DE60002562T2

DE60002562T2 - Ein system für zellbasierte reihenuntersuchungen

Info

Publication number: DE60002562T2
Application number: DE60002562T
Authority: DE
Inventors: A. Kenneth GIULIANO; Ravi Kapur
Original assignee: Cellomics Inc
Current assignee: Cellomics Inc
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 2000-02-25
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2020-02-26
Also published as: EP1155304B1; DE60002562D1; CA2362117C; CA2362117A1; WO2000050872A3; EP1155304A2; WO2000050872A9; EP1314980A3; ATE239907T1; AU3605600A; JP3576491B2; IL144797A0; WO2000050872A2; EP1314980A2; JP2003526772A; EP1314980B1

Description

Querverweis
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorkläufigen US Anmeldungen für die Patentseriennummern 60/122,152 (26. Februar 1999), 60/123,399 (8. März 1999), 09/352,141, (12. Juli 1999), 601151,797 (31. August 1999), 60/168,408 (1. Dezember 1999); und ist eine teilweise Fortführung von 09/430,656 (29. Oktober 1999); 09/398,965, eingereicht am 17. September 1999, die eine teilweise Fortführung der Seriennummer 09/031,271, eingereicht am 27. Februar 1998, ist, die eine teilweise Fortführung der US-Anmeldung Seriennummer 08/810983, eingereicht am 27. Februar 1997, ist.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet der fluoreszenzbasierten zell- und molekularbiochemischen Assays für Arzneistofferkennung.
Hintergrund der Erfindung
Arzneistofferkennung in ihrer gegenwärtigen Form ist ein langer Mehrschrittprozess, der die Identifizierung spezifischer Krankheitsziele ("Targets"), die Entwicklung eines Assays, der auf einem spezifischen Ziel beruht, die Validierung des Assays, die Optimierung und Automatisierung des Assays zur Erzeugung eines Screens, das Screenen von Verbindungsbibliotheken mit dem Assay in hohem Durchsatz, um "Treffer" zu identifizieren, die Validierung der Treffer und die Optimierung der Trefferverbindung beinhaltet. Das Ergebnis (Output) dieses Vorgangs ist eine Leitverbindung, die in präklinische und, wenn sie bestätigt wird, eventuell in klinische Versuche geht. Bei diesem Vorgang unterscheidet sich die Phase des Screenings von den Phasen der Assayentwicklung und beinhaltet das Testen der Wirksamkeit der Verbindung in lebenden biologischen Systemen.
Historisch gesehen ist die Arzneistofferkennung ein langsamer und teurer Prozess, der pro erzeugtem Arzneistoff zahlreiche Jahre und viele hundert Millionen Dollar umfasst. Entwick lungen in den Bereichen der "Genomics-Techniken" und des Screening mit hohem Durchsatz haben in den Bereichen der Identifizierung von Zielen und dem Volumen an gescreenten Verbindungen zu gesteigerter Kapazität und Wirksamkeit geführt. Signifikante Fortschritte in der automatisierten DNA- Sequenzierung, der Anwendung der PCR und der positionellen Klonierung, der Hybridisierungstest und die Bioinformatik haben die Anzahl von Genen (und Genfragmenten) gesteigert, die für potentielle Arzneistoffscreeningziele kodieren. Jedoch bleibt das Basisschema für das Arzneistoffscreening das gleiche.
Die Verwendung bestehender Verfahren und Protokolle zur Validierung genomischer Ziele als Angriffspunkte für die therapeutische Intervention wurden aufgrund der langsamen manuellen Verfahren, die zum Beispiel bei funktionellen in vivo Modellen, der funktionellen Analyse rekombinanter Proteine und der Expression von Kandidatengenen in stabilen Zelllinien verwendet werden, zu einer Engstelle. Primäre DNA-Sequenzen, die durch automatisiertes Sequenzieren erhalten wurden, ermöglichen keine Identifizierung der Genfunktion, können jedoch Informationen über allgemeine "Motive" und spezifische Genhomologie bei Vergleich mit bekannten Sequenzdatenbanken zur Verfügung stellen. Genomische Verfahren, wie Substraktionshybridisierung und RADE (rapid amplification of differential expression) können zur Identifizierung von Genen verwendet werden, die in einem Modell eines Krankheitszustandes auf- und abreguliert werden. Jedoch laufen die Identifizierung und Validierung immer noch auf dem gleichen Wege ab. Einige Proteomikverfahren verwenden die Identifizierung von Proteinen (globale Expressions-Arrays, 2D-Elektrophorese, kombinatorische Bibliotheken) in Kombination mit reverser Genetik, um Kandidatengene von Interesse zu identifizieren. Solche möglichen "krankheitsassoziierten Sequenzen" oder "DAS", die als intakte cDNA isoliert werden, stellen gegenüber diesen Verfahren einen großen Vorteil dar, aber sie werden hundertfach identifiziert, ohne irgendeine Information hinsichtlich der Art, der Aktivität und der Verteilung des codierten Proteins bereitzustellen. Die Auswahl einer Teilmenge von DAS als Arzneistoffscreeningziele ist "zufällig", und somit ohne funktionelle Daten zur Bereitstellung einer mechanistischen Verbindung mit der Krankheit extrem ineffizient. Es ist daher notwendig, neue Technologien zum schnellen Screenen von DAS zur Etablierung biologischer Funktionen bereitzustellen, wodurch die Validierung des Ziels und die Kandidatenoptimierung bei Arzneistofferkennung verbessert wird.
Es gibt drei Hauptrichtungen zur Verbesserung der Produktivität der frühen Phase der Arzneistofferkennung. Zunächst benötigt man Werkzeuge, die eine gesteigerte Fähigkeit zur Handhabung der Informationen bereitstellen. Die Bioinformatik ist mit der schnellen Entwicklung von DNA-Sequenzierungssystemen und der Evolution von genomischen Datenbanken aufgeblüht. "Genomic" beginnt, eine wichtige Rolle in der Identifizierung von poten tiellen neuen Zielen zu spielen. "Proteomic" wurde unerlässlich, um die Struktur und Funktion von Proteinzielen in Zusammenhang zu bringen, um Arzneistoffwechselwirkungen vorherzusagen. Jedoch ist die nächste Stufe der biologischen Komplexität die Zelle. Daher besteht ein Bedarf, multidimensionale Informationen aus Zellen zu erhalten, zu verwalten und zu suchen. Weiterhin benötigt man Werkzeuge mit hohem Durchsatz. Wie sich bereits bei der DNA-Sequenzierung und bei dem primären Screening mit hohem Durchsatz gezeigt hat, ist die Automatisierung ein Schlüssel zur Verbesserung der Produktivität. Die vorliegende Erfindung stellt automatisierte Systeme zur Verfügung, die Informationen über multiple Parameter aus Zellen gewinnen, die den Ansprüchen für Werkzeuge mit höherem Durchsatz gerecht werden. Die vorliegende Erfindung stellt auch Lösungen zur Miniaturisierung von Verfahren bereit, wodurch bei Verringerung der Volumen an Reagenzien und Testverbindungen, die in jedem Test benötigt werden, ein gesteigerter Durchsatz ermöglicht wird.
Radioaktivität war die hauptsächliche Anzeige ("read out") in frühen Arzneistofterkennungstests. Jedoch hat der Bedarf an mehr Information, höherem Durchsatz und Miniaturisierung einen Schub Richtung Fluoreszenznachweis verursacht. Fluoreszenzbasierte Reagenzien können zu leistungsfähigeren Tests mit multiplen Parametern führen, die einen höheren Durchsatz und höheren Informationsgehalt aufweisen und geringere Volumina an Reagenzien und Testverbindung erfordern. Fluoreszenz ist ebenfalls sicherer und billiger als auf Radioaktivität basierende Verfahren.
Das Screening von Zellen, die mit Farbstoffen und fluoreszierenden Reagenzien behandelt wurden, ist im Stand der Technik gut bekannt. Es gibt beachtlich viel Literatur bezüglich der genetischen Veränderung von Zellen zur Produktion von Fluoreszenzproteinen, wie modifiziertes grünfluoreszierendes Protein (GFP) als Reportermolekül. Einige Eigenschaften von Wildtyp-GFP sind von Morise et al. (Biochemistry 13 (1974), S. 2656–2662) und Ward et al. (Photochem. Photobiol. 31 (1980), S. 611–615) offenbart. Das GFP der Qualle Aequorea victoria besitzt ein Anregungsmaximum bei 395 nm und ein Emissionsmaximum bei 510 nm und benötigt keinen exogenen Faktor für die Fluoreszenzaktivität. Verwendungen für GFP, die in der Literatur offenbart sind, sind weit verbreitet und beinhalten die Untersuchung von Genexpression und Proteinlokalisation (Chalfie et al., Science 263 (1994), S. 12501–12504)), als ein Werkzeug zur Visualisierung von subzellulären Organellen (Rizzuto et al., Curr. Biology 5 (1995), S. 635–642)), Visualisierung von Proteintransport entlang des sekretorischen Signalwegs (Kaether und Gerdes, FEBS Letters 369 (1995), S. 267–271)), Expression in Pflanzenzellen (Hu und Cheng, FEBS Letters 369 (1995), S. 331–334)) und Drosophila-Embryonen (Davis et al., Dev. Biology 170 (1995), S. 726–729)), und ein Reportermolekül fusioniert an ein anderes Protein von Interesse (US-Patent 5,491,084). In ähnlicher Weise bezieht sich die WO96/23898 auf Verfahren zum Nachweis von biologisch aktiven Substanzen, die die intrazellulären Vorgänge beeinflussen, durch Verwendung eines GFP-Konstruktes, das eine Proteinkinaseaktivierungsstelle besitzt. Dieses Patent und alle Patente, die in dieser Anmeldung referiert sind, sind durch Referenz in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
Zahlreiche Referenzen beziehen sich auf GFP-Proteine in biologischen Systemen. Zum Beispiel beschreibt die WO96/09598 ein System zur Isolierung von Zellen von Interesse, unter Verwendung der Expression eines GFP-ähnlichen Proteins. Die WO96/27675 beschreibt die Expression von GFP in Pflanzen. Die WO95/21191 beschreibt die Expression von modifiziertem GFP-Protein in transformierten Organismen zum Nachweis von Mutagenese. Die US-Patente 5,401,629 und 5,436,128 beschreiben Tests und Zusammensetzungen zum Nachweis und zur Auswertung der intrazellulären Transduktion eines extrazellulären Signals unter Verwendung rekombinanter Zellen, die Zelloberflächenrezeptoren exprimieren und Reportergenkonstrukte enthalten, die transkriptionelle regulatorische Elemente beinhalten, die auf die Aktivität von Zelloberflächenrezeptoren reagieren.
Die Durchführung eines Screens von vielen tausenden von Verbindungen erfordert die parallele Handhabung und Verarbeitung von vielen Verbindungen und Assayreagenzien. Standard-Hochdurchsatzscreens ("HTS") verwenden Gemische von Verbindungen und biologische Reagenzien zusammen mit einer Indikatorverbindung, die in Array von Vertiefungen in Standardmikrotiterplatten mit 96 oder 384 Vertiefungen beladen sind. Das aus jeder Vertiefung gemessene Signal, entweder Fluoreszenzemission, optische Dichte oder Radioaktivität, integriert das Signal des vollständigen Materials in der Vertiefung, wodurch man einen Gesamtpopulationsdurchschnitt aller Moleküle in der Vertiefung erhält.
Science Applications International Corporation (SAIC) 130 Fifth Avenue, Seattle, WA. 98109) beschreibt ein Bildgebungsplattenlesegerät. Dieses System verwendet eine CCD-Kamera, um ein Bild des gesamten Bereichs einer Platte mit 96 Vertiefungen anzufertigen. Das Bild wird analysiert, um die Gesamtfluoreszenz pro Vertiefung für das gesamte Material in der Vertiefung zu berechnen.
Molecular Devices, Inc. (Sunnyvale, CA) beschreibt ein System (FLIPR), das Laserrasterbeleuchtung mit geringem Winkel ("low angle lasen scanning illumination") und eine Maske zur selektiven Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich von etwa 200 Micron vom Boden der Vertiefungen in Standard 96-Vertiefungsplatten zur Verminderung des Hintergrunds bei der Sichtbarmachung von Einzelzellschichten verwendet. Dieses System verwendet eine CCD-Kamera, um ein Bild des gesamten Bereichs des Bodens der Platte anzufertigen. Obwohl dieses System Signale misst, die von einer Einzelzellschicht am Boden der Vertiefung abstammen, wird das gemessene Signal über den Bereich der Vertiefungen gemittelt und wird daher noch als Messung der Durchschnittsantwort einer Population von Zellen angesehen. Das Bild wird analysiert, um die Gesamtfluoreszenz pro Vertiefung für zellbasierte Tests zu berechnen. Vorrichtungen zum Flüssigkeitstransport wurden ebenfalls in zellbasierte Screeningsysteme aufgenommen, wie das FLIPR-System, um eine Antwort zu initiieren, die dann mit einem Makrobildgebungssystem als Durchschnittsreaktion einer gesamten Vertiefungspopulation beobachtet wird.
Im Gegensatz zu Screens mit hohem Durchsatz wurden verschiedene Screens mit hohem Informationsgehalt ("HCS") entwickelt, um dem Bedürfnis nach detaillierter Information über die zeitlich räumliche Dynamik von Zellbestandteilen und -vorgängen entgegenzukommen. Screens mit hohem Informationsgehalt automatisieren die Extraktion von Multicolor-Fluoreszenzinformation, die von spezifischen auf Fluoreszenz basierenden Reagenzien abgeleitet ist, die in Zellen aufgenommen wurden (Giuliano und Taylor (1995), Curr. Op. Cell Biol. 7: 4; Giuliano et al. (1995) Ann. Rev. Biomol. Struct. 24: 405). Die Zellen werden mit einem optischen System analysiert, das sowohl räumliche als auch zeitliche Dynamik messen kann (Farkas et al. (1993) Ann. Rev. Physiol. 55: 785; Giuliano et al. (1990) in Optical Microscopy for Biology. B. Herman und K. Jacobson (Hrsg.), S. 543–557, Wiley-Liss, New York; Hahn et al (1992) Nature 359: 736; Waggoner et al. (1996) Hum. Pathol. 27: 494). Das Konzept besteht darin, jede Zelle als eine "Vertiefung" zu behandeln, die auf den Aktivitäten der markierten Bestandteile räumliche und zeitliche Information besitzt.
Die Arten an biochemischer und molekularer Information, die jetzt über auf Fluoreszenz basierenden Reagenzien zugänglich sind, die auf Zellen angewendet werden, beinhalten Ionenkonzentrationen, Membranpotential, spezifische Translokationen, Enzymaktivitäten, Genexpression, wie auch die Anwesenheit, Menge und Muster von Metaboliten, Proteinen, Lipiden, Kohlehydraten und Nukleinsäuresequenzen (DeBiasio et al., (1996) Mol. Biol. Cell. 7: 1259; Giuliano et al., (1995) Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24: 405; Heim and Tsien, (1996) Curr. Biol. 6: 178).
Screens mit hohem Informationsgehalt können entweder auf fixierten Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, biologischen Liganden und/oder Nukleinsäurehybridisierungssonden oder mit lebenden Zellen unter Verwendung von Multicolor-Fluoreszenzindikatoren und "Biosensoren" durchgeführt werden. Die Wahl von Screens fixierter oder lebender Zellen hängt von dem spezifisch benötigten zellbasierten Assay ab.
Assays mit fixierten Zellen sind die einfachsten, da ein Array von anfänglich lebenden Zellen in einem Mikrotiterplattenformat mit verschiedenen zu testenden Verbindungen und Dosierungen behandelt werden kann, dann können die Zellen fixiert, mit spezifischen Reagenzien markiert und gemessen werden. Keine Umgebungskontrolle der Zellen ist nach Fixierung erforderlich. Räumliche Information wird erhalten, aber nur zu einem Zeitpunkt. Die Verfügbarkeit tausender Antikörper, Liganden und Nukleinsäurehybridisierungssonden, die auf die Zellen angewendet werden können, macht dies zu einem attraktiven Ansatz für viele Arten von zellbasierten Screens. Die Fixierungs- und Markierungsschritte können automatisiert werden, wodurch eine wirksame Verarbeitung der Assays ermöglicht wird.
Tests mit lebenden Zellen sind anspruchsvoller und aussagekräftiger, da ein Array von lebenden Zellen, der die gewünschten Reagenzien enthält, sowohl über die Zeit als auch über den Raum gescreent werden kann. Während der Messung ist eine Umgebungskontrolle der Zellen (Temperatur, Feuchtigkeit und Kohlendioxid) erforderlich, da die physiologische Gesundheit der Zellen für multiple Fluoreszenzmessungen über die Zeit aufrechterhalten werden muss. Es gibt eine wachsende Liste fluoreszierender physiologischer Indikatoren und "Biosensoren", die Veränderungen biochemischer und molekularer Aktivitäten innerhalb von Zellen anzeigen (Giuliano et al., (1995) Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24: 405; Hahn et al., (1993) in Fluorescent and Luminescent Probes forr Biological Activity. W. T. Mason , (Hrsg.), S. 349–359, Academic Press, San Diego).
Die Zugänglichkeit und Verwendung von fluoreszenzbasierenden Reagenzien hat dazu beigetragen, die Entwicklung von Screens mit hohem Informationsgehalt sowohl in fixierten als auch in lebenden Zellen voranzutreiben. Fortschritte bei der Instrumentalisierung zur automatischen Extraktion von Multicolorinformation mit hohem Gehalt hat es kürzlich möglich gemacht, HCS zu einem automatisierten Werkzeug zu machen. Ein Artikel von Tailor et al. (American Scientist 80 (1992), S. 322–335) beschreibt viele von diesen Verfahren und ihrer Anwendung. Proffitt et al. (Cytometry 24: 204–213 (1996)) beschreibt ein halbautomatisiertes Fluoreszenzdigitalbildgebungssystem zur Quantifizierung relativer Zellzahlen in situ in einer Vielzahl von Gewebekulturplattenformaten, insbesondere Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen. Das System besteht aus einem Epifluoreszenzinversionsmikroskop mit einer elektrisch angetriebenen Bühne, einer Videokamera, einem Bildverstärker und einem Mikrocomputer mit einem PC-Vision-Digitalisierer. Turbopascalsoftware kontrolliert die Bühne und scannt die Platte, wobei pro Vertiefung multiple Bilder aufgenommen werden. Die Software berechnet die Gesamtfluoreszenz pro Vertiefung, stellt die tägliche Kalibrierung bereit und lässt sich für eine Vielzahl von Gewebekulturplattenformaten leicht konFigurieren. Die Schwellenwertbe stimmung von digitalen Bildern und Reagenzien, die nur fluoreszieren, wenn sie von lebenden Zellen aufgenommen werden, werden dazu verwendet, Hintergrundfluoreszenz ohne die Entfernung von überschüssigem fluoreszierendem Reagens zu vermindern.
Rasterkonfokale Mikroskopbildgebung ("scanning confocal microscope imaging") (Go et al., (1997) Analytical Biochemistry 247: 210–215; Goldman et al., (1995) Experimental Cell Research 221: 311–319) und Multiphoton-Mikroskop-Bildgebung (Denk et al., (1990) Science 248: 73; Gratton et al., (1994) Proc. of the Microscopical Society of America, S. 154–155) sind auch gut etablierte Verfahren zur Erlangung von hochauflösenden Bildern von Mikroskopproben. Der prinzipielle Vorteil dieser optischen Systeme besteht in der sehr schmalen Fokustiefe, die es ermöglicht, dass Eigenschaften von beschränktem axialem Ausmaß gegenüber dem Hintergrund aufgelöst werden. Zum Beispiel ist es möglich, interne zytoplasmatische Eigenschaften adhärenter Zellen von den Eigenschaften auf der Zellobertläche zu trennen. Da Raster-Multiphoton-Bildgebung ("scanning multiphoton imaging") Lasersysteme mit sehr kurzer Pulsdauer erfordert, um den erforderlichen hohen Photonenfluss zur erreichen, kann in diesen Systemen auch die Lebenszeit der Fluoreszenz gemessen werden (Lakowicz et al., (1992) Anal. Biochem. 202: 316–330; Gerrittsen et al. (1997), J. of Fluorescence 7: 11–15)), wodurch weitere Fähigkeit für verschiedene Nachweisarten bereitgestellt wird. Kleine, zuverlässige und relativ preiswerte Lasersysteme sind jetzt erhältlich, um Multiphoton-konfokale Mikroskopie recht routinemäßig anzuwenden.
Eine Kombination aus biologischer Heterogenität von Zellen in Populationen (Bright et al., (1989) J. Cell. Physiol. 141: 410; Giuliano, (1996) Cell Motil. Cytoskel. 35: 237)) wie auch die hohe räumliche und zeitliche Frequenz chemischer und molekularer Information, die innerhalb von Zellen vorliegt, macht es unmöglich, Information von hohem Gehalt aus Zellpopulationen mit existierenden Gesamt-Mikrotiterplattenlesegeräten zu extrahieren. Für Multicolor, fluoreszenzbasierende Screens mit Zellen, die einzeln analysiert werden, wurde keine Screeningplattform mit hohem Gehalt entworfen. In ähnlicher Weise ist gegenwärtig kein Verfahren erhältlich, das automatisierten Flüssigkeitstransport zu Arrays von Zellen zum Zweck des systematischen Screening von Verbindungen hinsichtlich der Fähigkeit kombiniert, eine zelluläre Antwort zu induzieren, die durch HCS-Analyse identifiziert wird, insbesondere von Zellen, die in Mikrotiterplatten kultiviert wurden. Weiterhin existiert im Stand der Technik kein Verfahren, das hohe Durchsatz-Vertiefung-für-Vertiefung-Messungen zur Identifizierung von "Treffern" in einem Assay, gefolgt von einer zweiten Zelle-für-Zelle-Messung mit hohem Informationsgehalt, auf der gleichen Platte kombiniert, nur für diese Vertiefungen, die als Treffer identifiziert wurden.
Die vorliegende Erfindung stellt Systeme, Verfahren und Screens zur Verfügung, die Screening mit hohem Durchsatz (HTS) und Screening mit hohem Informationsgehalt (HCS) kombinieren, die die Validierung von Zielen und die Optimierung von Kandidaten durch Kombination vieler Zellscreeningformate mit fluoreszenzbasierten molekularen Reagenzien und computerbasierten Eigenschaftsextraktionen, Datenanalysen und Automatisierung verbessert, was zu einer größeren Menge und Schnelligkeit der Datensammlung führt, zu verkürzten Zykluszeiten und schließlich zur schnelleren Auswertung möglicher Arzneistoffkandidaten. Die vorliegende Erfindung stellt auch Möglichkeiten zur Miniaturisierung der Verfahren bereit, wobei das Volumen von Reagenzien und Testverbindungen, die in jedem Assay benötigt werden, vermindert wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Zellen, umfassend Zur-Verfügung-Stellen von Zellen, die Fluoreszenzreportermoleküle enthalten, in einem Array von Orten, Behandlung der Zellen in dem Array von Orten mit einem oder mehreren Reagenzien, Sichtbarmachung einer Anzahl von Zellen an jedem Ort mit Fluoreszenzoptik, Konvertieren der optischen Information in digitale Daten, Verwenden der digitalen Daten, um die Verteilung, Umgebung und Aktivität der fluoreszenzmarkierten Reportermoleküle in den Zellen zu bestimmen, und die Verteilung von Zellen, und Interpretieren der Information in Bezeichnungen einer positiven, negativen oder Null-Wirkung der Verbindung, die getestet wird, auf die biologische Funktion.
In dieser Ausführungsform bestimmt das Verfahren schnell die Verteilung, Umgebung oder Aktivität von fluoreszenzmarkierten Reportermolekülen in Zellen, für den Zweck, eine große Anzahl von Verbindungen zu screenen, auf diejenigen, die spezifisch bestimmte biologische Funktionen beeinflussen. Der Array von Orten kann eine Mikrotiterplatte oder ein Mikrochip sein, der eine Mikroplatte ist, die Zellen in einem Array von Standorten besitzt. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das Verfahren computerbasierte Mittel zur Erlangung, Prozessierung, Wiedergabe und Speicherung der erlangten Daten ein. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin eine automatisierte Flüssigkeitslieferung zu dem Array von Zellen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Informationen, die von dem Screening mit hohem Durchsatz erhalten wurden, auf der gleichen Platte verwendet, um selektiv Screening mit hohem Informationsgehalt auf nur einer Untergruppe von den Zellstandorten auf der Platte durchzuführen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Zellscreeningsystem zur Verfügung gestellt, das umfasst:

– ein fluoreszenzoptisches System mit einer hohen Vergrößerung,
– eine X,Y-Bühne, das zum Halten einer Platte, die einen Array von Zellen enthält, angepasst ist und Mittel hat zur Bewegung der Platte für die geeignete Anpassung und Fokussierung auf die Zellarrays;
– eine digitale Kamera;
– eine Lichtquelle, die optische Mittel hat, die Anregungslicht zu den Zellarrays leiten und ein Mittel zur Leitung des imitierten Fluoreszenzlichts von den Zellen zu der digitalen Kamera; und
– ein Computermittel zum Empfang und Prozessierung digitaler Daten von der digitalen Kamera, wobei das Computermittel eine digitale Bildfangschaltung zum Empfangen der Bilder von der Kamera einschließt, ein Display für Benutzerinteraktion und Display der Assayergebnisse, digitales Lagermedium für Datenlagerung und Archivierung, und ein Mittel zur Kontrolle, Aufnahme, Prozessierung und Wiedergabe der Ergebnisse.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Screeningsystem weiterhin einen Computerbildschirm, der funktionell mit dem Computer zur Wiedergabe der Daten verbunden ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform speichert das Computermittel zum Empfang und zur Prozessierung digitaler Daten von der digitalen Kamera die Daten in einer Bioinformatikdatenbank. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Zellscreeningsystem weiterhin ein Lesegerät, das ein Signal von vielen oder allen der Vertiefungen parallel misst. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Zellscreeningsystem weiterhin ein mechanisch-optisches Mittel zur Änderung der Vergrößerung des Systems, um es zu ermöglichen, das Verfahren zwischen Screening mit hohem Durchsatz und hohem Informationsgehalt zu wechseln. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Screeningsystem weiterhin eine Kammer und ein Kontrollsystem, um die Temperatur, CO₂-Konzentration und Feuchtigkeit, die die Platte umgibt, auf einem Niveau zu halten, das erforderlich ist, um alle Zellen am Leben zu erhalten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform benutzt das Zellscreeningsystem ein konfokales Scan-Beleuchtungs- und Nachweissystem.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein maschinenlesbares Speichermedium zur Verfügung gestellt, das ein Programm umfasst, das einen Satz von Instruktionen zur Auslösung eines Zellscreeningsystems, um Verfahren auszuführen, zur Bestimmung der Verteilung und Aktivität von spezifischen zelzellulären Bestandteilen und Verfahren enthält, zur Verfügung gestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Zellscreeningsystem ein fluoreszenzoptisches System mit hoher Vergrößerung mit einer Bühne, die zum Halten von Zellen angepasst ist, und einem Mittel zur Bewegung der Bühne, eine digitale Kamera, eine Lichtquelle zum Empfangen und Prozessieren der digitalen Daten von der digitalen Kamera und ein Computermittel zum Empfangen und Prozessieren der digitalen Daten von der digitalen Kamera. Bevorzugte Ausführungsformen des maschinenlesbaren Speichermediums umfassen Programme, bestehend aus einem Satz von Instruktionen zur Auslösung eines Zellscreeningsystems zur Ausführung der Verfahren, wie dargelegt in Figur. 9, 11, 12, 13, 14 oder 15. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfasst ein Programm, bestehend aus einem Satz von Instruktionen zur Verursachung eines Zellscreeningsystems zur Ausführung von Verfahren zum Nachweis der Verteilung und Aktivität von spezifischen zellulären Bestandteilen und Verfahren. In den meisten bevorzugten Ausführungsformen schließen die zellulären Verfahren ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Kerntranslokation eines Proteins, zelluläre Hypertrophie, Apoptose und Protease-induzierte Translokation eines Proteins.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden eine Vielzahl von automatisierten Zellscreeningverfahren zur Verfügung gestellt, einschließlich Screens zur Identifizierung von Gemischen, die Transkriptionsfaktoraktivität, Proteinkinaseaktivität, Zellmorphologie, Mikrotubulistruktur, Apoptose, Rezeptorinternalisierung und Protease-induzierte Translokation eines Proteins beeinflussen.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung rekombinante Nukleinsäuren zur Verfügung, die einen Proteasebiosensor kodieren, umfassend:

a. eine erste Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein nachweisbares Polypeptidsignal kodiert;
b. eine zweite Nukleinsäuresequenz, die wenigstens eine Proteaseerkennungsstelle kodiert, wobei die zweite Nukleinsäuresequenz funktionell verbunden ist mit der ersten Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein nachweisbares Polypeptidsignal kodiert; und
c. eine dritte Nukleinsäuresequenz, die wenigstens eine Reaktantenzielsequenz kodiert, wobei die dritte Nukleinsäuresequenz funktionell verbunden ist mit der zweiten Nukleinsäuresequenz, die wenigstens eine Proteaseerkennungsstelle kodiert.

