CN101076247A - Hiv－感染个体的治疗性免疫 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于在感染了人免疫缺陷病毒(“HIV”)的个体中诱导治疗性免疫应答的改善的方法。所述方法包括给具有受控制的病毒血症的个体施用表达HIV抗原的腺病毒疫苗组合物。以这种方式对感染个体进行免疫，能够诱导针对所述病毒的细胞介导的免疫应答，它在应答的水平和应答的广度方面都是显著的。随后发生的治疗性免疫应答能够有效地保持病毒的低滴度，因此，提供了减弱个体对抗病毒治疗依赖性的前景。

Description

HIV-感染个体的治疗性免疫
对相关申请的交叉引用
本申请要求2003年9月18日提交的美国临时申请流水号60/504,522的权益。
有关联邦资助的开发的声明
不适用
对缩微胶片附录的参考
不适用
发明领域
本发明披露了用于在具有受控制的病毒血症的HIV-感染个体中包含病毒复制的有效方法。该方法包括用含有编码HIV抗原的外源核酸的重组的复制缺陷型腺病毒对所述个体进行免疫。
发明背景
人免疫缺陷病毒(HIV)是获得性人免疫缺陷综合征(AIDS)和相关疾病的病原体。HIV是逆转录病毒科的RNA病毒，并且表现出所有逆转录病毒所具有的5′LTR-gag-pol-env-LTR 3′组构。被称作原病毒的HIV的完整形式的长度为大约9.8Kb。病毒基因组的每一个末端包括被称作长末端重复(LTRs)的侧翼序列。
HIV基因编码至少九种蛋白，并且被划分成三种类型：主要结构蛋白(Gag，Pol，和Env)，调节蛋白(Tat和Rev)；和附属蛋白(Vpu，Vpr，Vif和Nef)。gag基因编码55-千道尔顿(kDa)的前体蛋白(p55)，p55是由未剪接的病毒mRNA表达的，并且由作为pol基因的产物的HIV蛋白酶进行蛋白水解加工。成熟的p55蛋白产物是p17(基质)，p24(衣壳)，p9(核壳体)和p6。所述pol基因编码病毒复制所必需的蛋白——逆转录酶，蛋白酶，整合酶和RNAse H。所述病毒蛋白是以Gag-Pol融合蛋白形式表达的，它是通过核糖体移码产生的160kDa的前体蛋白。病毒编码的蛋白酶能够通过蛋白水解将Pol多肽从Gag-Pol融合体上切割下来，并且将Pol多肽进一步切割成成熟蛋白，该成熟蛋白提供了蛋白酶(Pro，P10)，逆转录酶(RT，P50)，整合酶(IN，p31)和RNAse H(RNAse，p15)活性。nef基因编码早期辅助HIV蛋白(Nef)，业已证实它具有若干种活性，如下调CD4表达，干扰T-细胞激活，和刺激HIV传染性。env基因编码病毒包膜糖蛋白，该糖蛋白是作为160-千道尔顿(kDa)的前体(gp160)翻译的，然后被细胞蛋白酶切割，以便产生外部120-kDa包膜糖蛋白(gp120)和跨膜41-kDa包膜糖蛋白(gp41)。Gp120和gp41保持缔合，并且展示在病毒颗粒和HIV-感染细胞的表面上。tat基因编码长的形式和短的形式的Tat蛋白，它是一种RNA结合蛋白，是HIV复制所必需的转录反式激活剂。rev基因编码13kDa的Rev蛋白，它是一种RNA结合蛋白。Rev蛋白与病毒RNA的被称作Rev反应元件(RRE)的区域结合。Rev蛋白能促进未剪接的病毒RNA从细胞核转移到细胞质中。Rev蛋白是HIV晚期基因表达所需要的，因此是HIV复制所需要的。
病毒表达的蛋白能够使得所述病毒进入靶细胞，并且指导病毒RNA复制，以便最终产生其他传染性病毒。除了其他共同受体分子之外，Gp120能结合位于辅助T-淋巴细胞，巨噬细胞和其他靶细胞表面上的CD4/趋化因子受体。X4(巨噬细胞亲嗜性)病毒表现出对CD4/CXCR4复合体的嗜好，而R5(T-细胞系亲嗜性)病毒与CD4/CCR5受体复合物相互作用。在gp120与CD4结合之后，gp41能介导决定病毒进入的融合事件。所述病毒然后与所述靶细胞融合并且进入靶细胞，此后发生的是通过RNA依赖性DNA聚合酶的作用，它的单链RNA基因组逆转录形成双链DNA。被称作原病毒的病毒DNA随后进入细胞核，在这里，病毒DNA指导新病毒RNA在细胞核内的产生，早期和晚期HIV病毒蛋白的表达，以及随后新的病毒颗粒的产生和细胞释放。在检测宿主中病毒负荷的能力方面的最新进展，证实了原发感染导致了所述病毒的大量产生和组织分布，随后是稳态水平的病毒(尽管在此期间经过了连续的病毒生产和更新)，最终导致病毒负荷的另一次爆发，由此导致临床AIDS的发作。生产性的受感染的细胞具有若干天时间的半衰期，而慢性或潜伏感染的细胞具有3周时间的半衰期，随后是非生产性的受感染的细胞，它具有长的半衰期(超过100天)，但是不会明显造成在疾病过程中出现的逐日的病毒负荷。
CD4辅助T淋巴细胞的破坏，对于免疫防御来说是重要的，它是进展的免疫失调的主要原因，这是HIV感染的特征。CD4T-细胞的丧失，严重削弱了身体抵御大部分入侵者的能力，不过，它对病毒，真菌，寄生虫和某些细菌，包括分枝杆菌的防御具有特别严重的影响。
对HIV感染个体的有效治疗方案已经可行，并且用于治疗感染了HIV个体的仪器也可以获得。业已证实能作为HIV复制的抑制剂的抗病毒剂(包括，但不局限于抗逆转录病毒治疗(″ART″))能非常成功地治疗AIDS和类似疾病；业已报导了用抗病毒药物有效治疗能在8周内将病毒负荷水平降低90％或更多，实现病毒负荷的连续降低，并最终在6个月内达到检测不到的水平。现有若干种类型的抗病毒化合物包括，但不局限于逆转录酶抑制剂(例如，叠氮胸苷(AZT)和依夫维瑞)；蛋白酶(例如，因地那韦和那非那韦)；和整合酶。
不幸的是，这些药物对世界上很多地方的所述疾病没有显著作用。另外，在可以进行所述治疗选择的个体中，治疗将需要长期抗逆转录病毒治疗，以便保持低水平的病毒，并最终防止病毒反弹。为此，最近的努力集中在促进HIV-感染个体的免疫应答方面，业已通过给感染个体施用免疫球蛋白使所述个体接受了抗逆转录病毒治疗。所提到的文献采用HIV抗原作为免疫原，并且通过施用DNA、施用完整的灭活的(gp120-去除的)HIV-1疫苗或通过痘病毒载体(例如，ALVAC，NYVAC)施用而送递所述免疫原；例如，参见，Hoff和McNamara，1999The Lancet 353：1723-1724；以及以下专利文献：WO 98/08539；WO01/08702；WO 01/54701；和WO 02/095005。
据申请人所知，以前感染了HIV的表现出受控制的病毒血症个体没有用包括编码HIV抗原的外源核酸的重组的，复制缺陷型腺病毒进行免疫。正如本文所披露的，该方法能诱导很高水平的性质上非常广的病毒特异性CD8+和CD4+T细胞应答。所述治疗性免疫应答能够确保具有有效维持低滴度病毒的能力，因此，提供了减弱个体对抗病毒治疗的依赖性的前景。在抵抗AIDS中重要的是产生用于HIV-感染个体的疫苗方案，这有助于在感染个体中恢复强的HIV-特异性细胞介导的免疫应答。
发明概述
本发明提供了用于在感染了人免疫缺陷病毒(″HIV″)的个体中诱导治疗性免疫应答的方法。该方法包括对表现出病毒血症的主动控制的感染个体进行免疫(通过主动免疫应答或通过用抗病毒剂治疗)，包括施用含有编码至少一种HIV抗原的外源核酸的重组的，复制缺陷型腺病毒。用这种方式免疫，能诱导多种性质的病毒特异性CD8+和CD4+T细胞应答的显著增强。随后发生的治疗性免疫应答，具有有效保持低滴度病毒的能力，因此，提供了减弱个体对抗病毒治疗依赖性的前景。
细胞毒性T淋巴细胞(″CTL″)构成了免疫系统细胞应答的重要部分。为了诱导CTL免疫应答，抗原必须在细胞内合成或者导入细胞，然后通过蛋白酶体复合物加工成小的肽，并且转运到内质网/高尔基复合物分泌途径，以便最终与主要组织相容性复合体(MHC)I类蛋白缔合。CD8+T淋巴细胞通过T细胞受体(TCR)和CD8细胞表面蛋白识别与I类MHC缔合的抗原。将幼稚CD8+T细胞激活成活化的效应物或记忆细胞，通常需要上文所述的抗原的TCR占据，以及共刺激蛋白的占据。CTL应答的最佳诱导通常需要来自CD4+T淋巴细胞的细胞因子形式的″帮助″，它能通过TCR和CD4占据识别与MHCII类分子缔合的抗原。当个体在施用疫苗之前或施用疫苗同时有效限制了病毒复制(这是通过对接受治疗的个体的主动免疫应答或对抗病毒治疗的有利反应)时，本发明具有在感染了HIV的个体中诱导CD8+和CD4+应当的能力。
因此，本发明涉及用于在感染了HIV的个体中诱导针对HIV的细胞介导的免疫应答的方法，该方法包括给经历了HIV病毒拷贝数量减少的个体施用包括编码HIV抗原的外源核酸的重组的，复制缺陷型腺病毒。与某些以前的时间点相比，这种具有减少的病毒负荷的状态，无论是否有利，在本文中通常称作″受控制的″或″受限的″。在优选实施方案中，所述病毒负荷业已减少，并且在10,000病毒拷贝或更少；或优选大约5,000个拷贝或更少的数量级上。优选的是，所述个体的CD4+计数为每毫升血浆至少300个细胞；更优选每毫升血浆超过400个细胞；最优选每毫升血浆超过500个细胞。同样优选的是，所述个体尚未发展成AIDS。在免疫时导致病毒数量减少的原因并不重要。例如，这种减少可以是由免疫系统对病毒存在作出反应的先天能力介导的；以前的免疫有助于个体保持病毒负荷在控制之下；或者用抗病毒剂治疗。抗病毒剂可以选自任何能够有效减轻病毒负荷的化合物或治疗剂。所述抗病毒剂优选选自以下的化合物类型：蛋白酶抑制剂，逆转录酶抑制剂，和整合酶抑制剂。优选的，给个体施用的抗病毒剂是有效抗病毒治疗剂的某种组合，如存在于活性抗逆转录病毒治疗(″HAART″)中的那些，该术语在本领域中通常被用于表示三种或三种以上抗病毒药物的混合物，该术语包括，但不局限于病毒蛋白酶逆转录酶的组合。
用于本发明方法中的重组的，复制缺陷型腺病毒包括编码至少一种HIV抗原的外源核酸。所述HIV抗原可以是能够在个体中诱导免疫应答的任何抗原，最优选来自选自下组的HIV抗原：HIV gag，pol，env，nef，rev，tat，vpu，vpr，和vif；或它们的任何抗原性/免疫原性部分。另外，本发明涉及一次或多次施用表达HIV抗原的重组腺病毒，因此，涉及各种激发-增强方案，以便用于本发明的方法。在这种场合下，首先给个体施用激发剂量的病毒(或多核苷酸)载体，它包括编码HIV抗原的核酸，在经过一段时间之后，施用加强剂量的病毒(或多核苷酸)载体，它包括编码HIV抗原的核酸；假设所述激发或加强施用采用了腺病毒载体。优选的是，所述激发和加强施用的病毒载体是不同的，以便逃避针对第一次送递的载体的任何宿主免疫。其他病毒载体的选择对于本文所披露方法的成功并不重要。任何能够送递抗原并且实现所述抗原的充分表达，以便诱导细胞介导的免疫应答的病毒载体应当足以激发或加强腺病毒介导的施用。所述其他载体可选自独特血清型的腺病毒。另外，在所述腺病毒施用之后或之前，可以施用不同来源的病毒载体，例如，痘病毒载体，逆转录病毒载体，和甲病毒载体，腺伴随病毒载体等。本发明的另一种实施方案采用了激发-加强方案，其中，在施用腺病毒之前或之后，施用了包括编码HIV抗原的核酸的多核苷酸。本发明的另一种实施方案采用了激发-加强方案，其中，在施用腺病毒之前或之后，以施用蛋白/重组蛋白的形式送递了HIV抗原。
