NO319372B1 - Fremgangsmate, samt diagnostiske sett for bestemmelse av toksisitet ved anvendelse av bakterielle stresspromotere fusert til reporter-gener - Google Patents
Fremgangsmate, samt diagnostiske sett for bestemmelse av toksisitet ved anvendelse av bakterielle stresspromotere fusert til reporter-gener Download PDFInfo
- Publication number
- NO319372B1 NO319372B1 NO19950040A NO950040A NO319372B1 NO 319372 B1 NO319372 B1 NO 319372B1 NO 19950040 A NO19950040 A NO 19950040A NO 950040 A NO950040 A NO 950040A NO 319372 B1 NO319372 B1 NO 319372B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- stress
- promoter
- gene
- compound
- dna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 128
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 title claims abstract description 24
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 33
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 title description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 claims abstract description 198
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 174
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 124
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000008650 pH stress Effects 0.000 claims abstract description 11
- 101100063439 Escherichia coli (strain K12) dinD gene Proteins 0.000 claims description 22
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 20
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 20
- 101150007306 nfo gene Proteins 0.000 claims description 18
- 101150027964 ada gene Proteins 0.000 claims description 17
- -1 ada-alkA Proteins 0.000 claims description 17
- 101150100366 end gene Proteins 0.000 claims description 15
- 101150019302 alkA gene Proteins 0.000 claims description 14
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 claims description 14
- 101150013110 katG gene Proteins 0.000 claims description 14
- 101150036359 clpB gene Proteins 0.000 claims description 12
- 230000010335 redox stress Effects 0.000 claims description 12
- 101100509674 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) katG3 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 101150102864 rpoD gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101100149753 Drosophila melanogaster Syngr gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100091878 Plasmodium falciparum (isolate 3D7) rpoC2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150029016 rpo3 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150076849 rpoS gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150117326 sigA gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150078419 zwf gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101001027057 Bacillus subtilis (strain 168) Flagellin Proteins 0.000 claims description 8
- 101100174653 Dictyostelium discoideum g6pd-2 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101150085516 ZWF1 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 claims description 7
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 claims description 7
- 101150026856 zwf2 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101150043276 Lon gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101100235786 Rattus norvegicus Lonp1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 229940040511 liver extract Drugs 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 67
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 40
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 17
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 16
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 abstract description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 3
- 238000009510 drug design Methods 0.000 abstract description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 143
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 84
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 69
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 69
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 69
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 64
- 239000000047 product Substances 0.000 description 52
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 38
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 32
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 22
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 22
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 22
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 18
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 18
- FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L paraquat dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1 FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 17
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 16
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 15
- 101150087539 sodA gene Proteins 0.000 description 15
- 101150017120 sod gene Proteins 0.000 description 14
- 101150018269 sodB gene Proteins 0.000 description 14
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 13
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical class [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N methyl methanesulfonate Chemical compound COS(C)(=O)=O MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 101100150784 Escherichia coli (strain K12) sulA gene Proteins 0.000 description 11
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- YBMITDXVPZOTSK-QTKMDUPCSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxy-1-(2-nitrophenyl)hexan-1-one Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O YBMITDXVPZOTSK-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- VCMMXZQDRFWYSE-UHFFFAOYSA-N plumbagin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1O VCMMXZQDRFWYSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 10
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 10
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 10
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- YHQDZJICGQWFHK-UHFFFAOYSA-N 4-nitroquinoline N-oxide Chemical compound C1=CC=C2C([N+](=O)[O-])=CC=[N+]([O-])C2=C1 YHQDZJICGQWFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 7
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 7
- 101100062109 Desulfuromonas acetoxidans cyd gene Proteins 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 6
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 6
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 6
- 101150072263 mutT gene Proteins 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000012031 short term test Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000011724 DNA Repair Enzymes Human genes 0.000 description 5
- ZMOIGGHUSNHCAB-UHFFFAOYSA-N Isoplumbagin Natural products C1=CC(O)=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1 ZMOIGGHUSNHCAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 101150098704 SDH gene Proteins 0.000 description 5
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 5
- ALPCEXCHMFUSAN-UHFFFAOYSA-N beta-Dihydroplumbagin Natural products C1=CC=C2C(=O)C(C)CC(=O)C2=C1O ALPCEXCHMFUSAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 5
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 5
- 231100000039 Ames test Toxicity 0.000 description 4
- ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N Bipyridyl Chemical group N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 108010076525 DNA Repair Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 4
- 231100001074 DNA strand break Toxicity 0.000 description 4
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 4
- MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N Menadione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1 MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 4
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 101150055715 hag gene Proteins 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin Chemical compound O1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2OC2=C1C=C(Cl)C(Cl)=C2 HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 108091029792 Alkylated DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 101100137785 Escherichia coli (strain K12) proX gene Proteins 0.000 description 3
- 241000702189 Escherichia virus Mu Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- JJWSNOOGIUMOEE-UHFFFAOYSA-N Monomethylmercury Chemical compound [Hg]C JJWSNOOGIUMOEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 3
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 101150041755 fepB gene Proteins 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002432 hydroperoxides Chemical class 0.000 description 3
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 3
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 3
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 3
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008789 oxidative DNA damage Effects 0.000 description 3
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 3
- 150000007965 phenolic acids Chemical class 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BUZOGVVQWCXXDP-VPENINKCSA-N 8-oxo-dGTP Chemical compound O=C1NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 BUZOGVVQWCXXDP-VPENINKCSA-N 0.000 description 2
- 101100273316 Acinetobacter baylyi (strain ATCC 33305 / BD413 / ADP1) catF gene Proteins 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UGTJLJZQQFGTJD-UHFFFAOYSA-N Carbonylcyanide-3-chlorophenylhydrazone Chemical compound ClC1=CC=CC(NN=C(C#N)C#N)=C1 UGTJLJZQQFGTJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 230000007118 DNA alkylation Effects 0.000 description 2
- 230000000970 DNA cross-linking effect Effects 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010057366 Flavodoxin Proteins 0.000 description 2
- 101000836620 Homo sapiens Nucleic acid dioxygenase ALKBH1 Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 101100296558 Pseudomonas knackmussii (strain DSM 6978 / LMG 23759 / B13) pcaF gene Proteins 0.000 description 2
- 101100494806 Pseudomonas syringae pv. syringae katB gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 2
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 2
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 101150083380 adaA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000001909 effect on DNA Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 101150015067 fabB gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 2
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 101150001899 lacY gene Proteins 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150004478 merR gene Proteins 0.000 description 2
- 229960002523 mercuric chloride Drugs 0.000 description 2
- 150000002731 mercury compounds Chemical class 0.000 description 2
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 231100001223 noncarcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 2
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- PVYJZLYGTZKPJE-UHFFFAOYSA-N streptonigrin Chemical compound C=1C=C2C(=O)C(OC)=C(N)C(=O)C2=NC=1C(C=1N)=NC(C(O)=O)=C(C)C=1C1=CC=C(OC)C(OC)=C1O PVYJZLYGTZKPJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tert‐butyl hydroperoxide Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000012711 vitamin K3 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011652 vitamin K3 Substances 0.000 description 2
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 1
- BGGXFWKAGMTQIO-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-1-oxidoquinolin-1-ium Chemical compound C1=CC=CC2=[N+]([O-])C([N+](=O)[O-])=CC=C21 BGGXFWKAGMTQIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRIBMENBGGCKPD-UHFFFAOYSA-N 3-(2,3-dimethoxyphenyl)prop-2-enal Chemical compound COC1=CC=CC(C=CC=O)=C1OC FRIBMENBGGCKPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 4-nitrophenyl-α-d-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 0.000 description 1
- ZPVSFHWMXABGPU-UHFFFAOYSA-N 4-nitroquinoline Chemical compound C1=CC=C2C([N+](=O)[O-])=CC=NC2=C1 ZPVSFHWMXABGPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000007566 ATP-Dependent Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010071550 ATP-Dependent Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 101100417113 African swine fever virus (isolate Tick/Malawi/Lil 20-1/1983) Mal-103 gene Proteins 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- OWNRRUFOJXFKCU-UHFFFAOYSA-N Bromadiolone Chemical compound C=1C=C(C=2C=CC(Br)=CC=2)C=CC=1C(O)CC(C=1C(OC2=CC=CC=C2C=1O)=O)C1=CC=CC=C1 OWNRRUFOJXFKCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 101100499417 Chlamydia pneumoniae dnaA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PMPVIKIVABFJJI-UHFFFAOYSA-N Cyclobutane Chemical class C1CCC1 PMPVIKIVABFJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 239000012624 DNA alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 101100425816 Dictyostelium discoideum top2mt gene Proteins 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 1
- 102100037777 Galactokinase Human genes 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010036164 Glutathione synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100034294 Glutathione synthetase Human genes 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical class OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N L-canavanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCONC(N)=N FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101100278084 Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) dnaK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100027051 Nucleic acid dioxygenase ALKBH1 Human genes 0.000 description 1
- FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N O-guanidino-DL-homoserine Natural products OC(=O)C(N)CCON=C(N)N FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 1
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108010063499 Sigma Factor Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101100117145 Synechocystis sp. (strain PCC 6803 / Kazusa) dnaK2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 101001066237 Treponema pallidum (strain Nichols) Putative galactokinase Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- WTIJXIZOODAMJT-WBACWINTSA-N [(3r,4s,5r,6s)-5-hydroxy-6-[4-hydroxy-3-[[5-[[4-hydroxy-7-[(2s,3r,4s,5r)-3-hydroxy-5-methoxy-6,6-dimethyl-4-(5-methyl-1h-pyrrole-2-carbonyl)oxyoxan-2-yl]oxy-8-methyl-2-oxochromen-3-yl]carbamoyl]-4-methyl-1h-pyrrole-3-carbonyl]amino]-8-methyl-2-oxochromen- Chemical compound O([C@@H]1[C@H](C(O[C@H](OC=2C(=C3OC(=O)C(NC(=O)C=4C(=C(C(=O)NC=5C(OC6=C(C)C(O[C@@H]7[C@@H]([C@H](OC(=O)C=8NC(C)=CC=8)[C@@H](OC)C(C)(C)O7)O)=CC=C6C=5O)=O)NC=4)C)=C(O)C3=CC=2)C)[C@@H]1O)(C)C)OC)C(=O)C1=CC=C(C)N1 WTIJXIZOODAMJT-WBACWINTSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- JCHLKIQZUXYLPW-UMMCILCDSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6,8-dioxo-3,7-dihydropurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2NC(=O)N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O JCHLKIQZUXYLPW-UMMCILCDSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 101150073130 ampR gene Proteins 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000002959 beta galactosidase induction Methods 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007665 chronic toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000160 chronic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000002508 compound effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 101150018737 cyd gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 101150067506 dinB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073209 dinD gene Proteins 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150020338 dnaA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- HPWMACWMMZPMSS-UHFFFAOYSA-N ethane;sulfuric acid Chemical compound CC.OS(O)(=O)=O HPWMACWMMZPMSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006846 excision repair Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 1
- 230000004133 fatty acid degradation Effects 0.000 description 1
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108010020410 methionine sulfoxide reductase Proteins 0.000 description 1
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001459 mortal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002352 nonmutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 101150073640 ompF gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000001451 organic peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 101150015673 porin gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011886 postmortem examination Methods 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002265 redox agent Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000003303 reheating Methods 0.000 description 1
- 231100000916 relative toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 101150000706 rimK gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 101150082896 topA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 239000004061 uncoupling agent Substances 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse fremskaffer fremgangsmåter og diagnostiske sett for bestemmelse av en forbindelses toksisitet. Fremgangsmåtene og de diagnostiske sett ifølge foreliggende oppfinnelse anvender et antall bakterielle vertsorganismer, hvorav hver har en DNA-sekvens som koder for en forskjellig stresspromoter fusert til et gen som koder for et påviselig produkt. Hver av disse stresspromotere blir indusert ved eksponering til en forskjellig type cellulært stress. Stresspromoterne som anvendes i foreliggende oppfinnelse, omfatter totalt de promotere som reagerer på redox-stress, DNA-stress, proteinstress, energistress og pH-stress. Fremgangsmåtene og de diagnostiske sett ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å karakterisere og mengdebestemme toksisiteten av en forbindelse, så vel som å identifisere den cellulære mekanisme av den toksiske virkning. Videre gir fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse informasjon om en forbindelses virkning på subcel-lulært nivå. Denne informasjon kan anvendes til å utforme antitoksiner til forbindelser som er funnet å være toksiske samt i aktiv medikamentutforming.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Minst 55.000 kjemikalier blir for tiden produsert i de fo-rente stater. Over 2000 nye kjemikalier blir innført på markedet hvert år. Meget få av disse kjemikalier har blitt omfattende undersøkt for akutt eller kronisk toksisitet.
For eksempel har mindre enn 1 prosent av kommersielle kjemikalier undergått fullstendig helserisikovurdering.
The Environmental Protection Agency ("EPA") har autoritet til å kreve toksikologisk undersøkelse av et kjemikalium før kommersiell produksjon, men denne autoritet blir sjel-den håndhevet. Mindre enn 10 prosent av nye kjemikalier blir utsatt for detaljert undersøkelse av EPA. På grunn av ønsket om lave kostnader og hurtig tilgang til markedet anvender EPA ofte tidligere undersøkte homologe forbindelsers toksisitet for å angi et nytt kjemikaliums toksisitet.
Den potensielle toksisitet av nye medikamenter blir overvåket av the Food and Drug Administration ("FDA"). For en søknad om anerkjennelse av et nytt medikament (New Drug Application (NDA)) krever FDA en mengde toksisitets-, kar-sinogenisitets-, mutagenisitets- og reproduksjons/fertili-tetstester i minst to arter av levende dyr. Det kreves at disse forsøk skal vare i opptil ett år. Kostnaden forbundet med å få utført disse forsøkene, er enorme. For eksempel koster en typisk 90 dagers eksponeringstoksisitetstest på rotter omkring $100.000. En to års toksisitetstest på rotter koster omkring $800.000 [Casarett andDoull's Toxico-logy, 4. utgave, M. O. Amdur et al., red., Pergamon Press, New York, NY, side 37 (1991)].
Ved siden av kostnader utviser dyreforsøk også ulemper når det gjelder tid, dyrets lidelse og nøyaktighet. Typiske toksisitetstester er delt i tre stadier: akutt, korttids og langtids. Akutte tester, som bestemmer LD50for en forbindelse {dosen ved hvilken 50% av forsøksdyrene dør) krever 60-100 dyr og et antall forsøk for å bestemme LDso, dose-responskurver og for overvåking av kliniske endepunkter, andre enn død. Korttidstester involverer vanligvis minst 24 hunder og 90 rotter og varer fra 90 døgn med rotter til 6-14 måneder med hunder. Kroppsvekt, matinntak, blod, urin og vevsprøver blir ofte målt i korttidstester. I tillegg blir døde dyr utsatt for post mortemundersøkelser. Lang-tidstester ligner korttidstester, men varer minst 2 år med rotter og opptil 7 år med hunder eller aper.
Dyreforsøk har blitt gjenstand for kritikk fra aktivister
for dyrenes rettigheter og publikum generelt på grunn av de alvorlige lidelser som dyrene utsettes for. Dessuten setter nye funn spørsmålstegn ved nøyaktigheten av dyreforsøk. For eksempel kan variabler, så som dyrefor, skade forutsigbar-heten av dyreforsøk ved bestemmelse av karsinogene egenska-per [P.H. Abelson, "Diet and Cancer in Humans and Todents", Science, 255, s. 141 (1992)]. Tidligere bestemmelse angå-
ende dioksintoksisitet, basert på marsvinforsøk, blir nå vurdert på nytt [B.J. Culiiton, "OS Government Orders New Look At Dioxin", Nature, 352, s. 753 (1991),- L. Roberts, "More Pieces in the Dioxin Puzzle", Research News, October 1991, s. 377]. Det er derfor tydelig at det består et tvingende behov for et raskt, billig og pålitelig alterna-tiv til toksisitetsforsøk på dyr.
Flere alternative korttidstester er tilgjengelige. For eksempel påviser Ames Assay karsinogener som forårsaker gene-tisk reversjon av mutante stammer av Salmonella typhimurium. Imidlertid kan Ames Assay ikke påvise verken ikke-muta-gene karsinogener eller ikke-karsinogene toksider. Gjær-karsinogen-assaysystemet beskrevet i US patent 4.997.757 overvinner enkelte av ulempene hos Ames Assay, men er fremdeles ikke i stand til å påvise ikke-karsinogene toksiner. Begge disse assays er utformet for å påvise endringer og mutasjoner kun ved DNA-nivå. Derfor kan disse tester ifølge tidligere teknikk ikke påvise direkte skade på proteiner eller lipidmembraner og heller ikke inhibitorer av DNA-syntese. Videre gir ingen av korttidstestene som anvendes for tiden, noen informasjon omkring den cellulære mekanisme hvorved et karsinogen, mutagen eller toksin utøver sin virkning. Følgelig viser disse assays ifølge tidligere teknikk heller ikke noen informasjon som ville være til nytte for utvelgelse av et motvirkende middel eller motgift for en forbindelse som er funnet å være toksisk.
Det er fra EP 0063522 A2 kjent rekombinante celler som består av et sfi-gen og et gen som koder for LacZ. De rekombinante cellene er transformerte E. coli og er velegnet for mutasjonsstudier. Mutasjoner kan påvises ved å måle forskjellige nivåer av p-galaktosidase. I PNAS, vol. 89, april 1992, WASHINGTON OS s.3217-3221, Hassan et al., "Re-gulatory roles of Fur, Fur and Are in expression of manga-nese-containing superoxide dismutase in E. coli" er det studert reguleringsfunksjoner for Fur-; Fur- og Arc-genene ved mutasjoner i de forskjellige genene og hvordan dette påvirker ekspresjonen av sodA - lacZ (sodA koder for superoksyd oksidoreduktase) i E. coli. I PNAS, vol. 85, juli 1988, WASHINGTON US s. 4799 - 4803, Kogoma et al., "Isolation of gene fusions inducible by oxidative stress in E. coli" beskrives isolering av 3 fusjonsgener, fusjonert til lacZ-genet i E. coli for å studere induksjon av oksydativt stress. Induksjonen kan påvises ved ekspresjon av P-galaktosidase.
Oppsummering av oppfinnelsen
Søkeren har løst problemene angitt ovenfor ved å fremskaffe en fremgangsmåte som kombinerer et antall DNA-konstruksjoner, som hver omfatter en forskjellig stresspromoter fusert til en DNA-sekvens som koder for et påvisbart polypeptid, så som p-galaktosidase.
En passende bakteriell vertsorganisme som bærer en hvilken som helst av disse fusjoner er et in vivo diagnostisk rea-gens for bestemmelse av om en gitt forbindelse induserer den spesielle stresspromoter som stammen inneholder. Ved å inkubere en slik vertsorganisme med en gitt forbindelse og undersøke for det påviselige polypeptid kan man raskt og lettvint bestemme om en spesiell stresspromoter induseres eller undertrykkes av forbindelsen. Ved å gjenta denne fremgangsmåte med et antall vertsorganismer hvor hver orga-nisme inneholder en annen stresspromoter genfusjon, kan toksisiteten av en forbindelse både mengdebestemmes og ka-rakteriseres med hensyn til hvordan den skader cellen.
Foreliggende oppfinnelse fremskaffer slike sett av vertsorganismer i form av diagnostiske sett for å undersøke og karakterisere toksisitet. Disse sett som omfatter de trekk som er angitt i krav l's karakteriserende del er optimalt utformet for å bestemme toksisiteten av en forbindelse i løpet av dager i stedet for måneder eller år, noe som er nødvendig ved dyreforsøk. Videre oppnår settene ifølge fo religgende oppfinnelse disse resultater for en liten del av kostnadene ved dyreforsøk og uten de uheldige konsekvenser for levende dyr. I tillegg gir de diagnostiske sett og metoder ifølge foreliggende oppfinnelse informasjon om naturen av et toksins virkning på cellen, noe som korttidsfor-søkene ifølge tidligere teknikk ikke klarer å gjøre.
