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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Hilfsmittel zum
Gewinnen von quantitativen Informationen über einen Einfluss auf eine
zelluläre
Antwort, insbesondere einen Einfluss hervorgerufen durch in Kontakt
bringen oder inkubieren der Zelle mit einem Stoff, der eine zelluläre Antwort
beeinflusst, wobei die zelluläre
Antwort durch Neuverteilung mindestens einer Komponente in der Zelle
deutlich wird. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren
zum Gewinnen von quantitativen Informationen über einen Einfluss auf einen intrazellulären Weg,
das die Neuverteilung mindestens einer Komponente einschließt, die
mit dem Weg assoziiert ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann als eine
sehr effiziente Vorgehensweise zum Testen oder Entdecken des Einflusses
einer Substanz auf einen physiologischen Prozess verwendet werden,
beispielsweise in Verbindung mit dem Screenen nach neuen Arzneimitteln,
dem Testen von Stoffen auf Toxizität, zum Identifizieren von Arzneimitteltargets
(drug targets) von bekannten oder neuen Arzneimitteln. Andere wertvolle
Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens
und der erfindungsgemäßen Technologie
werden für
den Fachmann auf Basis der folgenden Offenbarung deutlich. In einer
besonderen Ausführungsform
der Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum
Detektieren der intrazellulären
Translokation oder Neuverteilung von biologisch aktiven Polypeptiden,
vorzugsweise einem Enzym, die intrazelluläre Prozesse beeinflussen, und
ein DNA-Konstrukt und eine Zelle zur Verwendung in dem Verfahren.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Intrazelluläre Wege
werden durch eine Kaskade von Komponenten streng reguliert, die
einer Modulation in einer zeitlich und räumlich charakteristischen Weise unterliegen.
Bestimmte Krankheitszustände
können
einer veränderten
Aktivität
von einzelnen signalvermittelnden Komponenten zugeordnet werden
(d. h. Proteinkinasen, Proteinphosphatasen, Transkriptionsfaktoren).
Diese Komponenten bieten sich daher selbst als attraktive Ziele
für eine
therapeutische Intervention an.
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Proteinkinasen
und -phosphatasen sind gut beschriebene Komponenten verschiedener
intrazellulärer Signalwege.
Von der katalytischen Aktivität
von Proteinkinasen und -phosphatasen wird angenommen, dass sie in
praktisch allen regulierbaren zellulären Prozessen eine Rolle spielt.
Obwohl die Beteiligung von Proteinkinasen in der zelluläre Signalweitergabe
und -regulation Gegenstand extensiver Studien war, ist ein detailliertes
Wissen über
beispielsweise die exakten zeitlichen und räumlichen Merkmale von Signalübertragungs-Ereignissen
aufgrund des Fehlens einer geeigneten Technologie oft schwierig
zu erhalten.
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Von
neuen Wegen zum Überwachen
der spezifischen Modulation von intrazellulären Wegen in intakten, lebenden
Zellen wird angenommen, dass sie neue Möglichkeiten in der Entdeckung
von Arzneimitteln, der funktionellen Genomforschung (functional
genomics), Toxikologie, dem Überwachen
von Patienten etc. bereitstellen.
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Es
ist wahrscheinlich, dass das räumliche
Zusammenwirken der Proteinkinase-Aktivität für den hohen Grad
der Spezifität
von individuellen Proteinkinasen essentiell ist. Die durch Proteinkinasen
vermittelte Phosphorylierung wird durch Phosphatase-Aktivität ausgeglichen.
Auch innerhalb der Phosphatasen-Familie wurde eine Translokation
beobachtet, z. B. die Translokation von PTP2C zu Membranverwerfungen
[(Cossette et al. 1996)], und in ähnlicher Weise ist es wahrscheinlich,
dass sie für
Phosphatase-Aktivität
bezeichnend ist.
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Proteinkinasen
zeigen oft vor, während
und nach der Aktivierung eine spezifische intrazelluläre Verteilung.
Von dem Überwachen
von Translokationsprozessen und/oder der Neuverteilung von individuellen
Proteinkinasen oder Untereinheiten davon ist es daher wahrscheinlich,
dass es für
ihre funktionelle Aktivität
bezeichnend ist. Eine Verbindung zwischen Translokation und katalytischer
Aktivierung ist für
Proteinkinasen wie die Diacyl-Glycerol-(DAG)-abhängigen Proteinkinase C (PKC),
die cAMP-abhängige
Proteinkinase (PKA) [(DeBernardi et al. 1996)] und die Mitogen-aktivitierte
Proteinkinase ERK1 [(Sano et al. 1995)] gezeigt worden.
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Üblicherweise
verwendete Verfahren zum Nachweisen von intrazellulärer Lokalisation/Aktivität von Proteinkinasen
und -phosphatasen sind Immunoprezipitation, Western-Blotting und
immunocytochemischer Nachweis.
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Wenn
die Familie von Diacyl-Glycerol (DAG)-abhängigen Proteinkinasen C (PKCs)
als ein Beispiel genommen wird, so ist gezeigt worden, dass die
individuellen PKC-Isoformen, die auf verschiedene Gewebe und Zellen
verteilt sind, unterschiedliche Aktivator-Erfordernissen aufweisen
und eine differenzielle Translokation als Antwort auf Aktivierung
zeigen. Katalytisch inaktive DAG-abhängige PKCs
sind im Allgemeinen im Zytoplasma verteilt, während sie nach Aktivierung
translozieren, um mit verschiedenen zellulären Komponenten assoziiert
zu werden, z. B. Plasmamembran [(Farese, 1992), (Fulop Jr. et al.
1995)], Kern [(Khalil et al. 1992)], Cytoskelett [(Blobe et al.
1996)]. Das Translokations-Phänomen, das
für PKC-Aktivierung
bezeichnend ist, ist unter Verwendung unterschiedlicher Ansätze überwacht
worden: a) Immunocytochemie, wobei die Lokalisierung individueller
Isoformen nach Permeabilisierung und Fixierung der Zellen nachgewiesen
werden kann [(Khalil et al. 1992)]; und b) Markieren (tagging) aller
DAG-abhängiger
PKC-Isoformen mit einem Fluoreszenz-markierten Phorbol-Myristat-Acetat
(PMA) [(Godson et al. 1996)]; und c) chemisches Markieren von PKC b1
mit dem Fluorophor Cy3 [(Bastiaens & Jovin 1996)] und d) genetisches
Markieren von PKCα [(Schmidt
et al. 1997)] und von PKCγ und
PKCε [(Sakai
et al. 1996)]. Das erste Verfahren stellt keine dynamischen Informationen
bereit, während
die anderen Verfahren dies tun. Das Markieren von PKC mit Fluoreszenz-markiertem
Phorbol-Myristat-Acetat kann nicht zwischen verschiedenen DAG-abhängigen Isoformen
der PKC unterscheiden, markiert aber alle Isoformen und zeigt die
Bewegung aller Isoformen. Chemisches und genetisches Markieren von
spezifischen DAG-abhängigen
PKCs bestätigte,
dass sie in einer Isoform-spezifischen Weise nach Aktivierung zur
Zellperipherie oder zum Kern wandern.
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In
einem alternativen Verfahren ist Proteinkinase-A-Aktivität in lebenden
Zellen durch chemisches Markieren einer der Kinase-Untereinheiten
gemessen worden (Adams et al. 1991). Die Basis der Methode ist, dass
die regulatorische und katalytische Untereinheit der gereinigten
Proteinkinase-A mit Fluorescein und Rhodamin markiert wird. Bei
niedrigen cAMP-Spiegeln wird Proteinkinase A in eine heterotetramäre Form
zusammengesetzt, die auf Fluoreszenz-Resonanz basierende Energieübertragung
(fluorescence resonance energy transfer) zwischen den zwei Fluoreszenz-Farbstoffen
ermöglicht.
Die Aktivierung von Proteinkinase A führt zur Dissoziation des Komplexes,
wodurch die Energieübertragung
eliminiert wird. Ein Nachteil dieser Technologie ist, dass die markierte
Proteinkinase A in die interessierenden Zellen mikroinjiziert werden
muss. Diese hochinvasive Technik ist mühsam und nicht für das Screenen
einer großen
Anzahl von biologisch aktiven Substanzen anwendbar. Ein weiterer
Nachteil dieser Technik verglichen zu der vorliegenden Erfindung
ist, dass die markierte Proteinkinase-A nicht in Organismen/Tiere
als Transgen eingeführt
werden kann.
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Mochly-Rosen
(Science 268, Seiten 247–251
(1995)) schlägt
vor, dass die Lokalisierung von Ankerproteinen einen Teil der Spezifität der durch
Kinasen vermittelten Antworten bereitstellt. Es wird vorgeschlagen,
dass Inhibitoren der Interaktion zwischen den Kinasen und deren
Ankerproteinen als therapeutische Mittel geeignet sein können.
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Kürzlich wurde
entdeckt, dass das grün-fluoreszierende
Protein (Green Fluorescent Protein (GFP)), das in vielen unterschiedlichen
Zelltypen einschließlich
Säugerzellen
exprimiert wurde, hochfluoreszierend wurde [(Chalfie et al. 1994)].
WO 95/07463 beschreibt eine Zelle, die fähig ist, GFP zu exprimieren,
und ein Verfahren zum Nachweisen eines interessierenden Proteins
in einer Zelle basierend auf dem Einführen eines DNA-Moleküls in eine
Zelle, das eine DNA-Sequenz aufweist, welche das interessierende
Protein mit einer DNA-Sequenz verbindet, die ein GFP kodiert, so
dass das durch das DNA-Molekül
hergestellte Protein das interessierende Protein fusioniert an das
GFP aufweist, dann Kultivieren der Zellen unter Bedingungen, welche die
Expression des fusionierten Proteins erlauben, und Nachweisen der
Lokalisierung der Fluoreszenz in der Zelle, wodurch das interessierende
Protein in der Zelle lokalisiert wird. Beispiele derartiger fusionierter
Proteine werden allerdings nicht bereitgestellt, und die Verwendung
von Fusionsproteinen mit GFP zum Nachweis oder der Quantifizierung
von Translokation oder Neuverteilung biologisch aktiver Polypeptide,
die intrazelluläre Prozesse
nach Aktivierung beeinflussen, wie Proteine, die in Signalwege involviert
sind, z. B. Proteinkinasen oder -phosphatasen, ist nicht vorgeschlagen
worden. WO 95/07463 beschreibt ferner Zellen, die für den Nachweis
von Molekülen
nützlich
sind, wie Hormone oder Schwermetalle, in einer biologischen Sonde,
durch operatives Verbinden eines regulatorischen Elements des Gens,
das durch das interessierende Molekül beeinflusst wird, an ein
GFP, wobei die Anwesenheit der Moleküle das regulatorische Element
beeinflusst, das wiederum die Expression des GFP beeinflusst. Auf
diese Weise wird das Gen kodierend für GFP als Reporter-Gen in einer
Zelle verwendet, die zum Überwachen
der Anwesenheit einer spezifischen molekularen Identität konstruiert
ist.
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Green
Fluorescent Protein ist in einem Test für den Nachweis der Translokation
des Glucokortikoid-Rezeptors (GR) [Carey, KL et al., The Journal
of Cell Biology, Vol. 133, Nr. 5, Seiten 985–996 (1996)] verwendet worden.
Eine GR-S65TGFP-Fusion
ist verwendet worden, um den Mechanismus zu untersuchen, der in
die Translokation des Glucokortikoid-Rezeptors (GR) als Antwort
auf den Agonisten Dexamethason aus dem Cytosol, wo es in der Abwesenheit
eines Liganden anwesend ist, durch die Kernpore in den Kern, wo
es nach Liganden-Bindung
verbleibt, involviert ist. Die Verwendung einer GR-GFP-Fusion ermöglicht die
Echtzeit-Darstellung und Quantifizierung von nukleären/Zytoplasmatischen
Verhältnissen
des Fluoreszenz-Signals.
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WO
97/11094 offenbart neue Varianten des Green Fluorescent Proteins,
GFP, bei denen die Aminosäure
an Position 1 vor dem Chromophor mutiert worden ist, um einen Anstieg
der Fluoreszenz-Aktivität
bereitzustellen. Es wird ferner offenbart, dass diese Mutation zu
einer erhöhten
Fluoreszenz in Zellen führt,
die GFP exprimieren, wenn die Zellen bei einer Temperatur von 30°C oder darüber inkubiert
werden. Es wird ferner vorgeschlagen, dass, da die offenbarten Proteine
signifikant heller als Wild-Typ GFP sind, die Konzentration, die
für die
Visualisierung benötigt
wird, erniedrigt werden kann.
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Schmidt
(FASEB J Vol 11, Nr. 3, Seite 2924 (1997)) offenbart eine dynamische
3-D-Analyse der Translokation eines S65T-mutierten GFP, das an α-PKC fusioniert
ist, induziert durch z. B. Serum und PKC-Agonisten. Sakai et al.
(Japan J. Pharmacol. (73), Seite 69, 1997) offenbart die Verwendung
einer Fusion, von GFP- und PKC-Isoformen um die Translokation von
PKC als Antwort auf verschiedene Aktivatoren zu visualisieren.
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Viele
gegenwärtig
verwendete Screening-Programme, die entworfen wurden, um Verbindungen
zu finden, die Proteinkinase-Aktivität beeinflussen, basieren auf
Messungen der Kinase-Phosphorylierung von artifiziellen oder natürlichen
Substraten der, Rezeptorbindung und/oder der Expression eines Rezeptorgens.
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OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine wichtige neue Dimension in der
Untersuchung von zellulären
Systemen, die Neuverteilung einschließen, dadurch bereit, dass die
Erfindung die Quantifizierung der Neuverteilungsantworten oder -ereignisse
bereitstellt, die durch einen Einfluss hervorgerufen werden, typischerweise den
Kontakt mit einem chemischen Stoff oder einer Mischung von chemischen
Stoffen, aber auch durch Veränderungen
in der physikalischen Umgebung. Die Quantifizierung ermöglicht es
numerisch oder als Kurven oder Graphen ausgedrückt, zwischen den Einflüssen (oder
dem Grad an Einflüssen)
auf zelluläre
Systeme und der Neuverteilungs-Antwort sinnvolle Verbindungen aufzustellen.
Dies ist hoch vorteilhaft, da, wie gefunden wurde, die Quantifizierung
auf sowohl eine schnelle wie eine reproduzierbare Weise erreicht
werden kann, und da – was
vielleicht noch wichtiger ist – die
Systeme, die unter Verwendung des erfindungs gemäßen Verfahrens quantifizierbar
werden, Systeme sind, von denen enorme Mengen an neuer Information
und Einblick abgeleitet werden kann.
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Die
vorliegenden Screening-Assays haben im Vergleich zu anderen Screening-Assays, z. B. Rezeptor-Bindungs-Assays,
enzymatische Assays und Reporter-Gen-Assays
den besonderen Vorteil, dass sie ein System bereitstellen, in dem
biologisch aktive Stoffe mit vollständig neuen Wirkungsarten, z.
B. Inhibition oder Förderung
der Neuverteilung/Translokation eines biologisch aktiven Polypeptids
als ein Weg zum Regulieren seiner Wirkung anstelle der Inhibition/Aktivierung
von enzymatischer Aktivität,
auf eine Weise identifiziert werden können, die eine sehr hohe Selektivität gegenüber der
bestimmten Isoform des biologisch aktiven Polypeptids und ferner
die Entwicklung einer Verbindungs-Selektivität gegenüber anderen Isoformen desselben
biologischen aktiven Polypeptids oder anderen Verbindungen desselben
Signalweges sicherstellt.
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In
ihrem breitesten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Identifizierung eines Medikamentes oder eines toxischen Stoffes,
das/der direkt oder indirekt die Neuverteilung mindestens eines
Bestandteils eines intrazellulären
Weges beeinflusst, wobei das Verfahren das Gewinnen von quantitativen
Informationen über
den Einfluss der Stoffe auf die Neuverteilung durch Aufzeichnen
der Veränderung,
die durch das Inkontaktbringen oder Inkubieren einer mechanisch
intakten lebenden Zelle oder von mechanisch intakten lebenden Zellen
mit dem Stoff verursacht wird, des räumlich verteilten Lichts umfasst,
das von einer Luminophore emittiert wird, die in der Zelle oder
den Zellen vorliegt und die auf eine Weise neu verteilt werden kann,
die mit dem Grad des Einflusses in Beziehung steht und/oder die
mit einem Bestandteil assoziiert sein kann, der auf eine Weise neu
verteilt wird, die mit dem Grad des Einflusses in Beziehung steht,
wobei die Luminophore mindestens einen Anteil eines GFPs umfasst,
wobei die Aminosäure
in Position 1 stromaufwärts
von der Chromophore in dem GFP mutiert worden ist, um einen Anstieg
der Fluoreszenz-Intenstität
bereitzustellen, wenn das fluoreszierende Protein in den Zellen
bei einer Temperatur oberhalb von 30°C exprimiert wird, wobei die
Zelle oder die Zellen bei einer Temperatur von 30°C oder höher während des
Zeitraums, über
den der Einfluss beobachtet wird, inkubiert wird/werden, und Verarbeiten
der aufgezeichneten Veränderung
in dem räumlich
verteilten Licht, um es in eine oder mehrere Zahlen umzusetzen,
die für
den Grad der Neuverteilung gemäß einer Eichung
repräsentativ
sind, die auf den Neuverteilungs-Antworten, die auf die gleiche
Weise aufgezeichnet wurden, auf bekannte Grade eines relevanten
Einflusses beruht, wobei das Ergebnis der Verarbeitung die biologische
Aktivität
des Stoffes anzeigt.
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Die Zellen
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In
der Erfindung ist die Zelle oder sind die Zellen mechanisch intakt
und während
des Experimentes am Leben. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird
die Zelle oder werden die Zellen zu einem Zeitpunkt nach der Anwendung
des Einflusses fixiert, an dem von der Antwort vorherbestimmt wurde,
dass sie signifikant ist, und die Aufzeichnung wird zu einer beliebigen
späteren
Zeit durchgeführt.
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Die
mechanisch intakte lebende Zelle oder intakten lebenden Zellen können ausgewählt werden
aus der Gruppe bestehend aus Pilzzellen oder Zellen, wie eine Hefezelle
oder -zellen; Invertebratenzelle oder -zellen einschließlich Insektenzelle
oder -zellen, und Vertebratenzelle oder -zellen, wie Säugerzelle
oder -zellen. Diese Zelle oder diese Zellen wird/werden während des
Zeitraumes, über
den der Einfluss beobachtet wird, bei einer Temperatur von 30°C oder darüber inkubiert,
vorzugsweise bei einer Temperatur von 32°C bis 39°C, besonders bevorzugt bei einer
Temperatur von 35°C
bis 38°C
und am meisten bevorzugt bei einer Temperatur von 37°C. In einem
erfindungsgemäßen Aspekt
ist die mechanisch intakte lebende Zelle Teil einer Matrix aus identischen
oder nicht identischen Zellen.
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Eine
in der vorliegenden Erfindung verwendete Zelle sollte ein Nukleinsäurekonstrukt
enthalten, das ein Fusions-Polypeptid wie vorliegend definiert enthält, und
in der Lage sein, die von dem Konstrukt kodierte Sequenz zu exprimieren.