附图的简要说明
图1A-1C表示抗逆转录病毒治疗(″ART″)+疫苗组的结果。(a)表示每只动物的病毒负荷(RNA拷贝数/mL)。箭头表示药物治疗开始的时间(A)和免疫的时间(V)。(b)在第111(第一次免疫之前)，137(第一次免疫之后)，158(第二次免疫之后)，227(MRKAd6免疫之前)和255天(MRKAd6免疫之后)的gag-特异性CD8+T细胞水平(每106个淋巴细胞中gag-特异性IFNγ生产性CD8+细胞的数量)。以上结果是通过使用肽合并物测定的，所述合并物由具有10-aa的重叠并且包括完整的SIVmac239蛋白的20-aa的肽组成；这里所示出的值扣除了模拟反应试管中的水平。(c)在与步骤(b)相同的测定日期的Gag-特异性CD4+T细胞的水平(每106个淋巴细胞中gag-特异性IFNγ生产性CD8+细胞的数量)。这里所示出的值同样扣除了模拟反应试管中的水平。
图2A-2C表示″仅有疫苗″组的结果。(a)表示每只动物的病毒负荷(RNA拷贝数/mL)。箭头表示免疫的时间(V)。(b)在第111(第一次免疫之前)，137(第一次免疫之后)，158(第二次免疫之后)，227(MRKAd6免疫之前)和255天(MRKAd6免疫之后)的Gag-特异性CD8+T细胞水平(每106个淋巴细胞中gag-特异性IFNγ生产性CD8+细胞的数量)。以上结果是通过使用肽合并物测定的，所述合并物由具有10-aa的重叠并且包括完整的SIVmac239蛋白的20-aa的肽组成；这里所示出的值扣除了模拟反应试管中的水平。(c)在与步骤(b)相同的测定日期的Gag-特异性CD4+T细胞水平(每106个淋巴细胞中gag-特异性IFNγ生产性CD8+细胞的数量)。这里所示出的值同样扣除了模拟反应试管中的水平。
图3A-3C表示″仅有ART″组的结果。(a)表示每只动物的病毒负荷(RNA拷贝数/mL)。箭头表示药物治疗开始的时间(A)。(b)在第111，137，158，227和255天的Gag-特异性CD8+T细胞水平(每106个淋巴细胞中gag-特异性IFNγ生产性CD8+细胞的数量)。以上结果是通过使用肽合并物测定的，所述合并物由具有10-aa的重叠并且包括完整的SIVmac239蛋白的20-aa的肽组成；这里所示出的值扣除了模拟反应试管中的水平。(c)在与步骤(b)相同的测定日期的Gag-特异性CD4+T细胞水平(每106个淋巴细胞中gag-特异性IFNγ生产性CD8+细胞的数量)。这里所示出的值同样扣除了模拟反应试管中的水平。
图4A-4C表示″无处理″对照组的结果。(a)表示每只动物的病毒负荷(RNA拷贝数/mL)。(b)在第111，137，158，227和255天的Gag-特异性CD8+T细胞水平(每106个淋巴细胞中gag-特异性IFNγ生产性CD8+细胞的数量)。以上结果是通过使用肽合并物测定的，所述合并物由具有10-aa的重叠并且包括完整的SIVmac239蛋白的20-aa的肽组成；这里所示出的值扣除了模拟反应试管中的水平。(c)在与步骤(b)相同的测定日期的Gag-特异性CD4+T细胞水平(每106个淋巴细胞中gag-特异性IFNγ生产性CD8+细胞的数量)。这里所示出的值同样扣除了模拟反应试管中的水平。
图5A-5D表示gag-特异性T细胞应答的宽度。对gag亚合并的阳性是通过在IFNγELISPOT分析中超过或等于50SFC/106PBMC的应答而确定的。最大得分为10。在第74(第一次免疫之前)，158(第二次免疫之后，和269天之后(第三次免疫之后)测定每一只动物的PBMC。(a)ART+疫苗组。(b)″仅有疫苗″组。(c)″仅有ART″组。(d)″无处理″对照组。
图6表示编码SIV mac239 gag的密码子优化的核酸序列(SEQ IDNO：1)。
图7表示具有G2A突变的编码SIV mac251 nef的密码子优化的核酸序列(SEQ ID NO：2)。
发明的详细说明
披露了在以具有受控制的病毒血症为特征的HIV-感染个体中诱导治疗性免疫应答的新方法。所述方法包括给受感染的个体施用包括编码至少一种HIV抗原的外源核酸的重组的，复制缺陷型腺病毒；其中，所述个体在施用之前或同时经历了HIV病毒拷贝数量的减少。在免疫时造成病毒拷贝数量(即，病毒负荷)减少的具体原因并不重要。所述减少可以是由免疫系统对病毒的存在作出应当的先天能力；有助于保持病毒负荷稳定的以前的免疫；用抗病毒剂治疗；或也许可能尚未确定的任何其他原因介导的。重要的是发现以这种方式治疗个体进行免疫(即，在感染阶段使用腺病毒载体)，能在个体中有效诱导病毒特异性细胞介导的免疫应答，正如由在接受治疗的感染了SIV的猕猴体内病毒特异性细胞毒性CD8+和辅助CD4+T细胞应答的显著增强所表明的。随后的治疗性免疫应答具有有效维持低滴度病毒的能力，因此，提供了减弱个体对抗病毒治疗的依赖性的前景。
用于治疗感染个体的特定抗病毒剂不具备本发明方法的用途。例如，所述抗病毒剂可以是基于/来自抗体，多核苷酸，多肽，肽，或小分子。能够在个体内有效减少病毒复制/病毒负荷的任何抗病毒剂都能根据本发明的方法充分地激发个体对象的免疫。抗病毒剂能够拮抗病毒的功能/生命周期，并且针对病毒的正确的生命周围所必需的蛋白/功能；这种效果是可以通过体内或体外测定方便地确定的。能针对特殊病毒蛋白的某些典型的抗病毒剂包括蛋白酶抑制剂，逆转录酶抑制剂(包括核苷类似物；非核苷逆转录酶抑制剂；和核苷酸类似物)，和整合酶抑制剂。蛋白酶抑制剂包括，例如，因地那韦/CRIXIVAN；利托那韦/NORVIR；沙奎那韦/FORTOVASE；那非那韦/VIRACEPT；安泼那韦/AGENERASE；罗品那韦和利托那韦/KALETRA。逆转录酶抑制剂包括，例如，(1)核苷类似物，例如，齐多夫定/RETROVIR(AZT)；didanosine/VIDEX(ddI)；扎西胞苷HIVID(ddC)；斯塔夫定/ZERIT(d4T)；拉米夫定/EPIVIR(3TC)；阿巴卡韦/ZIAGEN(ABC)；(2)非核苷逆转录酶抑制剂，例如，奈韦拉平/VIRAMUNE(NVP)；地拉夫定/RESCRIPTOR(DLV)；依夫维瑞/SUSTIVA(EFV)；和(3)核苷酸类似物，例如，tenofovir DF/VIREAD(TDF)。整合酶抑制剂包括，例如，在美国申请公开号US 2003/0055071中披露的分子，该申请的公开日为2003年3月20日；以及国际申请公开号WO 03/035077。所提到的抗病毒剂还能够针对病毒/病毒蛋白的功能，例如，调节性蛋白tat或rev分别与反式激活反应区(″TAR″)或rev-反应(″RRE″)的相互作用。
本发明还涉及对业已用组合的抗病毒剂治疗过的个体进行免疫。例如，抗病毒剂可以与有效量的HIV/AIDS抗病毒剂，免疫调节剂，抗-感染剂，或用于治疗HIV感染或AIDS的疫苗组合使用，包括，但不局限于以下表格中的物质：
                                            抗病毒剂
  药物名称   生产商(商品和/或地点)   适应症(活性)
  阿巴卡韦GW 15921592U89阿巴卡韦+拉米夫定+齐多夫定acemannanACH 126443阿昔洛韦AD-439AD-519阿德福韦二叔戊酰氧甲酯GS 840AL-721   Glaxo Welcome(ZIAGEN)GlaxoSmithKline(TRIZIVIR)Carrington Labs(Irving，TX)Achillion Pharm.Burroughs WellcomeTanox BiosystemsTanox BiosystemsGileadEthigen(Los Angeles，CA)   HIV感染，AIDS，ARC(核苷逆转录酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(核苷逆转录酶抑制剂)ARCHIV感染，AIDS，ARC(核苷逆转录醇抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC，与AZT组合HIV感染，AIDS，ARCHIV感染，AIDS，ARCHIV感染，AIDS，ARC(逆转录酶抑制剂)ARC，PGL,HIV阳性，AIDS
 α干扰素AMD3100安泼那韦141 W94GW 141VX478(Vertex)安沙霉素LM427能中和pH不稳定性α异常干扰素的抗体AR177atazanavir(BMS 232632)β-氟-ddABMS-232623(CGP-73547)BMS-234475(CGP-61755)Capravirine(AG-1549，S-1153)CI-1012  GlaxoSmithKlineAnorMedGlaxoSmithKline(AGENERASE)Adria Laboratories(Dublin，OH)Erbamont(Stamford，CT)Advanced BiotherapyConcepts(Rockville，MD)Aronex PharmBristol-Myers Squibb(REYATAZTM)Nat′l Cancer InstituteBristol-Myers Squibb/NovartisBristol-Myers Squibb/NovartisPfizerWarner-Lambert   卡波西肉瘤，HIV，与逆转录病毒组合HIV感染，AIDS，ARC(CXCR4拮抗剂)HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)ARCAIDS，ARCHIV感染，AIDS，ARCHIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)AIDS-相关疾病HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(非核苷逆转录酶抑制剂)HIV-1感染
