JP2007515386A - Hiv感染個体の治療用免疫化 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)に感染した個体において治療用免疫応答を惹起するための改良された方法を提供する。該方法は、抑制されたウイルス血症を有する個体に、HIV抗原を発現するアデノウイルスワクチン組成物を投与することを含む。このような感染個体の免疫化は、応答のレベルおよび応答の幅広さの両方において顕著である、該ウイルスに対する細胞性免疫応答を惹起する。結果的に生じる治療用免疫応答は、ウイルスの低力価を有効に維持する能力を有し、したがって、抗ウイルス療法に対する個体の依存性を軽減すると予想される。
Description
本発明は、抑制されたウイルス血症を有するHIV感染個体においてウイルス複製を阻止するための有効な手段を開示する。該方法は、HIV抗原をコードする外因性核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスでの該個体の免疫化を含む。
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は後天性ヒト免疫不全症候群(エイズ)および関連障害の病原体である。HIVはレトロウイルス科のRNAウイルスであり、全てのレトロウイルスの5’−LTR−gag−pol−env−LTR3’体制を示す。プロウイルスとして公知の組込み形態のHIVは約9.8Kb長である。該ウイルスゲノムの各末端は、長末端反復配列(LTR)として公知のフランキング配列を含有する。
HIV遺伝子は少なくとも9個のタンパク質をコードしており、それらは主要構造タンパク質(Gag、PolおよびEnv)、調節タンパク質(TatおよびRev)および補助タンパク質(Vpu、Vpr、VifおよびNef)の3つのクラスに分けられる。gag遺伝子は55キロダルトン(kDa)の前駆体タンパク質(p55)をコードしており、これは未スプライスウイルスmRNAから発現され、HIVプロテアーゼ(pol遺伝子の産物)によるタンパク質分解によりプロセシングされる。成熟p55タンパク質産物はp17(マトリックス)、p24(カプシド)、p9(ヌクレオカプシド)およびp6である。pol遺伝子は、ウイルスの複製に必要なタンパク質、すなわち、逆転写酵素、プロテアーゼ、インテグラーゼおよびRNアーゼHをコードしている。これらのウイルスタンパク質は、リボソームフレームシフトにより産生される160kDaの前駆体タンパク質であるGag−Pol融合タンパク質として発現される。該ウイルスコード化プロテアーゼはタンパク質分解により該Gag−Pol融合体からPolポリペプチドを切り離し、さらに該Polポリペプチドを成熟タンパク質にまで切断し、該成熟タンパク質はプロテアーゼ(Pro、P10)、逆転写酵素(RT、P50)、インテグラーゼ(IN、p31)およびRNアーゼH(RNアーゼ、p15)活性をもたらす。nef遺伝子は、CD4発現のダウンレギュレーション、T細胞活性化の阻害およびHIV感染性の促進のような幾つかの活性を有することが示されている初期補助(アクセサリー)HIVタンパク質(Nef)をコードしている。env遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードしており、該糖タンパク質は160キロダルトン(kDa)の前駆体(gp160)として翻訳され、ついで細胞プロテアーゼにより切断されて外部120kDaエンベロープ糖タンパク質(gp120)および膜貫通41kDaエンベロープ糖タンパク質(gp41)を与える。Gp120およびgp41は会合したままであり、ウイルス粒子上およびHIV感染細胞表面上に提示される。tat遺伝子は、HIVの複製に必須の転写トランスアクチベーターであるRNA結合タンパク質であるTatタンパク質の長い形態および短い形態をコードしている。rev遺伝子は、RNA結合タンパク質である13kDaのRevタンパク質をコードしている。Revタンパク質は、Rev応答配列(RRE)と称されるウイルスRNAの領域に結合する。Revタンパク質は核から細胞質への未スプライスウイルスRNAの輸送を促進する。Revタンパク質はHIV後期遺伝子発現に要求され、そしてHIVの複製に要求される。
該ウイルス発現タンパク質は、該ウイルスが標的細胞内に侵入し更なる感染性ウイルスの最終的産生のためのウイルスRNAの複製を指令することを可能にする。Gp120は、他の補助受容体(コレセプター)分子に加えて、ヘルパーTリンパ球、マクロファージおよび他の標的細胞の表面上に存在するCD4/ケモカイン受容体に結合する。X4(マクロファージ指向性)ウイルスはCD4/CXCR4複合体に対する指向性を示し、R5(T細胞系指向性)ウイルスはCD4/CCR5受容体複合体と相互作用する。gp120がCD4に結合した後、gp41が、ウイルスの侵入をもたらす融合事象を媒介する。ついで該ウイルスは標的細胞と融合しそれに侵入し、ついでRNA依存性DNAポリメラーゼにより、その一本鎖RNAゲノムから二本鎖DNAへの逆転写が生じる。ついで、プロウイルスとして公知の該ウイルスDNAは細胞核に侵入し、該細胞核内で、該ウイルスDNAは、該核内での新たなウイルスRNAの産生、初期および後期HIVウイルスタンパク質の発現、ならびにそれに続く新たなウイルス粒子の産生および細胞放出を指令する。該一次感染は、該ウイルスの非常に高い産生および組織分布ならびにそれに続くウイルスの定常状態レベル(ただし、これはこの相における連続的なウイルス産生およびターンオーバーによるものである)を与え、最終的には、臨床的エイズ発症を招く更なるウイルス負荷の放出をもたらすことが、宿主内のウイルス負荷の検出能における最近の進歩から示されている。生産的感染細胞は数日間の半減期を有し、一方、慢性または潜伏感染細胞は3週間の半減期を有し、それに続く非生産的感染細胞は、長い半減期(100日以上)を有するが、疾患経過の全体にわたり認められる日々のウイルス負荷に有意には寄与しない。
免疫防御に決定的に重要なCD4ヘルパーTリンパ球の破壊が、HIV感染の特徴である進行性免疫機能不全の主要原因である。CD4 T細胞の喪失は、ほとんどの侵入体と戦う身体能力を著しく損なうが、それはウイルス、真菌、寄生生物および或る細菌(マイコバクテリアを含む)に対する防御に対して特に深刻な影響を及ぼす。
HIV感染個体に対する有効な治療法が利用可能となっており、HIV感染個体の治療に役立っている。HIV複製のインヒビターとして作用する抗ウイルス剤(抗レトロウイルス療法(「ART」)を含むがこれに限定されるものではない)はエイズおよび類似疾患の治療において大きな成功を収めていることが示されており、抗ウイルス薬での有効な治療は、ウイルス負荷レベルを8週間以内に90%以上減少させ、6ヶ月以内に最終的に検出不可能なレベルにまでウイルス負荷を連続的に減少させると報告されている。現在のところ、逆転写酵素インヒビター(例えば、アジドチミジン(AZT)およびエファビレンツ)、プロテアーゼインヒビター(例えば、インジナビルおよびネルフィナビル)およびインテグラーゼインヒビターを含む(これらに限定されるものではない)幾つかのクラスの抗ウイルス化合物が存在する。
残念ながら、これらの薬物は世界の多くの地域における該疾患に対して有意な効果をもたらさないであろう。さらに、これらの治療選択が可能な個体においては、低レベルのウイルスを維持し最終的にはウイルスのリバウンドを防ぐためには、治療は長期間の抗レトロウイルス療法を要するであろう。この理由により、最近では、感染個体に免疫原を投与することにより、抗レトロウイルス療法を受けたHIV感染者の免疫応答を促進することに精力が注がれている。示されている刊行物においては、免疫原としてHIV抗原が使用され、DNAの投与、全不活化(gp120欠失)HIV−1ワクチンの投与またはポックスウイルスベクター(例えば、ALVAC、NYVAC)による投与によりそれが運搬されている。例えば、HoffおよびMcNamara,1999 The Lancet 353:1723−1724、ならびに以下の特許公開:WO 98/08539、WO 01/08702、WO 01/54701およびWO 02/095005を参照されたい。
出願人が知る限りにおいては、抑制されたウイルス血症を示すHIV既感染者が、HIV抗原をコードする外因性核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスで免疫化されたということはない。本明細書に開示するとおり、この方法は、非常に幅広い性質のウイルス特異的CD8+およびCD4+ T細胞応答の両方を非常に高レベルで誘導しうる。結果的に生じる治療用免疫応答は、低力価のウイルスを有効に維持する能力を有し、したがって、抗ウイルス療法に対する個体の依存性を軽減すると予想される。強力なHIV特異的細胞性免疫応答を感染個体において回復させるのを補助しうる、HIV感染個体において有用なワクチン法を見出すことが、エイズとの闘いにおいて非常に重要であろう。
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)に感染した個体において治療用免疫応答を惹起するための改良された方法を提供する。該方法は、少なくとも1つのHIV抗原をコードする外因性核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスを投与することにより、ウイルス血症の能動的(active)抑制(能動免疫応答または抗ウイルス剤での治療によるもの)を示す感染個体を免疫化することを含む。このような免疫化は、非常に幅広い性質のウイルス特異的CD8+およびCD4+ T細胞応答における顕著な増強を誘導する。結果的に生じる治療用免疫応答は、ウイルスの低力価を有効に維持する能力を有し、したがって、抗ウイルス療法に対する個体の依存性を軽減すると予想される。
細胞傷害性Tリンパ球(「CTL」)は免疫系の細胞性応答の必須部分を構成する。CTL免疫応答を惹起するためには、抗原が細胞内で合成されるか細胞内に導入され、ついでプロテアソーム複合体により小さなペプチドにプロセシングされ、主要組織適合性複合体(MHC)クラスIタンパク質との最終的な会合のために小胞体/ゴルジ複合体分泌経路内に輸送されなければならない。CD8+ Tリンパ球は、T細胞受容体(TCR)およびCD8細胞表面タンパク質を介して、クラスI MHCと会合した抗原を認識する。活性化エフェクターまたは記憶細胞へのナイーブCD8+ T細胞の活性化は、一般には、前記のとおりの抗原のTCR関与および共刺激タンパク質の関与の両方を要する。CTL応答の最適な誘導は、通常、TCRおよびCD4の関与を介してMHCクラスII分子と会合した抗原を認識するCD4+ Tリンパ球からのサイトカインの形態での「援助」を要する。HIVに感染した個体が、ワクチン投与の前またはそれと同時に、該治療個体自身の能動免疫応答または抗ウイルス療法に対する好ましい応答により有効に阻止されたウイルス複製を示している場合、本発明は、該個体においてCD8+およびCD4+応答の両方を誘導する能力を有する。