Die Zelle ist eine eukaryotische Zelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Pilz zellen, wie Hefezellen, Invertebratenzellen einschließlich Insektenzellen,
und Vertebratenzellen, wie Säugerzellen.
Die bevorzugten Zellen sind Säugerzellen.
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In
einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt
können
die Zellen von einem Organismus sein, der in mindestens einer seiner
Komponentenzellen eine Nukleinsäuresequenz
trägt,
die für
ein wie hier definiertes Fusions-Polypeptid kodiert und die in der
Lage ist, die Nukleinsäuresequenz
zu exprimieren. Der Organismus ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus einzelligen und mehrzelligen Organismen, wie ein Säuger.
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Die Luminophore
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Die
Luminophore ist die Komponente, welche es der Neuverteilung gestattet,
durch Emittieren des Lichts in einer räumlichen Verteilung bezogen
auf den Grad des Einflusses visualisiert und/oder aufgezeichnet zu
werden. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist die Luminophore in der Lage, in einer Weise neu verteilt zu
werden, die für
den Grad des Einflusses physiologisch relevant ist. In einer anderen
Ausführungsform
ist die Luminophore in der Lage, mit einer Komponente zu assoziieren,
die in der Lage ist, in einer Weise neu verteilt zu werden, die
für den
Grad des Einflusses physiologisch relevant ist. In einer anderen
Ausführungsform
kann die Luminophoren-Korrelation zwischen der Neuverteilung der
Luminophore und dem Grad des Einflusses experimentell bestimmt werden.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Aspekt ist die Luminophore
in der Lage, auf im wesentlichen die gleiche Weise wie die mindestens
eine Komponente eines intrazellulären Weges neu verteilt zu werden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist die Luminophore in der Lage, nach räumlicher Assoziation mit einer
Komponente gequencht zu werden, die durch Modulation des Weges neu
verteilt wird, wobei das Quenching als eine Veränderung in der Intensität der Lumineszenz
gemessen wird.
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Die
Luminophore ist ein GFP, bei dem die Aminosäure in Position 1 stromaufwärts von
dem Chromophor in dem GFP mutiert worden ist, um einen Anstieg der
Fluoreszenzintensität
bereitzustellen, wenn das Fluoreszenz-Protein in Zellen bei einer
Temperatur oberhalb etwa 30°C
exprimiert wird. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird das GFP durch eine Nukleinsäuresequenz
kodiert und exprimiert, die in der Zelle oder den Zellen enthalten
ist. Das GFP ist vorzugsweise ein Hybrid-Polypeptid umfassend eine Fusion
von mindestens einem Teil jedes der zwei Polypeptide, von denen
eines das GFP umfasst, und das andere ein biologisch aktives Polypeptid
umfasst. Das GFP ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe von grünen Fluoreszenz-Proteinen
mit der F64L-Mutation wie F64L-GFP, F64L-Y666H-GFP, F64L-S65T-GFP,
und EGFP.
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Das
GFP könnte
N- oder C-terminal mit einer Markierung (tag), gegebenenfalls über einen
Peptidlinker, an das biologisch aktive Peptid oder einen Teil oder
eine Untereinheit davon gebunden sein. Die Fluoreszenz-Sonde könnte eine
Komponente eines intrazellulären
Signalwegs sein. Die Sonde wird durch ein Nukleinsäurekonstrukt
kodiert. Der zu untersuchende Weg in der vorliegenden Erfindung
könnte
ein intrazellulärer Signalweg
sein.
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Der Einfluss
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In
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
könnte
der Einfluss der Kontakt zwischen der mechanisch intakten lebenden
Zelle oder der Gruppe von mechanisch intakten lebenden Zellen mit
einem chemischen Stoff und/oder die Inkubation der mechanisch intakten
lebenden Zelle oder der Gruppe von mechanisch intakten lebenden
Zellen mit einem chemischen Stoff sein. Der Einfluss moduliert die
intrazellulären Prozesse.
In einem Aspekt könnte
die Modulation eine Aktivierung der intrazellulären Prozesse sein. In einem anderen
Aspekt könnte
die Modulierung eine Deaktivierung der intrazellulären Prozesse
sein. In noch einem anderen Aspekt könnte der Einfluss die Neuverteilung
ohne direktes Beeinflussen der metabolischen Aktivität der Komponente
der intrazellulären
Prozesse inhibieren oder fördern.
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In
einer Ausführungsform
wird die Erfindung als Basis für
ein Screening-Programm
verwendet, bei dem die Wirkung von unbekannten Einflüssen wie
ei ner Verbindungs-Bibliothek mit dem Einfluss von bekannten Bezugsverbindungen
unter standartisierten Bedingungen verglichen werden kann.
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Das Aufzeichnen
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Zusätzlich zu
der Intensität
gibt es verschiedene Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Parameter, die durch
die Wirkung des Einflusses auf die zugrunde liegenden zellulären Phänomene moduliert
werden können,
und daher in der Erfindung verwendet werden können. Einige Beispiele sind
Resonanz-Engerietransfer, Fluoreszenz-Lebensdauer, Polarisation,
Wellenlängen-Verschiebung.
Jedes dieser Verfahren benötigt
eine bestimmte Filterart in dem Emissions-Lichtweg, um die gewünschte Lichtkomponente
auszuwählen
und um andere Komponenten zu verwerfen. Das Aufzeichnen der Lichteigenschaft
kann in Form eines geordneten Arrays von Werten wie ein CCD-Array
oder eine Vakuum-Röhrenvorrichtung
wie eine Vidikon-Röhre
sein.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
könnte
das durch eine Luminophore emittierte räumlich verteilte Licht durch
eine Veränderung
in der Resonanz-Energie
zwischen der Luminophore und einer anderen Lumineszenzeinheit nachgewiesen
werden, die in der Lage ist, Energie an die Luminophore abzugeben,
wobei jedes der beiden ausgewählt
oder hergestellt worden ist, um Teil der bestimmten Komponenten
des intrazellulären
Weges zu sein oder an sie gebunden oder mit ihnen assoziiert zu
sein. In dieser Ausführungsform durchmacht
entweder die Luminophore oder die Lumineszenz-Einheit, die in der
Lage ist, Energie an die Luminophore abzugeben, eine Neuverteilung
als Antwort auf einen Einfluss. Der Resonanz-Energietransfer würde als
eine Veränderung
in der Emissions-Intensität
von der Luminophore gemessen, vorzugsweise aufgespürt durch
einen Einzelkanal-Photodetektor, der nur auf die durchschnittliche
Intensität
der Luminophore in einer nicht räumlich
aufgelösten
Art antwortet.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
könnte
das Aufzeichnen des räumlich
verteilten Lichtes an einem einzigen Zeitpunkt nach dem Anwenden
des Einflusses gemacht werden. In einer anderen Ausführungsform
könnte
das Aufzeich nen an zwei Zeitpunkten gemacht werden, wobei ein Punkt
vor und der andere Punkt nach dem Anwenden des Einflusses ist. Das
Resultat oder die Variation wird bestimmt aus der Veränderung
der Fluoreszenz verglichen mit der vor dem Einfluss oder der Modulation
gemessenen Fluoreszenz. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform
könnte
das Aufzeichnen bei einer Serie von Zeitpunkten durchgeführt werden,
bei der die Anwendung des Einflusses an einem Zeitpunkt nach dem
ersten Zeitpunkt in der Serie von Aufzeichnungen stattfindet, wobei
das Aufzeichnen beispielsweise mit einer vorher bestimmten Zeitdifferenz
von etwa 0,1 Sekunde bis 1 Stunde, vorzugsweise von 1 bis 60 Sekunden,
besonders bevorzugt von 1 bis 30 Sekunden, insbesondere von 1 bis
10 Sekunden, über
einen Zeitraum von 1 Sekunde bis 12 Stunden, wie von 10 Sekunden
bis 12 Stunden, beispielsweise von 10 Sekunden bis 1 Stunde, wie
von 60 Sekunden bis 30 Minuten oder 20 Minuten durchgeführt werden.
Das Resultat oder die Variation wird von der Veränderung in der Fluoreszenz über die
Zeit bestimmt. Das Resultat oder die Variation könnte auch als eine Veränderung
in der räumlichen
Verteilung der Fluoreszenz über
die Zeit bestimmt werden.
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Vorrichtung
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Das
Aufzeichnen der von der Luminophore emittierten räumlich verteilten
Lumineszenz wird durch eine Vorrichtung zum Messen der Verteilung
der Fluoreszenz in der Zelle oder den Zellen durchgeführt, und dabei
jede Veränderung
in der Verteilung der Fluoreszenz in der Zelle oder in den Zellen,
die ein Minimum der folgenden Komponententeile einschließt: (a)
eine Lichtquelle, (b) ein Verfahren zum Auswählen der Wellenlänge(n),
des Lichtes von der Quelle, das die Fluoreszenz des Proteins anregen
wird, (c) eine Vorrichtung, die schnell das Anregungslicht blockieren
kann oder in den Rest des Systems lassen kann, (d) eine Serie von
optischen Elementen, um das Anregungslicht zu einer Probe zu bringen,
die emittierte Fluoreszenz in einer räumlich aufgelösten Weise
zu sammeln, und ein Bild von dieser Fluoreszenz-Emission zu bilden,
(e) eine Platte oder Ständer,
der/die den Zellencontainer hält,
wobei die Zellen in einer vorher bestimmten Geometrie bezüglich der
Reihe der optischen Elemente gemessen werden, (f) ein Detektor, um
die räumlich
aufgelöste
Fluoreszenz in Form eines Bildes aufzuzeichnen, (g) ein Computer
oder elektronisches System und assoziierte Software, um die aufgezeichneten
Bilder zu erhalten und zu speichern, und um den Grad der Neuverteilung
von den aufgezeichneten Bildern zu berechnen.
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In
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist das Vorrichtungssystem automatisiert. In einer Ausführungsform
umfassen die Komponenten in (d) und (e) wie oben erwähnt ein
Fluoreszenz-Mikroskop. In einer Ausführungsform ist die oben in
(f) erwähnte
Komponente eine CCD-Kamera.
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In
einer Ausführungsform
wird das Bild durch ein optisches Scann-System gebildet und aufgezeichnet.
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In
einer Ausführungsform
wird ein Flüssigkeits-Zugabesystem
verwendet, um eine bekannte oder unbekannte Verbindung zu einer
oder allen Zellen in den Zellhalter an einem Zeitpunkt hinzuzufügen, der
von vornherein festgelegt ist. Vorzugsweise steht das Flüssigkeits-Zugabesystem
unter der Kontrolle des Computers oder des elektronischen Systems.
Solch ein automatisiertes System kann für ein Screening-Programm aufgrund
seiner Fähigkeit
verwendet werden, Resultate von einer größeren Anzahl an Testverbindungen
zu erzeugen, als ein humaner Operator unter Verwenden der Vorrichtung
in einer manuellen Weise erzeugen könnte.
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Quantifizierung
des Einflusses
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Das
Aufzeichnen der Variation oder des Resultates bezüglich des
von der Luminophore emittierten Lichts wird durch Aufzeichnen des
räumlich
verteilten Lichts als eines oder mehrere digitale Bilder durchgeführt, und
das prozessieren der aufgezeichneten Variation, um sie auf eine
oder mehrere Zahlen zu reduzieren, die für den Grad der Neuverteilung
repräsentativ
sind, umfasst eine digitale bildverarbeitende Vorgehensweise oder
eine Kombination von digitalen bildverarbeitenden Vorgehensweisen.
Die quantitative Information, die für den Grad der zellulären Antwort
auf den Einfluss oder das Resultat des Einflusses auf den intrazellulären Weg bezeichnend
ist, wird von der Aufzeichnung oder den Auf zeichnungen entsprechend
einer vorbestimmten Kalibrierung extrahiert, die auf Antworten oder
Resultaten basiert, die in derselben Weise, bezüglich bekannter Grade eines
relevanten spezifischen Einflusses aufgezeichnet wurden. Diese Kalibrierungs-Vorgehensweise wird
entsprechend den unten beschriebenen Prinzipien entwickelt (Entwickeln
einer auf Bildern basierenden Assay-Technik). Spezifische Beschreibungen
der Vorgehensweisen für
bestimmte Assays werden in den Beispielen gegeben.
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Während das
schrittweise Vorgehen, das notwendig ist, um das Bild oder die Bilder
auf den Wert zu reduzieren, der für jeden Assay repräsentativ
ist oder sind, für
jeden Assay besonders ist, sind die einzelnen Schritte im Allgemeinen
gut bekannte Verfahren zur Bildbearbeitung. Einige Beispiele der
einzelnen Schritte sind Punktoperationen wie Subtraktion, Bilden
eines Verhältnisses
und Bilden eines Grenzwertes, Digitalfilterverfahren wie Weichmachen,
Verschärfen
und Eckenbestimmung, räumliche
Frequenzverfahren wie Fourier-Filtern, Bild-Kreuz-Korrelation und Bild-Auto-Korrelation,
Objekt-Finden und Klassifizierung (Blob-Analyse), und farbliche Raum-Manipulationen
zur Visualisierung. Zusätzlich
zu den algorithmischen Vorgehensweisen können auch heuristische Verfahren
wie neurale Netzwerke verwendet werden.
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Nukleinsäurekonstrukte
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäurekonstrukte
kodieren in ihren Nukleinsäuresequenzen
Fusions-Polypeptide umfassend ein biologisch aktives Polypeptid,
das eine Komponente eines intrazellulären Weges ist, oder einen Teil
davon und ein GFP, vorzugsweise eine F64L-Mutante von GFP, das N- oder C-terminal,
gegebenenfalls über
ein Peptidlinker, an das biologisch aktive Polypeptid oder einen
Teil davon fusioniert ist.
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In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine Proteinkinase oder eine
-phosphatase.
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In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid ein Transkriptionsfaktor oder
ein Teil davon, der die zelluläre
Lokalisation nach Aktivierung verändert.
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In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid ein Protein oder ein Teil
davon, das/der mit dem cytoskelettalen Netzwerk assoziiert ist und
das die zelluläre Lokalisation
nach Aktivierung verändert.
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In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine Proteinkinase oder ein
Teil davon, die/der die zelluläre
Lokalisation nach Aktivierung verändert.
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In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine Serin/Threonin-Proteinkinase
oder ein Teil davon, die/der in der Lage ist, die intrazelluläre Lokalisation nach
Aktivierung zu verändern.
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In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine Tyrosinkinase oder ein
Teil davon, die/der in der Lage ist, die intrazelluläre Lokalisation
nach Aktivierung zu verändern.
-
In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine Phospholipid-abhängige Serin/Threonin-Proteinkinase oder
ein Teil davon, die/der in der Lage ist, die intrazelluläre Lokalisation
nach Aktivierung zu verändern.
-
In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine cAMP-abhängige Proteinkinase
oder ein Teil davon, die/der in der Lage ist, die intrazelluläre Lokalisation
nach Aktivierung zu verändern.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion.
-
In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine cGMP-abhängige Proteinkinase
oder ein Teil davon, die/der in der Lage ist, nach Aktivierung die
zelluläre
Lokalisation zu verändern.
-
In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine Calmodulin-abhängige Serin/Threonin-Proteinkinase
oder ein Teil davon, die/der in der Lage ist, nach Aktivierung die
zelluläre
Lokalisation zu verändern.
-
In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine Mitogen-aktivierte Serin/Threonin-Proteinkinase
oder ein Teil davon, die/der in der Lage ist, nach Aktivierung die
zelluläre
Lokalisation zu verändern.
In bevorzugten Ausführungsformen
sind die durch die Nukleinsäurekonstrukte
kodierten biologisch aktiven Polypeptide eine ERK1-F64L-S65T-GFP-Fusion oder
eine EGFP-ERK1-Fusion.
-
In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine Cyclin-abhängige Serin/Threonin-Proteinkinase
oder ein Teil davon, die/der in der Lage ist, nach Aktivierung die
zelluläre
Lokalisation zu verändern.
-
In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid eine Proteinphosphatase oder
ein Teil davon, die/der in der Lage ist, die zelluläre Lokalisation
nach Aktivierung zu verändern.
-
In
einer erfindungsgemäßen bevorzugten
Ausführungsform
können
die Nukleinsäurekonstrukte DNA-Konstrukte
sein.
-
In
einer Ausführungsform
ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt
kodierte biologisch aktive Polypeptid
-
In
einer Ausführungsform
stammt das für
GFP kodierende Gen in dem Nukleinsäurekonstrukt von Aequorea victoria.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das für
GFP kodierende Gen in dem Nukleinsäurekonstrukt EGFP oder eine
GFP-Variante ausgewählt aus
F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP, F64L-S65T-GFP.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung können
die DNA-Konstrukte durch jede der in SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44,
46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76,
78, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130,
132, 134, 136, 138, 140, 142 gezeigten DNA-Sequenzen identifiziert
werden oder sind Varianten dieser Sequenzen, die in der Lage sind,
das gleiche Fusions-Polypeptid oder ein Fusions-Polypeptid zu kodieren,
das dazu biologisch äquivalent
ist, z. B. eine Isoform oder eine Spleiß-Variante oder ein homologes
aus einer anderen Spezies.
-
Screening-Programm
-
Die
vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, das dazu verwendet
werden kann, um ein Screening-Programm für die Identifikation biologisch
aktiver Substanzen zu etablieren, die direkt oder indirekt intrazelluläre Signalwege
beeinflussen können
und aufgrund dieser Eigenschaft möglicherweise als Medikamente nützlich sind.
Basierend auf Messungen in lebenden Zellen der Neuverteilung von
räumlich
aufgelöster
Lumineszenz von Luminophoren, die eine Veränderung in der Verteilung nach
Aktivierung oder Deaktivierung eines intrazellulären Signalweges durchmachen,
zeigt das Resultat der einzelnen Messung jedes Stoffes, der untersucht
wird, seine potentielle biologische Aktivität an.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird das Screening-Programm für die Identifikation eines
biologisch toxischen Stoffes wie vorliegend definiert verwendet,
der seine toxische Wirkung durch Interferieren mit einem intrazellulären Signalweg
ausübt.
Basierend auf Messungen der Neuverteilung von räumlich aufgelöster Lumineszenz
in den lebenden Zellen von Luminophoren, die eine Veränderung
in der Verteilung nach Aktivierung oder Deaktivierung eines intrazellulären Signalweges
durchmachen, zeigt das Resultat der einzelnen Messung jedes Stoffes,
der untersucht wurde, seine potentielle biologisch toxische Aktivität an. In
einer Ausführungsform
eines Screening-Programmes kann eine Verbindung, die eine Komponente
eines wie vorliegend definierten intrazellulären Weges moduliert, gefunden
werden und die therapeutische Menge der Verbindung kann durch ein
erfindungsgemäßes Verfahren
abgeschätzt
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform führt die
vorliegende Erfindung zu der Entdeckung eines neuen Weges, um einen
Zustand oder eine Krankheit zu behandeln, der/die mit der intrazellulären Funktion
eines biologisch aktiven Polypeptids in Bezug steht, umfassend die
Verabreichung an einen Patienten, der an diesem Zustand oder an
dieser Krankheit leidet, einer wirksamen Menge einer Verbindung,
die durch irgendein erfindungsgemäßes Verfahren entdeckt worden
ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
ein Verfahren zur Identifikation eines neuen Arzneimittel-Targets
oder verschiedener neuer Arzneimittel-Targets aus der Gruppe biologisch
aktiver Polypeptide etabliert, die Komponenten von intrazellulären Signalwegen
sind.