Oppfinnelsen muliggjør også identifikasjon av et antitoksin til en forbindelse som er påvist å være toksisk, ved hjelp av metodene ifølge foreliggende oppfinnelse. Oppfinnelsen fremskaffer også en fremgangsmåte for å minske toksisiteten av et medikament.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 viser induksjonen av merR-, sfiA- og sodA-promoterne ved varierende konsentrasjoner av metyllkvikksølv, som målt ved p-galaktosidasesyntese. Figur 2 viser induksjonen av sfiA-, ada-alkA-, nfo- og dinD-promoterne ved varierende konsentrasjoner av 4-nitro-quinolin, som målt ved p-galaktosidasesyntese. Figur 3 viser induksjonen av sfiA-, ada-alkA-, nfo- og dinD-promoterne ved varierende konsentrasjoner av metylme-tansulfat, som målt ved p-galaktosidasesyntese. Figur i viser induksjonen av soil7-, soil9- og soi28-promoterne ved varierende konsentrasjoner av plumbagin, som målt ved p-galaktosidåsesyntese. Figur 5 viser induksjonen av sodA-, proU- og soil7-promoterne ved varierende konsentrasjoner av natriumklorid som målt ved p-galaktosidasesyntese. Figur 6 viser induksjonen av fepB-, sodA- og sfiA-promoterne ved varierende konsentrasjoner av 2,2<1->dipyridyl, som målt ved p-galaktosidasesyntese- Figur 7 viser induksjonen av aniG-, sfiA- og soil7-promoterne ved forskjellige pH, som målt ved p-galaktosidasesyntese. Figur 8 viser induksjonen av soil7-, soil9-, soi26 og katG-promoterne ved varierende konsentrasjoner av hydrogenperoksyd, som målt ved P-galaktosidasesyntese. Figur 9 viser effekten av forskjellige konsentrasjoner av metylmetansulfonat på induksjonen av hver av de seksten stresspromotere i de fleste foretrukne diagnostiske sett ifølge foreliggende oppfinnelse, som målt ved størrelsen av økning i p-galaktosidaseaktivitet. Figur 10 viser effekten av forskjellige konsentrasjoner av kvikksølvklorid på induksjonen av hver av de seksten stresspromotere i de fleste foretrukne diagnostiske sett ifølge foreliggende oppfinnelse, som målt ved størrelsen av økning i p-galaktosidaseaktivitet. Figur 11 viser effekten av forskjellige konsentrasjoner av nitroquinolinoksyd på induksjonen av hver av de seksten stresspromotere i de fleste foretrukne diagnostiske sett ifølge foreliggende oppfinnelse, som målt ved størrelsen av økning i p-galaktosidaseaktivitet. Figur 12 viser effekten av forskjellige konsentrasjoner av paraquat på induksjonen av hver av de seksten stresspromotere i de mest foretrukne diagnostiske sett ifølge foreliggende oppfinnelse, som målt ved størrelsen av økning i galaktosidaseaktivitet.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Som brukt heri blir uttrykkene "stress" og "toksisitet" brukt om hverandre og refererer til forstyrrelsen av cellens biokjemiske og biofysiske homeostase.
Uttrykket "redox-stress" som brukt i foreliggende søknad, refererer til tilstander som varierer fra den normale re-duksjons /oksydasjonspotensiale ("redox")-tilstand hos cellen. Redox stress innbefatter økede nivåer av superoksyder, økede nivåer av peroksyder - både hydrogenperoksyd og organiske peroksyder, økede nivåer av glutation og alle andre tilstander som endrer redox-potensialet hos cellen, så som eksponering til sterke reduksjonsmidler.
Uttrykket "DNA-stress" som brukt heri, refererer til endringer i deoksyribonukleinsyre eller precursornukleotider. For eksempel innbefatter DNA-stress brudd i DNA-kjeden, DNA-kjedekryssbinding, eksponering til DNA-interkalaterende midler, både øket og senket superhelisitet, oksydativ DNA-skade, DNA-alkylering, oksydering av nukleotldtrifosfater og alkylering av nukleotldtrifosfater. Uttrykket innbefatter også inhibering av DNA-syntese og replikasjon.
"Proteinstress" som brukt i søknaden, refererer til endringer hos proteiner eller enkelte aminosyrer, så vel som endringer i intracellulær transport av proteiner. Uttrykket innbefatter denaturering av proteiner, misfolding av proteiner, chelatering av proteinkofaktorer, kryssbinding av proteiner, både .oksygenavhengig og uavhengig oksydering av inter- og intrakjedebindinger, så som disulfidbindinger, alkylering av proteiner, oksydasjon av individuelle aminosyrer og proteinskade forårsaket av eksponering til tungmetaller, så som kadmium.
Uttrykket "energistress" blir brukt for å omfatte tilstander som påvirker ATP-nivåene i cellen. Eksempler på energistress er påtvunget anaerobisk metabolisme i nærvær av oksygen, forstyrrelser av elektrontransporten og eksponering til dekoblingsmidler.
Uttrykket "pH-stress" som brukt heri refererer til tilstander som forårsaker forstyrrelser i intracellulær pH, dvs. som nedsetter intracellulær pH til under 6,0 eller øker intracellulær pH til over 7,5. pH-stress kan f.eks. forårsa-kes av at cellen eksponeres til ionoforer eller andre cellemembranødeleggende komponenter eller av at de eksponeres til svake organiske hydrofobe syrer, så som fenolsyre. Ut-trykket innbefatter også cellemembranskade og skadende endringer i elektromotivt potensiale.
Uttrykket "stresspromoterinduksjon" refererer til tilstander som enten øker eller minker nivået av ekspresjon av påvisbare genprodukter.
Individuelle celler reagerer på toksiske stimuli, delvis ved å aktivere spesifikke gener hvis proteinprodukter de-toksifiserer stimuliene eller reparerer skade forårsaket av disse. Pattedyrceller og bakterieceller har til felles et stort antall genetiske og biokjemiske responser på skade og stress. For de fleste stressresponsgener som er funnet i pattedyr, har et nært relatert gen blitt identifisert i bakterier. For eksempel har det blitt vist at et bakterielt DNA-reparasjonsenzym med hell kan komplementere en human celle som mangler sitt eget DNA-reparasjonsenzym [E. Fried-berg, "DNA Repair", Microbiol. Review, 52, s. 70 (1988)]. Således er bakterielle responser på stress temmelig nøyak-tige angivere av stressresponser i høyere eukaryoter.
Minst 35 forskjellige bakterielle stressgener har allerede blitt isolert ogkarakterisert. Disse gener blir indusert av et antall kjemiske stressfaktorer eller cellulær skade. Blant de kjemiske stressfaktorer som induserer ett eller flere av disse identifiserte gener, er eksponering av cellen til kvikksølv, tungmetaller, nitroksyder, aromatiske hydrokarboner, surhet, basisitet, alkyleringsmidler, peroksyder ingsmidler, kryssbindende midler, ionoforer, aktive redox-midler og dekoblingsmidler. Eksempler på cellulær skade som induserer disse identifiserte gener, er lipidok-sydering, brudd i DNA-kjeden, DNA-alkylering, DNA-kryssbin ding, DNA-oksydering, osmotisk ubalanse, proteinoksydering, protein-misfolding, proteinalkylering, ATP-tap, membranper- . meabilisering og glutationtap. Det er antatt at det eksisterer mange flere stressgener. Identifiseringen og karakte-riseringen av disse ytterligere stressgener er meget ønskelig for forståelsen av hvilke effekter forskjellige kjemiske stressfaktorer har på cellen.
Foreliggende oppfinnelse fremskaffer diagnostiske sett og fremgangsmåter for å bestemme og karakterisere toksisiteten av en forbindelse med hensyn til typen av skade som den forårsaker i cellen, dvs. DNA-skade, proteinskade, redox-skade osv. Hvert diagnostisk sett ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et antall bakterielle vertsceller, hvor hver inne- holder en bakteriell stresspromoter operativt forbundet til et gen som koder for et påvisbart produkt. Denne konstruksjon kan være lokalisert i det bakterielle kromosom eller på et ekstrakromosomalt element, så som et plasmid. Fortrinnsvis er konstruksjonen til stede som en enkelt kopi i cellens bakterielle kromosom.
Graden av induksjon eller represjon av en spesiell stresspromoter måles ved nivået av påvisbart produkt, sammenlignet med en ubehandlet kontrollkultur av samme vertsorganisme. Fremgangsmåten og settene ifølge foreliggende oppfinnelse karakterisering av typen cellulær skade forårsaket av en forbindelse.
Stresspromoterne som anvendes i de diagnostiske sett og fremgangmåter ifølge foreliggende oppfinnelse har blitt valgt basert på de spesifikke typer stress overfor hvilke genet de normalt regulerer, reagerer. Fordi promotere kon-trollerer genekspresjon er det promoteren som faktisk blir indusert av stress. Dersom promoteren er fusert til et gen som koder for et annet polypeptid, vil ekspresjonen av dette peptid følgelig bli påvirket ved eksponering til den spesielle stresstype som induserer promoteren.
Således kan man, ved å bestemme hvilke spesielle stresspromotere som blir indusert av en forbindelse og sammenligne disse resultater med standardkurver dannet ved eksponering til forbindelser som er kjent for å forårsake spesifikke stresstyper, forutsi og karakterisere den spesifikke type cellulært stress som denne forbindelse vil forårsake. Dette er viktig, både når det gjelder å bestemme tolererbare inn-taksnivåer av en forbindelse og å bestemme symptomer som kan bli korrelert med dens toksisitet. Enda viktigere er det at informasjonen som kan fremskaffes ved bruken av settene og fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, mu-liggjør utarbeidelse av effektive antitoksiner overfor en toksisk forbindelse, så vel som optimalisering av nye medi-kamentutforminger.
De diagnostiske sett og fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse anvender et antall bakterielle vertsorganismer. Totalt omfatter disse vertsorganismer promotere som reagerer på hver av: redox-stress, DNA-stress, proteinstress, energistress og pH-stress.
Foretrukket er promoterne som reagerer på redox-stress i fremgangsmåten og settene ifølge foreliggende oppfinnelse, valgt fra promoterne av sodA-, soi28-, katG-, ahp-, rdc-, gsh-, zwf- og micF-genene.
sodA-genet koder for superoksyd-dismutase og blir sterkt indusert når celler eksponeres til kjemikalier som danner superoksydradikaler i cellen, så som paraquat, plumbagin,
menadion, streptonigrin, metylenblått og fenazinmetylsulfat [A. Carlioz et al., EMBO J., 5, s. 623.30 (1986); T. Kogoma et al.. Proe. Nati. Acad. Sei. OSA, 85, s. 4799-803 (1988);
D. Touati, J. Bacteriol., 170, s. 2511-20 (1988); F. Tsa-neva et al., J. Bacteriol., 172, s. 4197-205 (1990)]. sodA-genet induseres også ved metallchelatorer, så som 1,10-fe-nantrolin, 2,2'-dipyridyl og EDTA [D.Touati, supra]. sodA-geninduksjon avhenger av en økning i steady state superok- sydkonsentrasjonen, ikke nødvendigvis av cellulær skade forårsaket av superoksyder.
soi28-genet koder for en pyruvat:flavodoksin-oksidoreduktase. Dette gen induseres kun av superoksyddannende reagen-ser. Spesifikt induseres soi28-genet når to små tiol- inneholdende proteiner - flavodoksin og ferredoksin - blir oksydert. Disse proteiner i redusert form er nødvendige for DNA-syntese. Følgelig kan alvorlig superoksydstress forårsake opphør av DNA-syntese.
katG-genet har blitt beskrevet av P. C. Loewen et al., Bacteriol., 162, s. 661-67 (1985), og beskrivelsen av dette er heri innbefattet pr. referanse. katG-genet koder for en hydrogenperoksydinduserbar katalaseaktivitet. Det kan bli indusert spesielt av H2O2eller forbindelser som forårsaker produksjon av H2O2i cellen. katG-genet reagerer imidlertid ikke på superoksyddannende forbindelser.
ahp-genet induseres av hydrogenperoksyd og organiske hydroperoksyder, både eksogene og slike som er dannet ved per-oksydering av proteiner og fettsyrer. Kloningen og sekvens-eringen av ahp-genet ble beskrevet av G. Storz et al., J. Bacteriol., 171, s. 2049-55 (1989), hvis beskrivelse er innbefattet heri pr. referanse. ahp-promoter-lacZ-fusjonen kan anvendes til å skjelne mellom 1ipidperoksyderingsskade og eksogene organiske hydroperoksyder ved å klone konstruksjonen i en fettsyresyntese og en nedbrytningsmutant av E. coli. En slik stamme, som er eksemplifisert av en fabB, fadE-genotype, kan dannes slik at den inkorporerer perok-sydasjonssensitive fettsyrer i sin cellemembran ved vekst på et substrat inneholdende slike fettsyrer. Induksjonen av ahp-promoterkontrollert ekspresjon av lacZ i en slik stamme kan indikere at en forbindelse forårsaker lipidperoksydering. Dette kan bli bekreftet ved å undersøke en vill-type-stamme av E. coli som inneholder samme konstruksjon. Hvis samme forbindelse ikke klarer å indusere Ø-galaktosidase-
ekspresjon i denne sistnevnte stamme, bekrefter dette at forbindelsen forårsaker lipidperoksydering, men er ikke i seg selv et organisk hydroperoksyd.
rdc-promoteren er søkers navn for den tiolsensitive promoter som har blitt beskrevet av G. T. Javor et al., J. Bacteriol., 170, s. 3291-95 (1988). Denne promoter blir indusert av tiolglyserol og andre sterke reduserende stoffer.
gsh-genet koder for glutation-syntetase og blir indusert av forbindelser som nedsetter cellulære glutationnivåer, så som N-etylmaleimid. gsh-genet har blitt klonet og sekvensert [H. Gushima et al., Nucleic Acid Res., 12, s. 9299-307
(1985), hvis beskrivelse heri er innbefattet pr. referanse] .
zwf-genet koder for glukose-6-hydrogenase og induseres av superoksyddannende forbindelser og nitrogenoksyd [J. T. Greenberg et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87, s. 6181-85 (1990)1. Zwf-genet har blitt klonet og sekvensert [D. L. Rowley et al., J. Bacteriol., 173, s. 968-77 (1991).
micF-genet koder for antisense RNA som stenger av translasjon av poringenet, ompF. Dette gen induseres av superoksyddannende forbindelser, så som paraquat [J. T. Greenberg et al., supra]. micF-genet blir også indusert av etanol og av varmesjokk. micF-genet har blitt klonet og sekvensert [T. Mizuno et al., Proe. Nati. Adac. Sei. USA, 81, s. 1966-70
(1984).
Andre redox-stresspromotere som kan anvendes i de diagnostiske sett og fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter soil7 og soil9, som reagerer på superoksyder IT. Kogoma et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, s. 4799-803 (1988)].
Promoterne som reagerer på DNA-stress som er anvendelige ved fremgangsmåtene og settene ifølge foreliggende oppfinnelse, blir fortrinnsvis valgt fra promoterne av dinD-, ada-, ada-alkA-, leu-500-, gyr-, top-, mutT- og nfo-genene.
dinD-genet er en del av et større regulon, SOS-regulonet, som reagerer på forstyrrelse av DNA-replikasjon. Forstyrrelse av DNA-replikasjon blir oftest forårsaket av en begrenset klasse DNA-lesjoner, innbefattende kjedebrudd og "cyklobutan-dimerer". Typiske indusere for dinD innbefatter forbindelser som mitomycin C, bleomycin og 4-nitroquinolinoksyd, så vel som eksponering til OV-bestråling. dinD-promoteren reagerer ikke på oksydativ DNA-skade, bortsett fra når celler eksponeres til ekstremt høye konsentrasjoner av H202(som resulterer i DNA-kjedebrudd). dinD-promoteren blir heller ikke generelt indusert av alkylert DNA eller oksydativt skadet DNA [S. Kenyon et al.. Nature, 289, s. 808-12 (1981)].
ada-genet koder for et protein som reagerer spesifikt på alkylert DNA. Dette, i sin tur, regulerer seg selv og andre gener (alkA og alkB) som er involvert i reparasjonen av alkylert DNA. ada-, alkA- og alkB-genene er alle deler av samme operon. Alkyleringsskade på DNA innbefatter dannelse av O-6-alkylguanin og 3-alkyladenin. Kjente alkyleringsmidler som induserer ada-genekapresjon innbefatter metylmetansulfonat (MMS), etylmetansulfonat (EMS) og N-metyl-N'-ni-tro-N-nitrosoguanidin (MNNG) [B. Demple, Bioessays, 6, s. 157-160 (1987)]. ada-genet har blitt klonet og sekvensert [Y. Nakabeppu et al., J. Biol. Chem., 260, s. 7281-88
(1985), hvis beskrivelse er innbefattet heri pr. referanse] .
leu-500 promoteren er en mutantpromoter i det Salmonella
typhimurium leucin biosyntetiske operon. Promoterfunksjonen kan bli restaurert ved å øke DNA-superkveiling i cellen [D. M.L. Lilley et al., Molec. Microbiol., 5, s.779-83 (1991)].
Følgelig kan en leu-500-lacZ-fusjon innsatt i enten en S. typhimurium- eller en E. coli-vertsorganisme brukes til å påvise midler som forårsaker øket superkveiling.
gyr-genet koder for et av helicase-enzymene i E. coli. Dette enzym overvåker og opprettholder den korrekte grad av DNA-superkveiling ved å øke superkveilingen. Midler som minker superkveiling av DNA i cellen, så som DNA-kjede kryssbindingsmidler, induserer gyr-promoteren [K. Drlica et al.,Biochemistry, 27, s. 2252-59 (1988)].
top-genet koder for en topoisomerase som fjerner super-kveilinger i overkveilet DNA. [K.Drlica et al., supra]. Transkripsjon av top-genet stimuleres ved behandlinger som øker superkveiling [Y.-C. Tse-Dinh et al., J. Mol. Biol.,
202, s. 735-42 (1988)]. Det reagerer følgelig på en måte som er motsatt av gyr-genets, som induseres ved behandlinger som minker superkveilingen. I gjær inkluderer midler som induserer top-genekspresjon også rekombinasjon, noe som antyder at rekombinasjon blir lettet av top-isomerase. Derfor antar søker at top-geninduksjon kan bli brukt for å identifisere "rekombinogeniske" midler, som generelt er sterke karsinogener.
mutT-genet koder for et 15 kilodalton protein som spesielt nedbryter 8-oxo-dGTP til GMP. 8-oxo-GTP dannes ved røntgen-bestråling, så vel som mange naturlig forekommende oksy-danter [H. Maki og M. Sekiguchi, Nature, 355, s. 273-75
(1992)]. mutT induseres av midler og tilstander som forårsaker cellulær produksjon av 8-oxo-dGTP.
nfo-genet koder for et DNA reparasjonsenzym som er spesifikt for oksydativ skade. Spesielt er slik skade dannelsen av 3<1->blokkerende grupper, så som 3' glykolater, dannet ved spaltingen av imidazolringen hos nukleinsyrer [B. Demple et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, s. 7731-35 (1986)].
Andre DNA reparasjonsenzymer reagerer ikke på denne DNA-skade [S. Saporito et al., J. Bacteriol., 170, s. 5141-45
(1988)}. nfo induseres spesielt av aktive redox midler, så
som paraquat og menadion [S. Farr et al., Microbio1. Rev., 55, s. 561-85 (1991)].
Andre promotere som reagerer på DNA-stress og kan bli brukt i fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatter dnaA, som koder for et protein involvert i DNA-replikasjonen og induseres av midler som blokkerer replikasjon [C. Kenyon et al., J. Mol. Biol.. 160, s. 445-57 (1982)]; sfiA, som koder for et protein involvert i utkuttingsrepa-rasjon av DNA og induseres ved eksponering til UV-bestråling [P.Quillardet et al., J. Bakteriol., 157, s. 36-38
(1984)]; nrd, som koder for ribonukleotid reduktase, et protein som er nødvendig for DNA-syntese og induseres av midler som hemmer DNA-syntese [P. Reichard, Ann. Rev. Biochem., 57, s. 349-74 (1988)]; dinB, hvis funksjon er ukjent, men som induseres av midler som skader DNA [G. C. Walker et al., J. Mol. Biol., 160, s. 445-57 (1982)]; recA, som induseres av enkeltkjedede DNA-kutt og DNA-kryssbindende midler [S. Caseragola et al., 185, s. 430-39 (1982)]; og aidC, som induseres av plasskrevende DNA alkyleringsmidler [R. Fram et al., Cancer Res., 48, s. 4823-26 (1988)].