  Cidofovircurdlan sulfate巨细胞病毒免疫珠蛋白羟甲基无环鸟苷更昔洛韦地拉夫定硫酸葡聚糖DdC(扎西胞苷双脱氧胞苷)ddI(didanosine，双脱氧肌苷)DPC681&DPC684DPC961&DPC083EL10依夫维瑞(DMP266)  Gilead ScienceAJIPharma USAMedImmuneSyntexPharmacia-Upjohn(RESCRIPTOR)Ueno Fine Chem.Ind.Ltd.(Osaka，Japan)Hoffman-La Roche(HIVID)Bristol-Myers Squibb(VIDEX)DuPontBristol-Myers Squibb(from DuPont Pharma)Elan Corp，PLC(Gainesville，GA)Bristol-Myers Squibb(SUSTIVA)Merck(STOCRIN) CMV视网膜炎，疱疹，乳头瘤病毒HIV感染CMV视网膜炎威胁视力的CMV外周CMV视网膜炎HIV感染，AIDS，ARC(非核苷逆转录酶抑制剂)AIDS，ARC，HIV阳性无症状HIV感染，AIDS，ARC(核苷逆转录酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC；与AZT/d4T组合(核苷逆转录酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV感染  AIDS，ARC(非核苷逆转录酶抑制剂)HIV感染HIV感染，AIDS，ARC(非核苷RT抑制剂)
    法昔洛韦EmtricitabineFTCEmvirineEnfuvirtideT-20HBY097Fosamprenavir金丝桃素重组人干扰素β干扰素α-n3吲哚那韦ISIS 2922JE2147/AG1776KNI-272拉米夫定，3TC     Novartis(FAMVIR)Gilead(from TrianglePharmaceuticals)(COVIRACIL)Emory UniversityGilead(from TrianglePharmaceuticals)(COACTINON)Trimeris & Roche(FUZEON)Hoechst Marion RousselGlaxo Smith KlineVIMRx Pharm.Triton Biosciences(Almeda，CA)Inteferon SciencesMerck(CRIXIVAN)ISIS PharmaceuticalsAgouronNat′l Cancer InstituteGlaxoSmithKline(EPIVIR) 带状疱疹，单纯疱疹HIV感染，AIDS，ARC(核苷逆转录酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(非核苷逆转录酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(融合抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(非核苷逆转录酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(安泼那韦的前药)HIV感染，AIDS，ARCAIDS，卡波西肉瘤，ARCARC，AIDSHIV感染，AIDS，ARC，无症状HIV阳性，(蛋白酶抑制剂)CMV视网膜炎HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV-相关疾病HIV感染，AIDS，ARC(核苷逆转录酶抑制剂)
  拉米夫定+齐多夫定洛布卡韦罗品那韦(ABT-378)罗品那韦+利托那韦(ABT-378/r)mozenavir(DMP-450)那非那韦奈韦拉平Novapren肽T八肽序列PRO 140PRO 542TrisodiumphosphonoformatePNU-140690Probucol  GlaxoSmithKline(COMBIVIR)Bristol-Myers SquibbAbbottAbbott(KALETRA)AVID(Camden，NJ)Agouron(VIRACEPT)BoeheringerIngleheim(VIRAMUNE)Novaferon Labs，Inc.(Akron，OH)Peninsula Labs(Belmont，CA)ProgenicsProgenicsAstra Pharm.Products，IncPharmacia UpjohnVyrex HIV感染，AIDS，ARC(核苷逆转录酶抑制剂)CMV感染HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(非核苷逆转录酶抑制剂)HIV抑制剂AIDSHIV感染，AIDS，ARC(CCR5共同受体抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(附着抑制剂)CMV视网膜炎，HIV感染其它CMV感染HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV感染，AIDS
  RBC-CD4利托那韦(ABT-538)沙奎那韦斯塔夫定；d4T双脱氢脱氧胸苷T-1249TAK-779Tenofovirtipranavir(PNU-140690)TMC-120&TMC-125TMC-126ValaciclovirVirazoleribavirin Sheffield Med.Tech(Houston TX)Abbott(NORVIR)Hoffmann-LaRoche(FORTOVASE)Bristol-Myers Squibb(ZERIT)TrimerisTakedaGilead(VIREAD)Boehringer IngelheimTibotecTibotecGlaxoSmithKlineViratek/ICN(CostaMesa，CA) HIV感染，AIDS，ARCHIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(核苷逆转录酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(融合抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(可注射的CCR5受体拮抗剂)HIV感染，AIDS，ARC(核苷逆转录酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(非核苷逆转录酶抑制剂)HIV感染，AIDS，ARC(蛋白酶抑制剂)genital HSV&CMV感染无症状的HIV阳性，LAS，ARC
  齐多夫定；AZT   GlaxoSmithKline(RETROVIR)   HIV感染，AIDS，ARC，卡波西肉瘤与其它治疗组合(核苷逆转录酶抑制剂)
                                     免疫调节剂
  药物名称   生产商   适应症
  AS-101BropirimineAcemannanCL246,738EL10FP-21399γ干扰素粒细胞巨噬细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子HIV核心颗粒免疫刺激剂   Wyeth-AyerstPharmacia UpjohnCarrington Labs，Inc.(Irving，TX)American CyanamidLederle LabsElan Corp，PLC(Gainesville，GA)Fuki ImmunoPharmGenentechGenetics InstituteSandozHoeschst-RousselImmunexSchering-PloughRorer   AIDS晚期AIDSAIDS，ARCAIDS，卡波西肉瘤HIV感染抑制HIV与CD4+细胞融合ARC，与TNF组合(肿瘤坏死因子)AIDSAIDSAIDS，与AZT组合血清阳性HIV
    IL-2白介素-2IL-2白介素-2IL-2白介素-2(aldeslukin)免疫球蛋白静脉内(人)IMREG-1IMREG-2Imuthiol Diethyl DithioCarbamateα-2干扰素甲硫氨酸-脑啡肽MTP-PE胞壁酰-三肽粒细胞集落刺激因子RemunerCD4重组的可溶性人CD4rCD4-IgG杂合体重组的可溶性人CD4  CetusHoffman-La RocheImmunexChironCutter Biological(Berkeley，CA)Imreg(New Orleans，LA)Imreg(New Orleans，LA)Merieux InstituteSchering PloughTNI Pharmaceutical(Chicago，IL)Ciba-Geigy Corp.AmgenImmune Response Corp.GenentechBiogen  AIDS，与AZT组合AIDS，ARC，HIV，与AZT组合AIDS，CD4的胞计数增加儿科AIDS，与AZT组合AIDS，卡波西肉瘤，ARC，PGLAIDS，卡波西肉瘤，ARC，PGLAIDS，ARC卡波西肉瘤与AZT组合，AIDSAIDS，ARC卡波西肉瘤，AIDS，与AZT组合免疫治疗AIDS，ARCAIDS，ARCAIDS，ARC
干扰素α2aSK&F106528可溶性T4Thymopentin肿瘤坏死因子；TNFEtanercept英夫单抗 Hoffman-La RocheSmith KlineImmunobiologyResearch InstituteGenentechImmunex Corp(ENBREL)Centocor(REMICADE) 卡波西肉瘤，AIDS，ARC，与AZT组合HIV感染HIV感染ARC，与γ干扰素组合类风湿关节炎类风湿关节炎和克隆氏病
                                       抗感染剂
药物名称 生产商 适应症
氯林可霉素与伯氨喹氟康唑Pastille Nystatin PastilleOrnidyl Eflornithine依西酸喷他脒(IM&IV)甲氧苄啶甲氧苄啶/磺胺吡曲克辛依西酸喷他脒用于吸入 Pharmacia UpjohnPfizerSquibb Corp.Merrell DowLyphoMed(Rosemont，IL)Burroughs WellcomeFisons Corporation PCP隐球菌脑膜炎，念珠菌病预防口腔念珠菌病PCPPCP治疗抗菌抗菌PCP治疗PCP预防