-
In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird ein individuelles Behandlungsschema für die selektive
Behandlung eines ausgewählten
Patienten etabliert, der an einem Leiden leidet, bei dem die verfügbaren Medikamente,
die für
die Behandlung des Leidens verfügbar
sind, auf einer relevanten primären
Zelle oder auf relevanten primären
Zellen getestet werden, die von dem Patienten aus einem oder mehreren
Geweben erhalten werden, unter Verwenden eines Verfahrens umfassend
das Transfizieren der Zelle oder der Zellen mit mindestens einer
DNA-Sequenz, die
eine erfindungsgemäße Fluoreszenz-Sonde
kodiert, Transferieren der transfizierten Zelle oder Zellen zurück in den
Patienten, oder Kultivieren der Zelle oder Zellen unter Bedingungen,
welche die Expression der Sonden erlauben, und Exponieren derselben
einem Array der verfügbaren
Medikamente, dann Vergleichen der Veränderungen in Fluoreszenz-Mustern
oder Neuverteilungsmustern der Fluoreszenz-Sonden in der intakten
lebenden Zelle oder Zellen, um die zelluläre Antwort auf die spezifischen Medikamente
nachzuweisen (Erhalten eines zellulären Wirkungsprofils), dann
Auswählen
eines Medikaments oder mehrerer Medikamente basierend auf der gewünschten
Wirkung und den akzeptierbaren Grad an Nebenwirkungen und Verabreichen
einer wirksamen Menge dieser Medikamente an den ausgewählten Patienten.
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Zurückverfolgen
eines Signal-Transduktions-Weges
-
Die
vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, das verwendet werden
kann, um ein Screening-Programm zum Zurückverfolgen von Signaltransduktionswegen
wie vorliegend definiert zu etablieren. In einer Ausführungsform
wird das Screening-Programm verwendet, um genauer zu etablieren,
auf welcher Ebene eine oder mehrere Verbindungen einen spezifischen
Signaltransduktionsweg beeinflussen, indem nacheinander oder gleichzeitig
der Einfluss der Verbindung oder der Verbindungen auf die Neuverteilung
von räumlich
aufgelöster
Lumineszenz von verschiedenen der Luminophoren getestet wird, die
eine Veränderung
in der Verteilung nach Aktivierung oder Deaktivierung des untersuchten
intrazellulären
Signalweges durchmachen.
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Konstruktion und Testen
der Sonden
-
Im
Allgemeinen wird eine Sonde, d. h. ein „GeneX"-GFP-Fusion oder eine GFP-„GeneX"-Fusion unter Verwenden von PCR mit „GeneX"-sezifischen Primern
konstruiert, gefolgt von einem Klonierungsschritt, um „GeneX" in den gleichen
Leserahmen wie GFP zu fusionieren. Die Fusion kann eine kurze, von
dem Vektor abstammende Sequenz zwischen „GeneX" und GFP enthalten (z. B. Teil einer
vielfachen Klonierungsstellenregion (multiple cloning site region)
in dem Plasmid), was zu einem Peptid-Linker zwischen „GeneX" und GFP in dem resultierenden
Fusionsprotein führt.
-
Detailliertes schrittweises
Verfahren:
-
- – Identifizieren
der Sequenz des Gens. Dies wird am einfachsten durch Durchsuchen
einer Hinterlegung von genetischer Information durchgeführt, z.
B. der GenBank Sequence Database, die allgemein erhältlich ist
und immer wieder von Molekularbiologen verwendet wird. In den spezifischen
Beispielen unten wird die GenBank-Zugangsnummer des fraglichen Gens
bereitgestellt.
- – Entwurf
genspezifischer Primer. Eine Untersuchung der Sequenz des Gens gestattet
den Entwurf von genspezifischen Primern, die in einer PCR-Reaktion verwendet
werden können.
Typischerweise schließt der
Primer des oberen Stranges (top-strand primer) das ATG-Start-Codon
des Genes und die folgenden etwa 20 Nukleotide ein, während der
Primer des unteren Stranges (bottom-strand primer) das Stop-Codon und
die ca. 20 davor liegenden Nukleotide einschließt, falls das Gen hinter GFP
fusioniert werden soll, d. h. eine GFP-„GeneX"-Fusion. Wenn das Gen vor GFP fusioniert
werden soll, d. h. eine „GeneX"-GFP-Fusion, muss
ein Stop-Codon vermieden werden. Wahlweise soll nicht die Gesamtlänge des
GeneX in der Fusion verwendet werden, sondern nur der Teil, der
sich als Antwort auf ein Signal wie GeneX räumlich verteilt und neu verteilt.
- – Zusätzlich zu
genspezifischen Sequenzen enthalten die Primer mindestens eine Erkennungssequenz
für ein
Restriktionsenzym, um das nachfolgende Klonieren des PCR-Produktes
zu ermöglichen.
Die Stellen werden derart ausgewählt,
so dass sie in dem PCR-Produkt nur einmal vorkommen und mit Stellen
in dem Klonierungsvektor kompatibel sind. Danach kann es notwendig
sein, eine exakte Anzahl an Nukleotiden zwischen der Restriktionsenzym-Schnittstelle
und der genspezifischen Sequenz einzufügen, um den korrekten Leserahmen
des Fusionsgens und/oder eine Translationsinitiations-Konsensussequenz
zu etablieren. Als letztes enthalten die Primer immer einige wenige
Nukleotide vor der Restriktionsenzym-Schnittstelle, um einen Verdau
mit dem Enzym zu ermöglichen.
- – Identifizieren
einer Quelle für
das zu amplifizierende Gen. Damit eine PCR-Reaktion ein Produkt mit genspezifischen
Primern erzeugen kann, muss die Gensequenz anfänglich in der Reaktion vorhanden
sein, z. B. in Gestalt von cDNA. Die Information in der GenBank
oder in der wissenschaftlichen Literatur wird gewöhnlicherweise
anzeigen, in welchem Gewebe oder in welchen Geweben das Gen exprimiert
wird, und cDNA-Bibliotheken aus einer großen Vielzahl von Geweben oder
Zelltypen von verschiedenen Spezies sind kommerziell erhältlich,
z. B. von Clontech (Palo Alto), Stratagene (La Jolla) und Invitrogen
(San Diego). Viele Gene sind auch in klonierter Form von der The
American Type Tissue Collection (Virginia) erhältlich.
- – Optimieren
der PCR-Reaktion. Von verschiedenen Faktoren ist es bekannt, dass
sie die Effizienz und die Spezifität einer PCR-Reaktion beeinflussen,
einschließlich
der Annealing-Temperatur der Primer, der Ionen-Konzentration, besonders Mg2+ und
K+, die in der Reaktion vorhanden sind,
und der pH der Reaktion. Falls das Resultat einer PCR-Reaktion für unbefriedigend
gehalten wird, kann das daran liegen, dass die oben genannten Parameter
nicht optimal sind. Verschiedene Annealing-Temperaturen sollten
getestet werden, z. B. in einer PCR-Maschine mit einem eingebauten
Temperatur-Gradienten, erhältlich
beispielsweise von Stratagene (La Jolla), und/oder verschiedener
Pufferzusammensetzungen sollten getestet werden, z. B. das OptiPrime-Puffer-System
von Stratagene (La Jolla).
- – Klonieren
des PCR-Produkts. Der Vektor, in den das amplifizierte Gen-Produkt kloniert
werden wird und mit GFP fusioniert werden wird, sollte bereits in
Erwägung
gezogen worden sein, wenn die Primer entworfen wurden. Wenn ein
Vektor ausgewählt
wird, sollte man mindestens berücksichtigen,
in welchen Zelltypen die Sonde nachfolgend exprimiert werden wird,
so dass der Promotor, der die Expression der Sonde kontrolliert,
mit den Zellen kompatibel ist. Die meisten Expressionsvektoren enthalten
auch einen oder mehrere selektive Marker, z. B. Vermitteln einer
Resistenz gegenüber
einem Arzneimittel, was ein geeignetes Merkmal ist, wenn man stabile
Transfektanten herstellen möchte.
Der selektive Marker sollte auch mit den zu verwendenden Zellen
kompatibel sein.
-
Das
tatsächliche
Klonieren des PCR-Produkts sollte keine Schwierigkeit darstellen,
das es normalerweise ein Ein-Schritt-Klonieren eines Fragmentes,
das mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten wurde,
in einem Vektor darstellen wird, der mit denselben zwei Enzymen
verdaut wurde. Falls sich das Klonieren als problematisch herausstellt,
kann dies daran liegen, dass die Restrik tionsenzyme mit dem PCR-Fragment
nicht gut funktioniert haben. In diesem Fall könnte man längere Verlängerungen an das Ende der Primer anfügen, um
eine mögliche
Schwierigkeit des Verdaus in der Nähe eines Fragmentendes zu überwinden,
oder man könnte
einen Zwischenklonierungsschritt einfügen, der nicht auf den Verdau
mit einem Restriktionsenzym basiert. Verschiedene Unternehmen bieten
Systeme für
diesen Ansatz an, z. B. Invitrogen (San Diego) und Clontech (Palo
Alto).
-
Sobald
das Gen kloniert worden ist, und in dem Verfahren mit dem GFP-Gen
fusioniert worden ist, sollte das resultierende Produkt, typischerweise
ein Plasmid, sorgfältig überprüft werden,
um sicherzustellen, dass es so ist, wie erwartet. Der genaueste
Test wäre,
die Nukleotidsequenz des Fusionsgens zu erhalten.
-
Testen der Sonde.
-
Sobald
ein DNA-Konstrukt für
eine Sonde erzeugt worden ist, kann ihre Funktionalität und Verwendbarkeit
getestet werden, indem es den folgenden Tests unterworfen wird:
- – Transfizieren
desselben in Zellen, die in der Lage sind, die Sonde zu exprimieren.
Die Fluoreszenz der Zellen wird kurz danach getestet, typischerweise
am nächsten
Tag. An diesem Punkt werden zwei Merkmale der zellulären Fluoreszenz
festgestellt: die Intensität
und die subzelluläre
Lokalisation.
-
Die
Intensität
sollte gewöhnlicherweise
mindestens genauso stark sein, wie diejenige von unfusioniertem
GFP in den Zellen. Falls dies nicht so ist, so könnte die Sequenz oder die Qualität der Sonden-DNA
fehlerhaft sein und sollte sorgfältig überprüft werden.
-
Die
subzelluläre
Lokalisation ist ein Anzeichen dafür, ob es von einer Sonde wahrscheinlich
ist, dass sie gut funktioniert. Falls ihre Lokalisation wie diejenige
ist, die von dem fraglichen Gen erwartet wird, z. B. sie ausgeschlossen
ist von dem Kern, kann man sofort mit einem funktionellen Test weitermachen.
Falls die Sonde nicht gleich nach dem Transfektionsverfahren lokalisiert
ist, kann dies an einer Überexpression
zu diesem Zeitpunkt liegen, da die Zelle typischerweise sehr viele
Kopien des Plasmids aufgenommen haben wird, und die Lokalisation
wird mit der Zeit stattfinden, z. B. innerhalb weniger Wochen, wenn
die Plasmid-Kopienanzahl
und der Expressionsspiegel abnehmen. Falls die Lokalisation nicht
nach einem verlängerten
Zeitraum stattfindet, kann dies daran liegen, dass die Fusion an
GFP eine Lokalisierungsfunktion zerstört hat, z. B. eine Proteinsequenz
maskiert hat, die für
die Interaktion mit seinem normalen zellulären Ankerprotein essenziell
ist. In diesem Fall könnte
die entgegengesetzte Fusion funktionieren, z. B. falls GeneX-GFP
nicht funktioniert, könnte
die GFP-GeneX dies tun, da zwei verschiedene Teile des GeneX durch
die Nähe
von GFP beeinflusst sein werden. Falls dies nicht funktioniert,
könnte
die Nähe
von GFP an jedem Ende ein Problem sein, und es könnte versucht werden, den Abstand
durch Einbauen eines längeren
Linkers zwischen GeneX und GFP in das DNA-Konstrukt zu erhöhen.
-
Falls
es keine vorherige Kenntnis der Lokalisation gibt, und falls keine
Lokalisation beobachtet wird, kann dies daran liegen, dass die Sonde
nicht an diesem Punkt lokalisieren sollte, weil dies die Natur des
an GFP fusionierten Proteins ist. Es sollte dann einem funktionellen
Test unterworfen werden.
-
In
einem funktionellen Test werden die Zellen, welche die Sonde exprimieren,
mit mindestens einer Verbindung behandelt, von der man weiß, dass
sie, gewöhnlicherweise
durch Aktivieren, mit dem Signalweg interferiert, von dem von der
Sonde erwartet wird, dass sie ihn anzeigt, indem sie sich in der
Zelle neu verteilt. Falls die Neuverteilung wie erwartet ist, z.
B. falls das vorherige Wissen mitteilt, dass sie vom Ort X zum Ort
Y translozieren sollte, hat sie den ersten kritischen Test passiert.
In diesem Fall kann man mit der weiteren Charakterisierung und Quantifizierung
der Antwort fortfahren.
-
Falls
dies nicht wie erwartet stattfindet, kann dies daran liegen, dass
der Zelle mindestens eine Komponente des Signalweges fehlt, z. B.
ein Zelloberflächen-Rezeptor, oder es
liegt eine Spezies-Inkompatibilität vor, z. B. falls die Sonde
aufgrund einer Sequenzinformation über ein humanes Genprodukt
entworfen wurde, und die Zelle stammt von einem Hamster. In beiden
Fällen
sollte man an dere Zelltypen für
das Testverfahren identifizieren, in denen diese potentiellen Probleme
nicht auftreten sollten.
-
Falls
es keine vorherige Kenntnis über
das Neuverteilungsmuster gibt, muss die Analyse der Neuverteilung
mit einer größeren Tiefe
durchgeführt
werden, um zu identifizieren, welches die essentiellen und indikativen
Merkmale sind, und, wenn das klar ist, kann man mit einer weiteren
Charakterisierung und Quantifizierung der Antwort weitermachen.
Falls kein Merkmal einer Neuverteilung identifiziert werden kann,
kann das Problem wie oben erwähnt
sein, und die Sonde sollte unter optimaleren zellulären Bedingungen
neu getestet werden.
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Falls
die Sonde unter optimalen zellulären
Bedingungen keine Wirkung zeigt, muss sie neu entworfen werden.
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Entwickeln
einer bildbasierenden Assay-Technik
-
Der
Prozess des Entwickelns eines bildbasierenden Neuverteilungs-Assays
beginnt entweder mit der nicht geplanten experimentellen Beobachtung,
dass ein Neuverteilungs-Phänomen
visualisiert werden kann, oder mit dem Entwurf einer Sonde, die
spezifisch einem Neuverteilungs-Phänomen folgen soll, von dem
bereits bekannt ist, dass es auftritt. In jedem Fall ist die erste
und beste Forschungstechnik für
einen trainierten Wissenschaftler oder Techniker, das Phänomen zu
beobachten. Selbst mit den schnellen Fortschritten in der Computertechnologie
ist die humane Auge-Gehirn-Kombination unter den bekannten Muster-Erkennungssystemen
immer noch das stärkste
und erfordert kein fortgeschrittenes Wissen über das System, um potentiell interessierende
und nützliche
Muster in Rohdaten zu entdecken. Dies trifft insbesondere zu, falls
derartige Daten in Gestalt von Bildern präsentiert werden, die der natürliche „Datentyp" für das humane
visuelle prozessieren sind. Da humanes visuelles Prozessieren am
effektivsten in einem relativ engen Frequenzbereich arbeitet, d.
h. wir können
entweder sehr schnelle oder sehr langsame Veränderungen in unserem visuellen
Feld nicht sehen, mag es erforderlich sein, die Daten aufzuzeichnen
und sie entweder mit einer Zeitverlängerung oder -kompression erneut
zu spielen.
-
Einige
Lumineszenz-Phänomene
können
nicht durch das menschliche Auge direkt gesehen werden. Beispiele
schließen
Polarisation und Fluoreszenz-Lebensdauer ein. Mit geeigneten Filtern
oder Detektoren können
diese Signale allerdings als Bilder oder Sequenzen von Bildern aufgezeichnet
werden und dem Menschen auf die gerade eben beschriebene Weise präsentiert
werden. Auf diesem Weg können
Muster detektiert werden, und dieselben Verfahren können angewendet
werden.
-
Sobald
von der Neuverteilung bestimmt worden ist, dass sie ein reproduzierbares
Phänomen
darstellt, werden ein oder mehrere Datensätze für den Zweck des Entwickelns
einer Verfahrensweise zum Extrahieren der quantitativen Informationen
von den Daten erzeugt. Parallel dazu werden die biologischen und
optischen Bedingungen bestimmt, welche die Rohdaten mit der besten
Qualität
für den
Assay geben. Dies kann ein iterativer Prozess werden; es kann notwendig
sein, ein quantitatives Vorgehen zu entwickeln, um die Wirkung des
Manipulierens der Assay-Bedingungen auf den Assay zu bestimmen.
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Die
Datensätze
werden durch eine Person oder Personen untersucht, die Kenntnis
des biologischen Phänomens
hat/haben und in der Anwendung von Bildverarbeitungstechniken bewandert
ist/sind. Das Ziel dieser Übung
ist es, ein Verfahren zu bestimmen oder es zumindest vorzuschlagen,
das das Bild oder die Sequenz der Bilder, das/die die Aufzeichnung
einer „Antwort" darstellt oder darstellen
auf einen Wert reduziert, der dem Grad der Antwort entspricht. Unter
Verwenden von entweder interaktiver Bildverarbeitungs-Software oder
einer Bildverarbeitungs-Toolbox
und einer Programmiersprache wird das Verfahren als ein Prozess
oder Algorithmus kodiert, der das Bild oder die Bilder als Input
nimmt und den Grad der Antworten (in irgendwelchen Einheiten) als
sein Output erzeugt. Einige der Kriterien zum Auswerten der Validität einer
bestimmten Vorgehensweise sind:
- • Variiert
der Grad der Antwort in einer biologisch signifikanten Weise, d.
h., zeigt er die bekannte oder angenommene Abhängigkeit von der Konzentration
des stimulierenden Mittels oder der stimulierenden Bedingung?
- • Ist
der Grad der Antwort reproduzierbar, d. h., gibt die gleiche Konzentration
oder Menge an stimulierendem Mittel oder Bedingung dieselbe Antwort
mit einer akzeptablen Varianz?
- • Ist
der dynamische Bereich der Antwort ausreichend für den Zweck des Assays? Falls
nicht, kann eine Änderung
in dem Vorgehen oder in einem seiner Parameter den dynamischen Bereich
verbessern?
- • Zeigt
das Vorgehen irgendwelche klaren „Pathologien", d. h., fuhrt es
zu lächerlichen
Werten für
die Antwort, falls üblicherweise
vorkommende Unvollständigkeiten
in dem bildgebenden Prozess vorhanden sind? Können derartige Pathologien
eliminiert, kontrolliert oder berücksichtigt werden?