したがって、本発明は、HIVウイルスコピー数の減少を示している個体に、HIV抗原をコードする外因性核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスを投与することを含んでなる、HIVに感染した個体においてHIVに対する細胞性免疫応答を惹起するための方法に関する。過去の或る時点と比較してウイルス負荷(viral load)が減少している状態(促進されてそうなったのかどうかには無関係である)は、一般に、本明細書中では「抑制(されている)」または「阻止(されている)」と称される。好ましい実施形態においては、ウイルス負荷は減少しており、10,000ウイルスコピーまたはそれ未満、より好ましくは約5,000コピーまたはそれ未満の規模である。好ましくは、該個体は血漿1ml当たり少なくとも300細胞のCD4+数、より好ましくは、血漿1ml当たり400細胞を超えるCD4+数、最も好ましくは、血漿1ml当たり500細胞を超えるCD4+数を有する。また、該個体は未だエイズに進行していないことが好ましい。免疫化の時点でのウイルス数の減少の原因は重要ではない。該減少は、例えば、該ウイルスの存在に対して免疫系が応答する先天的能力、ウイルス負荷を抑制状態に維持するよう個体を補助する前もって行う免疫化、または抗ウイルス剤での治療によりもたらされうる。抗ウイルス剤は、ウイルス負荷の減少をもたらしうる任意の化合物または療法から選ばれうる。抗ウイルス剤は、好ましくは、プロテアーゼインヒビター、逆転写酵素インヒビターおよびインテグラーゼインヒビターよりなる化合物のクラスから選ばれる。好ましくは、個体に投与する抗ウイルス剤は、高活性抗レトロウイルス療法(「HAART」)(この用語は、一般には、3種以上の抗ウイルス薬のカクテルを意味するものとして当技術分野で用いられ、ウイルスプロテアーゼインヒビターと逆転写酵素インヒビターとの組合せを包含する)において使用するもののような有効な抗ウイルス療法剤の何らかの組合せである。
本発明の方法において有用な組換え複製欠損型アデノウイルスは、少なくとも1つのHIV抗原をコードする外因性核酸を含む。該HIV抗原は、個体において免疫応答を惹起しうる任意の抗原であることが可能であり、最も好ましくは、HIV gag、pol、env、nef、rev、tat、vpu、vprおよびvifよりなる群から選ばれるHIV抗原またはそれらの任意の抗原性/免疫原性部分に由来する。本発明は更に、HIV抗原を発現する組換えアデノウイルスの単一および複数の投与を含み、したがって、それと共に、本発明の方法において使用する種々の初回−追加抗原刺激法を含む。そのような場合においては、個体に、まず、HIV抗原をコードする核酸を含むウイルス(またはポリヌクレオチド)ビヒクルの初回量を投与し、ある期間の後、HIV抗原をコードする核酸を含むウイルス(またはポリヌクレオチド)ビヒクルの追加量を投与し、ここで、初回投与または追加投与のいずれかはアデノウイルスビヒクルを使用する。好ましくは、最初に投与したビヒクルに対する宿主免疫を回避するために、初回投与のウイルスビヒクルおよび追加投与のウイルスビヒクルは互いに異なる。互いのウイルスビヒクルの選択は、本明細書に開示する方法の成功のために重要ではない。該抗原を運搬し該抗原の十分な発現を達成して細胞性免疫応答を惹起しうる任意のウイルスビヒクルが、アデノウイルスによる初回または追加投与に十分なはずである。互いに異なるビヒクルは、異なるアデノウイルス血清型から選ばれうる。あるいは、アデノウイルス投与の後または前に、異なる起源のウイルスビヒクル、例えばポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを投与することが可能である。本発明のもう1つの実施形態は、アデノウイルス投与の前または後に、HIV抗原をコードする核酸のポリヌクレオチド投与を行う初回−追加法を用いる。本発明の更にもう1つの実施形態は、アデノウイルス投与の前または後に、タンパク質/組換えタンパク質投与の形態のHIV抗原の運搬を行う初回−追加法を用いる。
(発明の詳細な説明)
抑制されたウイルス血症を有することにより特徴づけられるHIV感染個体において治療用免疫応答を惹起するための新規方法を記載する。該方法は、少なくとも1つのHIV抗原をコードする外因性核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスを感染個体に投与することを含み、該個体は、該投与の前またはそれと同時に、HIVウイルスコピー数の減少を示している。免疫化の時点でのウイルスコピー数(すなわち、ウイルス負荷)の減少の具体的な原因は重要ではない。該減少は、例えば、該ウイルスの存在に対して免疫系が応答する先天的能力、ウイルス負荷を抑制状態に維持するよう個体を補助する前もって行う免疫化、抗ウイルス剤での治療、または恐らくは不明なままでさえありうる任意の他の原因によりもたらされうる。重要なのは、治療されたSIV感染マカクにおけるウイルス特異的細胞傷害性CD8+およびヘルパーCD4+ T細胞応答の顕著な増強により示されるとおり、このような(すなわち、この感染段階におけるアデノウイルスビヒクルでの)治療個体の免疫化が該個体においてウイルス特異的細胞性免疫応答を有効に惹起することが判明したという知見である。結果的に生じる治療用免疫応答は、ウイルスの低力価を有効に維持する能力を有し、したがって、抗ウイルス療法に対する個体の依存性を軽減すると予想される。
抑制されたウイルス血症を有することにより特徴づけられるHIV感染個体において治療用免疫応答を惹起するための新規方法を記載する。該方法は、少なくとも1つのHIV抗原をコードする外因性核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスを感染個体に投与することを含み、該個体は、該投与の前またはそれと同時に、HIVウイルスコピー数の減少を示している。免疫化の時点でのウイルスコピー数(すなわち、ウイルス負荷)の減少の具体的な原因は重要ではない。該減少は、例えば、該ウイルスの存在に対して免疫系が応答する先天的能力、ウイルス負荷を抑制状態に維持するよう個体を補助する前もって行う免疫化、抗ウイルス剤での治療、または恐らくは不明なままでさえありうる任意の他の原因によりもたらされうる。重要なのは、治療されたSIV感染マカクにおけるウイルス特異的細胞傷害性CD8+およびヘルパーCD4+ T細胞応答の顕著な増強により示されるとおり、このような(すなわち、この感染段階におけるアデノウイルスビヒクルでの)治療個体の免疫化が該個体においてウイルス特異的細胞性免疫応答を有効に惹起することが判明したという知見である。結果的に生じる治療用免疫応答は、ウイルスの低力価を有効に維持する能力を有し、したがって、抗ウイルス療法に対する個体の依存性を軽減すると予想される。
感染個体の治療において使用する具体的な抗ウイルス剤は本方法の有用性とは無関係である。抗ウイルス剤は、例えば、抗体、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドまたは小さな分子に基づく/由来するものでありうる。個体内のウイルス複製/ウイルス負荷を有効に軽減する任意の抗ウイルス剤が、本明細書に開示する方法による免疫化のための十分な準備を個体にもたらすはずである。抗ウイルス剤はウイルスの機能/生活環を妨げ、該ウイルスの適切な生活環に必須のタンパク質/機能を標的化し、その作用はインビボまたはインビトロアッセイにより容易に測定されうる。特定のウイルスタンパク質を標的化する幾つかの代表的な抗ウイルス剤としては、プロテアーゼインヒビター、逆転写酵素インヒビター(ヌクレオシド類似体、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターおよびヌクレオチド類似体)およびインテグラーゼインヒビターが挙げられる。プロテアーゼインヒビターには、例えばインジナビル/CRIXIVAN(登録商標)、リトナビル/NORVIR(登録商標)、サキナビル/FORTOVASE(登録商標)、ネルフィナビル/VIRACEPT(登録商標)、アンプレナビル/AGENERASE(登録商標)、ロピナビルおよびリトナビル/KALETRA(登録商標)が含まれる。逆転写酵素インヒビターには、例えば、(1)ヌクレオシド類似体、例えばジドブジン/RETROVIR(登録商標)(AZT)、ジダノシン/VIDEX(登録商標)(ddI)、ザルシタビン/HIVID(登録商標)(ddC)、スタブジン/ZERIT(登録商標)(d4T)、ラミブジン/EPIVIR(登録商標)(3TC)、アバカビル/ZIAGEN(登録商標)(ABC)、(2)非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えばネビラピン/VIRAMUNE(登録商標)(NVP)、デラビルジン/RESCRIPTOR(登録商標)(DLV)、エファビレンツ/SUSTIVA(登録商標)(EFV)、および(3)ヌクレオチド類似体、例えばテノフォビルDF/VIREAD(登録商標)(TDF)が含まれる。インテグラーゼインヒビターには、例えば、2003年3月20日付け公開の米国特許出願公開番号US2003/0055071および国際出願WO 03/035077に開示されている分子が含まれる。示されているとおり、該抗ウイルス剤は該ウイルス/ウイルスタンパク質の機能、例えば、それぞれトランス活性化応答領域(「TAR」)またはrev応答要素(「RRE」)との調節タンパク質tatまたはrevの相互作用をも標的化しうる。
本発明は、抗ウイルス剤の組合せで治療された個体の免疫化をも含む。例えば、抗ウイルス剤は、以下の表に示すものを含む(それらに限定されるものではない)、HIV感染またはエイズの治療に有用なHIV/エイズ抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗感染剤またはワクチンの有効量と組合せて投与することが可能である。
本明細書に開示する方法において免疫化の前にウイルス負荷を減少させるために使用しうる抗ウイルス剤の組合せの範囲は前記表に限定されるものではなく、原理上は、HIV感染またはエイズの治療に有用な任意の医薬組成物との任意の組合せを含むと理解されるであろう。抗ウイルス剤および他の物質は、HIV/エイズの治療のための治療剤として使用される場合には、典型的には、Physicians’Desk Reference,54th edition,Medical Economics Company,2000に記載されている投与量を含む、当技術分野において報告されているそれらの通常の投与量範囲および投与計画で使用される。
ウイルスの生活環の抗ウイルス的阻害およびそれに伴うウイルス負荷に対する影響は、とりわけ、治療の前、途中および/または後に個体内に存在するウイルスコピーの数を分析することにより測定することが可能である。この測定結果は、任意の特定の抗ウイルス治療計画の成功/失敗に関する指標として使用することが可能であり、個体の臨床的進行の診断またはリスクを予想するための基礎となる。特定の個体は或る抗ウイルス剤に対する耐性を示すことがあり、したがって、任意の特定の抗ウイルス治療計画の成功の度合を監視することが重要である。ウイルス負荷は患者の細胞、血漿または組織内のウイルス/ウイルス感染細胞の量の尺度である。疾患の進行に関連した絶対的な数は存在しないが、血漿内のウイルスの或るレベルは個体の感染状態を示すものとして分類されている。血漿HIV RNAレベルの減少は生存の延長および疾患への進行の可能性の減少に関連づけられている。したがって、ウイルスのレベルが高くなればなるほど、発症が速くなるようである。血漿1ml当たりに約100,000コピー以上のHIV RNAが存在する場合には非常に高レベルのウイルスが存在すると言われており、血漿1ml当たりに約30,000〜50,000コピーのHIV RNAが存在する場合には高レベルのウイルスが存在すると言われており、血漿1ml当たりに約5,000〜10,000コピーのHIV RNAが存在する場合には低レベルのウイルスが存在すると言われている(Carpenterら,1996 JAMA 276:147−154)。患者の血液細胞、組織、血清または血漿に対して行うアッセイにより直接的または間接的にウイルス負荷を測定するためには幾つかの手段が利用可能である。例えば、“Report of the NIH to Define Principles of Therapy of HIV Infection”,Morbidity & Mortality Weekly Reports,47(No.RR−5)の1998年4月24日号(1998年6月17日改訂);Voldberding & Jacobson,1992 AIDS Clinical Review(Marcel Dekker,Inc.,N.Y.)を参照されたい。