃에서 4 내지 5시간 동안 배양한 후, 배양물을 LB/X-gal 평판 상에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 분리한 청색 콜로니를 집어낸 뒤, 공지의 유도제(inducer) 존재하에서 배양함으로써 특정 스트레스 프로모터의 존재에 대해 검사하였다. 그 다음 세균 용균물을 β-갈락토시다제 활성에 대해 분석하였다. 유도성 β-갈락토시다제 활성을 나타내는 콜로니는 목적하는 스트레스 프로모터 융합체의 단일 복사물을 포함하고 있다.
실시예 12
바람직한 키트를 이용한 공지 독소의 추가 분석
실시예 11에 모두 기술한 바 있는, 가장 바람직한 프로모터 융합체군과 β-갈락토시다제 분석법을 사용하여 MMS, HgCl, 4-NQO 및 파라콰트에 대한 유도 프로파일을 만들었다.
제9도는 MMS가 470μM 내지 1880μM의 농도에서 특이적으로 ada 프로모터를 유도하며 이보다 낮은 정도로 dinD 프로모터를 유도함을 나타낸다. 이것으로 주로 DNA를 알킬화(ada 유도)하여 DNA 손상을 야기시키는 MMS의 공지된 작용 기작을 확인하였다. dinD의 보다 낮은 유도성은 우연한 DNA 쇄 파열의 결과 일 수 있다.
제10도는 염화 수은이 특이적으로 무기 수은 화합물에 반응하는 것으로 공지된 merR 프로모터를 유도함을 입증한다.
제11도는 4-NQO가 dinD 프로모터의 유도를 야기하며, 이보다 낮은 정도로 soi28, nfo 및 micF 프로모터를 유도함을 입증한다. 이것은 산화적 쇄 파열을 통해 DNA를 손상 시킬뿐만 아니라 세포의 산화 환원 반응의 균형을 파괴시키는 4-NQO의 작용 유형과 일치하였다.
제12도는 파라콰트에 의한 soi28 및 micF 프로모터의 특이적인 유도 및 이보다 낮은 정도로 nfo 프로모터를 유도함을 입증한다. 파라콰트는 초과산화물 라디칼 형성을 야기시켜 차례로 산화 환원 스트레스 프로모터 soi28 및 micF를 유도 하는 것으로 공지되어 있다. nfo 프로모터는 세포내 고농도의 초과산화물 라디칼에 의해 야기될 수 있는 산화적 DNA 손상에 의해 유도된다. merR 및 dinD 프로모터의 명백한 저해는 아직 설명된 바 없다.
전술한 연구외에도, β-갈락토시다제에 융합된 다음과 같은 세균 스트레스 프로모터의 단일 복사물을 보유하는 세균으로 구성되는 바람직한 프로모터 군에 대해 다수의 기타 화학 약품을 선별하였다. soi28, dinD, hag, ada, gyr, katG, nfo, clpB, merR, top, cyd, micF, zwf, groE, katF 및 aniG.
이 분석들의 결과는 하기 표 4에 제시한다.
표 4
β-갈락토시다제의 스트레스 프로모터 조절된 발현에 대한 각종 화합물의 효과
표 4(계속)
표 4(계속)
상기 표에서, "시약"은 각종 스트레스 프로모터 융합체를 보유하는 세균 배양물에 첨가된 화합물이고: "고농도"는 상기 배양물에 대해 시험한 시약의 최고 농도 이며; "유도된 프로모터"는 특정 시약에 의해 유도된 스트레스 프로모터이고; "유도율"은 시약의 부재하에서 β-갈락토시다제 발현 정도와 비교한 시약(표의 "농도"란에 나타낸 농도로)의 존재하에서 스트레스-프로모터 조절된 β-갈락토시다제 발현의 정도이다.
전술한 바와 같이 본 발명의 다수의 양태를 제공하였지만, 그 기본적인 구성은 본 발명의 진단 키트, 방법 및 생성물을 이용하는 기타의 양태를 제공하기 위해 변형될 수 있음은 명백한 것이다. 그러므로, 본 발명의 영역은 전술한 실시예에 제공한 특정 양태 보다는 본 명세서에 첨부한 특허청구의 범위에 의해 제한된다는 것은 당연한 것이다.