- • Kann
das Vorgehen mit der normalen Variation in der Anzahl und/oder Größe von Zellen
in einem Bild umgehen?
-
In
einigen Fällen
kann das Verfahren offensichtlich sein; in anderen können sich
eine Anzahl von möglichen
Vorgehensweisen selbst vorschlagen. Selbst wenn ein Verfahren den
anderen klar überlegen
erscheint, kann eine Optimierung von Parametern erforderlich sein.
Die verschiedenen Vorgehensweisen werden auf den Datensatz angewendet,
und die oben vorgeschlagenen Kriterien werden bestimmt oder die
einzige Vorgehensweise wird wiederholt unter Anpassung des Parameters
oder der Parameter angewendet, bis die zufriedenstellendsten Kombinationen
von Signal, Rauschen, Bereich etc. erreicht sind. Dies entspricht
der Kalibrierung irgendeines Typs von Einzelhandsensoren.
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Die
Anzahl an Möglichkeiten,
einen Einzelwert aus einem Bild zu extrahieren, ist extrem groß und daher
muss ein intelligenter Ansatz beim Anfangsschritt der Reduktion
dieser Anzahl auf eine kleine, endliche Anzahl möglicher Vorgehensweisen vorgenommen
werden. Dies besagt nicht, dass die letztendlich erhaltene Vorgehensweise
notwendigerweise die beste Vorgehensweise ist – aber eine globale Suche nach
der besten Vorgehensweise steht einfach aufgrund der riesigen Anzahl
an involvierten Möglichkeiten
außer
Frage.
-
Auf
Bildern basierende Assays unterscheiden sich nicht darin von anderen
Assay-Techniken,
dass ihre Nützlichkeit
durch Parameter wie die Spezifität
für die
gewünschte
Komponente der Sonde, der dynamische Bereich, die Varianz, die Sensitivität, der Konzentrationsbereich, über den
der Assay funktioniert, und andere solche Parameter charakterisiert
ist. Während
es nicht notwendig ist, jedes und alle davon zu charakterisieren, bevor
der Assay verwendet wird, stellen sie den einzigen Weg dar, einen
Assay mit einem anderen zu vergleichen.
-
Beispiel: Entwickeln eines
quantitativen Assays für
GLUT4-Translokation
-
GLUT4
ist ein Mitglied der Klasse von Glucose-Transportermolekülen, die
bei der zellulären
Glucoseaufnahme wichtig sind. Von ihm ist bekannt, dass er bei einigen
Zuständen
der Glucoseaufnahmestimulation zur Plasmamembran transloziert. Die
Fähigkeit,
die Glucoseaufnahmeantwort nicht-invasiv zu visualisieren, ohne
die Glucoseaufnahme zu messen, wäre
ein sehr nützlicher
Assay für
jeden, der beispielsweise nach Behandlungen für Typ2-Diabetes sucht.
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Eine
CHO-Zelllinie, die den humanen Insulinrezeptor stabil exprimierte,
wurde als Basis für
eine neue Zelllinie verwendet, die eine Fusion zwischen GLUT4 und
GFP stabil exprimierte. Von dieser Zelllinie wurde erwartet, dass
sie eine Translokation von GLUT4 zur Plasmamembran zeigte, visualisiert
durch die Bewegung des GFP. Die Translokation konnte definitiv in
Gestalt des Auftretens von lokalen Erhöhungen in der Fluoreszenz in
Regionen der Plasmamembran gesehen werden, die eine charakteristische
Form oder ein charakteristisches Muster aufwiesen. Dies ist in 12 gezeigt.
-
Diese
Objekte wurden als „Snircles" bekannt und das
Phänomen
ihres Auftretens als „Snircling". Um ihr Auftreten
zu quantifizieren, musste ein Verfahren gefunden werden, um sie
als Objekte in dem Bildfeld zu isolieren, und dann um sie zu zählen, ihre
Fläche
zu messen oder einige Parameter über
sie zu bestimmen, die in einer Dosis-abhängigen Weise mit der Insulinkonzentration
korrelieren, der die Zellen ausgesetzt worden waren. Um die Snircles
abzutrennen, wurde eine Binarisierungsvorgehensweise angewendet,
in der eine Kopie des Bildes, das mit einem relativ starken Gauß-Kernprogramm
weichgemacht wurde (sigma = 2,5) von einer anderen Kopie subtrahiert
wurde, auf die nur ein relativ leichte Gaußsche Glättung angewendet worden war
(sigma = 0,5). Das resultierende Bild wurde bezüglich seiner min/max-Bereiche
erneut eingeteilt, und ein automatischer Grenzwert wurde angewendet,
um das Bild in zwei Ebenen aufzuteilen. Das Bild mit Grenzwert enthält einen
Hintergrund eines Wertes, alle gefundenen Objekte mit einem anderen
Wert. Die gefundenen Objekte wurden erst durch einen Filter filtriert,
um Objekte zu entfernen, die wesentlich zu groß und zu klein waren, um Snircles
zu sein. Die verbleibenden Objekte, die Snircles und andere Artefakte
von dem Bild mit etwa denselben Größen- und Intensitätseigenschaften
wie Snircles darstellen, werden einer Klassifizierungsvorgehensweise
unterworfen, die zuvor mit vielen Snircle-Bildern trainiert worden
war, um Snircles zu erkennen und die anderen Artefakte auszuschließen. Das
Resultat dieser Vorgehensweise ist ein binäres Bild, das nur die gefundenen
Snircles bis zu dem Grad zeigt, zu dem die Klassifizierungsvorgehensweise
diese akkurat identifizieren kann. Die Gesamtfläche der Snircles wird dann
summiert und dieser Wert ist das quantitative Maß des Grads an Snircling für das Bild.
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Definitionen:
-
In
der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen deckt der Ausdruck „ein Einfluss" das Kontaktieren
oder Inkubieren der Zelle oder Zellen mit Stoffen, von denen bekannt
ist oder von denen erwartet wird, dass sie einen Einfluss auf die
zelluläre
Antwort einschließlich
eines Neuverteilungs-Beitrages ausüben. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform
könnte
der Einfluss Stoffe aus einer Verbindungs-Arzneimittelbibliothek
darstellen.
-
Im
vorliegenden Kontext ist von dem Ausdruck „Grünes Fluoreszierendes Protein" (green fluorescent protein,
GFP) beabsichtigt, dass er ein Protein anzeigt, das, wenn durch
eine Zelle exprimiert, eine Fluoreszenz nach Exposition gegenüber Licht
der korrekten Anregungswellenlänge
emittiert (vgl. [(Chalfie et al. 1994)]). Im folgenden wird GFP,
in dem eine oder mehrere Aminosäuren
ersetzt, insertiert oder deletiert worden sind, am häufigsten
als „modifiziertes
GFP" bezeichnet.
-
„GFP" wie im vorliegenden
verwendet, meint ein modifiziertes GFP, das derart modifiziert ist,
dass es eine erhöhte
Fluoreszenz zeigt, wenn es in Zellen bei einer Temperatur oberhalb
von 30°C
exprimiert wird, wie beschrieben in PCT/DK96/00051, veröffentlicht
als WO 97/11094 am 27. März
1997, und das ein von Aequorea Green Fluorescent Protein (GFP) abstammendes
Fluoreszenz-Protein
oder jegliches funktionelles Analogon davon umfasst, bei dem die
Aminosäure
an Position 1 oberhalb des Chromophoren mutiert worden ist, um einen
Anstieg der Fluoreszenzintensität
bereitzustellen, wenn das erfindungsgemäße Fluoreszenzprotein in Zellen
exprimiert wird. In einem Aspekt stammt das GFP von dem Qualle Aequorea
victoria ab. Das GFP ist wahlweise weiter modifiziert, wie die blaue
Fluoreszenzvariante von GFP, offenbart durch Heim et al (1994). Proc.
Natl. Acad. Sci. 91: 12501. Bevorzugte GFP-Varianten sind F64L-GFP,
F64L-Y66H-GFP und F64L-S65T-GFP.
Eine besonders bevorzugte GFP-Variante zur Verwendung in allen Aspekten
dieser Erfindung ist EGFP (DNA kodierend EGFP das eine F64L-S65T-Variante
ist, deren Codons für
die Expression in Säugerzellen
optimiert sind, ist von Clontech, Palo Alto, erhältlich, Plasmide enthaltend
die EGFP-DNA-Sequenz vgl. GenBank Zugangs-Nrn.: U55762, U55763).
-
Von
dem Ausdruck „intrazellulärer Signalweg" und „Signaltransduktionsweg" ist beabsichtigt,
dass er die koordinierten intrazellulären Prozesse anzeigt, bei denen
lebende Zellen ein externes oder internes Signal in zelluläre Antworten übertragen.
Derartige Signaltransduktion schließt eine enzymatische Reaktion
ein, wobei die Enzyme Proteinkinasen, GTPasen, ATPasen, Proteinphosphatasen,
Phospholipasen einschließen, aber
nicht auf sie beschränkt
sind. Die zellulären
Antworten schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf Gentranskription, Sekretion, Proliferation, mechanische Aktivität, metabolische
Aktivität,
Zelltod.
-
Der
Ausdruck „Luminophore" wird verwendet,
um GFP anzuzeigen.
-
Der
Ausdruck „mechanisch
intakte lebende Zelle" wird
verwendet, um eine Zelle anzuzeigen, die entsprechend den Standardkriterien
für diesen
bestimmten Zelltyp als lebend angesehen wird, wie Aufrechterhaltung
eines normalen Membranpotentials, Energiemetabolismus, Proliferationskapazität, und die
keine physikalisch invasive Behandlung erfahren hat, die entworfen
wurde, um externe Substanzen in die Zelle einzuführen, wie Mikroinjektion.
-
Der
Ausdruck „physiologisch
relevant", wenn
auf die experimentell bestimmte Neuverteilung einer intrazellulären Komponente
angewendet, wie gemessen durch Veränderung in den Lumineszenzeigenschaften oder
-verteilung, wird verwendet, um anzuzeigen, dass diese Neuverteilung
auf Basis des zugrundeliegenden biologischen Phänomens erklärt werden kann, das zu der
Neuverteilung führt.
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Die
Ausdrücke „Bildverarbeitung" und „Bildanalyse" werden verwendet,
um eine große
Familie von digitalen Datenanalysetechniken oder Kombinationen von
derartigen Techniken zu beschreiben, die geordnete Zahlenarrays
(Bilder) auf quantitative Information reduzieren, die diese geordneten
Zahlenarrays beschreibt. Wenn derartige geordnete Zahlenarrays gemessene
Werte von einem physikalischen Prozess darstellen, ist die abgeleitete
quantitative Information daher ein Maß für den physikalischen Prozess.
-
Der
Ausdruck „Fluoreszenzsonde" wird verwendet,
um ein Fluoreszenz-Fusionspolypeptid
anzuzeigen, das ein GFP oder jeden funktionellen Teil davon umfasst,
der mit einem biologisch aktiven Polypeptid wie vorliegend definiert
N- oder C-Terminal
fusioniert ist, gegebenenfalls über
einen Peptidlinker, der aus einem oder mehreren Aminosäureresten
besteht, wobei die Größe des Peptidlinkers
selbst nicht kritisch ist, solange die gewünschte Funktionalität der Fluoreszenzsonde
aufrechterhalten wird. Eine erfindungsgemäße Fluoreszenzsonde wird in
eine Zelle exprimiert und ahmt im wesentlichen das physiologische
Verhalten der biologisch aktiven Polypeptideinheit des Fusionspolypeptids
nach.
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Von
dem Ausdruck „Säugerzelle" ist beabsichtigt,
dass er jegliche lebende Zelle mit Säugerursprung anzeigt. Die Zelle
kann eine etablierte Zelllinie sein, viele von denen sind von The
American Type Culture. Collection (ATCC, Virginia, USA) erhältlich oder
eine primäre
Zelle mit einer begrenzten Lebensdauer, die von einem Säugergewebe
abstammt, einschließlich
Gewebe abstammend von einem transgenen Tier, oder eine neu etablierte
unsterbliche Zelllinie, abstammend von einem Säugergewebe einschließlich transgenischen
Geweben, oder eine Hybridzelle oder Zelllinie erhalten durch Fusionieren
von verschiedenen Zelltypen mit Säugerursprung, z. B. Hybridoma-Zelllinien.
Diese Zellen können
gegebenenfalls ein oder mehrere nicht-native Genprodukte exprimieren,
z. B. Rezeptoren, Enzyme, Enzymsubstrate, vor oder zusätzlich zu
der Zugabe der Fluoreszenzsonde. Bevorzugte Zelllinien schließen ein,
sind aber nicht auf diejenigen von fibroblasten Ursprungs beschränkt, z.
B. BHK, CHO, BALB, oder endothelialen Ursprungs, z. B. HUVEC, BAE
(bovine artery endothelial), CPAE (cow pulmonary artery endothelial)
oder pankreatischen Ursprungs, z. B. RIN, INS-1, MIN6, bTC3, aTC6,
bTC6, HIT, oder hematopoietischen Ursprungs, z. B. adipocytischen
Ursprungs, z. B. 3T3-L1, neuronalen/neuroendokrinen Ursprungs, z.
B. AtT20, PC12, GH3, muskulären
Ursprungs, z. B. SKMC, A10, C2C12, renalen Ursprungs, z. B. HEK293,
LLC-PK1.
-
Von
dem Ausdruck „Hybridpolypeptid" ist beabsichtigt,
dass er ein Polypeptid anzeigt, das eine Fusion von mindestens einem
Teil von jedem von zwei Proteinen ist, in diesem Fall mindestens
ein Teil des Green Fluorescent Protein, und mindestens ein Teil
einer katalytischen und/oder regulatorischen Domäne einer Proteinkinase. Ferner
ist von einem Hybridpolypeptid beabsichtigt, dass es ein Fusionspolypeptid
anzeigt, das ein GFP oder mindestens einen Teil des Green Fluorescent
Protein umfasst, der ein funktionelles Fluorophore enthält und mindestens
einen Teil eines biologisch aktiven Polypeptids wie vorliegend definiert,
unter der Voraussetzung, dass diese Fusion nicht das PKCα-GFP, PKCγ-GFP und
PKCε-GFP
ist, offenbart durch Schmidt et al. und Sakai et al. Daher kann
GFP N- oder C-terminal
an ein biologisch aktives Polypeptid angehängt sein, gegebenenfalls über einen
Linkerteil oder ein Linkerpeptid, das aus einer Sequenz aus einer
oder mehreren Aminosäuren
besteht. Das Hybridpolypeptid oder Fusionspolypeptid kann als eine
Fluoreszenzsonde in intakten lebenden Zellen wirken, die eine DNA-Sequenz
tragen, die für
das Hybridpolypeptid unter Bedingungen kodiert, welche die Expression
des Hybridpolypeptids gestatten.
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Von
dem Ausdruck „Kinase" ist beabsichtigt,
dass er ein Enzym anzeigt, das in der Lage ist, eine zelluläre Komponente
zu phosphorylieren.
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Von
dem Ausdruck „Proteinkinase" ist beabsichtigt,
dass er ein Enzym anzeigt, das in der Lage ist, Serin und/oder Threonin
und/oder Tyrosin in Peptiden und/oder Proteinen zu phosphorylieren.
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Von
dem Ausdruck „Phosphatase" ist beabsichtigt,
dass er ein Enzym anzeigt, das in der Lage ist, Phosphoserin und/oder
Phosphothreonin und/oder Phosphotyrosin in Peptiden und/oder Proteinen
zu dephosphorylieren.
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In
dem vorliegenden Kontext ist von dem Ausdruck „biologisch aktives Polypeptid" beabsichtigt, dass er
ein Polypeptid anzeigt, das nach Aktivierung intrazelluläre Prozesse
beeinflusst, wie ein Enzym, das in intrazellulären Prozesse aktiv ist, oder
ein Teil davon, umfassend eine gewünschte Aminosäuresequenz,
die eine biologische Funktion aufweist oder eine biologische Wirkung
in einem zellulären
System ausübt.
In dem Polypeptid können
eine oder mehrere Aminosäuren
deletiert, insertiert oder ersetzt sein, um seine biologische Funktion
zu verändern,
z. B. durch Inaktivmachen einer katalytischen Stelle. Vorzugsweise
ist das biologisch aktive Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Proteinen, die an einen intrazellulären Signalweg teilnehmen, wie
Enzyme, die in intrazelluläre
Phosphorylierungs und Dephosphorylierungsprozesse involviert sind,
einschließlich
Kinase, Proteinkinasen und Phosphorylasen, wie vorliegend definiert,
aber auch Proteine, die das Cytoskelett aufbauen, spielen bei der
intrazellulären
Signaltransduktion wichtige Rollen und sind deshalb in die Bedeutung
von „biologisch
aktivem Polypeptid" vorliegend
eingeschlossen. Bevorzugter ist das biologisch aktive Polypeptid
ein Protein, das entsprechend seines Zustandes als aktiviert oder
nicht-aktiviert die Lokalisation innerhalb der Zelle verändert, bevorzugt
als eine intermediäre
Komponente in einem Signaltransduktionsweg. Eingeschlossen in diese
bevorzugte Gruppe von biologisch aktiven Polypeptiden sind cAMP
abhängige
Proteinkinasen A.
-
Von
dem Ausdruck „eine
Substanz mit biologischer Aktivität" ist beabsichtigt, dass er jede Probe
anzeigt, die eine biologische Funktion aufweist oder eine biologische
Wirkung in einem zellulären
System ausübt. Die
Probe kann eine Probe eines biologischen Materials wie eine Probe
einer Körperflüssigkeit
sein, einschließlich
Blut, Plasma, Tränenflüssigkeit,
Milch, Urin oder mikrobiologischer oder Pflanzenextrakt, eine Umweltprobe
enthaltend Verunreinigungen einschließlich Schwermetallen oder Toxinen,
oder sie kann eine Probe sein, die eine Verbindung oder eine Mischung
von Verbindungen enthält,
die durch organische Synthese oder genetische Techniken hergestellt
wurden.
-
Der
Satz, jede Veränderung
der Fluoreszenz" meint
jede Veränderung
in Absorptions-Eigenschaften, wie Wellenlänge und Intensität, oder
jede Veränderung
in spektralen Eigenschaften des emittierten Lichts, wie eine Veränderung
der Wellenlänge,
Fluoreszenzlebensdauer, Intensität
oder Polarisation, oder jede Veränderung
in der intrazellulären
Lokalisation des Fluorophors. Es kann daher auf einer spezifischen
zellulären
Komponente lokalisiert sein (z. B. Organelle, Membran, Cytoskelett,
molekulare Struktur) oder es kann gleichmäßig in der Zelle oder in Teilen
der Zellen verteilt sein.
-
Der
Ausdruck „Organismus" wie vorliegend verwendet
zeigt jeden einzelligen oder mehrzelligen Organismus an, der vorzugsweise
aus dem Tierreich stammt einschließlich Protozonen, aber auch
Organismen, die Teile des Pflanzenreiches sind, wie Algen, Pilze,
Bryophyten, und vaskuläre
Pflanzen sind in dieser Definition eingeschlossen.
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Von
dem Ausdruck „Nukleinsäure" ist beabsichtigt,
dass er jeden Typ von Poly- oder
Oligonukleinsäuresequenzen
anzeigt, wie eine DNA-Sequenz, eine cDNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz.