ウイルスRNAまたはDNAを測定するために利用可能な技術には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない:ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)増幅技術(例えば、WO 94/20640;AMPLICOR(登録商標);Sambrookら,1989 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d Edition(Cold Spring Harbor press,Cold Spring Harbor,N.Y.);Ausubelら,1994 Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates and John Wiley & Sons,New York,N.Y.)およびPCR Protocols,1991(Cold Spring Harbor,N.Y.));分岐DNA(「bDNA」)試験(例えば、WO 92/02526;米国特許第5,451,503号;米国特許第4,775,619号;QUANTIPLEX(登録商標);VERSANT(登録商標));標準的なハイブリダイゼーション(ハイブリダイゼーションにおけるプローブの使用を含む;例えば、EP 617,132を参照されたい);および抗体検出方法。ウイルス負荷は、抗ウイルス剤での治療の前に測定すべきである。抗ウイルス薬での有効な治療は、ウイルス負荷を8週間以内に90%以上減少させ、その後、6ヶ月以内に検出不可能なレベルにまでウイルス負荷を減少させ続けると報告されている。好ましくは、本発明の方法におけるワクチン接種の前に投与する抗ウイルス剤はウイルス負荷の減少をもたらし、ウイルス負荷をウイルスの定常状態レベルの1/3以下に、より好ましくは、「検出不可能」なレベル(これは、その時点で利用可能な技術および用いる具体的な技術により定義される用語である)にまで減少させる。
出願人は、抑制されたウイルス血症の存在/非存在と、HIV抗原をコードする核酸の運搬において組換え複製欠損型アデノウイルスを使用する免疫化プロトコールの利益との間の相関性を同定した。したがって、本発明は、ウイルス負荷が抑制されている(すなわち、ウイルス負荷レベルが、過去の或る時点において存在したものから減少している)HIV感染個体の免疫化に基づくものである。したがって、本発明の1つの実施形態は、ウイルス血症の抑制の後またはそれと同時に行うHIV感染個体の治療用免疫化を含む。ウイルス血症の抑制は、素質的(免疫化)/先天的免疫応答、抗ウイルス剤での治療などから生じる、ウイルス負荷の減少と定義される。アデノウイルスは、感染した免疫化対象においてウイルス特異的細胞性免疫応答を引き起こしうることが確認されている。
アデノウイルスは、いくつかの鳥類および哺乳類宿主において同定されている非外包性正二十面体ウイルスである(Horneら,1959 J.Mol.Biol.1:84−86;Horwitz,1990 In Virology,B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編,pps.1679−1721)。最初のヒトアデノウイルス(Ad)は40年以上前に分離された。それ以来、種々の哺乳類種に感染する100を超える異なるアデノウイルス血清型が分離されており、それらのうちの51個はヒト由来である(Straus,1984,In The Adenoviruses,H.Ginsberg編,pps.451−498,New York:Plenus Press;Hierholzerら,1988 J.Infect.Dis.158:804−813;SchnurおよびDondero,1993,Intervirology;36:79−83;Jongら,l999 J Clin Microbiol.,37:3940−5)。ラットおよびアカゲザル赤血球の赤血球凝集特性、DNA相同性、制限酵素切断パターン、G+C含量比および腫瘍原性を含む多数の生化学的、化学的、免疫学的および構造的基準に基づき、ヒト血清型は6つの亜属(A〜F)に分類されている(Straus,前掲;Horwitz,前掲)。
アデノウイルスゲノムは非常に詳細に特徴づけられている。それは約36,000塩基対の直鎖状二本鎖DNA分子よりなり、いくつかの異なる血清型が存在するにもかかわらず、同様に位置した特異的機能を有するアデノウイルスゲノムの全体的な体制においては或る程度の全般的保存性が認められる。
アデノウイルスは外因性遺伝子の運搬のための非常に魅力的な標的である。アデノウイルスの生物学は非常に詳細に理解されている。アデノウイルスが免疫適格性個体における重篤なヒト病理に関連していることは見出されていない。該ウイルスはそのDNAを宿主細胞内に非常に効率的に導入し、多種多様な細胞に感染しうる。さらに、該ウイルスは、高いウイルス力価で大量に生産されうる。また、該ウイルスはウイルスゲノムの必須初期領域1(E1)の欠失/修飾により複製欠損型にされることが可能であり、該ウイルスは、E1活性を欠いた(または実質的に欠いた)もの、したがって、意図される宿主/ワクチン被接種体における複製能を喪失したものとなりうる。例えば、Brodyら,1994 Ann N Y Acad Sci.,716:90−101を参照されたい。E1以外のアデノウイルス遺伝子(例えば、E3、E2および/またはE4)の欠失により、より大きな外因性遺伝子収容能を有するアデノウイルスベクターが得られており、該アデノウイルスベクターは有効な遺伝子運搬ビヒクルでもあることが判明した。したがって、そのようなベクターは、本発明の方法における使用に適している。前記理由の多くにより、アデノウイルスベクターはワクチン用および遺伝子治療用の遺伝子導入ベクターとして広範に使用されている。
現在のところ、C亜群からの2つの良く特徴づけられたアデノウイルス血清型であるAd5およびAd2が、最も広く使用されている遺伝子運搬用ベクターである。アデノウイルス血清型5は、外因性遺伝物質の発現を達成するための非常に有効なアデノウイルスビヒクルであることが判明している。野生型アデノウイルス血清型5配列は公知であり、当技術分野において記載されている。参照により本明細書に組み入れるChroboczekら,1992 J.Virology 186:280を参照されたい。したがって、本発明の特定の実施形態は、初回投与または追加投与において野生型アデノウイルス血清型5配列に基づくアデノウイルスビヒクルを使用する免疫化方法であり、そのウイルスはAmerican Type Culture Collection(「ATCC」)にATCC寄託番号VR−5として寄託されている。もう1つの実施形態は、使用するアデノウイルスベクター(Ad5、Ad6またはその他)がWO 02/22080(これを参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている、本発明の免疫化方法である。該ベクターは、E1において少なくとも部分的に欠失しており、いくつかのアデノウイルスパッケージング反復を含む(すなわち、E1欠失は、野生型Ad5配列に対応する塩基対約450−458までには開始しない)。これらの特性はウイルスの増殖特徴/特性を著しく促進することが判明している。
本発明は、アデノウイルス血清型2、5または6(ATCC寄託番号VR−6;例えば、2003年4月17日付け公開のWO 03/31588を参照されたい)を使用して有効に行うことが可能であるが、本発明においては、単一投与法または別のウイルスビヒクルまたはポリヌクレオチド/タンパク質投与との組合せ投与における本明細書に開示されている方法において、別の異なるヒトおよび非ヒトアデノウイルスを使用することが可能であると予想される。当業者は、別の異なるアデノウイルス血清型(例えば、前記の亜属A〜Fにおいて見出される種々の血清型;例えば、Ad7、Ad35(例えば、EP1054064を参照されたい)、Ad24、Ad34などを包含するがこれらに限定されるものではない)および非ヒト血清型(霊長類アデノウイルス(例えば、Fitzgeraldら,2003 J.Immunol.170(3):1416−1422;Xiangら,2002 J.Virol.76(6):2667−2675を参照されたい)を包含するがこれらに限定されるものではない)を容易に同定し、本明細書に開示されている方法にそれを組み入れることが可能である。代替的Ad血清型は、一般集団においてそれよりも優勢なアデノウイルス血清型に対する中和抗体から逃れる能力を有するため、そのような代替的Ad血清型が望ましい。また、血清型が異なれば、それが有する指向性も異なり、したがって、代替的血清型がワクチンまたは遺伝子治療に用いられた場合には、より優れた免疫応答が惹起されうる。
本発明の方法における使用に適したアデノウイルスベクターは、Hittら,1997“Human Adenovirus Vectors for Gene Transfer into Mammalian Cells”Advances in Pharmacology 40:137−206(これを参照により本明細書に組み入れることとする)に概説されているような公知技術を用いて構築することが可能である。関心のある特定のアデノウイルスに相同な配列を含む、関心のある異種核酸を含有するプラスミドまたはシャトルベクターを作製することが多い。ついで、相同組換えが生じて該ウイルス核酸内への該異種核酸の取り込みが生じる宿主細胞内に、シャトルベクターおよびウイルスDNAまたは第2プラスミド(クローン化ウイルスDNAを含有するもの)をコトランスフェクトする。好ましいシャトルベクターおよびクローン化ウイルスゲノムはアデノウイルス部分およびプラスミド部分を含有する。複製欠損型ベクターの構築において使用するシャトルベクターでは、アデノウイルス部分は、典型的には、非機能的な又は欠失したE1およびE3領域、ならびに簡便な制限部位に隣接した遺伝子発現カセットを含有する。シャトルベクターのプラスミド部分は、典型的には、原核生物プロモーターの転写制御下で抗生物質耐性マーカーを含有する。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子および他の薬学的に許容される耐性マーカーを使用することが可能である。原核生物における発酵による該核酸の高レベルの産生を補助するためには、シャトルベクターが原核生物複製起点を含有し高コピー数であるのが好都合である。多数の商業的に入手可能な原核生物クローニングベクターがこれらの利点をもたらす。非必須DNA配列は、好ましくは除去される。また、該ベクターは真核細胞内で複製不能であることが好ましい。これは、核酸ワクチン配列が被投与者のゲノム内に組込まれるリスクを最小にする。該核酸の発現を特定の組織型に限定するのが望ましい場合には、組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを使用することが可能である。シャトルベクターおよび野生型アデノウイルスウイルスDNA(Adバックボーンベクター)の相同組換えはアデノウイルスプレプラスミドの生成を引き起こす。線状化後、該プレプラスミドはPER.C6(登録商標)細胞または代替的E1相補性細胞系において複製されうる。ついで、ウイルスの複製が完了したら、感染細胞および培地を回収することが可能である。ついで、回収した物質を精製し、製剤化し、宿主への投与まで保存することが可能である。
