DE1199564T1 - Verfahren zum Screenen von Substanzen die einen effekt auf intrazelluläre Translokation haben - Google Patents

Verfahren zum Screenen von Substanzen die einen effekt auf intrazelluläre Translokation haben

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DE1199564T1 DE1199564T DE01204477T DE1199564T1 DE 1199564 T1 DE1199564 T1 DE 1199564T1 DE 1199564 T DE1199564 T DE 1199564T DE 01204477 T DE01204477 T DE 01204477T DE 1199564 T1 DE1199564 T1 DE 1199564T1
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Claims (33)

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von intrazellulärer Translokation eines Bestandteils eines intrazellulären Weges, der die intrazellulären Prozesse beeinflusst, umfassend:
(a) Züchten einer oder mehrerer Zellen, enthaltend eine Nukleotidsequenzkodierung für ein Hybridpolypeptid, umfassend ein Luminophor, der mit dem Bestandteil unter Bedingungen
verbunden ist, die eine Exprimierung der Nukleotidsequenz gewähren,
(b) Inkubieren der Zelle oder Zellen mit einem für die biologische Funktion oder biologische Wirkung zu screenenden Stoff und
(c) Messen des Lichts, das von dem Luminophor in der inkubierten Zelle oder den inkubierten Zellen emittiert wird und Bestimmen des Ergebnisses oder der Veränderung in Hinblick auf das emittierte Licht vom Luminophor, wobei eine solche Veränderung die Translokation des Bestandteils in der
Zelle oder den Zellen anzeigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) durch Gewinnen von quantitativen Informationen, die mit der Translokation des Bestandteils in Beziehung stehen, durch Aufzeichnen der Veränderung in räumlich verteiltem Licht, das vom Luminophor emittiert wird, wobei eine solche Veränderung die Translokation des Bestandteils in der Zelle oder den Zellen anzeigt.
-2-
DEAEP* &Ggr;*1 99 564 Tl
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Bestandteil ein biologisch aktives Polypeptid ist und das Verfahren weiter den folgenden Schritt umfasst:
(d) Messen der Wirkung des Stoffs auf die Hem-
mung/Aktivierung der enzymatischen Aktivität des biolo
gisch aktiven Polypeptids.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei der Stoff ein Stoff ist, dessen Einfluss auf einen intrazellulären Weg bestimmt werden soll.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei der Schritt (c) zu einem einzelnen Zeitpunkt nach der Anwendung des Stoffs durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei der Schritt (c) zu zwei Zeitpunkten durchgeführt wird, wobei ein Punkt vor und der andere Punkt nach der Anwendung des Stoffs liegt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das emittierte Licht der Zelle oder Zellen vor der Inkubation der Zelle oder Zellen mit dem Stoff gemessen wird und das/die in Schritt (c) bestimmte Ergebnis oder Veränderung eine Veränderung des emittierten Lichts verglichen mit dem emittierten Licht, das vor der Inkubation der Zelle oder Zellen mit dem Stoff gemessen wurde, ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Aufzeichnung mittels einer Serie von Zeitpunkten durchgeführt wird, bei welchen die Anwendung des Einflusses einige Zeit nach dem ersten Zeitpunkt in den Aufzeichnungsserien auftritt, indem die Aufzeichnung z.B. mit einem vorbestimmten Zeitabstand von 0,1 Sekunden bis 1 Stunde, vorzugsweise von 1 bis 60 Sekunden, stärker bevorzug von 1 bis 30 Sekunden, insbesondere von 1 bis 10 Sekunden über eine Zeitspanne von 1 Sekunde bis 12 Stunden
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-3-
DE/EP 1 199 564 Tl
wie von IO Sekunden bis 12 Stunden, z.B. von 10 Sekunden bis 1 Stunde wie von 60 Sekunden bis 30 Minuten oder 20 Minuten durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Zelle oder Zellen zu einem Zeitpunkt nach der Anwendung des Stoffs, bei welchem die Antwort als bedeutsam vorbestimmt wurde, fixiert wird/werden und die Aufzeichnung zu einer willkürlichen späteren Zeit durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Luminophor ein Luminophor ist, das in einer Weise translokalisiert werden kann, die für den Grad des Stoffs physiologisch relevant ist.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Luminophor ein Luminophor ist, das in einer Weise translokalisiert werden kann, von welcher experimentell bestimmt wurde, dass sie mit dem Grad des Stoffs in Beziehung steht.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die „Veränderung oder das Ergebnis in Hinblick auf das räumlich verteilte Licht, das durch das Luminophor emittiert wird, durch eine Veränderung des Resonanzenergietransfer zwischen dem Luminophor und einer anderen lumineszierenden Einheit nachgewiesen wird, die dem Luminophor Energie liefern kann, wobei jede dieser ausgewählt worden ist oder künstlich erzeugt worden ist, um ein Teil von bestimmten Bestandteilen des intrazellulären Weges zu werden oder an diese gebunden oder mit diesen assoziiert zu werden, und eine der beiden einer Translokation in Antwort auf den Einfluss unterzogen wird, wodurch die Menge des Resonanzenergietransfers verändert wird, wobei die Veränderung des Resonanzenergietransfers als eine Veränderung in der Intensität der Emission vom Luminophor gemessen wird.
• V
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DE/EP 1 199 564 TI