-
Von
dem Ausdruck „biologisch äquivalent", sofern er Proteine
betrifft, ist beabsichtigt, dass er meint, dass ein erstes Protein äquivalent
zu einem zweiten Protein ist, falls die zellulären Funktionen der zwei Proteine
sich jeweils ersetzen können,
z. B. falls die zwei Proteine eng verwandte Isoformen sind, die
durch verschiede ne Gene kodiert werden, wenn sie Spleißvarianten
sind, oder allelische Varianten, die von demselben Gen abstammen,
falls sie identische zelluläre
Funktionen in unterschiedlichen Zelltypen durchführen, oder in unterschiedlichen
Spezies. Von dem Ausdruck „biologisch äquivalent", sofern er DNA betrifft,
ist beabsichtigt, dass er meint, dass eine erste DNA-Sequenz, die
ein Polypeptid kodiert, zu einer zweiten DNA-Sequenz äquivalent
ist, die ein Polypeptid kodiert, falls die durch die zwei Gene kodierten
funktionellen Proteine biologisch äquivalent sind.
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Von
der Wendung „Zurückverfolgen
eines Signaltransduktionsweges" ist
beabsichtigt, dass sie einen Prozess zum genaueren Definieren anzeigt,
auf welcher Ebene ein Signaltransduktionsweg beeinflusst ist, entweder
durch den Einfluss chemischer Komponenten oder eines Krankheitszustands
in einem Organismus. Betrachten wir einen spezifischen Signaltransduktionsweg,
dargestellt durch die bioaktiven Polypeptide A-B-C-D, mit Signaltransduktion
von A zu D. Wenn alle Komponenten dieses Signaltransduktionsweges
untersucht werden, können
Verbindungen oder Krankheitszustände,
welche die Aktivität
oder Neuverteilung von ausschließlich D beeinflussen, als auf
C oder stromabwärts
von C wirkend angenommen werden, während Verbindungen oder Krankheitszustände, welche
die Aktivität
oder Neuverteilung von C und D, aber nicht von A oder B beeinflussen,
als stromabwärts
von B wirkend angenommen werden können.
-
Der
Ausdruck „fixierte
Zellen" wird verwendet,
um Zellen zu meinen, die mit einem cytologischen Fixiermittel wie
Glutaraldehyd oder Formaldehyd behandelt sind, Behandlungen, die
dazu dienen, chemisch lösliche
und unlösliche
Proteine innerhalb der Struktur der Zelle kreuzzuvernetzen und zu
stabilisieren. Einmal in diesem Stadium, können solche Proteine von der
Struktur der nun toten Zelle nicht mehr verloren gehen.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
1 CHO-Zellen,
die das PKAc-F64L-S65T-GFP-Hybridprotein exprimieren, sind in HAM's F12-Medium mit
50 mM Forskolin bei 37°C
behandelt worden.
-
Die
Bilder der GFP-Fluoreszenz in diesen Zellen sind bei verschiedenen
Zeitintervallen nach der Behandlung gemacht worden, nämlich: a)
40 Sekunden, b) 60 Sekunden, c) 70 Sekunden, d) 80 Sekunden. Die Fluoreszenz
verändert
sich von einer punktförmigen
zu einer mehr gleichmäßigen Verteilung
innerhalb des (nicht-nukleären)
Zytoplasmas.
-
2.
Zeitraffer-Analyse von Forskolin-induzierter PKAc-F64L-S65T-GFP-Neuverteilung.
CHO-Zellen, exprimierend das PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein, wurden durch zeitabhängige Fluoreszenz-Mikroskopie
analysiert. Fluoreszenz-Mikroskopbilder wurden bei regulären Intervallen
von 2 Minuten bis zu 8 Minuten nach der Zugabe des Agonisten erhalten.
Die Zellen wurden mit 1 mM Forskolin herausgefordert, sobald das
obere linke Bild erhalten wurde (t = 0). Rahmen wurden bei den folgenden
Zeiten gewonnen: i) 0, ii) 1, iii) 2, iv) 3, v) 4, und vi) 5 Minuten.
Größenskala
10 mm.
-
3.
Zeitraffer-Analysen der PKAc-F64L-S65T-GFP-Neuverteilung als Antwort
auf verschiedene Agonisten. Die Wirkungen von 1 mM Forskolin (A),
50 mM Forskolin (B), 1 mM dbcAMP (C) und 100 mM IBMX (D) (Zugaben
durch offene Pfeile angezeigt) auf die Lokalisierung des PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein wurden
durch Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie von CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP-Zellen
analysiert. Die Wirkung der Zugabe von 10 mM Forskolin (offener
Pfeil), schnell gefolgt durch wiederholtes Waschen mit Puffer (gefüllter Pfeil)
auf die Lokalisation des PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein wurde in denselben Zellen
analysiert (E). In einem parallelen Experiment wurde die Wirkung
des Zugebens von 10 mM Forskolin und 100 mM IBMX (offener Pfeil)
gefolgt durch wiederholtes Waschen mit Puffer enthaltend 100 mM
IBMX (gefüllter
Pfeil) analysiert (F). Das Entfernen von Forskolin bewirkte, dass
das PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein zu den zytoplasmatischen Aggregaten
zurückkehrte,
während
dies durch die kontinuierliche Gegenwart von IBMX verhindert wird
(F). Die Wirkung von 100 mM Glucagon (3G,
offener Pfeil) auf die Lokalisierung des PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein
wird auch für
BHK/GR, PKAc-F64L-S65T-GFP-Zellen gezeigt. Die Wirkung von 10 mM Noradrenalin
(H), gefüllter
Pfeil, auf die Lokalisation des PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein wurde in ähnlicher
Weise analysiert, in transient transfizierten CHO, PKAc-F64L-S65T-GFP-Zellen,
vorbehandelt mit 10 mM Forskolin, offener Pfeil, um [cAMP]i zu erhöhen.
N. B. in 3H zählt die x-Achse die Bilderanzahl,
mit 12 Sekunden zwischen den Bildern. Die Rohdaten dieses Experiments
bestanden aus 60 Fluoreszenz-Mikroskopbildern, erhalten bei gleichmäßigen Intervallen
einschließlich
verschiedene Bilder, die vor der Zugabe von Puffer oder Agonisten
erhalten wurden. Die Diagramme (A–G) zeigen jeweils eine Quantifizierung
der Antwort, die über
alle 60 Bilder gesehen wurde, durchgeführt wie beschrieben in Analyse
Verfahren 2. Die Veränderung
der Gesamtfläche
der hochfluoreszenten Aggregate, bezogen auf die Anfangsfläche der fluoreszenten
Aggregate, ist als Ordinate in allen Graphen in 3 gegenüber der
Zeit für
jedes Experiment aufgetragen. Größenskala
10 mm.
-
4.
Dosis-Antwort-Kurve (zwei Experimente) für Forskolin-induzierte Neuverteilung
der PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion.
-
5.
Zeit zwischen dem Beginn einer Antwort und halb maximialer (t1/2max) und maximaler (tmax) PKAc-F64L-S65T-GFP-Neuverteilung.
Die Daten wurden von Kurven wie diejenigen extrahiert, die in „2" gezeigt sind. Alle
t1/2max und tmax-Werte sind als Mittelwerte ± SD dargestellt
und basieren auf einer Gesamtzahl von 26 bis 30 Zellen aus 2–3 unabhängigen Experimenten
für jede
Forskolinkonzentration. Da die beobachtete Neuverteilung über die
Zeit andauert, wurden die tmax-Werte als
der früheste
Zeitpunkt genommen, an dem eine vollständige Neuverteilung erreicht
ist. Es ist zu bemerken, dass die Werte nicht mit dem Grad der Neuverteilung
in Beziehung stehen.
-
6.
Parallele Dosis-Antwort-Analysen von Forskolin induziertem cAMP-Anstieg und PKAc-F64L-S65T-GFP-Neuverteilung.
Die Wirkungen von Puffer oder 5 ansteigenden Forskolinkonzentrationen
auf die Lokalisation des PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusionsprotein
in CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP-Zellen, wachsen gelassen in einer 96-Vertiefungen-Platte,
wurden wie oben beschrieben, analysiert. Das Berechnen des Verhältnisses
der SD's der Fluoreszenz- Mikroskopbildern,
die von demselben Zellenfeld genommen wurden, vor und 30 Minuten
nach der Zugabe von Forskolin, ergaben ein reproduzierbares Maß der PKAc-F64L-S65T-GFP-Neuverteilung.
Der Graph zeigt die einzelnen 48 Messungen und eine Spur ihrer Mittelwerte ± s.e.m.
bei verschiedenen Forskolinkonzentrationen an. Zum Vergleich wurden
die Wirkungen von Puffer oder 8 ansteigenden Konzentrationen von
Forskolin auf [cAMP]i durch einen Sintillation-Proximitäts-Assay
von Zellen analysiert, die unter denselben Bedingungen wachsen gelassen
wurden. Der Graph zeigt eine Spur des Mittelwertes ± s.e.m.
der 4 Experimente an, ausgedrückt
in willkürlichen
Einheiten.
-
7.
BHK-Zellen, stabil transfiziert mit dem humanen muskarinischen (hM1)-Rezeptor und der PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion.
Carbachol (100 mM bei 1 Sekunde hinzugefügt) induzierte eine transiente Neuverteilung
von PKAc-F64L-S65T-GFP
vom Zytoplasma zu der Plasmamembran. Bilder wurden bei den folgenden
Zeiten genommen: a) 1 Sekunde vor Carbachol-Zugabe, b) 8,8 Sekunden
nach Zugabe und c) 52,8 Sekunden nach Zugabe.
-
8.
BHK-Zellen, die mit dem hM1-Rezeptor und der PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion stabil transfiziert
waren, wurden mit Carbachol (1 mM, 10 mM, 100 mM) behandelt. In
Einzelzellen wurde das intrazelluläre [Ca2+]
gleichzeitig mit der Neuverteilung von PKAc-F64L-S65T-GFP aufgezeichnet.
Die gestrichelte Linie zeigt die Zugabezeiten von Carbachol an.
Die obere Tafel zeigt die Veränderungen
der intrazellulären
Ca2+-Konzentration individueller Zellen
mit der Zeit bei jeder Behandlung. Die mittlere Tafel zeigt die
Veränderungen
der durchschnittlichen zytoplasmatischen GFP-Fluoreszenz für individuelle
Zellen gegenüber
der Zeit für
jede Behandlung. Die untere Tafel zeigt Veränderungen in der Fluoreszenz
der Peripherie von Einzelzellen, innerhalb von Regionen, die spezifisch
den umgebenden Rand einer Zelle wie in der normalen Projektion gesehen
einschließen,
die Regionen, welche die beste Chance eröffnen, Veränderungen der Fluoreszenzintensität der Plasmamembran
zu überwachen.
-
9.
- a) Die hERK1-F64L-S65T-GFP-Fusion
exprimiert in HEK293-Zellen behandelt mit 100 mM MEK1 Inhibitor PD98059
in HAM F-12 (ohne Serum) für 30
Minuten bei 37°C.
Die Kerne werden ihrer Fluoreszenz während dieser Behandlung entleert.
- b) Dieselben Zellen wie in (a) gefolgt von Behandlung mit 10%
fötalem
Kälberserum
für 15
Minuten bei 37°C.
- c) Zeitprofile für
die Neuverteilung von GFP-Fluoreszenz in HEK293-Zellen nach Behandlung
mit verschiedenen Konzentrationen von EGF in Hepes-Puffer (HAM F-12
ersetzt durch Hepes-Puffer direkt vor dem Experiment). Die Neuverteilung
der Fluoreszenz ist als die Veränderung
in dem Verhältniswert
zwischen Flächen
im Kern und Zytoplasma von Einzelzellen ausgedrückt. Jedes Zeitprofil ist der
Mittelwert für
Veränderungen,
die in 6 Einzelzellen gesehen wurden.
- d) Balken-Diagramm für
die Endpunktmessungen, 600 Sekunden nach Start der EGF-Behandlungen,
der Fluoreszenz-Veränderung
(Kern: Zytoplasma) nach verschiedenen Konzentrationen von EGF.
-
10.
- a) Die SMAD2-EGFP-Fusion,
exprimiert in HEK293-Zellen mit Serumentzug über Nacht in HAM F-12. HAM F-12
wurde dann durch Hepes-Puffer pH 7,2 genau vor dem Experiment ersetzt.
Größenskala
ist 10 mm.
- b) HEK293-Zellen, welche die SMAD2-EGFP-Fusion exprimieren,
wurden mit verschiedenen Konzentrationen an TGF-beta wie angegeben
behandelt, und die Neuverteilung der Fluoreszenz wurde gegenüber die Zeit
aufgetragen.
Die Zeitprofil-Auftragungen stellen Anstiege in
der Fluoreszenz im Kern dar, normalisiert auf Startwerte in jeder
gemessenen Zelle. Jede Spur ist das Zeitprofil für einen einzelnen Zellkern.
- c) Ein Balkendiagramm, das die Endpunktveränderung der Fluoreszenz innerhalb
von Kernen (nach 850 Behandlungssekunden) für verschiedene Konzentrationen
an TGF-beta darstellt. Jeder Balken ist der Wert für einen
Einzelkern in jedem Experiment.
-
11. Die VASP-F64L-S65T-GFP-Fusion in CHO-Zellen,
die mit dem humanen Insulinrezeptor stabil transfiziert waren. Den
Zellen wurde zwei Stunden lang in HAM F-12 das Serum entzogen, dann
wurden sie mit 10%igem fötalem
Kälberserum
behandelt. Das Bild zeigt die resultierende Neuverteilung der Fluoreszenz nach
15 Behandlungsminuten. GFP-Fluoreszenz wird in Strukturen lokalisiert,
die als fokale Adhäsionen
entlang der Länge
der Aktin-Stressfasern identifiziert wurden.
-
12. Zeit-abhängige
Aufzeichnung der GLUT4-GFP-Neuverteilung in CHO-HIR-Zellen. Die Zeit zeigt Minuten nach
der Zugabe von 100 nM Insulin an.
-
BEISPIEL 1
-
Konstruktion, Testen und
Implementierung eines Assays für
cAMP basierend auf PKA-Aktivierung in Echtzeit in lebenden Zellen.
-
Nützlich zum Überwachen
der Aktivität
von Signalwegen, die zu veränderten
Konstruktionen an cAMP führen,
z. B. Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die an G-Proteine
der Gs oder Gi-Klasse
koppeln.
-
Die
katalytische Untereinheit der murinen cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKAc)
wurde C-terminal an ein F64L-S65T-Derivat von GFP fusioniert. Die
resultierende Fusion (PKAc-F64L-S65T-GFP) wurde zum in vivo Überwachen
der Translokation und dadurch der Aktivierung von PKA verwendet.
-
Konstruktion der PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion:
-
Geeignete
Restriktionsendonucleasestellen wurden durch Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain
reaction, PCR) in cDNAs eingeführt,
die für
murine PKAc (GenBank Zugangs-Nr.: M12303) und F64L-S65T-GFP (Sequenz
offenbart in WO 97/11094) kodierten. Die PCR-Reaktionen wurden entsprechend Standardprotokollen
mit den folgenden Primern durchgeführt:
5'PKAc: TTggACACAAgCTTTggACACCCTCAggATATgggCAACgCCgCCgCCgCCAAg
(SEQ ID NO: 3),
3'PKAc:
gTCATCTTCTCgAgTCTTTCAggCgCgCCCAAACTCAgTAAACTCCTTgCCACAC (SEQ ID
NO: 4),
5'GFP:
TTggACACAAgCTTTggACACggCgCgCCATgAgTAAAggAgAAgAACTTTTC (SEQ ID NO:
1),
3'GFP:
gTCATCTTCTCgAgTCTTACTCCTgAggTTTgTATAgTTCATCCATgCCATgT (SEQ ID NO:
2).
-
Das
PKAc-Amplifikations-Produkt wurde dann mit HindIII + AscI verdaut
und das F64L-S65T-GFP Produkt mit AscI + XhoI. Die zwei verdauten
PCR-Produkte wurden nachfolgend mit einem HindIII + XhoI verdauten
Plasmid ligiert (pZeoSV® Säuger Expressionsvektor, Invitrogen,
San Diego, CA, USA). Das resultierende Fusions-Konstrukt (SEQ ID
NO: 68 & 69)
war unter Kontrolle des SV40 Promotors.
-
Transfektion und Zell-Kulturbedingungen.
-
Chinesische
Hamstereierstockzellen (Chinese Hamster Ovary Cells, CHO) wurden
mit dem Plasmid enthaltend die PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion unter Verwendung
des Calcium-Phosphat-Präzipitat-Verfahrens in
HEPES-gepufferter Salzlösung
transfiziert (Sambrook et al. 1989). Stabile Transfektanten wurden
selektiert unter Verwenden von 1000 mg Zeocin/ml (Invitrogen) in
dem Wachstumsmedium (DMEM mit 1000 mg Glucose/l, 10% fötalem Rinderserum
(fetal bovine serum, FBS), 100 mg Penicillin-Streptomycin-Mischung
ml–1,
2 mM L-Glutamin,
gekauft von Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Untransfizierte
CHO-Zellen wurden als Kontrolle verwendet. Um die Wirkung von Glucagon
auf die Fusionsproteintranslokation zu testen, wurde die PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion stabil
in Baby-Hamsternierenzellen exprimiert, welche den humanen Glucagon
Rezeptor überexprimierten
(BHK/GR-Zellen). Untransfizierte BHK/GR-Zellen wurden als Kontrolle verwendet.
Die Expression des GR wurde mit 500 mg G418/ml (Neo Marker) aufrechterhalten
und PKAc-F64L-S65T-GFP wurde mit 500 mg Zeocin/ml (Sh ble Marker)
aufrechterhalten. CHO-Zellen wur den auch gleichzeitig mit Vektoren
cotransfiziert, welche die PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion und den humanen a2a Adrenoceptor
(hARa2a) enthielten.
-
Für die Fluoreszenz-Mikroskopie
wurden die Zellen auf Lab-Tek Deckelgläsern (coverglasses), die mit Kammern
versehen waren, mindestens 24 Stunden lang adherieren gelassen (Nalge
Nunc. Int., Naperville, IL, USA) und bis 80% Konfluenz kultiviert.
Vor den Experimenten wurden die Zellen über Nacht ohne Selektionsdruck
in HAM F-12-Medium mit Glutamax (Life Technologies), 100 mg Penicillin-Streptomycin-Mischung
ml–1 und
0,3% FBS kultiviert. Dieses Medium hat eine niedrige Autofluoreszenz,
was die Fluoreszenz-Mikroskopie der Zellen direkt aus dem Inkubator
ermöglicht.
-
Überwachen der Aktivität von PKA-Aktivität in Echtzeit:
-
Das
Erhalten von Bildern von lebenden Zellen wurde erreicht unter Verwenden
eines Zeiss Axiovert 135M Fluoreszenz-Mikroskops, ausgestattet mit
einem Fluar 40X, NA: 1,3 Öl-Immersionsobjektiv
und gekoppelt an eine Photometrics CH250 Digital-(charged coupled
device, CCD)Kamera. Die Zellen wurden mit einer 100 W HBO Bogenlampe
beleuchtet. In dem Lichtweg war ein 470 ± 20 nm Anregungs-Filter,
ein 510 nm Dichroitischer Spiegel und ein 515 ± 15 nm Emissions-Filter für minimalen
Bildhintergrund. Die Zellen wurden mit einer selbstgebauten Heizung
des Mikroskoptisches gehalten und überwacht, damit sie bei 37°C waren.