  螺旋霉素Intraconazole-R51211曲麦克特   Rhone-PoulencJanssen Pharm.Warner-Lambert   组织胞浆菌病；隐球菌脑膜炎PCP
                                     其它
  药物名称  生产商 适应症
  道诺霉素重组人促红细胞生成素重组人生长激素白三烯B4受体拮抗剂乙酸甲地孕酮可溶性CD4蛋白和衍生物睾酮总肠道营养  NeXstar，SequusOrtho Pharm.Corp.Serono-Bristol-Myers Squibb-Alza，Smith KlineNorwich EatonPharmaceuticals 卡波西肉瘤与AZT治疗相关的严重贫血AIDS相关的消瘦恶病质HIV感染治疗与AIDS相关的厌食HIV感染AIDS相关的消瘦与AIDS相关的腹泻和吸收不良
可以理解的是，在用本文所披露的本发明的方法免疫之前可用于减少病毒负荷的抗病毒剂的组合的范围并不局限于以下表格，而是原则上包括与可用于治疗HIV感染或AIDS的任何药物组合物的组合。在作为治疗剂用于治疗HIV/AIDS时，抗病毒剂和其他试剂通常是以在本领域中所报导的常规剂量范围和方案使用的，包括披露于以下文献中的剂量：Physicians′Desk Reference，54th，edition，MedicalEconomics Company，2000。
抗病毒剂干扰病毒的生命周期，并因此影响病毒负荷的效果，特别是可以通过分析在治疗之前，期间和/或之后个体内存在的病毒拷贝的数量测定。这种测定可用作任何特定抗病毒剂治疗方案成功/失败的标志，并且构成了预测个体的诊断或临床进展的危险的基础。特定个体可以产生针对某些抗病毒剂的抗性，因此，重要的是监测任何特定抗病毒治疗方案的成功程度。病毒负荷是患者的细胞，血浆或组织中病毒/受病毒感染细胞的量的测量值。尽管没有与疾病尽管相关的绝对数量，血浆中某种水平的病毒业已被分类为表明了个体的感染状态。血浆HIV RNA水平的降低，与增加的存活率和降低的疾病进展的可能性相关。因此，似乎病毒的水平越高，疾病的发作越快。很高水平的病毒被认为是每毫升血浆存在大约100,000个拷贝或更多HIV RNA。高水平的病毒被认为是每毫升血浆存在大约30,000-50,000个拷贝的HIV RNA；而低水平的病毒被认为是每毫升血浆中存在大约5,000-10,000个拷贝的HIV RNA；Carpenter等，1996JAMA 276：147-154。有若干种方法可用于测定病毒负荷，无论是直接的或间接的测定，包括对患者血细胞，组织，血清和血浆进行的测定；例如，参见，″Reportof the NIH to Define Principles of Therapy of HIV infection″，Apr.24，1998 issue of Morbidity & Mortality Weekly Reports，47(No.RR-5)；revised June 17，1998；Voldberding & Jacobson，1992 AIDS Clinical Review(Marcel Dekker，Inc.，N.Y.).用于测定病毒RNA或DNA的现有技术包括，但不局限于以下方法：聚合酶链反应(″PCR″)扩增技术(例如，WO 94/20640；AMPLICOR；Sambrook等，1989 Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d Edition(Cold Spring Harbor press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Ausubel等，1994 Current Protocols in Molecular Biology(GreenPublishing Associates and John Wiley & Sons，New York，N.Y.；and PCR Protocols，1991(Cold Spring Harbor，N.Y.)；分支DNA(″bDNA″)试验(例如，WO 92/02526；U.S.5,451,503；U.S.4,775,619；QUANTIPLEX；VERSANT)；标准杂交(包括将探针用于杂交，例如，参见，EP 617,132)；以及抗体检测方法。病毒负荷应当在用抗病毒剂治疗之前测定。业已报导用抗病毒药物有效治疗能够在8周之内将病毒负荷降低90％，随后在6个月之内继续将病毒负荷降低到检测不到的水平。优选的是，在按照本发明的方法免疫之前使用的抗病毒剂能有效降低病毒负荷，它能够将病毒负荷降低到病毒稳态水平的1/3或更低；更优选的是，降低到″无法检测″水平(该术语是通过目前现有的技术和所采用的特定技术定义的)。
申请人业已确定了受控制的病毒血症的存在/不存在和将重组的，复制缺陷型腺病毒用于送递编码HIV抗原的核酸的免疫方案的优点之间的相关性。因此，本发明正是基于体内病毒负荷受到控制(即，病毒负荷水平业已相对某些以前的时间点的水平有所降低)的HIV-感染个体的免疫。因此，本发明的实施方案包括具有受控制的病毒血症之后或同时对HIV-感染个体的治疗性免疫；受控制的病毒血症被定义为病毒负荷的减少，它来自倾向的(免疫的)/先天免疫应答，用抗病毒剂或其他制剂进行的治疗等。业已确定腺病毒能够在受感染的免疫的受试者中实现病毒特异性细胞介导的免疫应答。
腺病毒是无包膜的，二十面体的病毒，业已在若干禽类和哺乳动物宿主中鉴定了这种病毒；Horne等，1959 J.Mol.Biol.1：84-86；Horwitz，1990 In Virology，eds.B.N.Fields and D.M.Knipe，pps.1679-1721。第一种人类腺病毒(Ads)是在四十年之前分离的。从那时起，业已分离了超过100种不同的腺病毒血清型，它们能够感染各种哺乳动物物种，其中的51种是来源于人类的；Straus，1984，In The adenoviruses，ed.H.Ginsberg，pps.451-498，New York：Plenus Press；Hierholzer等，1988 J.Infect.Dis.158：804-813；Schnurr and Dondero，1993，Intervirology；36：79-83；Jong等，1999 J Clin Microbiol.，37：3940-5。业已将所述人类血清型分类成六种亚型(A-F)，这种分类是基于多种生物学，化学，免疫学和结构标准，包括大鼠和猕猴红细胞的红细胞凝聚特性，DNA同源性，限制酶切割形式，G+C含量的百分比以及致瘤性；Straus，同上；Horwitz，同上。
业已对腺病毒基因组进行了充分表征。它由大约36,000碱基对的线性双链DNA分子组成，并且，尽管存在若干不同的血清型，在腺病毒基因组的总体组构方面存在某些共同的保守性，某些特定的功能具有类似的定位。
腺病毒一直是送递外源基因的非常诱人的目标。对腺病毒的生物学有非常充分的理解。在免疫感受态个体中，尚未发现腺病毒与严重的人类病理学相关。所述病毒在将它的DNA导入宿主细胞方面是非常有效的，并且能够感染多种细胞。另外，所述病毒能够以高病毒滴度大量产生。另外，通过去除/修饰病毒基因组的必要的早期区1(E1)使得所述病毒缺少(或基本上缺少)E1活性，因此使它不能够在预期的宿主/疫苗中复制，可以使所述病毒成为复制缺陷型；例如，参见，Brody等，1994 AnnNYAcadSci.，716：90-101。去除E1之外的腺病毒基因(例如，在3，E2和/或E4上)业已产生了具有较大的外源基因包含能力的腺病毒载体，业已证实所述腺病毒载体同样是有效的基因送递载体。因此，所述载体适用于本发明的方法。由于上述多种原因，业已将腺病毒载体广泛用作基因转移载体，用于疫苗和基因治疗目的。
目前，来自亚型C，Ad5和Ad2的两种充分表征的腺病毒血清型，是最广泛使用的基因送递载体。业已发现腺病毒血清型5是用于实现外源遗传物质表达的非常有效的腺病毒载体。野生型腺病毒血清型5序列是公知的，并且披露于文献中；参见，Chroboczek等，1992 J.Virology 186：280，该文献被收作本文参考。因此，本发明的一种具体实施方案是使用基于野生型腺病毒血清型5序列的腺病毒载体进行激发或加强施用的免疫方案；其中的病毒业已保藏在美国典型培养物保藏中心(″ATCC″)，ATCC保藏号为VR-5。另一种实施方案是根据本发明的免疫方案，其中，使用了腺病毒载体(Ad5，Ad6或其他形式)，参见WO 02/22080；该文献被收作本文参考。所述载体在E1区至少部分缺失，并且包括若干腺病毒包装重复(即，E1去除直到相当于野生型Ad5序列的碱基对大约450-458才开始)。业已发现，上述特性能大大增强病毒的生长特征/特性。
尽管本发明可以用腺病毒血清型2，5或6(ATCC保藏号VR-6；例如，参见WO 03/31588，公开日为2003年4月17日)有效进行，本发明要指出的是，可以将其他的和不同的人类和非人类腺病毒用于所披露的方法中，用于单独施用方案或用于与其他病毒载体，或多核苷酸/蛋白施用的组合施用。本领域技术人员能够方便地确定其他的和不同的腺病毒血清型(例如，存在于亚属A-F中的各种血清型；包括，但不局限于Ad7；Ad35(例如，参见EP1054064)；Ad24；Ad34；等)和非人血清型(包括，但不局限于灵长类腺病毒(例如，参见，Fitzgerald等，2003 J.Immunol.170(3)：1416-1422；Xiang等，2002 J.Virol.76(6)：2667-2675))；并且将它整合在本文所披露的方法中。需要其他Ad血清型，是因为它们具有逃避针对腺病毒血清型的中和抗体的能力，这种血清型在普通群体中是更常见的。其他血清型同样具有其他亲嗜性，这种亲嗜性可能导致在用于疫苗或基因治疗目的时诱导出色的免疫应答。