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Veränderung in der Intensität der Emission vom Luminophor durch einen einkanaligen Lichtdetektor abgetastet wird, der nur der. mittleren Intensität des Luminophors in einer nichträumlich aufgelösten Art entspricht.
5
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Eigenschaft des aufgezeichneten Lichts die Intensität, Fluoreszenz, Lebensdauer, Polarisierung, Wellenlängenverschiebung oder eine andere Eigenschaft ist, die als Ergebnis der zugrunde liegenden zellulären Antwort moduliert wird.
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Aufzeichnen des räumlich verteilten Lichts unter Verwendung eines Aufzeichnungssystems durchgeführt wird, das die räumliche Verteilung einer aufzeichenbaren Eigenschaft des Lichts in Form einer geregelten Anordnung von .Werten aufzeichnet.
16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Aufzeichnen der räumlichen Verteilung der aufzeichenbaren Eigenschaft des Lichts unter Verwendung einer Ladungstransfervorrichtung wie einem CCD-Array oder einer Vakuumröhrenvorrichtung wie einer Vidiconröhre durchgeführt wird.
17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Schritt (c) durch Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wird.
18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Aufzeichnen der Veränderung oder des Ergebnisses in Hinsicht auf das von der Luminophore emittierte Licht durchgeführt wird, indem das räumlich verteilte Licht als eines oder mehrere digitale Bilder aufgezeichnet wird, und die Verarbeitung der aufgezeichneten Veränderung zu deren Umset-
-5-
zung in eine oder mehrere Zahlen, die für den Grad der Neuverteilung repräsentativ sind, ein Verfahren zur Digitalbildverarbeitung oder eine Kombination von Verfahren zur Digitalbildverarbeitung umfasst.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der intrazelluläre Weg ein intrazellulärer Signalweg ist.
20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Luminophor ein Fluorophor ist.
21. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Luminophor ein Grün-Fluoreszenz-Protein (GFP) ist.
22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das GFP ausgewählt ist aus GFPs mit der F64L-Mutation.
23. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das GFP eine GFP-Variante, ausgewählt aus F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP, F64L-S65T-GFP und EGFP ist.
24. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidsequenz eine DNA-Sequenz ist.
25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die biologisehe Funktion oder biologische Wirkung eine Aktivierung ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 24, wobei die biologische Funktion oder biologische Wirkung eine Deaktivierung ist.
27. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelle oder Zellen eine Säugerzelle oder Säugerzellen ist/sind, die während des Zeit-
-6-
raums, über den der Einfluss beobachtet wird, bei einer Temperatur von 3O0C oder höher inkubiert wird/werden, vorzugsweise bei einer Temperatur von 320C bis 390C, stärker bevorzugt bei einer Temperatur von 350C bis 380C und am stärksten bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 370C. 5
28. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens eine Zelle ein Teil einer Matrix von identischen oder nichtidentischen Zellen ist.
29. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelle oder Zellen aus der Gruppe, bestehend aus Pilzzellen wie eine Hefezelle, Invertebratzellen einschließlich Insektenzellen und Vertebratzellen wie Säugerzellen ausgewählt wird/werden.
30. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren der Erfindung ein Screening-Programm ist.
31. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ein Screening-Programm zur Identifizierung eines biologisch aktiven Stoffs ist, der direkt oder indirekt einen intrazellulären Signalweg beeinflusst und als Medikament potentiell nützlich ist, wobei das Ergebnis oder die einzelne Messung von jedem Stoff gescreent wird, was anzeigt, dass dessen potentielle biologische Aktivität auf der Messung der Neuverteilung von räumlich verteilter Lumineszenz in lebenden Zellen beruht und einer Veränderung in der Verteilung über Aktivierung eines intrazellulären Signalweges unterzogen wird.
32. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ein Screening-Programm zur Identifizierung eines biologisch toxischen Stoffs wie hier definiert ist, der seine toxische Wirkung durch Unterbrechen eines intrazellulären Signalwegs ausübt, wobei das Ergebnis der ein-
zelnen Messung von jedem Stoff gescreent wird, was anzeigt, dass dessen potentielle toxische Aktivität auf der Messung der Neuverteilung des Luminophors in lebenden Zellen beruht und einer Veränderung in der Verteilung über Aktivierung eines intrazellulären Signalweges unterzogen wird.
33. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das biologisch aktive Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Proteinkinase, einer Phosphatase, einem Transkriptionsfaktor und einem Protein, das mit einem Zytoskelett-Netzwerk verbunden ist, das zelluläre Lokalisierung über Aktivierung verändert, besteht.
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