[서열 목록]
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 : 스펜서 비. 파르
(A) 성명
(ii) 발명의 명칭 : 독성을 측정하는 방법 및 진단 키트
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(D) 주 : 뉴욕
(I) 국가 : 미국
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(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
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(D) 소프트 웨어 : PatentIn Release # 1,0, 버젼 # 1.25
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(i) 서열 특징 :
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GCTCATATTC ATCTCCAGTA 20
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GCTATGTGTG TGATGTGAGC 20
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TGATGACAGA TGTCGCCCCA 20
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(A) 길이 : 20개 염기쌍
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(xi) 서열번호 5의 서열 :
CAGGTGCGTT GTAGTGAGTT 20
(2) 서열번호 6에 대한 정보 :
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(A) 길이 : 21개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
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(xi) 서열번호 6의 서열 :
CAATAAACGA GATAACTCTC C 21
(2) 서열번호 7에 대한 정보 :
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(A) 길이 : 22개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
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(xi) 서열번호 7의 서열 :
AAGCTTAATT AAGATCAATT TG 22
(2) 서열번호 8에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 8의 서열 :
GCCGCAGAAA GCGGTTCGCC 20
(2) 서열번호 9에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20매 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 9의 서열 :
ATCGGGTTGT TAGTTAACGC 20
(2) 서열번호 10에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22개 염기쌍
(B) 종류 . 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 10의 서열 :
CTATACTTCC TCCGTGTTTT CG 22
(2) 서열번호 11에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 11의 서열 :
CATCGCATAA ACCACTACAT 20
(2) 서열번호 12에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20채 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 12의 서열 :
GTTACTGCCC TGACCGGCGG 20
(2) 서열번호 13에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 13의 서열 :
GAATTCGACC GCCATTGCGC 20
(2) 서열번호 14에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 14의 서열 :
AAGTGGGTAT TTCACCTAAG 20
(2) 서열번호 15에 대한 정보 :
(xi) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 셤기쌍 20
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 15의 서열 :
AAGCTTGCAT TGAACTTGTG 20
(2) 서열번호 16에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 16의 서열 :
GTTTGCCGCC TGCTCTTCCC 20
(2) 서열번호 17에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 17의 서열 :
GACGGCGATT GAGCCGACGG 20
(2) 서열번호 18에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 : 20
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
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(xi) 서열번호 18의 서열 :
TTAGTACCGG TAGTGGCCTG 20
(2) 서열번호 19에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
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(xi) 서열번호 19의 서열 :
AAGCTTCCTT GTCAGCGAAA 20
(2) 서열번호 20에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
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(xi) 서열번호 20의 서열 :
CAGCGTTTCG TCAGCTTTGC 20
(2) 서열번호 21에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 21의 서열 :
CTACGTTATG GTTTACCGGC 20
(2) 서열번호 22에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 22의 서열 :
AAGTACGCGA CGGTGTACCG 20
(2) 서열번호 23에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 23의 서열 :
GCATCAACCG CAGGTTGCGC 20
(2) 서열번호 24에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 24의 서열 :
CACCGGCGTC ACGCAGCGTA 20