De promoterne som reagerer på proteinstress som er anvendelige i fremgangsmåten og settene ifølge foreliggende oppfinnelse, er valgt fra rpoD-, lon-, clpB-, merR-, fepB-entC-, meto- og groE-genene.
rpoD-genet koder for en sigma-subenhet som er en del av RNA polymerase holoenzyntet. rpoD-promoteren er en sterk "varmesjokk"-promoter som reagerer på alle de samme betingelser som induserer varmesjokkresponsen [D. W. Cowing et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, s. 2679-83 (1985)]. I tillegg til å induseres av øket temperatur blir "varmesjokk"-responsen også indusert av nesten alle alkoholer, så vel
som enkelte tungmetaller. Den cellulære respons mot "varmesjokk" er faktisk en respons til en økning i konsentrasjo-nene av misdannede ferdigutviklede proteiner og ufoldede uferdige proteiner.
lon-genet koder for en ATP-avhengig protease, som nedbryter misdannede proteiner [D. T. Chin et al., J. Biol. Chem., 263, s. 11718-28 (1988)]. Den reagerer på midler som forårsaker uriktig folding av ferdigutviklede proteiner.
clpB-genproduktet har proteaseaktivitet og kan binde til skadede proteiner. Det blir indusert når cellen danner et overskudd av skadede proteiner [M. Kitigawa et al., J. Bacteriol., 173, 4247-53 (1991)]. Misdannede eller avkort-ede proteiner induserer clpB-genekspresjon.
merR-genet reagerer på elementært kvikksølv så vel som på de fleste uorganiske kvikksølvforbindelser [W. Ross et al., J. Baceteriol., 171, s. 4009-18 (1988)]. Det er kjent at kvikksølv forårsaker modifisering av tiolgrupper av proteiner, noe som ofte fører til hemming av enzymfunksjonen. Kvikksølv kan også endre sulfydrylgrupper i cellemembraner, noe som forårsaker endringer i membranpermeabilitet og membrantransport.
fepB-entC-genet koder for et periplasmisk protein som er nødvendig for jerntransport inn i cellen. Ekspresjon av fepB-entC reguleres av mengden av tilgjengelig jern inne i cellen. Lave jernnivåer induserer genet, mens høye nivåer stenger av dets transkripsjon [T. J. Brickman et al., J. Mol. Hiol., 212, S. 669-83 (1990)].
meto-genet koder for metioninsulfoksydreduktase. Genet induseres av oksydert metionin.
groE-genet spiller en rolle i cellevekst. Selv om produktet av groE-genet har ATPase-aktivitet, blir dets cellulære
funksjon enda ikke forstått. Det er også kjent at groE-genproduktet fungerer som molekylært beskyttelsesprotein. groE-genet induseres av midler som forårsaker uriktig folding av protein [D. W. Cowing et al.rProe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, s. 2679-83 (1985)]. Sekvensen av groE-promoteren har blitt beskrevet [D. W. Cowing et al., J. Mol. Biol., 210, s. 513-20 (1989).
Andre promotere som reagerer på proteinstress og kan bli brukt i fremgangsmåten og settene ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatter dnaK, som induseres av midler som forårsaker uriktig folding av proteiner [D. W.Cowing et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, s. 2679-83 (1985)]; og rimK, som man antar induseres av midler som hemmer eller forstyrrer translasjon [W. Kang et al., Molec. Gen. Gene-tics, 217, s. 281-88 (1989)].
Promoterne som reagerer på energistress og som er anvendelige i fremgangsmåten og settene ifølge foreliggende oppfinnelse, er valgt fra promoterne av sdh-, cyo-, cyd- og unc-genene.
sdh-genet koder for succinatdehydrogenase, et enzym som fjerner elektroner fra succinat og gir dem til cytokrom ok-syda se [R. Poole og W. Engledew, i "Escherichia coli and Salmonella typhimurium", F.C. Neidhart, red., ASM Press, Washington D.C., s. 170-200 (1967)]. Ekspresjon av sdh-genet reguleres av tilstedeværelsen av oksygen i cellen. Under anaerobe tilstander eller tilstander som forstyrrer elektrontransport blir sdh-genet slått av. Således ville ekspresjonen av p-galaktosidase regulert av en sdh-lacZ-fusjon minke ved tilstedeværelsen av et toksin som påvirker elektrontransport.
cyo- og cyd-genene koder for de to cytokrom oksydasegenene i E. coli. cyo-genet blir uttrykt sterkt når celler dyrkes under normale aerobe betingelser, men blir undertrykket un-
der anaerobe betingelser eller tilstander som hemmer respirasjon [S. Yuchi et al., J. Bacteriol., 172, s. 6020-6025
(1990)]. Følgelig, slik som sdh-fusjonen beskrevet ovenfor, er det minket cyo-proraoterkontrollert ekspresjon av påviselig produkt som indikerer at en forbindelse er toksisk. I motsetning til dette, induseres cyd-genet under betingelser som hemmer respirasjon og er undertrykket under normale aerobe vekstbetingelser.
unc-genet koder for en av Fl-ATPase-subenhetene. Det induseres av midler som reduserer energiladningen (ATP-nivå) av cellen, så som frakoblingsmidler og ionoforer [K. von Meyenberg et al., EMBO J., 4, s. 2357-63 (1985)].
Promotere som reagerer på pH-stress som er anvendelige i fremgangsmåtene og settene ifølge foreliggende oppfinnelse, er valgt fra promoterne for hag-, katF-, micF- og aniG-genene.
hag-genet koder for et protein som er involvert i cellebevegelighet. Cellebevegelighet krever en protongradient over cellemembranen til en flage Hær motor [M. J. Silverman et al., J. Bacteriol., 120, s. 1196-1203 (1974)]. Enhver forbindelse som ødelegger pH-gradienten ved å tillate en fri strøm av ioner over membranen, vil indusere hag-gen-ekspresjon og således hag-promoteren.
katF-genet koder for en regulator av en av de to katalaser i E. coli [Triggs-Raine og Loewen, Gene, 52, s. 121-28
(1987)]. Det blir indusert av betingelser som endrer den intracellulære pH, så som eksponering til svake organiske syrer som fenolsyre. Det induseres også ved sult.
micF-genet, som er beskrevet ovenfor i redox-stresspromoterdelen, reagerer også både på membranskade og endringer i det osmotiske trykk [J. T. Greenberg et al., Proe. Nati.
Acad. Sei. USA, supra]. Det er kjent at både etanol og varmesjokk induserer micF-genet.
aniG-genet er et S■ typhimurium-gen som induseres ved endringer i intracellulær pH [Z. Aliabadi et al., J. Bacteriol., 170, s. 842-51 (1988)]. aniG-promoteren kan anvendes i settene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, enten i en S. typhimurium-vertsorganisme eller i en E. coli vertsorganisme.
Andre promotere som reagerer på pH-stress og som kan anvendes i settene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter eps, som koder for det kapsulære poly-sakkarid syntetase-gen og induseres av cellemembranskade [S. Gottesmann et al., Molec. Microbiol., 5, s. 1599-606
(1991)]; proU [A. Barron et al., J. Bacteriol., 167, s. 433-38 (1986)], son induseres ved økning i osmotisk trykk; og mdoA, som koder for et enzym involvert i syntesen av pe-riplasmiske membran-oligosakkarider og induseres ved mem-brans kade og osmotisk stress [J. Lacroix et al., Molec. Microbiol., 5, s. 1745-53 (1991)].
For å identifisere anvendelige stresspromotere kan man fremstille og utvelge et Mu dX fag kromosomalt eller som plasmid-bibliotek. Fremstillingen av slike bibliotek er beskrevet av T. A. Baker et al., J. Bacteriol., 156, s. 970-74 (1983).
Et kromosomalt bibliotek dannes ved å transfektere en ampicillin-sensitiv bakteriell stamme, fortrinnsvis E. coli som mangler hele lac-operonet, med Mu dX. Denne fag, som bærer lacZ-genet, setter dette tilfeldig inn i vertskromosomet. Visse av disse innsetninger danner en stresspromoter-lacZ-fusjon. For å identifisere slike fusjoner blir ampicillinresistente transfektanter utvalgt for induksjon av B-galak tosidase-ekspresjon ved kjente indusere av spesielle stresstyper.
Et plasmid Mu dx-bibliotek dannes ved å isolere det kromo-soma le DNA av en lac" bakteriell vertsorganisme, fortrinnsvis E. coli, og utsette den for restriksjonsspalting. De resulterende kromosomale fragmenter, hvorav enkelte vil inneholde alle eller en del av et stressgen og dets promoter, blir så klonet inn i en på lignende måte spaltet vektor, som ikke barer et ampicillin-resistensgen, men som fortrinnsvis bærer et annet antibiotisk resistensgen, dvs. tetracyklinresistens. Et eksempel på en slik vektor er pKT28. Det resulterende plasmidbibliotek blir så brukt til å transformere en amp<5>, tet<s>, lac" bakteriell stamme. Amp11, tet<*>-transformanter isoleres og blir så transfektert med Mu dX fag. Transfektantene blir dyrket i medier inneholdende ampicillin og tetracyklin. Plasmid DNA blir så isolert og brukt til å transformere en amp<s>, tet<s>, lac" bakteriell stamme. Utvelgelse for fusjoner blir oppnådd som beskrevet ovenfor, bortsett fra at de ønskede transformanter er både amp<*>og tet<R>.
Plasmidbibliotekmetoden er foretrukket, fordi den tillater påvisning av Mu dX-innsetninger inn i stressgener som el-lers ville være dødelige. Kun plasmidkopien av stressgenet inneholder Mu dX-innskuddet. Således er den kromosomale kopi av stressgenet fremdeles funksjonelt og er i stand til å reagere på stresstypen.
En annen fremgangsmåte for å identifisere nye stresspromotere og danne fusjoner til DNA som koder for påviselige proteiner, innbefatter innsetting av tilfeldige restrik-sjonfragmenter av bakterielt kromosomalt DNA inn i spesielt utformede vektorer. Slike vektorer inneholder et multippelt kloningssete, beliggende 5' til en DNA-sekvens som koder for et påviselig protein. Den mest foretrukne vektor av denne type er pRS415. Etter innsetning av bakterielle kro mosomale fragmenter inn i en slik vektor etter hagle-inn-setningsmetoden, blir det resulterende rekombinante DNA-mo-lekyl brukt til å transformere en stamme av bakterier som mangler hele lac-operonet, men er vill-type i enhver annen henseende. De resulterende transformanter blir utvalgt med forbindelser som forårsaker kjente stresstyper. Disse transformanter, som har endret ekspresjon av det påviselige protein i nærvær av slike forbindelser, inneholder ønskeli-ge fusjonstyper.
De diagnostiske sett og fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse avhenger av induksjonen av spesielle stresspromotere for å endre ekspresjon av påviselig genprodukt. Denne endring i ekspresjonsnivå blir målt både kvalitativt og kvantitativt. For å være anvendelig i slike sett og metoder må den spesielle stresspromoter være operativt bundet til genet som koder for et påviselig produkt. Ut-trykket "operativt forbundet" refererer til plasseringen av promoteren i forhold til genet som koder for det påviselige produkt, slik at transkripsjon av genet reguleres av promoteren. Slik plassering er velkjent i faget og involverer plassering av promoteren oppstrøms (5') for genet, slik at ingen transkripsjonsavslutningssignaler er til stede mellom promoteren og Shine-Dalgarno-setet som ligger foran genet.
Foretrukket vil den delen av DNA som bærer genet som koder for det påviselige produkt, også inneholde dette gens Shine-Dalgarno-sekvens og translasjons-startkodon. Få denne måte er korrekt leseramme ikke av betydning når det DNA som bærer stresspromoteren ligeres til det DNA som koder for det påviselige produkt. Dette gjelder selv om promoter-DNA også bærer en Shine-Dalgarno-sekvens og en del av den stressgenkodende region. For slike konstruksjoner vil tilstrekkelig translasjon bli kontrollert av Shine-Dalgarno-sekvens en av det påviselige produktgen og ved dette gens startkodon initiere til å påvise induksjon av promoteren. Foreliggende oppfinnelse kan også benyttes med konstruksjoner hvor det påviselige genprodukt er et fusjonsprotein inneholdende en N-terminal del av det native stressgenpro-dukt. I disse konstruksjoner inneholder den delen av DNA som inneholder promoteren, også DNA som koder for minst den N-terminale aminosyre av stressgenproduktet. Slike konstruksjoner er anvendelige ved påvisning av stresstyper som påvirker genekspresjon ved det translasjonene nivå. For disse konstruksjoner krever operativ binding ligering ved den 5' ende av det DNA som koder for det påviselige produkt til den 3' ende av det DNA som koder for promoteren og en del av den stressgenkodende region, slik at det DNA som koder for de N-terminale aminosyrer av stressgenproduktet er i samme leseramme som det DNA som koder for det påviselige produkt. Det vil være innlysende for den alminnelige fagmann at for slike konstruksjoner vil promoter-DNA inneholde Shine-Dalgarno-sekvensen og translasjonene st art kodon og at det DNA som koder for det påviselige produkt ikke må inneholde sin egen Shine-Dalgarno-sekvens.
Valget av genet til operativt å bli bundet til stresspromoterne i settene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, er i hovedsak uten grenser, så lenge (1) en DNA-sekvens som koder for det påviselige produkt har blittkarakterisert, og (2) produktet av genet kan bli påvist. Tilstrekkelig karakterisering innbefatter kunnskap om den fullstendige kodende sekvens, tilgjengelighet av et cDNA-molekyl eller kunnskap om et tilstrekkelig antall restrik-sjonsseter innenfor DNA-sekvensen til å muliggjøre at genet kan manipuleres til å danne en operativ binding til stresspromoter en .
Foretrukket er det påviselige produkt B-galaktosidase (kodet for av lacZ-genet), kloramfenikolacetyl-transferase (kodet for av cat-genet), galaktose-kinase (kodet for av galK-genet), p-glukosidase (kodet for av gus-genet), glu tation-transferase eller luciferase (kodet for av lux-genet). Mest foretrukket blir lacZ-genet anvendt.
De stresspromoter-påviselige produktfusjoner inneholdt i vertsorganismene anvendt i de diagnostiske sett og fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli dannet ved å bruke standard rekombinante DNA-teknikker som er velkjente i faget. Valget av teknikker avhenger av hva som er kjent omkring den spesielle stresspromoter som skal bli brukt i stammen. Dersom et stressgen har blitt klonet i et plasmid, kan Mu dX-innsetningsteknikken beskrevet ovenfor anvendes for å danne en stresspromoter-påvisbar genproduktfusjon. Det eneste krav for å bruke Mu dX i dette tilfelle, er at plasmidet som inneholder stressgenet ikke koder for ampicillinresistens. Utvelgelse for en funksjonell fusjon blir oppnådd ved å eksponere transfektanter til et stress som er kjent for å indusere det spesielle stressgen. For enhver av de ovennevnte Mu dX-transfeksjonsmetoder er det foretrukket at den bakterielle stamme som blir eksponert til stresstypen, har en vill-type fenotype for alle andre gener enn lac. Et eksempel på en stamme som er foretrukket for å inneholde en stresspromoter-påvisbar produktfusjon, er E. coli stamme SF1,
Dersom nukleotidsekvensen av stressgenet er kjent, kan polymerase kjedereaksjonsteknologien anvendes for å danne lacZ eller andre påviselige proteinfusjoner. Spesielt syn-tetiserer man primere som er komplementære til de 5' og 3' ender av stresspromoterdelen av genet, hybridiserer disse primere til denaturert, totalt bakterielt DNA under passende betingelser og utfører PCR. På denne måte kan klonbare mengder av enhver sekvensert stresspromoter fremskaffes. Når stresspromoter-DNA har blitt fremskaffet, blir det ligert til et DNA som koder for et påviselig protein i en passende vektor, så som pRS415, som inneholder et multippelt kloningssete like oppstrøms fra lacZ-genet [R. Simons et al., Gene, s. 86-96 (1987)]. Slike metoder er velkjente i faget.
Valget av bakterielle stammer som til slutt inneholder den spesielle stresspromoter-påvisbare produktkonstruksjon og således er anvendelig i fremgangsmåtene og settene ifølge foreliggende oppfinnelse, er bare begrenset av stammens manglende mulighet til å syntetisere det påviselige produkt i sin utransformerte tilstand. Mest foretrukket bør den anvendte stamme være homolog med stresspromoteren. Stammen bør også være vi11-type for alle andre gener, spesielt stressgener. Få denne måte eksisterer det en kromosomal versjon av verts-stressgenet som på passende måte kan reagere på en stressfaktor i tillegg til en annen kopi av stresspromoteren som induseres for å danne det påviselige produkt. Den foretrukne stamme er E. coli SF1, som ble dannet av oppfinneren og er beskrevet nedenfor.
For å sammenligne induksjonsnivået av forskjellige stresspromotere i settene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er det ønskelig at kopiantallet av hver stresspromoter-reportergenfusjon som anvendes i settene og metodene ifølge foreliggende oppfinnelse, er like. Fordi plasmider som inneholder disse fusjoner kan variere meget i antall kopier pr. celle, er den mest foretrukne metode for å likestille kopiantall å integrere stresspromoter-reporter-genkonstruksjonen i det bakterielle kromosom. På denne måte vil hver fusjon være til stede i en enkelt kopi.
Den mest foretrukne fremgangsmåte for å oppnå integrering i det bakterielle kromosom er via bruken av en bakteriofag. Enhver fag som inneholder to eller flere forskjellige områ-der av DNA som er homologe med to segmenter av DNA på vektoren inneholdende fusjonen, kan anvendes. Disse doble om-råder av homologa tillater at det opptrer en dobbel rekom-binasjonshendelse mellom vektoren og fagen når fagen infi-serer en celle som inneholder vektoren. Dette tillater vek toren å integrere i faggenomet. Et eksempel på en slik bakteriofag er éRS88, en lysis-defektiv fag som inneholder om-råder av DNA som er homologe med ampicillin-resistensgenet og med p-galaktosidase.
Fag inneholdende den integrerte fusjon blir identifisert ved å påvise plaquer for reportergenekspresjon etter in-okulering i et lag av bakterier i nærvær av en forbindelse som induserer det spesielle stressgen i fusjonen. Positive plaquer blir så isolert og fag deri brukt til å infisere bakterier under lysigene betingelser. Mest foretrukket er fagen anvendt i denne fremgangsmåte lytisk-defektiv, dvs. fag-DNA kan ikke hoppe ut av det bakterielle kromosom under betingelser som normalt induserer den lytiske cyklus.
Det er foretrukket at hver bakteriell vertsorganisme som anvendes i settene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder kun én spesiell stresspromoter-påvisbar genproduktfusjon. På denne måte kan, dersom en forbindelse induserer ekspresjon av det påviselige genpro-dukt i enhver spesiell vertsorganisme, den spesielle type stress forårsaket av forbindelsen bli identifisert på utvetydig måte. Det bør imidlertid bli forstått at visse stresspromotere som kan anvendes i fremgangsmåter og sett ifølge foreliggende oppfinnelse, kan reagere på mer enn én type stress. For eksempel blir sodA-promoteren indusert av både superoksyder og av metallenelatorer.
Når en promoter som reagerer på flere typer stress blir anvendt i settene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, er det foretrukket at en vertsorganisme som har en annen promoter som reagerer på kun én av disse stresstyper også blir anvendt. På denne måte kan naturen av stress-funksjonen forårsaket av forbindelsen bli mer nøyaktig bestemt. Således kan bruken av en E. coli vertsorga- nisme som inneholder en soi28 promoter-påviselig genproduktfusjon, som reagerer kun på superoksyder, brukes sammen med en vertsorganisme som inneholder sodA-promoterfusjonen. Denne kombinasjon av vertsorganismer gir en muligheten til å bestemme hvorvidt induksjon av sistnevnte promoter skjed-de på grunn av superoksyddannelse eller me tallenelatering.
I henhold til den mest foretrukne utførelsesform anvender settene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse de følgende promotere fusert til p-galaktosidase: soi28, dinD, hag, ada, gyr, katG, nfo, clpB, merR, top, cyd, micF, zwf, groE, katF og aniG. Hver av stresspromoterfusjonene er til stede i en eneste kopi integrert i det bakterielle kromosom av en forskjellig vertsorganisme. Alle fusjonene, bortsett fra aniG, er fortrinnsvis i E. coli stamme SF1. AniG-fusjonen er fortrinnsvis i en stamme av S. typhimurium.