組換えアデノウイルスの増殖およびレスキューのために使用するE1相補性細胞系は、ウイルスが複製するのに必須の要素(該要素が該細胞の遺伝物質内にコードされているかトランスで提供されるかには無関係である)を提供すべきである。さらに、E1相補性細胞系およびベクターは、複製可能ウイルス(または複製可能アデノウイルス(「RCA」))を潜在的に与えうる、該ベクターのDNAと該細胞系のDNAとの間の相同組換えを可能にしうる重複要素を含有しないことが好ましい。典型的には、E1相補性細胞は、網膜または腎臓に由来するヒト細胞であるが、適当なE1または任意の他の重要な欠失領域を発現しうる任意の細胞系を使用して、本発明の方法での使用に適したアデノウイルスを作製することが可能である。羊膜細胞のような胚性細胞はE1相補性細胞系の作製に特に適していることが示されている。いくつかの細胞系が利用可能であり、それらには、公知細胞系PER.C6(登録商標)(ECACC寄託番号96022940)、911、293およびE1 A549が含まれるが、これらに限定されるものではない。PER.C6(登録商標)細胞系はWO 97/00326(1997年1月3日付け公開)および発行された米国特許第6,033,908号(それらを共に参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている。PER.C6(登録商標)は、相同組換えによる複製可能アデノウイルスの生成を妨げるように設計された、複製欠損型(FG)アデノウイルスの産生を相補するE1遺伝子セグメントが導入された初代ヒト網膜芽細胞系である。293細胞は、参照により本明細書に組み入れるGrahamら,1977 J.Gen.Virol 36:59−72に記載されている。非C群アデノウイルスベクターの増殖およびレスキューのためには、増殖させるウイルスにおいて欠失しているE1領域に相補的なE1領域を発現する細胞系を使用することが可能である。あるいは、同じ血清型に由来するE1およびE4の領域を発現する細胞系を使用することが可能である。例えば、米国特許第6,270,996号を参照されたい。もう1つの別法は、利用可能なE1発現細胞系(例えば、PER.C6(登録商標)、A549または293)内で非C群アデノウイルスを増殖させることであろう。この後者の方法は、決定的に重要なE4領域を、増殖させるアデノウイルス内に導入することを含む。決定的に重要なE4領域は、相補性細胞系のE1遺伝子産物(特にE1B 55K領域)のものと同じ又は非常に類似した血清型のウイルスに固有のものであり、少なくとも、E4 Orf6をコードする核酸を含む。当業者は、本発明の方法での使用に適した組換え複製欠損型アデノウイルスの製造に適した多数の他の方法を容易に理解し実施することが可能である。
本発明での使用に適した組換えアデノウイルスは、HIV抗原またはその免疫学的に関連した修飾体をコードする外因性核酸を含む。関心のあるHIV抗原には、HIVの主要構造タンパク質、例えばGag、PolおよびEnv(gp160、gp120およびgp41を包含する)、調節タンパク質(例えば、TatおよびRev)および補助タンパク質(例えば、Vpu、Vpr、VifおよびNef)、それらの免疫学的に関連した修飾体/誘導体およびそれらの免疫原性部分が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明は、HIV抗原をコードする核酸の種々のコドン最適化形態、例えば、コドン最適化HIV gag(コドン最適化完全長(「FL」)GagおよびtPA−Gag融合タンパク質のp55形態を包含するがこれらに限定されるものではない)、HIV pol、HIV nef、HIV env、HIV tat、HIV revおよび免疫学的に関連のある選択された修飾体をも含む。特定の実施形態において、参照により本明細書に組み入れるWO 02/22080に開示されているgag、polおよびnef抗原を含む組換え複製欠損型アデノウイルスを使用する。コドン最適化HIV−1 gag遺伝子はWO 02/22080に開示されている。コドン最適化HIV−1 env遺伝子はPCT国際出願WO 97/31115およびWO 97/48370に開示されている。コドン最適化HIV−1 pol遺伝子は、2000年12月21日付け出願の米国特許出願第09/745,221号およびWO 01/45748に開示されている。コドン最適化HIV−1 nef遺伝子は、2000年12月15日付け出願の米国特許出願第09/738,782号およびWO 01/43693に開示されている。特定のHIV抗原またはその免疫学的に関連した部分もしくは修飾体/誘導体をコードする前記のものを含む(それらに限定されるものではない)適当なヌクレオチド配列を選択することは当業者の認識範囲内に十分に含まれる。本明細書においては、「免疫学的に関連」または「抗原性」は、(1)ウイルス抗原に関しては、該タンパク質が、投与されると、該ウイルスの増殖および/または広がりを遅延させるのに及び/又は個体内に存在するウイルス負荷を減少させるのに十分な個体内における測定可能な免疫応答を惹起しうること、または(2)ヌクレオチド配列に関しては、該配列が、前記の能力を有するタンパク質をコードしうることを意味する。
該組換え複製欠損型アデノウイルスにより運搬される関心のある単一のタンパク質または抗原に加えて、2以上のタンパク質または抗原を別々のビヒクルまたは同一のビヒクルにより運搬することが可能である。複数の遺伝子/機能的等価体を適当なシャトルプラスミド内に連結して、複数のオープンリーディングフレームを含む前アデノウイルスプラスミドを作製することが可能である。複数の遺伝子/機能的等価体に関するオープンリーディングフレームは、異なるプロモーターおよび転写終結配列に、機能しうる形で連結されうる。他の実施形態においては、該オープンリーディングフレームは、単一プロモーターに、機能しうる形で連結されることが可能であり、該オープンリーーディングフレームは、内部リボソーム進入シグナル(IRES;WO 95/24485に開示されている)、または複数のオープンリーディングフレームの転写を単一プロモーターから外す(run off)ことを可能にする適当な代替物に、機能しうる形で連結されうる。ある実施形態においては、該オープンリーディングフレームは、段階的(stepwise)PCR、または2つのオープンリーディングフレームを互いに融合させるための適当な代替法により、互いに融合されうる。本発明での使用に適したgag−pol融合構築物の一例および種々の他の組合せ形式投与計画が、参照により本明細書に組み入れるWO 02/22080に開示されている。当技術分野で認識されている幾つかのHIV抗原の多様な組合せから構築された融合構築物(gag−pol−nef融合体を包含するがこれに限定されるものではない)に到達しそれを有効に使用することは当業者の認識範囲内に十分に含まれる。本発明において有用なすべての構築物においては、ウイルスビヒクルの有効なパッケージング限界に、適切な配慮をしなければならない。例えば、アデノウイルス5型は野生型Ad5配列の約105%のクローニング容量上限を示すことが判明している。
外因性核酸は、HIV−1およびHIV−2、株A、B、C、D、E、F、G、H、I、O、IIIB、LAV、SF2、CM235およびUS4を含む(これらに限定されるものではない)いずれかのHIV株に由来しうる。例えば、参照により本明細書に組み入れるMyersら編,“Human Retroviruses and AIDS:1995(Los Alamos National Laboratory,Los Alamos NM 87545)を参照されたい。本明細書に開示する方法での使用に適したもう1つのHIV株はHIV−1株CAM−1である(参照により本明細書に組み入れるMyersら編,“Human Retroviruses and AIDS:1995,IIA3−IIA19)。この遺伝子はクレードB(北米/欧州)配列のコンセンサスアミノ酸配列に酷似している。HIV遺伝子配列は種々のクレードのHIV−1に基づくことが可能であり、その具体例としては、クレードBおよびCが挙げられる。多数のHIV株の遺伝子の配列がGenBankから公に入手可能であり、HIVの初代野外分離体は、これらの株を入手可能にするようQuality Biological(Gaithersburg,MD)と契約しているNational Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID)から入手可能である。また、株は、World Health Organization(WHO),Geneva Switzerlandからも入手可能である。
外因性核酸はDNAおよび/またはRNAであることが可能であり、二本鎖または一本鎖でありうる。該核酸は、E1平行(5’から3’へ転写される)または逆平行(ベクターバックボーンに対して3’から5’方向へ転写される)配向で挿入されうる。該核酸は、所望の宿主(例えば、哺乳類宿主)内での発現のためにコドンが最適化されうる。該異種核酸は発現カセットの形態でありうる。遺伝子発現カセットは、典型的には、(a)関心のあるタンパク質または抗原をコードする核酸、(b)該タンパク質をコードする核酸に機能しうる形で連結された異種プロモーター、および(c)転写終結シグナルを含有する。特定の実施形態においては、該異種プロモーターは真核生物RNAポリメラーゼにより認識される。本発明での使用に適したプロモーターの一例は、最初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである(Chapmanら,1991 Nucl.Acids Res.19:3979−3986)。本発明で使用されうるプロモーターの更なる例としては、強力免疫グロブリンプロモーター、EF1αプロモーター、マウスCMVプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、SV40初期/後期プロモーターおよびβアクチンプロモーターが挙げられるが、意図される宿主内で発現を引き起こしうる任意のプロモーターが本発明の方法において使用されうると当業者に認識されうる。該プロモーターは、Tetオペレーター配列のような調節可能配列を含みうる。転写および発現の調節の可能性をもたらすこれらのような配列は、遺伝子転写の抑制が望まれる場合に有用である。アデノウイルス遺伝子発現カセットは転写終結配列を含むことが可能であり、その具体例としては、ウシ成長ホルモン終結/ポリアデニル化シグナル(bGHpA)または以下のとおりに定められる50ヌクレオチド長の短い合成ポリAシグナル(SPA)が挙げられる。
リーダーまたはシグナルペプチドをトランスジーン内に組込むことも可能である。特定の実施形態においては、リーダーは組織特異的プラスミノーゲンアクチベータータンパク質tPAに由来する。
該組換えアデノウイルスは、単独で又は初回/追加抗原刺激投与法の一部として投与することが可能である。この場合、個体に、まず、HIV抗原をコードする核酸を含むウイルス(またはポリヌクレオチド)ビヒクルの初回量を投与し、ある期間の後、HIV抗原をコードする核酸を含むウイルス(またはポリヌクレオチド)ビヒクルの追加量を投与し、ここで、初回投与または追加投与のいずれかはアデノウイルスビヒクルを使用する。初回量は免疫応答を有効に初回刺激して、後で循環免疫系において抗原が同一のものと確認されると該免疫応答は宿主内の該抗原を即座に認識しそれに応答しうる。好ましくは、最初に投与したビヒクルに対する宿主免疫を回避するために、初回投与のウイルスビヒクルおよび追加投与のウイルスビヒクルは互いに異なる。互いのウイルスビヒクルの選択は、本明細書に開示する方法の成功のために重要ではない。該抗原を運搬し該抗原の十分な発現を達成して細胞性免疫応答を惹起しうる任意のビヒクルが、アデノウイルスによる初回または追加投与に十分なはずである。混合様式の初回および追加接種法は、既存の抗ベクター免疫が存在する場合には特に、増強された免疫応答をもたらすであろう。初回−追加投与は、典型的には、(ウイルスベクター、プラスミド、タンパク質などにより)少なくとも1回、対象を初回抗原刺激し、所定の長さの時間を経過させ、ついで(ウイルスベクター、プラスミド、タンパク質などにより)追加抗原刺激することを含む。通常、複数の初回抗原刺激、典型的には1〜4回の初回抗原刺激を行うが、より多数の初回抗原刺激を行うことが可能である。初回抗原刺激と追加抗原刺激との間の時間の長さは、典型的には約4ヶ月〜1年と様々となりうるが、当業者に認識されるとおり他の時間枠を用いることも可能である。また、追従(follow−up)または追加投与を、選択された時間間隔で反復することも可能である。