(2) 서열번호 25에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 19개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 25의 서열 :
GATCCGGTAC GCGTGATTT 19
(2) 서열번호 26에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 26의 서열 :
CCAGACGCAT AACTCCTCCC 20
(2) 서열번호 27에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 27의 서열 :
CGCTTGACTC CGTACATGAG 20
(2) 서열번호 28에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 28의 서열 :
TGGATAGCGT AACCTTACTT 20
(2) 서열번호 29에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(2) 서열번호 16에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 16의 서열 :
GTTTGCCGCC TGCTCTTCCC 20
(2) 서열번호 17에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 17의 서열 :
GACGGCGATT GAGCCGACGG 20
(2) 서열번호 18에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 : 20
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 18의 서열 :
TTAGTACCGG TAGTGGCCTG 20
(2) 서열번호 19에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 19의 서열 :
AAGCTTCCTT GTCAGCGAAA 20
(2) 서열번호 20에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 20의 서열 :
CAGCGTTTCG TCAGCTTTGC 20
(2) 서열번호 21에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 21의 서열 :
CTACGTTATG GTTTACCGGC 20
(2) 서열번호 22에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 22의 서열 :
AAGTACGCGA CGGTGTACCG 20
(2) 서열번호 23에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 23의 서열 :
GCATCAACCG CAGGTTGCGC 20
(2) 서열번호 24에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 24의 서열 :
CACCGGCGTC ACGCAGCGTA 20
(2) 서열번호 25에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 19개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 25의 서열 :
GATCCGGTAC GCGTGATTT 19
(2) 서열번호 26에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 26의 서열 :
CCAGACGCAT AACTCCTCCC 20
(2) 서열번호 27에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 27의 서열 :
CGCTTGACTC CGTACATGAG 20
(2) 서열번호 28에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 28의 서열 :
TGGATAGCGT AACCTACTT 20
(2) 서열번호 29에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 29의 서열 :
CCACAAGATG CAACCCCGAG 20
(2) 서열번호 30에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 : 20
(A) 길이 : 21개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(2) (D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 30의 서열 :
GACGTATCCA TATCATCCTC C 21
(2) 서열번호 31에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 31의 서열 :
TTGACGATGG ACGCGCTGGA 20
(2) 서열번호 32에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 32의 서열 :
CAATTGGTAT AACCAATGTG 20
(2) 서열번호 33에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 33의 서열 :
AAGCTTCAGC AGTGGGAGAA 20
(2) 서열번호 34에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 21개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 34의 서열 :
GTATAAACCG CCTTCCGGGC C 21
(2) 서열번호 35에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 35의 서열 :
CTGCACTGGC GGCGCAAACC 20
(2) 서열번호 36에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 36의 서열 :
ATAAGACGCG GACAGCGTCG 20
(2) 서열번호 37에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 37의 서열 :
AAAGCAAATA AATTTAATTT TT 22
(2) 서열번호 38에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 38의 서열 :
GGCCACCCGG CCTTTCGCTG 20
(2) 서열번호 39에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 19개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 19의 서열 :
TCTCGGCGTT GAATGTGGG 19
(2) 서열번호 40에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 40의 서열 :
CGACGTCTTC CATGGACGGC 20
(2) 서열번호 41에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 41의 서열 :
GTCAACAAAA TGCAATGGCG 20
(2) 서열번호 42에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 42의 서열 :