Det er kjent at enkelte forbindelser ikke er toksiske overfor pattedyr i sin native form, men blir toksiske etter å ha blitt behandlet i leveren. I henhold til en annen utfø-relsesform av foreliggende oppfinnelse blir forbindelsen som skal undersøkes i fremgangsmåten og settene ifølge foreliggende oppfinnelse, følgelig forbehandlet med et S9 le-verekstrakt. Fremgangsmåter for å fremstille et S9 lever-ekstrakt ("S9") er beskrevet av S. Vennitt et al., i Huta-genicity Testing - A Practical Approach. s. Vennitt et al., red. IRL Press, Oxford, England, s. 52-57 (1984), hvis beskrivelse er innbefattet heri pr. referanse. S9 er i hovedsak et grovhomogenat av rottelever med uoppløselige partik-ler fjernet ved lavhastighetssentrifugering. S9 inkuberes med forsøksforbindelsen i en kaliumbuffer inneholdende NADP for å etterape trinn I og trinn II biotransformasjon av forbindelser som normalt utføres av pattedyrleveren.
Før et assay utføres på en forbindelse av ukjent toksisitet under anvendelse av fremgangsmåtene og settene ifølge foreliggende oppfinnelse, blir standardkurver fortrinnsvis dannet ved å bruke minst én og fortrinnsvis tre forbindelser som er kjent for å indusere hver spesifikke stresspromoter som skal bli brukt for å identifisere den ukjente forbindelse. Hvert kjent kjemikalium bør mer foretrukket bli un-dersøkt mot alle de tre promotere, og ikke bare promoteren som den er kjent for å indusere. I tillegg bør hvert kjemikalium undersøkes over et tilstrekkelig bredt område av konsentrasjoner for å gi en anvendelig standardkurve, fortrinnsvis 1 picomolar til 1 millimolar.
Når standardkurvene har blitt dannet, blir en computer-database inneholdende disse kurver generert. Denne database blir så brukt for å sammenligne stresspromoter-induksjons-profiler av forbindelsene som skal undersøkes, med profile-ne for toksinene brukt for å danne standardkurven. Således blir resultatene av enhver utestet forbindelse uttrykt ut fra den relative toksisitet sammenlignet med kjente indusere for stresspromotere.
Alle karakteriserings- og toksisitetsbestemmelsesmetodene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter det første trinn separat å dyrke hver av de enkelte bakterielle vertsorganismer beskrevet ovenfor.Vertsorganismene bør dyrkes slik at de er i logaritmisk eller stasjonær fase. Veksten kan være i et minimalt medium, så som M9 supplementert med glukose, eller i LB; med eller uten antibiotika, så som ampicillin eller tetracyklin, avhengig av den anvendte bakte-riestamme. Veksttemperaturer på mellom 30°C og 37°C kan anvendes, hvor den nedre ende av området er foretrukket dersom den stresspromoter-påviselige produktfusjon ble oppnådd via temperatursensitiv fagtransfeksjon, så som Hu dX. Veksten av vertsorganismene følges av målinger av celletetthet via absorbens av kulturen ved 600 nm (ODcoo) * En ODwo på mellom omkring 0,1 og 0,2 er mest foretrukket.
Etter denne initielle vekst blir forbindelsen som skal un-dersøkes, tilsatt en del av hver kultur. For initielle for-søk bør en serie på 10-gangers fortynnelse av forbindelsen brukes, som strekker seg fra millimolar- til picoraolar-konsentrasjoner. En annen serie av fortynninger av forbindelsen som har blitt pre-inkubert med S9-fraksjon, bør også fremstilles og tilsettes til en andre del av hver kultur. En tredjedel av hver kultur blir ikke eksponert til forbindelsen og blir brukt både som kontroll for å måle effekten av forbindelsen på cellenes totale vekst, og for en base-linjemåling av påviselig genprodukt. ODsooav kulturene like før eksponering til forbindelsen blir nedtegnet.
Alle kulturene (både kontroll og eksponert) får så inkuberes ved normal veksttemperatur i en tidsperiode som strekker seg fra 5 minutter til 24 timer. Mer foretrukket fore-går eksponering av den toksiske eller forsøksforbindelsen i 2 til 4 timer. Etter denne ytterligere inkubering blir en del av både den eksponerte kultur og kontrollkulturene brukt for å bestemme komparativ vekst ved å måle ODi00. En annen del av både kontrollkulturen og den eksponerte kultur blir brukt for å måle nivået av påviselig genprodukt. En fagmann er fullstendig klar over at dersom det påviselige produkt befinner seg i cytoplasma, må cellene bli lysert før det spesielle assay blir utført. Metoder for lysering av bakterier er velkjent i faget, og innbefatter mekaniske metoder, så som homogenisering, enzymatiske metoder, så som behandling med lysozym, og cellevegg-solubiliseringsmetod-er, så som behandling med toluen eller kloroform. Dersom, på den annen side, det påviselige produkt blir skilt ut fra vertscellen, behøver man kun å bruke dyrkningsvæsken for assayet.
Når det påviselige produkt er frigjort fra cellene, kan det bli mengdebestemt. Mengdebestemmelse kan utføres på et antall måter som er velkjente i faget. For eksempel kan et koiorimetrisk substrat anvendes dersom ekspresjonsproduktet er et enzym. Passende koiorimetriske substrater for spesielle enzymer er velkjent i faget. Alternativt kan et assay som anvender spesifikke antistoff, så som et RIA eller ELISA, bli brukt for å påvise ekspresjonsproduktet. Til og med assays som påviser mRNA-nivåer, så som Northern blots, kan anvendes for å påvise induksjon. I den mest foretrukne utførelsesform blir det lett etter ekspresjonsproduktet B-galaktosidase ved å anvende det koiorimetriske substrat o-nitrofenyl-galaktose (ONPG). Reaksjonen blir mengdebestemt spektrofotometrisk ved å måle absorbens ved 420 og 550 nm.
Avhengig av det anvendte assays natur kan det bli nødvendig å justere bufferbetingelsene for den lyserte kultur eller supernatant. Følgelig kan en egnet buffer tilsettes til den lyserte kultur eller supernatant, slik at det skapes opti-male forhold for det spesielle assay. Dersom det undersøkte produkt skal påvises ved et RIA- eller ELISA-assay, må bufferbetingelsene justeres til en nøytral pH for å mulig-gjøre maksimal antistoff-antigen-kompleksdanneIse og for å minimalisere ikke-spesifikk antistoffbinding. Slike betingelser er velkjent i faget og er eksemplifisert ved en endelig buffertilstand på 50 mM fosfatbuffer, 150 mM NaCl, pH 7,0. Dersom det undersøkte produkt er en enzym og påvirk-ning skal oppnås ved et kolorimetrisk substratassay, må bufferbetingelsene bli optimalisert for maksimal enzymatisk aktivitet og minimal ikke-katalytisk spaltning av substra-tet. Disse betingelser er konvensjonelle og varierer avhengig av enzymene som skal påvises.
For assays som anvender kolorimetriske substrater for å måle direkte enzymatisk ekspresjonsprodukt (i motsetning til ELISA-assays, som indirekte anvender koiorimetriske substrater), må tiden for reaksjonen bli registrert, fordi tid er et element for å måle aktivitet. I slike assays er det følgelig ikke nødvendig å stoppe reaksjonen mellom ekspresjonsprodukt og kolorimetrisk substrat i alle kulturer samtidig. Imidlertid er det innlysende at reaksjonen i enhver spesiell kontrollprøve vil bli stoppet på samme tid som den tilsvarende forsøksprøve. Fagmannen vil være klar over hvordan de forskjellige enzym-/substratreaksjoner skal stoppes. Enda mer foretrukket blir reaksjonen i multiple prøver overvåket samtidig ved bruk av en anordning som en roultibrønnplateleser. Når en slik anordning blir anvendt, blir det dannet en kurve som nedtegner absorbens mot tid. Reportergenproduktaktivitet blir så uttrykt som endringen i adsorbens over tid, dvs. vinkelen av den lineære del av den dannede kurve. Anvendelse av denne foretrukne metode for å måle reportergenproduktaktivitet unngår behovet for å stoppe den koiorimetriske reaksjon.
I henhold til den mest foretrukne utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, hvor det påvisbare produkt er B-galaktosidase, blir vertscellene lysert ved tilsetning av kloroform og bufferbetingelsene for assayet er 0,06 M Na2HP0«-7H2O, 0,04 M NaH2PO,-H20, 0,01 H KC1, 0,001 H MgS04-HzO, 0,05 M p-merkaptoetanol, pH 7,0. Hvis nødvendig, blir reaksjonen fortrinnsvis stoppet ved tilsetning av Na2C03.
De innsamlede data fra de ovenfor beskrevne målinger gjør det mulig å nedtegne forsøksforbindelseskonsentrasjon mot cellevekst (ODfioo-i&ålinger) og forsøksforbindelseskonsen-trasjon mot nivå av stresspromoterinduksjon (som bestemt
ved mengden eller hastigheten av dannet påviselig produkt).
Førstnevnte kurve er viktig, fordi eksponering av visse av de transformerte vertsorganismer anvendt i settene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse til høye konsentrasjoner av forsøksforbindelse kan være dødelig. Således kan en nøyaktig avlesning av spesifikk induksjon av en stresspromoter ikke fremskaffes for denne konsentrasjon av forsøksforbindelse. Imidlertid, dersom celledød inntreffer uten en sammenfallende induksjon av en spesiell stresspromoter, er det innlysende at forsøksforbindelsen er toksisk, men ikke forårsaker denne spesielle stresstype. Dette kan indikere at ytterligere fusjoner bør undersøkes mot for-søksforbindelsen.
Det er kjent at mens enkelte forbindelser ikke behøver a være toksiske, kan kombinasjoner av ikke-toksiske forbindelser faktisk være toksiske. Følgelig bør det forstås at settene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse også kan anvendes for å bestemme den potensielle toksisitet av kombinasjoner av kjente og ukjente forbindelser på samme måte som den beskrevet ovenfor.
I henhold til en annen utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å identifisere et antitoksin til en forbindelse bestemt til å være toksisk, ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse. Som beskrevet ovenfor, når en stresspromoter-induksjons/suppresjons-pro-fil blir dannet for en ukjent forbindelse, blir denne pro-fil sammenlignet med profiler av kjente forbindelser i en database. Et potensielt antitoksin av den ukjente forbindelse er en kjent motgift for en forbindelse som har en lignende stresspromoter-induksjons/suppresjonsprofil. For å undersøke effektiviteten av et slikt antitoksin blir stresspromoterassayet gjentatt under anvendelse av kun de vertsorganismer som inneholder stresspromotere som ble indusert eller undertrykt av den ukjente forbindelse. Hver av disse vertsorganismer blir preinkubert med varierende konsentrasjoner av det foreslåtte antitoksin før tilsetning av en induserende/undertrykkende konsentrasjon av ukjent forbindelse. Dersom preinkubering med det foreslåtte anti-toksin minker eller fjerner effekten av den ukjente forbindelse, vil et slikt antitoksin sannsynligvis være effek-tivt.
Endelig fremskaffer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å forbedre utformingen av aktivt medikament. I henhold til denne utførelsesform blir et nytt medikament først undersøkt med hvilket som helst av de ovenfor beskrevne sett og metoder og dets toksisitet blir bestemt. Informasjonen fremskaffet ved slike metoder og sett indikerer den cellulære mekanisme av medikamentets toksisitet. Den delen av medikamentet som sannsynligvis forårsaker den spesielle cellulære skade som er indikert, kan så på passende måte modifiseres eller fjernes, avhengig av rollen som denne del spiller i medikamentets farmasøytiske aktivitet. Det resulterende modifiserte medikament blir så under-søkt på nytt med settene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse for å bestemme om dets toksisitet har
blitt tilstrekkelig redusert eller fjernet.
For at oppfinnelsen beskrevet heri skal bli mer fullstendig forstått, er de følgende eksempler anført.
Visse av de grunnleggende molekylære biologiteknikker beskrevet nedenfor er ikke angitt i detalj. Slike teknikker er velkjente i faget, og er beskrevet i beskrivelsen av Molecular Cloninq - A Laboratory Manual Second Edition, J. Sambrook et al., red., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989).
Eksempel 1
Anvendelse av fag Mu dX for å danne stresspromoter-lacZ- fusjoner
Mu dX-fagen bærer ampicillinresistensgenet og både lacZ- og lacY-genene. Fagen danner tilfeldige innsetninger i gener eller operoner på en slik måte at i enkelte transduktanter blir lacZ- og lacY-genene den bærer plassert under kontroll av en promoter for et gen eller operon hvori innsetningen ligger. Enkelte av disse produktive innsetninger vil inn-treffe i stress-induserbare gener. Slike innsetninger ble valgt ut ved å undersøke for ampicillinresistente transduktanter som øker eller minker ekspresjon av lacZ under betingelser som induserer stresspromoteren. Fordi Mu dX-fagen er noe temperatursensitiv, blir alle kulturer dyrket ved 30°C i stedet for 37°C.
I. Fremstilling av Mu dX- lysat
For å fremstille Mu dX-lysatet ble metoden beskrevet av J. H. Krueger et al., Meth. Enzymol., 100, s. 501-09 (1983), benyttet. Spesielt ble E. coli MAL103-celler dyrket, som inneholder både Mu dX-bakteriofagen og en MuC temperatursensitiv hjelperbakteriofag satt inn i dets kromosom, i LB + ampicillin (70 ug/ml) ved 28<*>C inntil de nådde en tetthet på 10° celler/ml. Veksttemperaturen ble så forandret til 43°C i 20 minutter og tilbake til 37"C i 60 minutter eller inntil lysis ble synlig. Deretter ble det tilsatt 1% v/v kloroform og kulturen ble inkubert i ytterligere 5 minutter ved romtemperatur. Kulturen ble så sentrifugert ved 8000 rpm i 5 minutter, supernatanten ble oppsamlet i et sterilt rør og pelleten ble resuspendert i fersk LB. Suspensjonen ble sentrifugert nok en gang ved 8000 rmp i 5 minutter, og den resulterende supernatant ble tilsatt til den initielle supernatant og ble lagret ved 4°C i 1% v/v kloroform.
II. Anvendelse av Mu dX for å danne en lacZ- fusjon med en k~ i ent st res spromoter
.Når et stressgen allerede var blitt identifisert og klonet i et plasmid, ble de følgende teknikker anvendt for å danne en stresspromoter-lacZ-fusjon. Først må E. coli-stammen som bærer plasmidet være Amp<5>og plasmidet bør fortrinnsvis inneholde en medikamentresistensmarkør som er forskjellig fra Amp<R>. Cellene som bærer plasmidet ble dyrket i LB ved 30°C
til en konsentrasjon på IO<9>celler /ml. Cellene ble så sentrifugert og pelleten ble resuspendert i halvparten av det opprinnelige volum av LB. CaCl2ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 2,5 mM og cellene ble lagret på is.
En serie på 4 tigangers fortynninger av fag-lysater beskrevet i del I ovenfor, ble deretter dannet i 25 mM MgSo*, ImM CaCl2. 100 ul av hver fagfortynning ble så blandet med 100 ul av E. coli-cellene og inkubert ved 30°C i 20 minutter. Cellene ble så sentrifugert, og supernatanten ble kastet. Pelleten ble resuspendert i 2 ml LB og inkubert ved 30°C i 100 minutter. Kloramfenikol ble så tilsatt til kulturen (15 ug/ml endelig konsentrasjon) og inkubert i ytterligere 3 timer ved 30°C. Et plasmid mini-prep ble deretter utført.
De resulterende plasmider ble brukt til å transformere lac" , Amp<s>E. coli-stammen under anvendelse av en CELL-PORATOR (elektroporasjonsapparat) [BRL, Bethesda, MD] og ved å følge forhandlers retningslinjer. Transformantene ble plassert på LB + ampicillin (70 ug/ml) + X-gal (40 ug/ml)-plater som, dersom det opprinnelige plasmid inneholdt et antibiotisk resistensgen, også eventuelt inneholdt det passende antibiotikum. Etter dyrkning av transformantene over natten ved 30°C, ble 100 blå kolonier isolert og utsådd på nytt på duplikate plater inneholdende det samme medium, hvorav én ytterligere inneholdt et middel som induserer eller undertrykker det spesielle stressgen inneholdt på plasmidet.
Dersom det tilsatte middel forårsaket induksjon av stressgenet, ble de kolonier som var mørkere blå på platen inneholdende induksjonsmiddel antatt å inneholde en fusjon mellom lacZ-genet og promoteren av det klonede stressgen. Motsatt, dersom midlet undertrykker stressgenet, ble de kolonier som var signifikant lysere blå i farge eller hvite på den middelinneholdende plate utvalgt som inneholdende den ønskede konstruksjon. Bekreftelse av slike konstruksjoner ble oppnådd ved å bruke p-galaktosidase-assayet beskrevet nedenfor.
III. Anvendelse av Mu dX for å danne et bibliotek inneholdende lacZ- fusjoner med ukjente stresspromotere
De to metodologier beskrevet nedenfor muliggjorde oppdagel-se av tidligere ukjente stresspromotere.
A. Kromosomale bibliotek
Søker infiserte en eksponensielt voksende kultur av en E, coil-stamme som manglet hele lac-operonet med fag Mu dX ved en infeksjonsmultiplisitet på 0,1 til 0,2, som beskrevet ovenfor i del II. Transduktantene ble utvalgt ved vekst på LB + ampicillin (70 ug/ml)-plater ved 30°C. Søker utsådde deretter i replika transduktantene på LB + X-gal (40 ug/ml)-plater enten i nærvær eller fravær av et middel som induserer en definert stresstype og inkuberte platene over natten ved 30°C. Kolonier som var tydelig forskjellige i fargeintensitet i nærvær av midlet sammenlignet med fravær av dette, ble valgt ut.
Kulturer av disse utvalgte kolonier ble så undersøkt for induserbarhet eller represjon av B-galaktosidase-aktivitet som beskrevet nedenfor.
B. Plasmid- biblioteker
Denne metodologi er lignende den ovenfor, men unngår enhver potensiell dødelighet forårsaket av innsetningen av Hu dX-fagen i et stressgen, som derved inaktiverer dette gen.
Spesielt blir plasmid pKT218 (Amp<8>, Tet<R>) fullstendig spaltet med Pstl, som spalter ved et enkeltsete i plasmidet. Prøven blir så inaktivert med fenol/kloroform og DNA utfelt ved å bruke natriumacetat/EtOH. Vektoren blir så behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase for å forhindre selvtil-knytning.
Genomisk DNA isoleres fra en stamme av E. coli som mangler hele lac-operonet, men er villtype i ethvert annet aspekt. Det isolerte DNA blir så delvis fordøyet med Pstl. Etter spaltning blir prøven behandlet med fenol/kloroform for å inaktivere enzymet. Det spaltede DNA blir så utfelt ved å bruke natrlumacetat/EtOH-metoden.
Det spaltede kromosomale DNA blir så ligert til den tilsvarende spaltede vektor, Ligeringsblandingen blir brukt til å transformere kompetente E. coli lac<*>-celler ved elektroporering. Transformanter dyrkes i LB + tetracyklin ved 30°C inntil de når stasjonær fase. Kloramfenikol (15 ug/ml endelig konsentrasjon) blir så tilsatt, og kulturen inkuberes i ytterligere 3 timer ved 30<*>C. Plasmider blir så isolert fra kulturen og brukt til å transformere en lac", Tet<s->stamme under anvendelse av elektroporeringsteknikken. Transformantene blir så dyrket i LB + tetracyklin inntil de når logaritmisk fase.
Transformantene blir infisert med Mu dX ved en infeksjonsmultiplisitet på 0,1 til 0,2, som beskrevet ovenfor. Transduktantene blir så ut sådd på LB + ampicillin (70fig/ml) + tetracyklinplater og dyrket over natten ved 30<*>C. Individuelle kolonier blir replikasjonsutsådd på X-gal (40 ug/ml)-plater, enten i nærvær eller fravær av et middel som induserer en definert stresstype, og platene inkuberes over natten ved 30°C. Kolonier som er signifikant forskjellige i farge i nærvær av midlet, sammenlignet med fravær av dette, blir valgt ut.
Kulturer av disse kolonier ble deretter undersøkt for induserbar het eller represjon av p-galaktosidase som beskrevet nedenfor.