适用于本发明方法的腺病毒载体可以使用已知技术构建，如在以下文献中提到的技术：Hitt等，1997″Human adenovirus Vectors forGene Transfer into Mammalian Cells″Advances in Pharmacology40：137-206，该文献被收作本文参考。通常，制备包括感兴趣的异源核酸的质粒或穿梭载体，它包括与感兴趣的特定腺病毒同源的序列。所述穿梭载体和病毒DNA或包括克隆的病毒DNA的第二种质粒被共同转染到宿主细胞中，在这里发生同源重组，导致异源核酸整合到病毒核酸上。优选的穿梭载体和克隆的病毒基因组包括腺病毒和质粒部分。对于用于构建复制缺陷型载体的穿梭载体来说，所述腺病毒部分通常包括无功能的或缺失的E1和E3区，和基因表达盒，其侧翼是常见的限制位点。穿梭载体的质粒部分通常包括受原核启动子的转录控制的抗生素抗性标记。可以使用氨苄青霉素抗性基因，新霉素抗性基因和其他可以药用的抗生素抗性标记。为了有助于在原核生物中通过发酵高水平生产核酸，所述穿梭载体有利地包含原核生物的复制起点，并且具有高拷贝数量。有多种商业化原核克隆载体提供上述优点。优选除掉非必需的DNA序列。同样优选的是，所述载体不能在真核细胞中复制。这降低了核酸疫苗序列整合到受体基因组中的风险。当希望能将核酸表达限制在特定组织类型中，可以使用组织特异性启动子或增强子。穿梭载体和野生型腺病毒DNA(Ad主链载体)的同源重组，导致了腺病毒前质粒的产生。在线性化时，所述前质粒能够在PER.C6细胞或其他E1-补充细胞系中复制。一旦病毒复制结束，就可以收获受感染的细胞和培养基。然后纯化收获的材料，配制，并且在给宿主施用之前保存。
用于繁殖和拯救重组腺病毒的E1-补充细胞系应当提供病毒复制所必需的元件，无论所述元件是在细胞遗传物质中编码的或者是以反式形式提供的。另外，E1-补充细胞系和所述载体优选不包括重叠元件，所述元件使得载体的DNA和细胞系的DNA之间能够发生同源重组，有可能导致复制感受态病毒(或复制感受态腺病毒(″RCA″))。通常，E1-补充细胞是来自视网膜或肾脏的人类细胞，不过，任何细胞系都能够表达合适的E1，并且，任何其他关键的缺失区都能够用于产生适用于本发明方法的腺病毒。诸如羊水细胞的胚胎细胞特别适合制备E1补充细胞系。有若干种细胞系可以利用，包括，但不局限于已知的细胞系PER.C6(ECACC保藏号96022940)，911，293，和E1 A549。PER.C6细胞系披露于WO 97/00326(公开日为1997年1月3日)中，以及授权的美国专利号6,033,908中，这两份文献都被收作本文参考。PER.C6是用E1基因片段转导过的原代的人类成视网膜细胞系，它能补充复制缺陷(FG)腺病毒的产生，不过，它被设计成通过同源重组阻止复制感受态腺病毒的产生。293细胞披露于以下文献中：Graham等，1977 J.Gen.Virol 36：59-72，该文献被收作本文参考。为了繁殖和拯救非C型腺病毒载体，可以使用能表达E1区的细胞系，它补充在繁殖的病毒中缺失的E1区。另外，可以使用表达来自相同血清型的E1和E4的区域的细胞系；例如，参见，U.S.6,270,996。另一种替代方案是，在现有的E1-表达细胞系(例如，PER.C6，A549和293)中繁殖非典型C腺病毒。后一种方法涉及将关键的E4区掺入要繁殖的腺病毒上。关键的E4区是相同或者高度类似血清型的病毒中天然存在的，如同补充细胞系的E1基因产物(特别是E1B 55K区)，并且至少包括编码E4 Orf6的核酸。本领域技术人员很容易理解并且实施适合生产适用于本发明方法的重组的复制缺陷型腺病毒的多种其他方法。
适用于本发明的重组腺病毒包括编码HIV抗原的外源核酸或它的免疫学上相关的修饰形式。感兴趣的HIV抗原包括，但不局限于HIV的主要结构蛋白，如Gag，Pol，和Env(包括gp160，gp120和gp41)；调节蛋白(例如，Tat和Rev)；和辅助蛋白(例如，Vpu，Vpr，Vif和Nef)；前述物质的免疫学上相关的修饰形式/衍生物，以及它们的免疫原性部分。本发明还涉及编码HIV抗原的核酸的各种密码子优化的形式，包括密码子优化的HIV gag(包括，但不局限于p55形式的密码子优化的全长(″FL″)Gag和tPA-Gag融合蛋白)，HIV pol，HIVnef，HIV env，HIV tat，HIV rev，和选定的免疫学相关性的修饰。采用重组的，复制缺陷型腺病毒的具体实施方案包括披露于WO02/22080中的gag，pol，和nef抗原；该文献被收作本文参考。在WO 02/22080中技露了密码子优化的HIV-1 gag基因。在PCT国际申请WO 97/31115和WO 97/48370中披露了密码子优化的HIV-1 env基因。在2000年12月21日提交的美国申请流水号09/745,221，和WO01/45748中技露了密码子优化的HIV-1pol基因。在2000年12月15日提交的美国申请流水号09/738,782，和WO 01/43693中披露了密码子优化的HIV-1 nef基因。选择合适的核苷酸序列，包括，但不局限于上文所提到的编码特殊HIV抗原的序列，或它的在免疫学上相关的部分或修饰物/衍生物属于本领域技术人员的知识范围。本文所定义的″免疫学上相关的″或″抗原性″表示(1)至于病毒抗原，是指所述蛋白在施用时能够在个体内诱导可测量的免疫应答，这种免疫应答足以延缓病毒的繁殖和/或传播，和/或降低存在于个体内的病毒负荷；或(2)至于核苷酸序列，是指所述序列能够编码具有以上功能的蛋白。
除了通过重组的，复制缺陷型腺病毒送递一种感兴趣的蛋白或抗原之外，还可以通过独立的载体，或者通过相同的载体送递两种或两种以上蛋白或抗原。可以将多个基因/功能性等同物连接在合适的穿梭质粒上，用于制备包括多个开放读框的前腺病毒质粒。多个基因/功能性等同物的开放读框可操作地与不同的启动子和转录终止序列连接。在其他实施方案中，所述开放读框能够可操作地与单一启动子连接，所述开放读框可操作地与内部核糖体进入序列(IRES；参见WO95/24485)，或合适的其他元件连接，使得所述多个开放读框的转录能够使用一个启动子。在某些实施方案中，所述开放读框可以通过逐步的PCR或合适的替代方法融合在一起，以便将两个开放读框融合在一起。适用于本发明的gag-pol融合构建体和多种其他组合形式的施用方案的例子可以参见WO 02/22080；该文献被收作本文参考。获得并且有效利用若干种本领域已知的HIV抗原的不同组合构建的融合构建体并且有效地对其进行利用，属于本领域技术人员的知识范围，包括，但不局限于gag-pol-nef融合体。在本文所使用的所有构建体中，必须考虑病毒载体的包装限制。例如，业已证实5型腺病毒具有大约为野生型Ad5序列的105％的克隆容量上限。
外源核酸可来自任何HIV菌株，包括，但不局限于HIV-1和HIV-2，菌株A，B，C，D，E，F，G，H，I，O，IIIB，LAV，SF2，CM235，和US4；例如，参见，Myers等，eds.″Human Retroviruses and AIDS：1995(Los Alamos National Laboratory，Los Alamos NM 87545)；在此收作本文参考。适用于本文所披露方法的另一种HIV菌株是HIV-1菌株CAM-1；Myers等，eds.″Human Retroviruses and AIDS：1995，IIA3-IIA19，该文献被收作本文参考。该基因与进化枝B(北美/欧洲)序列的共有氨基酸序列非常类似。HIV基因序列可能以HIV-1的各种进化枝为基础；其具体例子是进化枝B和C。很多HIV菌株的基因序列可以从GenBank公开获得，并且HIV的初步的野外分离物可以从National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID)获得，该机构业已与Quality Biological(Gaithersburg，MD)签订了合同，可以提供所述菌株。菌株还可以从瑞士日内瓦的世界卫生组织(WHO)获得。
所述外源核酸可以是DNA和/或RNA，并且可以是双链或单链的。所述核酸可以沿E1平行(沿5′→3′方向转录)或反-平行(沿相对载体主链的3′→5′方向转录)方向插入。所述核酸可以是密码子优化的，以便在需要的宿主(例如哺乳动物宿主)中表达。所述异源核酸可以是表达盒形式的。基因表达盒通常包括(a)编码感兴趣的蛋白或抗原的核酸；(b)与编码蛋白的核酸可操作地连接的异源启动子；和(c)转录终止信号。在具体实施方案中，所述异源启动子是由真核RNA聚合酶识别的。适用于本发明的启动子的一种例子是立即早期人类巨细胞病毒启动子(Chapman等，1991 Nucl.Acids Res.19：3979-3986)。可用于本发明的启动子的其他例子是强免疫球蛋白启动子，EF1α启动子，鼠CMV启动子，Rous肉瘤病毒启动子，SV40早期/晚期启动子，和β肌动蛋白启动子。不过，本领域技术人员可以理解的是，能够在预期的宿主中实现表达的任何启动子都可用于本发明的方法中。所述启动子可以包括可调节序列，如Tet操纵子序列。在需要抑制基因转录时，可以使用例如提供具有调节转录和表达的可能性的序列。所述腺病毒基因表达盒可以包括转录终止序列；它的具体实施方案是牛生长激素终止/聚腺苷酸化信号(bGHpA)或如下定义的长度为50个核苷酸的短的合成polyA信号(SPA)：AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG(SEQ IDNO：3)。还可以将前导序列或信号肽整合到转基因中。在具体实施方案中，所述前导序列来自组织特异性血纤维蛋白溶酶原活化蛋白，tPA。
所述重组腺病毒可以单独施用，或者作为激发/加强型施用方案的一部分。在这种场合下，个体首先施用激发剂量的包括编码HIV抗原的核酸的病毒(或多核苷酸)载体，随后在经过某些时间之后，施用加强剂量的包括编码HIV抗原的核酸的病毒(或多核苷酸)载体；前提是激发或加强施用都采用了腺病毒载体。所述激发剂量能有效激发免疫应答，因此，随后在循环免疫系统中鉴定抗原时，所述免疫应答能够马上识别并且应答于对宿主体内的抗原。优选的是，激发和加强施用的病毒载体是不同的，以便逃避宿主针对第一次送递的载体的任何免疫。其他病毒载体的选择对于本文所披露方法的成功并不重要。能够送递抗原并且实现所述抗原的充分表达，以便诱导细胞介导的免疫应答的任何载体，应当足以激发或加强腺病毒介导的施用。混合模式的激发和加强接种方案会导致增强了的免疫应答，特别是当存在预先存在的抗载体免疫力。激发-加强施用通常涉及激发受试者(通过病毒载体，质粒，蛋白等)至少一次，允许经过预定长度的时间，然后加强(通过病毒载体，质粒，蛋白等)。通常采用多次激发，一般为1-4次，不过可以使用更多次。激发和加强之间的时间长度通常可以为大约4个月至1年，不过，正如本领域技术人员所了解的，可以使用其他时间方案。后续或加强施用同样可以以特定的时间间隔重复。