初回−追加法は、異なるアデノウイルス血清型、異なる起源のウイルス、ウイルスベクター/タンパク質の組合せ、ならびにウイルスおよびポリヌクレオチド投与の組合せを用いることが可能である。そのようなプロトコールの一例として、第1血清型の組換えアデノウイルスベクターを含む初回量を投与し、ついで、第2の異なる血清型の組換えアデノウイルスベクターを含む追加量を投与することが挙げられるであろう。そのような実施形態の一例は、血清型5の組換えアデノウイルスベクターを含む初回量を投与し、ついで、血清型6の組換えアデノウイルスベクターを含む追加量を投与することを含むであろう(参照により本明細書に組み入れる2003年3月12日付け出願の国際出願番号PCT/US03/07727)。もう1つの実施形態は、初回投与および追加投与において、多様な起源の、異なるウイルスビヒクルの使用を含むであろう。ただし、初回投与および/または追加投与の少なくともいずれかはアデノウイルスビヒクルを使用する。異なるウイルスビヒクルの具体例には、アデノ随伴ウイルス(「AAV」;例えば、Samulskiら,1987 J.Virol.61:3096−3101;Samulskiら,1989 J.Virol.63:3822−3828を参照されたい)、レトロウイルス(例えば、Miller,1990 Human Gene Ther.1:5−14;Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biologyを参照されたい)、ポックスウイルス(限定的なものではないが複製欠損型NYVAC、ALVAC、TROVACおよびMVAベクターを含む;例えば、Panicali & Paoletti,1982 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:4927−31;Nakanoら 1982 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1593−1596;Picciniら,In Methods in Enzymology 153:545−63(Wu & Grossman編,Academic Press,San Diego);Sutterら,1994 Vaccine 12:1032−40;Wyattら,1996 Vaccine 15:1451−8;ならびに米国特許第4,603,112号、第4,769,330号、第4,722,848号、第4,603,112号、第5,110,587号、第5,174,993号および第5,185,146号を参照されたい)およびアルファウイルス(例えば、WO 92/10578;WO 94/21792;WO 95/07994;ならびに米国特許第5,091,309号および第5,217,879号を参照されたい)が含まれるが、これらに限定されるものではない。HIV抗原の運搬のためにアデノウイルスおよびポックスウイルスベクターを使用する初回−追加法は、参照により本明細書に組み入れる2003年3月12日付け出願の国際出願番号PCT/US03/07511に記載されている。前記免疫化法に代わる方法としては、アデノウイルスによる初回および/追加投与と共にポリヌクレオチド投与(限定的なものではないが「裸DNA」または促進されたポリヌクレオチド運搬を含む)を用いるものが挙げられるであろう。例えば、Wolffら,1990 Science 247:1465および以下の特許公開を参照されたい米国特許第5,580,859号、第5,589,466号、第5,739,118号、第5,736,524号、第5,679,647号、WO 90/11092およびWO 98/04720。もう1つの代替手段としては、アデノウイルスと共に初回−追加法において組換えタンパク質の投与を用いるものが挙げられるであろう。
可能な宿主/ワクチン被接種体/個体には、霊長類、特にヒトおよび非ヒト霊長類が含まれ、商業的または家畜獣医学的に重要な任意の非ヒト哺乳類が含まれるが、これらに限定されるものではない。
該組換えウイルスベクターを含む組成物は、バッファー、正常食塩水またはリン酸緩衝食塩水、スクロース、他の塩およびポリソルベートのような生理的に許容される成分を含有しうる。ある実施形態においては、該製剤は、2.5〜10mM TRISバッファー、好ましくは約5mM TRISバッファー;25〜100mM NaCl、好ましくは約75mM NaCl;2.5〜10% スクロース、好ましくは約5% スクロース;0.01〜2mM MgCl2;および0.001%〜0.01% ポリソルベート80(植物由来)を含有する。pHは、約7.0〜9.0、好ましくは約8.0であるべきである。当業者は、他の通常のワクチン賦形剤も該製剤中で使用しうると理解するであろう。特定の実施形態においては、該製剤は、5mM TRIS、75mM NaCl、5% スクロース、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート80をpH8.0で含有する。これは、ガラス表面へのウイルスの吸着の可能性を最小にしウイルス安定性のために最適に近いpHおよび二価陽イオン組成を有する。それは、筋肉注射の際に組織刺激を引き起こさない。それは、好ましくは、使用まで凍結される。
ワクチン被接種体内に導入されるワクチン組成物中のウイルス粒子の量は、使用する転写および翻訳プロモーターの強度ならびに発現遺伝子産物の免疫原性に左右されるであろう。一般には、1×107〜1×1012粒子、好ましくは約1×1010〜1×1011粒子の免疫学的または予防的に有効な用量を筋肉組織内に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入(impression)および他の投与様式、例えば腹腔内、静脈内または吸入運搬も意図される。本発明のワクチン組成物の非経口的導入と同時またはその後の、免疫応答を増強または拡張する他の物質(インターロイキン12)の非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、皮下または他の手段の投与も有利である。
以下の非限定的な実施例は本発明を例示するために記載されている。
SIV gag遺伝子を含有するAd5前(プレ)アデノウイルスプラスミドの構築
A.アデノウイルスシャトルベクターの構築
SIV gagはmac239株から最初に分離された(Kestlerら,1990 Science 248:1109−1112)。コドン最適化DNA配列(配列番号1)を化学合成し、pVlR−CMVI−SIVgag(Eganら,2000 J.Virol.74:7485−7495)内にクローニングした。制限エンドヌクレアーゼBglIIを使用する消化により、プラスミドpVlR−CMVI−SIVgagからSIV gag DNAを単離した。ついで該BglII断片をゲル精製し、プラスミドpMA1(MRKpdelEl+CMVmin+BGHpA(str.)とも称される)(塩基対(「bp」)1−5792のAd5配列を含有しbp451−3510のE1配列の欠失を伴うプラスミドであり、該E1欠失内にHCMVプロモーターおよびBGHpAがE1平行配向で挿入されており、それらを唯一のBglII部位が隔てている)内のBglII部位内に連結した。この方法によりAd5前プラスミドpMAl−hCMV8−SIVgagを得た。これは後にMRKpAl− hCMV8−SIVgagと改名された。MRKpAl−hCMV8−SIVgag(pMAl−hCMV8−SIVgag)の遺伝的構造を制限酵素およびDNA配列決定により確認した。
A.アデノウイルスシャトルベクターの構築
SIV gagはmac239株から最初に分離された(Kestlerら,1990 Science 248:1109−1112)。コドン最適化DNA配列(配列番号1)を化学合成し、pVlR−CMVI−SIVgag(Eganら,2000 J.Virol.74:7485−7495)内にクローニングした。制限エンドヌクレアーゼBglIIを使用する消化により、プラスミドpVlR−CMVI−SIVgagからSIV gag DNAを単離した。ついで該BglII断片をゲル精製し、プラスミドpMA1(MRKpdelEl+CMVmin+BGHpA(str.)とも称される)(塩基対(「bp」)1−5792のAd5配列を含有しbp451−3510のE1配列の欠失を伴うプラスミドであり、該E1欠失内にHCMVプロモーターおよびBGHpAがE1平行配向で挿入されており、それらを唯一のBglII部位が隔てている)内のBglII部位内に連結した。この方法によりAd5前プラスミドpMAl−hCMV8−SIVgagを得た。これは後にMRKpAl− hCMV8−SIVgagと改名された。MRKpAl−hCMV8−SIVgag(pMAl−hCMV8−SIVgag)の遺伝的構造を制限酵素およびDNA配列決定により確認した。
B.前アデノウイルスプラスミドの構築
シャトルプラスミドMRKpAl−hCMV8−SIVgag(pMAl−hCMV8−SIVgag)を制限酵素SgrAIおよびBstZI17Iで消化し、ついで線状化(ClaI消化)Ad5バックボーンプラスミドMRKpAd(El−/E3−)ClaIと共に大腸菌(E.coli)株BJ5183内に同時形質転換した。生じたMRKpAd−hCMV8−SIVgagをBJ1583から回収し、大量生産のためにコンピテント大腸菌(E.coli)Stbl2内に再形質転換した。MRKpAd−hCMV8−SIVgagの遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。ELISAおよびウエスタン分析の結果はSIV gag遺伝子の発現を証明した。
シャトルプラスミドMRKpAl−hCMV8−SIVgag(pMAl−hCMV8−SIVgag)を制限酵素SgrAIおよびBstZI17Iで消化し、ついで線状化(ClaI消化)Ad5バックボーンプラスミドMRKpAd(El−/E3−)ClaIと共に大腸菌(E.coli)株BJ5183内に同時形質転換した。生じたMRKpAd−hCMV8−SIVgagをBJ1583から回収し、大量生産のためにコンピテント大腸菌(E.coli)Stbl2内に再形質転換した。MRKpAd−hCMV8−SIVgagの遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。ELISAおよびウエスタン分析の結果はSIV gag遺伝子の発現を証明した。
SIV nef遺伝子を含有するAd5前アデノウイルスプラスミドの構築
A.SIV nefG2A突然変異の作製およびアデノウイルスシャトルベクターの構築
SIV nef配列はmac251株から最初に分離された(Kestlerら,1988 Nature 331:619−622)。コドン最適化DNA配列(配列番号2)を化学合成し、pA1−To−SIVnef内にクローニングした。プラスミドpA1−To−SIVnefは、テトラサイクリンオペレーター(To)により調節されるヒトCMVプロモーター、およびSIV nef遺伝子の発現調節要素としてのウシ成長ホルモン転写ターミネーター/ポリアデニル化シグナルを利用するものである。GCCと各末端のBclI部位とを含有するプライマーを使用するPCR増幅により、SIV nefのグリシン(G)の第2コドンGGTをアラニン(A)のGCCに変換した。新たな遺伝子はnefGCC(新コドン)またはnefG2A(アミノ酸変化)は称される。第2コドンの位置にGCCを含有するプライマーを使用して、該nef遺伝子をPCR増幅した。PCR産物をBclIで消化し、ゲル精製し、MRKAd5シャトルプラスミドMRK2内のBglI制限エンドヌクレアーゼ部位(BclIおよびBglIIの付着末端は適合性である)内に連結して、プラスミドMRK2−hCMV−SIVnefGCCを得た。該プラスミドの遺伝的構造をDNA配列決定および制限酵素消化により確認した。
A.SIV nefG2A突然変異の作製およびアデノウイルスシャトルベクターの構築