Eksempel 2
Anvendelse av pRS415 for å danne stresspromoter- lacz- fusjoner
I. Anvendelse av pRS415 for å danne en stresspromoter-lacZ- fusjon med en ukjent stresspromoter
Plasmidet pRS415 inneholder lacZ-genet og et multippelt kloningssete like oppstrøms fra dette gen. Det er beskrevet i R. Simons et al., Gene, s. 85-96 (1987).
Smal-setet i pRS415 tillater haglladningskloning av kromosomalt DNA, som blir spaltet med hvilket som helst restrik-sjons enzym og deretter gjort buttendet med eksonuklease. Alle teknikkene beskrevet nedenfor er standard prosedyrer innenfor molekylær biologiteknikk, og er beskrevet i Molecular Cloning - A Laboratory Manual Second Edition, J. Sambrook et al., red., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988).
Spesielt isoleres genomisk DNA fra en stamme av E. coli som mangler hele lac-operonet, men er villtype i ethvert annet aspekt. Det isolerte DNA blir så delvis spaltet med ethvert restriksjonsenzym som spalter ved et fire basepar målområ-de. Etter spalting blir prøvene behandlet med fenol/kloroform for å inaktivere enzymene. Det spaltede DNA blir så utfelt ved å bruke natriumacetat/EtOH-metoden. Om nødvendig blir prøven så spaltet med Sl nuklease for å danne butte ender og deretter utfelt på nytt med natriumacetat/EtOH.
Samtidig blir pRS415 spaltet med Smal. Prøven blir så inaktivert med fenol/kloroform og DNA utfelt ved å bruke na-triumacetat/EtOH. Vektoren blir behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase for å forhindre selvtilkobling.
Det spaltede kromosomale DNA blir så ligert til den tilsvarende spaltede vektor. Ligeringsblandingen blir brukt til å transformere kompetente E. coli lac" -celler ved elektroporering under anvendelse av en CELL-PORATOR-apparatur. Etter transformasjon blir transformantene fortynnet og utsådd på LB + ampicillin (70 ug/ml) + tetracyklin + X-gal (40 ug/ml)-plater ved en tetthet på 1000 kolonier pr. plate. Etter vekst over natten ved 37"C blir replikaplater av de ovennevnte plater dannet på to plater av samme medium, en med og en uten tilsetning av en forbindelse som danner et ønsket stress. Transformanter inneholdende innsatte, repro-duserbare promotere i pRS415-vektoren vil være mørkere blå på den stressforbindelsesinneholdende plate enn på kont-rollplaten. Motsatt vil transformanter inneholdende lacZ-fusjoner til en promoter som er undertrykt av stress, være lysere blå eller hvite på den forbindelsesinneholdende plate.
Induserbarhet eller represjon blir bekreftet med individuelle positive kloner ved å bruke en av Q-galaktosidaseas-sayene beskrevet nedenfor og varierende konsentrasjoner av den stressinduserende forbindelse.
II. Anvendelse av pRS415 for å danne en stresspromoter-lacZ- fusjon med en kjent stresspromoter
A. Dannelse av et kjent stresspromoter DNA- fragment ved å bruke PCR- amplifikering
Når sekvensen av et stressgen er tilgjengelig og promoter-området var blitt posisjonsbestemt, anvendte oppfinneren en PCR-metode for å amplifikere stresspromoteren. Spesielt utformet oppfinneren et primer-par som er komplementære til de 5' og 3' ender av stresspromoteren. Området som skal amplifikeres, er normalt i området fra 300 til 800 basepar og lengden av primerområdene fra omkring 15 til 25 nukleo-tider.
Etter at primerne er syntetisert blir de hybridisert til genomisk DNA ved å anvende velkjente PCR-betingelser [f.-eks. Molecular Cloninq - A Laboratory Manual Second Edition, J. Sambrook et al., red., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)]. Spesielt inneholder PCR-reaksjonen de følgende komponenter: genomisk DNA (0,5 ug), dNTPs (200 uM hver), primere (30 picomol hver) og Taq polymerase (2,5 enheter). Typisk blir 30 cykler av PCR utført, hvor hver cyklus omfatter oppvarming av prøven til 95°C i 1 minutt, avkjøling til 54°C i 15 sekunder, og deretter ny oppvarming til 73"C i 3 minutter. I siste trinn av den endelige cyklus blir prøven oppvarmet til 73°C i 10 minutter i stedet for 3 minutter.
Etter at PCR-reaksjonen er fullstendig, blir 1 enhet av Klenow-fragment tilsatt for å fylle inn eventuelle over-heng.-
B. Fusjon av et kjent stresspromoter DMA- fragment til lacZ-genet i pRST415
Det amplifikerte DNA-fragment inneholdende stresspromoteren blir renset og deretter ligert i Smal-spaltet pRS415 som har blitt behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase. Ligeringsblandingen blir så brukt til å transformere lac", A»P<S>E- coli-celler ved elektroporering. Transformantene blir utsådd på LB + ampicillin (70 ug/ml) + X-gal (40 ug/ml). Kolonier som er lyse eller mørke blå, blir valgt ut og sådd ut i replika på to plater. En replikaplate inneholder LB + ampicillin (70 fig/ml) + X-gal (40 fig/ml) . Den andre inneholder samme forbindelser pluss en forbindelse kjent for å indusere eller undertrykke den spesifikke promoter. For stressinduserte promotere inneholder kolonier som er mørkere blå på den forbindelsesinneholdende plate etter vekst over natten ved 30°C den ønskede promoter-1acZ-fusjon. For stressundertrykte promotere inneholder kolonier som er lysere blå eller hvite på den forbindeIsesinnehold-ende plate den passende fusjon.
Eksempel 3
Konstruksjon av E. coli stamme SF1
SF1 er et derivat av E. coli Kl2-stamme GC4468. Opphavsstammen har en F", thi, rpsL, ft(lac-pro)169 genotype. På grunn av thi-mutasj onen krever opphavsstammen thiamin for vekst. De foretrukne vertsorganismer ifølge foreliggende oppfinnelse bør være villtype for alle gener, bortsett fra lac. Derfor dannet oppfinneren SF1 ved å så ut omtrent 10<10>GC4468-celler på plater inneholdende M9 + glukosemedium. Kolonier som vokste på slikt medium må ha revertert til en thi<*>genotype. En slik koloni ble valgt ut og betegnet SF1.
En prøve av stamme SF1 ble deponert hos the American Type Culture Colleetion (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Roekvilie, Maryland 20852 den 26. juni 1992 og gitt tilgangsnummer 55337.
Eksempel 4
Pl- ly sat fremgangsmåte for å flytte stresspromoter- lacZ- f vi-sjoner mellom vertsstammer
Denne fremgangmåte tillot oppfinneren å bevege en stresspromoter-lacZ-fusjon fra en vertsstamme til en annen. På denne måte kan alle stresspromoter-lacZ-fusjoner i et diagnostisk sett plasseres i samme vertscellebakgrunn. Denne teknikk ble brukt til å plassere alle stresspromoter-lacZ-fusjonene i stamme SF1.
Pl-fag spalter tilfeldig vertscelle-DNA med sin egen endo-gene endonuklease og pakker de resulterende DNA-fragmenter i virioner. Visse av de dannede og pakkede DNA-f ragmenter vil inneholde den ønskede stresspromoter-lacZ-fusjon.
Pl-lysatet ble dannet som følger. Cellene inneholdende den ønskede stresspromoter-lacZ-fusjon, enten på et plasmid eller inne i kromosomet, ble dyrket over natten i LB ved 30<*>C inntil tidlig stasjonær fase. Oppfinneren inokulerte deretter 50 (il av denne kultur i 5 ml LB inneholdende 0,4% glukose og 5 mM CaCl2og inkuberte i 30 minutter ved 30°C. Deretter ble 0,1 ml Pl-fag (omkring 5 x 10<8>pfu/ml) tilsatt til kulturen og inkubering fortsatt i 2-4 timer, inntil cellelysis ble observert. Oppfinneren tilsatte deretter 0,1 ml kloroform, spinomrørte i 10 sekunder og sentrifugerte for å fjerne cellulært avfall. Supernatanten ble lagret ved 4<*>C med ytterligere 0,1 ml kloroform.
Oppfinneren utførte deretter transduksjon av den mottakende stamme, SF1. SF1 ble dyrket i LB til tidlig stasjonær fase. Cellene ble deretter sentrifugert og resuspendert i 2,5 ml 5 mM CaCl og 10 mM MgSO*. Deretter ble 0,1 ml av cellesusp-ensjonen blandet med enten 10 fil eller 100 ul Pl-lysat i separate rør. Oppfinneren hadde også et rør med kun 100 ul celler og et rør med kun 100 ul Pl-lysat som kontroller. Disse rør ble deretter inkubert i nøyaktig 20 minutter ved 30°C, uten risting. Så ble 0,1 ml IM Na-citrat tilsatt til hvert rør og sentrifugert for å pelletere cellene. Dersom stresspromoteren induseres av en spesiell forbindelse, ble cellene resuspendert i 50 fil LB og sådd på LB + ampicillin (70 fig/ml) + X-gal (40 ug/ml) + forbindelsen. De kolonier som var blå etter vekst over natten ved 30°C, inneholdt stresspromoter-lacZ-fusjonen. Dersom stresspromoteren blir undertrykt av en spesiell forbindelse, ble cellene resuspendert i 50 fil LB og sådd ut på LB + ampicillin (70 ug/ml) + X-gal (40 fig/ml) . Blå kolonier ble valgt ut og sådd ut i replikat på samme medium, eller det samme medium pluss den undertrykkende forbindelse. Kolonier som var lysere blå eller hvite på den forbindelsesinneholdende plate, inneholdt den ønskede fusjon.
Eksempel 5
Toksin- induserbare p- qalaktosidase- assays
Oppfinneren brukte to variasjoner av samme assay for å bestemme endringer i stresspromoter-tilknyttet B-galaktosidaseekspresjon indusert av forskjellige forbindelser.
Det første assay ble utført i små forsøksrør. E. coli-vertsorganisme(r) som inneholder en stresspromoter-lacZ genfusjon, ble dyrket separat over natten med risting i enten LB komplementert med 70 ug/ml ampicillin eller M9+G supplement ert med 70 ug/ml ampicillin (180 ml H20, 20 ml 10X M9 salter (10X M9 salter = 60 g Na2HP04, 30 g KH2P04, 5 g NaCl, 10 g NH4Cl/liter), 2 ml 40% glukose, 0,4 ml IM MgS04, 20 fil IM Cacl2) ved 30°C. Neste morgen ble én dråpe av hver overnattingskultur fortynnet i en serie rør, hvert inneholdende 1 ml ferskt medium. Dette tillot oppfinneren å undersøke en rekke konsentrasjoner av forbindelsen på hver vertsorganisme. Cellene ble så dyrket ved 30<*>C inntil de nådde en optisk tetthet ved 600 nm (OD6oo) på 0,1 - 0,2. Ved dette punkt ble et rør med hver stresspromoterinneholdende vertsorganisme plassert på is og brukt til å måle OD6oofør tilsetning av forbindelsen. De andre rør med hver stresspromoterinneholdende vertsorganisme ble delt i to, hvor en halvdel mottok forbindelsen som skulle undersøkes (1 pM - 1 mM, i 10 gangers trinn ble rutinemessig brukt) og den andre halvdel mottok ingen forbindelse. Rørene som ikke mottok noen forbindelse, virket både som kontroll for effekten av forbindelsen på cellevekst og som en basislin-jemåling av Q-gaktosidase-ekspresjon.
Kulturene ble så inkubert i ytterligere 2 timer ved 30°C. En 0,5 ml porsjon av hver kultur ble fjernet for en ODeoo-måling. (Hvis 0DU» var for høy til å ta en nøyaktig måling, ble den 0,5 ml store porsjon fortynnet med en like stor vo-lumdel av ferskt kulturmedium, prøven lest ved OD6oopå nytt og avlesningen multiplisert med to.) Oppfinneren tok deretter 200 ul fra hver kultur og pipetterte det i 800 ul Z-buffer (16,1 g Na2HP04-7H20, 5,5 g NaH2P04-H20, 0,75 g KC1, 0,246 g MgS04-7H20, 2,7 ml B-merkaptoetanol/liter, pH 7,0). Til dette ble det tilsatt 2 dråper toluen og kulturene ble omrørt med spin i 10 sek. Ytterligere Z-buffer ble så tilsatt til 2 ml endelig volum. Den toluen/Z-bufrede prøve ble så inkubert i et 37°C vannbad i 40 min. Prøven ble så i 5 min plassert i en varmeblokk som hadde blitt forvarmet til 28°C. For å starte den koiorimetriske reaksjon tilsatte oppfinneren 200 ul o-nitrofenylgalaktose (ONPG; 4 mg/ml i Z-buffer), mens det ble holdt nøyaktig oversikt over reak-sjonstiden. Hvis et spesielt prøverør ble lys gult, tilsatte oppfinneren 0,5 ml Na2C03for å stoppe reaksjonen, samt stoppet også reaksjonen i den tilsvarende kontrollprøve, idet den nøyaktige tid som var gått fra ONPG-tilsetning til Na2C03-tilsetning ble nedtegnet. Prøven og kontrollen ble så avlest i et spektrofotometer ved 0D420og ODsso.
Aktivitetsenheter ble regnet ut ved å bruke følgende formel: OP42p-( l, 75) ( OPsso) Aktivitetsenheter = 1,000 x
tid x kulturvolum x OD60o
hvori tid er tiden som har gått fra tilsetning av PNPG til stopping av reaksjonen med Na2C03, i minutter; kulturvolum er volumet brukt i assayet (i det ovennevnte tilfelle 0,2 ml); OD420og OD550er forskjellene i disse OD-verdier mellom toksinprøvene og kontrollprøvene; og OD60oer avlesningen som ble funnet fra den toksinbehandlede kultur etter inkubering.
Den andre type assay utføres i 96 brønners mikrotiterplater. I dette assay ble passende E. coli-vertsorganismer dyrket separat over natten ved 30°C i enten M9+G-medium eller LB-medium. I begge tilfeller ble mediet supplementert med 70 ug/ml ampicillin. Neste dag ble cellene fortynnet 20
ganger i ferskt medium og dyrket ved 30"C inntil de nådde en OD6oo på 0,2-0,4. Oppfinnerne pippeterte deretter 50 ul av hver vertscelle inn i to rekker av brønner i en steril 96-brønners mikrotiterplate. Én rekke ble brukt for å måle effekten av forsøksforbindelsen på p-galaktosidase-ekspresjon. Den andre rekke ble brukt for å måle effekten av for-søksforbindelser på cellevekst.
Oppfinneren laget så en 10 gangers fortynningsserie av forbindelsen som skulle undersøkes i kulturmedium ved å til-sette 50 ul av hver fortynning til cellene i brønn 2 til 9 i hver rekke av celler (dvs. brønn 2 mottok forbindelse av full styrke, brønn 3 mottok en 1:10-fortynning av for-bin-delse, brønn 4 mottok 1:100-fortynning og så videre).
Cellene i brønn 1 av hver rekke mottok 50 ul av medium
alene. En ODeoo-måling av alle brønner ble tatt for å godt-gjøre enhver absorbens som kunne skyldes forsøksforbindel-sen. Cellene ble så inkubert i 90 minutter ved 30°C med mo-derat risting. Etter inkubering ble en OD60o-måling av alle
brønner foretatt, og 1 dråpe kloroform + 10 ul av 1% SDS ble tilsatt til hver brønn i første rekke. Deretter ble det tilsatt 100 ul Z-buffer til hver av brønnene i første rekke og inkubert i 20 minutter ved 30°C.
Oppfinneren tilsatte deretter 40 fil 0NP6 (4 mg/ml i Z-buffer) til hver brønn i første rekke, fortsatte inkubering ved 30°C og startet tidsbestemmelse av reaksjonen. Dette tillot cellene i andre rekke å fortsette vekst og således bekrefte effekten av forsøksforbindeIse på cellevekst over en lengre tidsperiode. Når det utviklet seg en gul farge i hver av brønnene som mottok ONPG, ble reaksjonen stoppet i alle brønner i første rekke ved tilsetning av 500 ul 1 M Na2C03, og tiden ble nøyaktig notert. OD420og OD550av
alle brønner i første rekke ble avlest og enhetene for aktivitet målt ved formelen angitt ovenfor. Cellene i andre rekke fikk vokse i ytterligere 90 minutter etter den initielle 90 minutters inkubering. En OD&oo**måling ble tatt hvert 30. minutt for å overvåke celleveksten.
De samme to assays ble anvendt når represjon av stresspromoter-kontrollert p-galaktosidase-ekspresjon ble undersøkt. Den eneste forskjell var at gul farve utviklet seg i kontr-ollprøvene før i de forbindelsesinneholdende prøver. Etter at den gule farge hadde utviklet seg i kontrollbrønnen, ble reaksjonen i både de kontroll- og forbindelsesinneholdende prøver stoppet samtidig.
Både enhetene for p-galaktosidaseaktivitet og kulturens ODeoo nedtegnes mot dosen av forbindelse for hver undersøkt dosering. Slike kurver gjorde det mulig for oppfinneren å bestemme LD50for en forbindelse. Disse kurver kan også an-tyde at forsøksforbindelsen er toksisk (via en minskning i ODsoo med økende konsentrasjoner av forbindelse) til tross for at den ikke klarte å indusere en spesiell promoter (ingen induksjon/suppresjon av p-galaktosidaseekspresjon).
Eksempel 6
Konstruksjon av spesifikke stresspromoter- lacZ- fusjoner
I. sodA
Oppfinneren fremskaffet et sodA-lacZ fusjonsgen fra Dr. Da-niele Touati. Han dannet fusjonen ved å bruke fag Mu dX
kromosomal tilfeldig innsetningsteknlkk beskrevet ovenfor i eksempel 1, del III. Transduktantene ble utvalgt for spesifikk induksjon av B-galaktosidaseekspresjon i nærvær av pa-raguat. Oppfinneren flyttet sodA-lacZ-fusjonen inn i stamme SP1 ved Pl-mediert transduksjon som beskrevet i eksempel 3.
Sekvensen av sodA er kjent [D. Touati, J. Bacteriol., 170,
s. 2511-20 (1988); og H. M. Hassan et al., Proe. Mati. Acad. Sei. USA, 89, s. 3217-21 (1992), hvis beskrivelse er innbefattet heri pr. referanse]. Følgelig kan en sodA-lacZ-fusjon konstrueres ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-ACGAAAAGTACGGCATTGAT-3' [SEQ ID NO: 1] og 5'-GCTCATATTCATCTCCAGTA-3' [SEQ ID NO: 2]. Transformanter inneholdende den ønskede fusjon blir identifisert ved induserbar het av B-galaktosidaseekspresjon i nærvær av enten paraquat eller metallchelatorer.
II. soi28
soi28-lacZ-fusjonen ble konstruert ved å bruke den tilfeldige Mu dX fag kromosomale innsetningsteknikk beskrevet ovenfor i eksempel 1, del III. Konstruksjonen er beskrevet i T. Kogoma et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, s. 4799-803 (1988). Transduktanter ble utvalgt for sin evne til å uttrykke B-galaktosidase når de induseres med paraquat, som beskrevet i T. Kogoma et al., supra.
Alternativt kan en soi28-lacZ-fusjon dannes ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 5, del II, og de føl-gende primere: 5'-GCTATGTGTGTGATGTGAGC-3' [SEQ ID NO: 3] og 5'-TGATGACAGATGTCGCCCCA-3' [SEQ ID NO: 4]. Ønskede fusjoner blir påvist ved induserbarhet av p-galaktosidaseekspresjon i nærvær av paraquat.
III. katF
katF-genet er beskrevet av P. C. Loewen et al., J. Bacteriol., 162, s. 661-67 (1985). katF-genet koder for en hydrogenperoksyd-induserbar katalaseektivitet. En katF-lacZ-fusjon ble konstruert ved Mu dX-innsetning i et klonet KatF-gen på et plasmid, som beskrevet i eksempel 1, del II.
En katF-lacZ-fusjon blir alternativt konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og primerne 5 *-CAGGTGCGTTGTAGTGAGTT-3' [SEQ ID NO: 5] og 5'-CAATAAACGAGATAACTCTCC-3' [SEQ ID NO:6]. Konstruksjonen ble undersøkt for induserbarhet av B-galaktosidaseekspresjon ved fenolsyre eller en annen svak organisk syre.