Die vorliegende Erfindung stellt auch einen rekombinanten Expressionsvektor zur Verfügung, der in der Lage ist, die rekombinanten Nukleinsäuren, die Proteasebiosensoren kodieren, zu exprimieren, genauso wie genetisch modifizierte Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transfiziert sind.
Die Erfindung stellt weiterhin rekombinante Proteasebiosensoren zur Verfügung, umfassend

d. eine erste Domäne, umfassend wenigstens ein nachweisbares Polypeptidsignal;
e. eine zweite Domäne, umfassend wenigstens eine Proteaseerkennungsstelle; und
f. eine dritte Domäne, umfassend wenigstens eine Reaktantenzielsequenz; wobei die erste Domäne und die dritte Domäne durch die zweite Domäne getrennt sind.

In einem weiteren Aspekt schließt die vorliegende Erfindung Assays und Reagenzien zur Charakterisierung einer Probe auf die Anwesenheit eines Toxins zur Verfügung. Das Verfahren umfasst die Verwendung eines Detektors, einer Sortiermaschine und Identifizierungsklassen von Toxinbiosensoren, um verschiedene Spiegel der Toxincharakterisierung zur Verfügung zu stellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Diagramm der Bestandteile des zellbasierten Scanningsystems.
2 zeigt eine schematische Darstellung des Mikroskopaufbaus.
3 zeigt den Kameraaufbau.
4 veranschaulicht den Vorgang des Zellscannings.
5 veranschaulicht eine Benutzeroberfläche, die die Hauptfunktion zur Anleitung des Benutzers zeigt.
6 ist ein Diagramm der Zweiplattformarchitektur des "Dual Mode-Systems" für das zellbasierte Screening, wobei eine Plattform eine Teleskoplinse verwendet, um alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte abzulesen und wobei eine zweite Plattform eine Linse mit höherer Vergrößerung verwendet, um einzelne Zellen in einer Vertiefung zu lesen.
7 ist ein Ausschnitt eines optischen Systems für eine Einzelplatttormarchitektur des Dual Mode-Systems für zellbasiertes Screening, das eine bewegliche Teleskoplinse verwendet, um alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zur erfassen und eine bewegliche Linse mit höherer Vergrößerung, um einzelne Zellen in einer Vertiefung zu erfassen.
8 veranschaulicht das Flüssigkeitstransportsystem zur Gewinnung kinetischer Daten des zellbasierten Screeningsystems.
9 ist ein Flussdiagramm des Prozessierungsschritts für das zellbasierte Scanningsystem.
10 A–J veranschaulicht die Strategie des Kerntranslokationsassays.
11 ist ein Flussdiagramm, das die Prozessierungsschritte in dem Dual Mode-System für zellbasiertes Screening, welches das Screening von Mikrotiterplatten mit hohem Durchsatz und hohem Informationsgehalt kombiniert, definiert.
12 ist ein Flussdiagramm, das die Prozessierungsschritte der Betriebsart (Modus) mit hohem Durchsatz des Systems für zellbasiertes Screening definiert.
13 ist ein Flussdiagramm, das die Prozessierungsschritte der Betriebsart mit hohem Informationsgehalt des Systems für zellbasiertes Screening definiert.
14 ist ein Flussdiagramm, das die Prozessierungsschritte definiert, die zum Erhalt kinetischer Daten in der Betriebsart mit hohem Informationsgehalt des Systems für zellbasiertes Screening erforderlich sind.
15 ist ein Flussdiagramm, dass die Prozessierungsschritte definiert, die in einer Vertiefung während der Aufnahme von kinetischen Daten durchgeführt werden.
16 ist ein Beispiel der Daten eines bekannten Inhibitors der Translokation.
17 ist ein Beispiel der Daten eines bekannten Stimulators der Translokation.
18 veranschaulicht die Darstellung in graphischer Anzeige.
19 veranschaulicht die Daten der Betriebsart mit hohem Durchsatz des Systems für zellbasiertes Screening, ein Beispiel der Daten, die an der Betriebsart mit hohem Informationsgehalt weitergeleitet wurden, diese Daten, die in der Betriebsart mit hohem Gehalt erhalten wurden und die Ergebnisse der Analyse der Daten.
20 zeigt die Messung einer arzneistoffinduzierten Translokation vom Zytoplasma zum Kern.
21 veranschaulicht eine graphische Benutzeroberfläche der Messung, die in Figur. 20 gezeigt wird.
22 veranschaulicht eine graphische Benutzeroberfläche mit einer Darstellung der Daten der Messung, die in Figur. 20 gezeigt wird.
23 ist ein Diagramm, das die kinetischen Daten repräsentiert, die aus den in Figur. 20 gezeigten Messungen erhalten wurden.
24 veranschaulicht einen Screen mit hohem Gehalt von arzneistoffinduzierter Apoptose.
25 Die Graphen veranschaulichen Veränderungen in der Morphologie nach Induktion von Apoptose. Staurosporin (A) und Paclitaxel (B) induzieren klassische Kernfragmentation in L929-Zellen. BHK-Zellen zeigen konzentrationsabhängige Veränderungen in Antwort auf Staurosporin (C), jedoch eine eher klassische Antwort auf Paclitaxel (D). MCF-7-Zellen zeigen entweder Kernkondensation (E) oder Fragmentation (F) in Antwort auf jeweils Staurosporin und Paclitaxel. In allen Fällen wurden die Zellen Verbindungen für 30 Stunden ausgesetzt.
26 veranschaulicht die Dosisantwort von Zellen auf Staurosporin bezüglich sowohl Kerngröße als auch Kernperimeterwindung.
27 Die Graphen zeigen Induktion von Apoptose durch Staurosporin und Paclitaxel, die zu Veränderungen im Peri-Kern-f-Actin-Gehalt führen. (A, B) Beide apoptotischen Stimulatoren induzieren dosisabhängigen Anstieg im f-Actin-Gehalt in L929-Zellen. (C) In BHK-Zellen induziert Staurosporin einen dosisabhängigen Anstieg in f-Actin, wohingegen Paclitaxel (D) Ergebnisse produziert, die variab ler sind. (E) MCF-7-Zellen zeigen entweder eine Verringerung oder einen Anstieg, abhängig von der Konzentration von Staurosporin. (F) Paclitaxel-induzierte Veränderungen im f-Actin-Gehalt waren hochvariabel und nichtsignifikant. Die Zellen wurden den Verbindungen für 30 Stunden ausgesetzt.
28 Die Diagramme veranschaulichen mitochondriale Veränderungen in Antwort auf Induktion von Apoptose. L929 (A, B)- und BHK (C, D)-Zellen antworteten sowohl auf Staurosporin (A, C) als auch auf Paclitaxel (B, D) mit einem Anstieg der mitochondrialen Masse. MCF-7-Zellen zeigten entweder eine Verringerung im Membranpotential (E, Staurosporin) oder einen Anstieg in der mitochondrialen Masse (F, Paclitaxel), abhängig von dem Stimulus. Die Zellen wurden den Verbindungen für 30 Stunden ausgesetzt. 28G ist ein Diagramm, das die simultane Messung von Staurosporinwirkungen auf die mitochondriale Masse und das mitochondriale Potential in BHK-Zellen zeigt.
29 zeigt die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen für verschiedene Typen von Proteasebiosensordomänen. (A) Signalsequenzen. (B) Proteaseerkennungsstellen. (C) Produkt/Reaktanten-Zielsequenzen.
30 zeigt schematisch einige Basisorganisationen von Domänen in Proteasebiosensoren der Erfindung.
31 ist ein schematisches Diagramm eines spezifischen 3-Domänen-Proteasebiosensors.
32 ist eine Fotografie, die die Wirkung der Stimulation von Apoptose durch cis-Platin auf BHK-Zellen zeigt, die mit einem Expressionsvektor, der den Caspasebiosensor, gezeigt in Figur. 32, exprimiert, transfiziert sind.
33 ist ein schematisches Diagramm eines 4-Domänen-Proteasebiosensors.
34 ist ein schematisches Diagramm eines spezifischen 4-Domänen-Proteasebiosensors, der ein Kernlokalisierungssignal enthält.
35 ist ein schematisches Diagramm eines spezifischen 5-Domänen-Proteasebiosensors.
36 zeigt die unterschiedliche Antwort in einem dualen Markierungsassay der p38 MAPK und NF-κB Signalwege über die drei Modell-Toxine und zwei verschiedenen Zelltypen. Behandlungen, die mit einem Stern markiert sind, unterscheiden sich von den Kontrollen mit einer Aussagewahrscheinlichkeit von 99% (p < 0,01).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Alle zitierten Patente, Patentanmeldung und andere Referenzen sind durch Referenz in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
Die hier verwendeten Begriffe haben die folgende spezifische Bedeutung:
Marken zellulärer Domänen. Lumineszierende Sonden mit hoher Affinität für spezifische zelluläre Bestandteile, die spezifische Organellen und Moleküle beinhalten. Diese Sonden können entweder keine lumineszierenden Moleküle oder fluoreszenzmarkierte Makromoleküle sein, die als "Markierungsreagenzien", "Umgebungsindikatoren" oder "Biosensoren" verwendet werden.
Markierungsreagenzien. Markierungsreagenzien schließen lumineszierend markierte Makromoleküle, einschließlich Fluoreszenzproteinanaloga und Biosensoren, lumineszierende makromolekulare Chimären, einschließlich jenen, die mit dem grünfluoreszierenden Protein und dessen Mutanten gebildet werden, lumineszierend markierte primäre oder sekundäre Antikörper, die mit zellulären Antigenen reagieren, die an einer physiologischen Antwort beteiligt sind, lumineszierende Färbungen, Farbstoffe und andere kleine Moleküle, ein, sind aber nicht auf sie beschränkt.
Marken zellulärer Translokation. Lumineszenzmarkierte Makromoleküle oder Organellen, die während eines zellulären Vorgangs oder einer physiologischen Reaktion von einer Zelldomäne zu einer anderen wandern. Translokationsmarker können entweder einfach die Lokalisierung, bezogen auf Marker zellulärer Domänen, berichten oder sie können auch Biosensoren sein, die auch einige biochemische oder molekulare Aktivität berichten.
Biosensoren. Makromoleküle, die aus einer Domäne mit biologischer Funktion und einer lumineszierenden Sonde oder Sonden bestehen, die die Veränderungen der Umgebung widerspiegeln, die entweder in der Zelle oder auf deren Oberfläche auftreten. Eine Klasse lumineszenzmarkierter Makromoleküle, die dazu entworfen wurde, diese Vorgänge aufzu spüren und zu berichten, wurde als "fluoreszierende Proteinbiosensoren" bezeichnet. Der Proteinbestandteil des Biosensors stellt eine hochentwickelte molekulare Erkennungsgruppe zur Verfügung. Ein fluoreszierendes Molekül, das an dem Proteinbestandteil in der Nähe einer aktiven Stelle angeheftet ist, übersetzt die Veränderungen der Umgebung in Fluoreszenzsignale, die mit einem System mit einer geeigneten zeitlichen und räumlichen Auflösung, wie das Zellscanningsystem der vorliegenden Erfindung, nachgewiesen werden. Da die Modulierung der Aktivität von nativem Protein innerhalb einer lebenden Zelle reversibel ist und da die fluoreszierenden Proteinbiosensoren so entworfen werden können, dass sie reversibel Veränderungen in der Proteinaktivität aufspüren, sind diese Biosensoren im Wesentlichen wiederverwendbar.
Krankheitsassoziierte Sequenzen ("DAS"). Dieser Ausdruck bezieht sich auf Nukleinsäuresequenzen, die durch Standardverfahren identifiziert werden, wie primäre DNA-Sequenzdaten, genomische Verfahren wie Subtraktionshybridisierung und RADE und proteomische Verfahren in Kombination mit reverser Genetik, wie bei Kandidatenverbindungen für Arzneistoffe. Der Ausdruck bedeutet nicht, dass diese Sequenz nur mit einem Krankheitszustand assoziiert ist.
Screening mit hohem Gehalt (HCS) kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Arzneistoffen auf komplexe molekulare Ereignisse, wie Signaltransduktionswege, genauso wie auf Zellfunktionen, die Apoptose, Zellteilung, Zelladhäsion, Bewegung, Exocytose und Zell-Zell-Kommunikation beinhalten, jedoch nicht auf diese beschränkt sind, zu messen. Vielfarbige Fluoreszenz ermöglicht es, dass zahlreiche Ziele und Zellvorgänge in einem einzigen Screen getestet werden können. Das miteinander in Bezug Setzen zellulärer Reaktionen wird eine Fülle von Informationen erzeugen, die für die Validierung des Ziels und die Leitoptimierung erforderlich sind.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das ein Zellscreeningsystem verwendet, umfassend ein optisches Fluoreszenzsystem mit hoher Vergrößerung mit einem Mikroskopobjektiv, einer Bühne X,Y, das dazu geeignet ist, einen Array von Stellen zur Aufnahme von Zellen zu halten, und mit einer Vorrichtung zur Bewegung der Platte, um die Stellen mit dem Mikroskopobjektiv in Übereinstimmung zu bringen und eine Vorrichtung zur Bewegung der Platte in dieser Richtung, um Fokussierung auszulösen; eine Digitalkamera; eine Lichtquelle mit einer optischen Vorrichtung zur Ausrichtung des von den Zellen imitierten fluoreszierenden Lichts auf eine Digitalkamera; und eine Computervorrichtung zum Erhalt und zur Verarbeitung der digitalen Daten von der Digitalkamera, wobei die Computervorrichtung beinhaltet: eine digitale Bildfangschaltung zum Erhalt der Bilder von der Kamera, eine Anzeige für die Wechselwirkung mit dem Benutzer und zur Anzeige der Assayergebnisse, digitale Speichermedien für Datenspeicherung und -archivierung und Mittel zur Kontrolle, zum Erhalt, zur Verarbeitung und zur Anzeige der Ergebnisse.
1 ist ein schematisches Diagramm einer bevorzugten Ausführungsform des Zellscanningsystems. Es wird ein Inversionsfluoreszenzmikroskop 1 verwendet, wie ein Zeiss Axiovert-Inversions-Fluoreszenzmikroskop, das Standardobjektive mit einer Vergrößerung von Ibis 100-fach zur Kamera verwendet, und eine Weißlichtquelle (z. B. eine 100 W Quecksilberbogenlampe oder eine 75 W Xenonlampe) mit der Stromversorgung 2. Es gibt eine X,Y-Bühne 3 zur Bewegung der Platte 4 in X,Y-Richtung über das Objektiv des Mikroskops. Ein Z-Achsen-Fokusantrieb 5 bewegt das Objektiv in Z-Richtung zur Fokussierung. Ein Joystick 6 stellt die manuelle Bewegung der Bühne in der XYZ-Richtung zur Verfügung. Eine Digitalkamera 7 mit hoher Auflösung erstellt Bilder von jeder Vertiefung oder Stelle auf der Platte. Es gibt eine Stromquelle 8 für die Kamera, eine Automatisierungskontrolleinheit 9 und eine zentrale Verarbeitungseinheit 10. Der PC 11 stellt eine Anzeige 12 zur Verfügung und besitzt angeschlossene Software. Über den Drucker 13 kann eine Hardcopy ausgedruckt werden.
2 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskopaufbaus 1, die die X,Y-Bühne, Z-Achsen Fokusantrieb 5, den Joystick 6, die Lichtquelle 2 und die Automatisierungskontrolleinheit 9 genauer zeigt. Es werden Kabel zu dem Computer 15 bzw. dem Mikroskop 16 bereitgestellt. Zusätzlich zeigt 2 eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen 17, die auf der X,Y-Bühne 3 in X,Y-Richtung bewegt wird. Licht von der Lichtquelle 2 tritt durch den PC-kontrollierten Verschluss 18 auf ein motorgetriebenes Filterrad 19 mit Anregungsfiltern 20. Das Licht tritt in den Filterwürfel 25, der einen dichromatischen Spiegel 26 und einen Emissionsfilter 27 aufweist. Anregungslicht reflektiert von dem dichromatischen Spiegel in die Vertiefungen in der Mikrotiterplatte 17 und fluoreszierendes Licht 28 tritt durch den dichromatischen Spiegel 26 und den Emissionsfilter 27 und zur digitalen Kamera 7.
3 zeigt eine schematische Zeichnung eines bevorzugten Kameraaufbaus. Die Digitalkamera 7, die einen automatischen Verschluss zur Kontrolle der Aussetzung und eine Stromzufuhr 31 aufweist, erhält fluoreszierendes Licht 28 von dem Mikroskopaufbau. Ein digitales Kabel 30 leitet digitale Signale an den Computer weiter.
Die vorstehend beschriebenen standardmäßigen optischen Konfigurationen verwenden Mikroskopoptik zur direkten Erzeugung eines vergrößerten Bildes der Probe auf dem Kamerasensor, um ein Bild mit hoher Auflösung der Probe einzufangen. Dieses optische System wird im Allgemeinen als "Breitfeldmikroskopie" bezeichnet. Fachleute auf dem Gebiet der Mikroskopie wissen, dass ein Bild der Probe mit hoher Auflösung durch eine Vielzahl anderer optischer Systeme erzeugt werden kann, die den standardmäßigen rasterkonfokalen Nachweis eines fokussierten Punkts oder einer Linie der Erhellung beinhalten, die über die Probe gescannt wird (Go et al. 1997, oben) und die Multiphotonenraster-konfokale Mikroskopie (Denk et al., 1990, oben) einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind, die beide auf einem CCD-Detektor Bilder darstellen können oder durch synchrone Digitalisierung der analogen Ergebnisse einer Fotoverstärkerröhre.
In Screeninganwendungen ist es häufiger notwendig, eine bestimmte Zelllinie oder eine primäre Zellkultur zu verwenden, um aus den bestimmten Eigenschaften dieser Zellen Vorteile zur ziehen. Fachleute auf dem Gebiet der Zellkultur wissen, dass einige Zelllinien kontaktinhibiert sind, was bedeutet, dass sie das Wachstum einstellen, wenn sie von anderen Zellen umgeben sind, während andere Zelllinien unter diesen Bedingungen Weiterwachsen und sich im wahrsten Sinne des Wortes auftürmen und dabei viele Schichten bilden. Ein Beispiel einer solchen Zelllinie ist die HEK 293 (ATCC CRL1573)-Linie. Ein optisches System, das Bilder von Einzelschichten in vielschichtigen Präparationen darstellen kann, ist erforderlich für die Verwendung mit Zelllinien, die dazu tendieren, mehrere Schichten zu bilden. Die große Tiefenschärfe von Breiffeldmikroskopen erzeugt ein Bild, das eine Projektion durch die vielen Schichten von Zellen darstellt, was die Analyse subzellulärer räumlicher Verteilungen in schichtbildenden Zellen extrem schwer macht. Alternativ dazu ermöglicht die sehr geringe Tiefenschärfe, die mit einem konfokalen Mikroskop erreicht werden kann (etwa ein Micron), die Unterscheidung einer Einzelzellschicht mit hoher Auflösung, wodurch die Bestimmung der subzellulären räumlichen Verteilung erleichtert wird. In ähnlicher Weise ist die konfokale Bildgebung zu bevorzugen, wenn Nachweisarten, wie die Darstellung von Fluoreszenzlebenszeit, erforderlich sind.
Das Ergebnis eines standardmäßigen konfokalen Bildgebungsaufsatzes für ein Mikroskop ist ein digitales Bild, das in das gleiche Format umgewandelt werden kann wie Bilder, die durch die anderen, vorstehend beschriebenen, Zellscreeningsystemausführungsformen erzeugt werden und kann deshalb auf genau die gleiche Weise wie jene Bilder verarbeitet werden. Die Gesamtkontrolle, die Datengewinnung und die Analyse in dieser Ausführungsform ist im Wesentlichen die gleiche. Die optische Anordnung des konfokalen Mikroskopsystems ist mit der Ausnahme des Illuminators und der Detektoren im Wesentlichen dieselbe wie vorstehend beschrieben. Für die konfokale Mikroskopie erforderliche Systeme zur Erleuchtung und zum Nachweis wurden als Zubehör entwickelt, das an standardmäßige mikroskopische Systeme angeheftet werden kann an jenes der vorliegenden Erfindung (Zeiss, Deutschland).
Die alternativen optischen Systeme können daher in das vorstehend beschriebene System leicht integriert werden.
Die 4 veranschaulicht eine alternative Ausführungsform der Erfindung, in der Zellanordnungen in Mikrovertiefungen 40 auf einer Mikrotiterplatte 41 vorliegen, wie in der coanhängigen US-Anmeldung Seriennummer 08/865,341, hier durch Referenz in ihrer Gesamtheit eingeschlossen, beschrieben sind. Typischerweise ist die Mikroplatte 20 mm × 30 mm, verglichen mit einer Standardmikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, die 86 mm × 129 mm groß ist. Die Anordnung von Zellen auf einer Mikroplatte mit höherer Dichte ermöglicht es, dass die Mikroplatte bei niedriger Auflösung von wenigen Microns pro Pixel für einen hohen Durchsatz bildlich verarbeitet werden kann und bestimmte Stellen auf der Mikroplatte können bei einer höheren Auflösung von weniger als 0,5 Microns pro Pixel bildlich verarbeitet werden. Diese beiden Auflösungsarten helfen dabei, den Gesamtdurchsatz des Systems zu verbessern.
Die Mikroplattenkammer 42 dient als Mikroflüssigkeitstransportsystem für die Zugabe von Verbindungen zu Zellen. Die Mikroplatte 41 in der Mikroplattenkammer 42 wird in ein X,Y-Mikroplattenlesegerät 43 gestellt. Die digitalen Daten werden wie vorstehend beschrieben verarbeitet. Die geringe Größe dieses Mikroplattensystems erhöht den Durchsatz, vermindert das Reagensvolumen und ermöglicht die Kontrolle der Verteilung und der Platzierung von Zellen für eine schnelle und genaue zellbasierte Analyse. Verarbeitete Daten können auf einem PC-Bildschirm 11 dargestellt werden und in eine Bioinformatikdatenbank 44 eingespeist werden. Diese Datenbank ermöglicht nicht nur die Speicherung und die Gewinnung von Daten, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, sondern ermöglicht auch die Gewinnung und Speicherung externer Daten, die sich auf die Zellen beziehen. 5 ist ein PC-Bildschirm, der die Arbeitsweise der Software veranschaulicht.
In einer alternativen Ausführungsform wird ein System mit hohem Durchsatz (HTS) direkt mit dem HCS, entweder auf der gleichen Plattform oder auf zwei verschiedenen Plattformen, die elektronisch, d. h. über ein lokales Netzwerk verbunden sind, gekoppelt. Dieses System, das als optisches System "dualer Betriebsart" bezeichnet wird, besitzt den Vorteil der Steigerung des Durchsatzes eines HCS durch dessen Koppelung mit einem HTS, wodurch eine langsamere Datengewinnung mit hoher Auflösung und Analyse nur in einer kleinen Anzahl von Vertiefungen notwendig wird, die eine Reaktion in der gekoppelten HTS zeigen.
Im Stand der Technik sind Lesesysteme mit hohem Durchsatz für vollständige Platten bekannt und werden gewöhnlich als Bestandteile eines HTS-Systems verwendet, das dazu verwendet wird, große Anzahlen von Verbindungen zu screenen (Beggs (1997), J. of Biomolec. Screening 2: 71–78; Macaffrey et al., (1996) J. Biomolec. Screening 1: 187–190).
In einer Ausführungsform des zellbasierten Screenings der "dualen Betriebsart" wird eine Architektur mit zwei Plattformen bereitgestellt, in der die Datengewinnung mit hohem Durchsatz auf einer Plattform und die Datengewinnung mit hohem Gehalt auf einer zweiten Plattform stattfindet (6). Die Verarbeitung läuft auf jeder Plattform unabhängig ab, wobei die Ergebnisse über eine Netzwerkkarte laufen oder eine einzelne Kontrolleinheit wird dazu verwendet, die Ergebnisse beider Plattformen zu verarbeiten.
Wie in 6 veranschaulicht, besteht ein beispielhaftes optisches System zwei-Plattformsystem der dualen Betriebsart aus zwei lichtoptischen Instrumenten, einer Plattform mit hohem Durchsatz 60 und einer Plattform mit hohem Gehalt 65, die fluoreszierende Signale ablesen, die von Zellen emittiert werden, die in Mikrotiterplatten oder Mikrovertiefungsarrays auf einer Mikroplatte kultiviert werden und die über eine elektronische Verbindung 64 miteinander kommunizieren. Die Plattform mit hohem Durchsatz 60 analysiert alle Vertiefungen in der gesamten Platte entweder auf parallele oder schnelle serielle Art. Fachleute wissen, dass es viele solche käuflich erhältlichen Lesesysteme mit hohem Durchsatz gibt, die in ein zellbasiertes Screeningsystem integriert werden können, Topcount (Packard Instruments, Meriden, CT); Spectramax, Lumiskan (Molecular Devices, Sunnyvale, CA); Fluoroscan (Labsystems, Beverly, MA)). Die Plattform mit hohem Gehalt 65, wie vorstehend beschrieben, scannt von Vertiefung zu Vertiefung und gewinnt und analysiert Bilddaten mit hoher Auflösung, die von individuellen Zellen innerhalb einer Vertiefung gewonnen wurden.
Die im Systemcomputer 62 befindliche HTS-Software kontrolliert das Instrument mit hohem Durchsatz und die Ergebnisse werden auf dem Monitor 61 dargestellt. Die im Computersystem 67 befindliche HCS-Software kontrolliert die Instrumentenhardware 65 für den hohen Gehalt, optionale Vorrichtungen (z. B. Plattenbeladungsgerät, Umgebungskammer, Flüssigkeitsverteiler), analysiert die digitalen Bilddaten von der Platte, stellt Ergebnisse auf dem Monitor 66 bereit und verwaltet Daten, die in einer integrierten Datenbank gemessen werden. Die beiden Systeme können sich auch einen einzelnen Computer teilen, in dem Fall würden alle Daten auf diesem Computer gesammelt, verarbeitet und angezeigt, ohne ein lokales Netzwerk für den Transfer der Daten zu benötigen. Mikrotiterplatten werden vom System mit hohem Durchsatz zum System mit hohem Gehalt 63 entweder manuell oder durch eine bekannte (Beggs (1997), oben; Mcaffrey (1996), oben) Roboterplattentransfervorrichtung transferiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet das optische System der dualen Betriebsart ein einzelnes Plattformsystem (7). Es besteht aus zwei getrennten optischen Modulen, die einem HCS-Modul 203 und einem HTS-Modul 209, die unabhängig oder gemeinsam bewegt werden können, so dass zu einem Zeitpunkt nur eins davon dazu verwendet wird, Daten von der Mikrotiterplatte 201 zu gewinnen. Die Mikrotiterplatte 201 wird auf eine motorisierte X,Y-Bühne montiert, so dass sie zur Bildgebung entweder in der HTSoder HCS-Betriebsart positioniert werden kann. Nach der Gewinnung und der Analysierung der HTS-Bilddaten, wie nachstehend beschrieben, wird das HTS-optische Modul 209 aus dem optischen Weg entfernt und das HCS-optische Modul 203 wird an die richtige Position bewegt.
Das optische Modul für HTS 209 besteht aus einer Projektionslinse 214, einem Anregungswellenlängenfilter 213 und einem doppelbrechenden Spiegel 210, die dazu verwendet werden, den gesamten Boden der Platte mit einer spezifischen Wellenlängenbande eines herkömmlichen Mikroskoplampensystems (nicht gezeigt) zu beleuchten. Die Fluoreszenzemission wird durch den dichromatischen Spiegel 210 und den Emissionswellenlängenfilter 211 durch eine Linse 212 gebündelt, die ein Bild auf der Kamera 216 mit dem Sensor 215 erzeugt.
Das optische Modul für HCS 203 besteht aus einer Projektionslinse 208, einem Anregungswellenlängenfilter 207 und einem dichromatischen Spiegel 204, die dazu verwendet werden, die hintere Apertur des Mikroskopobjektivs 202 zu erhellen und dadurch das Feld des Objektivs eines standardmäßigen Mikroskopbeleuchtungssystems (nicht gezeigt). Die Fluoreszenzemission wird durch das Mikroskopobjektiv 202 gesammelt, tritt durch den dichromatischen Spiegel 204 und den Emissionswellenlängenfilter 205 und ist durch eine Röhrenlinse 206 gebündelt, die ein Bild auf der gleichen Kamera 216 mit dem Sensor 215 erzeugt.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Zellscreeningsystem weiterhin eine Vorrichtung zum Flüssigkeitstransport zur Verwendung mit der Ausführungsform der lebenden Zellen des Verfahrens des Zellscreenings (siehe nachstehend). 8 stellt beispielhaft eine Flüssigkeitstransportvorrichtung zur Verwendung mit dem erfindungsgemäßen System dar. Sie besteht aus einer Bank von 12 Spritzenpumpen 701, die durch einen einzelnen Motor angetrieben werden. Die Größe jeder Spritze 702 hängt vom Volumen ab, das in jede Vertiefung transportiert werden soll, typischerweise zwischen 1 und 100 μl. Jede Spritze ist über flexible Schläuche 703 mit einer ähnlichen Bank von Konnektoren verbunden, die Standardpipettenspitzen 705 verwenden. Die Bank von Pipettenspitzen ist an ein Antriebssystem angeheftet, so dass sie relativ zur Mikrotiterplatte 706 heruntergelassen und angehoben werden können, um in jede Vertiefung Flüssigkeit zu transportieren. Die Platte wird auf eine X,Y-Bühne aufgebracht, wodurch zum Zwecke der Datengewinnung eine Bewegung relativ zum optischen System 707 ermöglicht wird. Dieser Aufbau ermöglicht es, dass ein Satz von Pipettenspitzen oder sogar eine einzelne Pipettenspitze Reagens in alle Vertiefungen der Platte transportiert. Die Bank von Spritzenpumpen kann dazu verwendet werden, gleichzeitig Flüssigkeit in 12 Vertiefungen zu transportieren oder in weniger Vertiefungen nach Entfernung einiger Spitzen.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Zellen bereit, umfassend die Bereitstellung eines Arrays von Stellen, die multiple Zellen enthalten, wobei die Zellen ein oder mehrere fluoreszierende Reportermoleküle enthalten; das Scanning multipler Zellen an jeder der Stellen, die Zellen enthalten, um fluoreszierende Signale der fluoreszierenden Reportermoleküle in den Zellen zu erhalten; das Konvertieren der fluoreszierenden Signale in digitale Daten; und die Verwendung der digitalen Daten, um die Verteilung, die Umgebung oder die Aktivität der fluoreszierenden Reportermoleküle innerhalb der Zellen zu bestimmen.
Zellarrays
Das Screening einer großen Anzahl von Verbindungen hinsichtlich der Aktivität im Hinblick auf eine bestimmte biologische Funktion erfordert die Herstellung von Arrays von Zellen für die parallele Handhabung von Zellen und Reagenzien. Standardmikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, die 96 mm × 129 mm sind, mit Vertiefungen mit 6 mm Durchmesser auf einem 9 mm-Feld, werden verwendet für Kompatibilität mit gegenwärtigen automatisierten Beladungs- und Roboterhandhabungssystemen. Die Mikroplatte ist typischerweise 20 mm × 30 mm groß, mit Zellorten mit einer Dimension von 100–200 Micron auf einem Träger von etwa 500 Micron. Verfahren zur Herstellung von Mikroplatten sind beschrieben in der US-Patenanmeldung Seriennr. 08/865,341, hier durch Referenz in ihrer Gesamtheit eingeschlossen. Mikroplatten können aus coplanaren Schichten von Materialien bestehen, an die sich Zellen anheften, die mit Materialien durchgemustert sind, an die sich die Zellen nicht anheften werden, oder eingeritzte dreidimensionale Oberflächen, ähnlich gemusterten Materialien. Zum Zweck der folgenden Diskussion beziehen sich die Begriffe "Vertiefung" und "Mikrovertiefung" auf eine Position in einer Anordnung irgendeiner Konstruktion, an die sich Zellen anheften und innerhalb derer die Zellen bildlich verarbeitet werden. Mikroplatten können ebenfalls in den Räumen zwischen den Vertiefungen Flüssigkeitstransportkanäle beinhalten. Das kleinere Format einer Mikroplatte erhöht die Gesamteffizienz des Systems durch Minimierung der Mengen der Reagenzien, der Lagerung und der Handhabung während der Präparation und der Gesamtbewegung, die für den Scanningvorgang erforderlich ist. Zusätzlich kann der gesamte Bereich der Mikroplatte wirksamer bildhaft verarbeitet werden, wodurch, wie nachstehend in diesem Dokument beschrieben, für das Mikroplattenlesegerät eine zweite Wirkungsweise ermöglicht wird.
Fluoreszenzreportermoleküle
Ein Hauptbestandteil des neuen Arzneistofferkennungsparadigmas ist eine kontinuierlich wachsende Familie fluoreszierender und lumineszierender Reagenzien, die dazu verwendet werden, die zeitliche und räumliche Verteilung, den Gehalt und die Aktivität intrazellulärer Ionen, Metaboliten, Makromoleküle und Organellen zu messen. Klassen dieser Reagenzien beinhalten Markierungsreagenzien, die die Verteilung und die Menge an Molekülen in lebenden und fixierten Zellen messen, Umgebungsindikatoren, die zeitlich und räumlich Signalübertragungsereignisse dokumentieren und fluoreszierende Proteinbiosensoren zur Messung von molekularen Aktivitäten eines Zielmoleküls innerhalb lebender Zellen. Ein Multiparameteransatz, der in einer einzelnen Zelle verschiedene Reagenzien kombiniert, ist ein starkes neues Werkzeug für die Arzneistofferkennung.
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der hohen Affinität von fluoreszierenden oder lumineszierenden Molekülen für spezifische zelluläre Bestandteile. Die Affinität für spezifische Bestandteile wird durch physikalische Kräfte wie Ioneninteraktionen, kovalente Bildung (dies beinhaltet chimäre Fusion mit Protein-basierten Chromophoren, Fluorophoren und Lumiphoren) sowie durch hydrophobe Wechselwirkungen, elektrisches Potential und in einigen Fällen Einschluss innerhalb eines zellulären Bestandteils gesteuert. Die lumineszierenden Sonden können kleine Moleküle, markierte Makromoleküle oder genetisch veränderte Proteine sein, die grünfluoreszierende Proteinchimären einschließen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Fachleute kennen eine große Vielzahl fluoreszierender Reportermoleküle, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, die fluoreszierend markierte Biomoleküle wie Proteine, Phospholipide und DNA-Hybridisierungssonden einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. In ähnlicher Weise wurden fluoreszierende Reagenzien, die spezifisch mit bestimmten chemischen Bindungs- oder Assoziierungseigenschaften synthetisiert wurden, als fluoreszierende Reportermoleküle vennrendet (Barak et al., (1997), J. Biol. Chem. 272: 27497–27500; Southwick et al., (1990), Cytometry 11:418-430; Tsien (1989) in Methods in Cell Biology, Band 29, Taylor und Wang (Hrsg.), S. 127–156). Fluoreszierend markierte Antikörper sind besonders nützliche Reportermoleküle aufgrund ihrer hohen Spezifität zur Anheftung an ein einzelnes molekulares Ziel in einem so komplexen Molekülgemisch wie in einer Zelle oder einem Gewebepunkt.
Die lumineszierenden Sonden können innerhalb der lebenden Zellen synthetisiert werden oder können in die Zelle transportiert werden durch einige nicht-mechanische Arten, einschließlich Diffusion, erleichtertem oder aktivem Transport, signalsequenzvermitteltem Transport und endozytischer oder pinozytischer Aufnahme. Mechanische Massenbeladungsvertahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, können ebenfalls dazu verwendet werden, lumineszierende Sonden in lebende Zellen zu transportieren (Barber et al., (1996), Neuroscience Letters 207: 17–20; Bright et al., (1996), Cytometn 24: 226–233; McNeil (1989) in Methods in Cell Biology, Band 29, Taylor und Wang (Hrsg.), S. 153–173). Diese Verfahren beinhalten Elektroporation und andere mechanische Verfahren, wie Beladung durch Abschaben, Beladung durch Kügelchen, Beladung durch Beschuss, Beladung durch Spritzen, hypertonisches und hypotonisches Beladen. Zusätzlich können Zellen genetisch verändert werden, um Reportermoleküle wie GFP zu exprimieren, das, wie vorstehend beschrieben, an ein Protein von Interesse gekoppelt ist (Chalfie und Prasher US-Patent Nr. 5,491,084; Cubitt et al., (1995), Trends in Biochemical Science 20: 448–455).
Sobald die lumineszierenden Sonden in der Zelle sind, lagern sie sich als Ergebnis von spezifischen Wechselwirkungen mit hoher Affinität mit der Zieldomäne oder aufgrund anderer Arten der molekularen Zielausrichtung wie signalsequenzvermitteltem Transport an ihre Zieldomäne an. Fluoreszierend markierter Reportermoleküle sind nützlich zur Bestimmung des Orts, der Menge und der chemischen Umgebung des Reporters. Es kann zum Beispiel bestimmt werden, ob sich der Reporter in einer lipophilen Membranumgebung oder in einer mehr wässrigen Umgebung befindet (Giuliano et al., (1995), Ann. Rev. of Biophysics and Biomolecular Structure 24: 405–434; Giuliano und Taylor, (1995), Methods in Neuroscience 27: 1–16). Die pH-Umgebung des Reporters kann bestimmt werden (Bright et al., (1989), J. Cell Biology 104: 1019–1033;) Giuliano et al., (1986), Annual. Biochem. 167: 362–371; Tomas et al., (1997), Biochemistry 18: 2210–2218). Es kann bestimmt werden, ob ein Reporter mit einer chelatbildenden Gruppe an ein Ion wie Ca²⁺ gebunden ist oder nicht (Bright et al., (1989), in Methods in Cell Biology, Band 30, Taylor und Wang (Hrsg.), S. 157–192; Shimura et al., (1988), J. of Biochemistry (Tokyo) 251: 405–410; Tsien (1989), in Methods in Cell Biology, Band 30, Taylor und Wang (Hrsg.), S. 127–156).
Weiterhin können bestimmte Zelltypen innerhalb eines Organismus Bestandteile enthalten, die spezifisch markiert sind, die in anderen Zelltypen nicht vorkommen. So enthalten zum Beispiel Epithelialzellen häufiger polarisierte Membranbestandteile. Das bedeutet, diese Zellen verteilen Makromoleküle entlang ihrer Plasmamembran asymmetrisch. Bindegewebe- oder Stützgewebezellen enthalten häufiger Granula, die Moleküle enthalten, die für diesen Zweck spezifisch sind (z. B. Heparin, Histamin, usw.). Die meisten muskulären Gewebezellen enthalten ein sarkoplasmatisches Reticulum, eine spezialisierte Organelle, deren Funktion darin besteht, die Konzentration von Calciumionen innerhalb des Zellzytoplasmas zu regulieren. Viele Nervengewebezellen enthalten sekretorische Granula und Vesikel , in denen sich Neurohormone oder Neurotransmitter befinden. Deshalb können fluoreszierende Moleküle so entwickelt werden, dass sie nicht nur spezifische Bestandteile innerhalb spezifischer Zellen markieren, sondern auch spezifische Zellen innerhalb einer Population gemischter Zelltypen.
Fachleute kennen eine große Anzahl von Wegen, Fluoreszenz zu messen. Einige Fluoreszenzreportermoleküle weisen zum Beispiel eine Veränderung der Anregungs- oder Emissionsspektren auf, einige zeigen Resonanzenergietransfer, wobei ein fluoreszierender Reporter Fluoreszenz verliert, während ein zweiter an Fluoreszenz gewinnt, einige zeigen einen Verlust (Quenching) oder ein Auftreten der Fluoreszenz, während andere eine Rotationsbewegung zeigen (Giuliano et al., (1995), Ann. Rev. of Biophysics and Biomol. Structure 24: 405–434, Giuliano et al., (1995), Methods in Neuroscience 27: 1–16).
Scannen von Zellarrays
Bezug nehmend auf 9 wird eine bevorzugte Ausführungsform zur Analyse von Zellen bereitgestellt, die benutzergesteuerte Parameter umfasst, die auf der Basis des durchgeführten Tests ausgewählt werden, Datengewinnung durch das Zellscreeningsystem hinsichtlich der Verteilung fluoreszierender Signale innerhalb einer Probe und einen interaktiven Datenüberblick und eine Analyse. Zu Beginn eines automatisierten Scanvorgangs gibt der Bediener die Information 200 ein, die die Probe beschreibt, spezifiziert die Filtereinstellung und die Fluoreszenzkanäle, um die verwendeten biologischen Marken und die gesuchte Information in Übereinstimmung zu bringen und passt dann die Kameraeinstellung an, um mit der Helligkeit der Probe überein zu stimmen. Zum Zwecke der Flexibilität zur Handhabung eines Probenbereichs ermöglicht die Software eine Auswahl verschiedener Parametereinstellungen, die dazu verwendet werden, Kern und Zytoplasma zu identifizieren und die Auswahl verschiedener Fluoreszenzreagenzien, die Identifizierung von Zellen von Interesse, basierend auf der Morphologie oder der Helligkeit, und die Zellzahl, die pro Vertiefung analysiert werden soll. Diese Parameter werden in der Datenbank des Systems gespeichert, um für jeden automatisierten Lauf leicht erhältlich zu sein. Die interaktive Zellidentifizierung des Systems vereinfacht die Auswahl morphologischer Parametergrenzen, wie der Bereich der Größe, der Form und der Intensität der zu analysierenden Zellen. Der Benutzer spezifiziert, welche Vertiefungen der Platte durch das System gescannt werden und wie viele Felder oder wie viele Zellen innerhalb jeder Vertiefung analysiert werden sollen. In Abhängigkeit des Aufbaus, der vom Benutzer in Schritt 101 ausgewählt wird, vor-fokussiert das System entweder automatisch den Bereich der Platte, der gescannt werden soll, mit einem Autofokusvorgang, um den Fokus der Platte 102 zu finden oder der Benutzer vor-fokussiert 103 interaktiv den zu scannenden Bereich durch Auswahl von drei Markierungspunkten, die den rechteckigen Bereich definieren, der gescannt werden soll. Ein "Focal Plane Model" mit einer Anpassung der kleinsten Annäherung wird dann aus diesen Begrenzungspunkten berechnet, um den Fokus jeder Vertiefung während eines automatisierten Scanvorgangs abzuschätzen. Der Fokus jeder Vertiefung wird durch Interpolieren des "Focal Plane Models" während eines Scanvorgangs abgeschätzt.
Während eines automatisierten Scanvorgangs zeigt die Software dynamisch den Status des Scans, einschließlich der Zahl der zu analysierenden Zellen, der gegenwärtig analysierten Vertiefung, Bilder jeder unabhängigen Wellenlänge und das Ergebnis des Screens für jede Vertiefung in dem Moment, in dem es bestimmt wird. Die Platte 4 (1) wird in serpentinenförmiger Weise gescannt, wenn die Software die motorisierte Mikroskop-X,Y-Bühne von Vertiefung zu Vertiefung und von Feld zu Feld innerhalb jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen automatisch bewegt. Fachleute auf dem Gebiet der Programmierung können die Software für das Scanning anderer Mikroplattenformate, wie zum Beispiel 24, 48 und 384 Vertiefungsplatten anpassen. Scanmuster der gesamten Platte sowie das Scanmuster der Felder innerhalb jeder Vertiefung sind programmiert. Das System passt den Probenfokus innerhalb eines Autofokusvorgangs 104 (Figur. 9) durch den Z-Achsen-Fokusantrieb 5 an, kontrolliert die Filterauswahl über ein motorisiertes Filterrad 19 und erhält und analysiert Bilder von bis zu vier verschiedenen Farben ("Kanäle" oder "Wellenlängen").
Das Autofokusverfahren wird bei einer durch den Benutzer ausgewählten Frequenz durchgeführt, typischerweise für das erste Feld in jeder Vertiefung und dann einmal alle 4 bis 5 Felder innerhalb jeder Vertiefung. Das Autofokusverfahren berechnet den Startpunkt der Z-Achse durch Interpolieren aus dem vorberechneten Plane-Focal-Modell. Startet man eine programmierbare Distanz oberhalb oder unterhalb dieses Sollwertes, dann bewegt das Verfahren die mechanische Z-Achse durch eine Zahl verschiedener Positionen, gewinnt ein Bild an jeder Position und findet das Maximum eines berechneten Fokuswerts, der den Kontrast jedes Bildes abschätzt. Die Z-Position des Bildes mit dem größten Fokuswert bestimmt den besten Fokus für ein bestimmtes Feld. Fachleute auf dem Gebiet erkennen dies als eine Variante automatisierter Autofokusverfahren, wie beschrieben in Harms et al. in Cytometry 5 (1984), 236–243, Groen et al. in Cytometn 6 (1985), 81–91, und Firestone et al. in Cytometn 12 (1991), 195–206.
Zur Bildgewinnung wird die Expositionszeit der Kamera getrennt für jeden Farbstoff angepasst, um von jedem Kanal ein Bild mit hoher Qualität zu gewährleisten. Je nach Wahl des Benutzers können Softwarevorgänge verwendet werden, um Registrierungsschwankungen zwischen Wellenlängen zu korrigieren, durch zählen linearer (X und Y) Verschiebungen zwischen Wellenlängen, bevor man weitere Messungen durchführt. Der elektronische Verschluss 18 wird kontrolliert, so dass eine Fotoausbleichung der Sonde auf ein Minimum gebracht wird. Hintergrundschatten und ungleichmäßige Ausleuchtung können durch die Software anhand bekannter Verfahren korrigiert werden (Bright et al., (1987), J. Cell Biol. 104: 1019–1033).
In einem Kanal werden Bilder eines primären Markers 105 (9) (typischerweise Zellkerne, die mit DAPI- oder Pl-Fluoreszenzfarbstoffen gegengefärbt werden) erhalten, die mit einem adaptiven Schwellenwertverfahren segmentiert (identifiziert) werden. Das adaptive Schwellenwertverfahren 106 wird dazu verwendet, dynamisch die Schwelle eines Bildes zur Trennung der Zellen vom Hintergrund auszuwählen. Die Färbung von Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen kann über die Zellen in einer Mikrotiterplattenprobe sowie innerhalb von Bildern eines Feldes von Zellen innerhalb jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte zu einem unbekannten Ausmaß variieren. Diese Variation kann als Ergebnis der Probenpräparation und/oder der dynamischen Art der Zellen auftreten. Ein globaler Schwellenwert wird für das gesamte Bild berechnet, um die Zellen vom Hintergrund zu trennen und um Feld-zu-Feld-Variationen auszugleichen. Diese globalen adaptiven Techniken sind Varianten der im Stand der Technik beschriebenen Verfahren (Kittler et al. in Computer Vision, Graphics and Image Processing 30 (1985), 125–147, Ridler et al. in IEEE Trans. Systems, Man, and Cybernetics (1978), 630–632).
Ein alternatives Verfahren zur adaptiven Schwellenwertbildung verwendet Schwellenwertbildung in lokalen Bereichen im Vergleich zur Schwellenwertbildung über das gesamte Bild. Die Bildanalyse lokaler Bereiche führt zu einer besseren Gesamtsegmentation, da die Färbung der Zellkerne (sowie anderer markierter Bestandteile) über das Bild variieren kann. Unter Verwendung dieses globalen/lokalen Verfahrens wird ein Bild mit verminderter Auflösung (reduziert in der Größe durch einen Faktor von 2 bis 4) zuerst global segmentiert (unter Verwendung adaptiver Schwellenbildung), um interessierende Bereiche in dem Bild zu finden. Diese Bereiche können als Führer dienen, um die gleichen Regionen bei voller Auflösung vollständiger zu analysieren. Es wird dann ein mehr lokalisierter Schwellenwert kalkuliert (wieder durch adaptive Schwellenbildung) für jede Region von Interesse.
Das Ergebnis des Segmentationsvertahrens ist ein binäres Bild, in dem die Objekte weiß sind und der Hintergrund schwarz. Dieses binäre Bild, das im Stand der Technik auch als Maske bezeichnet wird, wird dazu verwendet zu bestimmen, ob das Feld Objekte 107 enthält. Die Maske ist mit einem Blasen (Blob)-Markierungsverfahren markiert, wodurch jedes Objekt (oder Blase) eine einzelne Nummer zugeordnet bekommt. Morphologische Eigenschaften, wie Umgebung und Form der Blasen, werden verwendet, um Blasen, die eher Zellen sind, von denen zu unterscheiden, die als Artefakte betrachtet werden. Der Anwender stellt die morphologischen Selektionskriterien vorab ein, durch Eingabe bekannter zellmorphologischer Eigenschaften oder durch Verwendung des interaktiven Trainingswerkzeugs. Wenn Objekte von Interesse in dem Feld gefunden werden, dann werden Bilder für alle anderen aktiven Kanäle 108 erhalten, ansonsten wird die Bühne zu dem nächsten Feld 109 in der aktuellen Vertiefung weiter transportiert. Jedes Objekt von Interesse wird in dem Bild für weitere Analysen 110 lokalisiert. Die Software bestimmt, ob das Objekt die Kriterien für einen gültigen Zellkern 111 aufweisen, durch Messen der morphologischen Eigenschaften (Größe und Form). Für jede gültige Zelle wird die Lokalisierung der XYZ-Bühne gespeichert, ein kleines Bild der Zelle wird gespeichert und die Eigenschaften werden gemessen 112.
Das Zellscanningverfahren der vorliegenden Erfindung kann dazu verwendet werden, mit zellulären Proben viele verschiedene Assays durchzuführen, durch gleichzeitige Anwendung einer Anzahl analytischer Verfahren zur Messung von Eigenschaften bei multiplen Wellenlängen. Ein Beispiel eines solchen Assays stellt die folgende Messung zur Verfügung:

1. Die vollständige Fluoreszenzintensität innerhalb des Zellkerns für die Farben 1-4 2. Der Bereich des Zellkerns für die Farbe 1 (der primäre Marken)
3. Die Form des Zellkerns für Farbe 1 wird durch drei Formeigenschaften beschrieben:
a) Bereich des Umfangs im Quadrat
b) Verhältnis des Kästchenbereichs
c) Verhältnis von Länge zu Breite
4. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität innerhalb des Zellkerns für die Farben 1–4 (d. h. #1 geteilt durch #2)
5. Die vollständige Fluoreszenzintensität des Rings außerhalb des Kerns (vergleiche Figur. 10), die die Fluoreszenz des Cytoplasmas der Zelle darstellt (cytoplasmatische Maske) für die Farben 2–4
6. Der Bereich der cytoplasmatischen Maske
7. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der cytoplasmatischen Maske für die Farben 2–4 (d. h. #5 geteilt durch #6)
B. Das Verhältnis der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der cytoplasmatischen Maske zur durchschnittlichen Fluoreszenzintensität innerhalb des Zellkerns für die Farben 2–4 (d. h. #7 geteilt durch #4)
9. Die Differenz der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der cytoplasmatischen Maske und die durchschnittliche Fluoreszenzintensität innerhalb des Zellkerns für die Farben 2–4 (d. h. #7 minus #4)
10. Die Anzahl fluoreszierender Domänen (auch als Tupfen, Punkte oder Körnchen bezeichnet) innerhalb des Zellkerns für die Farben 2-4