SIV nef配列はmac251株から最初に分離された(Kestlerら,1988 Nature 331:619−622)。コドン最適化DNA配列(配列番号2)を化学合成し、pA1−To−SIVnef内にクローニングした。プラスミドpA1−To−SIVnefは、テトラサイクリンオペレーター(To)により調節されるヒトCMVプロモーター、およびSIV nef遺伝子の発現調節要素としてのウシ成長ホルモン転写ターミネーター/ポリアデニル化シグナルを利用するものである。GCCと各末端のBclI部位とを含有するプライマーを使用するPCR増幅により、SIV nefのグリシン(G)の第2コドンGGTをアラニン(A)のGCCに変換した。新たな遺伝子はnefGCC(新コドン)またはnefG2A(アミノ酸変化)は称される。第2コドンの位置にGCCを含有するプライマーを使用して、該nef遺伝子をPCR増幅した。PCR産物をBclIで消化し、ゲル精製し、MRKAd5シャトルプラスミドMRK2内のBglI制限エンドヌクレアーゼ部位(BclIおよびBglIIの付着末端は適合性である)内に連結して、プラスミドMRK2−hCMV−SIVnefGCCを得た。該プラスミドの遺伝的構造をDNA配列決定および制限酵素消化により確認した。
B.前アデノウイルスプラスミドの構築
シャトルプラスミドMRK2−hCMV−SIVnefGCCを制限酵素BstZl7IおよびSgrAIで消化し、ついで線状化(ClaI消化)Ad5バックボーンプラスミドpHVE3と共に大腸菌(E.coli)株BJ5183内に同時形質転換した。生じたMRKpAd−E3−hCMV−SIVnef(GCC)をBJ1583から回収し、大量生産のためにコンピテント大腸菌(E.coli)Stbl2内に再形質転換した。前プラスミドMRKpAd−E3−hCMV−SIVnef(GCC)の遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。ウエスタン分析の結果はSIV nefGCC遺伝子の発現を証明した。
シャトルプラスミドMRK2−hCMV−SIVnefGCCを制限酵素BstZl7IおよびSgrAIで消化し、ついで線状化(ClaI消化)Ad5バックボーンプラスミドpHVE3と共に大腸菌(E.coli)株BJ5183内に同時形質転換した。生じたMRKpAd−E3−hCMV−SIVnef(GCC)をBJ1583から回収し、大量生産のためにコンピテント大腸菌(E.coli)Stbl2内に再形質転換した。前プラスミドMRKpAd−E3−hCMV−SIVnef(GCC)の遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。ウエスタン分析の結果はSIV nefGCC遺伝子の発現を証明した。
研究用組換えアデノウイルスの作製
前臨床動物研究のためのウイルスを製造するために、PER.C6(登録商標)付着単層細胞培養内で前アデノウイルスプラスミドを感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスMRKAd5SIVgagをレスキューするためには、30μgのMRKpAd−hCMV8−SIVgagを制限酵素PacI(New England Biolabs)で消化し、GenePorter2キット(GTS,Gene Therapy Systems,Inc.)を使用してT75フラスコ内のPER.C6(登録商標)細胞内にトランスフェクトした。感染性ウイルスMRKAd5SIVnefGCCをレスキューするためには、30μgの前アデノウイルスプラスミドMRKpAd−E3−hCMV−SIVnef(GCC)を制限酵素PacI(New England Biolabs)で消化し、リン酸カルシウム共沈技術(Cell Phect Transfection Kit,Amersham Pharmacia Biotech Inc.)を用いてT75フラスコ内のPER.C6(登録商標)内にトランスフェクトした。PacI消化はプラスミド配列からウイルスゲノムを遊離させて、PER.C6(登録商標)内への侵入後にウイルス複製を引き起こした。完全なウイルス細胞変性効果(CPE)が観察された後、感染細胞および培地を回収した。PER.C6(登録商標)付着単層細胞培養内での複数回の継代により、該ウイルスストックを増幅した。最終継代時に、ウイルスをCsCl超遠心により細胞ペレットから精製し、特徴づけした。ウイルス粒子に関してウイルスゲノムを定量する分析用アッセイにより、ウイルスの量を測定した。組織培養感染量50%(TCID50)アッセイにより、ウイルス感染力を測定した。精製されたウイルスの同一性および純度を、精製されたウイルスDNAの制限エンドヌクレアーゼ(HindIII+PacI)分析により確認した。制限分析のためには、消化されたウイルスDNAをP33−dATPで末端標識し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。SIV gagおよびnefGCC(G2A)の遺伝子発現を、インビトロで増殖させたウイルス感染哺乳類細胞から集めた材料で、ELISAまたはウエスタン分析によりモニターした。MRKAd5SIVgagおよびMRKAd5SIVnefGCC(MRKAd−E3−hCMV−SIVnef(GCC))をマウスおよびアカゲザルにおける免疫学的評価において使用した。
前臨床動物研究のためのウイルスを製造するために、PER.C6(登録商標)付着単層細胞培養内で前アデノウイルスプラスミドを感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスMRKAd5SIVgagをレスキューするためには、30μgのMRKpAd−hCMV8−SIVgagを制限酵素PacI(New England Biolabs)で消化し、GenePorter2キット(GTS,Gene Therapy Systems,Inc.)を使用してT75フラスコ内のPER.C6(登録商標)細胞内にトランスフェクトした。感染性ウイルスMRKAd5SIVnefGCCをレスキューするためには、30μgの前アデノウイルスプラスミドMRKpAd−E3−hCMV−SIVnef(GCC)を制限酵素PacI(New England Biolabs)で消化し、リン酸カルシウム共沈技術(Cell Phect Transfection Kit,Amersham Pharmacia Biotech Inc.)を用いてT75フラスコ内のPER.C6(登録商標)内にトランスフェクトした。PacI消化はプラスミド配列からウイルスゲノムを遊離させて、PER.C6(登録商標)内への侵入後にウイルス複製を引き起こした。完全なウイルス細胞変性効果(CPE)が観察された後、感染細胞および培地を回収した。PER.C6(登録商標)付着単層細胞培養内での複数回の継代により、該ウイルスストックを増幅した。最終継代時に、ウイルスをCsCl超遠心により細胞ペレットから精製し、特徴づけした。ウイルス粒子に関してウイルスゲノムを定量する分析用アッセイにより、ウイルスの量を測定した。組織培養感染量50%(TCID50)アッセイにより、ウイルス感染力を測定した。精製されたウイルスの同一性および純度を、精製されたウイルスDNAの制限エンドヌクレアーゼ(HindIII+PacI)分析により確認した。制限分析のためには、消化されたウイルスDNAをP33−dATPで末端標識し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。SIV gagおよびnefGCC(G2A)の遺伝子発現を、インビトロで増殖させたウイルス感染哺乳類細胞から集めた材料で、ELISAまたはウエスタン分析によりモニターした。MRKAd5SIVgagおよびMRKAd5SIVnefGCC(MRKAd−E3−hCMV−SIVnef(GCC))をマウスおよびアカゲザルにおける免疫学的評価において使用した。
SIV gag遺伝子を含有するAd6前アデノウイルスプラスミドの構築
SIV gag遺伝子を含有するMRKAd5前プラスミドの作製に使用したMRKAd5シャトルプラスミドpMRKhCMVSIVgagbGH(MRKpAl−hCMV8−SIVgagまたはpMAl−hCMV8−SIVgagとも称される)を、対応するMRKAd6前プラスミドの作製に使用した。シャトルプラスミドpMRKhCMVSIVgagbGHをEcoRIおよびStuIで消化し、ついで線状化(ClaI消化)Ad6バックボーンプラスミドpMRKAd6El−と共に大腸菌(E.coli)株BJ5183内に同時形質転換した。回収したプラスミドを、大量生産のためにコンピテント大腸菌(E.coli)Stbl2内に再形質転換した。前プラスミドpMRKAd6El−hCMVSIVgagbGHの遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。
SIV gag遺伝子を含有するMRKAd5前プラスミドの作製に使用したMRKAd5シャトルプラスミドpMRKhCMVSIVgagbGH(MRKpAl−hCMV8−SIVgagまたはpMAl−hCMV8−SIVgagとも称される)を、対応するMRKAd6前プラスミドの作製に使用した。シャトルプラスミドpMRKhCMVSIVgagbGHをEcoRIおよびStuIで消化し、ついで線状化(ClaI消化)Ad6バックボーンプラスミドpMRKAd6El−と共に大腸菌(E.coli)株BJ5183内に同時形質転換した。回収したプラスミドを、大量生産のためにコンピテント大腸菌(E.coli)Stbl2内に再形質転換した。前プラスミドpMRKAd6El−hCMVSIVgagbGHの遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。
SIV nefGCC遺伝子を含有するAd6前アデノウイルスプラスミドの構築
SIV nef(GCC)を含有するMRKAd5前プラスミドの作製に使用したMRKAd5シャトルプラスミドpMRKhCMVSIVnef(G2A)(MRK2−hCMV−SIVnef(GCC)とも称される)を、対応するMRKAd6前プラスミドの作製に使用した。シャトルプラスミドpMRKhCMVSIVnef(G2A)をEcoRIおよびBstXIで消化し、ついで線状化(ClaI消化)Ad6バックボーンプラスミドpMRKAd6El−と共に大腸菌(E.coli)株BJ5183内に同時形質転換した。ついで、回収したプラスミドを、大量生産のためにコンピテント大腸菌(E.coli)Stbl2内に再形質転換した。前プラスミドpMRKAd6El−hCMVSIVnefbGH(GCCまたはG2A)の遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。
SIV nef(GCC)を含有するMRKAd5前プラスミドの作製に使用したMRKAd5シャトルプラスミドpMRKhCMVSIVnef(G2A)(MRK2−hCMV−SIVnef(GCC)とも称される)を、対応するMRKAd6前プラスミドの作製に使用した。シャトルプラスミドpMRKhCMVSIVnef(G2A)をEcoRIおよびBstXIで消化し、ついで線状化(ClaI消化)Ad6バックボーンプラスミドpMRKAd6El−と共に大腸菌(E.coli)株BJ5183内に同時形質転換した。ついで、回収したプラスミドを、大量生産のためにコンピテント大腸菌(E.coli)Stbl2内に再形質転換した。前プラスミドpMRKAd6El−hCMVSIVnefbGH(GCCまたはG2A)の遺伝的構造を制限酵素消化により確認した。
研究用組換えMRKAd6 gagおよびnefの作製
