DE1199564T1 - Verfahren zum Screenen von Substanzen die einen effekt auf intrazelluläre Translokation haben - Google Patents
Verfahren zum Screenen von Substanzen die einen effekt auf intrazelluläre Translokation habenInfo
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Claims (33)
1. Verfahren zum Nachweis von intrazellulärer Translokation eines Bestandteils
eines intrazellulären Weges, der die intrazellulären Prozesse beeinflusst, umfassend:
(a) Züchten einer oder mehrerer Zellen, enthaltend eine Nukleotidsequenzkodierung
für ein Hybridpolypeptid, umfassend ein Luminophor, der mit dem Bestandteil unter Bedingungen
verbunden ist, die eine Exprimierung der Nukleotidsequenz gewähren,
(b) Inkubieren der Zelle oder Zellen mit einem für die biologische
Funktion oder biologische Wirkung zu screenenden Stoff und
(c) Messen des Lichts, das von dem Luminophor in der inkubierten Zelle oder den inkubierten Zellen emittiert wird und
Bestimmen des Ergebnisses oder der Veränderung in Hinblick auf das emittierte Licht vom Luminophor, wobei eine
solche Veränderung die Translokation des Bestandteils in der
Zelle oder den Zellen anzeigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) durch Gewinnen von quantitativen
Informationen, die mit der Translokation des Bestandteils in Beziehung
stehen, durch Aufzeichnen der Veränderung in räumlich verteiltem Licht, das vom Luminophor emittiert wird, wobei eine solche Veränderung
die Translokation des Bestandteils in der Zelle oder den Zellen anzeigt.
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DEAEP* &Ggr;*1 99 564 Tl
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Bestandteil ein biologisch
aktives Polypeptid ist und das Verfahren weiter den folgenden Schritt umfasst:
(d) Messen der Wirkung des Stoffs auf die Hem-
mung/Aktivierung der enzymatischen Aktivität des biolo
gisch aktiven Polypeptids.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei der Stoff ein Stoff ist,
dessen Einfluss auf einen intrazellulären Weg bestimmt werden soll.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei der Schritt (c) zu einem
einzelnen Zeitpunkt nach der Anwendung des Stoffs durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei der Schritt (c) zu zwei
Zeitpunkten durchgeführt wird, wobei ein Punkt vor und der andere Punkt nach der Anwendung des Stoffs liegt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das emittierte Licht der
Zelle oder Zellen vor der Inkubation der Zelle oder Zellen mit dem Stoff gemessen wird und das/die in Schritt (c) bestimmte Ergebnis oder Veränderung
eine Veränderung des emittierten Lichts verglichen mit dem emittierten Licht, das vor der Inkubation der Zelle oder Zellen mit dem Stoff
gemessen wurde, ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Aufzeichnung mittels
einer Serie von Zeitpunkten durchgeführt wird, bei welchen die Anwendung des Einflusses einige Zeit nach dem ersten Zeitpunkt in den Aufzeichnungsserien
auftritt, indem die Aufzeichnung z.B. mit einem vorbestimmten Zeitabstand von 0,1 Sekunden bis 1 Stunde, vorzugsweise von 1
bis 60 Sekunden, stärker bevorzug von 1 bis 30 Sekunden, insbesondere von 1 bis 10 Sekunden über eine Zeitspanne von 1 Sekunde bis 12 Stunden
, «♦** «♦ ■*■*■■ ··. ·»*■*
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DE/EP 1 199 564 Tl
wie von IO Sekunden bis 12 Stunden, z.B. von 10 Sekunden bis 1 Stunde
wie von 60 Sekunden bis 30 Minuten oder 20 Minuten durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Zelle oder Zellen zu
einem Zeitpunkt nach der Anwendung des Stoffs, bei welchem die Antwort als bedeutsam vorbestimmt wurde, fixiert wird/werden und die Aufzeichnung
zu einer willkürlichen späteren Zeit durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Luminophor
ein Luminophor ist, das in einer Weise translokalisiert werden kann, die für den Grad des Stoffs physiologisch relevant ist.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Luminophor
ein Luminophor ist, das in einer Weise translokalisiert werden kann, von welcher experimentell bestimmt wurde, dass sie mit dem Grad des
Stoffs in Beziehung steht.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die „Veränderung
oder das Ergebnis in Hinblick auf das räumlich verteilte Licht, das durch das Luminophor emittiert wird, durch eine Veränderung des Resonanzenergietransfer
zwischen dem Luminophor und einer anderen lumineszierenden Einheit nachgewiesen wird, die dem Luminophor Energie
liefern kann, wobei jede dieser ausgewählt worden ist oder künstlich erzeugt worden ist, um ein Teil von bestimmten Bestandteilen des intrazellulären
Weges zu werden oder an diese gebunden oder mit diesen assoziiert zu werden, und eine der beiden einer Translokation in Antwort auf den
Einfluss unterzogen wird, wodurch die Menge des Resonanzenergietransfers verändert wird, wobei die Veränderung des Resonanzenergietransfers
als eine Veränderung in der Intensität der Emission vom Luminophor gemessen wird.