GCGTTATGCT TTTAGTGGCA CTGG 24
(2) 서열번호 43에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 20개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 43의 서열 :
AAGCTTACAC AGCATAACTG 20
(2) 서열번호 44에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 종류 : 직쇄상
(xi) 서열번호 44의 서열 :
CCAGGCAGGG CATCGGCGGG GG 22
(2) 서열번호 45에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 31개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열번호 45의 서열 :
ATATGAATTC GTCGGCAAGT CCATTCTCCC C 31
(2) 서열번호 46에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 31개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열번호 46의 서열 :
ATATGGATCC GCGGGAGTTA TTCTAGTTGC C 31
(2) 서열번호 47에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 87개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열번호 47의 서열 :
TATAGAATTC CCTTGTCAGC GAAAAAAATT AAAGCGCAAG ATTGTTGGTT TTTGCGTGAT 60
GGTGACCGGG CAGCCTAAAG GCTATCC 87
(2)서열번호 48에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 62개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열번호 48의 서열
ATATGGATCC AATCAGCTCC CTGGTTAAGG ATAGCCTTTA GGCTGCCCGG TCACCATCAC 60
GC 62
(2) 서열번호 49에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 형태 . 직쇄상
(xi) 서열번호 49의 서열 :
CGCCGAATTC GCGGCGTAAT ATATACGTCC CATC
34
(2) 서열번호 50에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 42개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열번호 50의 서열 :
CGCGGGATCC CATGACTCCT TGCTCATCGC ATGAAGACTC CG 42
(2) 서열번호 51에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열번호 51의 서열 :
CGCCGAATTC TGCCGCAGTT TGCGCGCTTT TCCCG 34
(2) 서열번호 52에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 . 38개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열번호 52의 서열 :
GCGCGGATCC GTCATTCTCC TTAAGTTAAC TAACCCGG
(2)서열번호 53에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 82개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열번호 53의 서열 :
CGCCGAATTC ATGAGAATTT TTTTTCTTTT TCGCCCTTGA AGGGGCGAAG CCTCATCCGC 60
ATTTCTCTGG TCAGCAGGGG GG 82
(2)서열번호 54에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 75개 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 쇄의 수 일본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열번호 54의 서열 :
GCGCGGATCC CGGAGCTTAC GTGGTTTCCC GGCTGGTGAC CAGAGAAATG GGGATGAGGC 60
TTCGCCCCTT CAAGG 75

Claims (28)

  1. 화합물의 독성을 측정하거나 독성 화합물에 대한 항독소를 규명하기 위한 진단 키트로서, 이 키트는 다수의 세균 숙주를 포함하며, 이들 숙주 각각은 스트레스(stress)에 대한 응답 반응하는 프로모터를 갖고 있으며, 이 프로모터는 이것과 이종성이며 분석가능한 생성물을 암호하는 유전자에 작동적으로 연결되어 있고, 상기 다수의 숙주는 모두 산화환원 스트레스, DNA 스트레스, 단백질 스트레스, 에너지 스트레스 및 pH 스트레스 각각에 대해 응답반응하는 1종 이상의 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    산화환원 스트레스에 대해 응답 반응하는 프로모터가 sodA, soi28, katG, ahp, rdc, gsh, zwf 및 micF로 이루어진 군 중에서 선택되는 진단 키트.
  3. 제1항에 있어서,
    DNA 스트레스에 대해 응답 반응하는 프로모터가 dinD, ada-alkA, ada, leu-500, gyr, top, mutT 및 nfo로 이루어진 중에서 선택되는 진단 키트.
  4. 제1항에 있어서,
    단백질 스트레스에 대해 응답 반응하는 프로모터가 ropD, lon, clpB, merR, fepB-entC, groE 및 meto로 이루어진 군 중에서 선택되는 진단 키트.
  5. 제1항에 있어서,
    에너지 스트레스에 대해 응답 반응하는 프로모터가 sdh, cyo, cyd 및 unc로 이루어진 군 중에서 선택되는 진단 키트.
  6. 제1항에 있어서,
    pH 스트레스에 대해 응답 반응하는 프로모터가 hag, micF, aniG 및 katF로 이루어진 군 중에서 선택되는 진단 키트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 다수의 세균 숙주가 모두 프로모터 soi28, dinD, hag, ada, gyr, katG, nfo, clpB, merR, top, cyd, micF, zwf, groE, katF 및 aniG를 포함하는 진단 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    rdc, ahp, lon, unc, fepB-entC, leu-500, cyo, sdh, rpoD, ada-alkA, sodA, mutT, gsh 및 meto로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 프로모터를 더 포함하는 진단 키트.
  9. 제1항 내지 제8항 주 어느 한 항에 있어서,
    분석 가능한 생성물을 암호하는 유전자가 lacZ인 진단 키트.