前臨床免疫原性研究のためのウイルスを製造するために、PER.C6(登録商標)付着単層細胞培養内で前アデノウイルスプラスミドpMRKAd6El−hCMVSIVgagbGHおよびpMRKAd6El−hCMVSIVnefbGHを感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、30μgのpMRKAd6El−hCMVSIVgagbGHまたはpMRKAd6El−hCMVSIVnefbGHを制限酵素PacI(New England Biolabs)で部分消化し、リン酸カルシウム共沈技術(Cell Phect Transfection Kit,Amersham Pharmacia Biotech Inc.)を用いてT75フラスコ内のPER.C6(登録商標)細胞内にトランスフェクトした。pMRKAd6El−hCMVSIVgagbGHおよびpMRKAd6El−hCMVSIVnefbGHはそれぞれ、3個のPacI制限部位(各ITRに1個ずつ及び初期領域3内に位置する1個)を含有する。前Adプラスミドの線状化(それらの3個のPacI部位のうちの1個のみにおける消化)に好ましい消化条件を用いた。なぜなら、PER.C6(登録商標)細胞内への侵入後のウイルスDNAの複製の開始を可能にするためには、1個のみのITRの遊離が要求されるからである。完全なウイルス細胞変性効果(CPE)が観察された後、感染細胞および培地を回収した。PER.C6(登録商標)細胞内での複数回の継代により、該ウイルスストックを増幅した。最終継代時に、ウイルスをCsCl超遠心により細胞ペレットから精製し、特徴づけした。ウイルス粒子に関してウイルスゲノムを定量する分析用アッセイにより、ウイルス量を測定した。組織培養感染量50%(TCID50)アッセイにより、ウイルス感染力を測定した。精製されたウイルスの同一性および純度を、精製されたウイルスDNAの制限エンドヌクレアーゼ(HindIII+PacI)分析により確認した。制限分析のためには、消化されたウイルスDNAをP33−dATPで末端標識し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。SIV gagおよびnef(GCCまたはG2A)の遺伝子発現を、インビトロで増殖させたウイルス感染哺乳類細胞から集めた材料で、ELISAまたはウエスタン分析によりモニターした。MRKAd6hCMVSIVgagbGHおよびMRKAd6hCMVSIVnefbGH(GCCまたはG2A)をマウスおよびアカゲザルにおける免疫学的評価において使用した。
前臨床免疫原性研究のためのウイルスを製造するために、PER.C6(登録商標)付着単層細胞培養内で前アデノウイルスプラスミドpMRKAd6El−hCMVSIVgagbGHおよびpMRKAd6El−hCMVSIVnefbGHを感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、30μgのpMRKAd6El−hCMVSIVgagbGHまたはpMRKAd6El−hCMVSIVnefbGHを制限酵素PacI(New England Biolabs)で部分消化し、リン酸カルシウム共沈技術(Cell Phect Transfection Kit,Amersham Pharmacia Biotech Inc.)を用いてT75フラスコ内のPER.C6(登録商標)細胞内にトランスフェクトした。pMRKAd6El−hCMVSIVgagbGHおよびpMRKAd6El−hCMVSIVnefbGHはそれぞれ、3個のPacI制限部位(各ITRに1個ずつ及び初期領域3内に位置する1個)を含有する。前Adプラスミドの線状化(それらの3個のPacI部位のうちの1個のみにおける消化)に好ましい消化条件を用いた。なぜなら、PER.C6(登録商標)細胞内への侵入後のウイルスDNAの複製の開始を可能にするためには、1個のみのITRの遊離が要求されるからである。完全なウイルス細胞変性効果(CPE)が観察された後、感染細胞および培地を回収した。PER.C6(登録商標)細胞内での複数回の継代により、該ウイルスストックを増幅した。最終継代時に、ウイルスをCsCl超遠心により細胞ペレットから精製し、特徴づけした。ウイルス粒子に関してウイルスゲノムを定量する分析用アッセイにより、ウイルス量を測定した。組織培養感染量50%(TCID50)アッセイにより、ウイルス感染力を測定した。精製されたウイルスの同一性および純度を、精製されたウイルスDNAの制限エンドヌクレアーゼ(HindIII+PacI)分析により確認した。制限分析のためには、消化されたウイルスDNAをP33−dATPで末端標識し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。SIV gagおよびnef(GCCまたはG2A)の遺伝子発現を、インビトロで増殖させたウイルス感染哺乳類細胞から集めた材料で、ELISAまたはウエスタン分析によりモニターした。MRKAd6hCMVSIVgagbGHおよびMRKAd6hCMVSIVnefbGH(GCCまたはG2A)をマウスおよびアカゲザルにおける免疫学的評価において使用した。
薬物の製剤化
化合物(2003年3月20日付け公開の米国特許出願第US2003/0055071号に開示されているN−1−(7−{[(4−フルオロベンジル)アミノ]カルボニル}−8−ヒドロキシ−1,6−ナフチリジン−5−イル)−N−l−,N−2−,N−2−トリメチルエタンジアミド)の新鮮な溶液を以下のとおりに毎週製剤化した。化合物を正確に秤量し、5.24mg/mLの濃度で蒸留脱イオン水に溶解した。液体が透明になり可視性化合物粒子を含有しなくなった際に溶解は完了する。
化合物(2003年3月20日付け公開の米国特許出願第US2003/0055071号に開示されているN−1−(7−{[(4−フルオロベンジル)アミノ]カルボニル}−8−ヒドロキシ−1,6−ナフチリジン−5−イル)−N−l−,N−2−,N−2−トリメチルエタンジアミド)の新鮮な溶液を以下のとおりに毎週製剤化した。化合物を正確に秤量し、5.24mg/mLの濃度で蒸留脱イオン水に溶解した。液体が透明になり可視性化合物粒子を含有しなくなった際に溶解は完了する。
ウイルス、試験薬物およびワクチンの投与
該研究は、mamuA01(+)アカゲザルの4つのコホートよりなるものであった。第0日に、全コホートにSIVmac239を直腸内感染させた。該ウイルスは以下のとおりに製造した。該ウイルスを10%ウシ胎児血清/RPMI 1640細胞培養培地に3.2×10−5 TCID50/mLの最終濃度まで希釈した。直腸内投与のために、1mL容量を別々のシリンジに充填した。第30日に、コホート1および3の動物にBID用量のN−1−(7−{[(4−フルオロベンジル)アミノ]カルボニル}−8−ヒドロキシル−1,6−ナフチリジン−5−イル)−N−l−,N−2−,N−2−トリメチルエタンジアミドの投与を開始した。鼻−胃チューブを介して運搬される該化合物を20.98mg/kg/日で各サルに投与した。第122日および第150日にコホート1および2に5×1010 vp MRKAd5−SIVgag+5×1010 vp MRKAd5−SIVnefのカクテルを筋肉内投与し、ついで第234日に5×1010 vp MRKAd6−SIVgag+5×1010 vp MRKAd6−SIVnefのカクテルを追加投与した。すべての場合において、各ワクチンの全量を1mLのバッファーに懸濁させた。該マカクを麻酔(ケタミン/キシレン)し、ツベルクリンシリンジ(Becton−Dickinson)を使用して該ワクチンを0.5mLのアリコートで両方の三角筋に筋肉内投与した。コホート4には該薬物投与も免疫化も行わなかった。該免疫化計画中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから、血漿、血清および末梢血単核細胞(PBMC)を調製した。すべての動物の世話および扱いは、Guide for Care and Use of Laboratory Animals,Institute of Laboratory Animal Resources,National Research Councilに記載されている原則に従いInstitutional Animal Care and Use Committeeにより承認されている基準に従い行った。
該研究は、mamuA01(+)アカゲザルの4つのコホートよりなるものであった。第0日に、全コホートにSIVmac239を直腸内感染させた。該ウイルスは以下のとおりに製造した。該ウイルスを10%ウシ胎児血清/RPMI 1640細胞培養培地に3.2×10−5 TCID50/mLの最終濃度まで希釈した。直腸内投与のために、1mL容量を別々のシリンジに充填した。第30日に、コホート1および3の動物にBID用量のN−1−(7−{[(4−フルオロベンジル)アミノ]カルボニル}−8−ヒドロキシル−1,6−ナフチリジン−5−イル)−N−l−,N−2−,N−2−トリメチルエタンジアミドの投与を開始した。鼻−胃チューブを介して運搬される該化合物を20.98mg/kg/日で各サルに投与した。第122日および第150日にコホート1および2に5×1010 vp MRKAd5−SIVgag+5×1010 vp MRKAd5−SIVnefのカクテルを筋肉内投与し、ついで第234日に5×1010 vp MRKAd6−SIVgag+5×1010 vp MRKAd6−SIVnefのカクテルを追加投与した。すべての場合において、各ワクチンの全量を1mLのバッファーに懸濁させた。該マカクを麻酔(ケタミン/キシレン)し、ツベルクリンシリンジ(Becton−Dickinson)を使用して該ワクチンを0.5mLのアリコートで両方の三角筋に筋肉内投与した。コホート4には該薬物投与も免疫化も行わなかった。該免疫化計画中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから、血漿、血清および末梢血単核細胞(PBMC)を調製した。すべての動物の世話および扱いは、Guide for Care and Use of Laboratory Animals,Institute of Laboratory Animal Resources,National Research Councilに記載されている原則に従いInstitutional Animal Care and Use Committeeにより承認されている基準に従い行った。
ELISPOTアッセイ
アカゲザルに対するIFNγELISPOTアッセイを、いくつかの修飾を伴う既に記載されているプロトコール(Allenら,2001 J.Virol.75(2):738−749)に従い行った。抗原特異的刺激のために、10−aaの重複を伴う全HIV−1 gag配列を含む20−aaペプチド(Synpep Corp.,Dublin,CA)からペプチドプールを調製した。各ウェルに、50μLの2〜4×105個の末梢血単核細胞(PBMC)を加え、80フェムトリットル(「fL」)に設定された下方(lower)サイズカットオフを有するBeckman Coulter Z2粒子分析装置を使用して、該細胞を計数した。50μLの培地または該gagペプチドプール(8μg/mL濃度/ペプチド)を該PBMCに加えた。該サンプルを37℃、5% CO2で20〜24時間インキュベートした。相応してスポットを展開し、特製イメージャー、およびImageProプラットフォーム(Silver Spring,MD)に基づく自動計数サブルーチーンを使用して、該プレートを処理した。該計数を106細胞投入に対して正規化した。
アカゲザルに対するIFNγELISPOTアッセイを、いくつかの修飾を伴う既に記載されているプロトコール(Allenら,2001 J.Virol.75(2):738−749)に従い行った。抗原特異的刺激のために、10−aaの重複を伴う全HIV−1 gag配列を含む20−aaペプチド(Synpep Corp.,Dublin,CA)からペプチドプールを調製した。各ウェルに、50μLの2〜4×105個の末梢血単核細胞(PBMC)を加え、80フェムトリットル(「fL」)に設定された下方(lower)サイズカットオフを有するBeckman Coulter Z2粒子分析装置を使用して、該細胞を計数した。50μLの培地または該gagペプチドプール(8μg/mL濃度/ペプチド)を該PBMCに加えた。該サンプルを37℃、5% CO2で20〜24時間インキュベートした。相応してスポットを展開し、特製イメージャー、およびImageProプラットフォーム(Silver Spring,MD)に基づく自動計数サブルーチーンを使用して、該プレートを処理した。該計数を106細胞投入に対して正規化した。