Die Eigenschaften 1 bis 4 sind allgemeine Eigenschaften der verschiedenen Zellscreening-Assays der Erfindung. Diese Schritte werden gewöhnlich in einer Vielzahl von Bildanalyseanwendungen verwendet und sind im Stand der Technik bekannt (Russ (1992) The Image Processing Handbook, CRC Press Inc.; Gonzales et al., (1987), Digital Image Processing. Addison-Wesley Publishing Co., S. 391–448. Die Eigenschaften 5 bis 9 wurden spezifisch entwickelt, um Messungen der fluoreszierenden Moleküle einer Zelle innerhalb des lokalen cytoplasmatischen Bereichs der Zelle und die Translokation (d. h. Bewegung) fluoreszierender Moleküle vom Cytoplasma in den Kern bereitzustellen. Diese Eigenschaften (Schritte 5-9) werden dazu verwendet, Zellen in Mikroplatten hinsichtlich der Hemmung der Kerntranslokation zu analysieren. Die Hemmung der Kerntranslokation von Transkriptionsfaktoren stellt zum Beispiel einen neuen Ansatz für Screening intakter Zellen bereit (ausführliche Beispiele von anderen Screens werden nachstehend bereitgestellt). Ein spezifisches Verfahren misst die Menge an Sonde im Kernbereich (Eigenschaft 4) gegenüber der lokalen cytoplasmatischen Region (Eigenschaft 7) jeder Zelle. Die Quantifizierung des Unterschieds zwischen diesen beiden subzellulären Kompartimenten stellt ein Maß der Translokation von Cytoplasma in den Kern dar (Eigenschaft 9).
Eigenschaft 10 beschreibt einen Screen, der dazu verwendet wird, DNA- oder RNA-Sonden innerhalb der Kernbereiche in den Farben 2-4 zu zählen. Sonden sind zum Beispiel zur Identifizierung chromosomspezifischer DNA-Sequenzen kommerziell erhältlich (Life Technologies, Gaithersburg, MD; Genosys, Woodlands, TX; Biotechnologies, Inc., Richmond, CA; Bio 101, Inc., Vista, CA). Zellen sind in der Natur dreidimensional und wenn sie bei hoher Vergrößerung unter dem Mikroskop untersucht werden, kann eine Sonde im Fokus liegen, während eine andere vollständig aus dem Fokus ist. Das Zellscreeningvertahren der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis dreidimensionaler Sonden in Kernen bereit, durch Gewinnung von Bildern von multiplen fokalen Ebenen. Die Software bewegt den motorischen Z-Achsen-Antrieb 5 (Figur. 1) in kleinen Schritten, wobei die Schrittdistanz durch den Benutzer ausgewählt wird, um einem großen Bereich verschiedener Kerndurchmesser gerecht zu werden. In jedem fokalen Schritt wird ein Bild erhalten. Die maximale Graustufenintensität jedes Pixels in jedem Bild wird ermittelt und in einem resultierenden maximalen Projektionsbild gespeichert. Das maximale Projektionsbild wird dann dazu verwendet, die Sonden zu zählen. Das vorstehende Verfahren funktioniert gut bei der Zählung von Sonden, die nicht direkt über oder unter einer anderen gestapelt sind. Um Sonden gerecht zu werden, die auf anderen Sonden in der Z-Richtung gestapelt sind, können Benutzer eine Option auswählen, bei der Sonden in jeder der erhaltenen fokalen Ebene analysiert werden. Auf diese Weise führt das Scanningsystem das maximale Ebenenprojektionsverfahren durch, wie vorstehend diskutiert, entdeckt in diesem Bild interessierende Sondenbereiche und analys ert diese Bereiche dann in allen fokalen Ebenen weiter.
Nach der Messung der Zelleigenschaften 112 (9) überprüft das System, ob im gegenwärtigen Feld 113 noch unverarbeitete Objekte vorhanden sind. Wenn unverarbeitete Objekte vorhar den sind, lokalisiert es das nächste Objekt 110 und bestimmt, ob es die Kriterien für einen gültigen Zellkern 111 aufweist und misst seine Eigenschaften. Sobald alle Objekte im gegenwärtigen Feld verarbeitet sind, bestimmt das System, ob die Analyse der gegenwärtigen Platte vollständig ist 114; falls nicht, bestimmt es die Notwendigkeit, mehr Zellen in der gegenwärtigen Vertiefung 115 zu finden. Wenn der Bedarf besteht, dann schiebt das System das XYZ-Gestell zum nächsten Feld innerhalb der aktuellen Vertiefung 109 oder schiebt das Gestell zur nächsten Vertiefung 116 der Platte.
Nachdem ein Plattenscan abgeschlossen ist, können die Bilder und die Daten mit den Einrichtungen des Systems zum Bildüberblick, zur Datenansicht und zur Gesamtübersicht durchgegangen werden. Alle Bilder, Daten und Einstellungen eines Scans werden in der Datenbank des Systems archiviert, um später überprüft oder mit einem Netzwerkinformationsmanagementsystem ausgetauscht zu werden. Die Daten können ebenfalls in andere statistische Programme zur tabellarischen Darstellung der Ergebnisse und zur Erzeugung anderer Daten exportiert werden. Der Benutzer kann die Bilder jeder einzelnen Zelle, die vom System analysiert wurde, mit einem interaktiven Bildbearbeitungsverfahren 117 anschauen. C er Benutzer kann Daten auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis mit einer Kombination aus interaktivien Diagrammen, einem Datenblatt gemessener Eigenschaften und Bilder aller Fluoreszenzkanäle einer interessierenden Zelle in der Übersicht 118 anschauen. Es werden Möglichkeiten für das grafische Plotting bereitgestellt, wobei die Daten über interaktive Diagramme wie Histogramme und Steuerplots analysiert werden können. Die Benutzer können zusammenfasende Daten, die für alle Zellen innerhalb jeder Vertiefung einer Platte akku ausreichender Auflösung gelesen werden, um Bestimmungen auf einer Basis von Vertiefung pro Vertiefung durchzuführen. Dies bedeutet, Berechnungen werden durchgeführt, indem ein Durchschnittswert von vielen oder allen Zellen oder der Masse des Materials in jeder Vertiefung ermittelt wird. Vertiefungen, die im HTS eine definierte Antwort aufweisen (die "Treffer"), werden durch das System gekennzeichnet. Dann wird auf der gleichen Mikrotiterplatte oder dem Mikrovertiefungsarray jede Vertiefung, die als Treffer identifiziert wurde, wie vorstehend beschrieben, über HCS gemessen. Somit schließt das Verfahren der dualen Antriebsart ein:

1. Schnelles Messen zahlreicher Vertiefungen einer Mikrotiterplatte oder eines Mikrovertiefungsarrays,
2. Interpretieren der Daten zur Bestimmung der Gesamtaktivität fluoreszierend markierter Rezeptormoleküle in der Zelle auf einer Basis von Vertiefung pro Vertiefung zur Identifizierung von "Treffern" (Vertiefungen, die eine definierte Antwort zeigen),
3. Bildverarbeitung zahlreicher Zellen in jeder "Treffer"-Vertiefung, und
4. Interpretation des digitalen Bilddaten zur Bestimmung der Verteilung, der Umgebung oder der Aktivität der fluoreszierende markierten Rezeptormoleküle in den einzelnen Zellen (d. h. intrazelluläre Messungen) und der Verteilung der Zellen zum Test für spezifische biologische Funktionen

In einer bevorzugten Ausführungsform der Verarbeitung in der dualen Betriebsart (11) gibt der Benutzer zu Beginn des Laufs 301 Informationen 302 ein, die die Platte und ihre Bestandteile beschreibt, spezifiziert die Filtereinstellungen und die Fluoreszenzkanäle, um mit den verwendeten biologischen Markierungen überein zu stimmen, der gewünschten Information und bringt die Kameraeinstellung mit der Probenhelligkeit in Einklang. Dies Parameter werden in der Datenbank des Systems gespeichert, um für jeden automatisierten Lauf leicht erhältlich zu sein. Die Mikrotiterplatte oder der Mikrovertiefungsarray wird in das Zellscreeningsystem 303 entweder manuell oder automatisch durch Kontrolle eines Roboterbeladungsgeräts geladen. Zur Aufrechterhaltung der Temperatur, der Feuchtigkeit und CO₂ Konzentration in der Luft, die die lebenden Zellen in den Mikrotiterplatten oder den Mikrovertiefungsarrays umgibt, wird eine optionale Umgebungskammer 304 durch das System kontrolliert. Eine optionale Flüssigkeitstransportvorrichtung 305 (vgl. 8) wird durch das System kontrolliert, um Flüssigkeiten in die Vertiefungen während des Scans zu verteilen.
Verarbeitung mit hohem Durchsatz 306 wird zunächst auf der Mikrotiterplatte oder in dem Mikrovertiefungsarray durch Gewinnung und Analyse des Signals jeder der Vertiefungen in der Platte durchgeführt. Die Verarbeitung, die in der Betriebsart mit hohem Durchsatz 307 ausreichender Auflösung gelesen werden, um Bestimmungen auf einer Basis von Vertiefung pro Vertiefung durchzuführen. Dies bedeutet, Berechnungen werden durchgeführt, indem ein Durchschnittswert von vielen oder allen Zellen oder der Masse des Materials in jeder Vertiefung ermittelt wird. Vertiefungen, die im HTS eine definierte Antwort aufweisen (die "Treffer"), werden durch das System gekennzeichnet. Dann wird auf der gleichen Mikrotiterplatte oder dem Mikrovertiefungsarray jede Vertiefung, die als Treffer identifiziert wurde, wie vorstehend beschrieben, über HCS gemessen. Somit schließt das Verfahren der dualen Antriebsart ein:

In einer bevorzugten Ausführungsform der Verarbeitung in der dualen Betriebsart (11) gibt der Benutzer zu Beginn des Laufs 301 Informationen 302 ein, die die Platte und ihre Bestandteile beschreibt, spezifiziert die Filtereinstellungen und die Fluoreszenzkanäle, um mit den verwendeten biologischen Markierungen überein zu stimmen, der gewünschten Information und bringt die Kameraeinstellung mit der Probenhelligkeit in Einklang. Dies Parameter werden in der Datenbank des Systems gespeichert, um für jeden automatisierten Lauf leicht erhältlich zu sein. Die Mikrotiterplatte oder der Mikrovertiefungsarray wird in das Zellscreeningsystem 303 entweder manuell oder automatisch durch Kontrolle eines Roboterbeladungsgeräts geladen. Zur Aufrechterhaltung der Temperatur, der Feuchtigkeit und CO₂ Konzentration in der Luft, die die lebenden Zellen in den Mikrotiterplatten oder den Mikrovertiefungsarrays umgibt, wird eine optionale Umgebungskammer 304 durch das System kontrolliert. Eine optionale Flüssigkeitstransportvorrichtung 305 (vgl. 8) wird durch das System kontrolliert, um Flüssigkeiten in die Vertiefungen während des Scans zu verteilen.
Verarbeitung mit hohem Durchsatz 306 wird zunächst auf der Mikrotiterplatte oder in dem Mikrovertiefungsarray durch Gewinnung und Analyse des Signals jeder der Vertiefungen in der Platte durchgeführt. Die Verarbeitung, die in der Betriebsart mit hohem Durchsatz 307 durchgeführt wird, ist in 12 veranschaulicht und nachstehend beschrieben. Vertiefungen, die in dieser Betriebsart mit hohem Durchsatz eine ausgewählte Intensität der Antwort aufweisen ("Treffer") werden durch das System identifiziert. Das System führt eine konditionelle Operation 308 durch, die auf Treffer testet. Wenn Treffer gefunden werden, dann werden jene Vertiefungen mit den spezifischen Treffern weiterhin in der Betriebsart mit hohem Gehalt (Mikrolevel) 309 weiteranalysiert. Die Verarbeitung, die in der Betriebsart mit hohem Gehalt 312 durchgeführt wird, ist in 13 veranschaulicht. Das System aktualisiert dann 310 die Informatikdatenbank 318 mit den Ergebnissen der Messungen der Platte. Wenn weitere Platten 313 analysiert werden sollen, lädt das System die nächste Platte 303; andernfalls endet die Analyse der Platten 314.
Die nachstehende Diskussion beschreibt die in 12 veranschaulichte Betriebsart des hohen Durchsatzes. Die bevorzugte Ausführungsform dieses Systems, das Screeningsystem in der dualen Betriebsart auf einer einzelnen Plattform, wird beschrieben. Fachleute wissen, dass bei dem System mit zwei Plattformen eher die Platte zwischen zwei optischen Systemen als das optische System bewegt wird. Sobald das System aufgebaut wurde und die Platte beladen wurde, beginnt das System mit der HTS-Gewinnung und der Analyse 401. Das optische HTS-Modul wird durch Kontrolle eines motorisierten optischen Positionierungsgeräts 402 auf dem System in der dualen Betriebsart ausgewählt. In einem Fluoreszenzkanal werden Daten von einem primären Macker auf der Platte erhalten 403 und anhand eines Markierungsverfahrens 404 werden Vertiefungen vom Plattenhintergrund isoliert. Bilder werden auch in anderen verwendeten Fluoreszenzkanälen 405 gewonnen. Der Bereich in jedem Bild, der jeder Vertiefung 406 entspricht, wird gemessen 407. Eine Eigenschaft, die aus den Messungen einer spezifischen Vertiefung berechnet wird, wird mit einem vordefinierten Schwellenwert der Intensitätsantwort 408 verglichen und basierend auf dem Ergebnis wird die Vertiefung entweder als Treffer 409 gekennzeichnet oder nicht. Die Lokalisierung der Vertiefungen, die als Treffer gekennzeichnet sind, werden für die nachfolgende Verarbeitung in der Betriebsart mit hohem Gehalt gespeichert. Wenn noch Vertiefungen übrigbleiben, die verarbeitet werden sollen 410, dann geht das Programm zurück 406, bis alle Vertiefungen verarbeitet wurden 411 und das System beendet die Betriebsart mit hohem Durchsatz.
Nach der HTS-Analyse beginnt das System mit der Verarbeitung in der Betriebsart mit hohem Gehalt 501, der in 13 definiert ist. Das System wählt das optische HCS-Modul 502 durch Kontrolle des motorisierten Positionierungssystems aus. Für jede "Treffer"-Vertiefung, die in der Betriebsart mit hohem Durchsatz identifiziert wurde, wird auf die X,Y-Bühnenposition der Vertiefung aus dem Speicher oder einer Diskette zurückgegriffen und die Bühne wird dann zur ausgewählten Bühnenposition 503 bewegt. Der Autofokusvorgang 504 wird durch das erste Feld in jeder Treffervertiefung und dann alle 5 bis 8 Felder innerhalb jeder Vertiefung einmal wiederdurchgeführt. In dem Kanal werden Bilder des primären Markers 505 gewonnen (typischerweise Zellkerne, die mit DAPI-, Hoechst- oder Pl-Fluoreszenzfarbstoff gegengefärbt wurden). Die Bilder werden dann mit einem adaptiven Schwellenwertverfahren 506 segmentiert (getrennt in Bereiche von Kern und Nicht-Kern). Das Ergebnis des Segmentationsverfahrens ist eine binäre Maske, auf der die Objekte weiß und der Hintergrund schwarz sind. Dieses binäre Bild, auch im Stand der Technik als Maske bezeichnet, wird dazu verwendet zu bestimmen, ob das Feld Objekte 507 enthält. Die Maske wird mit einem Blasen (Blob)-Markierungsverfahren markiert, wobei jedes Objekt (oder Blob) eine eigene zugewiesene Nummer besetzt. Wenn im Feld Objekte gefunden werden, werden Bilder für alle anderen aktiven Kanäle 508 gewonnen, wenn nicht, wandert das Gestell weiter zum nächsten Feld 514 in der gegenwärtigen Vertiefung. Jedes Objekt wird in dem Bild lokalisiert für weitere Analyse 509. Morphologische Eigenschaften wie Bereich und Form der Objekte werden dazu verwendet, Objekte auszuwählen, die wahrscheinlich Zellkerne 510 sind und jene, die als Artefakte eingeschätzt werden, zu verwerfen (d. h. nicht weiterzuverarbeifen). Für jeden gültigen Zellkern wird die Position der XYZ-Bühne aufgezeichnet, ein kleines Bild der Zelle wird gespeichert und die testspezifischen Eigenschaften 511 werden gemessen. Das System führt dann mehrere Tests mit den Zellen durch, indem verschiedene analytische Verfahren angewandt werden, um Eigenschaften bei jeder der verschiedenen Wellenlängen zu messen. Nach Messung der Zelleigenschaften überprüft das System, ob im aktuellen Feld 512 unverarbeitete Objekte vorhanden sind. Wenn diese vorhanden sind, lokalisiert es das nächste Objekt 509 und bestimmt, ob es den Kriterien für einen gültigen Zellkern 510 gerecht wird und misst seine Eigenschaften. Nach Verarbeitung aller Objekte im aktuellen Feld bestimmt das System, ob es in der aktuellen Vertiefung 513 mehr Zellen oder Felder finden muss. Wenn es mehr Zellen oder Felder in der gegenwärtigen Vertiefung finden muss, dann bewegt das System die XYZ-Bühne zum nächsten Feld innerhalb der gegenwärtigen Vertiefung 515. Anderenfalls überprüft das System, ob noch weitere Treffervertiefungen 515 gemessen werden müssen. Falls ja, dann schreitet das System zur Vertiefung 503 mit dem nächsten Treffer und durchläuft einen weiteren Zyklus der Datengewinnung und der Analyse, anderenfalls wird die HCS-Betriebsart 516 beendet.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum kinetischen Screening lebender Zellen bereitgestellt. Die zuvor beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung werden dazu verwendet, die räumliche Verteilung zellulärer Bestandteile zu einem bestimmten Zeitpunkt, dem Zeitpunkt der chemischen Fixierung, zu charakterisieren. Als solche haben diese Ausführungsformen nur beschränkte Anwendbarkeit zur Implementierung von Screens, die auf Kinetik basieren, aufgrund der sequentiellen Art der Bildgewinnung und der Menge an Zeit, die benötigt wird, um alle Vertiefungen auf der Platte zu lesen. Da zum Beispiel zum Lesen aller Vertiefungen 30 bis 60 Minuten erforderlich sein können, können durch einfache Präparation einer Platte lebender Zellen und nachfolgendem mehrmaligem Lesen aller Vertiefungen nur sehr langsame kinetische Vorgänge gemessen werden. Schnellere kinetische Vorgänge können gemessen werden, indem jede Vertiefung mehrfach gelesen wird, bevor man zur nächsten Vertiefung fortschreitet, aber die verstrichene Zeit zwischen der ersten und der letzten Vertiefung wäre zu lang und schnelle kinetische Prozesse wären wahrscheinlich zuende, bevor man die letzte Vertiefung erreicht.
Die Erweiterung der Erfindung zur Erfassung der Kinetik lebender Zellen ermöglicht den Aufbau und die Verwendung von Screens, durch die ein biologischer Vorgang anstelle von oder zusätzlich zu räumlichen Charakteristika durch seine Kinetik charakterisiert wird. In vielen Fällen kann die Reaktion in lebenden Zellen dadurch gemessen werden, dass ein Reagens zu einer spezifischen Vertiefung gegeben wird und in geeigneten Zeiträumen multiple Messungen von diesen Zellen gemacht werden. Diese Ausführungsform der dynamischen lebenden Zelle der Erfindung beinhaltet daher eine Vorrichtung zum Flüssigkeitstransport in einzelne Vertiefungen des Systems, um in jede Vertiefung zu einem spezifischen Zeitpunkt vor dem Lesevorgang der Vertiefung Reagenzien zu transportieren. Diese Ausführungsform ermöglicht daher kinetische Messungen mit einer zeitlichen Auflösung von Sekunden bis Minuten in jeder Vertiefung der Platte. Zur Verbesserung der Gesamteffizienz des Systems dynamischer lebender Zellen wird das Kontrollprogramm zur Gewinnung von Daten modifiziert, um eine repetitive Datengewinnung von Unterbereichen der Platte zu ermöglichen, wodurch das System zwischen den Zeitpunkten, die für eine einzelne Vertiefung nötig sind, andere Vertiefungen lesen kann.
8 beschreibt ein Beispiel einer Flüssigkeitstransportvorrichtung, die mit der erfindungsgemäßen Ausführungsform für lebende Zellen verwendet werden kann und die vorstehend beschrieben wurde. Mit diesem Aufbau können über einen Satz von Pipettenspitzen 705 oder auch über eine einzelne Pipettenspitze Reagenzien in alle Vertiefungen der Platte transportiert werden. Die Bank von Spritzenpumpen 701 kann verwendet werden, um Flüssigkeiten gleichzeitig in 12 Vertiefungen zu transportieren oder auch in weniger Vertiefungen, indem einige der Spitzen 705 entfernt werden. Diese zeitliche Auflösung des Systems kann daher, ohne zu Lasten der Datengewinnung zu gehen, angepasst werden, indem die Anzahl der Spitzen und das Muster des Scannings wie folgt ausgewechselt werden. Typischerweise erfordert die Datengewinnung und die Analyse einer einzelnen Vertiefung etwa 5 Sekunden. Die Bewegung von Vertiefung zu Vertiefung unter Fokussieren in einer Vertiefung erfordert etwa 5 Sekunden, so dass die Gesamtzykluszeit für eine Vertiefung etwa 10 Sekunden beträgt. Wenn daher eine einzelne Pipettenspitze dazu verwendet wird, Flüssigkeit in eine einzelne Vertiefung zu transportieren und Daten repetitiv aus dieser Vertiefung gewonnen werden, dann können die Messungen mit einer zeitlichen Auslösung von etwa 5 Sekunden durchgeführt werden. Wenn 6 Pipettenspitzen dazu verwendet werden, Flüssigkeit gleichzeitig in 6 Vertiefungen zu transportieren und das System repetitiv alle 6 Vertiefungen scannt, wird jeder Scan 60 Sekunden erfordern, wodurch die zeitliche Auflösung etabliert wird. Für langsamere Vorgänge, bei denen nur alle 8 Minuten Daten gewonnen werden müssen, können Flüssigkeiten auf eine Hälfte der Platte transportiert werden, indem die Platte während der Flüssigkeitstransportphase bewegt wird und dann kann diese Hälfte der Platte repetitiv gescannt werden. Durch Anpassung der Größe der Unterbereiche, die auf der Platte gescannt werden, kann daher die zeitliche Auflösung angepasst werden, ohne zwischen den Datengewinnungsbereichen Wartezeiten einbauen zu müssen. Da das System kontinuierlich scannt und Daten gewinnt, ist die gesamt Zeit, die notwendig ist, einen kinetischen Datensatz von der Platte zu gewinnen, genauso lang wie die Zeit, die für einen einzelnen Scan der Platte erforderlich ist, multipliziert mit der Zahl der erforderlichen Zeitpunkte. Typischerweise sollte 1 Zeitpunkt vor der Zugabe der Verbindungen und 2 oder 3 Zeitpunkte nach Zugabe ausreichend sein für Zwecke des Screenings.
14 zeigt den Aufbau der Datengewinnung, der für kinetische Analysen verwendet wird. Der Beginn der Verarbeitung 801 ist die Konfiguration des Systems, die größtenteils identisch zur Standard-HCS-Konfiguration ist. zusätzlich muss der Benutzer Informationen eingeben, die spezifisch für die durchzuführende kinetische Analyse 802 sind, wie die Größe des Unterbereichs, die Anzahl der erforderlichen Zeitpunkte und die erforderliche Steigerung der Zeit. Ein Unterbereich ist eine Gruppe von Vertiefungen, die repetitiv gescannt wird, um kinetische Daten zu gewinnen. Die Größe des Unterbereichs wird angepasst, so dass das System während einer einzelnen Zeitspanne einen gesamten Unterbereich scannen kann, wodurch Wartezeiten minimiert werden. Die optimale Größe des Unterbereichs wird aus den Einstellungsparametern berechnet und falls nötig durch den Benutzer angepasst. Das System bewegt die Platte dann zum ersten Unterbereich 803 und zur ersten Vertiefung in diesem Unterbereich 804 zur Gewinnung der Vorstimulierungszeitpunkte (Zeit = 0). Der Ablauf der Datengewinnung, die in jeder Vertiefung durchgeführt wird, entspricht genau einem spezifischen HCS, das in der kinetischen Betriebsart läuft. 15 erläutert ein Flussdiagramm für diese Verarbeitung. Alle Schritte zwischen dem Start 901 und der Rückkehr 902 sind identisch mit den in 13 beschriebenen Schritten 504 bis 514.
Nach der Verarbeitung jeder Vertiefung in einem Unterbereich kontrolliert das erfindungsgemäß verwendete System, ob alle Vertiefungen im Unterbereich verarbeitet wurden 806 (14) und wandert über alle Vertiefungen, bis der gesamte Bereich verarbeitet wurde. Das System bringt die Platte dann in Position für die Flüssigkeitszugabe und kontrolliert den Flüssigkeitssystemtransport von Flüssigkeiten zum vollständigen Unterbereich 807. Dies kann mehrere Zugaben für Unterbereiche erfordern, die einige Reihen auf der Platte umfassen, wobei das System die Platte zwischen den Zugaben auf der X,Y-Bühne bewegt. Sobald die Flüssigkeiten zugegeben wurden, bewegt sich das System zur ersten Vertiefung im Unterbereich 808, um die Datengewinnung von Zeitpunkten zu beginnen. Daten werden von jeder Vertiefung 809 gewonnen, bevor das System durch alle Vertiefungen im Unterbereich 810 wandert. Nach jedem Durchgang durch den Unterbereich kontrolliert das System, ob alle Zeitpunkte 811 gemessen wurden, und wenn nicht, legt es eine Pause 813 ein, um, wenn nötig 812, mit dem erforderlichen Zeitschritt synchronisiert zu bleiben. Andernfalls überprüft das System zusätzliche Unterbereiche auf der Platte 814 und bewegt sich entweder zum nächsten Unterbereich 803 fort oder beendet den Vorgang 815. Somit umfasst die Betriebsart der kinetischen Analyse die Identifizierung von Unterbereichen aus der Mikrotiterplatte oder den zu untersuchenden Mikrovertiefungen durch den Benutzer, basierend auf der zu untersuchenden kinetischen Reaktion, wobei Daten innerhalb eines Unterbereichs gewonnen werden, bevor Daten in einem nachfolgenden Unterbereich gewonnen werden.
Spezifische Screens
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Zellscreeningverfahren und maschinenlesbares Speichermedium, umfassend ein Programm, das einen Satz von Anweisungen enthält, durch die ein Zellscreeningsystem Abläufe zur Definition und Verteilung und Aktivität spezifischer zellulärer Bestandteile und Vorgänge ausführt, zur Verfügung gestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Zellscreeningsystem ein fluoreszenzoptisches System mit hoher Vergrößerung, mit einer Bühne, die zum Halten von Zellen angepasst ist und eine Vorrichtung zum Bewegen der Bühne, eine Digitalkamera, eine Lichtquelle zum Erhalt und zur Verarbeitung der digitalen Daten von der Digitalkamera und einen Computer zum Erhalt und zur Verarbeitung der digitalen Daten von der Digitalkamera. Dieser Aspekt der Erfindung umfasst Programme, die das Zellscreeningsystem anleiten, die Verteilung und Aktivität spezifischer zellulärer Bestandteile und Prozesse unter Verwendung der lumineszierenden Sonden, dem optischen bildgebenden System und der Mustererkennungssoftware der Erfindung zu definieren. Bevorzugte Ausführungsformen des maschinenlesbaren Speichermediums umfassen Programme, die aus einem Satz von Instruktionen bestehen, durch die ein Zellscreeningsystem veranlasst wird, die in den Figur. 9, 11, 12, 13, 14 oder 15 dargestellten Vorgänge auszuführen. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfasst ein Programm, das aus einem Satz von Instruktionen besteht, die dazu führen, dass ein Zellscreeningsystem Vorgänge zum Nachweis der Verteilung und der Aktivität spezifischer zellulärer Bestandteile und Verfahren ausführt. In den meisten bevorzugten Ausführungsformen schließen die zellulären Vorgänge die Kerntranslokation eines Proteins, zellulärer Morphologie, Apoptose, Rezeptorinternalisierung und Protease-induzierte Translokation eines Proteins ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellscreeningverfahren verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die verschiedene zelluläre Prozesse modifizieren. Die Zellen können mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden und die Wirkung der Testverbindung auf einen zellulären Prozess kann analysiert werden. Alternativ kann die Zelle mit einer Testverbindung und einem bekannten Mittel, das den bestimmten zellulären Prozess modifiziert, in Kontakt gebracht werden, um zu bestimmen, ob die Testverbindung die Wirkung des bekannten Mittels inhibieren oder verstärken kann. Somit können die Verfahren verwendet werden, um Testverbindungen zu identifizieren, die eine bestimmte zelluläre Antwort verstärken oder verringern, genauso, um eine Testverbindung zu identifizieren, die die Fähigkeit von anderen Mitteln, eine bestimmte zelluläre Antwort zu verstärken oder zu verringern, beeinflusst. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Orte, die die Zellen enthalten, analysiert, unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren bei geringer Auflösung in einem System mit einer Betriebsart mit hohem Durchsatz und nur eine Untergruppe der Orte, die Zellen enthalten, werden analysiert in der Betriebsart mit hohem Inhalt, um Lumineszenzsignale von den lumineszenzmarkierten Reportermolekülen in subzellulären Kompartimenten der zu analysierenden Zellen zu erhalten.
Die nachstehenden Beispiele dienen lediglich der Beschreibung und beschränken nicht den Schutzumfang der Endung, der in den beigefügten Ansprüchen definiert wird. Die verschiedenen chemischen Verbindungen, Reagenzien, Farbstoffe und Antikörper, auf die in den nachstehenden Beispielen Bezug genommen wird, sind erhältlich von Quellen wie Sigma Chemical (St. Louis, MO), Molecular Probes (Eugene, OR), Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Accurate Chemical Company (Westbury, NY), Jackson Immunolabs und Clontech (Palo Alto, CA).
Beispiel 1 Screening der Translokation vom Cytoplasma zum Kern:
a. Transkripfionsfaktoren
Die Regulation der Transkription von einigen Genen schließt die Aktivierung eines Transkriptionsfaktors im Cytoplasma ein, was darin resultiert, dass der Faktor in den Kern transportiert wird, wo er die Transkription von einem bestimmten Gen oder von Genen initiieren kann. Diese Veränderung in der Transkriptionsfaktorverteilung ist die Basis für einen Screen für das zellbasierte Screeningsystem, um Verbindungen nachzuweisen, die Transkription eines bestimmten Gens oder einer Gruppe von Genen inhibieren oder induzieren. Es wird eine generelle Beschreibung des Screens gegeben, gefolgt von einem spezifischen Beispiel.
Die Verteilung des Transkriptionsfaktors wird bestimmt durch Markieren des Kerns mit einer DNA-spezifischen Fluorophore wie Hoechst 33423 und des Transkriptionsfaktors mit einem spezifischen fluoreszierenden Antikörper. Nach Autofokussierung auf den Hoechst-markierten Kern wird ein Bild des Kerns in dem zellbasierten Screeningsystem erworben und verwendet, um eine Maske durch eine oder verschiedene optionale Schwellenwertverfahren, wie oben beschrieben, zu erstellen. Die morphologischen Deskriptoren der Regionen, die durch die Maske definiert werden, werden verglichen mit den benutzerdefinierten Parametern und gültige Kernmasken werden identifiziert und mit dem folgenden Verfahren verwendet, um Transkriptionsfaktorverteilungen zu extrahieren. Jede gültige Kernmaske wird erodiert, um eine leicht kleinere Kernregion zu definieren. Die durchschnittliche Antikörperfluoreszenz in jeder dieser zwei Regionen wird bestimmt und der Unterschied zwischen diesen Durchschnittswerten wird definiert als die NucCyt-Differenz. Zwei Beispiele der Bestimmung von Kerntranslokationen sind nachstehend diskutiert und in 10A-J dargestellt. 10A veranschaulicht eine unstimulierte Zelle mit ihrem Kern 200, markiert mit einer blauen Fluorophore und einen Transkriptionsfaktor in dem Cytoplasma 201, markiert mit einer grünen Fluorophore. 10B veranschaulicht die Kernmaske 202, abgeleitet von dem zellbasierten Screeningsystem. 10C veranschaulicht das Cytoplasma 203 der unstimulierten Zelle, abgebildet bei einer grünen Wellenlänge. 10D veranschaulicht die erodierte (reduzierte) Kernmaske 202, um eine Kernprobenregion 204 mit minimaler cytoplasmatischer Verteilung zu definieren. Die Kerngrenze 202 ist mehrfach gedehnt (erweitert), um einen Ring zu bilden, der 2 bis 3 Pixel breit ist, der verwendet wird, um die cytoplasmatische Probenregion 205 für die gleiche Zelle zu definieren. 10E veranschaulicht weiterhin eine Seitenansicht, die die Kernprobenregion 204 und die cytoplasmatische Probenregion 205 zeigt. Daten der Kerntranslokation können unter Verwendung dieser zwei Probenregionen automatisch analysiert werden durch das zellbasierte Screeningsystem auf einer Zelle-für-Zelle-Basis. 10F-J veranschaulicht die Strategie zur Bestimmung der Kerntranslokation in einer stimulierten Zelle. 10F veranschaulicht eine stimulierte Zelle mit ihrem Kern 206, markiert mit einer blauen Fluorophore und einem Transkriptionsfaktor, in dem Cytoplasma 207 markiert mit einer grünen Fluorophore. Die Kernmaske 208 in 10G ist abgeleitet von dem zellbasierten Screeningsystem. 10H veranschaulicht das Cytoplasma 209 einer stimulierten Zelle, abgebildet bei einer grünen Wellenlänge.
Figur 101 veranschaulicht die Kernprobenregion 211 und eine cytoplasmatische Probenregion 212 der stimulierten Zelle. 10J veranschaulicht weiterhin eine Seitenansicht, die die Kernprobenregion 211 und die cytoplasmatische Probenregion 212 zeigt.
Eine spezifische Anwendung dieses Verfahrens wurde verwendet, um dieses Verfahren als einen Screen zu validieren. Eine humane Zelllinie wurde in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen plattiert. Einige Reihen der Vertiefungen wurden mit IL-1, einem bekannten Induktor des NF-κB-Transkriptionsfaktors, titriert. Die Zellen wurden dann fixiert und durch Standardverfahren mit einem fluoresceinmarkierten Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor und Hoechst 33423 gefärbt. Das zellbasierte Screeningsystem wurde verwendet, um Bilder von dieser Platte zu erhalten und zu analysieren und man fand, dass die NucCyt-Differenz stark mit der Menge des zugegebenen Agonisten in den Vertiefungen korrelierte, wie in Figur. 16 dargestellt. In einem zweiten Experiment wurde ein Antagonist gegen den Rezeptor für IL-1, IL-1RA titriert, in der Anwesenheit von 1L-1α, was stufenweise die Translokation, die durch IL-1α induziert wurde, inhibierte. Man fand, dass die NucCyt-Differenz stark mit dieser Inhibierung der Translokation korrelierte, wie dargestellt in 17.
Zusätzliche Experimente haben gezeigt, dass die NucCyt-Differenz genauso wie das Nuc-Cyt-Verhältnis übereinstimmende Ergebnisse über einen zweiten Bereich von Zelldichten und Reagenzkonzentrationen ergeben und somit routinemäßig verwendet werden können, um eine Verbindungsbibliothek auf spezifische Kerntranslokationsaktivität zu screenen. Weiterhin kann das gleiche Verfahren verwendet werden mit Antikörpern gegen andere Transkriptionsfaktoren oder GFP-Transkriptionsfaktorchimären oder fluoreszenzmarkierte Transkriptionsfaktoren, die in lebende fixierte Zellen eingeführt wurden, um auf Wirkungen auf die Regulation von Transkriptionsfaktoraktivität zu screenen.
18 ist eine repräsentative Bildschirmanzeige auf einem PC-Bildschirm von Daten, die in Übereinstimmung mit Beispiel 1 erhalten wurden. Diagramm 1 180 zeigt die Differenz zwischen der durchschnittlichen Antikörperfluoreszenz in der Kernprobenregion und cytoplasmatischen Probenregion, NucCyt-Differenz gegen Vertiefung #. Diagramm 2 181 zeigt die durchschnittliche Fluoreszenz des Antikörpers in der Kernprobenregion NP1-Durchschnitt gegen die Vertiefung #. Diagramm 3 182 zeigt die durchschnittliche Antikörperfluoreszenz in der cytoplasmatischen Probenregion, LIP1-Durchschnitt gegen Vertiefung #. Die Software erlaubt die Anzeige von Daten von jeder Zelle. Beispielsweise zeigt 18 eine Bildschirmanzeige 183, das Kernbild 184 und das fluoreszierende Antikörperbild 185 für Zelle # 26.
Die NucCyt-Differenz, auf die in Diagramm 1 180 aus 18 Bezug genommen wird, ist die Differenz zwischen der durchschnittlichen cytoplasmatischen Sondenintensität (fluoreszierendes Reportermolekül) und der durchschnittlichen Kernprobenintensität (fluoreszierendes Reportermolekül). Der NP1-Durchschnitt, auf den in Diagramm 2 181 aus 18 Bezug genommen wird, ist die durchschnittliche cytoplasmatische Sondenintensität (fluoreszierendes Reportermolekül) in der Kernprobenregion. Der L1P1-Durchschnitt, auf den in Diagramm 3 182 aus 18 Bezug genommen wird, ist die durchschnittliche Sondenintensität (fluoreszierendes Reportermolekül) in der cytoplasmatischen Probenregion.
Der Fachmann weiß, dass dieser Aspekt der Erfindung unter Verwendung anderer Transkriptionsfaktoren durchgeführt werden kann, die aus dem Cytoplasma in den Kern nach Aktivierung translozieren. In einem weiteren spezifischen Beispiel wurde die Aktivierung des c-fos-Transkriptionsfaktors durch Definieren seiner räumlichen Position in der Zelle bestimmt. Aktivierter c-fos wurde nur im Kern gefunden, wohingegen inaktivierter c-fos im Cytoplasma vorlag.
3T3-Zellen wurden mit 5000–10000 Zellen pro Vertiefung in eine Polyfiltronics 96-Vertiefungsplatte plattiert. Es wurde den Zellen ermöglicht anzuheften und über Nacht zu wachsen. Die Zellen wurden zweifach mit 100 μL serumfreien Medium gespült, inkubiert für 24–30 Stunden in serumfreien MEM-Kulturmedium und dann stimuliert mit Blutplättchen-abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF-BB) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), direkt verdünnt in serumfreies Medium bei Konzentrationen im Bereich von 1 bis 50 ng/ml für eine durchschnittliche Zeit von 20 Minuten.
Nach Stimulation wurden die Zellen für 20 Minuten in 3,7% Formaldehydlösung in 1X Hanks gepufferte Salinelösung (HBSS) fixiert. Nach der Fixierung wurden die Zellen mit HBSS gewaschen, um restliches Fixativ zu entfernen, für 90 Sekunden mit 0,5% Triton X-100-Lösung in HBSS permeabilisiert und zweifach mit HBSS gewaschen, um restliches Detergens zu entfernen. Die Zellen wurden dann für 15 Minuten mit einer 0,1%-igen Lösung von BSA in HBSS blockiert und weiterhin mit HBSS gewaschen, vor dem Zusatz von verdünnter primärer Antikörperlösung.
c-Fos Kaninchen-polyclononaler Antikörper (Calbiochem, PC05) wurde 1 : 50 in HBSS verdünnt und 50 μl der Lösung wurden in jede Vertiefung gegeben. Zellen wurden in Anwesenheit des primären Antikörpers für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann für eine Stunde bei Raumtemperatur in einem lichtdichten Behälter mit Ziegen-Antikaninchen sekundärem Antikörper konjugiert, an ALEXA^TM 488 (Molecular Probes) inkubiert, verdünnt 1 : 500 aus einem 100 mg/ml Stock in HBSS. Hoechst DNA Farbstoff (Molecular Probes) wurde dann zugegeben in einer Verdünnung von 1 : 1000 der Herstellerstocklösung (10 mg/ml). Die Zellen wurden dann mit HBSS gewaschen und die Platte wurde vor der Analyse mit dem erfindungsgemäßen Zellscreeningsystem verschlossen. Die Daten aus diesen Experimenten zeigten, dass die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, um transkriptionelle Aktivierung von c-fos durch seine räumliche Position in Zellen zu messen.
Der Fachmann weiß, dass obwohl das folgende Verfahren auf den Nachweis von c-fos-Aktivierung angewendet wird, es auf die Analyse von jedem Transkriptionsfaktor der aus dem Cytoplasma in den Kern nach Aktivierung transloziert angewendet werden kann. Beispiele von solchen Transkriptionsfaktoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, fos- und jun-Homologe-, NF-κB- (Kernfaktor kappa aus B-Zellen), NFAT- (Kernfaktor von aktivierten T-Lymphozyten), und STATs (Signaltransduktor und Aktivator der Transkription)-Faktoren (zum Beispiel vgl. Strehlow, I., und Schindler, C. 1998, J. Biol. Chem. 273: 28049–28056; Chow et al. 1997 Science 278: 1638–1641; Ding et al. 1998 J. Biol. Chem. 273: 28897–28905; Baldwin, 1996. Annu Rev Immunol. 14: 649–83; Kuo, C. T. und J. M. Leiden. 1999. Annu Rev Immunol. 17: 149–87; Rao et al. 1997. Annu Rev Immunol. 15: 707–47; Masuda et al. 1998. Cell Signal. 10: 599–611; Hoey, T., und U. Schindler. 1998. Curr Opin Genet Dev. 8: 582–7; Liu et al. 1998. Curr Opin Immuol. 10: 271–8.)
Somit werden in diesem Aspekt der Erfindung Indikatorzellen mit Testverbindungen behandelt und die Verteilung von lumineszenzmarkiertem Transkriptionsfaktor wird in Raum und Zeit gemessen, unter Verwendung eines Zellscreeningsystems wie das, was vorstehend offenbart wurde. Der lumineszenzmarkierte Transkriptionsfaktor kann exprimiert werden von oder zugegeben werden zu den Zellen, entweder vor, zusammen, mit oder nach Kontaktieren der Zellen mit einer Testverbindung.
Der Transkriptionsfaktor kann zum Beispiel als eine lumineszenzmarkierte Proteinchimäre durch transfizierte Indikatorzellen exprimiert werden. Alternativ kann der lumineszenzmarkierte Transkriptionsfaktor exprimiert werden, isoliert und zum größten Teil in Indikatorzellen gebracht werden, wie vorstehend beschrieben oder der Transkriptionsfaktor kann lumineszenzmarkiert werden nach der Isolierung. In einer weiteren Alternative wird der Transkriptionsfaktor von der Indikatorzelle exprimiert, die anschließend mit einer lumineszierenden Markierung in Kontakt gebracht wird, wie zum Beispiel ein Antikörper, der den Transkriptionsfaktor nachweist.
In einem weiteren Aspekt werden Kits zur Analyse der Transkriptionsfaktoraktivierung zur Verfügung gestellt, umfassend einen Antikörper, der spezifisch einen Transkriptionsfaktor von Interesse erkennt, und Instruktionen zur Verwendung des Antikörpers zur Durchführung der vorstehend beschriebenen Verfahren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Transkriptionsfaktor-spezifische Antikörper oder ein sekundärer Antikörper, der den Transkriptionsfaktorantikörper nachweist, lumineszenzmarkiert. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen enthält der Kit Zellen, die den Transkriptionsfaktor von Interesse exprimieren und/oder der Kit enthält eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie die Aktivierung des Transkriptionsfaktors von Interesse modifiziert, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und Serum, die beide fos-Aktivierung modifizieren; und Interleukin 1 (IL-1) und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), die beide NFκB Aktivierung modifizieren.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Kit einen rekombinanten Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure, die einen Transkriptionsfaktor von Interesse kodiert, umfasst, der von dem Cytoplasma in den Kern nach Aktivierung transloziert und Instruktionen zur Verwendung des Expressionsvektors zu Identifizierung von Verbindungen, die Transkriptionsfaktoraktivierung in einer Zelle von Interesse modifizieren. Alternativ enthalten die Kits gereinigten, lumineszenzmarkierten Transkriptionsfaktor. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Transkriptionsfaktor als ein Fusionsprotein mit einem Lumineszenzprotein exprimiert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf grün fluoreszierendes Protein, Luceriferase oder Mutanten oder Fragmente davon. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen enthält der Kit weiterhin Zellen, die mit dem Expressionsvektor transfiziert sind, einen Antikörper oder Fragment, das spezifisch an den Transkriptionsfaktor von Interesse bindet und/oder eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie die Aktivierung des Transkriptionsfaktors von Interesse (wie oben) modifiziert.
b. Proteinkinasen
Die Cytoplasma-zum-Kern-Screeningverfahren können auch dazu verwendet werden, die Aktivierung jeder Proteinkinase, die in einem inaktiven Status in dem Cytoplasma anwesend ist und in den Kern nach Aktivierung transportiert wird, oder die ein Substrat phosphoryliert, das von dem Cytoplasma in den Kern nach Phosphorylierung transloziert wird, zu analysieren. Beispiele geeigneter Proteinasen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, extrazelluläre signalregulierte Proteinkinasen (ERKs), c-Jun Amino-terminale Kinasen (JNKs), Fos-regulierende Proteinkinasen (FRKs), p38 Mitogen-aktivierte Proteinkinase (p38MAPK), Proteinkinase A (PKA) und Mitogen-aktivierte Proteinkinasekinasen (MAPKKs). (Für Bei spiele vergleiche Hall et al. 1999. J. Biol. Chem. 274: 376–83; Han, et al. 1995. Biochim. Biophys. Acta. 1265: 224–227; Jaaro et al. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 3742–3747; Taylor, et al. 1994. J. Biol. Chem. 269: 308–318; Zhao, Q., und F. S. Lee, 1999, J. Biol. Chem. 274: 8355–8; Paolillo et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 6546–52; Coso et al., 1995, Cell 81-1137-1146; Tibbles, L. A., und J. R. Woodgett, 1999, Cell Mol Life Sci. 55: 1230–54; Schaeffer, H. J., und M. J. Weber, 1999, Mol. Cell Biol. 19: 2435–44)
Alternativ wird Proteinkinaseaktivität bestimmt durch Beobachten der Translokation von einem lumineszenmarkierten Proteinkinasesubstrat aus dem Cytoplasma in den Kern nach Phosphorylierung durch die Proteinkinase von Interesse. In dieser Ausführungsform ist das Substrat nicht phosphoryliert und cytoplasmatisch vor der Phosphorylierung und wird in den Kern transloziert nach Phosphorylierung durch die Proteinkinase. In dieser Ausführungsform besteht keine Notwendigkeit, dass die Proteinkinase selbst aus dem Cytoplasma in den Kern transloziert wird. Beispiele solcher Substrate (und der korrespondierenden Proteinkinasen) schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, c-jun (JNK-Substrat); fos (FRK-Substrat) und p38 (p38MAPK-Substrat).
Somit werden in diesen Ausführungsformen Indikatorzellen mit Testverbindungen behandelt und die Verteilung von lumineszenzmarkierter Proteinkinase oder Proteinkinasesubstrat wird in Raum und Zeit gemessen, unter Verwendung eines Zellscreeningsystems, wie das, das vorstehend offenbart wurde. Die lumineszenzmarkierte Proteinkinase oder das Proteinkinasesubstrat können exprimiert werden von oder zugegeben werden zu den Zellen, entweder vor, zusammen, mit oder nach In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Testverbindung. Die Proteinkinase oder das Proteinkinasesubstrat können zum Beispiel als eine lumineszenzmarkierte Proteinchimäre von transfizierten Indikatorzellen exprimiert werden. Alternativ kann die lumineszenzmarkierte Proteinkinase oder das Proteinkinasesubstrat exprimiert werden, isoliert und insgesamt in Indikatorzellen gebracht werden, wie vorstehend beschrieben, oder die Proteinkinase oder das Proteinkinasesubstrat können lumineszenzmarkiert werden nach Isolierung. Als eine weitere Alternative wird die Proteinkinase oder das Proteinkinasesubstrat von der Indikatorzelle exprimiert, die anschließend mit einer lumineszierenden Markierung in Kontakt gebracht wird, wie einem markierten Antikörper, der die Proteinkinase oder das Proteinkinasesubstrat nachweist.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Proteinkinaseaktivität bestimmt durch Beobachten des Phosphorylierungsstatus (d. h.: phosphoryliert oder nicht phosphoryliert) eines Proteinkinasesubstrats. In dieser Ausführungsform besteht keine Notwendigkeit, dass entweder die Proteinkinase oder das Proteinkinasesubstrat aus dem Cytoplasma in den Kern nach Aktivierung transloziert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Phosphorylierungsstatus beobachtet durch In-Kontakt-Bringen der Zellen mit einem Antikörper, der nur die phosphorylierte Form des Proteinkinasesubstrats von Interesse bindet (zum Beispiel wie offenbart in US-Patent Nr. 5,599,681).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Biosensor der Phosphorylierung verwendet. Beispielsweise kann ein lumineszierend markiertes Protein oder Fragment davon an ein Protein fusioniert werden, das konstruiert wurde, um zu enthalten (a) eine Phosphorylierungsstelle, die durch eine Proteinkinase von Interesse erkannt wird; und (b) ein Kernlokalisierungssignal, das von der Phc sphorylierung unmaskiert ist. Solch ein Biosensor wird somit in den Kern nach Phosphory ierung transloziert und seine Translokation kann verwendet werden als ein Maß der Protein cinaseaktivierung.
In einem weiteren Aspekt werden Kits zur Analyse der Proteinkinaseaktivierung zur Verfügung gestellt, umfassend einen primären Antikörper, der spezifisch an eine Proteinkinase, ein Proteinkinasesubstrat oder eine phosphorylierte Form des Proteinkinasesubstrats von Interesse bindet und Instruktionen zur Verwendung des primären Antikörpers zur Identifizierung von Verbindung, die Proteink naseaktivierung in einer Zelle von Interesse modifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der primäre Antikörper oder ein sekundärer Antikörper, der den primären Antikörper nachweist, lumineszenzmarkiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit weiterhin Zellen, die die Proteinkinase von Interesse und/oder eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie die Aktivierung der Proteinkinase von Interesse modifiziert, umfasst, einschließlich, jedoch nicht beschränkend auf, Dibutyryl-cAMP (modifiziert PKA), Forskolin (PKA) und Anisomycin (p38MAPK).
Alternativ umfassen die Kits einem Expressionsvektor, der eine Proteinkinase oder ein Proteinkinasesubstrat von Interesse, das aus dem Cytoplasma in den Kern nach Aktivierung transloziert, kodiert und Instruktionen zur Verwendung des Expressionsvektors zur Identifizierung von Verbindungen, die Proteinkinaseaktivierung in einer Zelle von Interesse modifizieren. Alternativ enthalten die Kits eine gereinigte, lumineszierend markierte Proteinkinase oder Proteinkinasesubstrat. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Proteinkinase oder das Proteinkinasesubstrat Ion Interesse als ein Fusionsprotein mit einem Lumineszenzprotein exprimiert. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Kit weiterhin Zellen, die mit dem Expressionsvektor, einem Antikörper oder Fragment davon, das spezifisch an die Proteinkinase oder das Proteinkinasesubstrat von Interesse bindet und/oder eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie die Aktivierung der Proteinkinase von Interesse modifiziert, umfasst (siehe vorstehend).
In einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein maschinenlesbares Speichermedium, umfassend ein Programm, enthaltend einen Satz von Instruktionen, die ein Zellscreeningsystem dazu veranlassen, die Verfahren, die zur Analyse der Transkriptionsfaktor- oder Proteinkinaseaktivierung offenbart sind, auszuführen, wobei das Zellscreeningsystem ein optisches System mit einer Bühne umfasst, die zum Halten einer Platte, die Zellen enthält, angepasst ist, eine digitale Kamera, eine Vorrichtung zur Steuerung der Fluoreszenz oder Lumineszenz, die von den Zellen emittiert wird zur digitalen Kamera und eine Computervorrichtung zum Empfangen und Prozessieren der digitalen Daten von der digitalen Kamera.
Beispiel 2 Automatisierter Screen für Verbindungen, die zelluläre Morphologie modifizieren
Veränderungen der Zellgröße sind mit einer Anzahl von zellulären Bedingungen assoziiert, wie Hypertrophie, Zellanheftung und -verbreitung, Differenzierung, Wachstum und Teilung, nekrotischer und programmierter Zelltod, Zellbewegung, Morphogenese, Röhrenbildung und Koloniebildung.
Zelluläre Hypertrophie wurde beispielsweise mit einer Kaskade von Veränderungen in der Genexpression in Verbindung gebracht und kann in Zellkultur durch eine Veränderung in Zellgröße, die deutlich sichtbar ist, in adhärenten Zellen, die auf einem Deckgläschen wachsen, charakterisiert werden.
Zellgröße kann auch gemessen werden, um die Anheftung und Verteilung von adhärenten Zellen zu bestimmen. Zellverteilung ist das Ergebnis der selektiven Bindung von Zelloberflächenrezeptoren an Substratliganden und nachfolgende Aktivierung von Signaltransduktionswegen zum Cytoskelett. Zellanheftung und -verteilung auf Substratmoleküle ist ein wichtiger Schritt für die Metastase von Krebszellen, Leukozytenaktivierung während der Entzündungsantwort, Keratinozytenbewegung während Wundheilung und endotheliale Zellbewegung während Angiogenese. Verbindungen, die diese Oberflächenrezeptoren, Signaltransduktionswege oder das Cytoskelett beeinflussen, beeinflussen auch die Zellverteilung und können durch Messen der Zellgröße gescreent werden.
Der gesamte Zellbereich kann beobachtet werden durch Markierung des gesamten Zellkörpers oder des Zellcytoplasmas unter Verwendung von Cytoskelettmarkern, cytosolischen Volumenmarkern oder Zelloberflächenmarkern in Verbindung mit einer DNA-Markierung.
Beispiele solcher Markierungen (viele sind von Molecular Probes (Eugene, Oregon) und Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri)) schließen die Folgenden ein:
Dem Fachmann sind Protokolle zur Zellfärbung mit diesen verschiedenen Mitteln gut bekannt. Die Zellen werden lebend oder nach Fixierung gefärbt und die Zellumgebung kann gemessen werden. Lebende Zellen, die mit DilC16 gefärbt wurden, haben beispielsweise homogen markierte Plasmamembranen und die jeweiligen Zellquerschnitte werden einheitlich vom Hintergrund durch Fluoreszenzintensität des Farbstoffs unterschieden. Lebendzellfärbung mit cytosolischen Färbungen wie CMFDA erzeugen eine Fluoreszenzintensität, die proportional zur Zelldicke ist. Obwohl die Zellmarkierung in dünnen Bereichen der Zelle dunkler ist, kann die Zellumgebung vom Hintergrund unterschieden werden. Fixierte Zellen können mit Cytoskelettmarkern wie ALEXA^TM 488-Phalloidin, das polymerisiertes Actin markiert, gefärbt werden. Phalloidin färbt das Cytoplasma nicht homogen, aber erlaubt immer noch die Unterscheidung der Gesamtzellumgebung vom Hintergrund.
Zelluläre Hypertrophie
Ein Screen zur Analyse zellulärer Hypertrophie ist unter Verwendung der folgenden Strategie eingeschlossen. Primäre Rattenmonocyten können in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert werden, behandelt mit verschiedenen Verbindungen und dann fixiert und markiert werden mit einem Fluoreszenzmarker für die Zellmembran oder das Cytoplasma oder das Cytoskelett, wie einem Antikörper gegen einen Zelloberflächenmarker oder ein Fluoreszenzmarker für das Cytoskelett-ähnliche Rhodamin-Phalloidin, in Kombination mit einer DNA-Markierung wie Hoechst.
Nach Fokussierung auf die Hoechst-markierten Kerne werden zwei Bilder enroorben, eins der Hoechst-markierten Kerne und eins des fluoreszierenden Cytoplasmabildes. Die Kerne werden identifiziert durch Bestimmung des Schwellenwertes, um eine Maske zu erzeugen und dann Vergleichen der morphologischen Deskriptoren der Maske mit einem Satz von benutzerdefinierten Deskriptorwerten. Jedes Nichtkernbild (oder "cytoplasmatische Bild") wird dann getrennt prozessiert. Das Original-Cytoplasmabild kann einem Schwellenwert unterzogen werden, was ein cytoplasmatisches Maskenbild erzeugt. Lokale Regionen, die Zellen enthalten, werden um den Kern definiert. Die Grenzen der Zellen in diesen Regionen werden dann durch eine lokale dynamische Schwellenwertoperation auf der gleichen Region in dem fluoreszierenden Antikörperbild definiert. Eine Sequenz von Erosionen und Erweiterungen wird verwendet, um sich leicht berührende Zellen zu trennen und ein zweiter Satz von morphologischen Deskriptoren wird verwendet, um Einzelzellen zu identifizieren. Der Bereich der individuellen Zellen wird geordnet, um die Verteilung von Zellgrößen zu definieren für den Vergleich mit Größendaten von normalen und hypertrophischen Zellen.
Antworten von ganzen Platten mit 96 Vertiefungen (gemessen als durchschnittlicher cytoplasmatischer Bereich/Zelle) wurden analysiert durch die vorstehenden Verfahren, und die Ergebnisse zeigten, dass der Assay gleich arbeiten wird auf einer Vertiefung-zu-Vertiefung-, Platte-zu-Platte- und Tag-zu-Tag-Basis (unter 15% cov für ein maximales Signal). Die Daten zeigten eine sehr gute Korrelation für jeden Tag und es gab keine Variabilität, die auf die Vertiefungsposition in der Platte zurückzuführen war.
Die folgenden Summen können für das Feld berechnet werden. Der angesammelte Ganzkernbereich ist die Zahl von Nicht-Null-Pixeln in der Kernmaske. Der durchschnittliche Ganzkernbereich ist der angesammelte Ganzkernbereich, geteilt durch die Gesamtzahl von Kernen. Für jedes Cytoplasmabild können verschiedene Werte berechnet werden. Dieses ist der gesamte cytoplasmatische Bereich, der die Anzahl von Nicht-Null-Pixeln der cytoplasmati schen Maske ist. Die gesammelte cytoplasmatische Intensität ist die Summe der Intensitäten aller Pixel in der cytoplasmatischen Maske. Der cytoplasmatische Bereich pro Kern ist der gesamte cytoplasmatische Bereich, geteilt durch die Gesamtkernzahl. Die cytoplasmatische Intensität pro Kern ist die angesammelte Cytoplasmaintensität, geteilt durch die Gesamtkernzahl. Die durchschnittliche Cytoplasmaintensität ist die angesammelte Cytoplasmaintensität, geteilt durch den Cytoplasmabereich. Das Cytoplasmakernverhältnis ist der gesamte cytoplasmatische Bereich, geteilt durch den Gesamtkernbereich.
Zusätzlich können ein oder mehrere fluoreszierende Antikörper gegen andere zelluläre Proteine wie die Hauptmuskelproteine Actin oder Myosin eingeschlossen werden. Bilder dieser zusätzlich markierten Proteine können erhalten werden und gespeichert werden mit den vorstehenden Bildern, zur späteren Übersicht, um Anomalien in der Verteilung und Morphologie von diesen Proteinen in hypertrophischen Zellen zu identifizieren. Dieses Beispiel eines Multiparameterscreens ermöglicht die gleichzeitige Analyse von zellulärer Hypertrophie und Veränderungen in Actin- und Myosinverteilung.
Der Fachmann weiß, dass während die Beispiele Myocytenhypertrophie analysieren, diese Verfahren auch angewendet werden können, um Hypertrophie zu analysieren oder generelle Morphologieveränderungen in einem Zelltyp.
Zellmorphologie-Assays für Prostatakarzinom
Zellverteilung ist ein Maß für die Antwort von Zelloberflächenrezeptoren auf Substratanheftungs-Liganden. Die Verteilung ist proportional zu der Ligandenkonzentration oder zu der Konzentration von Verbindungen, die Rezeptorligandenfunktion reduzieren. Ein Beispiel für selektive Zellsubstratanheftung ist Prostatakarzinom-Zelladhäsion an das extrazelluläre Matrixprotein Kollagen. Prostatakrebszellen metastasieren zum Knochen über selektive Adhäsion an Kollagen.
Verbindung die mit Metastasen von Prostatakarzinomzellen interferieren wurden wie folgt gescreent. PC3 humane Prostatakarzinomzellen wurden in Medium mit geeigneten Stimulanzien kultiviert und auf kollagenbeschichtete Platten mit 96 Vertiefungen gebracht. Ligandenkonzentration kann variiert werden oder Inhibitoren der Zellverteilung können den Vertiefungen zugefügt werden. Beispiele für Verbindungen, die Verteilung bewirken können sind Rezeptorantagonisten wie Integrin- oder Proteoglycan-blockierende Antikörper, Signalinhibitoren einschließlich Phosphatidyl-Inositol3-Kinaseinhibitoren und Cytoskelettinhibitoren wie Cytochalasin D. Nach zwei Stunden wurden die Zellen fixiert und mit ALEXA^TM 488 Phalloi din (Molecular Probes) und Hoechst 33342 gefärbt, nach dem Protokoll für zelluläre Hypertrophie. Die Größe der Zellen unter diesen verschiedenen Bedingungen, gemessen wie beim cytoplasmatischen Färben, können von Hintergrundniveau unterschieden werden. Die Anzahl von Zellen pro Feld wird durch Messen der Zahl von Kernen, die mit Hoechst DNA-Farbstoff gefärbt wurden bestimmt. Der Bereich pro Zelle wird durch Teilen des cytoplasmatischen Bereichs (Phalloidinbild) durch die Zellzahl (Hoechst-Bild) gefunden. Die Größe der Zellen ist proportional zu der Ligandenrezeptorfunktion. Da der Bereich durch Ligandenkonzentration bestimmt wird und durch die resultierende Funktion der Zellen kann Arzneimittelwirksamkeit genauso wie Arzneimittelstärke durch diesen zellbasierten Assay bestimmt werden. Andere Messungen können durchgeführt werden, wie vorstehend für zelluläre Hypertrophie diskutiert.