  10. (a) 다수의 세균 숙주 각각은 스트레스에 대해 응답 반응하는 1종 이상의 프로모터를 갖고 있으며, 이 프로모터는 이것과 이종성이며 검출가능한 생성물을 암호하는 유전자에 작동적으로 연결되어 있고, 상기 다수의 숙주는 모두 산화환원 스트레스, DNA 스트레스, 단백질 스트레스, 에너지 스트레스 및 pH 스트레스 각각에 대해 응답 반응하는 프로모터를 포함하는 이들 숙주 각각을 별도로 배양하는 단계;
    (b) 이 배양물 각각을 화합물과 항온처리하는 단계;
    (c) 각 배양물에서 상기 검출가능한 생성물을 정량하는 단계; 및
    (d) 상기 화합물에 대한 스트레스 프로모터의 유도 프로파일을 만드는 단계를 포함하는 화합물의 독성을 측정하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    산화환원 스트레스에 대해 응답 반응하는 프로모터가 sodA, katG, ahp, soi28, rdc, gsh, micF 및 zwf로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    DNA 스트레스에 대해 응답 반응하는 프로모터가 dinD, ada-alkA, ada, leu-500, gyr, top, mutT 및 nfo로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    단백질 스트레스에 대해 응답 반응하는 프로모터가 rpoD, lon, clpB, merR, fepB-entC, meto 및 groF로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  14. 제10항에 있어서,
    에너지 스트레스에 대해 응답 반응하는 프로모터가 sdh, cyo, cyd 및 unc로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    pH 스트레스에 대해 응답 반응하는 프로모터가 hag, katF, micF 및 aniG로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 다수의 세균 숙주가 모두 프로모터 soi28, dinD, hag, ada, gyr, katG, nfo, clpB, merR, top, cyd, micF, zwf, groE, katF 및 aniG를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 다수의 세균 숙주가 rdc, ahp, lon, unc, fepB-entC, leu-500, cyo, sdh, rpoD, ada-alkA, sodA, mutT, gsh 및 meto로 이루어진 군중에서 선택되는 1종 이상의 프로모터를 더 포함하는 방법.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    (b) 단계 이전에 상기 화합물을 S9 간 추출물과 항온처리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  19. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출가능한 생성물을 암호하는 유전자가 lacZ인 방법.
  20. (a) 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 독성 화합물에 의해 유발된 스트레스의 유형을 결정하는 단계;
    (b)제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 상기 독성 화합물에 의해 유발된 스트레스와 유사한 스트레스를 유발시키는 공지된 독성 화합물을 규명하는 단계; 및
    (c) 상기 공지된 독성 화합물에 대한 항독소를 규명하는 단계를 포함하는 독성 화합물에 대한 항독소를 규명하는 방법.
  21. (a) 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 사용하여 약물에 의해 유발된 스트레스의 유형을 결정하는 단계; 및
    (b) 이와 같이 결정된 스트레스를 일으키는 상기 약물의 일부분을 변형시키거나 제거하는 단계를 포함하는 약물의 독성을 감소시키는 방법.
  22. 제18항에 있어서,
    검출가능한 생성물을 암호하는 유전자가 lacZ인 방법.
  23. 제20항에 있어서,
    검출가능한 생성물을 암호하는 유전자가 lacZ인 방법.
  24. (a) 제18항에 기재된 방법에 따라 독성 화합물에 의해 유발된 스트레스의 유형을 결정하는 단계;
    (b) 제18항에 기재된 방법에 따라 상기 독성 화합물에 의해 유발된 스트레스와 유사한 스트레스를 유발시키는 공지된 독성 화합물을 규명하는 단계; 및
    (c) 상기 공지된 독성 화합물에 대한 항독소를 규명하는 단계를 포함하는 독성 화합물에 대한 항독소를 규명하는 방법.
  25. (a) 제19항에 기재된 방법에 따라 독성 화합물에 의해 유발된 스트레스의 유형을 결정하는 단계;
    (b) 제19항에 기재된 방법에 따라 상기 독성 화합물에 의해 유발된 스트레스와 유사한 스트레스를 유발시키는 공지된 독성 화합물을 규명하는 단계; 및
    (c) 상기 공지된 독성 화합물에 대한 항독소를 규명하는 단계를 포함하는 독성 화합물에 대한 항독소를 규명하는 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    검출 가능한 생성물을 암호하는 유전자가 lacZ인 방법.
  27. (a) 제18항에 기재된 방법을 사용하여 약물에 의해 유발된 스트레스의 유형을 결정하는 단계; 및
    (b) 이와 같이 결정된 스트레스를 일으키는 상기 약물의 일부분을 변형시키거나 제거하는 단계를 포함하는 약물의 독성을 감소시키는 방법.
  28. (a) 제19항에 기재된 방법을 사용하여 약물에 의해 유발된 스트레스의 유형을 결정하는 단계; 및
    (b) 이와 같이 결정된 스트레스를 일으키는 상기 약물의 일부분을 변형시키거나 제거하는 단계를 포함하는 약물의 독성을 감소시키는 방법.
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