細胞内サイトカイン染色
完全RPMI培地(17×100mm丸底ポリプロピレンチューブ(Sarstedt,Newton,NC)中)内の1mlの2×106 PBMC/mlに、抗hCD28(クローンL293、Becton−Dickinson)および抗hCD49d(クローンL25、Becton−Dickinson)モノクローナル抗体を1μg/mLの最終濃度まで加えた。gag特異的刺激のために、10μLの該ペプチドプール(0.4mg/mL/ペプチド)を加えた。該チューブを37℃で1時間インキュベートし、ついで20μLの5mg/ml ブレフェルジンA(Sigma)を加えた。該細胞を37℃、5% CO2、湿度90%で16時間インキュベートした。4mLの冷PBS/2% FBSを各チューブに加え、該細胞を1200rpmで10分間ペレット化した。該細胞をPBS/2% FBSに再懸濁させ、いくつかの蛍光タグ付きmAb:20μL/チューブ 抗hCD3−APC、クローンFN−18(Biosource);20μL 抗hCD8−PerCP、クローンSK1(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ);および20μL 抗hCD4−PE、クローンSK3(Becton Dickinson)を使用して、表面マーカーに関して染色した(30分間、4℃)。この段階からのサンプルの取扱いは暗所で行った。該細胞を洗浄し、750μLの1×FACS Permバッファー(Becton Dickinson)中、室温で10分間インキュベートした。該細胞をペレット化し、PBS/2% FBSに再懸濁させ、0.1μgのFITC抗hIFNγ、クローンMD−1(Biosource)を加えた。30分間のインキュベーションの後、該細胞を洗浄し、PBSに再懸濁させた。Becton Dickinson FACSCalibur装置の全4色チャンネルを使用して、サンプルを分析した。該データを分析するために、低い側方および前方散乱リンパ球集団をまずゲーティング(gate)した。サイトカイン陽性事象に関する一般的な蛍光カットオフを、CD4+およびCD8+の両方の集団に対して並びにサンプルの模擬およびgagペプチド反応チューブに対して用いた。
完全RPMI培地(17×100mm丸底ポリプロピレンチューブ(Sarstedt,Newton,NC)中)内の1mlの2×106 PBMC/mlに、抗hCD28(クローンL293、Becton−Dickinson)および抗hCD49d(クローンL25、Becton−Dickinson)モノクローナル抗体を1μg/mLの最終濃度まで加えた。gag特異的刺激のために、10μLの該ペプチドプール(0.4mg/mL/ペプチド)を加えた。該チューブを37℃で1時間インキュベートし、ついで20μLの5mg/ml ブレフェルジンA(Sigma)を加えた。該細胞を37℃、5% CO2、湿度90%で16時間インキュベートした。4mLの冷PBS/2% FBSを各チューブに加え、該細胞を1200rpmで10分間ペレット化した。該細胞をPBS/2% FBSに再懸濁させ、いくつかの蛍光タグ付きmAb:20μL/チューブ 抗hCD3−APC、クローンFN−18(Biosource);20μL 抗hCD8−PerCP、クローンSK1(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ);および20μL 抗hCD4−PE、クローンSK3(Becton Dickinson)を使用して、表面マーカーに関して染色した(30分間、4℃)。この段階からのサンプルの取扱いは暗所で行った。該細胞を洗浄し、750μLの1×FACS Permバッファー(Becton Dickinson)中、室温で10分間インキュベートした。該細胞をペレット化し、PBS/2% FBSに再懸濁させ、0.1μgのFITC抗hIFNγ、クローンMD−1(Biosource)を加えた。30分間のインキュベーションの後、該細胞を洗浄し、PBSに再懸濁させた。Becton Dickinson FACSCalibur装置の全4色チャンネルを使用して、サンプルを分析した。該データを分析するために、低い側方および前方散乱リンパ球集団をまずゲーティング(gate)した。サイトカイン陽性事象に関する一般的な蛍光カットオフを、CD4+およびCD8+の両方の集団に対して並びにサンプルの模擬およびgagペプチド反応チューブに対して用いた。
ウイルス負荷の測定
ABI Prism 7700配列検出系を使用するSIVリアルタイムRNAレベルと称されるアッセイ(Leuteneggerら,2001 AIDS Res.Human Retro.17(3):243−51;Hofmann−Lehmann)をConsolidated Laboratory Services,Van Nuys,CAにおいて行うことにより、EDTA処理血漿からウイルス負荷を測定した。このリアルタイムアッセイは8桁にわたって正確であり高感度であり再現性を有し、該研究の経過中のウイルス負荷の有効な特徴づけを可能にすることが示された。この試験は、HIVではなくSIVのウイルス負荷を特異的に検出する。直線性は101〜109コピー/mLの範囲であった。
ABI Prism 7700配列検出系を使用するSIVリアルタイムRNAレベルと称されるアッセイ(Leuteneggerら,2001 AIDS Res.Human Retro.17(3):243−51;Hofmann−Lehmann)をConsolidated Laboratory Services,Van Nuys,CAにおいて行うことにより、EDTA処理血漿からウイルス負荷を測定した。このリアルタイムアッセイは8桁にわたって正確であり高感度であり再現性を有し、該研究の経過中のウイルス負荷の有効な特徴づけを可能にすることが示された。この試験は、HIVではなくSIVのウイルス負荷を特異的に検出する。直線性は101〜109コピー/mLの範囲であった。
結果
該研究におけるすべての動物はSIVmac239による感染の最初の17日以内にピークレベルのウイルス複製(3×106〜9×108ウイルスコピー/mL)を示した(図1A、2A、3A、4A)。コホート1(図1A)においては、6匹中3匹の動物が、第30日に開始した薬物治療に応答し、ウイルス負荷はベースラインレベルまで3桁以上低下した。コホート3(図3A)においては、6匹中2匹の動物が薬物治療に強力に応答し、ウイルス負荷はベースラインレベルまで低下している。
該研究におけるすべての動物はSIVmac239による感染の最初の17日以内にピークレベルのウイルス複製(3×106〜9×108ウイルスコピー/mL)を示した(図1A、2A、3A、4A)。コホート1(図1A)においては、6匹中3匹の動物が、第30日に開始した薬物治療に応答し、ウイルス負荷はベースラインレベルまで3桁以上低下した。コホート3(図3A)においては、6匹中2匹の動物が薬物治療に強力に応答し、ウイルス負荷はベースラインレベルまで低下している。
第122日および第150日に、コホート1および2にMRKAd5−SIVgag + MRKAd5−SIVnefで免疫化を行い、ついで第234日に、MRKAd6−SIVgag + MRKAd6−SIVnefの混合物を投与した。第111、137、158および255日に、細胞内サイトカイン染色を用いて、抗gag T細胞応答を評価した。結果を図1B、1C、2B、2C、3B、3C、4Bおよび4Cに要約する。コホート1(図1B、1C)においては、MRKAd5に基づくワクチンでの免疫化は、動物02−R052、02−R050および02−R056において、gag特異的細胞傷害性CD8+およびヘルパーCD4+応答の両方の劇的な増強(>10倍)を誘導した。全3匹の動物はそれらのウイルス負荷レベルの薬物誘導性抑制を示した。gag特異的T細胞応答の増強は、MRKAd6に基づくワクチンでの免疫化の際にも、これらの動物において明らかであった。CD8+およびCD4+応答の増強を示した唯一の他の動物は02−R053であった。この動物は、継続的薬物療法に応答したウイルス負荷の抑制を示さなかった。しかし、T細胞応答の増強は、MRKAd6追加ワクチンの投与後には維持されなかった。薬物治療を行わなかったコホート2(図2B、2C)においては、2匹の動物(02−R058、02−R047)は、該コホート内のその他の動物より良好に、ウイルス抑制を自然に示したらしく、これらの2匹の動物は、MRKAd5およびMRKAd6免疫化後に、gagに対するCD8+およびCD4+応答の両方における顕著な増強を示した。予想どおり、コホート3および4においてはT細胞応答における有意な変動は認められなかった。一般に、T細胞応答のレベルはコホート1において最高であり、コホート2、コホート3、そして最後にコホート4が続いた。抗nefT細胞応答においても、全4個のコホートにおいて同様の傾向が観察された(データ非表示)。
また、ELISPOTアッセイにおいて、gagペプチドプールをより小さな10個のサブプールに分けることにより、T細胞応答の幅を測定した。それぞれはN末端からC末端までのタンパク質の約50−aaのセグメントを代表する。第74日、第158日および第269日に、動物からのPBMCを該サブプールに対して試験した。図5は、与えられた時点で各動物に関して陽性抗原特異的応答が検出されたサブプールの数を示す。最も幅広いT細胞応答はコホート1、特に、薬物誘導性ウイルス抑制および該ワクチンに対する最強の免疫応答を示した動物(02−R052、02−R050、02−R056)において観察された。
これらの知見は、抑制されたウイルス血症を示す感染個体のアデノウイルス媒介性免疫化が、非常に幅広い性質の非常の高レベルのウイルス特異的CD8+およびCD4+ T細胞応答の両方をもたらしうるという見解を裏付けるものである。増強された免疫応答を惹起するこの方法は、感染個体が低ウイルス負荷を維持するよう補助し、したがって、抗ウイルス療法に対する個体の依存性を軽減すると予想される。
Claims (12)
- ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)−1抗原をコードする核酸を含む組換え複製欠損型アデノウイルスをHIV感染個体に投与することを含んでなり、該個体が該投与の前にHIVウイルスコピー数の減少を示している、HIV感染個体においてHIVに対する細胞性免疫応答を惹起するための方法。
- HIVウイルスコピー数の減少が、少なくとも部分的には、抗ウイルス剤での治療によるものである、請求項1記載の方法。
- 抗ウイルス剤がプロテアーゼインヒビター、逆転写酵素インヒビターおよびインテグラーゼインヒビターのうちの1以上を含む、請求項2記載の方法。
- 抗ウイルス剤がプロテアーゼインヒビターと逆転写酵素インヒビターとの組合せを含む、請求項2記載の方法。
- 該個体に該アデノウイルスを投与および再投与することを含む、請求項1記載の方法。
- HIV抗原をコードする核酸を含む別の血清型のアデノウイルスを投与することを更に含む、請求項1記載の方法。
- HIV抗原をコードする核酸を含む異なるウイルス起源のウイルスを投与することを更に含む、請求項1記載の方法。
- 該抗原がHIV gagに由来する、請求項1記載の方法。
- 該抗原がHIV nefに由来する、請求項1記載の方法。
- 該抗原がHIV polに由来する、請求項1記載の方法。
- 該抗原がHIV envに由来する、請求項1記載の方法。
- HIV抗原をコードする核酸を含むポリヌクレオチド組成物を投与することを更に含む、請求項1記載の方法。
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