IV. katG
katG-genet er beskrevet i P. C. Loewen et al., J. Bacteriol., supra. En katG-lacZ-fusjon kan konstrueres ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5<*->AAGCTTAATTAAGATCAATTTG-3' [SEQ ID NO:7] og 5<1->GCCGCAGAAAGCGGTTCGCC-3' [SEQ ID NO:8]. Transformanter inneholdende den ønskede fusjon identifiseres ved induksjon av B-galaktosidase i nærvær av H202.
V. ahp
Kloning og sekvensering av ahp-genet ble beskrevet av G. Storz et al., J. Bacteriol.. 171, s. 2049-55 (1988); og av L. A. Tartaglia et al., J. Mol. Biol., 210, s. 709-19
(1989). En ahp-lacZ-fusjon kan konstrueres ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-ATCGGGTTGTTAGTTAACGC-3<*>[SEQ ID NO:9] og
5'-CTATACTTCCTCCGTGTTTTCG-3' [SEQ ID NO:10], Ønskede fusjoner blir påvist ved induserbarhet av p-galaktosidaseekspresjon i nærvær av cumen-hydroperoksyd eller tert-butyl-hydroperoksyd.
Når en ahp-lacZ-fusjon anvendes i fremgangsmåtene og settene ifølge foreliggende oppfinnelse, bør konstruksjonen være til stede i både en villtype E. coli og en mutant-stamme av E. coli som ikke kan syntetisere eller nedbryte fettsyrer
(fabB, fadE-stamme). Mutantstammen gir evnen til å identifisere en forbindelse som forårsaker lipidperoksydering. Perokyderings-sensitive, pattedyrcellespesifikke fettsyrer, så som linolensyre og linoleinsyre, kan bli satt inn i den bakterielle membran hos en slik stamme ved å dyrke den i medier inneholdende slike fettsyrer. Når en transformant av mutantstammen blir indusert til å uttrykke p-galaktosidase av en forbindelse, men en villtype-transformant ikke blir det, må den aktuelle forbindelse forårsake lipidperoksydering.
Flytting av ahp-lacZ-fusjonskonstruksjonen fra den opp-rin-nelige stamme til en annen stamme blir oppnådd via Pl-ly-satprosedyren beskrevet i eksempel 3.
VI. nfo
nfo-genet koder for et DNA reparasjonsenzym som er spesifikt for oksydativ skade som spalter imidazolringen hos nukleinsyrer. Det blir indusert ved redox-aktive midler, så som slike som forårsaker superoksyd-radikaldannelse. nfo-genet ble beskrevet av R. Cunningham et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, s. 474-78 (1985). nfo-lacZ-konstruksjonen ble dannet som beskrevet i S. Saporito et al., J. Bacteriol., 170, s. 5141-45 (1988). Oppfinneren fikk denne konstruksjon fra Dr. Richard Cunningham.
En nfo-lacZ-fusjon kan konstrueres ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-CATCGCATAAACCACTACAT-3' (SEQ ID NO:11] og 5<1->GTTACTGCCCTGACCGGCGG-3<1>[SEQ ID NO:12]. Fusjonene blir utvalgt for induserbarhet av G-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av paraquat.
VII. sdh
Ekspresjon av sdh-genet blir Inhibert av mangel på oksygen eller inhibering av elektrontransport. Således blir påvisning av sdh-induksjon indikert ved en minkning i påvisbar produktekspresj on.
sdh-lacZ-fusjonen ble dannet ved Mu dX-innsetning i sdh-genet inneholdt på et plasmid som ble fremskaffet av Dr. John Guest, University of Sheffield, England, som beskrevet i eksempel 1, del II. Transformantene ble undersøkt ved inkubering under anaerobe betingelser.
Sekvensen av sdh har blitt publisert [S. S. Ner et al., Biochemistry, 22, s. 5243-48 (1983), hvis beskrivelse er innbefattet heri pr. referanse. En sdh-lacZ-fusjon kan bli konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5<*->GAATTCGACCGCCATTGCGC-3' [SEQ ID NO:13] og 5•-AAGTCGGTATTTCACCTAAG-3' [SEQ ID NO:14]. Transformanter blir undersøkt for tilstedeværelse av fusjonen ved undertrykket B-galaktosidase-ekspresjon under anaerobe betingelser.
VIII. dinD
Oppfinneren fikk denne konstruksjon fra Graham Walker, som laget denne fusjon slik som beskrevet i S. Kenyon et al., Nature, 289, s. 808-12 (1981). Denne konstruksjon ble dannet ved samme Mu dx-innsetningsprosedyre som beskrevet i eksempel 1, del III. Transduktanter inneholdende fusjonen ble identifisert ved ekspresjon av p-galaktosidase i nærvær av mitomycin C.
Oppfinneren flyttet dinD-lacZ-fusjonen inn i stamme SF1 ved hjelp av Pl-transduksjonsteknikken beskrevet i eksempel 3. Den resulterende stamme inneholdende dinD-lacZ-fusjonen er betegnet SF923.
En prøve av SF923 ble deponert hos the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 206520 den 26. juni 1992, og har fått tilgangsnummer 55336.
IX. rpoD
Oppfinneren fremskaffet en rpoD-lacZ-fusjon fra en annen kilde, som laget denne ved å anvende den Mu dX kromosomale innsetningsteknikk beskrevet i eksempel 1, del III. Oppfinneren flyttet rpoD-lacZ-fusjonen inn i E. coli stamme SF1 ved Pl-transduksjon som beskrevet i eksempel 3.
Alternativt kan en rpoD-lacZ-fusjon bli konstruert under
anvendelse av PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-AAGCTTGCATTGAACTTGTG-3' [SEQ ID NO:15] og 5'-GTTTGCCGCCTGCTCTTCCC-3' [SEQ ID NO:16]. Ønskede fusjoner blir påvist ved B-galaktosidaseekspresjon i nærvær av etanol.
X. hag
hag-lacZ-fusjonen ble konstruert ved innsetning av en Mu dX i et plasmid inneholdende et klonet hag-gen, som beskrevet i eksempel 1, del II. Transformanter ble utvalgt for represjon av p-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av CCCP.
Sekvensen av hag-genet er kjent [G. Kuwajima et al., J. Bacteriol., 168, s, 1479-83 (1987), hvis beskrivelse er innbefattet heri pr. referanse]. Således kan en hag-lacZ-fusjon bli kontruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-GACGGCGATTGAGCCGACGG-3' [SEQ ID NO:17] og 5'-TTAGTACCGGTAGTGGCCTG-3' [SEQ ID NO:18]. Transformanter blir undersøkt for tilstedeværelse av den ønskede fusjon ved minket ekspresjon av p-galaktosidase i nærvær av forbindelser som forstyrrer membranintegritet, så som CCCP.
XI. ada
Oppfinneren konstruerte en ada-lacZ-fusjon ved å bruke Mu dX-innsetningsteknikken beskrevet i eksempel 1, del II, inn i et plasmid inneholdende ada-genet. Dette plasmid ble fremskaffet fra Dr. Leona Samson ved Harvard University. Transfektanter ble utvalgt på basis av induksjon av p-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av MMS.
Nukeotidsekvensen av ada-genet har blitt publisert [Y. Nakabeppu et al., J. Biol. Chem., 260, s. 7281-88 (1985)]. Følgelig kan en ada-lacZ-konstruksjon bli dannet ved å anvende PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-AAGCTTCCTTGTCAGCGAAA-3' [SEQ ID NO:19] og 5'-CAGCGTTTCGTCAGCTTTGC-3* [SEQ ID NO:20]. Transformanter blir undersøkt for tilstedeværelse av den ønskede fusjon ved induserbarhet av p-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av MMS.
XII. flyr
En gyr-lacZ-fusjon ble under anvendelse av Mu dX-innset-ningsmetoden konstruert inn i et plasmid inneholdende gyr-genet som beskrevet i eksempel 1, del II. De resulterende transfektanter ble valgt ut for induksjon av p-galaktosidaseekspresjon i nærvær av nalidixinsyre.
Sekvensen av gyrA-genet ble beskrevet av H. Yohida et al,, Mol. Gen. Genet., 211, s. 1-7 (1988). En gyr-lacZ-fusjon kan bli konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-CTACGTTATGGTTTACCGGC-3<1->[SEQ ID NO:21] og 5'-AAGTACGCGACGGTGTACCG-3' [SEQ ID NO:22]. Transformanter inneholdende den ønskede fusjon blir identifisert ved induserbarhet av p-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av nalidixinsyre.
XIII, top
Oppfinneren anvendte den Mu dX kromosomale innsetningsteknikk beskrevet i eksempel 1, del III, for å danne et bibliotek og fra dette velge ut top-lacZ-fusjoner. Biblioteket utvelges for induksjon av p-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av acridin orange for å isolere kloner inneholdende den ønskede fusjon.
top-genet ble sekvensert av T.-D. Dinh et al., J. Mol. Biol., 191, s. 321-31 {1986). En top-lacZ-fusjon blir alternativt konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-GCATCAACCGCAGTTTGCGC-3<*>[SEQ ID NO:23] og 5<»->CACCGGCGTCACGCAGCGTA-3' [SEQ ID NO:24]. Transformanter inneholdende den ønskede fusjon blir identifisert ved induserbarhet av p-galaktoidase-ekspresjon i nærvær av et DNA interkalaterende middel, så som acridin orange eller eti-dium-bromid.
XIV. clpB
Oppfinneren konstruerte en clpB-lacZ-fusjon fra et plasmid inneholdende clpB-genet ved å bruke Mu dX innsetningsmeto-den beskrevet i eksempel 1, del II. Transduktanter ble utvalgt for induksjon av B-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av puromycin, en forbindelse som er kjent for å danne av-kortede proteiner.
clpB-genet har nylig blitt sekvensert [C. h. Sqires et al., J. Bacteriol., 173, s. 4254-62 (1991). Alternativt kan en clpB-lacZ-fusjon bli konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'- GATCCGGTACGCGTGATTT-3<1>[SEQ ID NO:25] og 5'-CCAGACGCATAACTCCTCCC-3' [SEQ ID NO:2 6]. De transformanter som kan bli indusert til å uttrykke p-galaktosidase ved eksponering til canavanin, puromycin eller varme, inneholder en clpB-lacZ-fusjon.
XV. merR
merR-genet er beskrevet av W. Ross et al., J. Bacteriol., 171, s. 4009-18 (1989). Oppfinneren fremskaffet merR-lacZ-fusjonen fra Dr. Ann Summers, i Dr. Ross<*>laboratorium.
En merR-lacZ-fusjon blir alternativt konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgen-de primere: 5<*->CGCTTGACTCCGTACATGAG-3<*>[SEQ ID NO:27] og 5<*->TGGATAGCGTAACCTTACTT-3<1>[SEQ ID NO:28]. De transformanter som uttrykker p-galaktosidase ved eksponering til me-tylkvikksølv, inneholder den ønskede fusjon.
XVI. fepB- entC
Oppfinneren konstruerte en fepB-entC-lacZ-fusjon ved Mu dX innsetning i et plasmidkodet fepB-entC-gen. Induksjonen ble målt ved å behandle de resulterende transformanter med me-tallchelatoren, EGTA.
Alternativt kan en fepB-entC-lacZ-fusjon bli konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-CCACAAGATGCAACCCCGAG-3' [SEQ ID NO:29] og 5'-GACGTATCCATATCATCCTCC-3' [SEQ ID NO:30], basert på den angitte nukleotidsekvens av fepB-genet [M. F. Elkins et al., J.Bacteriol., 171, s. 5443-51 (1989)]. Transformanter ble utvalgt for tilstedeværelse av den ønskede fusjon som beskrevet i T. J. Brickman et al., J. Mol. Biol., 212, s. 669-82 (1990).
XVII. cyo
Oppfinneren mottok en cyo-lacZ-fusjon fra Dr. C. C. Lin i Dr. Iuchi's laboratorium ved Harvard Medical School.
En partiell sekvens av cyo-operonet ble publisert av J. Minagawa et al., J. Biol. Chem., 265, s. 11198-203 (1990). En cyo-lacZ-fusjon kan konstrueres ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5<*->TTGACGATGGACGCGCTGGA-3<*>[SEQ ID NO:31] og 5'-CAATTGGTATAACCAATGTG-3' [SEQ ID NO:32]. Den resulterende lacZ-fusjon blir identifisert ved å inkubere transformantene under anaerobe betingelser og velge ut de transformanter som utviser undertrykket p-galaktosidase-ekspresjon.
XVIII. gsh
Oppfinneren konstruerte en gsh-lacZ-fusjon ved Mu dX-innsetning i et plasmid som bærer gsh-genet. Denne teknikk er beskrevet i eksempel 1, del II. Oppfinneren selekterte for kloner som uttrykte p-galaktosidase i nærvær av NEM.
gsh-genet har blitt klonet og sekvensert [H. Gushima et al., Nucleic Acids Res., 12, s. 9299-307 (1985). Følgelig kan en gsh-lacZ-fusjon bli dannet ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5<1->AAGCTTCAGCAGTGGCAGAA-3' [SEQ ID NO:33] og 5'-GTATAAACCGCCTTCCGGGCC-3' [SEQ ID NO:34]. Transformanter blir utvalgt med N-etylmaleimid.
XIX. mutT
En mutT-lacZ-fusjon ble dannet ved å bruke Mu dX innsetningsteknikken i en plasmidkodet versjon av mutT-genet som beskrevet i eksempel 1, del II. Transformanter ble utvalgt for B-galaktosidaseekspresjon etter eksponering til rønt-gen-bestråling.
Sekvensen av mutT-genet ble publisert av M. Akiyama et al., Mol. Gen. Genet., 206, s. 9-16 (1987), Således blir en mutT-lacZ-fusjon alternativt konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-CTGCACTGGCGGCGCAAACC-3' [SEQ ID NO:35] og 5'-ATAAGACGCGGACAGCGTCG-3<1>[SEQ ID NO:36]. Transformanter inneholdende den ønskede konstruksjon blir utvalgt for B-galaktosidase-ekspresjon etter eksponering til røntgenbe-stråling.
XX. une
Oppfinneren konstruerte en unc-lac-fusjon ved Mu dX-innsetning i et plasmid inneholdende en klonet unc-gen. Transformanter ble valgt ut for p-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av 2,4-dinitrofenol.
En partiell sekvens av unc-operonet ble publisert av H. Kanazawa et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 103, s. 604-12 (1981). Således kan en une-lacZ-fusjon bli konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgene primere: 5•-AAAGCAAATAAATTTAATTTTT-3'
[SEQ ID NO:37] og 5•-GGCCACCCGGCCTTTCGCTG-3' [SEQ ID NO:38]. Transformanter blir utvalgt for induserbarhet av B-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av 2,4-dinitrofenol.
XXI. rdc
Oppfinneren fremskaffet en stamme inneholdende en rdc-lacZ-fusjon fra Dr. G. T. Javor. Fusjonen ble dannet ved å bruke den tilfeldige Mu dX-innsetningsteknikk beskrevet i eksempel 1, del HIA. Transfektanter ble utvalgt for tilstedeværelsen av fusjonen ved inkubering på X-gal plater i nærvær av tioglycerol. Kolonier som var blå i et slikt assay, inneholdt den ønskede fusjon.
rdc-lacZ-fusjonen ble overført fra kildestammen til SF1 vd å bruke Pl transduksjonsteknikken beskrevet i ekempel 4. En stamme inneholdende denne fusjon ble betegnet SF924.
En prøve av SF924 ble deponert hos the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Avenue, Roekville, Maryland 20852, den 26. juni 1992, og fikk tiIgangsnummer 55335.
XXII. lon
Sekvensen av lon-genet og beliggenheten av promoteren har blitt beskrevet av T. A. Phillips et al., J. Bacteriol., 159, s. 283-87 (1984). En lon-lacZ-fusjon ble konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-TCTCGGCGTTGAATGTGGG-3' [SEQ ID NO:39] og 5<1->CGACGTCTTCCATGGACGGC-3' [SEQ ID NO:40]. Transformanter blir utvalgt for induserbarhet av B-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av puromycin.
XXIII. leu- 500
Sekvensen av leu-500-genet, som inneholder en enkelt punkt-mutasjon i promoteren, har blitt beskrevet av R. M. Gemmill et al., J. Bacteriol., 158, s. 948-53 (1984). En leu-500-lacZ-fusjon blir konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgene primere: 5'- GTCAACAAAATGCAATGGCG-3' [SEQ ID NO:41) og 5'-GCGTTATGCTTTTAGTGGCACTGG-3' [SEQ ID NO:42]. Transformanter blir utvalgt for induserbarhet av p-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av nalidixinsyre eller coumermycin.
XXIV. meto
Sekvensen av meto-genet har nylig blitt rapportert av M. Rahman et al., GenBank/ EMBL Database, tilgangsnr. M89992. En meto-lacZ-fusjon blir konstruert ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-AAGCTTACACAGCATAACTG-31 [SEQ ID NO:43] og 5'-CCAGGCAGGGCATCGGCGGGGG-3' [SEQ ID NO:4 4]. Trans formanter blir utvalgt for induserbarhet av p-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av N-etylmaleimid.
Eksempel 7
Assay av ukjente karsinogener ved å bruke forskjellige stresspromotere
Et antall forskjellige kjemikalier ble undersøkt med hen-blikk på deres evne til å indusere ekspresjoner av forskjellige stresspromoter-lacZ-fusjoner beskrevet ovenfor. Kjemikaliene som ble brukt for disse forsøk, var metyl-kvikksølv (0-1 uM), 4-nitrokinolinoksyd ("4-NQO") (0-100 picomolar), MMS (0-40 nM), paraquat (0-50 uM), plumbagin (0-160 uM), mitomycin (5 ug/ml), 2,2'-dipyridyl (0-160 uM, H202(0-1600 uM) og NaCl for osmotisk stress (0-0,8 M). Visse stresspromoter-lacZ-fusjoner ble også utsatt for variasjoner i pH og veksttemperatur.
Disse resultater gir viktig innsikt i typene av forbindelser som induserer forskjellige stresspromotere. For eksempel viser Figur 1 at kvikksølv spesifikt induserer merR-promoteren, men ikke sfiA'eller sodA-promoteren. Således kan det konkluderes at kvikksølv ikke har noen effekt på DNA-replikasjonen (et stress som induserer sfiA-promoteren) og ikke forårsaker dannelse av superoksyder (et stress som induserer sodA).
Figur 2 viser at 4-NQO forårsaker DNA-replikasjonsskade (induksjon av sfiA- og dinD-promoterne) spesifikt via DNA kjedebrudd (dinD-promoter), ikke DNA-a1kylering (adaA-promoter). Den mindre, men doseavhengige induksjon av nfo-promoteren antyder at DNA-skaden forårsaket av 4-NQO er oksygenavhengig.
MMS forårsaker tilsynelatende DNA-skade ved alkylering av DNA (induksjon av adaA-promoteren), ikke via kjedebrudd (dinD-promoter). Alkyleringen forårsaket av MMS er ikke oksygen-avhengig (nfo-promoter). Disse resultater er angitt i
Figur 3.
Både paraquat (se tabell nedenfor) og plumbagin (se Figur 4) forårsaker induksjon av soi28-promoteren. I tillegg in-duserte paraquat også nfo-promoteren, noe som indikerer at forbindelsen forårsaker oksygenavhengig DNA-skade. Paraquat har en neglisjerbar effekt på indusering av den anaerobio-sis- og transisjonsmetall-sensitive ndh-promoter. Resultatene med både paraquat og plumbagin er spesielt relevante, fordi ingen av disse forbindelsene danner en positiv respons i det meget brukte Ames Assay.
For mitomycinassayet anvendte oppfinneren kun én konsentrasjon av forbindelsen, men varierte tiden for eksponering fra 0-55 minutter. Resultatene, angitt i tabellen nedenfor, viser at etter 55 minutters eksponering til mitomycin er dinD-promoteren indusert omtrent fire ganger sin opprinnelige verdi. Dette indikerte at mitomycin forårsaket DNA-kjedebrudd.
Som ventet induserer øket osmotisk trykk (øket NaCl-konsentrasjon) proU-promoteren, men resulterer ikke i superoksyddannelse (ingen induksjon av sodA eller soil7) (Figur 5). I motsetning til dette forårsaker 2,2'-dipyridyl superoksyddannelse (sodA-induksjon), så vel som chelaterende metaller (fepB-induksjon). 2,2'-dipyridyl har ingen effekt på DNA-replikasjon (sfiA-promoter). Dette er vist i Figur 6.