• V
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DE/EP 1 199 564 TI
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Veränderung
in der Intensität der Emission vom Luminophor durch einen einkanaligen
Lichtdetektor abgetastet wird, der nur der. mittleren Intensität des Luminophors in einer nichträumlich aufgelösten Art entspricht.
5
5
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Eigenschaft
des aufgezeichneten Lichts die Intensität, Fluoreszenz, Lebensdauer,
Polarisierung, Wellenlängenverschiebung oder eine andere Eigenschaft ist, die als Ergebnis der zugrunde liegenden zellulären Antwort moduliert
wird.
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Aufzeichnen
des räumlich verteilten Lichts unter Verwendung eines Aufzeichnungssystems durchgeführt wird, das die räumliche Verteilung einer
aufzeichenbaren Eigenschaft des Lichts in Form einer geregelten Anordnung von .Werten aufzeichnet.
16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Aufzeichnen
der räumlichen Verteilung der aufzeichenbaren Eigenschaft des Lichts unter Verwendung einer Ladungstransfervorrichtung wie einem
CCD-Array oder einer Vakuumröhrenvorrichtung wie einer Vidiconröhre durchgeführt wird.
17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Schritt (c)
durch Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wird.
18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Aufzeichnen
der Veränderung oder des Ergebnisses in Hinsicht auf das von der Luminophore emittierte Licht durchgeführt wird, indem das räumlich
verteilte Licht als eines oder mehrere digitale Bilder aufgezeichnet wird, und die Verarbeitung der aufgezeichneten Veränderung zu deren Umset-
-5-
zung in eine oder mehrere Zahlen, die für den Grad der Neuverteilung repräsentativ
sind, ein Verfahren zur Digitalbildverarbeitung oder eine Kombination von Verfahren zur Digitalbildverarbeitung umfasst.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der intrazelluläre
Weg ein intrazellulärer Signalweg ist.
20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Luminophor
ein Fluorophor ist.
21. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Luminophor
ein Grün-Fluoreszenz-Protein (GFP) ist.
22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das GFP ausgewählt
ist aus GFPs mit der F64L-Mutation.
23. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das GFP eine
GFP-Variante, ausgewählt aus F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP, F64L-S65T-GFP
und EGFP ist.
24. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidsequenz
eine DNA-Sequenz ist.
25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die biologisehe
Funktion oder biologische Wirkung eine Aktivierung ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 24, wobei die biologische Funktion
oder biologische Wirkung eine Deaktivierung ist.
27. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelle oder
Zellen eine Säugerzelle oder Säugerzellen ist/sind, die während des Zeit-
-6-
raums, über den der Einfluss beobachtet wird, bei einer Temperatur von
3O0C oder höher inkubiert wird/werden, vorzugsweise bei einer Temperatur
von 320C bis 390C, stärker bevorzugt bei einer Temperatur von 350C
bis 380C und am stärksten bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 370C.
5
28. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens
eine Zelle ein Teil einer Matrix von identischen oder nichtidentischen Zellen ist.
29. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelle oder
Zellen aus der Gruppe, bestehend aus Pilzzellen wie eine Hefezelle, Invertebratzellen
einschließlich Insektenzellen und Vertebratzellen wie Säugerzellen
ausgewählt wird/werden.
30. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren
der Erfindung ein Screening-Programm ist.
31. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren
ein Screening-Programm zur Identifizierung eines biologisch aktiven
Stoffs ist, der direkt oder indirekt einen intrazellulären Signalweg beeinflusst
und als Medikament potentiell nützlich ist, wobei das Ergebnis oder
die einzelne Messung von jedem Stoff gescreent wird, was anzeigt, dass dessen potentielle biologische Aktivität auf der Messung der Neuverteilung
von räumlich verteilter Lumineszenz in lebenden Zellen beruht und einer Veränderung in der Verteilung über Aktivierung eines intrazellulären
Signalweges unterzogen wird.
32. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren
ein Screening-Programm zur Identifizierung eines biologisch toxischen Stoffs wie hier definiert ist, der seine toxische Wirkung durch Unterbrechen
eines intrazellulären Signalwegs ausübt, wobei das Ergebnis der ein-
zelnen Messung von jedem Stoff gescreent wird, was anzeigt, dass dessen
potentielle toxische Aktivität auf der Messung der Neuverteilung des Luminophors
in lebenden Zellen beruht und einer Veränderung in der Verteilung über Aktivierung eines intrazellulären Signalweges unterzogen
wird.
33. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das biologisch aktive Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Proteinkinase,
einer Phosphatase, einem Transkriptionsfaktor und einem Protein, das mit einem Zytoskelett-Netzwerk verbunden ist, das zelluläre Lokalisierung
über Aktivierung verändert, besteht.
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