-
Die
Bilder wurden auf die folgende Weise prozessiert und analysiert:
-
Verfahren 1: Schrittweises
Verfahren zur Quantifizierung der Translokation von PKA:
-
- 1. Das Bild wurde bezüglich dunklem Strom (dark current)
durch Durchführen
einer "pixel-by-pixel"-Subtraktion eines
dunklen Bildes korrigiert (ein Bild, das unter denselben Bedingungen
wie das gegenwärtige
Bild gemacht wird, mit der Ausnahme, dass der Kameraverschluss nicht
geöffnet
wird).
- 2. Das Bild wurde bezüglich
Nicht-Einheitlichkeit der Beleuchtung durch Durchführen eines "pixel-by-pixel"-Verhältnisses
mit einem Flachfeld-Korrekturbild
korrigiert (ein Bild, das unter denselben Bedingungen wie das gegenwärtige Bild
von einer einheitlich fluoreszierenden Probe gemacht wird).
- 3. Das Bild-Histogram, d. h., die Frequenz des Auftretens jedes
Intensitäts-Wertes in dem Bild
wurde berechnet.
- 4. Eine geglättete,
zweite Abteilung des Histogramms wurde berechnet und die zweite
Null wird bestimmt. Diese Null entspricht dem Wendepunkt des Histogramms
auf der hohen Seite des Haupt-Peaks, der die Hauptmasse der Bild-Pixel-Werte
darstellt.
- 5. Der in Schritt 4 bestimmte Wert wurde von dem Bild abgezogen.
Alle negativen Werte wurden verworfen.
- 6. Die Varianz (Quadrat der Standard-Abweichung) der verbliebenen
Pixel-Werte wurde
bestimmt. Dieser Wert stellt die „Antwort" für
das Bild dar.
- 7. Scintillations-Proximität-Assay
(scintillation proximity assay, SPA) für die unabhängige Quantifizierung von cAMP.
-
Verfahren 2: Alternativverfahren
zur Quantifizierung der PKA-Neuverteilung:
-
- 1. Die Fluoreszenzaggregate werden von jedem
Bild unter Verwenden eines automatisch gefundenen Grenzwertes basierend
auf der Maximierung der Informationsmessung zwischen dem Objekt
und dem Hintergrund abgetrennt. Die a priori Entropie des Bildhistogramms
wird als das Informationsmaß verwendet.
- 2. Die Fläche
jedes Bildes, die durch die Aggregate bedeckt ist, wird durch Zählen der
Pixel in den segmentierten Flächen
berechnet.
- 3. Der in Schritt 2 erhaltene Wert für jedes Bild in einer Serie,
oder Behandlungspaar, wird bezüglich
des Wertes normalisiert, der für
das erste (nicht stimulierte) aufgezeichnete Bild gefunden wurde.
Ein Wert von Null (0) zeigt keine Neuverteilung der Fluoreszenz
ausgehend von der Startbedingung an. Ein Wert von Eins (1) durch
dieses Verfahren entspricht einer vollen Neuverteilung.
-
Zellen
wurden in HAM F-12-Medium wie oben beschrieben kultiviert, aber
in Platten mit 96 Vertiefungen. Das Medium wurde mit Ca2+-HEPES-Puffer
mit 100 mM IBMX ausgetauscht und die Zellen wurden mit verschiedenen
Konzentrationen an Forskolin 10 Minuten lang stimuliert. Die Reaktionen
wurden durch Zugabe von NaOH auf 0,14 M gestoppt und die Menge an
cAMP wurde mit dem cAMP-SPA-Kit, RPA538 (Amersham) wie durch den
Hersteller beschrieben, gemessen.
-
Manipulieren
von intrazellulären
cAMP-Spiegeln, um die PKAc-F64L-S65T-GFP-Fusion zu testen.
-
Die
folgenden Verbindungen wurden verwendet, um cAMP-Spiegel zu variieren;
Forskolin, ein Aktivator der Adenylatcyclase; dbcAMP, ein Membran-permeables
cAMP Analogon, das durch Phosphodiesterase nicht abgebaut wird;
IBMX, ein Inhibitor der Phosphodiesterase.
-
CHO-Zellen,
die stabil PKAc-F64L-S65T-GFP exprimierten, zeigten eine dramatische
Translokation des Fusionsproteins von einer punktförmigen Verteilung
zu einer gleichförmigen
Verteilung über
das Zytoplasma nach einer Stimulierung mit 1 mM Forskolin (n = 3),
10 mM Forskolin (n = 4) und 50 mM Forskolin (n = 4) (1),
oder dbcAMP bei 1 mM (n = 6).
-
2 zeigt
den Fortschritt der Antwort in der Zeit nach Behandlung mit 1 mM
Forskolin.
-
3 gibt
einen Vergleich für
durchschnittliche Zeitprofile der Fusionsprotein-Neuverteilung und ein Maß für das Ausmaß jeder
Antwort auf die drei Forskolin konzentrationen (3A,
E, B) und auf 1 mM dbcAMP (3C), das
eine ähnliche,
aber langsamere Antwort hervorrief, und auf die Zugabe von 100 mM
IBMX (n = 4, 3D), das auch eine langsame
Antwort hervorrief sogar in der Abwesenheit einer Adenylatcyclasestimulation.
Zugabe von Puffer (n = 2) hatte keine Wirkung (Daten nicht gezeigt).
-
Als
eine Kontrolle für
das Verhalten des Fusionsproteins wurde F64L-S65T-GFP alleine in
CHO-Zellen exprimiert und diesen wurde auch 50 mM Forskolin verabreicht
(n = 5); die einheitliche diffuse Verteilung, die für GFP in
diesen Zellen charakteristisch ist, wurde durch solch eine Behandlung
nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt).
-
Die
Forskolin induzierte Translokation von PKAc-F64L-S65T-GFP zeigte
eine Dosis-Antwort-Beziehung (4 und 6),
siehe quantitative Verfahren oben.
-
Reversibilität der PKAc-F64L-S65T-GFP-Translokation:
-
Die
Freisetzung der PKAc-Sonde von ihren zytoplasmatischen Anker-Punkten
(hotspots) war reversibel. Wiederholtes Waschen der Zellen (5–8mal) mit
Puffer nach 10 μM
Forskolinbehandlung stellte das punktförmige Muster innerhalb 2–5 Minuten
vollständig
wieder her (n = 2, 3E). Tatsächlich kehrte
das Fusionsprotein zu einem Muster von Fluoreszenz-zytoplasmatischen-Aggregaten
zurück,
das praktisch von denjenigen ununterscheidbar war, das vor Forskolinstimulation
beobachtet wurde.
-
Um
zu testen, ob die Rückkehr
des Fusionsproteins zu den zytoplasmatischen Aggregaten eine Abnahme
in [cAMP]i wiederspiegelte, wurden die Zellen
mit einer Kombination von 10 mM Forskolin und 100 mM IBMX (n = 2)
behandelt und dann wiederholt gewaschen (5–8 mal) mit Puffer enthaltend
100 mM IBMX (3F). In diesen Experimenten
kehrte das Fusionsprotein nicht zu seiner pre-stimulatorischen Lokalisation nach Entfernung
von Forskolin zurück.
-
Test der PKA-F64L-S65T-GFP-Sonde
mit biologisch relevanten Mitteln
-
Um
die Antwort der Probe auf die Rezeptoraktivierung der Adenylatcyclase
zu testen, wurden BHK Zellen, die mit dem Glucagonrezeptor und der
PKA-F64L-S65T-GFP-Sonde
stabil transfiziert waren, einer Glucagonstimulation ausgesetzt.
Der Glucagonrezeptor ist an ein Gs-Protein
gekoppelt, das Adenylatcyclase aktiviert, wodurch der cAMP-Spiegel
erhöht
wird. In diesen Zellen führte
die Zugabe von 100 mM Glucagon (n = 2) zur Freisetzung der PKA-F64L-S65T-GFP-Sonde
von den zytoplasmatischen Aggregaten und zu einer resultierenden
Translokation des Fusionsproteins zu einer gleichmäßigeren
zytoplasmatischen Verteilung innerhalb von 2 bis 3 Minuten (3G). Ähnliche,
aber weniger deutliche Wirkungen wurden bei tieferen Glucagonkonzentrationen
gesehen (n = 2, Daten nicht gezeigt). Zugabe von Puffer (n = 2)
hatte keine Wirkung über
den Zeitraum (Daten nicht gezeigt).
-
Transient
transfizierte CHO-Zellen exprimierend hARa2a und die PKA-F64L-S65T-GFP-Sonde wurden
mit 10 mM Forskolin 7,5 Minuten lang behandelt, dann, immer in Gegenwart
von Forskolin, 10 mM Noradrenalin ausgesetzt, um die exogenen Adrenorezeptoren
zu stimulieren, die an ein Gi Protein koppeln,
das Adenylatcyclase inhibiert. Diese Behandlung führte zum
Wiederauftreten von Fluoreszenz in den zytoplasmatischen Aggregaten,
was für
einen Abfall in [cAMP]i bezeichnend ist
(3H).
-
Die Translokation des
Fusionsproteins korellierte mit [cAMP]i
-
Wie
oben beschrieben war die Zeit, die notwendig war, damit einer Antwort
vollständig
wurde, abhängig
von der Forskolin-Dosis (5). Zusätzlich war
auch der Grad der Antworten dosisabhängig. Um die PKA-F64L-S65T-GFP-Fusionsproteintranslokation
in einem System mit halb-hohem Durchsatz (Semi high through-put
system) zu testen, wurden mit der PKA-F64L-S65T-GFP-Fusion stabil
transfizierte CHO-Zellen mit Puffer und 5 ansteigenden Dosen Forskolin
(n = 8) stimuliert. Unter Verwenden des oben beschriebenen Bildverarbeitungsalgorithmus
(Verfahren 1) wurde eine dosisabhängige Beziehung im Bereich
von 0,01 bis 50 mM Forskolin beobachtet (6). Eine
halbmaximale Stimulation wurde bei etwa 2 mM Forskolin beobachtet.
Parallel wurden Zellen mit Puffer und 8 ansteigenden Konzentrationen
von Forskolin (n = 4) im Bereich von 0,01 bis 50 mM stimuliert.
Die Menge an hergestelltem cAMP wurde in einem SPA Assay gemessen.
Ein steiler Anstieg wurde zwischen 1 und 5 mM Forskolin beobachtet,
was mit dem steilsten Teil der Kurve für die Fusionsproteintranslokation
zusammenfällt
(siehe auch 6).
-
BEISPIEL 2
-
Quantifizierung der Neuverteilung
in Echtzeit in lebenden Zellen
-
Sonde für die Detektion
von PKC-Aktivität
in Echtzeit in lebenden Zellen:
-
Konstruktion von PKC-GFP-Fusion:
-
Die
Sonde wurde durch Ligieren von zwei mit Restriktionsenzymen behandelten
Polymeraseketten-Reaktion (PCR)-Amplifikationsprodukten der cDNA
für murine
PKCα (GenBank
Zugangsnummer: M25811) und F64L-S65T-GFP (Sequenz offenbart in WO
97/11094) konstruiert. Taq® Polymerase und die folgenden
Oligonukleotidprimer wurde für
die PCR verwendet;
5'mPKCa:
TTggACACAAgCTTTggACACCCTCAggATATggCTgACgTTTACCCggCCaaCg (SEQ ID
No: 5),
3'mPKCa:
gTCATCTTCTCgAgTCTTTCAggCgCgCCCTACTgCACTTTgCAAgATTgggTgC (SEQ ID
No: 6),
5'F64L-S65T-GFP:
TTggACACAAgCTTTggACACggCgCgCCATgAgTAAAggAgAAgAACTTTTC (SEQ ID No: 1),
3'F64L-S65T-GFP: gTCATCTTCTCgAgTCTTACTCCTgAggTTTgTATAgTTCATCCATgCCATgT
(SEQ ID No: 2).
-
Der
Hybrid-DNA-Strang wurde in den pZeoSV® Säugerexpressionsvektor
als HindIII-XhoI Kassette wie beschrieben in Beispiel 1 eingefügt.
-
Zellkultur:
-
BHK-Zellen
exprimierend den Human M1-Rezeptor unter der Kontrolle des induzierbaren
Metallothioninpromotors und gehalten mit dem Dihydrofolatreduktasemarker
wurden mit der PKCα-F64L-S65T-GFP-Sonde
unter Verwenden des Calciumphosphatpräzipitatverfahrens in HEPES
gepufferter Salzlösung
(HBS [pH 7.10]) transfiziert. Stabile Transfektanten wurden unter
Verwendung von 1000 μg
Zeocin®/ml
in dem Wachstumsmedium selektiert (DMEM mit 1000 mg Glukose/l, 10%
fötalem
Rinderserum (FBS), 100 mg Penicillin-Streptomycinmischung ml–1,
2 mM 1-Glutamin). Der hM1-Rezeptor und das PKCα-F64L-S65T-GFP Fusionsprotein
wurden mit 500 mM Methotrexat und 500 μg Zeocin®/ml
gehalten. 24 Stunden vor jedem Experiment wurden die Zellen in HAM
F-12 Medium mit Glutamax, 100 μg
Penicillin-Streptomycinmischung ml–1 und 0,3%
FBS transferiert. Dieses Medium erleichtert den Selektionsdruck,
führt zu
einer schwachen Induktion der Signaltransduktionswege und hat eine
niedrige Autofluoreszenz bei der relevanten Wellenlänge, was
die Fluoreszenzmikroskopie der Zellen direkt aus dem Inkubator ermöglicht.
-
Überwachen der PKC Aktivität in Echtzeit:
-
Digitale
Bilder von lebenden Zellen wurden gesammelt unter Verwenden eines
Zeiss Axiovert 135M Fluoreszenzmikroskops ausgestattet mit einem
40X, NA: 1,3 Ölimmersionsobjektiv
und gekoppelt an eine Photometrics CH250 Digital-(CCD)-Kamera. Die Zellen wurde mit einer
100 W Bogenlampe beleuchtet. In dem Lichtweg war ein 470 ± 20 nm
Anregungsfilter, ein 510 nm dichroidischer Spiegel und ein 515 ± 15 nm
Emissionsfilter für
minimalen Bildhintergrund. Die Zellen wurden mit einer selbstgebauten
Heizung des Mikroskoptisches gehalten und überwacht, damit sie bei 37°C waren.
-
Bilder
wurden unter Verwenden der IPLab Softwarepackung für Macintosh
analysiert.
-
Nach
Stimulation der M1-BHK-Zellen, welche die PKCα-F64L-S65T-GFP-Fusion stabil exprimierten, mit
Carbachol beobachteten wir eine dosisabhängige, transiente Translokation
vom Zytoplasma zur Plasmamembran (7a,
b, c). Gleichzeitiges Messen der Konzentration an zytosolischem
freien Calcium zeigte, das die Carbachol-induzierte Calciummobilisierung
der Translokation vorangeht (8).
-
Schrittweises Verfahren
zum Quantifizieren der Translokation von PKC:
-
- 1. Das Bild wurde bezüglich dunklem Strom (dark current)
durch Durchführen
einer "pixel-by-pixel"-Subtraktion eines
dunklen Bildes korrigiert (ein Bild, das unter denselben Bedingungen
wie das gegenwärtige
Bild gemacht wird, mit der Ausnahme, dass der Kameraverschluss nicht
geöffnet
wird).
- 2. Das Bild wurde bezüglich
Nicht-Einheitlichkeit der Beleuchtung durch Durchführen eines "pixel-by-pixel"-Verhältnisses
mit einem Flachfeld-Korrekturbild
korrigiert (ein Bild, das unter denselben Bedingungen wie das gegenwärtige Bild
von einer einheitlich fluoreszierenden Probe gemacht wird).
- 3. Eine Kopie des Bildes wurde gemacht, in der die Ränder identifiziert
sind. Die Ränder
in dem Bild werden durch ein Standard-Randdetektionsvorgehen gefunden – Überziehen
des Bildes mit einem Kernprogramm, das alle sich nicht verändernden
Komponenten mit großem
Ausmaß entfernt
(d. h. Hintergrund) und alle Veränderungen
mit kleinem Ausmaß betont
(d. h. scharfe Ränder).
Dieses Bild wurde dann in ein binäres Bild durch Einführen eines Schwellenwertes
umgewandelt. Objekte in dem binären
Bild, die zu klein sind, um Ränder
von Zellen darzustellen, wurde verworfen. Eine Aufblähung des
binären
Bildes wurde durchgeführt,
um alle Löcher
in den Bildrändern
zu schließen.
Alle Randobjekte in dem Bild, die in Kontakt mit den Grenzen des
Bildes waren, wurden verworfen. Dieses binäre Bild stellt die Randmaske
dar.
- 4. Eine weitere Kopie des Bildes wurde mit der in Schritt 3
beschriebenen Vorgehensweise hergestellt. Diese Kopie wurde weiter
verarbeitet, um Objekte nachzuweisen, die "Löcher" einschließen und
um alle Pixel in den Löchern
auf den binären
Wert des Randes zu setzen, d. h. eins. Dieses Bild stellt die Gesamtzellenmaske
dar.
- 5. Das ursprüngliche
Bild wurde mit der Rändermaske
von Schritt 3 maskiert und die Gesamtanzahl aller Pixelwerte wird
bestimmt.
- 6. Das Originalbild wurde mit der Gesamtzellenmaske von Schritt
4 maskiert und die Gesamtmenge aller Pixelwerte wurde bestimmt.
- 7. Der Wert von Schritt 5 wurde durch den Wert von Schritt 6
dividiert, um das Endresultat zu ergeben, die Fraktion der Fluoreszenzintensität in den
Zellen, die in den Rändern
lokalisiert war.
-
BEISPIEL 3
-
Sonden zur Detektion der
Neuverteilung von Mitogen-aktivierter Proteinkinase ERK1
-
Nützlich zum Überwachen
von Signalwegen, die MAPK einschließen, z. B. um Verbindungen
zu identifizieren, die die Aktivität des Weges in lebenden Zellen
modellieren.
-
ERK1,
eine Serin/Threonin-Proteinkinase, ist eine Komponente eines Signalweges,
der durch z. B. viele Wachstumsfaktoren aktiviert wird.
-
Sonden zur Detektion der
ERK1-Aktivität
in Echtzeit in lebenden Zellen:
-
Die
durch ein extrazelluläres
Signal regulierte Kinase (extracellular signal regulated kinase,
ERK1, eine mitogenaktivierte Proteinkinase, MAPK) wird N- oder C-terminal
an ein GFP-Derivat gekoppelt. Die in verschiedenen Säugerzellen
exprimierten resultierenden Fusionen werden verwendet, um in vivo
die nukleäre Translokation,
und damit die Aktivierung von ERK1 als Antwort auf Stimuli, die
den MAPK Weg aktivieren, zu überwachen.