Die Verfahren zur Analyse zellulärer Morphologie können in einem kombinierten Screen mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt verwendet werden. In einem Beispiel scannt die Betriebsart mit hohem Durchsatz die gesamte Vertiefung auf einen Anstieg der Fluoreszenz-Phalloidinintensität. Ein Grenzwert wird gesetzt, über dem sowohl Kerne (Hoechst) als auch Zellen (Phalloidin) gemessen werden in einer Betriebsart mit hohem Inhalt. In einem anderen Beispiel wird ein Umgebungsbiosensor (Beispiele schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die Biosensoren, die sensitiv auf Calcium und pH-Veränderungen reagieren) wird den Zellen zugesetzt und die Zellen werden mit einer Verbindung in Kontakt gebracht. Die Zellen werden in einer Betriebsart mit hohem Durchsatz gescannt und die Vertiefungen, die einen vorbestimmten Schwellenwert für Lumineszenz des Biosensors übersteigen, werden in einer Betriebsart mit hohem Inhalt gescannt.
In einem weiteren Aspekt werden Kits zur Verfügung gestellt zur Analyse zellulärer Morphologie, umfassend eine Lumineszenzverbindung, die verwendet werden kann, um spezifisch Zellcytoplasma, Membran oder Cytoskelett (wie die oben beschriebenen) zu markieren und Instruktionen zur Verwendung der lumineszierenden Verbindung, um Teststimuli zu identifizieren, die Veränderungen in der zellulären Morphologie gemäß den vorstehenden Verfahren induzieren oder inhibieren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit weiterhin einen lumineszierenden Marken für Zellkerne. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit wenigstens eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie zelluläre Morphologie modifiziert, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Integrin- oder Proteoglycan-blockierende Antikörper, Signalinhibitoren, einschließlich Phosphatidylinositol-3-Kinaseinhibitoren und Cytoskelettinhibitoren wie Cytochalasin D.
In einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein maschinenlesbares Speichermedium, das ein Programm umfasst, das einen Satz von Instruktionen enthält, das ein Zellscreeningsystem dazu veranlasst, die offenbarten Verfahren zur Analyse zellulärer Morphologie auszuführen, wobei das Zellscreeningsystem ein optisches System umfasst mit einer Bühne, die zum Halten einer Platte, die Zellen enthält, angepasst ist, eine digitale Kamera, eine Vorrichtung zur Steuerung der Fluoreszenz oder Lumineszenz, die von den Zellen emittiert wird zu der digitalen Kamera und Computervorrichtungen zum Empfang und zur Prozessierung der digitalen Daten von der digitalen Kamera.
Beispiel 3 Screen in der dualem Betriebsart (Modus) mit hohem Durchsatz und mit hohem Gehalt
Das folgende Beispiel ist ein Screen auf Aktivierung eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR), wie nachgewiesen durch die Translokation des GPCR aus der Plasmamembran zu einem nahen Kernort. Dieses Beispiel veranschaulicht, wie ein Screen mit hohem Durchsatz mit einem Screen mit hohem Inhalt gekoppelt werden kann in dem System der dualen Betriebsart für zellbasiertes Screening.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind eine große Klasse von 7 Transmembrandomänen-Zelloberflächenrezeptoren. Liganden dieser Rezeptoren stimulieren eine Kaskade von sekundären Signalen in der Zelle, die einschließen können, jedoch nicht beschränkt sind auf, Ca⁺⁺-transiente, cyclische AMP-Produktion, Inositoltriphosphat (IP₃)-Produktion und Phosphorylierung. Jedes dieser Signale ist schnell, tritt innerhalb von Sekunden bis Minuten auf, ist jedoch auch gewöhnlich. Beispielsweise produzieren viele verschiedene GPCR ein sekundäres Ca⁺⁺-Signal, wenn sie aktiviert werden. Die Stimulierung eines GPCR resultiert auch in dem Transport dieses GPCR aus der Zelloberflächenmembran zu einem internen nahen Kernkompartiment. Diese Internalisierung ist ein viel rezeptorspezifischer Indikator der Aktivierung eines bestimmten Rezeptors, als die vorstehend beschriebenen sekundären Signale.
19 veranschaulicht einen Screen in der dualen Betriebsart auf Aktivierung eines GPCRs. Zellen, die eine stabile Chimäre von GPCR mit einem blau fluoreszierenden Protein (BFP) tragen, würden mit der Acetoxymethylester-Form von Fluo-3 beladen sein, einem zelldurchlässigen Calciumindikator (grüne Fluoreszenz), der in lebenden Zellen durch die Hydrolyse der Ester gefangen ist. Sie würden dann in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte 601 gebracht werden. Die Vertiefungen würden dann mit einem Array von Testverbindungen behandelt werden, unter Verwendung eines Flüssigkeitsliefersystems und eine kurze Sequenz von Fluo-3-Bilder der gesamten Mikrotiterplatte würde erhalten werden und analysiert werden auf Vertiefungen, die eine Calciumantwort zeigen (d. h. Betriebsart mit hohem Durchsatz). Diese Bilder würden wie die Illustration der Mikrotiterplatte 601 in 19 erscheinen. Eine geringe Anzahl von Vertiefungen, wie Vertiefungen C4 und E9 in der Darstellung, würde heller fluoreszieren aufgrund der CA⁺⁺-Entlassung nach Stimulation des Rezeptors. Die Orte von Vertiefungen, die Verbindungen enthalten, die eine Antwort 602 induzieren, würden dann zu dem HCS-Programm transferiert werden und die optischen Mittel würden für eine detaillierte Zell-für-Zell-Analyse der blauen Fluoreszenz gewechselt werden für Anhaltspunkte der GPCR-Translokation in die perinukleäre Region. Der Boden von 19 veranschaulicht die zwei möglichen Ergebnisse der Analyse der hochauflösenden Zelldaten. Die Kamera bildet eine Unterregion 604 des Vertiefungsbereichs 603 ab, was Bilder der fluoreszierenden Zellen 605 erzeugt. Die gleichmäßige Verteilung der Fluoreszenz in den Zellen in Vertiefung C4 zeigt an, dass der Rezeptor nicht internalisierte, was impliziert, dass die CA⁺⁺-ntwort, die gesehen wurde, ein Ergebnis der Stimulierung einiger anderer Signalsysteme in der Zelle war. Andererseits zeigen die Zellen in Vertiefung E9 606 klar eine Konzentration des Rezeptors in der perinukleären Region an, was klar die vollständige Aktivierung des Rezeptors anzeigt. Da nur wenige Treffervertiefungen mit hoher Auflösung analysiert werden müssen, kann der Gesamtdurchsatz des Systems der dualem Betriebsart sehr hoch sein, verglichen mit dem hohen Durchsatz-System alleine.
Beispiel 4 Kinetischer Screen mit hohem Inhalt
Das Folgende ist ein Beispiel eines Screens, um die Kinetiken der Internalisierung eines Rezeptors zu messen. Wie vorstehend beschrieben, resultiert die Stimulierung eines GPCRs in der Internalisierung des Rezeptors mit einem Zeitablauf von etwa 15 Minuten. Das einfache Nachweisen des Endpunkts als Internalisierung oder nicht kann nicht ausreichend sein für die nähere Bestimmung der Potenz einer Verbindung als GPCR-Agonist oder -Antagonist. Jedoch würden 3 Zeitpunkte in 5-Minuten-Intervallen Information nicht nur über die Potenz während des Zeitabschnittes der Messung zur Verfügung stellen, sondern würde auch die Extrapolation der Daten auf viel längere Zeitabschnitte erlauben. Um diesen Assay durchzuführen, würden die Unterregionen als zwei Reihen definiert werden, die Probenintervalle als 5 Minuten und die Gesamtzahl von Zeitpunkten als 3. Das System würde dann beginnen durch Scannen von zwei Reihen und dann den zwei Reihen Reagenzien zuzufügen, was die Zeit = 0 Referenz etabliert. Nach Zusatz der Reagenzien würde das System wieder die zwei Reihen Unterregion scannen, um die Daten des ersten Zeitpunkts zu erlangen. Da dieser Prozess etwa 250 Sekunden dauern würde, einschließlich zurückscannen zum Beginn der Unterregion, würde das System 50 Sekunden warten, um die Erfassung des zweiten Zeitpunktes zu beginnen. Zwei weitere Zyklen würden die drei Zeitpunkte erzeugen und das System würde zu der zweiten Subregionreihe wandern. Die endgültigen Subregionen aus zwei 2-Reihen würden gescannt werden, um alle Vertiefungen auf der Platte zu beenden, was in vier Zeitpunkten für jede Vertiefung über die gesamte Platte resultieren würde. Obwohl die Zeitpunkte für die Vertiefungen leicht versetzt sein würden, im Vergleich zum Zeit = O-Punkt, würde der Abstand der Zeitpunkte sehr nah an den erforderlichen 5 Minuten liegen und die gegenwärtigen Erkennungszeiten und die Ergebnisse würden mit größerer Genauigkeit als in fixierten Zellscreens aufgezeichnet werden.
Beispiel 5 Screen mit hohem Gehalt der humanen Glucocorticoid-Rezeptor-Translokation
Eine Klasse von HCS schließt die arzneimittelinduzierte dynamische Umverteilung von intrazellulären Bestandteilen ein. Der humane Glucocorticoid-Rezeptor (hGR), ein Einzel-"Sensor" in der komplexen Umgebungsantwortmaschinerie der Zelle, bindet Steroidmoleküle, die in die Zelle verbreitet wurden. Der Ligandenrezeptorkomplex transloziert zum Kern, wo transkriptionelle Aktivierung auftritt (Htun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 4845, 1996).
Hormonrezeptoren sind generell ein exzellentes Arzneimittelziel, da ihre Aktivität an der Spitze von intrazellulären Schlüsselsignalwegen liegt. Deshalb hat ein Screen mit hohem Inhalt von hGR-Translokation einen eindeutigen Vorteil gegenüber in vitro Liganden-Rezeptorbindungs-Assays. Die Verfügbarkeit von bis zu zwei weiteren Kanälen der Fluoreszenz in dem Zellscreeningsystem der vorliegenden Erfindung ermöglicht es dem Screen, zwei zusätzliche Parameter parallel zu enthalten, wie andere Rezeptoren oder unterschiedliche Ziele oder andere zelluläre Prozesse.
Plasmidkonstrukt. Ein eukaryotisches Expressionsplasmid, das eine kodierende Sequenz für ein grün fluoreszierendes Protein – Human Glucocorticoid Rezeptor (GFP-hGR) Chimäre enthält, wurde unter Verwendung von GFP-Mutanten hergestellt (Palm et al., Nat. Struct. Biol. 4: 361 (1997)). Das Konstrukt wurde dann verwendet, um eine humane Gebärmutterkrebszelllinie (HeLa) zu transfizieren.
Zellpräparation und Transfektion. HeLa-Zellen (ATCC CCL-2) wurden trypsiniert und ausplattiert unter Verwendung von DMEM, enthaltend 5% Aktivkohle-/Dextran-behandeltes fötales Rinderserum (FBS) (HyClone) und 1% Penicillinstreptomycin (C-DMEM) 12–24 Stunden vor Transfektion und inkubiert bei 37°C und 5% CO₂. Transfektionen wurden durchgeführt durch Calciumphosphatco-präzipitation (Graham und Van der Eb, Virology 52: 456, 1973; Sambrook et al., (1989). Molecular Cloning: A Laboraton Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) oder mit Lipofectamin (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Für die Calciumphosphat-Transfektion wurde das Medium vor der Transfektion mit DMEM, enthaltend 5% Aktivkohle-/Dextran-behandeltes FBS, ersetzt. Zellen wurden mit dem Calcimphosphat-DNA-Präzipitat für 4–5 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert, 3–4 mal mit DMEM gewaschen, um das Präzipitat zu entfernen, gefolgt von dem Zusatz von C-DMEM.
Lipofectamintransfektionen wurden in serumfreien DMEM durchgeführt, ohne Antibiotika gemäß den Herstelleranweisungen (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Nach einer 2–3-stündigen Inkubation mit dem DNA-Liposomenkomplex wurde das Medium entfernt und durch C-DMEM ersetzt. Alle transfizierten Zellen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden bei 33°C und 50% CO₂ für 24–48 Stunden vor der Arzneimittelbehandlung inkubiert. Die Experimente wurden mit dem Transient-exprimierten Rezeptor in HeLa-Zellen durchgeführt.
Dexamethason-Induktion von GFP-hGR Translokation. Um Rezeptorligandentranslokations-kinetische Daten zu erhalten, wurden Kerne von transfizierten Zellen zunächst mit 5 μg/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) in C-DMEM für 20 Minuten bei 33°C und 5% CO₂ markiert. Die Zellen wurden einmal in Hank's Balancierter Salzlösung (HBSS) gewaschen, gefolgt von dem Zusatz von 100 nM Dexamethason in HBSS mit 1% Aktivkohle-/Dextranbehandeltem FBS. Um zu bestimmten Zeitpunkten Dexamethasontitrationsdaten zu erhalten, wurden die transfizierten HeLa-Zellen zunächst mit DMEM gewaschen und dann bei 33°C und 5% CO₂ für eine Stunde in Anwesenheit von 0 bis 1000 nM Dexamethason in DMEM, enthaltend 1 % Aktivkohle-/Dextran-behandeltes FBS inkubiert. Die Zellen wurden lebend analysiert oder sie wurden mit HBSS gespült, fixiert für 15 Minuten mit 3,7% Formaldehyd in HBSS, gefärbt mit Hoechst 33342 und vor der Analyse gewaschen. Das intrazelluläre GFPhGR Fluoreszenzsignal verschwand nicht durch dieses Fixierungsverfahren.
Bilderfassung und Analyse. Kinetische Daten wurden gesammelt durch Erfassen von Fluoreszenzbildpaaren (GFP-hGR- und Hoechst 33342-markierte Kerne) aus Feldern von lebenden Zellen in 1-Minuten-Intervallen für 30 Minuten nach dem Zusatz von Dexamethason. Ebenso wurden Bildpaare von jeder Vertiefung der Screening-Platten mit dem fixiertem Zeitpunkt 1 Stunde nach Zusatz von Dexamethason erhalten. In beiden Fällen wurden die Bildpaare, die zu jedem Zeitpunkt erhalten wurden, verwendet, um Kern und cytoplasmatische Regionen in jeder Zelle zu definieren. Die Translokation von GFP-hGR wurde berechnet durch Teilen der integrierten Fluoreszenzintensität von GFP-hGR in dem Kern durch die integrierte Fluoreszenzintensität von der Chimäre in dem Cytoplasma oder als eine kerncytoplasmatische Differenz von GFP-Fluoreszenz. In dem Screen mit festgelegten Zeitpunkten wurde dieses Translokationsverhältnis berechnet aus Daten, die aus wenigstens 200 Zellen erhalten wurden, die bei jeder Konzentration von Dexamethason getestet wurden. Arzneimittelinduzierte Translokation von GFP-hGR aus dem Cytoplasma in den Kern wurde deshalb mit einem Anstieg in dem Translokationsverhältnis korreliert.
Ergebnisse. 20 zeigt schematisch die arzneimittelinduzierte Cytoplasma 253 zu Kern 252-Translokation des humanen Glucocorticoidrezeptors. Das obere Paar schematischer Diagramme zeigt die Lokalisation von GFP-hGR in der Zelle vor 250 (A)- und nach 251 (B)-Stimulation mit Dexamethason. Unter diesen experimentellen Bedingungen induziert das Arzneimittel einen großen Teil der cytoplasmatischen GFP-hGR zur Translokation in den Kern. Diese Umverteilung wird quantifiziert durch Bestimmen des integrierten Intensitätsverhältnisses der cytoplasmatischen und Kernfluoreszenz in behandelten 255 und unbehandelten 254 Zellen. Das untere Paar der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigt die dynamische Umverteilung von GFP-hGR in einer Einzelzelle, vor 254 und nach 255 Behandlung. Der HCS wird durchgeführt mit Vertiefungen, die hunderte bis tausende von transfizierten Zellen enthalten und die Translokation wird quantifiziert für jede Zelle in dem Feld, das GFP-Fluoreszenz zeigt. Obwohl die Verwendung einer stabil transfizierten Zelllinie die höchste Konsistenz in markierten Zellen erreichen würde, störten die heterogenen Spiegel von GFP-hGR-Expression, die durch transiente Transfektion induziert wurden, nicht die Analyse durch das Zellscreeningsystem der vorliegenden Erfindung.
Um den Screen durchzuführen, scannt das Zellscreeningsystem jede Vertiefung der Platte, bildet eine Population von Zellen in jeder ab und analysiert die Zellen individuell. Hier werden zwei Kanäle der Fluoreszenz verwendet, um die cytoplasmatische und Kernverteilung von dem GFP-hGR in jeder Zelle zu definieren. Abgebildet in 21 ist das grafische Benutzerinterface des Zellscreeningsystems nahe dem Ende des GFP-hGR-Screens. Dieses Benutzerinterface bildet die parallele Datensammlung ab und analysiert die Fähigkeiten des Systems. Die Fenster, markiert als "Kern" 261 und "GFP-hGR" 262, zeigen das Paar Fluoreszenzbilder, die erhalten wurden und in einem Einzelfeld analysiert wurden. Das Fenster, markiert als "Farbüberlagerung" 260, wird durch Pseudokolorierung der vorstehenden Bilder gebildet und mischt sie so, dass der Benutzer sofort zelluläre Veränderungen identifizieren kann. In dem "gespeicherte Objektregionen"-Fenster 265 wird ein Bild, das jede analysierte Zelle enthält, und ihre Nachbarn gezeigt, wie es archiviert wird. Weiterhin werden die HCS-Daten gesammelt, sie werden analysiert für den Fall der GFP-hGR-Translokation und in eine sofortige "Treffer"-Antwort übersetzt. Die Platte mit 96 Vertiefungen, abgebildet in dem unte ren Fenster des Screens 267, zeigt, welche Vertiefungen einen Satz von benutzerdefinierten Screeningkriterien erfüllt haben. Beispielsweise zeigt eine weiß gefärbte Vertiefung 269, dass die arzneimittelinduzierte Translokation einen vorbestimmten Schwellenwert von 50% überschritten hat. Andererseits zeigt eine schwarz gefärbte Vertiefung 270, dass das getestete Arzneimittel weniger als 10% Translokation induziert. Grau gefärbte Vertiefungen 268 zeigen "Treffer", in denen der Translokationswert zwischen 10 und 50% fällt. Reihe "E" auf der analysierten Platte mit 96 Vertiefungen 266 zeigt eine Titration mit einem Arzneimittel, von dem bekannt ist, dass es GFP-hGR-Translokation aktiviert, Dexamethason. Dieser Beispielscreen verwendet nur zwei Fluoreszenzkanäle. Zwei zusätzliche Kanäle (Kanäle 3 263 und 4 264) sind erhältlich für Parallelanalysen von anderen spezifischen Zielen, Zellprozessen oder Cytotoxizität, um Screens mit multiplen Parametern zu erzeugen.
Es gibt eine Verbindung zwischen der Bilddatenbank und der Informationsdatenbank, was ein starkes Werkzeug während des Validierungsprozesses von neuen Screens ist. Bei Abschluss eines Screens hat der Benutzer den vollständigen Zugang zu Bild- und berechneten Daten (22). Das umfassende Datenanalysepaket des Zellscreeningsystem ermöglicht es dem Benutzer, HCS-Daten auf mehreren Ebenen zu untersuchen. Bilder 276 und detaillierte Daten in einer Bildschirmtabelle 279 für individuelle Zellen können separat betrachtet werden oder zusammenfassende Daten können gezeichnet werden. Die berechneten Ergebnisse eines Einzelparameters für jede Zelle in einer Platte mit 96 Vertiefungen ist beispielsweise in dem Feld, bezeichnet als Diagramm 1 275, gezeigt. Durch Auswählen eines Einzelpunkts in dem Diagramm kann der Benutzer den gesamten Datensatz für eine bestimmte Zelle anzeigen, der von einer existierenden Datenbank abgerufen wird. Hier sind das Bildpaar 276 und detaillierte Fluoreszenz und morphometrischen Daten von einer Einzelzelle (Zell# 118, graue Linie 277) gezeigt. Das große grafische Insert 278 zeigt die Ergebnisse der Dexamethasonkonzentration auf die Translokation von GFP-hGR. Jeder Punkt ist der Durchschnitt von Daten aus wenigstens 200 Zellen. Der berechnete EC₅₀ für Dexamethason in diesem Assay ist 2 nM.
Ein starker Aspekt von HCS mit dem Zellscreeningsystem ist die Fähigkeit von kinetischen Messungen unter Verwendung von Multicolorfluoreszenz und morphometrischen Parametern in lebenden Zellen. Zeitliche und räumliche Messungen können mit Einzelzellen in einer Population von Zellen in einem Feld durchgeführt werden. 23 zeigt kinetische Daten der Dexamethason-induzierten Translokation von GFP-hGR in verschiedenen Zellen in einem Einzelfeld. Humane HeLa-Zellen, die mit GFP-hGR transfiziert waren, wurden mit 100 nM Dexamethason behandelt und die Translokation von GFP-hGR wurde über die Zeit in einer Population von Einzelzellen gemessen. Das Diagramm zeigt die Antwort von behan delten Zellen 285, 286, 287 und 288 und nichttransfizierte Zellen 289. Diese Daten zeigen auch die Fähigkeit, Zellen mit verschiedenen Expressionsspiegeln zu analysieren.
Beispiel 6 Screen mit hohem Gehalt von arzneimittelinduzierter Apoptose
Apoptose ist ein komplexes zelluläres Programm, das eine Myriade molekularer Ereignisse und Signaltransduktionswege einschließt. Um den Mechanismus von Arzneimittelwirkung in diesem Prozess zu verstehen, ist es essentiell, so viele Ereignisse in den Zellen wie möglich zu messen, mit zeitlicher und räumlicher Auflösung. Deshalb würde ein Apoptosescreen, der wenig Zellprobenpräparation erfordert und dennoch eine automatisierte Anzeige von verschiedenen mit Apoptose in Verbindung stehenden Parametern zur Verfügung stellt, ideal sein. Ein zellbasierter Assay, der für das Zellscreeningsystem entworten wurde, wurde verwendet, um gleichzeitig verschiedene der morphologischen, Organellen und makromolekularen Kennzeichen von Paclitaxel-induzierter Apoptose zu quantifizieren.
Zellpräparation. Die Zellen, die für diese Studie ausgewählt wurden, waren Mausbindegewebsfibroblasten (L-929; ATCC CCL-1) und eine stark inversive Glioblastoma-Zelllinie (SNB-19; ATCC CRL-2219) (Welch et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 31: 610, 1995). Am Tag vor der Behandlung mit einem Apoptose-induzierenden Arzneimittel wurden 3500 Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen gebracht und über Nacht bei 37°C in einer befeuchteten 5% CO₂-Atmosphäre inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Kulturmedium aus jeder Vertiefung entfernt und mit frischem Medium ersetzt, das verschiedene Konzentrationen von Paclitaxel (0–50 μM) von einem 20 mM Stock, der in DMSO hergestellt wurde, enthielt. Die maximale Konzentration von DMSO, die in diesen Experimenten verwendet wurde, war 0,25%. Die Zellen wurden dann für 26 Stunden, wie vorstehend, inkubiert. Am Ende des Paclitaxelbehandlungszeitraums erhielt jede Vertiefung frisches Medium, das 750 nM Mito-Tracker Red (Molecular Probes; Eugene, OR) und 3 μg/ml Hoechst 33342 DNA-bindenden Farbstoff (Molecular Probes) enthielt und wurde wie vorstehend für 20 Minuten inkubiert. Jede Vertiefung der Platte wurde dann mit HBSS gewaschen und mit 3,7% Formaldehyd in HBSS für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Das Formaldehyd wurde dann mit HBSS ausgewaschen und die Zellen wurden für 90 Sekunden mit 0,5% (v/v) Triton X-100 permeabilisiert, gewaschen mit HBSS, inkubiert mit 2 U ml^–1 Bodipy FL Phallacidin (Molecular Probes) für 30 Minuten und mit HBSS gewaschen. Die Vertiefungen auf der Platte wurden mit 200 μL HBSS gefüllt, verschlossen und die Platte wurde bei 4°C gelagert, falls notwendig. Die Fluoreszenzsignale von Platten, die auf diese Weise gelagert wurden, waren für wenigstens zwei Wochen nach Präparation stabil. Wie in dem Kerntranslokationsassay kön nen Fluoreszenzreagenzien entworfen werden, um diesen Assay in einen Lebendzellscreen mit hohem Inhalt zu konvertieren.
Bilderfassung und Analyse durch das ArrayScan System. Die Fluoreszenzintensität von intrazellulärem MitoTracker Red, Hoechst 33342 und Bodipy FL Phallacidin wurde mit dem Zellscreeningsystem, wie oben beschrieben, gemessen. Morphometrische Daten von jedem Paar von Bildern, das von jeder Vertiefung erhalten wurde, wurden auch erhalten, um jedes Objekt in dem Bildfeld (z. B. Zellen und Kerne) nachzuweisen und um ihre Größe, Form und integrierte Intensität zu berechnen.
Kalkulationen und Ausgabe. Insgesamt wurden 50–250 Zellen pro Bildfeld gemessen. Für jedes Feld von Zellen wurden die folgenden Berechnungen durchgeführt: (1) Der durchschnittliche Kernbereich (μm²) wurde berechnet durch Teilen des Gesamtkernbereichs in einem Feld durch die Anzahl der nachgewiesenen Kerne. (2) Der durchschnittliche Kernumfang (μm) wurde berechnet durch Teilen der Summe von Umfängen von allen Kernen in dem Feld durch die Anzahl der nachgewiesenen Kerne in diesem Feld. Stark gewundene apoptotische Kerne hatten die größten Kernumfangwerte. (3) Die durchschnittliche Kernhelligkeit wurde berechnet durch Teilen der integrierten Intensität von dem Gesamtfeld der Kerne durch die Anzahl der Kerne in dem Feld. Ein Anstieg in der Kernhelligkeit war mit gesteigertem DNA-Gehalt korreliert. (4) Die durchschnittliche zelluläre Helligkeit wurde berechnet durch Teilen der integrierten Intensität eines Gesamtfelds von Zellen, gefärbt mit MitoTracker-Farbstoff durch die Anzahl von Kernen in dem Feld. Da die Menge an MitoTracker-Farbstoff, die sich in den Mitochondrien ansammelt, proportional zu dem mitochondrialen Potential ist, stimmt ein Anstieg in der durchschnittlichen Zellhelligkeit mit einem Anstieg im mitochondrialen Potential überein. (5) Die durchschnittliche zelluläre Helligkeit wurde auch berechnet durch Teilen der integrierten Intensität eines Gesamtfelds von Zellen, die mit Bodipy FL Phallacidin-Farbstoff gefärbt waren, durch die Anzahl von Kernen in dem Feld. Da die Phallotoxine mit hoher Affinität an die polymerisierte Form von Actin binden, ist die Menge von Bodipy FL Phallacidin-Farbstoff, der sich in der Zelle ansammelt, proportional zu dem Actinpolymerisierungsstatus. Ein Anstieg in der durchschnittlichen Zellhelligkeit stimmt mit einem Anstieg der Actinpolymerisierung überein.
Ergebnisse. 24 (obere Felder) zeigt die Veränderungen, die Paclitaxel in der Kernmorphologie von L-929 Zellen induzierte. Ansteigende Mengen an Paclitaxel hatten eine Vergrößerung und Fragmentierung der Kerne zur Folge 293, ein Merkmal von Apoptose. Die quantitative Analyse dieser und anderer Bilder, die von dem Zellscreeningsystem erhalten wurden, ist in der gleichen Figur dargestellt. Jeder gemessene Parameter zeigte, dass die L- 929 Zellen 296 weniger empfindlich gegen geringe Konzentrationen von Paclitaxel waren als die SNB-19 Zellen 297. Bei höheren Konzentrationen zeigten die L-929 Zellen jedoch eine Antwort für jeden gemessenen Parameter. Der Multiparameteransatz dieses Assays ist nützlich für die Zerlegung des Mechanismus der Arzneimittelwirkung. Zum Beispiel erreichten der Bereich, die Helligkeit und die Fragmentierung des Kerns 298 und die Actinpolymerisierungswerte 294 einen Maximalwert, als SNB-19 Zellen mit 10 nM Paclitaxel behandelt wurden (24; obere und untere Diagramme). Allerdings war das mitochondriale Potential 295 minimal bei der gleichen Konzentration von Paclitaxel (24; mittleres Diagramm). Die Tatsache, dass alle gemessen Parameter Kontrollniveau erreichten bei gesteigerter Paclitaxelkonzentration (> 20 nM) legt nahe, dass SNB-19 Zellen arzneimittel-metabolische oder Clearance-Signaltransduktionswege mit geringer Affinität haben, die bei ausreichend hohen Spiegeln der Arzneimittel kompensieren. Im Gegensatz zu der Arzneimittelempfindlichkeit von SNB-19 Zellen 297, zeigten L-929 eine andere Antwort auf Paclitaxel 296. Diese fibroblastischen Zellen zeigten eine maximale Antwort in vielen Parametern bei 5 μM Paclitaxel, eine 500-fach höhere Dosis als SNB-19 Zellen. Weiterhin zeigten die L-929 Zellen keine scharfe Verringerung in dem mitochondrialen Potential 295 bei jeder der Paclitaxelkonzentrationen, die getestet wurden. Diese Ergebnis ist in Übereinstimmung mit der Anwesenheit eines einzigartigen Apoptose-Signaltransduktionsweges zwischen einer normalen und einer Krebszelllinie. Diese Ergebnisse zeigen somit, dass ein relativ einfaches Fluoreszenzmarkierungsprotokoll mit dem Zellscreeningsystem der vorliegenden Erfindung gekoppelt werden kann, um einen Screen mit hohem Inhalt von Schlüsselereignissen, die in den programmierten Zelltod involviert sind, herzustellen.
Hintergrund
Ein Schlüssel zu dem Mechanismus der Apoptose war die Entdeckung, dass ungeachtet des letalen Stimulus der Tod in identischer apoptotischer Morphologie resultierte, die Zell- und Organellabbau und Neuverpackung, DNA-Spaltung in Nucleosomen, große Fragmente und Überhäufung der fragmentierten Zelle zur Verhinderung einer Entzündungsantwort einschließt. Apoptose unterscheidet sich deshalb von Nekrose, die eher durch akute Trauma einer Zelle übermittelt wird, was in der Verschüttung von potentiellen toxischen und antigenen zellulären Bestandteilen in das intrazelluläre Milieu resultiert, was zu einer inflammatorischen Antwort führt.
Die Kriterien zur Bestimmung, ob eine Zelle Apoptose erleidet (Wyllie et al., 1980, Int Rev Cytol. 68: 251–306; Thompson, 1995, Science. 267: 1456–62; Majno und Joris, 1995, Am J Pathol. 246: 3–15; Allen et al., 1998, Cell Mol Life Sci. 54: 427–45), schließen bestimmte mor phologische Veränderungen in der Erscheinung der Zelle, genauso wie Veränderungen in biochemischen und molekularen Markern ein. Apoptotische Zellen erleiden zum Beispiel häufig cytoplasmatische Membranblasenbildung (blebbing), ihre Chromosomen kondensieren schnell und sammeln sich um die Kernperipherie, die Kernfragmente und kleinen apoptotischen Körper werden gebildet. In vielen, jedoch nicht allen apoptotischen Zellen wird Chromatin ein Ziel für spezifischen Nukleasen, die DNA schneiden.
Apoptose wird normalerweise von einer charakteristischen Veränderung der Kernmorphologie (Chromatinkondensation oder -fragmentation) begleitet und einer schrittweisen Fragmentation von DNA bis hin zur Bildung von mono- und/oder oligomerischen Fragmenten von 200 Basenpaaren. Spezifische Veränderungen der Organellenfunktion, wie das mitochondriale Membranpotential, treten auf. Zusätzlich werden die spezifischen Cysteinproteasen (Caspasen) aktiviert, die ein hochselektives Muster von Proteindegradation durch proteolytische Spaltung nach spezifischen Asparaginsäureresten katalysiert. Zusätzlich erlaubt die externe Oberflächenaussetzung von Phosphatidylserinresten (normalerweise auf der inneren Membranseite) die Erkennung und Eliminierung von apoptotischen Zellen, bevor die Membran bricht und Cytosol oder Organellen in den intrazellulären Raum austreten und entzündliche Antworten elizitieren. Zellen, die Apoptose durchleben, tendieren darüber hinaus zur Schrumpfung, während sie auch einen reduzierten intrazellulären Kaliumspiegel haben.
Die generellen Muster der apoptotischen Signale sind sehr ähnlich unter verschiedenen Zelltypen und apoptotischen Induktoren. Die Details des Signaltransduktionsweges variieren jedoch signifikant, abhängig von dem Zelltyp und dem Induktor. Die Abhängigkeit und Unabhängigkeit von verschiedenen Signaltransduktionswegen, die in die Apoptose involviert sind, sind zur Zeit Gegenstand intensiver Forschung. Wir zeigen hier, dass der Signalweg auch abhängig von der Dosis des Induktors in spezifischen Zelltypen variiert.
Kernmorphologie
Zellen, die Apoptose durchleben, zeigen normalerweise zwei Typen von Kernveränderungen, Fragmentation oder Kondensation ((Majno und Joris, 1995), (Earnshaw, 1995)). Die Antwort in einem Zelltyp scheint abhängig von dem apoptotischen Induktor zu variieren. Während der Kernfragmentation wird ein kreisförmiger oder ovaler Kerr zunehmend lappenförmig. Schließlich fragmentiert der Kern dramatisch in viele Unterkerne. Manchmal kann die Dichte des Chromatins in dem lappenförmigen Kern räumliche Variationen in der Verteilung (Heterochromatisierung) zeigen, annähernd die Begrenzung, die bei Kernkondensation gesehen wird.
Kernkondensation wurde von manchen Zelltypen berichtet, wie MCF-7 (Saunders et al., 1997, Int J Cancer. 70L214-20). Kondensation scheint als eine Konsequenz des Verlustes der strukturellen Integrität des Euchromatins, der Kernmatrix und der Kernlamina aufzutreten (Hendzel et al., 1998, J Biol Chem. 273: 24470–8). Während der Kernkondensation konzentriert sich das Chromatin am Rand des Kerns, was zu einer Gesamtschrumpfung des Kerns führt. Somit muss die Verwendung der Kernmorphologie als ein Maß der Apoptose sowohl Kondensation als auch Fragmentation in Betracht ziehen.
Material und Verfahren
Zellen wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 3 x 10³ bis 1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung plattiert. Am folgenden Tag wurden apoptotische Induktoren zugesetzt mit angegebenen Konzentrationen und die Zellen wurden für die angegebene Zeit (normalerweise 16–30 Stunden) inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit 5 μg/ml Hoechst (Molecular Probes, Inc.) in frischem Medium gefärbt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden in Hank's Balancierter Salzlösung (HBSS) gewaschen und mit 3,7% Formaldehyd in HBSS bei Raumtemperatur fixiert. Die Zellen wurden 2X mit HBSS bei Raumtemperatur gewaschen und die Platte wurde verschlossen.
Die Quantifizierung der Veränderungen in der Kernmorphologie nach Induktion von Apoptose wurde erreicht durch (1) Messen der effektiven Größe der Kernregion; und (2) Messen des Grads der Windung (convolution) des Umfangs. Der Größenparameter stellt ein empfindlichere Messung der Kernkondensation zur Verfügung, wohingegen die Umfangmessung eine empfindlichere Messung der Kernfragmentation zur Verfügung stellt.
Ergebnisse und Diskussion
L929-Zellen antworten auf sowohl Staurosporin (30 Stunden) als auch Paclitaxel (30 Stunden) mit einer dosisabhängigen Veränderung in der Kernmorphologie (25A und 25B). BHK-Zellen beschrieben eine leicht kompliziertere, aber dennoch klar sichtbare Antwort. Staurosporin schien die Kernkondensation bei geringeren Dosen zu stimulieren und die Kernfragmentation bei höheren Dosen (25C und 25D). Im Gegensatz dazu induzierte Paclitaxel einen gleichmäßigen Anstieg in der Kernfragmentation mit gesteigerten Konzentrationen. Die Antwort von MCF-7-Zellen variierte dramatisch, abhängig von dem apoptotischen Induktor. Staurosporin schien Kernkondensationen zu elizitieren, wohingegen Paclitaxel Kernfragmentation (25E und 25F) induzierte.
26 veranschaulicht die Dosisantwort von Zellen hinsichtlich sowohl der Kerngröße als auch der Kernumfangwindung (-perimeter convolution). Es scheint eine Schwellung des Kerns vorzuliegen, die der Fragmentation vorangeht.
Ergebnis der Auswertung: Unterschiedliche Antworten von Zelllinien und von apoptotischen Induktoren wurden in einer dosisabhängigen Weise beobachtet, was darauf hinweist, dass dieser Assay nützlich sein wird für den Nachweis von Veränderungen der Kerneigenschaft von Apoptose.
Actinreorganisation
Wir haben Veränderungen im Actincytoskelett als einen potentiellen Parameter, der mit apoptotischen Veränderungen in Verbindung steht, eingeschätzt. Dies basierte auf der vorläufigen Beobachtung eines frühen Anstiegs im f-Actingehalt, der mit fluoreszierender Phalloidinmarkierung nachgewiesen wurde, einer f-Actin-spezifischen Färbung (unsere unpublizierten Daten; Levee et al. 1996, Am J Physiol. 271: C1981–92; Maekawa et al. 1996 Clin Exp Immunol. 105: 389–96). Veränderungen des Actincytoskeletts während der Apoptose wurden nicht in allen Zelltypen beobachtet (Endresen et al. 1995 Cytometn. 20: 162–71, van Engeland et al. 1997. Exp Cell Res. 235: 421–30).
Material und Verfahren
Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 3 × 10³ bis 1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung plattiert. Am folgenden Tag wurden apoptotische Induktoren in angegebener Konzentration zugegeben. Die Zellen wurden für die angegebene Zeit (normalerweise 16–30 Stunden) inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit 5 μg/ml Hoechst (Molecular Probes, Inc.) in frischem Medium gefärbt und für 30 Minuten bei 30 °C inkubiert. Die Zellen wurden in HBSS gewaschen und mit 3,7%-igem Formaldehyd in HBBS bei Raumtemperatur fixiert. Die Platten wurden mit HBSS gewaschen und mit 0,5 % v/v Triton X-100 in HBSS bei Raumtemperatur permeabilisiert. Die Platten wurden in HBSS gewaschen und mit 100 μl von 1 U/ml von Alexa 488 Phalloidin-Stock (100 μl/Vertiefung, Molecular Probes, Inc.) gefärbt. Die Zellen wurden 2X mit HBSS bei Raumtemperatur gewaschen und die Platte wurde verschlossen.
Die Quantifizierung des f-Actingehalts wurde durch Messen der Intensität der Phalloidinfärbung um den Kern erreicht. Dies wurde als eine angemessene Annäherung an einen gesamtcytoplasmatischen Durchschnitt der Intensität bestimmt. Die Maske, die verwendet wurde, um dieses cytoplasmatische Maß abzuschätzen, wurde von der Kernmaske, die durch die Hoechst-Färbung definiert wurde, abgeleitet. Die Ableitung wurde erreicht durch Kombinationen von Erosionen und Erweiterungen.
Ergebnisse und Diskussion: Veränderungen im f-Actingehalt variierten, basierend auf dem Zelltyp und dem apoptotischen Induktor (27). Staurosporin (30 Stunden) induzierte Steigerungen des f-Actins in L929- (27A) und BHHK-(27B) Zellen. MCF-7-Zellen zeigten eine konzentrationsabhängige Antwort. Bei geringen Konzentrationen (27E) schien eine Verringerung im f-Actingehalt aufzutreten. Bei höheren Konzentrationen stieg der f-Actingehalt. Paclitaxel (30 Stunden)-Behandlung führte zu einer großen Bandbreite von Antworten. L929-Zellen antworteten mit abgestuftem Anstieg im f-Actin (27B), wohingegen sowohl BHK- als auch MCF-7-Antworten hochvariabel waren (jeweils 27D & 27F).
Ergebnis der Auswertung: Sowohl Anstiege als auch Verringerungen der Signalintensität wurden für verschiedene Zelllinien gemessen und zeigten eine konzentrationsabhängige Antwort. Für bestimmte Zelllinien (apoptotische Induktorpaare) konnte dies ein statistisch signifikanter apoptotischer Indikator sein.
Veränderungen der mitochondrialen Masse/Potential
Einleitung
Veränderungen in Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle in der Apoptose (Henkart und Grinstein, 1996. J Exp Med. 183: 1293–5). Mitochondrien entlassen apoptogenische Faktoren durch die äußere Membran und leiten den elektrochemischen Gradienten der inneren Membran ab. Man geht davon aus, dass dies auftritt durch die Bildung der mitochondrialen Permeabilitätstransition (MPT), obwohl dies offensichtlich nicht für alle Fälle stimmt. Eine offensichtliche Manifestation der Bildung der MPT ist der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials. Die Inhibierung von MPT durch pharmakologische Intervention oder mitochondriale Expression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 verhindert den Zelltod, was nahe legt, dass die Bildung der MPT ein limitierendes Ereignis des Todesprozesses sein kann (vgl. zur Übersicht: Kroemer et al. 1998. Annu Rev Physiol. 60: 619–42). Es wurde auch beobachtet, dass Mitochondrien während der Stimulierung von Apoptose proliferieren können (Mancini et al. 1997. J Cell Biol. 138: 449–69; Camilleri-Broet et al. 1998. Exp Cell Res. 239: 277–92).
Ein Ansatz zur Messung von Apoptose-induzierten Veränderungen in Mitochondrien ist, das mitochondriale Membranpotential zu messen. Von den erhältlichen Verfahren ist die einfachste Messung die Umverteilung eines kationischen Farbstoffs, der sich in den intrazellulären Organellen, basierend auf dem Membranpotential, verteilt. Ein solcher Ansatz erfordert gewöhnlich lebende Zellen für die Messungen. Die kürzliche Einführung des MitoTracker-Farbstoffs (Poot et al. 1997. Cytometry. 27: 358–64; erhältlich von Molecular Probes, Inc., Oregon) stellt ein Mittel zur Messung des mitochondrialen Membranpotentials nach Fixierung zur Verfügung.
In Anbetracht der Beobachtungen eines möglichen Anstiegs der mitochondrialen Masse während der Apoptose ist die Menge des Farbstoffs, der die Mitochondrien markiert, abhängig von sowohl dem Membranpotential als auch der Anzahl der Mitochondrien. Wenn die Anzahl der Mitochondrien gleich bleibt, dann steht die Menge des Farbstoffs in direktem Zusammenhang mit dem Membranpotential. Wenn die Anzahl der Mitochondrien nicht gleich bleibt, dann wird das Signal wahrscheinlich von dem Anstieg in der Masse dominiert (Reipert et al. 1995. Exp Cell Res. 221: 281–8).
Es sind Sonden erhältlich, die die klare Trennung zwischen Veränderungen der Masse und des Potentials in HCS-Assays ermöglichen. Die mitochondriale Masse wird direkt gemessen durch Markierung mit Mitotracker Green FM (Poot und Pierce, 1999, Cytometry. 35: 311–7; erhältlich von Molecular Probes, Inc., Oregon). Diese Markierung ist unabhängig von mitochondrialem Membranpotential, jedoch proportional zur mitochondrialen Masse. Dies stellt auch ein Mittel zur Verfügung zur Normalisierung anderer mitochondrialen Messungen in jeder Zelle in Hinblick auf die mitochondriale Masse.
Material und Verfahren
Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 3 x 10³ bis 1 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung plattiert. Am folgenden Tag wurden apoptotische Induktoren in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt und die Zellen wurden für die angegebene Zeit (normalerweise 16–30 Stunden) inkubiert. Die Zellen wurden mit 5 μg/ml Hoechst (Molecular Probes, Inc.) und 750 nM MitoTracker Red (CMXRos, Molecular Probes, Inc.) in frischem Medium gefärbt und für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden in HBSS gewaschen und mit 3,7 %-igem Formaldehyd in HBSS bei Raumtemperatur fixiert. Die Platten wurden mit HBSS gewaschen und mit 0,5 % v/v Triton X-100 in HBSS bei Raumtemperatur permeabilisiert. Die Zellen wurden 2X mit HBSS bei Raumtemperatur gewaschen und die Platte wurde verschlossen. Für die Zweifachmarkierung von Mitochondrien wurden die Zellen mit 200 nM MitoTracker Green und 200 nM MitoTracker Red für 0,5 Stunden vor der Fixierung behandelt.
Ergebnisse und Diskussion
Die Induktion von Apoptose durch Staurosporin und Paclitaxel führte zu unterschiedlichen mitochondrialen Veränderungen, abhängig von dem Stimulus. L929-Zellen zeigten einen klaren Anstieg in der mitochondrialen Masse mit steigenden Staurosporinkonzentrationen (28). BHK-Zellen zeigten entweder eine Verringerung des Membranpotentials bei geringeren Konzentrationen von Staurosporin oder einen Anstieg in der Masse bei höheren Konzentrationen von Staurosporin (28C). MCF-7-Zellen antworteten mit einer gleichbleibenden Verringerung des mitochondrialen Membranpotentials in Antwort auf steigende Konzentrationen von Staurosporin (28E). Steigende Konzentrationen von Paclitaxel verursachten gleichbleibende Anstiege der mitochondrialen Masse (28B, 28D und 28F).
Das mitochondriale Membranpotential wird gemessen durch Markierung der Mitochondrien mit sowohl Mitotracker Green FM als auch Mitotracker Red (Molecular Probes, Inc.). Mitotracker Red-Markierung ist proportional zu sowohl der Masse als auch dem Membranpotential. Mitotracker Green FM-Markierung ist proportional zur Masse. Das Verhältnis des Mitotracker Red-Signals zu dem Mitotracker Green FM-Signal stellt ein Maß des mitochondrialen Membranpotentials zur Verfügung (Poot und Pierce, 1999). Dieses Verhältnis normiert die mitochondriale Masse im Hinblick auf das Multitacker Red-Signal (vgl. 28G). Die Kombination der Fähigkeit, die mitochondriale Masse zu normieren mit einem Maß des Membranpotentials, ermöglicht die unabhängige Bestimmung von beiden Parametern.
Ergebnis der Auswertung: Sowohl Verringerungen des Potentials als auch Anstiege der Masse wurden beobachtet, abhängig von der Zelllinie und dem getesteten Induktor. Die dosisabhängige Korrelation zeigt, dass dies ein vielversprechender apoptotischer Indikator ist.
Es ist möglich, viele Maße der Apoptose durch Ausnützung der Spektraldomänen der Fluoreszenzspektroskopie zu kombinieren. Tatsächlich wurden alle der Kernmorphologie/f-Actingehalt/mitochondriale Masse/mitochondriales Potential-Daten, die früher gezeigt wurden, als Multiparameterassays gesammelt, wurden jedoch einzeln zum Zwecke der Klarheit präsentiert.
Beispiel 7. Protease-induzierte Translokation eines Signalenzyms, das eine krankheitsassoziierte Sequenz enthält, aus dem Cytoplasma zum Kern
Plasmidkonstrukt. Ein eukaryotisches Expressionsplasmid, das eine kodierende Sequenz für ein grünfluoreszierendes Protein – Caspase (Cohen (1997), Biochemical J. 326: 1–16: Liang et al. (1997), J. of Molec. Biol. 274: 291–302) Chimäre kodiert, wird unter Verwendung von GFP-Mutanten hergestellt. Das Konstrukt wird verwendet, um eukaryotische Zellen zu transfizieren.
Zellpräparation und -transfektion. Zellen werden trypsiniert und 24 Stunden vor der Transfektion plattiert und bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Die Transfektionen werden durchgeführt durch Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Calciumphosphat-Copräzipitation oder Lipofektion. Die Zellen werden inkubiert mit dem Calciumphosphat-DNA-Präzipitat für 4–5 Stunden bei 37°C und 5% CO₂, 3–4 mal mit DMEM gewaschen, um das Präzipitat zu entfernen, gefolgt von dem Zusatz von c-DMEM. Lipofektamintransfektionen werden durchgeführt in serumfreiem DMEM ohne Antibiotika, gemäß den Herstelleranweisungen. Nach einer 2–3-stündigen Inkubation mit dem DNA-Liposomenkomplex wird das Medium entfernt und durch C-DMEM ersetzt.
Apoptotische Induktion von Caspase-GFP-Translokation. Um Caspase-GFP-translokationskinetische Daten zu erhalten, werden die Kerne von transfizierten Zellen zunächst mit 5 μg/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) in D-DMEM für 20 Minuten bei 37°C und 5% CO₂ markiert. Die Zellen werden dann einmal in Hank's Balancierter Salzlösung (HBSS) gewaschen, gefolgt von dem Zusatz von Verbindungen, die Apoptose induzieren. Diese Verbindungen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Paclitaxel, Staurosporin, Ceramid und Tumornekrosefaktor. Um Titrationsdaten zu festgelegten Zeitpunkten zu erhalten, werden transfizierte Zellen zunächst mit DMEM gewaschen und dann bei 37°C und 5% CO₂ für 1 h in Anwesenheit von 0–1000 nM Verbindung in DMEM inkubiert. Die Zellen werden lebend analysiert oder sie werden mit HBSS gespült, fixiert für 15 Min. mit 3,7%-igem Formaldehyd in HBSS, gefärbt mit Hoechst 33342 und vor der Analyse gewaschen.
Bilderfassung und -analyse. Kinetische Daten werden gesammelt durch Erfassen von Fluoreszenzbildpaaren (Caspase-GFP und Hoechst 33342-markierter Kerne) aus Feldern von lebenden Zellen in 1 Min.-Intervallen für 30 Min. nach Zusatz der Verbindung. Ebenso werden Bildpaare von jeder Vertiefung der Screeningplatten mit festgelegten Zeitpunkten 1 h nach Zusatz der Verbindung erhalten. In beiden Fällen werden die Bildpaare, die zu jedem Zeitpunkt erhalten wurden, verwendet, um Kern- und cytoplasmatische Regionen in jeder Zelle zu definieren. Translokation von Caspase-GFP wird berechnet durch Teilen der integrierten Fluoreszenzintensität von Caspase-GFP in dem Kern durch die integrierte Fluoreszenzintensität der Chimäre in dem Cytoplasma oder als Kern-cytoplasmatische Differenz der GFP-Fluoreszenz. In dem Screen mit festgelegten Zeitpunkten ist dieses Translokationsverhältnis berechnet aus Daten, die von wenigstens 200 Zellen bei jeder Konzentration der getesteten Verbindung erhalten wurden. Arzneimittel-induzierte Translokation des Caspase-GFP aus dem Cytoplasma in den Kern ist deshalb mit einem Anstieg in dem Translokationsverhältnis korreliert. Molekulare Interaktionsbibliotheken einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf diejenigen, die mögliche Aktivatoren oder Inhibitoren von Apoptose-aktivierten Enzymen umfassen, werden verwendet, um die Indikatorzelllinien zu screenen und einen spezifischen Liganden für das DAS und einen Signalweg, der durch Verbindungsaktivität aktiviert wird zu identifizieren.
Beispiel B. Identifikation von neuen Steroidrezeptoren von DAS
Zwei Quellen für Material und/oder Information sind erforderlich, um diese Ausführungsform zu verwenden, die die Einschätzung der Funktion eines uncharakterisierten Gens ermöglicht. Zunächst kann (können) krankheitsassoziierte Sequenzbanken) die cDNA-Sequenzen enthalten, die geeignet sind für die Transfektion in Säugerzellen, verwendet werden. Da jedes BADE oder differentielle Expressionsexperiment bis zu mehreren Hundert Sequenzen erzeugt, ist es möglich, einen hinreichenden Vorrat an DHF zu erzeugen. Weiterhin kann die Information von Primärsequenz-Datenbankrecherchen verwendet werden, um DAS in weite Kategorien einzuteilen, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf diese, die Signalsequenzen enthalten, sieben Transmembranmotive, konservierte Protease-Aktivierungsstellendomänen oder andere identifizierbare Motive. Basierend auf den Informationen, die aus diesen Quellen erhalten wurden, werden Verfahrenstypen und Indikatorzelllinien, die transfiziert werden sollen, ausgewählt. Eine große Anzahl von Motiven ist bereits gut charakterisiert und kodiert in den linearen Sequenzen, die in der großen Anzahl von Genen, in existierenden genomischen Datenbanken, enthalten sind.
In einer Ausführungsform werden die folgenden Schritte durchgeführt:

1) Die Information aus dem DAS-Identifikationsexperiment (einschließlich Datenbanksuchen) wird verwendet, als Basis zur Auswahl des relevanten biologischen Prozesses. (Zum Beispiel das DAS aus einer Tumorzelllinie für Zellzyklusmodulation, Apoptose, metastatische Proteasen, usw.)
2) Sortieren der DNA-Sequenzen oder DAS durch identifizierbare Motive (d. h. Signalsequenzen, 7-Transmembrandomänen, konservierte Proteaseaktivierungsstellendomänen, usw). Die anfängliche Gruppierung wird die Fluoreszenzmarkierungsstrategien, Wirtszelllinien, Indikatorzelllinien und Banken der bioaktiven Moleküle, die gescreent werden sollen, bestimmen, wie oben beschrieben.
3) Unter Verwendung von gut etablierten molekularbiologischen Verfahren wird DAS in einen Expressionsvektor, der für diesen Zweck konstruiert wurde, ligiert. Generalisierte Expressionsvektoren enthalten Promotoren, Verstärker und Terminatoren, um die Zielsequenzen in die Zelle zur transienten Expression zu liefern. Solche Vektoren können auch Antikörpermarkierungssequenzen, direkte Assoziationssequenzen, chromophore Fusionssequenzen, wie GFP, usw. enthalten, um den Nachweis zu erleichtern, wenn sie im Wirt exprimiert werden.
4) Transientes Transfizieren von Zellen mit DAS enthaltenden Vektoren unter Verwendung von Standardtransfektionsprotokollen, einschließlich: Calciumphosphat-Copräzipitation, Liposomen-vermittelt, DEAE-Dextran-vermittelt, Polykation-vermittelt, Viral vermittelt oder Elektroporation und Plattieren in Mikrotiterplatten oder Mikrovertiefungsarrays. Alternativ kann die Transfektion direkt in der Mikrotiterplatte selbst durchgeführt werden.
5) Ausführen der Zellscreeningverfahren, wie oben beschrieben.
In dieser Ausführungsform werden DAS verwendet, die gezeigt haben, dass sie ein Motiv (Motive) besitzen, die ein sinnvolles transkriptionelles Aktivierungspotential besitzen (z. B. DNA-Bindedomäne, Amino-terminale Modulationsdomäne, Gelenkregion oder Carboxy-terminale Ligandenbindedomäne, um neue Steroidrezeptoren zu identifizieren.