激发-加强方案可以采用不同的抗病毒血清型，不同来源的病毒，病毒载体/蛋白组合，以及病毒和多核苷酸施用的组合。所述方案的一种例子是包括第一种血清型的重组腺病毒载体的激发剂量，随后是包括第二种和不同血清型的重组腺病毒载体的加强剂量。所述实施方案的例子包括施用包括血清型5的重组腺病毒载体的激发剂量，随后施用包括血清型6的重组腺病毒载体的后续加强剂量；参见2003年3月12日提交的国际申请号PCT/US03/07727；该文献被收作本文参考。另一种实施方案包括将不同来源的不同的病毒载体用于激发和加强施用，前提是至少激发和/或加强施用使用了腺病毒载体。不同病毒载体的例子包括，但不局限于腺伴随病毒(″AAV″；例如，参见，Samulski等，1987J.Virol.61：3096-3101；Samulski等，1989J.Virol.63：3822-3828)；逆转录病毒(例如，参见，Miller，1990 Human GeneTher.1：5-14；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology)；痘病毒(包括，但不局限于复制-受损的NYVAC，ALVAC，TROVAC和MVA载体，例如，参见，Panicali & Paoletti，1982 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：4927-31；Nakano等1982 Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：1593-1596；Piccini等，In Methods in Enzymology 153：545-63(Wu & Grossman，eds.，Academic Press，San Diego)；Sutter等，1994 Vaccine 12：1032-40；Wyatt等，1996 Vaccine15：1451-8；和美国专利号4,603,112；4,769,330；4,722,848；4,603,112；5,110,587；5,174,993；和5,185,146)；和甲病毒(例如，参见，WO 92/10578；WO 94/21792；WO 95/07994；和美国专利号5,091,309和5,217,879).采用腺病毒和痘病毒载体送递HIV抗原的激发-加强方案披露于2003年3月12日提交的国际申请号PCT/US03/07511中；该文献被收作本文参考。上述免疫方案的替代方案是采用多核苷酸施用(包括，但不局限于″裸露DNA″或促进的多核苷酸送递)与腺病毒激发和/或强化的组合；例如，参见，Wolff等，1990 Science 247：1465，和以下的专利文献：美国专利号5,580,859；5,589,466；5,739,118；5,736,524；5,679,647；WO 90/11092和WO 98/04720。另一种替代方案是将重组蛋白施用与腺病毒一起应用在激发-加强方案中。
潜在的宿主/疫苗接种者/个体包括，但不局限于灵长类，特别是人类和非人灵长类，并且包括在商业上或在家养兽医行业方面重要的任何非人哺乳动物。
含有重组病毒载体的组合物可以包括生理学上可接受的成分，如缓冲剂，生理盐水或磷酸缓冲的盐溶液，核糖，其他盐和聚山梨醇酯。在某些实施方案中，制剂具有：2.5-10mM TRIS缓冲液，优选大约5mMTRIS缓冲液；25-100mM NaCl，优选大约75mM NaCl；2.5-10％蔗糖，优选大约5％蔗糖；0.01-2 mM MgCl2；和0.001％-0.01％polysorbate80(来源于植物)。PH范围应当为大约7.0-9.0，优选大约8.0。本领域技术人员可以理解的是，可以将其他常见疫苗赋形剂用在制剂中。在具体实施方案中，所述制剂包括5mM TRIS，75mM NaCl，5％蔗糖，1mM MgCl2，0.005％polysorbate 80，pH8.0。它的pH和二价阳离子组成接近病毒稳定性的最佳值，并且能使病毒吸附在玻璃表面上的可能性最小。在肌内注射时它不会导致组织刺激。在使用之前它优选冷冻的。
存在于要导入疫苗受体体内的疫苗组合物中的病毒颗粒的数量取决于所使用的转录和翻译启动子的强度，并且取决于表达的基因产物的免疫力。一般，将免疫上或预防上有效剂量的1×107-1×1012颗粒，优选大约1×1010-1×1011颗粒直接施用到肌肉组织中。还可以使用皮下注射，真皮内注射，通过皮肤压入，以及其他施用方式，如腹膜内，静脉内，或吸入送递。其他试剂的肠胃外施用，如静脉内，肌内，皮下或其他施用方式，能够强化或拓宽免疫应答(例如，白介素-12)，同时或随后肠胃外导入本发明的疫苗组合物同样是有利的。
提供以下非限定性实施例是为了说明本发明。
实施例1
构建包括SIV gag基因的Ad5前腺病毒质粒
A.构建腺病毒穿梭载体
SIV gag序列最初是从菌株mac239(Kestler等，1990 Science248：1109-1112)中分离的。化学合成密码子优化的DNA序列(SEQ IDNO：1)，并且克隆到pV1R-CMVI-SIVgag(Egan等，2000 J.Virol.74：7485-7495)上。SIV gag DNA是通过用限制性内切核酸酶BglII消化从质粒pV1R-CMVI-SIVgag中分离的。然后对Bg1II片段进行凝胶纯化，并且连接到质粒pMA1(也被称为MRKpdelE1+CMVmin+BGHpA(str.))上的BglII位点上；所述质粒是包括从1号碱基对(″bp″)到5792号碱基对的Ad5序列的质粒，所述序列去除了从451-3510的E1序列，所述质粒还包括沿E1平行方向插入所述E1缺失中的HCMV启动子和BGHpA，它们被一个独特的BglII位点分隔开。这种方法产生了Ad5前质粒pMA1-hCMV8-SIVgag，它随后被重新命名为MRKpA1-hCMV8-SIVgag。通过限制酶和DNA测序证实了MRKpA1-hCMV8-SIVgag(pMA1-hCMV8-SIVgag)的遗传结构。
B.构建前腺病毒质粒
用限制酶SgrAI和BstZ17I消化穿梭质粒MRKpA1-hCMV8-SIVgag(pMA1-hCMV8-SIVgag)，并且随后与线性化的(ClaI消化的)Ad5主链质粒，MRKpAd(E1-/E3-)ClaI共同转化入大肠杆菌菌株BJ5183。从BJ1583中回收所得到的MRKpAd-hCMV8-SIVgag，并且再次转化入感受态大肠杆菌Stb12，用于大规模生产。通过限制酶消化证实MRKpAd-hCMV8-SIVgag的遗传结构。ELISA和western结果证实了SIVgag基因表达。
实施例2
构建包括SIV nef基因的Ad5前腺病毒质粒
A.产生SIV nefG2A突变，并且构建腺病毒穿梭载体
SIV nef序列最初是从菌株mac251(Kestler，等，1988 Nature331：619-622)中分离的。化学合成密码子优化的DNA序列(SEQ IDNO：2)，并且克隆到pA1-To-SIVnef上。质粒pA1-To-SIVnef使用了人CMV启动子，它是通过四环素操纵子(To)和牛生长激素生长转录终止子/聚腺苷酸化信号调节的，作为SIV nef基因的表达调节元件。通过PCR扩增，使用在每个末端包含G CC和BclI位点的引物将编码SIV nef的甘氨酸(G)的第二个密码子GCC转化成编码丙氨酸(A)的GGT。新的基因被命名为nefGCC(新密码子)或nefG2A(氨基酸改变)。使用包括编码第二个密码子位置的GCC引物对nef基因进行PCR扩增。用BclI消化PCR产物，凝胶纯化，并且连接到MRKAd5穿梭质粒MRK2的BglII限制性内切核酸酶位点上(BclI和BgIII的粘端是相容的)，产生质粒MRK2-hCMV-SIVnefGCC。通过DNA测序和限制酶消化验证所述质粒的遗传结构。
B.构建前腺病毒质粒
用限制酶BstZ171和SgrAI消化穿梭质粒MRK2-hCMV-SIVnefGCC，并且与线性化的(ClaI消化的)Ad5主链质粒pHVE3共同转化入大肠杆菌菌株BJ1583。从BJ1583中回收得到的MRKpAd-E3-hCMV-SIVnef(GCC)，并且再次转化入感受态大肠杆菌Stb12，用于大规模生产。通过限制酶消化证实前质粒MRKpAd-E3-hCMV-SIVnef(GCC)的遗传结构。Western结果证实了SIV nef GCC基因表达。
实施例3
制备研究级重组腺病毒
为了制备用于临床前动物研究的病毒，前腺病毒质粒作为传染性毒粒在PER.C6贴壁单层细胞培养物中拯救。为了拯救传染性病毒MRKAd5SIVgag，用限制酶PacI(New England Biolabs)消化30μg的MRKpAd-hCMVS-SIVgag，并且使用GenePorter2试剂盒(GTS，GeneTherapy Systems，Inc.)转化入PER.C6细胞的T75烧瓶。为了拯救传染性病毒MRKAd5SIVnefGCC，用限制酶Pad(New EnglandBiolabs)消化30μg的前腺病毒质粒MRKpAd-E3-hCMV-SIVnef(GCC)，并且使用磷酸钙共沉淀技术(Cell Phect Transfection Kit，Amersham Pharmacia Biotech Inc.)转化入PER.C6细胞的T75烧瓶。PacI消化将病毒基因组从质粒序列中释放出来，允许在进入PER.C6细胞中之后进行病毒复制。在观察到完全的病毒细胞致病效应(CPE)之后，收获受感染的细胞和培养基。通过在PER.C6贴壁单层细胞培养物中多次传代，扩增病毒原种。在最后一次传代时，通过CsCl超速离心从细胞沉淀中纯化病毒，并且表征。通过分析测定确定病毒含量，该测定能够定量病毒颗粒的病毒基因组。通过组织培养感染剂量50％(TCI50)测定，确定病毒的传染性。通过对纯化的病毒DNA进行限制性内切核酸酶(HindIII+Pad)分析证实纯化病毒的性质和纯度。为了进行限制分析，用P33-dATP对消化过的病毒DNA进行末端标记，通过琼脂糖凝胶电泳进行大小分离，并且通过放射性自显影观察。通过ELISA或用从体外生长的病毒感染的哺乳动物细胞中收集的材料进行western分析，监测SIV gag和nefGCC(G2A)的基因表达。将MRKAd5SIVgag和MRKAd5SIVnefGCC(MRKAd-E3-hCMV-SIVnef(GCC))的原种用于在小鼠和猕猴中进行免疫学评估。
实施例4
构建包括SIV gag基因的Ad6前腺病毒质粒