-
a) Konstruktion der murinen
ERK1-F64L-S65T-GFP-Fusion:
-
Geeignete
Restriktionsendonukleasestellen werden in die cDNAs, die murines
ERK1 (GenBank Zugangsnummer: Z14249) und F64L-S65T-GFP (Sequenz
offenbart in WO 97/11094) kodieren, durch Polymerasekettenreaktion
(PCR) eingeführt.
Die PCR-Reaktionen werden entsprechend Standardprotokollen mit den folgenden
Primern durchgeführt:
5'ERK1: TTggACACAAgCTTTggACACCCTCAggATATggCggCggCggCggCggCTCCggggggCgggg
(SEQ ID No: 7),
3'ERK1:
gTCATCTTCTCgAgTCTTTCAggCgCgCCCggggCCCTCTggCgCCCCTggCTgg (SEQ ID
No: 8),
5'F64L-S65T-GFP:
TTggACACAAgCTTTggACACggCgCgCCATgAgTAAAggAgAAgAACTTTTC (SEQ ID No: 1),
3'F64L-S65T-GFP: gTCATCTTCTCgAgTCTTACTCCTgAggTTTgTATAgTTCATCCATgCCATgT
(SEQ ID No: 2).
-
Um
die mERK1-F64L-S65T-GFP SEQ ID No: 65 & 57)-Fusion herzustellen, wird das
ERK1 Amplifikationsprodukt mit HindIII + AscI und das F64L-S65T-GFP-Produkt mit AscI
+ XhoI verdaut. Um die F64L-S65T-GFP-mERK1-Fusion herzustellen,
wird das ERK1-Amplifikationsprodukt dann mit HindIII + Bsu36I und
das F64L-S65T-GFP-Produkt mit Bsu36I + XhoI verdaut. Die zwei Paare
verdauter PCR-Produkte werden nachfolgend mit einem HindIII + XhoI
verdauten Plasmid (pZeoSV® Säugerexpressionsvektor, Invitrogen,
San Diego, CA, USA) ligiert. Die resultierenden Fusionskonstrukte
sind unter Kontrolle des SV40-Promotors.
- b)
Das humane ERK1-Gen (GenBank Zugangsnummer: X60188) wurde unter
Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den Primern
ERK1-top (SEQ ID No: 9) und ERK1-bottom/+stop (SEQ ID No: 10) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen EcoR1 und BamH1
verdaut und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55763), verdaut mit EcoR1 und BamH1. Dieses stellt eine EGFP-ERK1
Fusion (SEQ ID NO 38 & 39)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors
her.
-
Das
Plasmid enthaltend die EGFP-ERK1-Fusion wurde in HEK293-Zellen unter
Verwendung der FUGENE Transfektionsreagenz (Boehringer Mannheim)
transfiziert. Vor den Experimenten wurden die Zellen auf 80% bis
90% Konfluenz in Kammern mit 8 Vertiefungen, DMEM mit 10% FCS wachsen
gelassen. Die Zellen wurden in reinem HAM F-12-Medium (ohne FCS)
gewaschen, und dann 30 bis 60 Minuten lang in reinem HAM F-12 (ohne
FCS) mit 100 μM
PD98059 inkubiert, einen Inhibitor von MEK1, einer Kinase, die ERK1
aktiviert; Dieser Schritt entleert effektiv den Kern von EGFP-ERK1.
Gerade bevor das Experiment gestartet wurde, wurde das HAM F-12
durch Hepespuffer nach einem Waschschritt mit Hepespuffer ersetzt.
Dies entfernt den PD98059-Inhibitor; falls das Blockieren der MEK1
immer noch gewünscht
wird (z. B. in Kontrollexperimenten), wird der Inhibitor in den
Hepespuffer eingeschlossen.
-
Der
experimentelle Aufbau des Mikroskops war wie in Beispiel 1 beschrieben.
-
60
Bilder wurden mit 10 Sekunden zwischen jedem gesammelt, wobei die
Testverbindung nach Bild Nr. 10 hinzugefügt wurde.
-
Die
Zugabe von EGF (1–100
nM) führte
innerhalb von Minuten zu einer Neuverteilung von EGFP-ERK1 von dem
Zytoplasma in den Kern (9a, b).
-
Die
Antwort wurde wie unten beschrieben quantifiziert und eine dosisabhängige Beziehung
zwischen der EGF-Konzentration und der Kerntranslokation von EGFP-ERK1
wurde gefunden (9c, d). Die Neuverteilung
der GFP Fluoreszenz ist in diesem Beispiel als die Veränderung
in dem Verhältniswert
zwischen Flächen
im Kern gegenüber
zytoplasmatischen Kompartimenten der Zelle ausgedrückt. Jedes
Zeitprofil ist der Durchschnitt der nukleären zu zytoplasmatischen Verhältnisse
von 6 Zellen in jeder Behandlung.
-
BEISPIEL 4:
-
Sonden zur Detektion der
Erk2 Neuverteilung.
-
Nützlich zum Überwachen
der Signalwege, die MAPK einschließen, z. B. zum Identifizieren
von Verbindungen, welche die Aktivität des Weges in lebenden Zellen
modulieren.
-
Erk2,
eine Serin/Threonin-Proteinkinase, ist mit ERK1 eng verwandt, aber
nicht dazu identisch; sie ist eine Komponente eines Signalweges,
der z. B. durch viele Wachstumsfaktoren aktiviert wird.
- a) Das Ratten Erk2-Gen (GenBank Zugangsnummer: M64300) wurde
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern Erk2- top
(SEQ ID No: 11) und Erk2-bottom/+stop (SEQ ID No: 13) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Xho1 und BamH1
verdaut, und ligiert in pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55763), verdaut mit Xho1 und BamH1. Dieses stellt eine EGFP-Erk2-Fusion
(SEQ ID No: 40 & 41)
unter Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das Ratten Erk2-Gen (GenBank Zugangsnummer: M64300) wurde
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern Erk2-top
(SEQ ID No: 11) und Erk2-bottom/–stop (SEQ ID No: 12) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Xho1 und BamH1
verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U 55762), verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies stellt eine Erk2-EGFP-Fusion
(SEQ ID No: 58 & 59)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide wurden in CHO-Zellen und BHK-Zellen transfiziert.
Die Zellen wurden unter Standardbedingungen wachsen gelassen. Vor
den Experimenten wurden die Zellen in Medium ohne Serum 48 bis 72
Stunden lang hungern gelassen. Dies führte zu einer vorherrschend
zytoplasmatischen Lokalisierung beider Sonden, insbesondere in BHK-Zellen.
10% fötales
Kälberserum
wurde zu den Zellen hinzugefügt,
und die Fluoreszenz der Zellen wurde wie in Beispiel 3 erklärt aufgezeichnet.
Zugabe von Serum führte
dazu, dass sich die Sonden in dem Kern innerhalb von Minuten nach
Zugabe von Serum neu verteilten.
-
BEISPIEL 5:
-
Sonden zur Detektion der
Smad2-Neuverteilung.
-
Nützlich zum Überwachen
von Signalwegen, die durch einige Mitglieder der Transforming Growth
factor-beta-Familie aktiviert werden, z. B. um Verbindungen zu identifizieren,
die die Aktivität
des Weges in lebende Zellen modulieren.
-
Smad2,
ein Signaltransduktionsmolekül,
ist eine Komponente eines Signalweges, der durch einige Mitglieder
der TGFbeta-Familie von Cytokinen induziert wird.
- a)
Das humane Smad2-Gen (GenBank Zugangsnummer: AF027964) wurde unter
Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den Primern
Smad2-top (SEQ ID No: 24) und Smad2-bottom/+stop (SEQ ID No: 26)
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen
EcoR1 und Acc65I verdaut, und in die pEGFP-C1 ligiert (Clontech,
Palo Alto; GenBank Zugangsnummer: U55763), verdaut mit EcoR1 und
Acc65I. Dies stellt eine EGFP-Smad2-Fusion (SEQ ID No: 50 & 51) unter der
Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das humane Smad2-Gen (GenBank Zugangsnummer: AF027964) wurde
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern Smad2-top (SEQ ID No: 24) und Smad2-bottom/–stop (SEQ
ID No: 25) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen
EcoR1 und Acc65I verdaut, und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo
Alto; GenBank Zugangsnummer: U55762), verdaut mit EcoR1 und Acc65I.
Dies stellt eine Smad2-EGFP-Fusion (SEQ ID No: 74 & 75) unter der
Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Das
Plasmid enthaltend die EGFP-Smad2-Fusion wurde in HEK293-Zellen
transfiziert, wo es eine zytoplasmatische Verteilung zeigte. Vor
den Experimenten wurden die Zellen in Nunc-Kammern mit 8 Vertiefungen
in DMEM mit 10% FCS auf 80% Konfluenz wachsen gelassen und über Nacht
in HAM F-12-Medium ohne FCS hungern gelassen.
-
Für die Experimente
wurde das HAM F-12-Medium durch Hepespuffer pH 7,2 ersetzt.
-
Der
experimentelle Aufbau des Mikroskops war wie in Beispiel 1 beschrieben.
-
90
Bilder wurden mit 10 Sekunden zwischen jedem gesammelt, und wobei
die Testverbindung nach Bild Nr. 5 zugefügt wurde.
-
Nach
Serumentzug der Zellen enthielt jeder Kern weniger GFP-Fluoreszenz
als das umgebende Zytoplasma (10a).
Die Zugabe von TGFbeta führte
innerhalb von Minuten zu einer Neuverteilung des EGFP-Smad2 von
dem Zytoplasma in den Kern (10b).
-
Die
Neuverteilung der Fluoreszenz in den behandelten Zellen wurde einfach
als der fraktionelle Anstieg der nukleären Fluoreszenz quantifiziert,
normalisiert auf den Startwert der GFP-Fluoreszenz im Kern jeder
unstimulierten Zelle.
-
BEISPIEL 6:
-
Sonde zur Detektion der
VASP Neuverteilung.
-
Nützlich zum Überwachen
von Signalwegen, die die Neuanordnung von Elementen des Zytoskelettes umfassen,
z. B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Weges
in lebenden Zellen modulieren.
-
VASP,
ein Phosphoprotein, ist eine Komponente von Strukturen des Zytoskelettes,
die sich als Antwort auf Signale neu verteilen, die fokale Adhäsionen beeinflussen.
- a) Das humane VASP-Gen (GenBank Zugangsnummer:
Z46389) wurde unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen
mit den Primern VASP-top (SEQ ID No: 94) und VASP-bottom/+stop (SEQ ID
No: 95) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit dem Restriktionsenzymen
Hind3 und BamH1 verdaut und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo
Alto; GenBank Zugangsnummer: U55763), verdaut mit Hind3 und BamH1.
Dies stellt eine EGFP-VASP Fusion (SEQ ID No: 124 & 125) unter der
Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Das
resultierende Plasmid wurde in CHO-Zellen exprimierend den humanen
Insulinrezeptor unter Verwendung des Calciumphosphattransfektionsverfahrens
transfiziert. Vor den Experimenten wurden die Zellen in Nunc Kammern
mit 8 Vertiefungen wachen gelassen und über Nacht in Medium ohne FCS
hungern gelassen.
-
Die
Experimente werden in einem Mikroskopaufbau wie in Beispiel 1 beschrieben
durchgeführt.
-
10%
FCS wurde zu den Zellen hinzugefügt
und Bilder wurden gesammelt. Die EGFP-VASP-Fusion wurde von einer
irgendwie gleichen Verteilung in der Nähe der Peripherie in mehr lokalisierte
Strukturen neu verteilt, die als fokale Adhäsionspunkte identifiziert wurden
(11).
-
Eine
große
Anzahl weiterer GFP-Fusionen ist hergestellt worden, oder wird gerade
hergestellt, was aus den folgenden Beispielen 7–22 ersichtlich ist, die auch
geeignete Wirtszellen und Substanzen zur Aktivierung von zellulären Signalwegen
vorschlagen, die überwacht
und analysiert werden sollen.
-
BEISPIEL 7:
-
Sonde zur
Detektion der Aktin-Neuverteilung
-
Nützlich zum Überwachen
von Signalwegen, die die Neuanordnung oder Bildung von Aktinfilamenten einschließen, z.
B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität von Wegen
modulieren, die zu Neuanordnungen des Zytoskelettes in lebenden
Zellen führen.
-
Aktin
ist eine Komponente von Strukturen des Zytoskelettes, die sich als
Antwort auf sehr viele zelluläre
Signale neu verteilt.
-
Die
Aktinbindungsdomäne
des humanen alpha-Aktinin-Gens (GenBank Zugangsnummer: X15804) wurde
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern ABD-top (SEQ ID No: 90) und ABD-bottom/–stop (SEQ ID No: 91) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Hind3 und BamH1
verdaut, und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer: U55762),
verdaut mit Hind3 und BamH1. Dies stellte eine Aktinbindungsdomäne-EGFP-Fusion
(SEQ ID No: 128 & 129)
unter Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Das
resultierende Plasmid wurde in CHO-Zellen transfiziert, die den
humanen Insulinrezeptor exprimierten. Die Zellen wurden mit Insulin
stimuliert, was dazu führte,
dass die Aktinbindungsdomäne-EGFP-Sonde
in morphologisch unterschiedliche, Membran-assoziierte Strukturen
neu verteilt wurde.
-
BEISPIEL 8:
-
Sonden zur Detektion der
p38-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von Signalwegen, die auf verschiedene zelluläre Stresssituationen antworten,
z. B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Weges
in lebenden Zellen modulieren, oder als Gegenscreen.
-
p38,
eine Serin/Threonin-Proteinkinase, ist eine Komponente eines stressinduzierten
Signalweges, der durch viele Typen zellulären Stresses aktiviert wird,
z. B. TNFalpha, Anisomycin, UV und Mitomycin C.
- a)
Das humane p38-Gen (GenBank Zugangsnummer: L35253) wurde unter Verwendung
von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den Primern p38-top (SEQ ID No: 14)
und p38-bottom/+stop (SEQ ID No: 16) amplifiziert. Das PCR-Produkt
wurde mit den Restriktionsenzymen Xho1 und BamH1 verdaut und in pEGFP-C1
ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer: U55763), verdaut
mit Xho1 und BamH1. Dies stellte eine EGFP-p38-Fusion (SEQ ID No:
46 & 47) unter
der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das humane p38-Gen (GenBank Zugangsnummer: L35253) wurde
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern p38-top
(SEQ ID No: 14) und p38-bottom/–stop
(SEQ ID No: 15) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen
Xho1 und BamH1 verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto;
GenBank Zugangsnummer: U55762), verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies
stellte eine p38-EGFP-Fusion (SEQ ID No: 64 & 65) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors
her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. HEK293, in der die EGFP-p38-Sonde und/oder die p38-EGFP-Sonde
ihre zelluläre
Verteilung von vorwiegend zytoplasmatisch zu nukleär innerhalb
von Minuten als Antwort auf die Aktivierung des Signalweges mit
beispielsweise Anisomycin verändern
sollten.
-
BEISPIEL 9:
-
Sonden zur Detektion der
Jnk1-Neuverteilung.
-
Nützlich zum Überwachen
von Signalwegen, die auf verschiedene zelluläre Stresssituationen antworten,
z. B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Weges
in lebenden Zellen modulieren, oder als Gegenscreen.
-
Jnk1,
eine Serin/Threonin-Proteinkinase, ist eine Komponente eines stressinduzierten
Signalweges, die sich von der oben beschriebenen p38 unterscheidet,
obwohl sie auch durch viele Typen von zellulärem Stress aktiviert wird,
z. B. TNFalpha, Anisomycin und UV.
- a) Das humane
Jnk1-Gen (GenBank Zugangsnummer: L26318) wurde unter Verwendung
von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den Primern Jnk-top
(SEQ ID No: 17) und Jnk-bottom/+stop (SEQ ID No: 19) amplifiziert.
Das PCR-Produkt
wurde mit den Restriktionsenzymen Xho1 und BamH1 verdaut, und in
pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer: U55763),
verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies stellte eine EGFP-Jnk1-Fusion (SEQ
ID No: 44 & 45)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das humane Jnk1-Gen (GenBank Zugangsnummer: L26318) wurde
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern Jnk-top (SEQ ID No: 17) und Jnk-bottom/–stop (SEQ ID No: 18) amplifiziert.
Das PCR-Produkt
wurde mit den Restriktionsenzymen Xho1 und BamH1 verdaut, und in
pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer: U55762),
verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies stellte eine Jnk1-EGFP-Fusion (SEQ
ID No: 62 & 63)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. HEK293, in der die EGFP-Jnk1-Sonde und/oder die Jnk1-EGFP-Sonde
ihre zelluläre
Verteilung von vorherrschend zytoplasmatisch zu nukleär als Antwort
auf die Aktivierung des Signalweges mit beispielsweise Anisomycin
verändern
sollten.
-
BEISPIEL 10:
-
Sonden zur Detektion der
PKG-Neuverteilung.
-
Nützlich zum Überwachen
von Signalwegen, die Veränderungen
in zyklischen GMP Spiegeln einschließen, z. B. um Verbindungen
zu identifizieren, die die Aktivität des Weges in lebenden Zellen
modulieren.
-
PKG,
eine cGMP-abhängige
Serin/Threonin-Proteinkinase, vermittelt das Guanylyl-Cyclase/cGMP-Signal.
- a) Das humane PKG-Gen (GenBank Zugangsnummer:
Y07512) wird unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen
mit den Primern PKG-top
(SEQ ID No: 81) und PKG-bottom/+stop (SEQ ID No: 83) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen Xho1 und BamH1
verdaut, und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55763), verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies stellt eine EGFP-PKG-Fusion
(SEQ ID No: 134 & 135)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das humane PKG-Gen (GenBank Zugangsnummer: Y07512) wird unter
Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den Primern
PKG-top (SEQ ID
No: 81) und PKG-bottom/–stop
(SEQ ID No: 82) amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen
Xho1 und BamH1 verdaut, und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo
Alto; GenBank Zugangsnummer: U55762), verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies
stellt eine PKG-EGFP-Fusion (SEQ ID No: 136 & 137) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors
her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. A10, in der die EGFP-PKG-Sonde und/oder die PKG-EGFP-Sonde
ihre zelluläre
Verteilung von zytoplasmatisch zu einer, die mit zytoskeletalen
Elementen assoziiert ist, innerhalb von Minuten als Antwort auf
die Behandlung mit Mitteln verändern
sollten, die Stickstoffoxid (NO) Spiegel erhöhen.
-
BEISPIEL 11:
-
Sonden zur Detektion der
Ikappa B Kinase-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von Signalwegen, die zu NF KappaB-Aktivierung führen, z. B. um Verbindungen
zu identifizieren, die die Aktivität des Weges in lebenden Zellen
modulieren.
-
Ikappa
B-Kinase, eine Serin/Threonin-Proteinkinase, ist eine Komponente
eines Signalweges, der durch eine Vielzahl von Induktionsmitteln
einschließlich
Cytokinen, Lymphokinen, Wachstumsfaktoren und stress induziert wird.
- a) Die alpha Untereinheit des humanen IKappa
B Kinase-Gens (GenBank Zugangsnummer: AF009225) wird unter Verwendung
von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den Primern IKK-top
(SEQ ID No: 96) und IKK-bottom/+stop
(SEQ ID No: 98) amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen
EcoR1 und Acc65I verdaut und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo
Alto; GenBank Zugangsnummer: U55763), verdaut mit EcoR1 und Acc65I.