For å se hvordan vertsorganismer som inneholder rpoD-promoteren reagerer på varmesjokk, inkuberte oppfinneren disse vertsorganismer ved 43°C i stedet for 30°C i 0-50 min. Resultatene av dette assay, angitt nedenfor, viser en tre gangers induksjon av rpoD-promoteren etter 20 min. Minknin-gen i induksjon observert etter 30 og 50 min ble tilskrevet øket celledød, ikke reversering av induksjon.
Endelig undersøkte oppfinneren effekten av å inkubere vertsorganismer som inneholder forskjellige stresspromoter-lacZ-fusjoner i medier med pH i området fra 5 til 8. Resultatene som er vist i figur 7, viser at sfiA- og soil7-promoterne ikke ble indusert ved noen av de forskjellige pH-verdier. aniG-promoteren viste maksimal induksjon ved pH 6,0 og en lineær minkning i induksjon både ved høyere og lavere pH.
Eksempel 8
Identifikasjon av antitoksiner
Etter at en ukjent forbindelse er funnet å være et toksin på basis av sin induksjon eller suppresjon av stresspromoter- kontrollert p-galaktosidase-ekspresjon, kan den samme prosess anvendes for å identifisere et potensielt anti-toksin.
Det blir vist at en ukjent forbindelse induserer ekspresjon av p-galaktosidase både i en vertsorganisme som inneholder en dinD-lacZ-konstruksjon og i en vertsorganisme som inneholder en katG-lacZ-konstruksjon. Dette indikerer at forbindelsen forårsaker produksjon av hydrogenperoksyd (katG-induksjon) i tilstrekkelig høye konsentrasjoner til å forårsake DNA kjedebrudd (dinD induksjon). Det er kjent at ascorbinsyre reduserer antallet hydrogenperoksydinduserte DNA kjedebrudd, og den er derfor et potensielt antitoksin for denne ukjente forbindelse.
Vertsorganismer inneholdende katG-lacZ og vertsorganismer inneholdende dinD-lacZ blir hver utsådd i 8 brønner i en 96 brønners mikrotiterskål. Hver brønn inkuberes med en forskjellig fortynning av ascorbinsyre i 30 min ved 30°C. Den første brønn er en kontroll og mottar ingen ascorbinsyre. Hver brønn blir så eksponert til konsentrasjonen av ukjent forbindelse, på forhånd bestemt til å være optimal for maksimal p-galaktosidase-induksjon. Assayet blir så utført som beskrevet i eksempel 5. Hvis vertsorganismene i de ascor-binsyrebehandlede celler uttrykker lavere nivåer av p-galaktosidase enn kontrollbrønnen, blir dette ansett å være et antitoksin.
Eksempel 9
Forbedret toksin- induserbart p- qalaktosidase- assay
To 96 brønners mikrotiterplater ble brukt for hver forbindelse som skulle undersøkes. En plate inneholdt stammer med fusjoner til "sterke" promotere: gyrA, katG, micF, topA, ada, cyd (amp<R>), hag (amp<R>) ogzwf (ampR) . Den andre plate inneholdt stammer med fusjoner til "svake" promotere (even-tuell medikamentresistens av stammen er indikert i paren-tes) : groE, clpB, katF, merR, soi28 (amp<*>), dinD (amp<R>), aniG (kan<R>) og nfo (kan<R>) .
Kulturer av hver av de ovennevnte stammer ble dyrket separat i 1 ml LB-medium inneholdende det passende antibiotikum, om nødvendig (100 ug ampicillin eller 50 ug kana-myc-in) over natten ved 37°C ved god aerering. Oppfinneren plasserte deretter 250 ul av en 1:117 fortynning av hver kultur i brønnene 2-11 av separate rekker. Brønn 1 i hver rekke inneholdt 225 ul LB + antibiotikum. Brønn 12 i hver rekke inneholdt 25 ul av den ufortynnede overnattingskultur og 300 fil LB + antibiotikum. Oppfinneren inkuberte deretter platene ved 37°C i 2 timer med god aerering. Eter 2 timer ble kulturene målt og OD60oregistrert.
Kjemikaliet som skal undersøkes ble oppløst i et minimalt volum oppløsningsmiddel, fortrinnsvis vann. Hvert kjemikalium ble undersøkt over et område på 5 gangers fortynninger. Oppfinneren tilsatte 25 ul av den passende fortynning til en gitt brønn i hver rekke (dvs. brønn 2 i hver rekke mottok 25 fil av ufortynnet kjemikalium, brønn 3 i hver rekke mottok 25 ul av en 1:5 fortynning, brønn 4 i hver rekke mottok 25 ul av en 1:25 fortynning, osv.). Brønn 1 i hver rekke mottok 25 ul sterilt vann. Etter tilsetning av kjemikaliet som skal undersøkes, målte oppfinneren igjen ODsoo av brønnene. Platene ble deretter inkubert ved 37°C i 2 timer med god aerering.
Etter inkubering med kjemikaliet målte og registrerte oppfinner OD6oofor hver brønn. Denne ODeoo-avlesning ble så brukt ved utregning av p-galaktosidase-aktivitet. Oppfinner pipetterte 200 pil av cellene fra hver brønn opp i en tilsvarende brønn i en 96 brønners mikrotiterplate av kloro-formresistent polypropylen. Oppfinneren tilsatte deretter 50 ul kloroform til hver brønn i en damphette og blandet ved å pipettere opp og ned. Platene fikk så stå ved romtemperatur i 15 minutter for at cellene skulle permeabilisere. Brønn 1 mottok 210 fil Z-buffer og 40 ul ONPG-oppløsning. Hens cellene permeabiliserte, plasserte oppfinneren 170 ul Z-buffer og 40 fil ONPG (4 mg/ml i Z-buffer) i hver av brøn-nene 2-13 i to 96-brønners mikrotiterpater ("reaksjonspla-ter"). Deretter pipetterte han 40 ul av de permeabili-serte celler {og passet på ikke å fjerne noe kloroform) fra hver brønn inn i den tilsvarende brønn i reaksjonsplatene og blandet ved å pipettere opp og ned. Når alle brønnene var fylt, ble platen plassert i en Ceres 900 mikroplate-avleser (Biotek, Burlington, VT) og analysert ved å måle
OC«o hvert minutt i 30 minutter. Brønn 1 i hver rekke fung-erte som blindprøve. Ved slutten av de 30 minutter ble ODsso for hver brønn registrert for bruk i aktivitetsut-regning. OD«o mot tid for hver brønn ble så nedtegnet og helningsvinkel av den lineære del av den resulterende kurve ble ut-regnet. B-galaktosidase-aktiviteten ble regnet ut ved hjelp av den følgende formel
[ tjt- tp] x ( helningsvinkel) + Ci= OD550
(tx) x (OD«oo) x (vol)
hvor to var tiden mellom tidspunktet for tilsetning av cellene til ONPG og tidspunktet ved hvilket platen ble plassert på plate-avleseren; txvar den totale tid mellom til-setningen av cellene til ONPG og slutten av minuttav-les-ningen; Civar den initielle OD42o-avlesning fra plate-le-seren; og "vol" var volumet av cellene (40 ul) delt med det totale volum i reaksjonsbrønnen (210 ul). Aktiviteten ble så sammenlignet med p-galaktosidaseaktiviteten for hver stamme som var inkubert ved fravær av kjemikalium for å gi en "gangers induksjon"-verdi.
Resultatene ble så nedtegnet i et tredimensjonalt histogram som viste ganger induksjon for hver stresspromoter ved hver konsentrasjon av kjemikalium. Eksempler på slike histogram-me r er vist i figurene 9-12.
Eksempel 10
Konstruksjon av ytterligere stresspromoter- lacZ- fusioner
XXV. micF
Oppfinneren konstruerte en micF-lagZ-fusjon ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de føl-gende primere: 5<1->ATATGAATTCGTCGGCAAGTCCATTCTCCCC-3' [SEQ
ID NO:45]; og 5'-ATATGGATCCGCGGGAGTTATTCTAGTTGCC-3' [SEQ ID
NO: 46].
Transformanter ble utvalgt for induserbarhet av p-galaktosidase-ekspresjon i nærvær av etanol.
XXVI. ada
Oppfinneren konstruerte en forbedret ada-lacZ-fusjon som følger. Oppfinneren syntetiserte de følgende to oligonukleotider som representerte deler av topp- og bunnkjeden av ada-promoteren: 5'-TATAGAATTCCCTTGTCAGCGAAAAAAATTAAAGCGCAA-GATTGTTGGTTTTTGCGTGATGGTGACCGGGCAGCCTAAAGGCTATCC-3• [SEQ ID
NO:47]; og 5'
ATATGGATCCAATCAGCTCCCTGGTTAAGGATAGCCTTTAGGCTGCCCGGTCACCATCA
CGC-3<*>[SEQ OD NO:48].
De to oligonukleotider hadde 30 basepar av homolog overlap-ping. Oppfinneren koblet oligonukleotidene til hverandre og inkuberte så med Klenow fragment for å fullstendiggjøre syntese av den dobbeltkjedede promoter. Oppfinneren spaltet så den dobbeltkjedede promoter med EcoRI og BamHI. Den spaltede promoter ble så klonet i EcoRI/ BamHI-spaltet pRS415. Positive transformanter ble isolert ved blå farge etter vekst i nærvær av MMS og X-gal.
XXVII. cyd
Oppfinneren fremskaffet en stamme av E. coli inneholdende en cyd-lacZ-fusjon integrert i det bakterielle kromosom. Nukleotidsekvensen av cyd-promoteren ble rapportert av G. N. Green et al., J. Biol. Chem., 263, s. 13138-143 (1988). Således kan en cyd-lacZ-fusjon konstrueres ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-CGCCGAATTCGCGGCGTAATATATACGTCCCATC-3' [SEQ ID NO:49] og 5'-CGCGGGATCCCATGACTCCTTGCTCATCGCATGAAGACTCCG-3' [SEQ ID
NO:50].
Transformanter blir utvalgt for induserbarhet av p-galaktosidaseekspresjon ved inkubering av stammen under anaerobe betingelser.
XXVIII. zwf
Oppfinneren fremskaffet en stamme av E. coli inneholdende en zwf-lacZ-fusjon integrert i det bakterielle kromosom.
En zwf-lacZ-fusjon kan konstrueres ved å bruke PCR-teknikken beskrevet i eksempel 2, del II, og de følgende primere: 5'-CGCCGAATTCTGCCGCAGTTTGCGCGCTTTTCCCG-3•[SEQ ID NO:51]; og 5'-GCGCGGATCCGTCATTCTCCTTAAGTTAACTAACCGG-3' [SEQ ID NO:52]
Transformanter blir utvalgt for induserbarhet av B-galaktosidaseekspresjon ved inkubering av stammer i nærvær av superoksyddannende forbindelser, så som paraquat, eller i nærvær av nitrogenoksyd.
XXIX. qroE
Oppfinneren fremskaffet en stamme av E. coli inneholdende en groE-lacZ-fusjon integrert i det bakterielle kromosom.
En groE-lacZ-fusjon kan konstrueres ved først å syntetisere de følgende to oligonukleotider, som representerte deler av topp- og bunnkjeden av groE-promoteren: 5'-CGCCGAATTCATCAGA
ATTTTTTTTCTTTTCCCCCTTGAAGGGGCGAAGCCTCATCCCCATTTCTCTGGTCACC
AGCCGGG-3<*>[SEQ ID NO:53]; og 5<»->
6CGC6GATCCCGGAGCTTACGTGGTTCCCGGCTGGTGACCAGAGAAATGGGGATGA6GC
TTCGCCCCTTCAAGG-3<1>lSEQ ID NO:54].
De to oligonukleotider blir tilkoblet til hverandre og så inkubert med Klenow-fragment for å fullstendiggjøre syntese av den dobbeltkjedede promoter. Den dobbeltkjedede promoter blir så spaltet med EcoRI og BamHI. Den spaltede promoter blir så klonet i EcoRI/ BamHI-spaltet pRS415. Positive transformanter blir dyrket i nærvær av X-Gal og identifisert ved en blå farve etter en økning i veksttemperatur i kulturene fra 37°C til 42°C i 30 minutter.
XXX. aniG
Oppfinner fremskaffet E. coli-stammen JF1295
(aniG1072::Mu dJ) fra Dr. John Foster og Dr. Kevin Karem fra University of South Alabama College of Hedicine. Denne stamme inneholder en enkelt kopi av en anig-lacZ-fusjon i det bakterielle kromosom. Konstruksjonen av denne stamme er beskrevet i Z. Aliabadi et al., J. Bacteriol., 170, s. 842-51 (1988).
Eksempel 11
Fremgangsmåte for integrering av en enkelt kopi av promoter- la cZ- fus 1 on i det bakterielle kromosom
For å sammenligne induksjon av de forskjellige promotere overfor hverandre, er det nødvendig å standardisere kopiantallet av hver promoterfusjon-konstruksjon. Dette ble oppnådd ved å bruke en rekombinant lambda fag for å inte-grere en enkelt kopi av fusjonen i det bakterielle kromosom.
E. coli stamme SF1 som bærer en stresspromoter-lacZ-fusjon på et plasmid, ble dyrket i 5 ml lambda-medium (1% (w/v) trypton, 0,1% (w/v) gjærekstrakt, 0,2% (w/v) maltose og 0,25% (w/v) Nacl) ved 37°C inntil cellene nådde en konsentrasjon på 5 x lOVml. Cellene ble så sentrifugert, og cel- lepelleten ble resuspendert i 5 ml 10 mM MgS04og inkubert ved 37°C i 1 time med risting.
Oppfinneren tilsatte så 100 ul av en fortynningsserie av éRS88 [R. W. Simons et al., Gene, 53, s. 85-96 (1987)] i SM-buffer til 200 ul celler. Blandingene ble inkubert ved
37°C i 15-20 minutter med risting. Hele de 300 ul ble så tilsatt til 3 ml toppagar 11% /w/v) trypton, 0,1% (w/v) gjærekstrakt, 0,2% (w/v) maltose, 0,25% (w/v) Nacl) og 0,65% (w/v) agar] holdt ved 45°C, og blandingen ble helt opp i lambda agar plater [1% (w/v) trypton, 1% (w/v) agar og 0,25% (w/v) NaCl]. Platene ble inkubert ved 37°C inntil synlige plaquer dannet seg. Platen som inneholdt de fleste konfluente plaqer ble anvendt for neste trinn.
Deretter tilsatte oppfinneren 5 ml SM-buffer til platen og skrapet forsiktig bort denne oppløsning sammen med topp-agaren inn i et glassrør. Til dette tilsatte oppfinneren 1 ml kloroform og hvirvelblandet dette i 10 sekunder. Oppfinneren sentrifugerte blandingen, fjernet den øvre fase av supernatanten, tilsatte 0,5 ml kloroform til den fjernede supernatant og lagret ved 4°C. Det endelige fag-lysat inneholdt mellom IO<6>og 10<10>fag/ml. Frekvensen av rekombinant fag inneholdende stresspromoterfusjonen er omkring 1 pr. 10<4>fag.
Deretter utførte oppfinneren trinnene å integrere en enkelt kopi av stresspromoterfusjonen i det bakterielle kromosom. SFl-celler ble dyrket i 5 ml lambda-medium ved 37<*>C til en konsentrasjon på 5 x IO<8>celler/ml. Så ble cellene sentrifugert og resuspendert i 5 ml 10 mM MgS04og inkuberte ved 37°C i 1 time med risting. Oppfinneren tilsatte så 100 ul av en fortynningsserie av eRS88-forrådet i SM-buffer til 200 fil celler. Blandingene ble inkubert ved 37<*>C i 15-20 minutter med risting. Hele de 300 ul ble tilsatt til 3 ml toppagar holdt ved 45°C og inneholdende 400 ug/ml X-Gal. Blandingen ble helt i lambda-agarplater, og platene ble inkubert ved 37°C inntil synlige plaquer dannet seg. Blå plaquer ble samlet opp ved å skubbe ut agaren med baksiden av en steril pipette og plassere agarpluggen i 200 fil SM-buffer og 50 ul kloroform. Blandingen ble så hvirvel-blandet inntil agarklumpen var brutt opp. Oppfinneren sentrifugerte så røret, flyttet supernatanten til et rør innehol-
dende 50 ul kloroform og lagret dette ved 4°C. De oppsam-lede plaqer ble renset en gang og deretter ble et lager dannet fra en plate inneholdende nesten konfluente plaquer.
For å danne en bakteriell stamme inneholdende en stresspromoter f us jon integrert i det bakterielle kromosom, ble det
ovennevnte plaquelager brukt til å infisere SFl-celler, som beskrevet ovenfor. Bakterielle kolonier som var til stede i sentrum av blå plaquer, ble samlet opp med en steril pas-teurpipette og plassert i 0,5 ml LB. Etter inkubering ved
37°C i 4-5 timer ble kulturen streket ut på LB/X-Gal-plater og inkubert ved 37°C over natten. Isolerte blå kolonier ble oppsamlet og deretter undersøkt for tilstedeværelse av den spesielle stresspromoter ved inkubering i nærvær av en kjent inducer. Bakterielle lysater ble så analysert for p-galaktosidase-aktivitet. Koloniene som utviste induserbar p-galaktosidase-aktivitet, inneholdt en enkelt kopi av den ønskede stresspromoterfusjon.
Eksempel 12
Ytterligere assays av kjente toksiner under anvendelse av det foretrukne sett
Oppfinneren brukte det mest foretrukne sett av promoter-fusjoner og p-galaktosidaseassayet, begge beskrevet i eksempel 11, for å danne en induksjonsprofil for MMS, HgCl, 4-NQO og paraquat.
Figur 9 viser at MMS spesifikt induserer ada-promoteren og, i mye mindre grad, dinD-promoteren ved konsentrasjoner på 470 uM til 1800 uM. Dette bekrefter den kjente virknings-måte av MMS som forårsaker DNA-skade i hovedsak ved å al-kylere DNA (ada-induksjon). Den mindre induksjon av dinD kan være et resultat av kraftige DNA kjedebrudd. Figur 10 viser at kvikksølvklorid spesifikt induserer mer<R->promoteren, som er kjent for å reagere på uorganiske kvikk-sølvforbindelser . Figur 11 viser at 4-NQO forårsaker induksjon av dinD-promoteren og i mindre grad av soi28-, nfo- og micF-promoterne. Dette er konsistent med virkningsmåten for 4-NQO som forårsaker DNA-skade via oksydative kjedebrudd så vel som forstyrrelse av redox-balansen i cellen. Figur 12 viser den spesifikke induksjon av soi28- og micF-promoterne og, i mindre grad av nfo-promoteren, med paraquat. Paraquat er kjent for å forårsake superoksydradikal-dannelse, som i sin tur induserer redox-stresspromotere soi28 og micF. nfo-promoteren blir indusert ved oksydativ DNA-skade, som kan være forårsaket av høye superoksyd-radi-kalkonsentrasjoner i cellen. Den tilsynelatende inhi-bering av mer<R->og dinD-promoterne kan enda ikke forklares.
I tillegg til de ovennevnte studier ble et stort antall andre kjemikalier undersøkt mot det foretrukne promoterse-tt, som består av bakterier inneholdende enkeltkopier av de følgende bakterielle stresspromotere fusert til B-galaktosidase: soi28, dinD, hag, ada, gyr, katG, nfo, clpB, merR, top, cyd, micF, zwf, groE, katF og aniG. Resultatene av disse undersøkelser er vist nedenfor i tabell 4.
I den ovenstående tabell er "middel" forbindelsen tilsatt til bakteriekulturene som innehodler de forskjellige stresspromoterfusjoner; "høy konsentr." er den høyeste konsentrasjonen av middel som er undersøkt mot disse kulturer; "inusert promoter" er stresspromoteren som blir indusert av et spesielt middel; "ganger induksjon" er nivået av stresspromoterkontrollert p-galaktosidaseekspresjon i nærvær av middel {ved den angitte konsentrasjon i "konsentrasjon "-kolonnen) sammenlignet med B-galaktosidaseekspresjon i nærvær av middel.