将用于制备携带SIV gag基因的MRKAd5前质粒的MRKAd5穿梭质粒pMRKhCMVSIVgagbGH(同样被称为MRKpA1-hCMV8-SIVgag或pMA1-hCMV8-SIVgag)用于制备相应的MRKAd6前质粒。用EcoRI和StuI消化穿梭质粒pMRKhCMVSIVgagbGH，然后与线性化的(ClaI消化的)Ad6主链质粒pMRKAd6E1-共同转化入大肠杆菌菌株BJ5183。将回收的质粒再次转化入感受态大肠杆菌Stb12，用于大规模生产。通过限制酶消化证实前质粒pMRKAd6E1-hCMVSIVgagbGH的遗传结构。
实施例5
构建包括SIV nef GCC基因的Ad6前腺病毒质粒
将用于制备携带SIV nef(GCC)的MRKAd5前质粒的MRKAd5穿梭质粒pMRKhCMVSIVnef(G2A)(也被称为MRK2-hCMV-SIVnef(GCC))，用于制备相应的MRKAd6前质粒。用EcoRI和BstXI消化穿梭质粒pMRKhCMVSIVnef(G2A)，然后与线性化的(ClaI消化的)Ad6主链质粒pMRKAd6E1-共同转化入大肠杆菌菌株BJ5183。将回收的质粒再次转化入感受态大肠杆菌Stb12，用于大规模生产。通过限制酶消化证实前质粒pMRKAd6E1-hCMVSIVnefbGH(GCC或G2A)的遗传结构。
实施例6
制备研究级重组MRKAd6gag和nef
为了制备用于临床前免疫原性研究的病毒，以传染性毒粒形式在PER.C6贴壁单层细胞培养物中拯救前腺病毒质粒pMRKAd6E1-hCMVSIVgagbGH和pMRKAd6E1-hCMVSIVnefbGH。为了拯救传染性病毒，用限制酶PacI(New England Biolabs)部分消化30μg的pMRKAd6E1-hCMVSIVgagbGH或pMRKAd6E1-hCMVSIVnefbGH，并且使用磷酸钙共沉淀技术(Cell Phect Transfection Kit，AmershamPharmacia Biotech Inc.)转化PER.C6细胞的T75烧瓶。pMRKAd6E1-hCMVSIVgagbGH和pMRKAd6E1-hCMVSIVnefbGH各自包括三个PacI限制位点，在每个ITR各一个，并且有一个位于早期片段3上。使用有利于前Ad质粒线性化的消化条件(仅消化三个PacI位点中的一个)，因为只需要释放一个ITR，在进入PER.C6细胞之后就能启动病毒DNA复制。在完成病毒细胞致病效应(CPE)观察之后，收获受感染的细胞和培养基。通过在PER.C6贴壁单层细胞培养物中多次传代，扩增病毒原种。在最后一次传代时，通过CsCl超速离心从细胞沉淀中纯化病毒，并且表征。通过分析测定确定病毒含量，该测定能够定量病毒颗粒的病毒基因组。通过组织培养感染剂量50％(TCI50)测定，确定病毒的传染性。通过对纯化的病毒DNA进行限制性内切核酸酶(HindIII+Pad)分析证实纯化病毒的性质和纯度。为了进行限制分析，用P33-dATP对消化过的病毒DNA进行末端标记，通过琼脂糖凝胶电泳进行大小分离，并且通过放射性自显影观察。通过ELISA或用从体外生长的病毒感染的哺乳动物细胞中收集的材料进行western分析，监测SIV gag和nef(GCC或G2A)的基因表达。将MRKAd6hCMVSIVgagbGH和MRKAd6hCMVSIVnefbGH(GCC或G2A)的原种用于在小鼠和猕猴体内进行免疫学评估。
实施例7
药物制剂
按以下方法每周制备化合物(N-1-(7-{[(4-氟苄基)氨基]羰基}-8-羟基-1，6-萘啶-5-基)-N-1-，N-2-，N-2-三甲基乙二胺的新鲜溶液，参见美国申请流水号US 2003/0055071，公开日为2003年3月20日)。精确地称取化合物，并且溶解在蒸馏过的，去离子水中，浓度为5.24mg/mL。当液体澄清时溶解完成，并且不包括可见的化合物颗粒。
实施例8
病毒，测试药物和疫苗的施用
本研究包括(4)个组的mamuA01(+)猕猴。在第0天，所有组都通过直肠内途径感染SIVmac239。病毒是按以下方法制备的。病毒稀释在10％胎牛血清/RPMI 1640细胞培养基中，使最终浓度为3.2×10-5TCID50/mL。将1mL体积填充到独立的注射器中，用于直肠内施用。在第30天，第1和3组的动物开始BID剂量的(N-1-(7-{[(4-氟苄基)氨基]羰基}-8-羟基-1，6-萘啶-5-基)-N-1-，N-2-，N-2-三甲基乙二胺。每只猴子每天使用20.98mg/kg化合物，所述化合物是通过鼻-胃管送递的。在第122和150天，第1和2组提供肌内剂量的5×1010vp MRKAd5-SIVgag+5×1010vpMRKAd5-SIVnef混合物，然后在第234天用5×1010vp MRKAd6-SIVgag+5×1010vp MRKAd6-SIVnef的混合物进行加强。在所有场合下，每一种疫苗的总剂量都悬浮在1mL缓冲液中。对猕猴进行麻醉(氯胺酮/甲苯噻嗪)，并且使用结核菌素注射器(Becton-Dickinson)将所述疫苗以0.5-mL的等份剂量肌内送递到三角肌中。第4组既不接受药物也不接受免疫。血浆，血清，和外周血单核细胞(PBMC)是用免疫方案期间的若干时间点收集的血液样品制备的。所有动物护理和处理是按照Institutional Animal Careand Use Committee批准的标准进行的，按照在以下文献中规定的原则进行：Guide for Care and Use of Laboratory Animals，Instituteof Laboratory Animal Resources，National Research Council。
实施例9
ELISPOT分析
按照以前披露的方法(Allen等，2001 J.Virol.75(2)：738-749)对猕猴进行IFN-γELISPOT分析，对所述方法进行了某些改进。为了进行抗原特异性刺激，用包括具有10-aa的重叠完整的HIV-1gag序列(Synpep Corp.，Dublin，CA)的20-aa肽制备肽合并物。向每一个孔中添加50μL的2-4×105外周血单核细胞(PBMCs)；使用Beckman Coulter Z2颗粒分析仪对细胞进行计数，将较小的尺寸截断设定为80飞升(″fL″)。将50μL的培养基或gag肽合并物以每种肽8μg/mL的浓度添加到PBMC中。所述样品在37℃，5％CO2中温育20-24小时。相应形成斑点，并且使用定制的显像仪和基于ImagePro platform平台的自动计算子程序(Silver Spring，MD)处理平板，所得的计数针对106细胞的输入值归一化。
实施例10
细胞内细胞因子染色
向存在于完全RPMI培养基(装在17×100mm园底聚丙烯试管(Sarstedt，Newton，NC))中的1ml的2×106PBMC/mL中，添加抗-hCD28(克隆L293，Becton-Dickinson)和抗-hCD49d(克隆L25，Becton-Dickinson)单克隆抗体，使最终浓度为1μg/mL。为了进行gag-特异性刺激，添加10μL的肽合并物(浓度为0.4mg/mL每种肽)。所述试管在37℃下温育1小时，此后，添加20μL的5mg/mL的brefeldin A(Sigma)。所述细胞在37℃，5％CO2，90％的湿度下温育16小时。将4mL冰冷的PBS/2％FBS添加到每只试管中，并且以1200rpm的速度离心10分钟使细胞沉淀。将所述细胞重新悬浮在PBS/2％FBS中，并且用若干种荧光标记的mAbs对表面标记进行染色(30分钟，4℃)：每只试管20μL抗-hCD3-APC，克隆FN-18(Biosource)；20μL抗-hCD8-PerCP，克隆SK1(Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)；和20μL抗-hCD4-PE，克隆SK3(Becton Dickinson)。来自这一阶段的样品处理是在黑暗中进行的。洗涤细胞，并且在750μL1×FACS Perm缓冲液(Becton Dickinson)中在室温下温育10分钟。使所述细胞沉淀，并且重新悬浮在PBS/2％FBS中，并且添加0.1μg的FITC-抗-hIFN-γ，克隆MD-1(Biosource)。在温育30分钟之后，洗涤细胞，并且重新悬浮在PBS中。使用Becton DickinsonFACSCalibur仪器的所有四种颜色的通道分析样品。为了分析所述数据，首先门控低侧向和正向散射的淋巴细胞群体；将细胞因子-阳性事件的常用荧光截断值用于CD4+和CD8+群体，并且用于样品的模拟和gag-肽反应试管。
实施例11
病毒负荷测定
病毒负荷是用EDTA-处理的血浆测定的，测定是通过在Consolidated Laboratory Services，Van Nuys进行的分析而实现的，CA表示使用ABI Prism 7700序列检测系统(Leutenegger，等，2001AIDS Res.Human Retro.17(3)：243-51；Hofmann-Lehmann)的SIV实时RNA水平。这种实时测定方法被证实是精确的，灵敏的，并且在八个数量级上是可再现的，可以在研究期间有效表征病毒负荷。这种实验能够特异性地检测SIV病毒负荷而不是HIV。线性范围为101-109拷贝数/mL。
实施例12
结果
本研究中的所有动物都在用SIVmac239感染的前17天内(图1A，2A，3A，4A)表现出最高水平的病毒复制(3×106-9×108病毒拷贝数量/mL)。在第1组(图1A)中，6只动物中的3只对从第30天开始的药物治疗有反应；病毒负荷降低了3个或3个以上数量级，达到基线。在第3组(图3A)，6只动物中有2只对药物治疗有强烈反应，病毒负荷降低到基线水平。
在第122和150天，第1组和第2组接受MRKAd5-SIVgag加MRKAd5-SIVnef免疫，然后在第234天使用MRKAd6-SIVgag加MRKAd6-SIVnef的混合物。在第111，137，158和255天通过细胞内细胞因子染色评估抗-gag T细胞应答。结果归纳在图1B，1C，2B，2C，3B，3C，4B，和4C中。在第1组(图1B，1C)，用基于MRKAd5的疫苗免疫，在动物02-R052，02-R050和02-R056诱导了gag-特异性细胞毒性CD8+和辅助CD4+应答的显著增加(大约10倍)。所有3只动物都具有药物诱导的病毒负荷水平的控制。在用基于MRKAd6的疫苗免疫时，在这些动物中gag-特异性T细胞应答的增强同样是明显的。在CD8+和CD4+应答方面表现出增强的唯一的其他动物是02-R053；所述动物没有反应于连续药物治疗的病毒负荷的控制。不过，在施用MRKAd6后续疫苗时，不会持续T细胞应答的增强。在没有进行药物治疗的第2组(图2B，2C)中，2只动物(02-R058，02-R047)同时表现出比该组中其他动物更好的病毒控制，并且这2只动物在MRKAd5和MRKAd6免疫之后表现出针对gag的CD8+和CD4+应答的显著增强。正如所预料的，第3组和第4组的T细胞应答没有明显的波动。一般，T细胞应答水平在第1组中最强，其次是第2组，再次是第3组，最后是第4组。在所有四组中都观察到了抗-nef T细胞应答的类似的趋势(数据未发表)。