Dies stellt eine EGFP-IKappa B-Kinase-Fusion (SEQ ID No: 120 & 121) unter der
Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Die alpha Untereinheit des humanen IKappa B Kinase-Gens (GenBank
Zugangsnummer: AF009225) wird unter Verwendung von PCR entsprechend
Standardprotokollen mit den Primern IKK-top (SEQ ID No: 96) und
IKK-bottom/–stop
(SEQ ID No: 97) amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen EcoR1
und Acc65I verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto;
GenBank Zugangsnummer: U55762), verdaut mit EcoR1 und Acc65I. Dies
stellt eine IKappa B-Kinase-EGFP-Fusion (SEQ ID No: 122 & 123) unter der
Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. Jurkat, in der die EGFP-IKappa B-Kinase-Sonde und/oder die
IKappa B-Kinase-EGFP-Sonde
eine mehr zytoplasmatische Verteilung innerhalb von Sekunden nach
Stimulation mit z. B. TNFalpha erreichen sollte.
-
BEISPIEL 12:
-
Sonden zur Detektion der
CDK2-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von Signalwegen des Zellzyklus, z. B. um Verbindungen zu identifizieren, die
die Aktivität
des Weges in lebenden Zellen modulieren.
-
CDK2,
eine Cyklin-abhängige
Serin/Threonin-Proteinkinase, ist eine Komponente des Signalsystems, das
den Zellzyklus reguliert.
- a) Das humane CDK2-Gen
(GenBank Zugangsnummer: X61622) wird unter Verwendung von PCR entsprechend
Standardprotokollen mit den Primern CDK2-top (SEQ ID No: 102) und CDK2-bottom/+stop (SEQ
ID No: 104) amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen
Xho1 und BamH1 verdaut und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo Alto;
GenBank Zugangsnummer: U55763), verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies
stellt eine EGFP-CDK2-Fusion (SEQ ID No: 114 & 115) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors
her.
- b) Das humane CDK2-Gen (GenBank Zugangsnummer: X61622) wird
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern CDK2-top
(SEQ ID No: 102) und CDK2-bottom/–stop (SEQ ID No: 103) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen Xho1 und BamH1
verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55762), verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies stellt eine CDK2-EGFP-Fusion
(SEQ ID No: 112 & 113)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. HEK293, in der die EGFP-CDK2-Sonde und/oder die CDK2-EGFP-Sonde
ihre zelluläre
Verteilung von zytoplasmatisch in Kontakt zu inhibierten Zellen
nukleärer
Lokalisation als Antwort auf die Aktivierung mit einer Anzahl von
Wachstumsfaktoren verändern
sollten, z. B. IGF.
-
BEISPIEL 13:
-
Sonden zur Detektion der
Grk5-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von Signalwegen, die die Desensitisierung von G-Proteinen gekoppelten Rezeptoren einschließen, z.
B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Weges
in lebenden Zellen modulieren.
-
Grk5,
eine G-Protein gekoppelte Rezeptor-Kinase, ist eine Komponente von
Signalwegen, die Membran-gebundene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
einschließen.
- a) Das humane Grk5-Gen (GenBank Zugangsnummer:
L15388) wird unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen
mit den Primern Grk5-top
(SEQ ID No: 27) und Grk5-bottom/+stop (SEQ ID No: 29) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen EcoR1 und BamH1
verdaut und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55763), verdaut mit EcoR1 und BamH1. Dies stellt eine EGFP-Grk5-Fusion
(SEQ ID No: 42 & 43)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das humane Grk5-Gen (GenBank Zugangsnummer: L15388) wird
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern Grk5-top
(SEQ ID No: 27) und Grk5-bottom/–stop (SEQ ID No: 28) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen EcoR1 und BamH1
verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55762), verdaut mit EcoR1 und BamH1. Dies stellt eine Grk5-EGFP-Fusion
(SEQ ID No: 60 & 61)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. HEK293, die einen Raten Dopamin D1A Rezeptor exprimiert, in
der die EGFP- Grk5-Sonde
und/oder die Grk5-EGFP-Sonde ihre zelluläre Verteilung von vorwiegend
zytoplasmatisch zu peripher als Antwort auf die Aktivierung des
Signalweges mit beispielsweise Dopamin verändern sollten.
-
BEISPIEL 14:
-
Sonden zur Detektion der
Zap70-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von Signalwegen, die den T-Zell-Rezeptor einschließen, z.
B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Weges
in lebenden Zellen modulieren.
-
Zap70,
eine Tyrosinkinase, ist eine Komponente eines Signalweges, der beispielsweise
in der T-Zell-Differenzierung aktiv ist.
- a)
Das humane Zap70-Gen (GenBank Zugangsnummer: L05148) wird unter
Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den Primern
Zap70-top (SEQ ID
No: 105) und Zap70-bottom/+stop (SEQ ID No: 107) amplifiziert. Das
PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen EcoR1 und BamH1 verdaut
und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55763), verdaut mit EcoR1 und BamH1. Dies stellt eine EGFP-Zap70-Fusion
(SEQ ID No: 108 & 109)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das humane Zap70-Gen (GenBank Zugangsnummer: L05148) wird
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern Zap70-top
(SEQ ID No: 105) und Zap70-bottom/–stop (SEQ ID No: 106) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen EcoR1 und BamH1
verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55762), verdaut mit EcoR1 und BamH1. Dies stellt eine Zap70-EGFP-Fusion
(SEQ ID No: 110 & 111)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. Jurkat, in der die EGFP-Zap70-Sonde und/oder die Zap70-EGFP-Sonde
ihre zelluläre
Verteilung von zytoplasmatisch zu Membran-assoziiert innerhalb von
Sekunden als Antwort auf die Aktivierung des T-Zell-Rezeptor-Signalweges
mit beispielsweise Antikörpern
gegen CD3epsilon verändern
sollten.
-
BEISPIEL 15:
-
Sonden zur Detektion der
p85-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von Signalwegen, die PI-3 Kinase einschließen, z. B. um Verbindungen
zu identifizieren, die die Aktivität des Weges in lebenden Zellen
modulieren.
-
p85alpha
ist die regulatorische Untereinheit der PI-3-Kinase, die eine Komponente
vieler Wege ist, die Membran-gebundene Tyrosin Kinase-Rezeptoren
und G-Protein gekoppelte Rezeptoren einschließen.
- a)
Das humane p85alpha-Gen (GenBank Zugangsnummer: M61906) wurde unter
Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den Primern
p85-top-C (SEQ ID No: 22) und p85-bottom/+stop (SEQ ID No: 23) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Bgl2 und BamH1
verdaut und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55763), verdaut mit Bgl2 und BamH1. Dies stellte eine EGFP-p85alpha-Fusion
(SEQ ID No: 48 & 49)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das humane p85alpha-Gen (GenBank Zugangsnummer: M61906) wurde
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern p85-top-N (SEQ ID No: 20) und p38-bottom/–stop (SEQ ID
No: 21) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen
EcoR1 und BamH1 verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo
Alto; GenBank Zugangsnummer: U55762), verdaut mit EcoR1 und BamH1.
Dies stellte eine p85alpha-EGFP-Fusion
(SEQ ID No: 66 & 67)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. CHO exprimierend den humanen Insulinrezeptor, in der die EGFP-p85-Sonde
und/oder die p85-EGFP-Sonde ihre zelluläre Verteilung von zytoplasmatisch
zu Membran-assoziiert innerhalb von Minuten als Antwort auf die
Aktivierung des Rezeptors mit Insulin verändern können.
-
BEISPIEL 16:
-
Sonden zur Detektion der
Protein-Tyrosin-Phosphatase-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von Signalwegen, die Tyrusinkinasen einschließen, z. B. um Verbindungen zu
identifizieren, die die Aktivität
des Weges in lebenden Zellen modulieren.
-
Protein-Tyrosin-Phosphatase1C,
eine Tyrosin-spezifische Phosphatase, ist eine inhibitorische Komponente
in Signalwegen, die z. B. einige Wachstumsfaktoren einschließen.
- a) Das humane Protein-Tyrosin-Phosphatase1C-Gen
(GenBank Zugangsnummer: X62055) wird unter Verwendung von PCR entsprechend
Standardprotokollen mit den Primern PTP-top (SEQ ID No: 99) und PTP-bottom/+stop
(SEQ ID No: 101) amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen
Xho1 und EcoR1 verdaut und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo Alto;
GenBank Zugangsnummer: U55763), verdaut mit Xho1 und EcoR1. Dies
stellt eine EGFP-PTP-Fusion
(SEQ ID No: 116 & 117)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das humane Protein-Tyrosin-Phosphatase1C-Gen (GenBank Zugangsnummer:
X62055) wird unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen
mit den Primern PTP-top (SEQ ID No: 99) und PTP-bottom/–stop (SEQ
ID No: 100) amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen
Xho1 und EcoR1 verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto;
GenBank Zugangsnummer: U5S762), verdaut mit Xho1 und EcoR1. Dies
stellte eine PTP-EGFP-Fusion
(SEQ ID No: 118 & 119)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert;
z. B. MCF-7, in der die EGFP-PTP-Sonde und/oder die PTP-EGFP-Sonde
ihre zelluläre
Verteilung vom Zytoplasma zur Plasmamembran innerhalb von Minuten
als Antwort auf die Aktivierung des Wachstum-inhibierenden Signalweges
mit beispielsweise Somatostatin verändern sollten.
-
BEISPIEL 17:
-
Sonden zur Detektion der
Smad4-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von Signalwegen, die die meisten Mitglieder der Familie des transformierenden
Wachstumsfaktors beta (transforming growth factor beta) einschließen, z.
B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Weges
in lebenden Zellen modulieren.
-
Smad4,
ein Signalvermittler, ist eine übliche
Komponente von Signalwegen, die durch verschiedene Mitglieder der
TGFbeta-Familie von Cytokinen induziert werden.
- a)
Das humane Smad4-Gen (GenBank Zugangsnummer: U44378) wurde unter
Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den Primern
Smad4-top und Smad4-bottom/+stop (SEQ ID No: 35) amplifiziert. Das
PCR- Produkt wurde
mit den Restriktionsenzymen EcoR1 und BamH1 verdaut und in pEGFP-C1
ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer: U55763), verdaut
mit EcoR1 und BamH1. Dies stellte eine EGFP-Smad4-Fusion (SEQ ID
No: 52 & 53)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das humane Smad4-Gen (GenBank Zugangsnummer: U44378) wurde
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern Smad4-top (SEQ ID No: 33) und Smad4-bottom/–stop (SEQ
ID No: 34) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen
EcoR1 und BamH1 verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo
Alto; GenBank Zugangsnummer: U55762), verdaut mit EcoR1 und BamH1.
Dies stellte eine Smad4-EGFP-Fusion
(SEQ ID No: 76 & 77)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine Zelllinie transfiziert, z.
B. HEK293, in der die EGFP-Smad4-Sonde und/oder die Smad4-EGFP-Sonde
ihre zelluläre
Verteilung von zytoplasmatisch zu nukleär innerhalb von Minuten als
Antwort auf die Aktivierung des Signalweges mit beispielsweise TGFbeta
verändern
sollten.
-
BEISPIEL 18:
-
Sonden zur Detektion der
Stat5-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von Signalwegen, die die Aktivierung von Tyrosinkinsen der Jak-Familie einschließen, z.
B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Weges
in lebenden Zellen modulieren.
-
Stat5,
Signalvermittler und Transkriptionsaktivator, ist eine Komponente
von Signalwegen, die z. B. durch viele Cytokine und Wachstumsfaktoren
induziert werden.
- a) Das humane Stat5-Gen (GenBank
Zugangsnummer: L41142) wurde unter Verwendung von PCR entsprechend
Standardprotokollen mit den Primern Stat5-top (SEQ ID No: 30) und Stat-bottom/+stop
(SEQ ID No: 32) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen
Bgl2 und Acc65I verdaut und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo
Alto; GenBank Zugangsnummer: U55763), verdaut mit Bgl2 und Acc65I. Dies
stellte eine EGFP-Stat5-Fusion (SEQ ID No: 54 & 55) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors
her.
- b) Das humane Stat5-Gen (GenBank Zugangsnummer: L41142) wurde
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern Stat5-top
(SEQ ID No: 30) und Stat5-bottom/–stop (SEQ ID No: 31) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Bgl2 und Acc65I
verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55762), verdaut mit Bgl2 und Acc65I. Dies stellte eine Stat5-EGFP-Fusion
(SEQ ID No: 78 & 79)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. MIN6, in der die EGFP-Stat5-Sonde und/oder die Stat5-EGFP-Sonde
ihre zelluläre
Verteilung von zytoplasmatisch zu nukleär innerhalb von Minuten als
Antwort auf die Aktivierung des Signalweges mit beispielsweise Prolaktin
verändern sollten.
-
BEISPIEL 19:
-
Sonden zur Detektion der
NFAT-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von Signalwegen, die die Aktivierung von NFAT einschließen, z.
B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Weges
in lebenden Zellen modulieren.
-
NFAT,
ein Transkriptionsaktivator, ist eine Komponente von Signalwegen,
die in z. B. Immunantworten involviert sind.
- a)
Das humane NFAT1-Gen (GenBank Zugangsnummer: U43342) wird unter
Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den Primern
NFAT-top (SEQ ID No: 84) und NFAT-bottom/+stop (SEQ ID No: 86) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen Xho1 und EcoR1
verdaut und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55763), verdaut mit Xho1 und EcoR1. Dies stellt eine EGFP-NFAT-Fusion
(SEQ ID No: 130 & 131)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das humane NFAT-Gen (GenBank Zugangsnummer: U43342) wird
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern NFAT-top
(SEQ ID No: 84) und NFAT-bottom/–stop (SEQ ID No: 85) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen Xho1 und EcoR1
verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55762), verdaut mit Xho1 und EcoR1. Dies stellt eine NFAT-EGFP-Fusion
(SEQ ID No: 132 & 133)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. Jurkat, in der die EGFP-NFAT-Sonde und/oder die NFAT-EGFP-Sonde
ihre zelluläre
Verteilung von zytoplasmatisch zu nukleär innerhalb von Minuten als
Antwort auf die Aktivierung des Signalweges mit beispielsweise Antikörpern gegen CD3epsilon
verändern
sollten.
-
BEISPIEL 20:
-
Sonden zur Detektion der
NFkappaB-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von Signalwegen, die zur Aktivierung von NFkappaB führen, z.
B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Weges
in lebenden Zellen modulieren.
-
NFkappaB,
ein Transkriptionsaktivator, ist eine Komponente von Signalwegen,
die auf eine Vielzahl von Induktoren einschließlich Cytokinen, Lymphokinen
und einigen immunsuppressiven Mitteln antworten.
- a)
Das Gen für
die humane NFkappaB p65-Untereinheit (GenBank Zugangsnummer: M62399)
wird unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit
den Primern NFkappaB-top (SEQ ID No: 87) und NFkappaB-bottom/+stop (SEQ
ID No: 89) amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen
Xho1 und BamH1 verdaut und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo Alto;
GenBank Zugangsnummer: U55763), verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies
stellt eine EGFP-NfkappaB-Fusion (SEQ ID No: 142 & 143) unter der
Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das Gen für
die humane NFkappaB p65-Untereinheit (GenBank Zugangsnummer: M62399)
wird unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit
den Primern NFkappaB-top (SEQ ID No: 87) und NFkappaB-bottom/–stop (SEQ
ID No: 88) amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen
Xho1 und BamH1 verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto;
GenBank Zugangsnummer: U55762), verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies
stellt eine NFkappaB-EGFP-Fusion (SEQ ID No: 140 & 141) unter der
Kontrolle eines CMV-Promotors her.
-
Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. Jurkat, in der die EGFP-NfkappaB-Sonde und/oder die NFkappaB-EGFP-Sonde
ihre zelluläre
Verteilung von zytoplasmatisch zu nukleär als Antwort auf die Aktivierung
des Signalweges mit beispielsweise TNFalpha verändern sollten.
-
BEISPIEL 21:
-
Sonde zur Detektion der
RhoA-Neuverteilung.
-
Nützlich zur Überwachung
von RhoA einschließenden
Signalwegen, z. B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Weges
in lebenden Zellen modulieren.
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RhoA,
eine kleine GTPase, ist eine Komponente von vielen Signalwegen,
z. B. LPA induzierte Neuanordnungen des Cytoskelettes.
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Das
humane RhoA-Gen (GenBank Zugangsnummer: L25080) wurde unter Verwendung
von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den Primern RhoA-top
(SEQ ID No: 92) und RhoA-bottom/+stop (SEQ ID No: 93) amplifiziert.
Das PCR-Produkt
wurde mit den Restriktionsenzymen Hind3 und BamH1 verdaut und in pEGFP-C1
ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer: U55763), verdaut
mit Hind3 und BamH1. Dies stellte eine EGFP-RhoA-Fusion (SEQ ID
No: 126 & 127)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
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Das
resultierende Plasmid wird in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. Swiss 3T3, in der die EGFP-RhoA-Sonde ihre zelluläre Verteilung
von einer einigermaßen
homogenen zu einer peripheren Verteilung innerhalb von Minuten nach
der Aktivierung des Signalweges mit beispielsweise LPA verändern sollte.
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BEISPIEL 22:
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Sonden zur Detektion der
PKB-Neuverteilung.
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Nützlich zur Überwachung
von PKB einschließenden
Signalwegen, z. B. um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität des Weges
in lebenden Zellen modulieren.
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PKB,
eine Serin/Threonin-Kinase, ist eine Komponente in verschiedenen
Signalwegen, von denen viele durch Wachstumsfaktoren aktiviert werden.
- a) Das humane PKB-Gen (GenBank Zugangsnummer:
M63167) wird unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen
mit den Primern PKB-top
(SEQ ID No: 36) und PKB-bottom/+stop (SEQ ID No: 80) amplifiziert.
Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen Xho1 und BamH1
verdaut und in pEGFP-C1 ligiert (Clontech, Palo Alto; GenBank Zugangsnummer:
U55763), verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies stellte eine EGFP-PKB-Fusion
(SEQ ID No: 138 & 139)
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors her.
- b) Das humane PKB-Gen (GenBank Zugangsnummer: M63167) wurde
unter Verwendung von PCR entsprechend Standardprotokollen mit den
Primern PKB-top
(SEQ ID No: 36) und PKB-bottom/–stop
(SEQ ID No: 37) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen
Xho1 und BamH1 verdaut und in pEGFP-N1 ligiert (Clontech, Palo Alto;
GenBank Zugangsnummer: U55762), verdaut mit Xho1 und BamH1. Dies
stellte eine PKB-EGFP-Fusion (SEQ ID No: 70 & 71) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors
her.
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Die
resultierenden Plasmide werden in eine geeignete Zelllinie transfiziert,
z. B. CHO Zellen, die den humanen Insulinrezeptor exprimieren, in
der die EGFP-PKB-Sonde
und/oder die PKB-EGFP-Sonde zwischen zytoplasmatischen und Membran-Orten
während
des Aktivierungs-Deaktivierungs-Prozesses nach der Zugabe von Insulin
zykliert. Der Übergang
sollte innerhalb von Minuten auftreten.
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REFERENZEN
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