Claims (21)
1. Diagnostisk sett for bestemmelse av toksisitet av en forbindelse eller for identifisering av et antitoksin mot en toksisk forbindelse,
karakterisert vedat det diagnostiske sett omfatter: et antall bakterielle vertsorganismer, hvor hver av de nevnte vertsorganismer inneholder en promoter som reagerer på stress, hvilken promoter er operativt forbundet til et gen som er heterologt for nevnte promoter og som koder for et påviselig produkt, hvor nevnte antall vertsorganismer totalt omfatter minst én promoter som reagerer på hver av redox-stress, DNA-stress, proteinstress, energistress og pH-stress.
2. Diagnostisk sett ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte promoter som reagerer på redox-stress, er valgt fra sodA, soi28, katG, ahp, rdc, gsh, zwf og micF.
3. Diagnostisk sett ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte promoter som reagerer på DNA-stress, er valgt fra dinD, ada-alkA, ada, leu-500, gyr, top, mutT eller nfo.
4. Diagnostisk sett ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte promoter som reagerer på proteinstress er valgt fra rpoD, lon, merR, fepB-entC, groE eller meto.
5. Diagnostisk sett ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte promoter som reagerer på energistress, er valgt fra sdh, cyo, cyd eller une.
6. Diagnostisk sett ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte promoter som reagerer på pH-stress, er valgt fra hag, micF, aniG eller kat F.
7. Diagnostisk sett ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte antall bakterielle vertsorganismer totalt omfatter promoterne sio28, dinD, hag, ada, gyr, katG, nfo, clpB, merR, top, cyd, micF, zwf, groE, katF og aniG.
8. Diagnostisk sett ifølge krav 7,karakterisert vedat det ytterligere omfatter minst én promoter valgt fra rdc, ahp, lon, une, fepB-entC, leu-500, cyo, sdh, rpoD, ada-alkA, sodA, mutT, gsh eller meto.
9. Diagnostisk sett ifølge ethvert av kravene 1-8,karakterisert vedat nevnte gen som koder for et påviselig produkt er lacZ.
10. Fremgangsmåte ved påvisning av toksisitet av en forbindelse,
karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) å separat dyrke en cellekultur omfattende hver av et antall bakterielle vertsorganismer, hvor hver av nevnte vertsorganismer inneholder minst én promoter som reagerer på stress, hvilken promoter er operativt forbundet til et gen som er heterologt til nevnte promoter og som koder for et påviselig produkt, og hvor nevnte mengde vertsorganismer totalt omfatter promotere som reagerer på hver av: redox-stress, DNA-stress, proteinstress, energistress og pH-stress; (b) å inkubere hver av nevnte cellekulturer med nevnte forbindelse, og (c) å påvise nevnte påviselige produkt i hver cellekultur .
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat nevnte promoter som reagerer på redox-stress, er valgt fra sodA, katG, ahp, soi28, rdc, gsh, micF og zwf.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat nevnte promoter som reagerer på DNA-stress, er valgt fra dinD, ada-alkA, ada, leu-500, gyr, top, mutT eller nfo.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat nevnte promoter som reagerer på proteinstress, er valgt fra rpoD, lon, clpB, merR, fepB-entC, meto og groE.
14. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat nevnte promoter som reagerer på energistress, er valgt fra sdh, cyo, cyd eller une.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat nevnte promoter som reagerer på pH-stress, er valgt fra hag, katF, micF eller aniG.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat nevnte mengde bakterielle vertsorganismer totalt omfatter promoterne soi28, dinD, hag, ada, gyr, katG, nfo, clpB, merR, top, cyd, micF, zwf, groE, katF og aniG.
17. Fremgangsmåte ifølge krav 16,karakterisert vedat nevnte mengde bakterielle vertsorganismer ytterligere omfatter minst én promo ter valgt fra rdc, ahp, lon, une, fepB-entC, leu-500, cyo, sdh, rpoD, ada-alkA, sodA, mutT, gsh eller meto.
18. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 10-17,karakterisert vedat den omfatter det ytterligere trinn å inkubere nevnte forbindelse med et S9 le-verekstrakt, før trinn (b).
19. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 10-18,karakterisert vedat nevnte gen som koder for et påviselig produkt, er lacZ.
20. Fremgangsmåte for å identifisere et antitoksin mot en toksisk forbindelse,
karakterisert vedat fremgangsåten omfatter trinnene: (a) å påvise typen stress forårsaket av nevnte toksiske forbindelse ved fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 10-19; (b) å identifisere en kjent toksisk forbindelse som, i fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 10-19, forårsaker lignende stresstyper som stresstypene forårsaket av nevnte toksiske forbindelse, og (c) å identifisere et antitoksin mot nevnte toksiske forbindelse.
21. Fremgangsåte ved minking av toksisiteten for et medikament,
karakterisert vedat fremgangsåten omfatter trinnene: (a) å bestemme typen stress forårsaket av nevnte medikament ved å bruke fremgangsåten ifølge ethvert av kravene 10-19, og (b) å modifisere eller eliminere en del av nevnte medikament som forårsaker nevnte bestemte stresstyper.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US91079392A | 1992-07-06 | 1992-07-06 | |
PCT/US1993/006537 WO1994001584A1 (en) | 1992-07-06 | 1993-07-06 | Methods and diagnostic kits for determining toxicity utilizing bacterial stress promoters fused to reporter genes |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO950040D0 NO950040D0 (no) | 1995-01-05 |
NO950040L NO950040L (no) | 1995-03-06 |
NO319372B1 true NO319372B1 (no) | 2005-07-25 |
Family
ID=25429335
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19950040A NO319372B1 (no) | 1992-07-06 | 1995-01-05 | Fremgangsmate, samt diagnostiske sett for bestemmelse av toksisitet ved anvendelse av bakterielle stresspromotere fusert til reporter-gener |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5589337A (no) |
EP (1) | EP0651825B1 (no) |
JP (1) | JP3456703B2 (no) |
KR (1) | KR100300932B1 (no) |
AT (1) | ATE162225T1 (no) |
AU (1) | AU687353B2 (no) |
CA (1) | CA2139667C (no) |
DE (1) | DE69316368T2 (no) |
DK (1) | DK0651825T3 (no) |
ES (1) | ES2113546T3 (no) |
GR (1) | GR3026639T3 (no) |
HK (1) | HK1008433A1 (no) |
NO (1) | NO319372B1 (no) |
SG (1) | SG77101A1 (no) |
WO (1) | WO1994001584A1 (no) |
Families Citing this family (51)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL107815A (en) * | 1992-12-04 | 2003-12-10 | Du Pont | Genetic constructs comprising a stress-responsive promoter linked to a lux reporter operon and methods of use in environmental testing |
ATE160178T1 (de) * | 1993-01-21 | 1997-11-15 | Harvard College | Verfahren und diagnostische kits unter verwendung von säuger-stresspromotoren zur bestimmung der toxizität einer verbindung |
GB9420735D0 (en) * | 1994-10-14 | 1994-11-30 | Karobio Ab | Reporter cell line |
DE69527850T2 (de) * | 1994-11-23 | 2003-04-24 | E.I. Du Pont De Nemours & Co., Inc. | Bioluminiscente lyophilisierte bakterien-reagenz zur giftstoff nachweit |
US6387651B1 (en) | 1995-04-12 | 2002-05-14 | Biolog, Inc. | Comparative phenotype analysis of two or more microorganisms using a plurality of substrates within a microwell device |
CN1991365A (zh) | 1996-01-26 | 2007-07-04 | 沃尔科股份有限公司 | 根据人类hiv病毒株的表型药物敏感性控制hiv阳性病人化疗的方法 |
JP2001503990A (ja) * | 1996-11-15 | 2001-03-27 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 環境傷害物を検出するための少量で高感度の方法 |
WO1999014311A1 (en) * | 1997-09-18 | 1999-03-25 | Smithkline Beecham Corporation | Method of screening for antimicrobial compounds |
EP0950717A1 (en) | 1998-04-14 | 1999-10-20 | "VLAAMSE INSTELLING VOOR TECHNOLOGISCH ONDERZOEK", afgekort "V.I.T.O." | Diagnostic system and method for determining the presence of a genotoxic compound in a sample |
WO2000028072A1 (en) * | 1998-11-06 | 2000-05-18 | Emory University | Biomarkers for oxidative stress |
US6953666B1 (en) | 1998-11-06 | 2005-10-11 | Emory University | Biomarkers for oxidative stress |
AU4546300A (en) * | 1999-04-10 | 2000-11-14 | Merlin Gesellschaft Fur Mikrobiologische Diagnostika Mbh | Genotypic classification method |
US6410255B1 (en) * | 1999-05-05 | 2002-06-25 | Aurora Biosciences Corporation | Optical probes and assays |
US6673554B1 (en) * | 1999-06-14 | 2004-01-06 | Trellie Bioinformatics, Inc. | Protein localization assays for toxicity and antidotes thereto |
US6931396B1 (en) | 1999-06-29 | 2005-08-16 | Gene Logic Inc. | Biological data processing |
US20030232056A1 (en) * | 1999-09-10 | 2003-12-18 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
GB2355791B (en) * | 1999-10-28 | 2004-10-20 | Molecular Light Tech Res Ltd | Detection of mRNA expression using chemiluminescent labelled probes |
US20040171107A1 (en) * | 2000-02-23 | 2004-09-02 | David Nelson | Modified flourescent proteins |
US6696239B1 (en) | 2000-04-20 | 2004-02-24 | Biolog, Inc. | Comparative phenotype analysis for assessment of biological active compounds such as antimicrobials |
US7020561B1 (en) | 2000-05-23 | 2006-03-28 | Gene Logic, Inc. | Methods and systems for efficient comparison, identification, processing, and importing of gene expression data |
US20030171876A1 (en) * | 2002-03-05 | 2003-09-11 | Victor Markowitz | System and method for managing gene expression data |
US6667153B1 (en) | 2000-06-26 | 2003-12-23 | Susan Margaret Thomas | Composition and method for detecting mutagens |
AU2001280746A1 (en) * | 2000-07-21 | 2002-02-05 | Phase-1 Molecular Toxicology | Canine toxicity genes |
WO2002061041A2 (en) * | 2000-11-21 | 2002-08-08 | Irm Llc | Solubility reporter gene constructs |
US20030119094A1 (en) * | 2001-09-24 | 2003-06-26 | Irm Llc | Solubility reporter gene constructs |
WO2002059560A2 (en) * | 2001-01-23 | 2002-08-01 | Gene Logic, Inc. | A method and system for predicting the biological activity, including toxicology and toxicity, of substances |
US7054758B2 (en) * | 2001-01-30 | 2006-05-30 | Sciona Limited | Computer-assisted means for assessing lifestyle risk factors |
CA2437498A1 (en) * | 2001-02-05 | 2002-08-15 | Shen Quan Pan | Methods and kits for identifying scavengers of reactive oxygen species (ros) |
WO2002073504A1 (en) * | 2001-03-14 | 2002-09-19 | Gene Logic, Inc. | A system and method for retrieving and using gene expression data from multiple sources |
US7211383B2 (en) * | 2001-04-05 | 2007-05-01 | Genelink, Inc. | Kits and methods for assessing skin health |
US20020146698A1 (en) * | 2001-04-05 | 2002-10-10 | Genelink, Inc. | Kits and methods for assessing oxidative stress |
US7251642B1 (en) | 2001-08-06 | 2007-07-31 | Gene Logic Inc. | Analysis engine and work space manager for use with gene expression data |
DE20116898U1 (de) * | 2001-10-15 | 2002-01-17 | FESTO AG & Co., 73734 Esslingen | Mikroventil |
KR20030040923A (ko) * | 2001-11-17 | 2003-05-23 | 광주과학기술원 | 산화적 손상과 관련된 유해성 탐지를 위한 재조합발광박테리아 대장균DH5@/pSodaLux(EBHJ1)[KCTC10098BP] |
KR100461757B1 (ko) * | 2002-06-20 | 2004-12-14 | 광주과학기술원 | 화학물질의 독성과 그 유해성을 탐지할 수 있는 재조합발광 박테리아 |
CA2445420A1 (en) | 2003-07-29 | 2005-01-29 | Invitrogen Corporation | Kinase and phosphatase assays |
US7727752B2 (en) | 2003-07-29 | 2010-06-01 | Life Technologies Corporation | Kinase and phosphatase assays |
WO2005045426A2 (en) * | 2003-11-10 | 2005-05-19 | Aic | Gene expression profiling of hazardous compounds and corresponding database clustering algorithm |
GB0415963D0 (en) * | 2004-07-16 | 2004-08-18 | Cxr Biosciences Ltd | Detection of cellular stress |
CA2475240A1 (en) * | 2004-07-20 | 2006-01-20 | Biophys, Inc. | Method and device to measure dynamic internal calibration true dose response curves |
CA2475456A1 (en) * | 2004-07-20 | 2006-01-20 | Biophys, Inc. | Method and device to optimize analyte and antibody substrate binding by least energy adsorption |
WO2006096063A1 (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-14 | Stichting Voor De Technische Wetenschappen | Construct and method for screening, selection and identification of stress factors |
US7646450B2 (en) * | 2005-12-29 | 2010-01-12 | Lg Display Co., Ltd. | Light emitting diode array, method of manufacturing the same, backlight assembly having the same, and LCD having the same |
ES2307395B2 (es) * | 2006-09-04 | 2009-07-09 | Universidad De Oviedo | Metodo rapido de deteccion y evaluacion de agentes genotoxicos. |
EP2067104A1 (en) | 2006-09-28 | 2009-06-10 | Xeround Systems Ltd. | Apparatus and method for a distributed storage global database |
US8647642B2 (en) | 2008-09-18 | 2014-02-11 | Aviex Technologies, Llc | Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
ES2977793T3 (es) | 2017-11-08 | 2024-08-30 | Twinstrand Biosciences Inc | Reactivos y adaptadores para la secuenciación de ácidos nucleicos y métodos para fabricar dichos reactivos y adaptadores |
JP7420388B2 (ja) * | 2018-02-13 | 2024-01-23 | ツインストランド・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド | 遺伝毒性を検出し、評価するための方法および試薬 |
AU2019300172A1 (en) | 2018-07-12 | 2021-01-28 | Twinstrand Biosciences, Inc. | Methods and reagents for characterizing genomic editing, clonal expansion, and associated applications |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0063522B1 (en) * | 1981-04-14 | 1989-07-19 | Institut Pasteur | An inducible dna replication-cell division coupling mechanism in escherichia coli |
FR2533584B1 (fr) * | 1982-09-28 | 1986-03-21 | Pasteur Institut | Procede de detection du pouvoir mutagene de substances, susceptibles d'induire la deterioration d'adn cellulaires, mettant en jeu la production d'une reponse sos |
US4569916A (en) * | 1984-05-21 | 1986-02-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Assay for tumor promoting agents |
EP0370813A3 (en) * | 1988-11-25 | 1991-06-19 | Exemplar Corporation | Rapid screening mutagenesis and teratogenesis assay |
HU218717B (hu) * | 1989-03-17 | 2000-11-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Co. | Nukleinsav-termelést fokozó növényi eredetű génfragmentek és eljárás előállításukra |
-
1993
- 1993-07-06 CA CA002139667A patent/CA2139667C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-06 AT AT93917113T patent/ATE162225T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-06 US US08/367,122 patent/US5589337A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-06 WO PCT/US1993/006537 patent/WO1994001584A1/en active IP Right Grant
- 1993-07-06 JP JP50356294A patent/JP3456703B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-06 ES ES93917113T patent/ES2113546T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-06 DE DE69316368T patent/DE69316368T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-06 SG SG1996001688A patent/SG77101A1/en unknown
- 1993-07-06 EP EP93917113A patent/EP0651825B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-06 KR KR1019950700038A patent/KR100300932B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-07-06 DK DK93917113T patent/DK0651825T3/da active
- 1993-07-06 AU AU45884/93A patent/AU687353B2/en not_active Expired
-
1994
- 1994-04-21 US US08/231,990 patent/US5585232A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-01-05 NO NO19950040A patent/NO319372B1/no not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-04-14 GR GR980400840T patent/GR3026639T3/el unknown
- 1998-07-14 HK HK98109159A patent/HK1008433A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US5585232A (en) | 1996-12-17 |
KR950702639A (ko) | 1995-07-29 |
SG77101A1 (en) | 2000-12-19 |
JP3456703B2 (ja) | 2003-10-14 |
NO950040D0 (no) | 1995-01-05 |
AU4588493A (en) | 1994-01-31 |
DE69316368D1 (de) | 1998-02-19 |
NO950040L (no) | 1995-03-06 |
HK1008433A1 (en) | 1999-05-07 |
ATE162225T1 (de) | 1998-01-15 |
GR3026639T3 (en) | 1998-07-31 |
ES2113546T3 (es) | 1998-05-01 |
KR100300932B1 (ko) | 2001-10-22 |
JPH08501930A (ja) | 1996-03-05 |
CA2139667A1 (en) | 1994-01-20 |
AU687353B2 (en) | 1998-02-26 |
EP0651825B1 (en) | 1998-01-14 |
US5589337A (en) | 1996-12-31 |
DK0651825T3 (da) | 1998-09-14 |
EP0651825A1 (en) | 1995-05-10 |
CA2139667C (en) | 2005-03-29 |
WO1994001584A1 (en) | 1994-01-20 |
DE69316368T2 (de) | 1998-06-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO319372B1 (no) | Fremgangsmate, samt diagnostiske sett for bestemmelse av toksisitet ved anvendelse av bakterielle stresspromotere fusert til reporter-gener | |
Shimohata et al. | The Cpx stress response system of Escherichia coli senses plasma membrane proteins and controls HtpX, a membrane protease with a cytosolic active site | |
Francis et al. | The type III secretion chaperone LcrH co‐operates with YopD to establish a negative, regulatory loop for control of Yop synthesis in Yersinia pseudotuberculosis | |
Alba et al. | degS (hhoB) is an essential Escherichia coli gene whose indispensable function is to provide σE activity | |
Chauhan et al. | Interference of Mycobacterium tuberculosis cell division by Rv2719c, a cell wall hydrolase | |
Deloménie et al. | Identification and functional characterization of arylamine N-acetyltransferases in eubacteria: evidence for highly selective acetylation of 5-aminosalicylic acid | |
Campodonico et al. | A yeast genetic system for the identification and characterization of substrate proteins transferred into host cells by the Legionella pneumophila Dot/Icm system | |
Testerman et al. | The alternative sigma factor σE controls antioxidant defences required for Salmonella virulence and stationary‐phase survival | |
Raivio et al. | Tethering of CpxP to the inner membrane prevents spheroplast induction of the Cpx envelope stress response | |
Stohl et al. | The transcriptome response of Neisseria gonorrhoeae to hydrogen peroxide reveals genes with previously uncharacterized roles in oxidative damage protection | |
Hinz et al. | The Caulobacter crescentus polar organelle development protein PodJ is differentially localized and is required for polar targeting of the PleC development regulator | |
Liu et al. | Role of Lon and ClpX in the post‐translational regulation of a sigma subunit of RNA polymerase required for cellular differentiation in Bacillus subtilis | |
Pulschen et al. | The stringent response plays a key role in B acillus subtilis survival of fatty acid starvation | |
Schnupf et al. | Regulated translation of listeriolysin O controls virulence of Listeria monocytogenes | |
Loprasert et al. | Molecular and physiological analysis of an OxyR‐regulated ahpC promoter in Xanthomonas campestris pv. phaseoli | |
Ben‐Yaakov et al. | The regulatory network of Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 | |
Lawler et al. | Dissection of functional domains of the polar localization factor PodJ in Caulobacter crescentus | |
Kumar et al. | Characterization of DsbD in Neisseria meningitidis | |
Stubbendieck et al. | Linearmycins activate a two-component signaling system involved in bacterial competition and biofilm morphology | |
Doronina et al. | The proteolytic control of restriction activity in Escherichia coli K‐12 | |
Jovanovic et al. | Physical, functional and conditional interactions between ArcAB and phage shock proteins upon secretin‐induced stress in Escherichia coli | |
Ruxin et al. | Regulatory involvement of the PerR and SloR metalloregulators in the Streptococcus mutans oxidative stress response | |
Loprasert et al. | The Burkholderia pseudomallei oxyR gene: expression analysis and mutant characterization | |
Khodai-Kalaki et al. | Characterization of the AtsR hybrid sensor kinase phosphorelay pathway and identification of its response regulator in Burkholderia cenocepacia | |
Usongo et al. | Depletion of RNase HI activity in Escherichia coli lacking DNA topoisomerase I leads to defects in DNA supercoiling and segregation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |