DE69837118T2 - Ein Verfahren zum Screenen von Substanzen hinsichtlich ihres Effekts auf cAMP Spiegel basierend auf intrazellulärer Translokation von PKA - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Hilfsmittel zum Gewinnen von quantitativen Informationen über einen Einfluss auf eine cAMP-Konzentration, insbesondere einen Einfluss hervorgerufen durch Inkontaktbringen oder Inkubieren der Zelle mit einem Stoff, der die cAMP-Konzentration beeinflusst, wobei die cAMP-Konzentration durch Neuverteilung von PKAc in der Zelle deutlich wird. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Gewinnen von quantitativen Informationen über einen Einfluss auf einen intrazellulären Weg, das die Neuverteilung mindestens einer Komponente einschließt, die mit dem Weg assoziiert ist. Das Verfahren der Erfindung kann als eine sehr effiziente Vorgehensweise zum Testen oder Entdecken des Einflusses eines Stoffs auf einen physiologischen Prozess verwendet werden, beispielsweise in Verbindung mit dem Screenen nach neuen Arzneimitteln, dem Testen von Stoffen auf Toxizität, zum Identifizieren von Arzneimitteltargets (drug targets) von bekannten oder neuen Arzneimitteln. Andere wertvolle Verwendungen des Verfahrens und der Technologie der Erfindung werden für den Fachmann auf Basis der folgenden Offenbarung deutlich.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Intrazelluläre Wege werden durch eine Kaskade von Komponenten streng reguliert, die einer Modulation in einer zeitlich und räumlich charakteristischen Weise unterliegen. Bestimmte Krankheitszustände können einer veränderten Aktivität von einzelnen signalvermittelnden Komponenten zugeordnet werden (d.h. Proteinkinasen, Proteinphosphatasen, Transkriptionsfaktoren). Diese Komponenten bieten sich daher selbst als attraktive Ziele für eine therapeutische Intervention an.
  • Proteinkinasen und -phosphatasen sind gut beschriebene Komponenten verschiedener intrazellulärer Signalwege. Von der katalytischen Aktivität von Proteinki nasen und -phosphatasen wird angenommen, dass sie in praktisch allen regulierbaren zellulären Prozessen eine Rolle spielen. Obwohl die Beteiligung von Proteinkinasen in der zellulären Signalweitergabe und -regulation Gegenstand extensiver Studien war, ist ein detailliertes Wissen über beispielsweise die exakten zeitlichen und räumlichen Merkmale von Signalübertragungs-Ereignissen aufgrund des Fehlens einer geeigneten Technologie oft schwierig zu erhalten.
  • Von neuen Wegen zum Überwachen der spezifischen Modulation von intrazellulären Wegen in intakten, lebenden Zellen wird angenommen, dass sie neue Möglichkeiten in der Entdeckung von Arzneimitteln, der funktionellen Genomforschung (functional genomics), Toxikologie, dem Überwachen von Patienten usw. bereitstellen.
  • Es ist wahrscheinlich, dass das räumliche Zusammenwirken der Proteinkinase-Aktivität für den hohen Grad der Spezifität von individuellen Proteinkinasen essentiell ist. Die durch Proteinkinasen vermittelte Phosphorylierung wird durch Phosphatase-Aktivität ausgeglichen. Auch innerhalb der Phosphatasen-Familie wurde eine Translokation beobachtet, z.B. die Translokation von PTP2C zu Membranverwerfungen [(Cossette et al. 1996)], und in ähnlicher Weise ist es wahrscheinlich, dass sie für Phosphatase-Aktivität bezeichnend ist.
  • Proteinkinasen zeigen oft vor, während und nach der Aktivierung eine spezifische intrazelluläre Verteilung. Von dem Überwachen von Translokationsprozessen und/oder der Neuverteilung von individuellen Proteinkinasen oder Untereinheiten davon ist es daher wahrscheinlich, dass es für ihre funktionelle Aktivität bezeichnend ist. Eine Verbindung zwischen Translokation und katalytischer Aktivierung ist für Proteinkinasen wie die Diacyl-Glycerol-(DAG)-abhängige Proteinkinase C (PKC), die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) [(DeBernardi et al. 1996)] und die Mitogen-aktivierte Proteinkinase ERK1 [(Sano et al. 1995)] gezeigt worden.
  • Üblicherweise verwendete Verfahren zum Nachweisen von intrazellulärer Lokalisation/Aktivität von Proteinkinasen und -phosphatasen sind Immunoprezipitation, Western-Blotting und immunocytochemischer Nachweis.
  • Wenn die Familie von Diacyl-Glycerol (DAG)-abhängigen Proteinkinasen C (PKCs) als ein Beispiel genommen wird, so ist gezeigt worden, dass die individuellen PKC-Isoformen, die auf verschiedene Gewebe und Zellen verteilt sind, unterschiedliche Aktivator-Erfordernisse aufweisen und eine differenzielle Translokation als Antwort auf Aktivierung zeigen. Katalytisch inaktive DAG-abhängige PKCs sind im Allgemeinen im Zytoplasma verteilt, während sie nach Aktivierung translozieren, um mit verschiedenen zellulären Komponenten assoziiert zu werden, z.B. Plasmamembran ((Farese, 1992), (Fulop Jr. et al. 1995)], Kern [(Khalil et al. 1992)], Cytoskelett [(Blobe et al. 1996)]. Das Translokations-Phänomen, das für PKC-Aktivierung bezeichnend ist, ist unter Verwendung unterschiedlicher Ansätze überwacht worden: a) Immunocytochemie, wobei die Lokalisierung individueller Isoformen nach Permeabilisierung und Fixierung der Zellen nachgewiesen werden kann [(Khalil et al. 1992)]; und b) Markieren (tagging) aller DAG-abhängiger PKC-Isoformen mit einem Fluoreszenz-markierten Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) [(Godson et al. 1996)]; und c) chemisches Markieren von PKC b1 mit dem Fluorophor Cy3 [(Bastiaens & Jovin 1996)] und d) genetisches Markieren von PKCα [(Schmidt et al. 1997)] und von PKCγ und PKCε [(Sakai et al. 1996)]. Das erste Verfahren stellt keine dynamischen Informationen bereit, während die anderen Verfahren dies tun. Das Markieren von PKC mit Fluoreszenzmarkiertem Phorbol-Myristat-Acetat kann nicht zwischen verschiedenen DAG-abhängigen Isoformen von PKC unterscheiden, markiert aber alle Isoformen und zeigt die Bewegung aller Isoformen. Chemisches und genetisches Markieren von spezifischen DAG-abhängigen PKCs bestätigte, dass sie in einer Isoformspezifischen Weise nach Aktivierung zur Zellperipherie oder zum Kern wandern.
  • In einem alternativen Verfahren ist Proteinkinase-A-Aktivität in lebenden Zellen durch chemisches Markieren einer der Kinase-Untereinheiten gemessen worden (Adams et al. 1991). Die Basis der Methode ist, dass die regulatorische und katalytische Untereinheit der gereinigten Proteinkinase-A mit Fluorescein bzw. Rhodamin markiert wird. Bei niedrigen cAMP-Spiegeln wird Proteinkinase A in eine heterotetramäre Form zusammengesetzt, die auf Fluoreszenz-Resonanz basierenden Energietransfer (fluorescence resonance energy transfer) zwischen den zwei Fluoreszenz-Farbstoffen ermöglicht. Die Aktivierung von Proteinkinase A führt zur Dissoziation des Komplexes, wodurch die Energieübertragung eliminiert wird. Ein Nachteil dieser Technologie ist, dass die markierte Proteinkinase A in die interessierenden Zellen mikroinjiziert werden muss. Diese hochinvasive Technik ist mühsam und nicht für das Screenen einer großen Anzahl von biologisch aktiven Substanzen anwendbar. Ein weiterer Nachteil dieser Technik verglichen mit der vorliegenden Erfindung ist, dass die markierte Proteinkinase-A nicht in Organismen/Tiere als Transgen eingeführt werden kann.
  • Kürzlich wurde entdeckt, dass das grün fluoreszierende Protein (Green Fluorescent Protein (GFP)), das in vielen unterschiedlichen Zelltypen einschließlich Säugerzellen exprimiert wurde, hochfluoreszierend wurde [(Chalfie et al. 1994)]. WO 95107463 beschreibt eine Zelle, die in der Lage ist, GFP zu exprimieren, und ein Verfahren zum Nachweisen eines interessierenden Proteins in einer Zelle basierend auf dem Einführen eines DNA-Moleküls in eine Zelle, das eine DNA-Sequenz aufweist, welche das interessierende Protein mit einer DNA-Sequenz verbindet, die ein GFP kodiert, so dass das durch das DNA-Molekül hergestellte Protein das interessierende Protein fusioniert an das GFP aufweist, dann Züchten der Zellen unter Bedingungen, welche die Expression des fusionierten Proteins gewähren, und Nachweisen der Lokalisierung der Fluoreszenz in der Zelle, wodurch das interessierende Protein in der Zelle lokalisiert wird. Beispiele derartiger fusionierter Proteine werden allerdings nicht bereitgestellt, und die Verwendung von Fusionsproteinen mit GFP zum Nachweis oder zur Quantifizierung von Translokation oder Neuverteilung biologisch aktiver Polypeptide, die intrazelluläre Prozesse nach Aktivierung beeinflussen, wie Proteine, die in Signalwege involviert sind, z.B. Proteinkinasen oder -phosphatasen, ist nicht vorgeschlagen worden. WO 95/07463 beschreibt ferner Zellen, die für den Nachweis von Molekülen, wie Hormone oder Schwermetalle, nützlich sind, in einer biologischen Sonde, durch operatives Verbinden eines regulatorischen Elements des Gens, das durch das interessierende Molekül beeinflusst wird, an ein GFP, wobei die Gegenwart der Moleküle das regulatorische Element beeinflusst, das wiederum die Expression des GFP beeinflusst. Auf diese Weise wird das Gen kodierend für GFP als Reporter-Gen in einer Zelle verwendet, die zum Überwachen der Anwesenheit einer spezifischen molekularen Identität konstruiert ist.
  • Grün fluoreszierendes Protein ist in einem Test für den Nachweis der Translokation des Glucokortikoid-Rezeptors (GR) [Carey, KL et al., The Journal of Cell Biology, Vol. 133, Nr. 5, Seiten 985-996 (1996)] verwendet worden. Eine GR-S65TGFP-Fusion ist verwendet worden, um die Mechanismen zu untersuchen, die in die Translokation des Glucokortikoid-Rezeptors (GR) als Antwort auf den Agonisten Dexamethason aus dem Cytosol, wo es in der Abwesenheit eines Liganden anwesend ist, durch die Kernpore in den Kern, wo es nach Liganden-Bindung verbleibt, involviert sind. Die Verwendung einer GR-GFP-Fusion ermöglicht die Echtzeit-Abbildung und Quantifizierung von nukleären/zytoplasmatischen Verhältnissen des Fluoreszenz-Signals.
  • Viele gegenwärtig verwendete Screening-Programme, die entworfen wurden, um Verbindungen zu finden, die Proteinkinase-Aktivität beeinflussen, basieren auf Messungen der Kinase-Phosphorylierung von artifiziellen oder natürlichen Substraten der, Rezeptorbindung und/oder der Expression eines Rezeptorgens.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine wichtige neue Dimension in der Untersuchung von zellulären Systemen, die Neuverteilung einschließen, dadurch bereit, dass die Erfindung die Quantifizierung der Neuverteilungsantworten oder -ereignisse bereitstellt, die durch einen Einfluss hervorgerufen werden, typischerweise den Kontakt mit einem chemischen Stoff oder einer Mischung von chemischen Stoffen, aber auch durch Veränderungen in der physikalischen Umgebung. Die Quantifizierung ermöglicht es numerisch oder als Kurven oder Graphen ausgedrückt, zwischen den Einflüssen (oder dem Grad an Einflüssen) auf zelluläre Systeme und der Neuverteilungs-Antwort sinnvolle Verbindungen aufzustellen. Dies ist äußerst vorteilhaft, da, wie gefunden wurde, die Quantifizierung auf sowohl eine schnelle wie eine reproduzierbare Weise erreicht werden kann, und da – was vielleicht noch wichtiger ist – die Systeme, die unter Verwendung des Ver fahrens der Erfindung quantifizierbar werden, Systeme sind, von denen enorme Mengen an neuer Information und Einblick abgeleitet werden kann.
  • Die vorliegenden Screening-Assays haben im Vergleich zu anderen Screening-Assays, z.B. Rezeptor-Bindungs-Assays, enzymatische Assays und Reporter-Gen-Assays den besonderen Vorteil, dass sie ein System bereitstellen, in dem biologisch aktive Stoffe mit vollständig neuen Wirkungsarten, z.B. Inhibition oder Förderung der Neuverteilung/Translokation eines biologisch aktiven Polypeptids als ein Weg zum Regulieren seiner Wirkung anstelle der Inhibition/Aktivierung von enzymatischer Aktivität, auf eine Weise identifiziert werden können, die eine sehr hohe Selektivität gegenüber der bestimmten Isoform des biologisch aktiven Polypeptids und ferner die Entwicklung einer Verbindungs-Selektivität gegenüber anderen Isoformen desselben biologisch aktiven Polypeptids oder anderen Verbindungen desselben Signalweges sicherstellt.
  • In ihrem breitesten Aspekt betrifft die Erfindung einen Assay für cAMP auf der Basis der PKA-Aktivierung, umfassend die Schritte:
    • (a) Züchten mindestens einer Zelle, enthaltend eine Nukleotidsequenzkodierung für ein Hybridpolypeptid, umfassend eine Fluorophore, die wahlweise durch einen Linker an die katalytische Untereinheit von cAMP-abhängiger Proteinkinase (PKAc) N- oder C-terminal markiert ist, unter Bedingungen, die die Expression der Nukleotidsequenz gewähren;
    • (b) Inkubieren der mindestens einen Zelle mit einem auf die biologische Funktion oder die biologische Wirkung zu testenden Stoff und
    • (c) Messen der durch die mindestens eine inkubierte Zelle hergestellten Fluoreszenz und Bestimmen des Ergebnisses oder der Veränderung im Hinblick auf die Fluoreszenz, wobei ein solches Ergebnis oder eine solche Veränderung die Translokation von PKAc und dadurch eine veränderte Konzentration von cAMP anzeigt.
  • Die Zellen
  • In der Erfindung ist die Zelle oder sind die Zellen mechanisch intakt und während des Experimentes am Leben. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Zelle oder werden die Zellen zu einem Zeitpunkt nach der Anwendung des Einflusses fixiert, an dem von der Antwort vorherbestimmt wurde, dass sie signifikant ist, und die Aufzeichnung wird zu einer beliebigen späteren Zeit durchgeführt.
  • Die mechanisch intakte lebende Zelle oder intakten lebenden Zellen können ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Pilzzellen oder Zellen, wie eine Hefezelle oder -zellen; Invertebratenzelle oder -zellen einschließlich Insektenzelle oder -zellen, und Vertebratenzelle oder -zellen, wie Säugerzelle oder -zellen. Diese Zelle oder diese Zellen wird/werden während des Zeitraumes, über den der Einfluss beobachtet wird, bei einer Temperatur von 30°C oder darüber inkubiert, vorzugsweise bei einer Temperatur von 32°C bis 39°C, besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 35°C bis 38°C und am meisten bevorzugt bei einer Temperatur von 37°C. In einem erfindungsgemäßen Aspekt ist die mechanisch intakte lebende Zelle Teil einer Matrix aus identischen oder nicht identischen Zellen.
  • Eine in der vorliegenden Erfindung verwendete Zelle sollte ein Nukleinsäurekonstrukt enthalten, das ein Fusions-Polypeptid wie hier definiert enthält, und in der Lage sein, die von dem Konstrukt kodierte Sequenz zu exprimieren. Die Zelle ist eine eukaryotische Zelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pilzzellen, wie Hefezellen, Invertebratenzellen einschließlich Insektenzellen, und Vertebratenzellen, wie Säugerzellen. Die bevorzugten Zellen sind Säugerzellen.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung können die Zellen von einem Organismus sein, der in mindestens einer seiner Komponentenzellen eine Nukleinsäuresequenz trägt, die für ein wie hier definiertes Fusions-Polypeptid kodiert und die in der Lage ist, die Nukleinsäuresequenz zu exprimieren. Der Organismus ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einzelligen und mehrzelligen Organismen, wie ein Säuger.
  • Die Luminophore
  • Die Luminophore ist die Komponente, welche es der Neuverteilung gestattet, durch Emmitieren des Lichts in einer räumlichen Verteilung bezogen auf den Grad des Einflusses visualisiert und/oder aufgezeichnet zu werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Luminophore in der Lage, in einer Weise neu verteilt zu werden, die für den Grad des Einflusses physiologisch relevant ist. In einer anderen Ausführungsform ist die Luminophore in der Lage, mit einer Komponente zu assoziieren, die in der Lage ist, in einer Weise neu verteilt zu werden, die für den Grad des Einflusses physiologisch relevant ist. In einer anderen Ausführungsform könnte die Luminophoren-Korrelation zwischen der Neuverteilung der Luminophore und dem Grad des Einflusses experimentell bestimmt werden. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ist die Luminophore in der Lage, auf im Wesentlichen die gleiche Weise wie die mindestens eine Komponente eines intrazellulären Weges neu verteilt zu werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Luminophore in der Lage, nach räumlicher Assoziation mit einer Komponente gequencht zu werden, die durch Modulation des Weges neu verteilt wird, wobei das Quenching als eine Veränderung in der Intensität der Lumineszenz gemessen wird.
  • Die Luminophore könnte eine Fluorophore sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung könnte die Luminophore ein Polypeptid sein, das durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert und exprimiert wird, die in der Zelle oder den Zellen enthalten ist. Die Luminophore könnte ein Hybrid-Polypeptid umfassend eine Fusion von mindestens einem Teil jedes der zwei Polypeptide, von denen eines ein lumineszierendes Polypeptid und das andere ein wie hier definiertes biologisch aktives Polypeptid umfasst.
  • Das lumineszierende Polypeptid könnte ein wie hier definiertes GFP oder ausgewählt aus der Gruppe von grün fluoreszierenden Proteinen mit der F64L-Mutation wie F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP, F64L-S65T-GFP, und EGFP sein. Das GFP könnte wahlweise über einen Peptidlinker an das biologisch aktive Peptid oder einen Teil oder eine Untereinheit davon N- oder C-terminal markiert (tagged) sein. Die Fluoreszenz-Sonde könnte eine Komponente eines intrazellulären Signalwegs sein. Die Sonde wird durch ein Nukleinsäurekonstrukt kodiert.
  • Der zu untersuchende Weg in der vorliegenden Erfindung könnte ein intrazellulärer Signalweg sein.
  • Der Einfluss
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung könnte der Einfluss der Kontakt zwischen der mechanisch intakten lebenden Zelle oder der Gruppe von mechanisch intakten lebenden Zellen mit einem chemischen Stoff und/oder die Inkubation der mechanisch intakten lebenden Zelle oder der Gruppe von mechanisch intakten lebenden Zellen mit einem chemischen Stoff sein. Der Einfluss moduliert die intrazellulären Prozesse. In einem Aspekt könnte die Modulation eine Aktivierung der intrazellulären Prozesse sein. In einem anderen Aspekt könnte die Modulation eine Deaktivierung der intrazellulären Prozesse sein. In noch einem anderen Aspekt könnte der Einfluss die Neuverteilung ohne direktes Beeinflussen der metabolischen Aktivität der Komponente der intrazellulären Prozesse inhibieren oder fördern.
  • In einer Ausführungsform wird die Erfindung als Basis für ein Screening-Programm verwendet, bei dem die Wirkung von unbekannten Einflüssen wie einer Verbindungs-Bibliothek mit dem Einfluss von bekannten Bezugsverbindungen unter standardisierten Bedingungen verglichen werden kann.
  • Das Aufzeichnen
  • Zusätzlich zu der Intensität gibt es verschiedene Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Parameter, die durch die Wirkung des Einflusses auf die zugrunde liegenden zellulären Phänomene moduliert werden können, und daher in der Erfindung verwendet werden können. Einige Beispiele sind Resonanzenergietransfer, Fluoreszenz-Lebensdauer, Polarisation, Wellenlängen-Verschiebung. Jedes dieser Verfahren benötigt eine bestimmte Filterart in dem Emissions-Lichtweg, um die gewünschte Lichtkomponente auszuwählen und um andere Komponenten zu ver werfen. Das Aufzeichnen der Lichteigenschaft kann in Form eines geordneten Arrays von Werten wie ein CCD-Array oder eine Vakuum-Röhrenvorrichtung wie eine Vidikon-Röhre sein.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung könnte das durch eine Luminophore emittierte räumlich verteilte Licht durch eine Veränderung im Resonanzenergietransfer zwischen der Luminophore und einer anderen Lumineszenzeinheit nachgewiesen werden, die in der Lage ist, Energie an die Luminophore abzugeben, wobei jedes der beiden ausgewählt oder hergestellt worden ist, um Teil der bestimmten Komponenten des intrazellulären Weges zu sein oder an sie gebunden oder mit ihnen assoziiert zu sein. In dieser Ausführungsform durchmacht entweder die Luminophore oder die Lumineszenz-Einheit, die in der Lage ist, Energie an die Luminophore abzugeben, eine Neuverteilung als Antwort auf einen Einfluss. Der Resonanzenergietransfer würde als eine Veränderung in der Emissions-Intensität von der Luminophore gemessen, vorzugsweise aufgespürt durch einen Einzelkanal-Photodetektor, der nur auf die durchschnittliche Intensität der Luminophore in einer nicht räumlich aufgelösten Art antwortet.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung könnte das Aufzeichnen des räumlich verteilten Lichtes zu einem einzigen Zeitpunkt nach dem Anwenden des Einflusses gemacht werden. In einer anderen Ausführungsform könnte das Aufzeichnen an zwei Zeitpunkten durchgeführt werden, wobei ein Punkt vor und der andere Punkt nach dem Anwenden des Einflusses ist. Das Resultat oder die Variation wird bestimmt aus der Veränderung der Fluoreszenz verglichen mit der vor dem Einfluss oder der Modulation gemessenen Fluoreszenz. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung könnte das Aufzeichnen zu einer Serie von Zeitpunkten durchgeführt werden, bei der die Anwendung des Einflusses an einem Zeitpunkt nach dem ersten Zeitpunkt in der Serie von Aufzeichnungen stattfindet, wobei das Aufzeichnen beispielsweise mit einer vorher bestimmten Zeitdifferenz von etwa 0,1 Sekunde bis 1 Stunde, vorzugsweise von 1 bis 60 Sekunden, besonders bevorzugt von 1 bis 30 Sekunden, insbesondere von 1 bis 10 Sekunden, über einen Zeitraum von 1 Sekunde bis 12 Stunden, wie von 10 Sekunden bis 12 Stunden, bei spielsweise von 10 Sekunden bis 1 Stunde, wie von 60 Sekunden bis 30 Minuten oder 20 Minuten durchgeführt wird. Das Resultat oder die Variation wird von der Veränderung in der Fluoreszenz über die Zeit bestimmt. Das Resultat oder die Variation könnte auch als eine Veränderung in der räumlichen Verteilung der Fluoreszenz über die Zeit bestimmt werden.
  • Vorrichtung
  • Das Aufzeichnen der von der Luminophore emittierten räumlich verteilten Lumineszenz wird durch eine Vorrichtung zum Messen der Verteilung der Fluoreszenz in der Zelle oder den Zellen durchgeführt, und dabei jede Veränderung in der Verteilung der Fluoreszenz in der Zelle oder in den Zellen, die ein Minimum der folgenden Komponententeile einschließt: (a) eine Lichtquelle, (b) ein Verfahren zum Auswählen der Wellenlänge(n), des Lichtes von der Quelle, das die Fluoreszenz des Proteins anregen wird, (c) eine Vorrichtung, die schnell das Anregungslicht blockieren kann oder in den Rest des Systems lassen kann, (d) eine Serie von optischen Elementen, um das Anregungslicht zu einer Probe zu bringen, die emittierte Fluoreszenz in einer räumlich aufgelösten Weise zu sammeln, und ein Bild von dieser Fluoreszenz-Emission zu bilden, (e) eine Platte oder ein Ständer, der/die den Zellencontainer hält, wobei die Zellen in einer vorher bestimmten Geometrie bezüglich der Reihe der optischen Elemente gemessen werden, (f) einen Detektor, um die räumlich aufgelöste Fluoreszenz in Form eines Bildes aufzuzeichnen, (g) einen Computer oder elektronisches System und assoziierte Software, um die aufgezeichneten Bilder zu erhalten und zu speichern, und um den Grad der Neuverteilung von den aufgezeichneten Bildern zu berechnen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Vorrichtungssystem automatisiert. In einer Ausführungsform umfassen die Komponenten in (d) und (e) wie oben erwähnt ein Fluoreszenz-Mikroskop. In einer Ausführungsform ist die oben in (f) erwähnte Komponente eine CCD-Kamera.
  • In einer Ausführungsform wird das Bild durch ein optisches Scann-System gebildet und aufgezeichnet.
  • In einer Ausführungsform wird ein Flüssigkeits-Zugabesystem verwendet, um eine bekannte oder unbekannte Verbindung zu einer oder allen Zellen in den Zellhalter an einem Zeitpunkt hinzuzufügen, der von vornherein festgelegt ist. Vorzugsweise steht das Flüssigkeits-Zugabesystem unter der Kontrolle des Computers oder des elektronischen Systems. Solch ein automatisiertes System kann für ein Screening-Programm aufgrund seiner Fähigkeit verwendet werden, Resultate von einer größeren Anzahl an Testverbindungen zu erzeugen, als ein humaner Operator unter Verwenden der Vorrichtung in einer manuellen Weise erzeugen könnte.
  • Quantifizierung des Einflusses
  • Das Aufzeichnen der Variation oder des Resultates bezüglich des von der Luminophore emittierten Lichts wird durch Aufzeichnen des räumlich verteilten Lichts als eines oder mehrere digitale Bilder durchgeführt, und das Verarbeiten der aufgezeichneten Variation, um sie auf eine oder mehrere Zahlen zu reduzieren, die für den Grad der Neuverteilung repräsentativ sind, umfasst eine digitale bildverarbeitende Vorgehensweise oder eine Kombination von digitalen bildverarbeitenden Vorgehensweisen. Die quantitative Information, die für den Grad der zellulären Antwort auf den Einfluss oder das Resultat des Einflusses auf den intrazellulären Weg bezeichnend ist, wird von der Aufzeichnung oder den Aufzeichnungen entsprechend einer vorbestimmten Kalibrierung extrahiert, die auf Antworten oder Resultaten basiert, die in derselben Weise, bezüglich bekannter Grade eines relevanten spezifischen Einflusses aufgezeichnet wurden. Diese Kalibrierungs-Vorgehensweise wird entsprechend den unten beschriebenen Prinzipien entwickelt (Entwickeln einer auf Bildern basierenden Assay-Technik). Spezifische Beschreibungen der Vorgehensweisen für bestimmte Assays werden in den Beispielen gegeben.
  • Während das schrittweise Vorgehen, das notwendig ist, um das Bild oder die Bilder auf den Wert zu reduzieren, der für jeden Assay repräsentativ ist oder sind, für jeden Assay besonders ist, sind die einzelnen Schritte im Allgemeinen gut bekannte Verfahren zur Bildbearbeitung. Einige Beispiele der einzelnen Schritte sind Punktoperationen wie Subtraktion, Bilden eines Verhältnisses und Bilden eines Grenzwertes, Digitalfilterverfahren wie Weichmachen, Verschärfen und Eckenbestimmung, räumliche Frequenzverfahren wie Fourier-Filtern, Bild-Kreuz-Korrelation und Bild-Auto-Korrelation, Objekt-Finden und Klassifizierung (Blob-Analyse), und farbliche Raum-Manipulationen zur Visualisierung. Zusätzlich zu den algorithmischen Vorgehensweisen können auch heuristische Verfahren wie neurale Netzwerke verwendet werden.
  • Nukleinsäurekonstrukte
  • Die hier beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte kodieren in ihren Nukleinsäuresequenzen Fusions-Polypeptide umfassend ein biologisch aktives Polypeptid, das eine Komponente eines intrazellulären Signalweges ist, oder einen Teil davon und ein GFP, vorzugsweise eine F64L-Mutante von GFP, das N- oder C-terminal, gegebenenfalls über ein Peptidlinker, an das biologisch aktive Polypeptid oder einen Teil davon fusioniert ist.
  • Das durch das Nukleinsäurekonstrukt kodierte biologisch aktive Polypeptid ist eine katalytische Untereinheit von PKAc.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt kodierte biologisch aktive Polypeptid eine PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion.
  • In einer Ausführungsform ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt kodierte biologisch aktive Polypeptid.
  • In einer Ausführungsform stammt das für GFP kodierende Gen in dem Nukleinsäurekonstrukt von Aequorea victoria. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das für GFP kodierende Gen in dem Nukleinsäurekonstrukt EGFP oder eine GFP-Variante ausgewählt aus F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP, F64L-S65T-GFP.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können die DNA-Konstrukte durch jede der in SEQ ID NO: 68 gezeigten DNA-Sequenz oder Varianten dieser Sequenz identifiziert werden, die in der Lage sind, das gleiche Fusions-Polypeptid oder ein Fusions-Polypeptid zu kodieren, das dazu biologisch äquivalent ist, z.B. eine Isoform oder eine Spleiß-Variante oder ein Homologon aus einer anderen Spezies.
  • Screening-Programm
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, das dazu verwendet werden kann, um ein Screening-Programm für die Identifikation biologisch aktiver Substanzen zu etablieren, die direkt oder indirekt intrazelluläre Signalwege beeinflussen können und aufgrund dieser Eigenschaft möglicherweise als Medikamente nützlich sind. Basierend auf Messungen in lebenden Zellen der Neuverteilung von räumlich aufgelöster Lumineszenz von Luminophoren, die eine Veränderung in der Verteilung nach Aktivierung oder Deaktivierung eines intrazellulären Signalweges durchmachen, zeigt das Resultat der einzelnen Messung jedes Stoffes, der untersucht wird, seine potentielle biologische Aktivität an.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Screening-Programm für die Identifikation eines biologisch toxischen Stoffes wie vorliegend definiert verwendet, der seine toxische Wirkung durch Interferieren mit einem intrazellulären Signalweg ausübt. Basierend auf Messungen der Neuverteilung von räumlich aufgelöster Lumineszenz in den lebenden Zellen von Luminophoren, die eine Veränderung in der Verteilung nach Aktivierung oder Deaktivierung eines intrazellulären Signalweges durchmachen, zeigt das Resultat der einzelnen Messung jedes Stoffes, der untersucht wurde, seine potentielle biologisch toxische Aktivität an. In einer Ausführungsform eines Screening-Programmes kann eine Verbindung, die eine Komponente eines wie vorliegend definierten intrazellulären Weges moduliert, gefunden werden und die therapeutische Menge der Verbindung kann durch ein erfindungsgemäßes Verfahren abgeschätzt werden. In einer bevorzugten Ausfährungsform führt die vorliegende Erfindung zu der Entdeckung eines neuen Weges, um einen Zustand oder eine Krankheit zu behandeln, der/die mit der intrazellulären Funktion eines biologisch aktiven Polypeptids in Bezug steht, umfassend die Verabreichung an einen Patienten, der an diesem Zustand oder an dieser Krankheit leidet, einer wirksamen Menge einer Verbindung, die durch irgendein erfindungsgemäßes Verfahren entdeckt worden ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Identifikation eines neuen Arzneimittel-Targets oder verschiedener neuer Arzneimittel-Targets aus der Gruppe biologisch aktiver Polypeptide etabliert, die Komponenten von intrazellulären Signalwegen sind.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein individuelles Behandlungsschema für die selektive Behandlung eines ausgewählten Patienten etabliert, der an einem Leiden leidet, bei dem die verfügbaren Medikamente, die für die Behandlung des Leidens verwendet werden, auf einer relevanten primären Zelle oder auf relevanten primären Zellen getestet werden, die von dem Patienten aus einem oder mehreren Geweben erhalten werden, unter Verwenden eines Verfahrens umfassend das Transfizieren der Zelle oder der Zellen mit mindestens einer DNA-Sequenz, die eine erfindungsgemäße Fluoreszenz-Sonde kodiert, Transferieren der transfizierten Zelle oder Zellen zurück in den Patienten, oder Züchten der Zelle oder Zellen unter Bedingungen, welche die Expression der Sonden erlauben, und Exponieren derselben einem Array der verfügbaren Medikamente, dann Vergleichen der Veränderungen in Fluoreszenz-Mustern oder Neuverteilungsmustern der Fluoreszenz-Sonden in der intakten lebenden Zelle oder Zellen, um die zelluläre Antwort auf die spezifischen Medikamente nachzuweisen (Erhalten eines zellulären Wirkungsprofils), dann Auswählen eines Medikaments oder mehrerer Medikamente basierend auf der gewünschten Wirkung und den akzeptierbaren Grad an Nebenwirkungen und Verabreichen einer wirksamen Menge dieser Medikamente an den ausgewählten Patienten.
  • Zurückverfolgen eines Signaltransduktionsweges
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, das verwendet werden kann, um ein Screening-Programm zum Zurückverfolgen von Signaltransduktionswegen wie hier definiert zu etablieren. In einer Ausführungsform wird das Screening-Programm verwendet, um genauer zu etablieren, auf welcher Ebene eine oder mehrere Verbindungen einen spezifischen Signaltransduktionsweg beeinflussen, indem nacheinander oder gleichzeitig der Einfluss der Verbindung oder der Verbindungen auf die Neuverteilung von räumlich aufgelöster Lumineszenz von verschiedenen der Luminophoren getestet wird, die eine Veränderung in der Verteilung nach Aktivierung oder Deaktivierung des untersuchten intrazellulären Signalweges durchmachen.
  • Konstruktion und Testen der Sonden
  • Im Allgemeinen wird eine Sonde, d.h. ein „GeneX"-GFP-Fusion oder eine GFP-„GeneX"-Fusion unter Verwenden von PCR mit „GeneX"-sezifischen Primern konstruiert, gefolgt von einem Klonierungsschritt, um „GeneX" in den gleichen Leserahmen wie GFP zu fusionieren. Die Fusion kann eine kurze, von dem Vektor abstammende Sequenz zwischen „GeneX" und GFP enthalten (z.B. Teil einer vielfachen Klonierungsstellenregion (multiple cloning site region) in dem Plasmid), was zu einem Peptid-Linker zwischen „GeneX" und GFP in dem resultierenden Fusionsprotein führt.
  • Detailliertes schrittweises Verfahren:
    • – Identifizieren der Sequenz des Gens. Dies wird am einfachsten durch Durchsuchen einer Hinterlegung von genetischer Information durchgeführt, z.B. der GenBank Sequence Database, die allgemein erhältlich ist und immer wieder von Molekularbiologen verwendet wird. In den spezifischen Beispielen unten wird die GenBank-Zugangsnummer des fraglichen Gens bereitgestellt.
    • – Entwurf genspezifischer Primer. Eine Untersuchung der Sequenz des Gens gestattet den Entwurf von genspezifischen Primern, die in einer PCR-Reaktion verwendet werden können. Typischerweise schließt der Primer des oberen Stranges (top-strand primer) das ATG-Start-Codon des Genes und die folgenden etwa 20 Nukleotide ein, während der Primer des unteren Stranges (bottom-strand primer) das Stop-Codon und die ca. 20 davor liegenden Nukleotide einschließt, falls das Gen hinter GFP fusioniert werden soll, d.h. eine GFP-„GeneX"-Fusion. Wenn das Gen vor GFP fusioniert werden soll, d.h. eine „GeneX"-GFP-Fusion, muss ein Stop-Codon vermieden werden. Wahlweise soll nicht die Gesamtlänge des GeneX in der Fusion verwendet werden, sondern nur der Teil, der sich als Antwort auf ein Signal wie GeneX räumlich verteilt und neu verteilt. Zusätzlich zu genspezifischen Sequenzen enthalten die Primer mindestens eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, um das nachfolgende Klonieren des PCR-Produktes zu ermöglichen. Die Stellen werden derart ausgewählt, so dass sie in dem PCR-Produkt nur einmal vorkommen und mit Stellen in dem Klonierungsvektor kompatibel sind. Danach kann es notwendig sein, eine exakte Anzahl an Nukleotiden zwischen der Restriktionsenzym-Schnittstelle und der genspezifischen Sequenz einzufügen, um den korrekten Leserahmen des Fusionsgens und/oder eine Translationsinitiations-Konsensussequenz zu etablieren. Als letztes enthalten die Primer immer einige wenige Nukleotide vor der Restriktionsenzym-Schnittstelle, um einen Verdau mit dem Enzym zu ermöglichen.
    • – Identifizieren einer Quelle für das zu amplifizierende Gen. Damit eine PCR-Reaktion ein Produkt mit genspezifischen Primern erzeugen kann, muss die Gensequenz anfänglich in der Reaktion vorhanden sein, z.B. in Gestalt von cDNA. Die Information in der GenBank oder in der wissenschaftlichen Literatur wird gewöhnlicherweise anzeigen, in welchem Gewebe oder in welchen Geweben das Gen exprimiert wird, und cDNA-Bibliotheken aus einer großen Vielzahl von Geweben oder Zelltypen von verschiedenen Spezies sind im Handel erhältlich, z.B. von Clontech (Palo Alto), Stratagene (La Jolla) und Invitrogen (San Diego). Viele Gene sind auch in klonierter Form von der The American Type Tissue Collection (Virginia) erhältlich.
    • – Optimieren der PCR-Reaktion. Von verschiedenen Faktoren ist es bekannt, dass sie die Effizienz und die Spezifität einer PCR-Reaktion beeinflussen, einschließlich der Annealing-Temperatur der Primer, der Ionen-Konzentration, besonders Mg2+ und K+, die in der Reaktion vorhanden sind, sowie der pH der Reaktion. Falls das Resultat einer PCR-Reaktion für unbe friedigend gehalten wird, kann das daran liegen, dass die oben genannten Parameter nicht optimal sind. Verschiedene Annealing-Temperaturen sollten getestet werden, z.B. in einer PCR-Maschine mit einem eingebauten Temperatur-Gradienten, erhältlich beispielsweise von Stratagene (La Jolla), und/oder verschiedene Pufferzusammensetzungen sollten ausprobiert werden, z.B. das OptiPrime-Puffer-System von Stratagene (La Jolla).
    • – Klonieren des PCR-Produkts. Der Vektor, in den das amplifizierte Gen-Produkt kloniert werden wird und mit GFP fusioniert werden wird, sollte bereits in Erwägung gezogen worden sein, wenn die Primer entworfen wurden. Wenn ein Vektor ausgewählt wird, sollte man mindestens berücksichtigen, in welchen Zelltypen die Sonde nachfolgend exprimiert werden wird, so dass der Promotor, der die Expression der Sonde kontrolliert, mit den Zellen kompatibel ist. Die meisten Expressionsvektoren enthalten auch einen oder mehrere selektive Marker, z.B. Vermitteln einer Resistenz gegenüber einem Arzneimittel, was ein geeignetes Merkmal ist, wenn man stabile Transfektanten herstellen möchte. Der selektive Marker sollte auch mit den zu verwendenden Zellen kompatibel sein.
  • Das tatsächliche Klonieren des PCR-Produkts sollte keine Schwierigkeit darstellen, da es normalerweise ein Ein-Schritt-Klonieren eines Fragmentes, das mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten wurde, in einem Vektor darstellen wird, der mit denselben zwei Enzymen verdaut wurde. Falls sich das Klonieren als problematisch herausstellt, kann dies daran liegen, dass die Restriktionsenzyme mit dem PCR-Fragment nicht gut funktioniert haben. In diesem Fall könnte man längere Verlängerungen an das Ende der Primer anfügen, um eine mögliche Schwierigkeit des Verdaus in der Nähe eines Fragmentendes zu überwinden, oder man könnte einen Zwischenklonierungsschritt einfügen, der nicht auf dem Verdau mit einem Restriktionsenzym basiert. Verschiedene Unternehmen bieten Systeme für diesen Ansatz an, z.B. Invitrogen (San Diego) und Clontech (Palo Alto).
  • Sobald das Gen kloniert worden ist, und in dem Verfahren mit dem GFP-Gen fusioniert worden ist, sollte das resultierende Produkt, typischerweise ein Plasmid, sorgfältig überprüft werden, um sicherzustellen, dass es so ist, wie erwartet. Der genaueste Test wäre, die Nukleotidsequenz des Fusionsgens zu erhalten.
  • Testen der Sonde.
  • Sobald ein DNA-Konstrukt für eine Sonde erzeugt worden ist, kann ihre Funktionalität und Verwendbarkeit getestet werden, indem es den folgenden Tests unterworfen wird:
    • – Transfizieren desselben in Zellen, die in der Lage sind, die Sonde zu exprimieren. Die Fluoreszenz der Zellen wird kurz danach getestet, typischerweise am nächsten Tag. An diesem Punkt werden zwei Merkmale der zellulären Fluoreszenz festgestellt: die Intensität und die subzelluläre Lokalisation.
  • Die Intensität sollte üblicherweise mindestens genauso stark sein, wie diejenige von unfusioniertem GFP in den Zellen. Falls dies nicht so ist, so könnte die Sequenz oder die Qualität der Sonden-DNA fehlerhaft sein und sollte sorgfältig überprüft werden.
  • Die subzelluläre Lokalisation ist ein Anzeichen dafür, ob es von einer Sonde wahrscheinlich ist, dass sie gut funktioniert. Falls ihre Lokalisation wie diejenige ist, die von dem fraglichen Gen erwartet wird, z.B. sie ausgeschlossen ist von dem Kern, kann man sofort mit einem funktionellen Test weitermachen. Falls die Sonde nicht gleich nach dem Transfektionsverfahren lokalisiert ist, kann dies an einer Überexpression zu diesem Zeitpunkt liegen, da die Zelle typischerweise sehr viele Kopien des Plasmids aufgenommen haben wird, und die Lokalisation wird mit der Zeit stattfinden, z.B. innerhalb weniger Wochen, wenn die Plasmid-Kopienanzahl und der Expressionsspiegel abnehmen. Falls die Lokalisation nicht nach einem verlängerten Zeitraum stattfindet, kann dies daran liegen, dass die Fusion an GFP eine Lokalisierungsfunktion zerstört hat, z.B. eine Proteinsequenz maskiert hat, die für die Interaktion mit seinem normalen zellulären Ankerprotein essenziell ist. In diesem Fall könnte die entgegengesetzte Fusion funktionieren, z.B. falls Ge neX-GFP nicht funktioniert, könnte die GFP-GeneX dies tun, da zwei verschiedene Teile des GeneX durch die Nähe von GFP beeinflusst sein werden. Falls dies nicht funktioniert, könnte die Nähe von GFP an jedem Ende ein Problem sein, und es könnte versucht werden, den Abstand durch Einbauen eines längeren Linkers zwischen GeneX und GFP in das DNA-Konstrukt zu erhöhen.
  • Falls es keine vorherige Kenntnis der Lokalisation gibt, und falls keine Lokalisation beobachtet wird, kann dies daran liegen, dass die Sonde nicht an diesem Punkt lokalisieren sollte, weil dies die Natur des an GFP fusionierten Proteins ist. Es sollte dann einem funktionellen Test unterworfen werden.
  • In einem funktionellen Test werden die Zellen, welche die Sonde exprimieren, mit mindestens einer Verbindung behandelt, von der man weiß, dass sie, üblicherweise durch Aktivieren, mit dem Signalweg interferiert, von dem von der Sonde erwartet wird, dass sie ihn anzeigt, indem sie sich in der Zelle neu verteilt. Falls die Neuverteilung wie erwartet ist, z.B. falls das vorherige Wissen mitteilt, dass sie vom Ort X zum Ort Y translozieren sollte, hat sie den ersten kritischen Test bestanden. In diesem Fall kann man mit der weiteren Charakterisierung und Quantifizierung der Antwort fortfahren.
  • Falls dies nicht wie erwartet stattfindet, kann dies daran liegen, dass der Zelle mindestens eine Komponente des Signalweges fehlt, z.B. ein Zelloberflächen-Rezeptor, oder es liegt eine Spezies-Inkompatibilität vor, z.B. falls die Sonde aufgrund einer Sequenzinformation über ein humanes Genprodukt entworfen wurde, und die Zelle von einem Hamster stammt. In beiden Fällen sollte man andere Zelltypen für das Testverfahren identifizieren, in denen diese potentiellen Probleme nicht auftreten sollten.
  • Falls es keine vorherige Kenntnis über das Neuverteilungsmuster gibt, muss die Analyse der Neuverteilung mit einer größeren Tiefe durchgeführt werden, um zu identifizieren, welches die essentiellen und indikativen Merkmale sind, und, wenn das klar ist, kann man mit einer weiteren Charakterisierung und Quantifizierung der Antwort weitermachen. Falls kein Merkmal einer Neuverteilung identifiziert werden kann, kann das Problem wie oben erwähnt sein, und die Sonde sollte unter optimaleren zellulären Bedingungen neu getestet werden.
  • Falls die Sonde unter optimalen zellulären Bedingungen keine Wirkung zeigt, muss sie neu entworfen werden.
  • Entwickeln einer bildbasierenden Assay-Technik
  • Der Prozess des Entwickelns eines bildbasierenden Neuverteilungs-Assays beginnt entweder mit der nicht geplanten experimentellen Beobachtung, dass ein Neuverteilungs-Phänomen visualisiert werden kann, oder mit dem Entwurf einer Sonde, die spezifisch einem Neuverteilungs-Phänomen folgen soll, von dem bereits bekannt ist, dass es auftritt. In jedem Fall ist die erste und beste Forschungstechnik für einen geübten Wissenschaftler oder Techniker, das Phänomen zu beobachten. Selbst mit den schnellen Fortschritten in der Computertechnologie ist die humane Auge-Gehirn-Kombination unter den bekannten Muster-Erkennungssystemen immer noch das stärkste und erfordert kein fortgeschrittenes Wissen über das System, um potentiell interessierende und nützliche Muster in Rohdaten zu entdecken. Dies trifft insbesondere zu, falls derartige Daten in Gestalt von Bildern präsentiert werden, die der natürliche „Datentyp" für das humane visuelle Verarbeiten sind. Da humanes visuelles Verarbeiten am effektivsten in einem relativ engen Frequenzbereich arbeitet, d.h. wir können entweder sehr schnelle oder sehr langsame Veränderungen in unserem visuellen Feld nicht sehen, mag es erforderlich sein, die Daten aufzuzeichnen und sie entweder mit einer Zeitverlängerung oder -kompression erneut abzuspielen.
  • Einige Lumineszenz-Phänomene können nicht durch das menschliche Auge direkt gesehen werden. Beispiele schließen Polarisation und Fluoreszenz-Lebensdauer ein. Mit geeigneten Filtern oder Detektoren können diese Signale allerdings als Bilder oder Sequenzen von Bildern aufgezeichnet werden und dem Menschen auf die gerade eben beschriebene Weise präsentiert werden. Auf diesem Weg können Muster detektiert werden, und dieselben Verfahren können angewendet werden.
  • Sobald von der Neuverteilung bestimmt worden ist, dass sie ein reproduzierbares Phänomen darstellt, werden ein oder mehrere Datensätze für den Zweck des Entwickelns einer Verfahrensweise zum Extrahieren der quantitativen Informationen von den Daten erzeugt. Parallel dazu werden die biologischen und optischen Bedingungen bestimmt, welche die Rohdaten mit der besten Qualität für den Assay geben. Dies kann ein iterativer Prozess werden; es kann notwendig sein, ein quantitatives Vorgehen zu entwickeln, um die Wirkung des Manipulierens der Assay-Bedingungen auf den Assay zu bestimmen.
  • Die Datensätze werden durch eine Person oder Personen untersucht, die Kenntnis des biologischen Phänomens hat/haben und in der Anwendung von Bildverarbeitungstechniken bewandert ist/sind. Das Ziel dieser Übung ist es, ein Verfahren zu bestimmen oder es zumindest vorzuschlagen, das das Bild oder die Sequenz der Bilder, das/die die Aufzeichnung einer „Antwort" darstellt oder darstellen auf einen Wert reduziert, der dem Grad der Antwort entspricht. Unter Verwenden von entweder interaktiver Bildverarbeitungs-Software oder einer Bildverarbeitungs-Toolbox und einer Programmiersprache wird das Verfahren als ein Prozess oder Algorithmus kodiert, der das Bild oder die Bilder als Input nimmt und den Grad der Antworten (in irgendwelchen Einheiten) als sein Output erzeugt. Einige der Kriterien zum Auswerten der Validität einer bestimmten Vorgehensweise sind:
    • • Variiert der Grad der Antwort in einer biologisch signifikanten Weise, d.h., zeigt er die bekannte oder angenommene Abhängigkeit von der Konzentration des stimulierenden Mittels oder der stimulierenden Bedingung?
    • • Ist der Grad der Antwort reproduzierbar, d.h., gibt die gleiche Konzentration oder Menge an stimulierendem Mittel oder Bedingung dieselbe Antwort mit einer akzeptablen Varianz?
    • • Ist der dynamische Bereich der Antwort ausreichend für den Zweck des Assays? Falls nicht, kann eine Änderung in dem Vorgehen oder in einem seiner Parameter den dynamischen Bereich verbessern?
    • • Zeigt das Vorgehen irgendwelche klaren „Pathologien", d.h., es zu lächerlichen Werten für die Antwort, falls üblicherweise vorkommende Unvollständigkeiten in dem bildgebenden Prozess vorhanden sind? Können derartige Pathologien eliminiert, kontrolliert oder berücksichtigt werden?
    • • Kann das Vorgehen mit der normalen Variation in der Anzahl und/oder Größe von Zellen in einem Bild umgehen?
  • In einigen Fällen kann das Verfahren offensichtlich sein; in anderen kann sich eine Anzahl von möglichen Vorgehensweisen selbst vorschlagen. Selbst wenn ein Verfahren den anderen klar überlegen erscheint, kann eine Optimierung von Parametern erforderlich sein. Die verschiedenen Vorgehensweisen werden auf den Datensatz angewendet, und die oben vorgeschlagenen Kriterien werden bestimmt oder die einzige Vorgehensweise wird wiederholt unter Anpassung des Parameters oder der Parameter angewendet, bis die zufriedenstellendsten Kombinationen von Signal, Rauschen, Bereich usw. erreicht sind. Dies entspricht der Kalibrierung irgendeines Typs von Einzelhandsensoren.
  • Die Anzahl an Möglichkeiten, einen Einzelwert aus einem Bild zu extrahieren, ist extrem groß und daher muss ein intelligenter Ansatz beim Anfangsschritt der Reduktion dieser Anzahl auf eine kleine, endliche Anzahl möglicher Vorgehensweisen vorgenommen werden. Dies besagt nicht, dass die letztendlich erhaltene Vorgehensweise notwendigerweise die beste Vorgehensweise ist – aber eine globale Suche nach der besten Vorgehensweise steht einfach aufgrund der riesigen Anzahl an involvierten Möglichkeiten außer Frage.
  • Bildbasierende Assays unterscheiden sich nicht darin von anderen Assay-Techniken, dass ihre Nützlichkeit durch Parameter wie die Spezifität für die gewünschte Komponente der Sonde, der dynamische Bereich, die Varianz, die Sensitivität, der Konzentrationsbereich, über den der Assay funktioniert, und andere solche Parameter charakterisiert ist. Während es nicht notwendig ist, jedes und alle davon zu charakterisieren, bevor der Assay verwendet wird, stellen sie den einzigen Weg dar, einen Assay mit einem anderen zu vergleichen.
  • Beispiel: Entwickeln eines quantitativen Assays für GLUT4-Translokation
  • GLUT4 ist ein Vertreter der Klasse von Glucose-Transportermolekülen, die bei der zellulären Glucoseaufnahme wichtig sind. Von ihm ist bekannt, dass er bei einigen Zuständen der Glucoseaufnahmestimulation zur Plasmamembran transloziert. Die Fähigkeit, die Glucoseaufnahmeantwort nicht-invasiv zu visualisieren, ohne die Glucoseaufnahme zu messen, wäre ein sehr nützlicher Assay für jeden, der beispielsweise nach Behandlungen für Typ2-Diabetes sucht.
  • Eine CHO-Zelllinie, die den humanen Insulinrezeptor stabil exprimierte, wurde als Basis für eine neue Zelllinie verwendet, die eine Fusion zwischen GLUT4 und GFP stabil exprimierte. Von dieser Zelllinie wurde erwartet, dass sie eine Translokation von GLUT4 zur Plasmamembran zeigte, visualisiert durch die Bewegung des GFP. Die Translokation konnte definitiv in Gestalt des Auftretens von lokalen Erhöhungen in der Fluoreszenz in Regionen der Plasmamembran gesehen werden, die eine charakteristische Form oder ein charakteristisches Muster aufwiesen. Dies ist in 12 gezeigt.
  • Diese Objekte wurden als „Snircles" bekannt und das Phänomen ihres Auftretens als „Snircling". Um ihr Auftreten zu quantifizieren, musste ein Verfahren gefunden werden, um sie als Objekte in dem Bildfeld zu isolieren, und dann um sie zu zählen, ihre Fläche zu messen oder einige Parameter über sie zu bestimmen, die in einer Dosis-abhängigen Weise mit der Insulinkonzentration korrelieren, der die Zeilen ausgesetzt worden waren. Um die Snircles abzutrennen, wurde eine Binarisierungsvorgehensweise angewendet, in der eine Kopie des Bildes, das mit einem relativ starken Gauß-Kernprogramm weichgemacht wurde (sigma = 2,5) von einer anderen Kopie subtrahiert wurde, auf die nur ein relativ leichte Gaußsche Glättung angewendet worden war (sigma = 0,5). Das resultierende Bild wurde bezüglich seiner min/max-Bereiche erneut eingeteilt, und ein automatischer Grenzwert wurde angewendet, um das Bild in zwei Ebenen aufzuteilen. Das Bild mit Grenzwert enthält einen Hintergrund eines Wertes, alle gefundenen Objekte mit einem anderen Wert. Die gefundenen Objekte wurden erst durch einen Filter filtriert, um Objekte zu entfernen, die wesentlich zu groß und zu klein waren, um Snircles zu sein. Die verbleibenden Objekte, die Snircles und andere Artefakte von dem Bild mit etwa denselben Größen- und Intensitätseigenschaften wie Snircles darstellen, werden einer Klassifizierungsvorgehensweise unterworfen, die zuvor mit vielen Snircle-Bildern trainiert worden war, um Snircles zu erkennen und die anderen Artefakte auszuschließen. Das Resultat dieser Vorgehensweise ist ein binäres Bild, das nur die gefundenen Snircles bis zu dem Grad zeigt, zu dem die Klassifizierungsvorgehensweise diese akkurat identifizieren kann. Die Gesamtfläche der Snircles wird dann summiert und dieser Wert ist das quantitative Maß des Grads an Snircling für das Bild.
  • Definitionen:
  • In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen deckt der Ausdruck „ein Einfluss" jeden beliebigen Einfluss ab, auf welchen die zelluläre Antwort eine Neuverteilung umfasst. So sind z.B. Erwärmen, Abkühlen, hoher Druck, niedriger Druck, Befeuchten oder Trocknen Einflüsse auf die zelluläre Antwort, auf welche eine resultierende Neuverteilung quantifiziert werden kann, jedoch sind wie oben erwähnt die vielleicht wichtigsten Einflüsse die Einflüsse auf die zelluläre Antwort unter Beteiligung einer das Kontaktieren oder Inkubieren der Zelle oder Zellen mit Stoffen, von denen bekannt ist oder von denen erwartet wird, dass sie einen Einfluss auf die zelluläre Antwort einschließlich eines Neuverteilungs-Beitrages ausüben. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung könnte der Einfluss Stoffe aus einer Verbindungs-Arzneimittelbibliothek darstellen.
  • Im vorliegenden Kontext ist von dem Ausdruck „Grün-Fluoreszenz-Protein" (green fluorescent protein, GFP) beabsichtigt, dass er ein Protein anzeigt, das, wenn durch eine Zelle exprimiert, eine Fluoreszenz nach Exposition gegenüber Licht der korrekten Anregungswellenlänge emittiert (vgl. [(Chalfie et al. 1994)]). Im folgenden wird GFP, in dem eine oder mehrere Aminosäuren ersetzt, insertiert oder deletiert worden sind, am häufigsten als „modifiziertes GFP" bezeichnet. „GFP" schließt wie hier verwendet GFP vom Wildtyp, abgeleitet von der Qualle Aequorea victoria, und Modifikationen von GFP wie die blau fluoreszierende Variante von GFP, offenbart von Heim et al. (1995, Proc. Natl. Acad Sci. 91:12501, und andere Modifikationen, die die Spektraleigenschaften der GFP-Fluoreszenz verändern, oder Modifikationen, die eine erhöhte Fluoreszenz aufweisen, wenn sie in Zellen bei einer Temperatur oberhalb von 30°C exprimiert werden, wie beschrieben in PCT/DK96/00051, veröffentlicht als WO 97/11094 am 27. März 1997 und hier unter Bezugnahme eingebracht, und das ein von Aequorea Green Fluorescent Protein (GFP) abstammendes Fluoreszenz-Protein oder jegliches funktionelles Analogon davon umfasst, bei dem die Aminosäure an Position 1 oberhalb des Chromophoren mutiert worden ist, um einen Anstieg der Fluoreszenzintensität bereitzustellen, wenn das erfindungsgemäße Fluoreszenzprotein in Zellen exprimiert wird. Bevorzugte GFP-Varianten sind F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP und F64L-S65T-GFP. Eine besonders bevorzugte GFP-Variante zur Verwendung in allen Aspekten dieser Erfindung ist EGFP (DNA kodierend EGFP das eine F64L-S65T-Variante ist, deren Codons für die Expression in Säugerzellen optimiert sind, ist von Clontech, Palo Alto, erhältlich, Plasmide enthaltend die EGFP-DNA-Sequenz vgl. GenBank Zugangs-Nrn.: U55762, U55763).
  • Von dem Ausdruck „intrazellulärer Signalweg" und „Signaltransduktionsweg" ist beabsichtigt, dass er die koordinierten intrazellulären Prozesse anzeigt, bei denen lebende Zellen ein externes oder internes Signal in zelluläre Antworten übertragen. Derartige Signaltransduktion schließt eine enzymatische Reaktion ein, wobei die Enzyme Proteinkinasen, GTPasen, ATPasen, Proteinphosphatasen, Phospholipasen einschließen, aber nicht auf sie beschränkt sind. Die zellulären Antworten schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Gentranskription, Sekretion, Proliferation, mechanische Aktivität, metabolische Aktivität, Zelltod.
  • Der Ausdruck „zweiter Botenstoff" wird verwendet, um eine Komponente mit niedrigem Molekulargewicht anzuzeigen, die an den frühen Ereignissen der intrazellulären Signaltransduktionswege beteiligt sind.
  • Der Ausdruck „Luminophore" wird verwendet, um einen chemischen Stoff anzuzeigen, der die Eigenschaft des Emittierens von Licht entweder von selbst oder durch Stimulation mit chemischen oder physikalischen Mitteln aufweist. Dies schließt Fluoreszenz, Biolumineszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Der Ausdruck „mechanisch intakte lebende Zelle" wird verwendet, um eine Zelle anzuzeigen, die entsprechend den Standardkriterien für diesen bestimmten Zelltyp als lebend angesehen wird, wie Aufrechterhaltung eines normalen Membranpotentials, Energiemetabolismus, Proliferationskapazität, und die keine physikalisch invasive Behandlung erfahren hat, die entworfen wurde, um externe Substanzen in die Zelle einzuführen, wie Mikroinjektion.
  • Der Ausdruck „physiologisch relevant", wenn auf die experimentell bestimmte Neuverteilung einer intrazellulären Komponente angewendet, wie gemessen durch Veränderung in den Lumineszenzeigenschaften oder -verteilung, wird verwendet, um anzuzeigen, dass diese Neuverteilung auf Basis des zugrundeliegenden biologischen Phänomens erklärt werden kann, das zu der Neuverteilung führt.
  • Die Ausdrücke „Bildverarbeitung" und „Bildanalyse" werden verwendet, um eine große Familie von digitalen Datenanalysetechniken oder Kombinationen von derartigen Techniken zu beschreiben, die geordnete Zahlenarrays (Bilder) auf quantitative Information reduzieren, die diese geordneten Zahlenarrays beschreibt. Wenn derartige geordnete Zahlenarrays gemessene Werte von einem physikalischen Prozess darstellen, ist die abgeleitete quantitative Information daher ein Maß für den physikalischen Prozess.
  • Der Ausdruck „Fluoreszenzsonde" wird verwendet, um ein Fluoreszenz-Fusionspolypeptid anzuzeigen, das ein GFP oder jeden funktionellen Teil davon umfasst, der mit einem biologisch aktiven Polypeptid wie vorliegend definiert N- oder C-Terminal fusioniert ist, gegebenenfalls über einen Peptidlinker, der aus einem oder mehreren Aminosäureresten besteht, wobei die Größe des Peptidlinkers selbst nicht kritisch ist, solange die gewünschte Funktionalität der Fluoreszenzsonde aufrechterhalten wird. Eine erfindungsgemäße Fluoreszenzsonde wird in eine Zelle exprimiert und ahmt im Wesentlichen das physiologische Verhalten der biologisch aktiven Polypeptideinheit des Fusionspolypeptids nach.
  • Von dem Ausdruck „Säugerzelle" ist beabsichtigt, dass er jegliche lebende Zelle mit Säugerursprung anzeigt. Die Zelle kann eine etablierte Zelllinie, viele von denen sind von The American Type Culture Collection (ATCC, Virginia, USA) erhältlich, oder eine primäre Zelle mit einer begrenzten Lebensdauer, die von einem Säugergewebe abstammt, einschließlich Gewebe abstammend von einem transgenen Tier, oder eine neu etablierte unsterbliche Zelllinie, abstammend von einem Säugergewebe einschließlich transgenen Geweben, oder eine Hybridzelle oder Zelllinie erhalten durch Fusionieren von verschiedenen Zelltypen mit Säugerursprung, z.B. Hybridoma-Zelllinien, sein. Diese Zellen können gegebenenfalls ein oder mehrere nicht-native Genprodukte, z.B. Rezeptoren, Enzyme, Enzymsubstrate, vor oder zusätzlich zu der Zugabe der Fluoreszenzsonde exprimieren. Bevorzugte Zelllinien schließen fibroblasten Ursprungs, z.B. BHK, CHO, BALB, oder endothelialen Ursprungs, z.B. HUVEC, BAE (bovine artery endothelial), CPAE (cow pulmonary artery endothelial) oder pankreatischen Ursprungs, z.B. RIN, INS-1, MIN6, bTC3, aTC6, bTC6, HIT, oder hematopoietischen Ursprungs, z.B. adipocytischen Ursprungs, z.B. 3T3-L1, neuronalen/neuroendokrinen Ursprungs, z.B. AtT20, PC12, GH3, muskulären Ursprungs, z.B. SKMC, A10, C2C12, renalen Ursprungs, z.B. HEK293, LLC-PK1, ein, sind aber darauf beschränkt.
  • Von dem Ausdruck „Hybridpolypeptid" ist beabsichtigt, dass er ein Polypeptid anzeigt, das eine Fusion von mindestens einem Teil von jedem von zwei Proteinen, in diesem Fall mindestens ein Teil des grün fluoreszierenden Proteins, und mindestens ein Teil einer katalytischen und/oder regulatorischen Domäne einer Proteinkinase ist. Ferner ist von einem Hybridpolypeptid beabsichtigt, dass es ein Fusionspolypeptid anzeigt, das ein GFP oder mindestens einen Teil des grün fluoreszierenden Proteins, der eine funktionelles Fluorophore enthält, und mindestens einen Teil eines biologisch aktiven Polypeptids wie hier definiert, umfasst, mit der Maßgabe, dass diese Fusion nicht das PKCα-GFP, PKCγ-GFP und PKCε-GFP, offenbart durch Schmidt et al. und Sakai et al, ist. So kann GFP N- oder C-terminal gegebenenfalls über einen Linkerteil oder ein Linkerpeptid, das aus einer Sequenz aus einer oder mehreren Aminosäuren besteht, an ein biologisch aktives Polypeptid angehängt sein. Das Hybridpolypeptid oder Fusionspolypeptid kann als eine Fluoreszenzsonde in intakten lebenden Zellen wirken, die eine DNA-Sequenz tragen, die für das Hybridpolypeptid unter Bedingungen kodiert, welche die Expression des Hybridpolypeptids gestatten.
  • Von dem Ausdruck „Kinase" ist beabsichtigt, dass er ein Enzym anzeigt, das in der Lage ist, eine zelluläre Komponente zu phosphorylieren.
  • Von dem Ausdruck „Proteinkinase" ist beabsichtigt, dass er ein Enzym anzeigt, das in der Lage ist, Serin und/oder Threonin und/oder Tyrosin in Peptiden und/oder Proteinen zu phosphorylieren.
  • Von dem Ausdruck „Phosphatase" ist beabsichtigt, dass er ein Enzym anzeigt, das in der Lage ist, Phosphoserin und/oder Phosphothreonin und/oder Phosphotyrosin in Peptiden und/oder Proteinen zu dephosphorylieren.
  • Im vorliegenden Kontext ist von dem Ausdruck „biologisch aktives Polypeptid" beabsichtigt, dass er ein Polypeptid, das nach Aktivierung intrazelluläre Prozesse beeinflusst, wie ein Enzym, das in intrazellulären Prozesse aktiv ist, oder ein Teil davon, umfassend eine gewünschte Aminosäuresequenz, die eine biologische Funktion aufweist oder eine biologische Wirkung in einem zellulären System ausübt, anzeigt. In dem Polypeptid können eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, insertiert oder ersetzt sein, um seine biologische Funktion, z.B. durch Inaktivmachen einer katalytischen Stelle zu verändern. Vorzugsweise ist das biologisch aktive Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, die an einem intrazellulären Signalweg teilnehmen, wie Enzymen, die in intrazelluläre Phosphorylierungs und Dephosphorylierungsprozessen involviert sind, einschließlich Kinasen, Proteinkinasen und Phosphorylasen, wie hier definiert, aber auch Proteinen, die das Cytoskelett aufbauen, spielen bei der intrazellulären Signaltransduktion wichtige Rollen und sind deshalb in der Bedeutung von „biologisch aktivem Polypeptid" hier eingeschlossen. Stärker bevorzugt ist das biologisch aktive Polypeptid ein Protein, das entsprechend seines Zustandes als aktiviert oder nicht-aktiviert die Lokalisation innerhalb der Zelle, vorzugsweise als eine intermediäre Komponente in einem Signaltransduktionsweg, verändert. Eingeschlossen in diese bevorzugte Gruppe von biologisch aktiven Polypeptiden sind cAMP abhängige Proteinkinasen A.
  • Von dem Ausdruck „eine Substanz mit biologischer Aktivität" ist beabsichtigt, dass er jede Probe anzeigt, die eine biologische Funktion aufweist oder eine biologische Wirkung in einem zellulären System ausübt. Die Probe kann eine Probe eines biologischen Materials wie eine Probe einer Körperflüssigkeit, einschließlich Blut, Plasma, Tränenflüssigkeit, Milch, Urin oder Mikroben- oder Pflanzenextrakt, eine Umweltprobe, enthaltend Verunreinigungen, einschließlich Schwermetallen oder Toxinen, sein, oder sie kann eine Probe sein, die eine Verbindung oder ein Gemisch von Verbindungen enthält, die/das durch organische Synthese oder genetische Techniken hergestellt wurde/n.
  • Die Wendung „jede Veränderung der Fluoreszenz" meint jede Veränderung in Absorptions-Eigenschaften, wie Wellenlänge und Intensität, oder jede Veränderung in spektralen Eigenschaften des emittierten Lichts, wie eine Veränderung der Wellenlänge, Fluoreszenzlebensdauer, Intensität oder Polarisation, oder jede Veränderung in der intrazellulären Lokalisation der Fluorophore. Es kann daher auf einer spezifischen zellulären Komponente (z.B. Organelle, Membran, Cytoskelett, molekulare Struktur) lokalisiert sein, oder es kann gleichmäßig in der Zelle oder in Teilen der Zellen verteilt sein.
  • Die Wendung „Zurückverfolgen eines Signaltransduktionswegs" ist beabsichtigt, anzuzeigen.
  • Der Ausdruck „Organismus" wie vorliegend verwendet zeigt jeden einzelligen oder mehrzelligen Organismus an, der vorzugsweise aus dem Tierreich stammt einschließlich Protozoanen, aber auch Organismen, die Teile des Pflanzenreiches sind, wie Algen, Pilze, Bryophyten, und vaskuläre Pflanzen sind in dieser Definition eingeschlossen.
  • Von dem Ausdruck „Nukleinsäure" ist beabsichtigt, dass er jeden Typ von Poly- oder Oligonukleinsäuresequenzen, wie eine DNA-Sequenz, eine cDNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz, anzeigt.
  • Von dem Ausdruck „biologisch äquivalent", sofern er Proteine betrifft, ist beabsichtigt, dass er meint, dass ein erstes Protein äquivalent zu einem zweiten Protein ist, falls die zellulären Funktionen der zwei Proteine sich jeweils ersetzen können, z.B. falls die zwei Proteine eng verwandte Isoformen sind, die durch verschiedene Gene kodiert werden, wenn sie Spleißvarianten sind, oder allelische Varianten, die von demselben Gen abstammen, falls sie identische zelluläre Funktionen in unterschiedlichen Zelltypen durchführen, oder in unterschiedlichen Spezies. Von dem Ausdruck „biologisch äquivalent", sofern er DNA betrifft, ist beabsichtigt, dass er meint, dass eine erste DNA-Sequenz, die ein Polypeptid kodiert, zu einer zweiten DNA-Sequenz äquivalent ist, die ein Polypeptid kodiert, falls die durch die zwei Gene kodierten funktionellen Proteine biologisch äquivalent sind.
  • Von der Wendung „Zurückverfolgen eines Signaltransduktionsweges" ist beabsichtigt, dass sie einen Prozess zum genaueren Definieren anzeigt, auf welcher Ebene ein Signaltransduktionsweg beeinflusst ist, entweder durch den Einfluss chemischer Verbindungen oder eines Krankheitszustands in einem Organismus. Betrachten wir einen spezifischen Signaltransduktionsweg, dargestellt durch die bioaktiven Polypeptide A-B-C-D, mit Signaltransduktion von A zu D. Wenn alle Komponenten dieses Signaltransduktionsweges untersucht werden, können Verbindungen oder Krankheitszustände, welche die Aktivität oder Neuverteilung von ausschließlich D beeinflussen, als auf C oder stromabwärts von C wirkend angenommen werden, während Verbindungen oder Krankheitszustände, welche die Aktivität oder Neuverteilung von C und D, aber nicht von A oder B beeinflussen, als stromabwärts von B wirkend angenommen werden können.
  • Der Ausdruck „fixierte Zellen" wird verwendet, um Zellen zu meinen, die mit einem cytologischen Fixiermittel wie Glutaraldehyd oder Formaldehyd behandelt sind, Behandlungen, die dazu dienen, chemisch lösliche und unlösliche Proteine innerhalb der Struktur der Zelle zu vernetzen und zu stabilisieren. Einmal in die sem Stadium, können solche Proteine von der Struktur der nun toten Zelle nicht mehr verloren gehen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 CHO-Zellen, die das PKAc-F64L-S65T-GFP-Hybridprotein exprimieren, sind in HAM's F12-Medium mit 50 mM Forskolin bei 37°C behandelt worden. Die Bilder der GFP-Fluoreszenz in diesen Zellen sind bei verschiedenen Zeitintervallen nach der Behandlung gemacht worden, nämlich: a) 40 Sekunden, b) 60 Sekunden, c) 70 Sekunden, d) 80 Sekunden. Die Fluoreszenz verändert sich von einer punktförmigen zu einer mehr gleichmäßigen Verteilung innerhalb des (nicht-nukleären) Zytoplasmas.
  • 2. Zeitraffer-Analyse von Forskolin-induzierter PKAc-F64L-S65T-GFP-Neuverteilung. CHO-Zellen, exprimierend das PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein, wurden durch zeitabhängige Fluoreszenz-Mikroskopie analysiert. Fluoreszenz-Mikroskopbilder wurden bei regulären Intervallen von 2 Minuten bis zu 8 Minuten nach der Zugabe des Agonisten erhalten. Die Zellen wurden mit 1 mM Forskolin herausgefordert, sobald das obere linke Bild erhalten wurde (t = 0). Rahmen wurden bei den folgenden Zeiten gewonnen: i) 0, ii) 1, iii) 2, iv) 3, v) 4, und vi) 5 Minuten. Größenskala 10 mm.
  • 3. Zeitraffer-Analysen der PKAc-F64L-S65T-GFP-Neuverteilung als Antwort auf verschiedene Agonisten. Die Wirkungen von 1 mM Forskolin (A), 50 mM Forskolin (B), 1 mM dbcAMP (C) und 100 mM IBMX (D) (Zugaben durch offene Pfeile angezeigt) auf die Lokalisierung des PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein wurden durch Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie von CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP-Zellen analysiert. Die Wirkung der Zugabe von 10 mM Forskolin (offener Pfeil), schnell gefolgt durch wiederholtes Waschen mit Puffer (gefüllter Pfeil) auf die Lokalisation des PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein wurde in denselben Zellen analysiert (E). In einem parallelen Experiment wurde die Wirkung des Zugebens von 10 mM Forskolin und 100 mM IBMX (offener Pfeil) gefolgt durch wiederholtes Waschen mit Puffer enthaltend 100 mM IBMX (gefüllter Pfeil) analysiert (F). Das Entfernen von Forskolin bewirkte, dass das PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein zu den zytoplasmatischen Aggregaten zurückkehrte, während dies durch die kontinuierliche Gegenwart von IBMX verhindert wird (F). Die Wirkung von 100 mM Glucagon (3G, offener Pfeil) auf die Lokalisierung des PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein wird auch für BHK/GR, PKAc-F64L-S65T-GFP-Zellen gezeigt. Die Wirkung von 10 mM Noradrenalin (H), gefüllter Pfeil, auf die Lokalisation des PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein wurde in ähnlicher Weise analysiert, in transient transfizierten CHO, PKAc-F64L-S65T-GFP-Zellen, vorbehandelt mit 10 mM Forskolin, offener Pfeil, um [cAMP]i zu erhöhen. N. B. in 3H zählt die x-Achse die Bilderanzahl, mit 12 Sekunden zwischen den Bildern. Die Rohdaten dieses Experiments bestanden aus 60 Fluoreszenz-Mikroskopbildern, erhalten bei gleichmäßigen Intervallen einschließlich verschiedene Bilder, die vor der Zugabe von Puffer oder Agonisten erhalten wurden. Die Diagramme (A-G) zeigen jeweils eine Quantifizierung der Antwort, die über alle 60 Bilder gesehen wurde, durchgeführt wie beschrieben in Analyse Verfahren 2. Die Veränderung der Gesamtfläche der hochfluoreszenten Aggregate, bezogen auf die Anfangsfläche der fluoreszenten Aggregate, ist als Ordinate in allen Graphen in 3 gegenüber der Zeit für jedes Experiment aufgetragen. Größenskala 10 mm.
  • 4. Dosis-Antwort-Kurve (zwei Experimente) für Forskolin-induzierte Neuverteilung der PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion.
  • 5. Zeit zwischen dem Beginn einer Antwort und halb maximialer (t1/2max) und maximaler (tmax) PKAc-F64L-S65T-GFP-Neuverteilung. Die Daten wurden von Kurven wie diejenigen extrahiert, die in „2" gezeigt sind. Alle t1/2max und tmax-Werte sind als Mittelwerte ± SD dargestellt und basieren auf einer Gesamtzahl von 26 bis 30 Zellen aus 2-3 unabhängigen Experimenten für jede Forskolinkonzentration. Da die beobachtete Neuverteilung über die Zeit andauert, wurden die tmax-Werte als der früheste Zeitpunkt genommen, an dem eine vollständige Neu verteilung erreicht ist. Es ist zu bemerken, dass die Werte nicht mit dem Grad der Neuverteilung in Beziehung stehen.
  • 6. Parallele Dosis-Antwort-Analysen von Forskolin induziertem cAMP-Anstieg und PKAc-F64L-S65T-GFP-Neuverteilung. Die Wirkungen von Puffer oder 5 ansteigenden Forskolinkonzentrationen auf die Lokalisation des PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein in CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP-Zellen, wachsen gelassen in einer 96-Vertiefungen-Platte, wurden wie oben beschrieben, analysiert. Das Berechnen des Verhältnisses der SD's der Fluoreszenz-Mikroskopbildern, die von demselben Zellenfeld genommen wurden, vor und 30 Minuten nach der Zugabe von Forskolin, ergaben ein reproduzierbares Maß der PKAc-F64L-S65T-GFP-Neuverteilung. Der Graph zeigt die einzelnen 48 Messungen und eine Spur ihrer Mittelwerte ± s.e.m. bei verschiedenen Forskolinkonzentrationen an. Zum Vergleich wurden die Wirkungen von Puffer oder 8 ansteigenden Konzentrationen von Forskolin auf [cAMP]i durch einen Sintillation-Proximitäts-Assay von Zellen analysiert, die unter denselben Bedingungen wachsen gelassen wurden. Der Graph zeigt eine Spur des Mittelwertes ± s.e.m. der 4 Experimente an, ausgedrückt in willkürlichen Einheiten.
  • 7. BHK-Zellen, stabil transfiziert mit dem humanen muskarinischen (hM1)-Rezeptor und der PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion. Carbachol (100 mM bei 1 Sekunde hinzugefügt) induzierte eine transiente Neuverteilung von PKAc-F64L-S65T-GFP vom Zytoplasma zu der Plasmamembran. Bilder wurden bei den folgenden Zeiten genommen: a) 1 Sekunde vor Carbachol-Zugabe, b) 8,8 Sekunden nach Zugabe und c) 52,8 Sekunden nach Zugabe.
  • 8. BHK-Zellen, die mit dem hM1-Rezeptor und der PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion stabil transfiziert waren, wurden mit Carbachol (1 mM, 10 mM, 100 mM) behandelt. In Einzelzellen wurde das intrazelluläre [Ca2+] gleichzeitig mit der Neuverteilung von PKAc-F64L-S65T-GFP aufgezeichnet. Die gestrichelte Linie zeigt die Zugabezeiten von Carbachol an. Die obere Tafel zeigt die Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration individueller Zellen mit der Zeit bei jeder Behandlung. Die mittlere Tafel zeigt die Veränderungen der durchschnittli chen zytoplasmatischen GFP-Fluoreszenz für individuelle Zellen gegenüber der Zeit für jede Behandlung. Die untere Tafel zeigt Veränderungen in der Fluoreszenz der Peripherie von Einzelzellen, innerhalb von Regionen, die spezifisch den umgebenden Rand einer Zelle wie in der normalen Projektion gesehen einschließen, die Regionen, welche die beste Chance eröffnen, Veränderungen der Fluoreszenzintensität der Plasmamembran zu überwachen.
  • 9
    • a) Die hERK1-F64L-S65T-GFP-Fusion exprimiert in HEK293-Zellen behandelt mit 100 mM MEK1 Inhibitor PD98059 in HAM F-12 (ohne Serum) für 30 Minuten bei 37°C. Die Kerne werden ihrer Fluoreszenz während dieser Behandlung entleert.
    • b) Dieselben Zellen wie in (a) gefolgt von Behandlung mit 10 % fötalem Kälberserum für 15 Minuten bei 37°C.
    • c) Zeitprofile für die Neuverteilung von GFP-Fluoreszenz in HEK293-Zellen nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von EGF in Hepes-Puffer (HAM F-12 ersetzt durch Hepes-Puffer direkt vor dem Experiment). Die Neuverteilung der Fluoreszenz ist als die Veränderung in dem Verhältniswert zwischen Flächen im Kern und Zytoplasma von Einzelzellen ausgedrückt. Jedes Zeitprofil ist der Mittelwert für Veränderungen, die in 6 Einzelzellen gesehen wurden.
    • d) Balken-Diagramm für die Endpunktmessungen, 600 Sekunden nach Start der EGF-Behandlungen, der Fluoreszenz-Veränderung (Kern: Zytoplasma) nach verschiedenen Konzentrationen von EGF.
  • 10.
    • a) Die SMAD2-EGFP-Fusion, exprimiert in HEK293-Zellen mit Serumentzug über Nacht in HAM F-12. HAM F-12 wurde dann durch Hepes-Puffer pH 7,2 genau vor dem Experiment ersetzt. Größenskala ist 10 mm.
    • b) HEK293-Zellen, welche die SMAD2-EGFP-Fusion exprimieren, wurden mit verschiedenen Konzentrationen an TGF-beta wie angegeben behandelt, und die Neuverteilung der Fluoreszenz wurde gegenüber die Zeit aufgetragen. Die Zeitprofil-Auftragungen stellen Anstiege in der Fluoreszenz im Kern dar, normalisiert auf Startwerte in jeder gemessenen Zelle. Jede Spur ist das Zeitprofil für einen einzelnen Zellkern.
    • c) Ein Balkendiagramm, das die Endpunktveränderung der Fluoreszenz innerhalb von Kernen (nach 850 Behandlungssekunden) für verschiedene Konzentrationen an TGF-beta darstellt. Jeder Balken ist der Wert für einen Einzelkern in jedem Experiment.
  • 11. Die VASP-F64L-S65T-GFP-Fusion in CHO-Zellen, die mit dem humanen Insulinrezeptor stabil transfiziert waren. Den Zellen wurde zwei Stunden lang in HAM F-12 das Serum entzogen, dann wurden sie mit 10 %igem fötalem Kälberserum behandelt. Das Bild zeigt die resultierende Neuverteilung der Fluoreszenz nach 15 Behandlungsminuten. GFP-Fluoreszenz wird in Strukturen lokalisiert, die als fokale Adhäsionen entlang der Länge der Aktin-Stressfasern identifiziert wurden.
  • 12. Zeit-abhängige Aufzeichnung der GLUT4-GFP-Neuverteilung in CHO-HIR-Zellen. Die Zeit zeigt Minuten nach der Zugabe von 100 nM Insulin an.
  • BEISPIEL 1
  • Konstruktion, Testen und Implementierung eines Assays für cAMP basierend auf PKA-Aktivierung in Echtzeit in lebenden Zellen.
  • Nützlich zum Überwachen der Aktivität von Signalwegen, die zu veränderten Konstruktionen an cAMP führen, z.B. Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die an G-Proteine der Gs oder Gi-Klasse koppeln.
  • Die katalytische Untereinheit der murinen cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKAc) wurde C-terminal an ein F64L-S65T-Derivat von GFP fusioniert. Die resultierende Fusion (PKAc-F64L-S65T-GFP) wurde zum in vivo Überwachen der Translokation und dadurch der Aktivierung von PKA verwendet.
  • Konstruktion der PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion:
  • Geeignete Restriktionsendonucleasestellen wurden durch Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) in cDNAs eingeführt, die für murine PKAc (GenBank Zugangs-Nr.: M12303) und F64L-S65T-GFP (Sequenz offenbart in WO 97/11094) kodierten. Die PCR-Reaktionen wurden entsprechend Standardprotokollen mit den folgenden Primern durchgeführt:
    5'PKAc: TTggACACAAgCTTTggACACCCTCAggATATgggCAACgCCgCCgCCgCCAAg (SEQ ID NO: 3),
    3'PKAc: gTCATCTTCTCgAgTCTTTCAggCgCgCCCAAACTCAgTAAACTCCTTgCCACAC (SEQ ID NO: 4),
    5'GFP: TTggACACAAgCTTTggACACggCgCgCCATgAgTAAAggAgAAgAACTTTTC (SEQ ID NO: 1),
    3'GFP: gTCATCTTCTCgAgTCTTACTCCTgAggTTTgTATAgTTCATCCATgCCATgT (SEQ ID NO: 2).
  • Das PKAc-Amplifikations-Produkt wurde dann mit HindIII + AscI verdaut und das F64L-S65T-GFP Produkt mit AscI + XhoI. Die zwei verdauten PCR-Produkte wurden nachfolgend mit einem HindIII + XhoI verdauten Plasmid ligiert (pZeoSV® Säuger Expressionsvektor, Invitrogen, San Diego, CA, USA). Das resultierende Fusions-Konstrukt (SEQ ID NO: 68 & 69) war unter Kontrolle des SV40 Promotors.
  • Transfektion und Zell-Kulturbedingungen.
  • Chinesische Hamstereierstockzellen (Chinese Hamster Ovary Cells, CHO) wurden mit dem Plasmid enthaltend die PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion unter Verwendung des Calcium-Phosphat-Präzipitat-Verfahrens in HEPES-gepufferter Salzlösung transfiziert (Sambrook et al. 1989). Stabile Transfektanten wurden selektiert unter Verwenden von 1000 mg Zeocin/ml (Invitrogen) in dem Wachstumsmedium (DMEM mit 1000 mg Glucose/l, 10 % fötalem Rinderserum (fetal bovine serum, FBS), 100 mg Penicillin-Streptomycin-Mischung ml–1, 2 mM L-Glutamin, gekauft von Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Untransfizierte CHO-Zellen wurden als Kontrolle verwendet. Um die Wirkung von Glucagon auf die Fusionsproteintranslokation zu testen, wurde die PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion stabil in Baby-Hamsternierenzellen exprimiert, welche den humanen Glucagon Rezeptor überexprimierten (BHK/GR-Zellen). Untransfizierte BHK/GR-Zellen wurden als Kontrolle verwendet. Die Expression des GR wurde mit 500 mg G418/ml (Neo Marker) aufrechterhalten und PKAc-F64L-S65T-GFP wurde mit 500 mg Zeocin/ml (Sh ble Marker) aufrechterhalten. CHO-Zellen wurden auch gleichzeitig mit Vektoren cotransfiziert, welche die PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion und den humanen a2a Adrenoceptor (hARa2a) enthielten.
  • Für die Fluoreszenz-Mikroskopie wurden die Zellen auf Lab-Tek Deckelgläsern (coverglasses), die mit Kammern versehen waren, mindestens 24 Stunden lang adherieren gelassen (Nalge Nunc. Int., Naperville, IL, USA) und bis 80 % Konfluenz kultiviert. Vor den Experimenten wurden die Zellen über Nacht ohne Selektionsdruck in HAM F-12-Medium mit Glutamax (Life Technologies), 100 mg Penicillin-Streptomycin-Mischung ml–1 und 0,3 % FBS kultiviert. Dieses Medium hat eine niedrige Autofluoreszenz, was die Fluoreszenz-Mikroskopie der Zellen direkt aus dem Inkubator ermöglicht.
  • Überwachen der Aktivität von PKA-Aktivität in Echtzeit:
  • Das Erhalten von Bildern von lebenden Zellen wurde erreicht unter Verwenden eines Zeiss Axiovert 135M Fluoreszenz-Mikroskops, ausgestattet mit einem Fluar 40X, NA: 1,3 Öl-Immersionsobjektiv und gekoppelt an eine Photometrics CH250 Digital-(charged coupled device, CCD) Kamera. Die Zellen wurden mit einer 100 W HBO Bogenlampe beleuchtet. In dem Lichtweg war ein 470 ± 20 nm Anregungs-Filter, ein 510 nm Dichroitischer Spiegel und ein 515 ± 15 nm Emissions- Filter für minimalen Bildhintergrund. Die Zellen wurden mit einer selbstgebauten Heizung des Mikroskoptisches gehalten und überwacht, damit sie bei 37°C waren.
  • Die Bilder wurden auf die folgende Weise verarbeitet und analysiert:
  • Verfahren 1: Schrittweises Verfahren zur Quantifizierung der Translokation von PKA:
    • 1. Das Bild wurde bezüglich dunklem Strom (dark current) durch Durchführen einer "pixel-by-pixel"-Subtraktion eines dunklen Bildes korrigiert (ein Bild, das unter denselben Bedingungen wie das gegenwärtige Bild gemacht wird, mit der Ausnahme, dass der Kameraverschluss nicht geöffnet wird).
    • 2. Das Bild wurde bezüglich Nicht-Einheitlichkeit der Beleuchtung durch Durchführen eines "pixel-by-pixel"-Verhältnisses mit einem Flachfeld-Korrekturbild korrigiert (ein Bild, das unter denselben Bedingungen wie das gegenwärtige Bild von einer einheitlich fluoreszierenden Probe gemacht wird).
    • 3. Das Bild-Histogram, d.h., die Frequenz des Auftretens jedes Intensitäts-Wertes in dem Bild wurde berechnet.
    • 4. Eine geglättete, zweite Abteilung des Histogramms wurde berechnet und die zweite Null wird bestimmt. Diese Null entspricht dem Wendepunkt des Histogramms auf der hohen Seite des Haupt-Peaks, der die Hauptmasse der Bild-Pixel-Werte darstellt.
    • 5. Der in Schritt 4 bestimmte Wert wurde von dem Bild abgezogen. Alle negativen Werte wurden verworfen.
    • 6. Die Varianz (Quadrat der Standard-Abweichung) der verbliebenen Pixel-Werte wurde bestimmt. Dieser Wert stellt die „Antwort" für das Bild dar.
    • 7. Scintillations-Proximität-Assay (scintillation proximity assay, SPA) für die unabhängige Quantifizierung von cAMP.
  • Verfahren 2: Alternativverfahren zur Quantifizierung der PKA-Neuverteilung:
    • 1. Die Fluoreszenzaggregate werden von jedem Bild unter Verwenden eines automatisch gefundenen Grenzwertes basierend auf der Maximierung der Informationsmessung zwischen dem Objekt und dem Hintergrund abgetrennt. Die a priori Entropie des Bildhistogramms wird als das Informationsmaß verwendet.
    • 2. Die Fläche jedes Bildes, die durch die Aggregate bedeckt ist, wird durch Zählen der Pixel in den segmentierten Flächen berechnet.
    • 3. Der in Schritt 2 erhaltene Wert für jedes Bild in einer Serie, oder Behandlungspaar, wird bezüglich des Wertes normalisiert, der für das erste (nicht stimulierte) aufgezeichnete Bild gefunden wurde. Ein Wert von Null(0) zeigt keine Neuverteilung der Fluoreszenz ausgehend von der Startbedingung an. Ein Wert von Eins (1) durch dieses Verfahren entspricht einer vollen Neuverteilung.
  • Zellen wurden in HAM F-12-Medium wie oben beschrieben kultiviert, aber in Platten mit 96 Vertiefungen. Das Medium wurde mit Ca2+-HEPES-Puffer mit 100 mM IBMX ausgetauscht und die Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen an Forskolin 10 Minuten lang stimuliert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von NaOH auf 0,14 M gestoppt und die Menge an cAMP wurde mit dem cAMP-SPA-Kit, RPA538 (Amersham) wie durch den Hersteller beschrieben, gemessen.
  • Manipulieren von intrazellulären cAMP-Spiegeln, um die PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion zu testen.
  • Die folgenden Verbindungen wurden verwendet, um cAMP-Spiegel zu variieren: Forskolin, ein Aktivator der Adenylatcyclase; dbcAMP, ein Membran-permeables cAMP Analogon, das durch Phosphodiesterase nicht abgebaut wird; IBMX, ein Inhibitor der Phosphodiesterase.
  • CHO-Zellen, die stabil PKAc-F64L-S65T-GFP exprimierten, zeigten eine dramatische Translokation des Fusionsproteins von einer punktförmigen Verteilung zu einer gleichförmigen Verteilung über das Zytoplasma nach einer Stimulierung mit 1 mM Forskolin (n = 3), 10 mM Forskolin (n = 4) und 50 mM Forskolin (n = 4) (1), oder dbcAMP bei 1 mM (n = 6).
  • 2 zeigt den Fortschritt der Antwort in der Zeit nach Behandlung mit 1 mM Forskolin.
  • 3 gibt einen Vergleich für durchschnittliche Zeitprofile der Fusionsprotein-Neuverteilung und ein Maß für das Ausmaß jeder Antwort auf die drei Forskolinkonzentrationen (3A, E, B) und auf 1 mM dbcAMP (3C), das eine ähnliche, aber langsamere Antwort hervorrief, und auf die Zugabe von 100 mM IBMX (n = 4, 3D), das auch eine langsame Antwort herorrief, sogar in der Abwesenheit einer Adenylatcyclasestimulation. Zugabe von Puffer (n = 2) hatte keine Wirkung (Daten nicht gezeigt).
  • Als eine Kontrolle für das Verhalten des Fusionsproteins wurde F64L-S65T-GFP alleine in CHO-Zellen exprimiert und diesen wurde auch 50 mM Forskolin verabreicht (n = 5); die einheitliche diffuse Verteilung, die für GFP in diesen Zellen charakteristisch ist, wurde durch solch eine Behandlung nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt).
  • Die Forskolin induzierte Translokation von PKAc-F64L-S65T-GFP zeigte eine Dosis-Antwort-Beziehung (4 und 6), siehe quantitative Verfahren oben.
  • Reversibilität der PKAc-F64L-S65T-GFP-Translokation:
  • Die Freisetzung der PKAc-Sonde von ihren zytoplasmatischen Anker-Punkten (hotspots) war reversibel. Wiederholtes Waschen der Zellen (5-8mal) mit Puffer nach 10 μM Forskolinbehandlung stellte das punktförmige Muster innerhalb 2-5 Minuten vollständig wieder her (n = 2, 3E). Tatsächlich kehrte das Fusionsprotein zu einem Muster von Fluoreszenz-zytoplasmatischen-Aggregaten zurück, das praktisch von denjenigen ununterscheidbar war, das vor Forskolinstimulation beobachtet wurde.
  • Um zu testen, ob die Rückkehr des Fusionsproteins zu den zytoplasmatischen Aggregaten eine Abnahme in [cAMP]i wiederspiegelte, wurden die Zellen mit einer Kombination von 10 mM Forskolin und 100 mM IBMX (n = 2) behandelt und dann wiederholt gewaschen (5-8 mal) mit Puffer enthaltend 100 mM IBMX (3F). In diesen Experimenten kehrte das Fusionsprotein nicht zu seiner prestimulatorischen Lokalisation nach Entfernung von Forskolin zurück.
  • Test der PKA-F64L-S65T-GFP-Sonde mit biologisch relevanten Mitteln
  • Um die Antwort der Probe auf die Rezeptoraktivierung der Adenylatcyclase zu testen, wurden BHK Zellen, die mit dem Glucagonrezeptor und der PKA-F64L-S65T-GFP-Sonde stabil transfiziert waren, einer Glucagonstimulation ausgesetzt. Der Glucagonrezeptor ist an ein Gs-Protein gekoppelt, das Adenylatcyclase aktiviert, wodurch der cAMP-Spiegel erhöht wird. In diesen Zellen führte die Zugabe von 100 mM Glucagon (n = 2) zur Freisetzung der PKA-F64L-S65T-GFP-Sonde von den zytoplasmatischen Aggregaten und zu einer resultierenden Translokation des Fusionsproteins zu einer gleichmäßigeren zytoplasmatischen Verteilung innerhalb von 2 bis 3 Minuten (3G). Ähnliche, aber weniger deutliche Wirkungen wurden bei tieferen Glucagonkonzentrationen gesehen (n = 2, Daten nicht gezeigt). Zugabe von Puffer (n = 2) hatte keine Wirkung über den Zeitraum (Daten nicht gezeigt).
  • Transient transfizierte CHO-Zellen exprimierend hARa2a und die PKA-F64L-S65T-GFP-Sonde wurden mit 10 mM Forskolin 7,5 Minuten lang behandelt, dann, immer in Gegenwart von Forskolin, 10 mM Noradrenalin ausgesetzt, um die exogenen Adrenorezeptoren zu stimulieren, die an ein Gi Protein koppeln, das Adenylatcyclase inhibiert. Diese Behandlung führte zum Wiederauftreten von Fluoreszenz in den zytoplasmatischen Aggregaten, was für einen Abfall in [cAMP]i bezeichnend ist (3H).
  • Die Translokation des Fusionsproteins korrelierte mit [cAMP]i
  • Wie oben beschrieben war die Zeit, die notwendig war, damit einer Antwort vollständig wurde, abhängig von der Forskolin-Dosis (5). Zusätzlich war auch der Grad der Antworten dosisabhängig. Um die PKA-F64L-S65T-GFP-Fusionsproteintranslokation in einem System mit halb-hohem Durchsatz (Semi high through-put system) zu testen, wurden mit der PKA-F64L-S65T-GFP-Fusion stabil transfizierte CHO-Zellen mit Puffer und 5 ansteigenden Dosen Forskolin (n = 8) stimuliert. Unter Verwenden des oben beschriebenen Bildverarbeitungsalgorithmus (Verfahren 1) wurde eine dosisabhängige Beziehung im Bereich von 0,01 bis 50 mM Forskolin beobachtet (6). Eine halbmaximale Stimulation wurde bei etwa 2 mM Forskolin beobachtet. Parallel wurden Zellen mit Puffer und 8 ansteigenden Konzentrationen von Forskolin (n = 4) im Bereich von 0,01 bis 50 mM stimuliert. Die Menge an hergestelltem cAMP wurde in einem SPA Assay gemessen. Ein steiler Anstieg wurde zwischen 1 und 5 mM Forskolin beobachtet, was mit dem steilsten Teil der Kurve für die Fusionsproteintranslokation zusammenfällt (siehe auch 6).
  • REFERENZEN
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  • Ausführungsform 1. Assay zum Nachweis von cAMP auf der Basis von PKA-Aktivierung, umfassend die Schritte:
    • (a) Züchten mindestens einer Zelle, enthaltend eine Nukleotidsequenzkodierung für ein Hybridpolypeptid, umfassend eine Fluorophore, die an die katalytische Untereinheit von cAMP-abhängiger Proteinkinase (PKAc) unter Bedingungen, die die Expression der Nukleotidsequenz gewähren, wahlweise durch eine Verbindungsgruppe N-terminal oder C-terminal markiert ist,
    • (b) Inkubieren der mindestens einen Zelle mit einem für die biologische Funktion oder biologische Wirkung zu testenden Stoff und
    • (c) Messen der Fluoreszenz, die von der mindestens einen inkubierten Zelle erzeugt wird und Bestimmen des Ergebnisses oder der Veränderung im Hinblick auf die Fluoreszenz, wobei ein solches Ergebnis oder eine solche Veränderung die Translokation von PKAc und dadurch eine abgeänderte Konzentration von cAMP angibt.
  • Ausführungsform 2. Verfahren nach Ausführungsform 1, wobei Schritt (c) durch Gewinnen von quantitativen Informationen, die mit der Translokation des Bestandteils in Beziehung stehen, durch Aufzeichnen der Veränderung in räumlich verteiltem Licht, das von der Fluorophore emittiert wird, wobei eine solche Veränderung die Translokation des Bestandteils in der Zelle oder den Zellen anzeigt, durchgeführt wird.
  • Ausführungsform 3. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1-2, wobei Schritt (c) zu einem einzigen Zeitpunkt nach dem Ausbringen des Stoffs durchgeführt wird.
  • Ausführungsform 4. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1-2, wobei Schritt (c) zu zwei Zeitpunkten, einem Punkt vor und dem anderen Punkt nach der Anwendung des Stoffs, durchgeführt wird.
  • Ausführungsform 5. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1-2, wobei das emittierte Licht der Zelle oder Zellen vor der Inkubation der Zelle oder Zellen mit dem Stoff gemessen wird und das Ergebnis oder die Veränderung, das/die in Schritt (c) bestimmt wird, eine Änderung im emittierten Licht im Vergleich zu dem emittierten Licht, das vor der Inkubation der Zelle oder Zellen mit dem Stoff gemessen wird, ist.
  • Ausführungsform 6. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1-2, wobei die Aufzeichnung zu einer Reihe von Zeitpunkten durchgeführt wird, wobei die Anwendung des Einflusses eine gewisse Zeit nach dem ersten Zeitpunkt in der Reihe der Aufzeichnungen stattfindet, indem die Aufzeichnung z.B. mit einem vorbestimmten Zeitabstand von 0,1 Sekunden bis 1 Stunde, vorzugsweise von 1 bis 60 Sekunden, stärker bevorzugt von 1 bis 30 Sekunden, insbesondere von 1 bis 10 Sekunden über eine Zeitspanne von 1 Sekunde bis 12 Stunden wie von 10 Sekunden bis 12 Stunden, z.B. von 10 Sekunden bis 1 Stunde wie von 60 Sekunden bis 30 Minuten oder 20 Minuten durchgeführt wird.
  • Ausführungsform 7. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1-2, wobei die Zelle oder Zellen zu einem Zeitpunkt nach der Anwendung des Stoffs, an welchem die Antwort als bedeutsam vorbestimmt wurde, fixiert wird/werden und die Aufzeichnung zu einer willkürlichen späteren Zeit durchgeführt wird.
  • Ausführungsform 8. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei die Veränderung oder das Ergebnis in Hinblick auf das räumlich verteilte Licht, das von der Fluorophore emittiert wird, durch eine Änderung im Resonanzenergietransfer zwischen der Fluorophore und einer anderen lumineszierenden Einheit, die Energie an die Fluorophore abgeben kann, nachgewiesen wird, wobei jede dieser ausgewählt worden ist oder künstlich erzeugt worden ist, um ein Teil von bestimmten Bestandteilen des intrazellulären Weges zu werden oder an diese gebunden oder mit diesen assoziiert zu werden, und eine der beiden einer Translokation in Antwort auf den Einfluss unterzogen wird, wodurch die Menge des Resonanzenergietransfers verändert wird, wobei die Veränderung des Resonanzenergietransfers als eine Veränderung in der Intensität der Emission von der Fluorophore gemessen wird.
  • Ausführungsform 9. Verfahren nach Ausführungsform 8, wobei die Änderung der Intensität in der Intensität der Emission von der Fluorophore durch einen einkanaligen Lichtdetektor abgetastet wird, der nur der mittleren Intensität der Fluorophore in einer nichträumlich aufgelösten Art entspricht.
  • Ausführungsform 10. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei die Eigenschaft des aufgezeichneten Lichts die Intensität, Fluoreszenzlebensdauer, Polarisierung, Wellenlängenverschiebung oder eine andere Eigenschaft ist, die als Ergebnis der zugrunde liegenden zellulären Antwort modulliert wird.
  • Ausführungsform 11. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1-8 und 10, insoweit Ausführungsform 10 nicht von Ausführungsform 9 abhängt, wobei das Aufzeichnen des räumlich verteilten Lichts unter Verwendung eines Aufzeichnungssystems durchgeführt wird, das die räumliche Verteilung einer aufzeichenbaren Eigenschaft des Lichts in Form einer geregelten Anordnung von Werten aufzeichnet.
  • Ausführungsform 12. Verfahren nach Ausführungsform 11, wobei das Aufzeichnen der räumlichen Verteilung der aufzeichenbaren Eigenschaft des Lichts unter Verwendung einer Ladungstransfervorrichtung wie eines CCD-Arrays oder einer Vakuumröhrenvorrichtung wie einer Vidiconröhre durchgeführt wird.
  • Ausführungsform 13. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei Schritt (c) durch Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wird.
  • Ausführungsform 14. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1-8, 10 und 13, insoweit Ausführungsformen 10 und 13 nicht von Ausführungsform 9 abhängen, wobei das Aufzeichnen der Veränderung oder des Ergebnisses in Hinsicht auf das von der Fluorphore emittierte Licht durchgeführt wird, indem das räumlich verteilte Licht als eines oder mehrere digitale Bilder aufgezeichnet wird, und die Verarbeitung der aufgezeichneten Veränderung zu deren Umsetzung in eine oder mehrere Zahlen, die für den Grad der Neuverteilung repräsentativ sind, ein Verfahren zur Digitalbildverarbeitung oder eine Kombination von Verfahren zur Digitalbildverarbeitung umfasst.
  • Ausführungsform 15. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei der intrazelluläre Weg ein intrazellulärer Signalweg ist.
  • Ausführungsform 16. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei die Fluorophore ein Grün-Fluoreszenz-Protein (GFP) ist.
  • Ausführungsform 17. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei das GFP ausgewählt ist aus der Gruppe von GFPs mit der F64L-Mutation.
  • Ausführungsform 18. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei das GFP eine GFP-Variante, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP, F64L-S65T-GFP und EGFP ist.
  • Ausführungsform 19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ausführungsformen, wobei die Nukleotidsequenz eine DNA-Sequenz ist.
  • Ausführungsform 20. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei die Zelle oder Zellen eine Säugerzelle/Säugerzellen ist/sind, die während des Zeitraums, über den der Einfluss beobachtet wird, bei einer Temperatur von 30°C oder höher inkubiert wird/werden, vorzugsweise bei einer Temperatur von 32°C bis 39°C, stärker bevorzugt bei einer Temperatur von 35°C bis 33°C und am stärksten bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 37°C.
  • Ausführungsform 21. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei mindestens eine Zelle ein Teil einer Matrix von identischen oder nichtidentischen Zellen ist.
  • Ausführungsform 22. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei die Zelle oder Zellen aus der Gruppe, bestehend aus Pilzzellen wie eine Hefezelle, Invertebratzellen einschließlich Insektenzellen und Vertebratzellen wie Säugerzellen ausgewählt wird/werden.
  • Ausführungsform 23. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei das Verfahren der Erfindung ein Screening-Programm ist.
  • Ausführungsform 24. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei das Verfahren ein Screening-Programm zur Identifizierung eines biologisch aktiven Stoffs ist, der direkt oder indirekt einen intrazellulären Signalweg beeinflusst und als Medikament potentiell nützlich ist, wobei das Ergebnis oder die einzelne Messung von jedem Stoff gescreent wird, was anzeigt, dass dessen potentielle biologische Aktivität auf der Messung der Neuverteilung von räumlich aufgelöster Lumineszenz in lebenden Zellen beruht und einer Veränderung in der Verteilung über Aktivierung eines intrazellulären Signalweges unterzogen wird.
  • Ausführungsform 25. Verfahren nach einer der vorangehenden Ausführungsformen, wobei das Verfahren ein Screening-Programm zur Identifizierung eines biologisch toxischen Stoffs wie hier definiert ist, der seine toxische Wirkung durch Unterbrechen eines intrazellulären Signalwegs ausübt, wobei das Ergebnis der einzelnen Messung von jedem Stoff gescreent wird, was anzeigt, dass dessen biologisch potentielle toxische Aktivität auf der Messung der Neuverteilung der Fluorophore in lebenden Zellen beruht und einer Veränderung in der Verteilung über Aktivierung eines intrazellulären Signalweges unterzogen wird.
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Claims (25)

  1. Assay zum Nachweis von cAMP auf der Basis von PKA-Aktivierung, umfassend die Schritte: (a) Züchten mindestens einer Zelle, enthaltend eine Nukleotidsequenzkodierung für ein Hybridpolypeptid, umfassend eine Fluorophore, die mit der katalytischen Untereinheit von cAMP-abhängiger Proteinkinase (PKAc) unter Bedingungen, die die Expression der Nukleotidsequenz gewähren, wahlweise durch eine Verbindungsgruppe N-terminal oder C-terminal markiert ist, (b) Inkubieren der mindestens einen Zelle mit einem für die biologische Funktion oder biologische Wirkung zu testenden Stoff und (c) Messen der Fluoreszenz, die von der mindestens einen inkubierten Zelle erzeugt wird und Bestimmen des Ergebnisses oder der Veränderung in Hinblick auf die Fluoreszenz, wobei ein solches Ergebnis oder eine solche Veränderung die Translokation von PKAc und dadurch eine veränderte Konzentration von cAMP anzeigt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) durch Gewinnen von quantitativen Informationen, die mit der Translokation des Bestandteils in Beziehung stehen, durch Aufzeichnen der Veränderung in räumlich verteiltem Licht, das von der Fluorophore emittiert wird, wobei eine solche Veränderung die Translokation des Bestandteils in der Zelle oder den Zellen anzeigt, durchgeführt wird.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, wobei Schritt (c) zu einem einzigen Zeitpunkt nach dem Aufbringen des Stoffs durchgeführt wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, wobei Schritt (c) zu zwei Zeitpunkten, einem Punkt vor und dem anderen Punkt nach der Anwendung des Stoffs, durchgeführt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, wobei das emittierte Licht der Zelle oder Zellen vor der Inkubation der Zelle oder Zellen mit dem Stoff gemessen wird und das Ergebnis oder die Veränderung, das/die in Schritt (c) bestimmt wird, eine Änderung im emittierten Licht im Vergleich zu dem emittierten Licht, das vor der Inkubation der Zelle oder Zellen mit dem Stoff gemessen wird, ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, wobei die Aufzeichnung zu einer Reihe von Zeitpunkten durchgeführt wird, wobei die Anwendung des Einflusses eine gewisse Zeit nach dem ersten Zeitpunkt in der Reihe der Aufzeichnungen stattfindet, indem die Aufzeichnung z.B. mit einem vorbestimmten Zeitabstand von 0,1 Sekunden bis 1 Stunde, vorzugsweise von 1 bis 60 Sekunden, stärker bevorzugt von 1 bis 30 Sekunden, insbesondere von 1 bis 10 Sekunden über eine Zeitspanne von 1 Sekunde bis 12 Stunden wie von 10 Sekunden bis 12 Stunden, z.B. von 10 Sekunden bis 1 Stunde wie von 60 Sekunden bis 30 Minuten oder 20 Minuten durchgeführt wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, wobei die Zelle oder Zellen zu einem Zeitpunkt nach der Anwendung des Stoffs, an welchem die Antwort als bedeutsam vorbestimmt wurde, fixiert wird/werden und die Aufzeichnung zu einer willkürlichen späteren Zeit durchgeführt wird.
  8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Veränderung oder das Ergebnis in Hinblick auf das räumlich verteilte Licht, das von der Fluorophore emittiert wird, durch eine Änderung im Resonanzenergietransfer zwischen der Fluorophore und einer anderen lumineszierenden Einheit, die Energie an die Fluorophore abgeben kann, nachgewie sen wird, wobei jede dieser ausgewählt worden ist oder künstlich erzeugt worden ist, um ein Teil von bestimmten Bestandteilen des intrazellulären Weges zu werden oder an diese gebunden oder mit diesen assoziiert zu werden, und eine der beiden eine Translokation in Antwort auf den Einfluss durchmacht, wodurch die Menge des Resonanzenergietransfers verändert wird, wobei die Veränderung des Resonanzenergietransfers als eine Veränderung in der Intensität der Emission von der Fluorophore gemessen wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Änderung der Intensität in der Intensität der Emission von der Fluorophore durch einen einkanaligen Lichtdetektor abgetastet wird, der nur der mittleren Intensität der Fluorophore in einer nichträumlich aufgelösten Art entspricht.
  10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Eigenschaft des aufgezeichneten Lichts die Intensität, Fluoreszenzlebensdauer, Polarisierung, Wellenlängenverschiebung oder eine andere Eigenschaft ist, die als Ergebnis der zugrunde liegenden zellulären Antwort modulliert wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8 und 10, insoweit Anspruch 10 nicht von Anspruch 9 abhängt, wobei das Aufzeichnen des räumlich verteilten Lichts unter Verwendung eines Aufzeichnungssystems durchgeführt wird, das die räumliche Verteilung einer aufzeichenbaren Eigenschaft des Lichts in Form einer geregelten Anordnung von Werten aufzeichnet.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Aufzeichnen der räumlichen Verteilung der aufzeichenbaren Eigenschaft des Lichts unter Verwendung einer Ladungstransfervorrichtung wie eines CCD-Arrays oder einer Vakuumröhrenvorrichtung wie einer Vidiconröhre durchgeführt wird.
  13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Schritt (c) durch Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wird.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, 10 und 13, insoweit die Ansprüche 10 und 13 nicht von Anspruch 9 abhängen, wobei das Aufzeichnen der Veränderung oder des Ergebnisses in Hinsicht auf das von der Fluorophore emittierte Licht durchgeführt wird, indem das räumlich verteilte Licht als eines oder mehrere digitale Bilder aufgezeichnet wird, und die Verarbeitung der aufgezeichneten Veränderung zu deren Umsetzung in eine oder mehrere Zahlen, die für den Grad der Neuverteilung repräsentativ sind, ein Verfahren zur Digitalbildverarbeitung oder eine Kombination von Verfahren zur Digitalbildverarbeitung umfasst.
  15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der intrazelluläre Weg ein intrazellulärer Signalweg ist.
  16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Fluorophore ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) ist.
  17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das GFP ausgewählt ist aus der Gruppe von GFPs mit der F64L-Mutation.
  18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das GFP eine GFP-Variante, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP, F64L-S65T-GFP und EGFP ist.
  19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidsequenz eine DNA-Sequenz ist.
  20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelle oder Zellen eine Säuferzelle/Säugerzellen ist/sind, die während des Zeitraums, über den der Einfluss beobachtet wird, bei einer Temperatur von 30°C oder höher inkubiert wird/werden, vorzugsweise bei einer Temperatur von 32°C bis 39°C, stärker bevorzugt bei einer Temperatur von 35°C bis 38°C und am stärksten bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 37°C.
  21. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens eine Zelle ein Teil einer Matrix von identischen oder nichtidentischen Zellen ist.
  22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelle oder Zellen aus der Gruppe, bestehend aus Pilzzellen wie eine Hefezelle, Invertebratzellen einschließlich Insektenzellen und Vertebratzellen wie Säugerzellen ausgewählt wird/werden.
  23. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren der Erfindung ein Screening-Programm ist.
  24. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ein Screening-Programm zur Identifizierung eines biologisch aktiven Stoffs ist, der direkt oder indirekt einen intrazellulären Signalweg beeinflusst und als Medikament potentiell nützlich ist, wobei das Ergebnis oder die einzelne Messung von jedem Stoff gescreent wird, was anzeigt, dass dessen potentielle biologische Aktivität auf der Messung der Neuverteilung von räumlich aufgelöster Lumineszenz in lebenden Zellen beruht und eine Veränderung in der Verteilung über Aktivierung eines intrazellulären Signalweges durchmacht.
  25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ein Screening-Programm zur Identifizierung eines biologisch toxischen Stoffs wie hier definiert ist, der seine toxische Wirkung durch Unterbrechen eines intrazellulären Signalwegs ausübt, wobei das Ergebnis der ein zelnen Messung von jedem Stoff gescreent wird, was anzeigt, dass dessen biologisch potentielle toxische Aktivität auf der Messung der Neuverteilung der Fluorophore in lebenden Zellen beruht und eine Veränderung in der Verteilung über Aktivierung eines intrazellulären Signalweges durchmacht.
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