同样通过将gag肽合并物分成10个更小的亚合并物，用ELISPOT分析评估了T细胞应答的广度。每一个表示所述蛋白的大约50-aa片段，从N-末端到C-末端。在第74，158和269天对所述亚合并物检测动物的PBMCs。图5表示对每一只动物在特定时间点检测到阳性抗原-特异性反应的亚合并物的数量。最广泛的T细胞应答出现在第1组，特别是出现在动物(02-R052，02-R050，02-R056)中，它们表现出药物诱导的病毒控制，和对疫苗的最强的免疫应答。
以上发现支持了以下概念，即表现出受控制的病毒血症的感染个体的腺病毒-介导的免疫能够提供性质非常广泛的，很高水平的病毒特异性CD8+和CD4+T细胞应答。这种诱导增强的免疫应答的方法应当有助于感染个体保持低病毒负荷，因此，提供减弱个体对抗病毒治疗的依赖性的前景。
序列表
<110>Merck & Co.，Inc.
<120>HIV-感染个体的治疗性免疫
<130>21534 PCT
<150>60/504,522
<151>2003-09-18
<160>3
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1533
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子优化的编码SIV mac239 gag的核酸序列
<400>1
atgggggtga ggaactctgt gctgtctggc aagaaggctg atgagctgga gaagatcagg 60
ctgaggccca atggcaagaa gaagtacatg ctgaagcatg tggtgtgggc tgccaatgag 120
ctggacaggt ttggcctggc tgagtccctg ctggagaaca aggagggctg ccagaagatc 180
ctgtctgtgc tggcccccct ggtgcccaca ggctctgaga acctgaagtc cctgtacaac 240
acagtgtgtg tgatctggtg catccatgct gaggagaagg tgaagcacac agaggaggcc 300
aagcagattg tgcagaggca cctggtggtg gagacaggca ccacagagac catgcccaag 360
acctccaggc ccacagcccc ctcctctggc agggggggca actaccctgt gcagcagatt 420
gggggcaact atgtgcacct gcccctgtcc cccaggaccc tgaatgcctg ggtgaagctg 480
attgaggaga agaagtttgg ggctgaggtg gtgcctggct tccaggccct gtctgagggc 540
tgcaccccct atgacatcaa ccagatgctg aactgtgtgg gggaccacca ggctgctatg 600
cagatcatca gggacatcat caatgaggag gctgctgact gggacctgca gcacccccag 660
cctgcccccc agcagggcca gctgagggag ccctctggct ctgacattgc tggcaccacc 720
tcctctgtgg atgagcagat ccagtggatg tacaggcagc agaaccccat ccctgtgggc 780
aacatctaca ggaggtggat ccagctgggc ctgcagaagt gtgtgaggat gtacaacccc 840
accaacatcc tggatgtgaa gcagggcccc aaggagccct tccagtccta cgtggacagg 900
ttctacaagt ccctgagggc tgagcagaca gatgctgctg tgaagaactg gatgacccag 960
accctgctga tccagaatgc caaccctgac tgcaagctgg tgctgaaggg cctgggggtg 1020
aaccccaccc tggaggagat gctgacagcc tgccaggggg tggggggccc tggccagaag 1080
gccaggctga tggctgaggc cctgaaggag gccctggccc ctgtgcccat cccctttgct 1140
gctgcccagc agaggggccc caggaagccc atcaagtgct ggaactgtgg caaggagggc 1200
cactctgcca ggcagtgcag ggcccccagg aggcagggct gctggaagtg tggcaagatg 1260
gaccatgtga tggccaagtg ccctgacagg caggctggct tcctgggcct gggcccctgg 1320
ggcaagaagc ccaggaactt ccccatggcc caggtgcacc agggcctgat gcccacagcc 1380
ccccctgagg accctgctgt ggacctgctg aagaactaca tgcagctggg caagcagcag 1440
agggagaagc agagggagtc cagggagaag ccctacaagg aggtgacaga ggacctgctg 1500
cacctgaact ccctgtttgg gggggaccag taa                              1533
<210>2
<211>744
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子优化的编码具有G2A突变的SIV mac251 nef的核酸序列
<400>2
atggccggag ctatttccat gaggcggtcc aagccggctg gagatctgcg acagaaactc 60
ttgcgggcgc gtggagagac ttatgggaga ctcttaggag aggtggaaga tggatcctcg 120
caatccctag gaggattagg caagggcttg agctcacgct cttgtgaggg acagaaatac 180
aatcaggggc agtatatgaa tactccatgg agaaacccag ctgaagaaa  agaaaaatta 240
gcatacagaa aacaaaatat ggatgatata gatgaggaag atgatgactt ggtaggggta 300
tcagtgaggc caaaagttcc cctaagagca atgacttaca aattggcaat agatatgtct 360
cattttataa aagaaaaggg gggactggaa gggatttatt acagtgcaag aagacataga 420
atcttagaca tgtacttaga aaaggaagaa ggcatcatac cagattggca ggattacacc 480
tcaggaccag gaattagata cccaaagaca tttggctggc tatggaaatt agtccctgta 540
aatgtatcag atgaggcaca ggaggatgag aggcattatt taatgcagcc agctcaaact 600
tccaagtggg atgacccttg gggagaggtt ctagcgtgga agtttgatcc aactctagcc 660
tacacttatg aggcatatgc tagataccca gaagagttgg aagcaagtca ggcctgtcag 720
aggaagaggt tagaagaagg ctaa                                        744
<210>3
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>短的合成poly A信号
<400>3
aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg             49

Claims (12)

1.一种用于在感染了HIV的个体中诱导针对人免疫缺陷病毒(″HIV″)的细胞介导的免疫应答的方法，该方法包括：
给HIV-感染的个体施用重组的，复制缺陷型腺病毒，该病毒包括编码HIV-1抗原的核酸；
其中，在施用之前所述个体经历了HIV病毒拷贝数量的减少。
2.如权利要求1的方法，其中，所述HIV病毒拷贝数量的减少是至少部分是由于用抗病毒剂进行的治疗。
3.如权利要求2的方法，其中，所述抗病毒剂包括下列成分中的一种或多种：蛋白酶抑制剂，逆转录酶抑制剂，和整合酶抑制剂。
4.如权利要求2的方法，其中，所述抗病毒剂包括蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂的组合。
5.如权利要求1的方法，它包括给所述个体施用和再次施用腺病毒。
6.如权利要求1的方法，它还包括施用包括编码HIV抗原的核酸的其他血清型的腺病毒。
7.如权利要求1的方法，它还包括施用包括编码HIV抗原的核酸的具有不同病毒来源的病毒。
8.如权利要求1的方法，其中，所述抗原源于HIV gag。
9.如权利要求1的方法，其中，所述抗原源于HIV nef。
10.如权利要求1的方法，其中，所述抗原源于HIV pol。
11.如权利要求1的方法，其中，所述抗原源于HIV env。
12.如权利要求1的方法，它还包括施用包括编码HIV抗原的核酸的多核苷酸组合物。
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