Das Definieren der fluoreszierenden Markierungen für dieses Experiment schließt die Identifizierung der Kernfärbung und Markierung des DAS durch Erzeugen einer GFP-Chimäre über Insertion von DAS in einen Expressionsvektor, nah fusioniert zu dem Gen, das GFP kodiert, ein. Alternativ kann ein Einzelketten-Antikörperfragment mit hoher Affinität zu einigen Teilen der exprimierten DAS konstruiert werden, unter Verwendung von Technologie, die im Stand der Technik erhältlich ist (Cambridge Antibody Technologies) und verbunden werden mit einer Fluorophore (FITC), um den möglichen transkriptionellen Aktivator/Rezeptor in der Zelle zu markieren. Diese Alternative würde eine externe Markierung zur Verfügung stellen, was keine DNA-Transfektion erfordern würde und deshalb würde sie nützlich sein, wenn Verteilungsdaten von den original-primären Zellkulturen, die verwendet wurden, um DAS zu erzeugen, gesammelt werden sollen.
Plasmidkonstrukt. Ein eukaryotisches Expressionsplasmid, das eine kodierende Sequenz für eine grünfluoreszierende Protein-DAS-Chimäre enthält, wird hergestellt unter Verwendung von GFP-Mutanten. Das Konstrukt wird verwendet, um HeLa-Zellen zu transfizieren. Wenn das Plasmid in eine Wirtszelle transfiziert wird, produziert es ein GFP, das an das DAS-Protein-Produkt fusioniert ist, bezeichnet als GFP-DASpp.
Zellpräparation und Transfektion. HeLa-Zellen werden trypsiniert und unter Verwendung von DMEM, enthaltend 5% Aktivkohle/Dextran-behandeltes fötales Rinder Serum (FBS) (Hyclone) und 1% Penicillin-Streptomycin (C-DMEM)-plattiert, 12–24 Stunden vor der Transfektion und inkubiert bei 37°C und 5% CO₂. Transfektionen werden durchgeführt durch Calciumphosphat-Copräzipitation oder mit Lipofectamin (Life Technologies). Zur Calciumphosphat-Transfektion wird das Medium vor der Transfektion mit DMEM, enthaltend 5% Aktivkohle/Dextran-behandeltes FBS ersetzt. Zellen werden mit Calciumphosphat-DNA-Präzipitat für 4–5 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert und 3–4 mal mit DMEM gewaschen, um das Präzipitat zu entfernen, gefolgt von dem Zusatz von C-DEMEM. Lipofectamintransfektionen werden in serumfreien DMEM ohne Antibiotika gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt. Nach einer 2-3-stündigem Inkubation mit DNA-Liposomenkomplexen wird das Medium entfernt und mit C-DMEM ersetzt. Alle transfizierten Zellen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen werden inkubiert bei 33°C und 5% CO₂ für 24–48 Stunden vor der Arzneimittelbehandlung. Experimente werden mit dem transient exprimierten Rezeptor in HeLa-Zellen durchgeführt.
Lokalisierung von exprimiertem GFP-DASpp in Zellen. Um zelluläre Verteilungsdaten zu erhalten, werden die Kerne von transfizierten Zellen zunächst mit 5 μg/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) in C-DMEM für 20 Minuten bei 33°C und 5% CO₂ markiert. Die Zellen werden einmal in Hank's Balancierter Salzlösung (HBSS) gewaschen. Die Zellen werden lebend analysiert oder mit HBSS gespült, fixiert für 15 Min. mit 3,7 %-igem Formaldehyd in HBSS, gefärbt mit Hoechst 33342 und vor der Analyse gewaschen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bilderfassung und -analyse unter Verwendung des Zellscreeningsystems der vorliegenden Erfindung durchgeführt. Das intrazelluläre GFP-DASpp-Fluoreszenzsignal wird gesammelt durch erwerben von Fluoreszenzbildpaaren (GFP-DASpp und Hoechst 33342-markierten Kernen) von Feldzellen. Die Bildpaare, die zu jeder Zeit erhalten wurden, werden verwendet, um Kern und cytoplasmatische Regionen in jeder Zelle zu definieren. Daten, die verteilte Signale in dem Cytoplasma zeigen, würden mit bekannten Steroidrezeptoren, die DNA-transkriptionelle Aktivatoren sind, übereinstimmen.
Screening auf Induktion von GFP-DASpp-Translokation. Unter Verwendung des vorstehenden Konstrukts, das für geeignete Expression des GFP-DASpp als eine Indikatorzelllinie bestätigt wurde, wird ein Screen verschiedener Liganden durchgeführt unter Verwendung einer Reihe von Steroidtypliganden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Östrogen, Progesteron, Retinoide, Wachstumsfaktoren, Androgene und viele andere Steroide und Steroidbasierte Moleküle. Bildertasssung und -analyse wird durchgeführt unter Verwendung des erfindungsgemäße Zellscreeningsystems. Das intrazelluläre GFP-DASpp-Fluoreszenzsignal wird gesammelt durch Erfassen von Fluoreszenzbildpaaren (GFP-DASpp und Hoechst 33342-markierte Kerne) aus Feldzellen. Die Bildpaare, die zu jedem Zeitpunkt erhalten werden, werden verwendet, um Kern und cytoplasmatische Region in jeder Zelle zu definieren. Die Translokation von GFP-DASpp wird berechnet durch Teilen der integrierten Fluoreszenzintensität von GFP-DASpp in dem Kern durch die integrierte Fluoreszenzintensität der Chimäre in dem Cytoplasma oder als eine Kern-cytoplasmatische Differenz von GFP-Fluoreszenz. Eine Translokation aus dem Cytoplasma in den Kern zeigt eine Ligandenbindungsaktivierung von dem DASpp an, und identifiziert somit die potentielle Rezeptorklasse und Wirkung. Die Kombination dieser Daten mit anderen Daten, die in ähnlicher Weise erhalten wurden, unter Verwendung von bekannten Inhibitoren und Modifizierern von Steroidrezeptoren, würde entweder das DASpp als ein Ziel bestätigen oder es würden mehr Daten von verschiedenen Quellen erzeugt werden.
Beispiel 9 Zusätzliche Screens
Translokation zwischen der Plasmamembran und dem Cytoplasma:
Profilactin-Komplex-Dissoziation und Bindung von Profilin an die Plasmamebran. In einer Ausführungsform wird ein fluoreszierender Proteinbiosensor der Profilin-Membranbindung hergestellt durch Markieren von gereinigtem Profilin (Federov et al. (1994), J. Molec. Biol. 241: 480–482; Lanbrechts et al. (1995), Eur. J. Biochem. 230: 281–286) mit einer Sonde, die eine Fluoreszenzlebenszeit in dem Bereich von 2-300 ns besitzt. Das markierte Profilin wird in lebende Indikatorzellen eingeführt unter Verwendung der Gesamtbeladungsverfahren und die Indikatorzellen werden mit Testverbindungen behandelt. Fluoreszenz Anisotrophie-Bildmikroskopie (Gough und Taylor (1993), J. Cell Biol. 121: 1095–1107) wird verwendet, um die testverbindungsabhängige Bewegung von fluoreszierenden Derivaten von Profilin zwischen dem Cytoplasma und der Membran für einen Zeitraum nach Behandlung von etwa 0,1 s bis 10 h zu messen, Rho-RhoGDI-Komplextranslokation zur Membran. In einer anderen Ausführungsform werden Indikatorzellen mit Testverbindungen behandelt und dann fixiert, gewaschen und permeabilisiert. Die Indikatorzell-Plasmamembran, Cytoplasma und Kern werden alle mit verschiedenfarbigen Markern markiert, gefolgt von Immunolokalisierung von Rohprotein (Self et al. (1995), Methods in Enzymology 256: 3–10; Tanaka et al. (1995), Methods in Enzymology 256: 41–49) mit Antikörpern, die mit einer vierten Farbe markiert sind. Jede dieser vier Markierungen wird separat abgebildet unter Verwendung des Zellscreeningsystems und die Bilder werden verwendet, um die Menge der Inhibierung oder Aktivierung von Translokation, die durch die Testverbindung bewirkt wird, zu berechnen. Um diese Berechnung durchzuführen, werden die Bilder der Sonden, die verwendet wurden, um die Plasmamebran und das Cytoplasma zu markieren, verwendet, um das Bild der immunologischen Sonde, die die Lokalisation von intrazellulärem Rohprotein markiert, zu maskieren. Die integrierte Helligkeit pro Einheitsbereich unter jeder Maske wird verwendet, um einen Translokationsquotienten zu bilden durch Teilen der Plasmamembran-integrierten Helligkeit/Bereich durch die cytoplasmatisch integrierte Helligkeit/Bereich. Durch Vergleichen der Translokationsquotientenwerte von Kontroll- und experimentellen Vertiefungen wird die prozentuale Translokation für jede potentielle Leitverbindung berechnet.
β-Arrestin-Translokation zu der Plasmamembran nach G-Proteinrezeptoraktivierung.
In anderen Ausführungsform einer Cytoplasma-zu-Kern-Translokation in einem Screen mit hohem Gehalt wird die Translokation von β-Arrestinprotein von dem Cytoplasma zu der Plasmamembran in Antwort auf Zellbehandlung gemessen. Um die Translokation zu messen, werden lebende Indikatorzellen, die lumineszierende Bereichmarker enthalten, mit Testverbindungen behandelt und die Bewegung von dem β-Arrestinmarker wird gemessen in Zeit und Raum unter Verwendung des Zellscreeningsystems der vorliegenden Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Indikatorzellen lumineszierende Marker, die aus einer grünfluoreszierenden Protein-β-Arrestin (GFP-β-Arrestin)-Proteinchimäre bestehen (Barak et al. (1997), J. Biol.Chem. 272: 27497–27500; Daaka et al. (1998), J. Biol. Chem. 273: 685–688), die von den Indikatorzellen exprimiert wird, durch die Verwendung von transienter oder stabiler Zelltransfektion und anderen Reportern, die verwendet werden, um cytoplasmatische und Membrandomänen zu markieren. Wenn die Indikatorzellen in dem Rohzustand sind, verteilen sich die Bereichsmarkermoleküle hauptsächlich in die Plasmamembran oder in das Cytoplasma. In dem Screen mit hohem Gehalt werden diese Marken verwendet, um das Zellzytoplasma und Plasmamembran in verschiedene Kanäle der Fluoreszenz zu beschreiben. Wenn die Indikatorzellen mit einer Testverbindung behandelt wer den, wird die dynamische Umverteilung von GFP-β-Arrestin berichtet als eine Reihe von Bildern über einen Zeitraum, der von 0,1 s bis 10 h reicht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Zeitmaß 1 h. Jedes Bild wird analysiert durch ein Verfahren, das die Bewegung der GFP-β-Arrestinproteinchimäre zwischen der Plasmamembran und dem Cytoplasma quantifiziert. Um diese Berechnung durchzuführen, werden die Bilder der Sonden, die verwendet wurden, um die Cytoplasmamembran und das Cytoplasma zu markieren, verwendet, um das Bild der GFP-β-Arrestinsonde, die den Ort des intrazellulären GFP-β-Arrestinproteins markiert, zu maskieren. Die integrierte Helligkeit pro Einheitsbereich unter jeder Maske wird verwendet, um einen Translokationsquotienten zu bilden, durch Teilen der Plasmamembranintegrierten Helligkeit/Bereich durch die cytoplasmatisch integrierte Helligkeit/ Bereich. Durch Vergleichen der Translokationsquotientenwerte von Kontroll- und experimentellen Vertiefungen wird die prozentuale Translokation für jede potentielle Leitverbindung berechnet. Die Ausgabe des Screens mit hohem Gehalt bezieht sich auf quantitative Daten, die das Maximum der Translokation in einer großen Zahl von individuellen Zellen beschreibt, die mit den Testverbindungen von Interesse behandelt wurden.
Translokation zwischen dem endoplasmatischen Reticulum und dem Golgi:
In einer Ausführungsform eines Screens mit hohem Gehalt der Translokation vom endoplasmatischen Reticulums zum Golgi wird die Translokation eines VSVG-Proteins aus dem ts045-Mutantenstamm des vesikulären Stomatitisvirus (Ellenberg et al. (1997), J. Cell. Biol. 138: 1193–1206; Presley et al. (1997) Nature 389: 81–85) aus dem endoplasmatischen Reticulum zu dem Golgi-Bereich gemessen, in Antwort auf Zellbehandlung. Um die Translokation zu messen, wurden Indikatorzellen, die lumineszierende Reporter enthielten, mit Testverbindungen behandelt und die Bewegung der Reporter wurde in Raum und Zeit gemessen unter Verwendung des Zellscreeningsystems der vorliegenden Erfindung. Die Indikatorzellen enthalten lumineszierende Reporter, die aus einer GFP-VSVG-Proteinchimäre bestehen, die durch die Indikatorzellen durch Verwendung einer transienten oder stabilen Zelltransfektion exprimiert werden und andere Bereichsmarker werden verwendet, um die Lokalisierung des endoplasmatischen Reticulums und Golgi-Bereichs zu messen. Wenn die Indikatorzellen in ihrem Ruhezustand sind bei 40°C, verteilen sich die GFP-VSVG-Proteinchimärenmoleküle hauptsächlich in dem endoplasmatischen Reticulum. In dem Screen mit hohem Gehalt werden Bereichsmarker von unterschiedlicher Farbe verwendet, um das endoplasmatische Reticulum und den Golgi-Bereich in verschiedenen Kanälen der Fluoreszenz zu beschreiben. Wenn die Indikatorzellen mit einer Testverbindung behandelt werden und die Temperatur gleichzeitig auf 32°C verringert wird, wird die dynamische Umverteilung der GFP-VSVG-Proteinchimäre als eine Reihe von Bildern über einen Zeitrahmen, der von 0,1 s bis 10 h reicht, berichtet. Jedes Bild wird durch ein Verfahren analysiert, das die Bewegung der GFP-VSVG-Proteinchimäre zwischen dem endoplasmatischen Reticulum und dem Golgi-Bereich quantifiziert. Um diese Berechnung durchzuführen, werden die Bilder von den Sonden, die verwendet wurden, um das endoplasmatische Reticulum und den Golgi-Bereich zu markieren, verwendet, um das Bild der GFP-VSVG-Sonde, die den Ort des intrazellulären GFP-VSVG-Proteins markiert, zu maskieren. Die integrierte Helligkeit pro Einheitsbereich unter jeder Maske wird verwendet, um einen Translokationsquotienten zu bilden durch Teilen der integrierten Helligkeit/Bereich des endoplasmatischen Reticulums durch die integrierte Helligkeit/Bereich des Golgi. Durch Vergleichen der Translokationsquotientenwerte von Kontroll- und experimentellen Vertiefungen wird die prozentuale Translokation berechnet für jede potentielle Leitverbindung. Die Ausgabe des Screens mit hohem Gehalt bezieht sich auf quantitative Daten, die das Maximum der Translokation in einer großen Anzahl von individuellen Zellen beschreibt, die mit einer Testverbindung von Interesse bei einer Endkonzentration im Bereich von 10^–12 M bis 10^–3 Mol für einen Zeitraum im Bereich von 1 Min. bis 10 h behandelt wurden.
Induktion und Inhibierung von Organellenfunktion:
Intrazelluläre Mikrotubulus-Stabilität.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein automatisiertes Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die Mikrotubulistruktur modifizieren, zur Verfügung gestellt. In dieser Ausführungsform werden Indikatorzellen mit Testverbindungen behandelt und die Verteilung von luminszierenden Mikrotubuli-markierenden Molekülen wird in Raum und Zeit gemessen unter Verwendung eines Zellscreeningsystems, wie das vorstehend offenbarte. Die lumineszierenden Mikrotubuli-markierten Moleküle können exprimiert werden von oder zugesetzt werden zu den Zellen entweder vor, zusammen mit oder nach In-Kontakt-Bringen der Zellen mit einer Testverbindung.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Aspekts exprimieren lebende Zellen einen lumineszenzmarkierten Proteinbiosensor der Mikrotubulidynamik, umfassend ein Protein, das Mikrotubuli fusioniert an ein Lumineszenzprotein markiert. Geeignete Mikrotubuli-markierende Proteine für diesen erfindungsgemäßen Aspekt schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf α- und β-Tubulinisoformen und MAP4. Bevorzugte Ausführungsformen des Lumineszenzproteins schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, grünfluoreszierendes Protein (GFP) und GFP-Mutanten. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt dieses Verfahren die Transfektion von Zellen mit einem Mikrotubuli-markierenden Lumineszenz protein ein, wobei das Mikrotubuli-markierende Protein α-Tubulin, β-Tubulin oder Mikrotubuliassozüertes Protein 4 (MAP4) sein kann, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Der hier dargelegte Ansatz ermöglicht dem Fachmann auf dem Gebiet, Lebendzellmessungen durchzuführen, um die Wirkung von Leitverbindungen auf Tubulinaktivität und Mikrotubulistabilität in vivo zu bestimmen.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird MAP4 an eine modifizierte Version des Aequorea victoria grün fluoreszierenden Proteins (GFP) fusioniert. Es wurde ein DNA-Konstrukt hergestellt, das aus einer Fusion zwischen der EGFP-kodierenden Sequenz (erhältlich von Clontech) und der kodierenden Sequenz von Maus-MAP4 besteht. (Olson et al., (1995), J. Cell Biol. 130(3); 639–650). MAP4 ist ein ubiquitäres Mikrotubuli-assoziiertes Protein, von dem bekannt ist, das es mit Mikrotubuli in Interphase, genauso wie mit mitotischen Zellen interagiert (Olmsted und Murofushi, (1993), MAP4 in "Guidebook to the Cytoskeleton and Motor Proteins." Oxford University Press. T. Kreis und R. Vale, Hrsg.). Seine Lokalisierung kann dann als ein Indikator für die Lokalisierung, Organisation und Integrität von Mikrotubuli in lebenden (oder fixierten) Zellen zu allen Stadien des Zellzyklus für zellbasierte HCS-Assays dienen. Während MAP2 und Tau- (Mikrotubuli-assoziierte Proteine, die spezifisch in neuronalen Zellen exprimiert werden) verwendet wurden, um GFP-Chimäre zu bilden (Kaech et al., (1996) Neuron. 17: 1189–1199; Hall et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 4733–4738), machen ihre beschränkte Zelltypverteilung und die Tendenz dieser Proteine, Mikrotubuli zu bündeln, wenn sie überexprimiert werden, diese Proteine weniger wünschenswert als molekulare Reagenzien zur Analyse in lebenden Zellen, die aus verschiedenen Geweben und Organen stammen. Gemäßigte Überexprimierung von GFP-MAP4 zerstört nicht die Mikrotubulifunktion oder -integrität (Olsen et al., 1995). Ähnliche Konstrukte können hergestellt werden unter Verwendung von β-Tubulin oder α-Tubulin durch Standardtechniken in dem Fachgebiet. Diese Chimären werden ein Mittel zur Verfügung stellen, um Mikrotubuliaktivität in lebenden Zellen während aller Stadien des Zellzyklus zu beobachten und zu analysieren.
In einer anderen Ausführungsform wird der Lumineszenz-markierte Proteinbiosensor der Mikrotubulidynamik exprimiert, isoliert und den Zellen, die analysiert werden sollen, durch Gesamtbeladungstechniken, wie Mikroinjektion, Scrape-Beladung und Impact-vermittelter Beladung zugefügt. In dieser Ausführungsform stellt sich die Frage der Überexprimierung in der Zelle nicht und somit können α- und β-Tubulinisoformen, MAP4, MAP2 und/oder Tau alle verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird der Proteinbiosensor von der Zelle exprimiert und die Zelle wird nachfolgend mit einer Lumineszenzmarkierung in Kontakt gebracht, wie einem markierten Antikörper, der den Proteinbiosensor, endogene Spiegel eines Proteinantigens oder beides nachweist. In dieser Ausführungsform kann eine Lumineszenzmarkierung, die αund β-Tubulinisoformen, MAP4, MAP2 und/oder Tau nachweist, verwendet werden.
Eine Vielzahl von GFP-Mutanten ist erhältlich, die alle wirksam in dieser Erfindung sein würden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf GFP-Mutanten, die kommerziell erhältlich sind (Clontech, Kalifornien).
Das MAP4-Konstrukt wurde in verschiedene Säugerzelllinien (BHK-21, Swiss 3T3, HeLa, HEK 293, LLCPK) eingeführt und die Organisation und Lokalisierung von Tubuli wurde in lebenden Zellen durch den Vorteil der GFP-Fluoreszenz als ein Indikator der MAP4-Lokalisierung visualisiert. Die Konstrukte können transient oder stabil exprimiert werden und Zelllinien können durch Standardverfahren hergestellt werden. Stabile HeLa-Zelllinien, die die EGFP-MAP4-Chimäre exprimieren, wurden erhalten, was anzeigt, dass die Expression der Chimäre nichttoxisch ist und die Mitose nicht stört.
Mögliche auswählbare Marken zur Etablierung und Aufrechterhaltung von stabilen Zelllinien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf das Neomycinresistenzgen, Hygromycinresistenzgen, Zeocinresistenzgen, Puromycinresistenzgen, Bleomycinresistenzgen und Blastacidinresistenzgen.
Die Nützlichkeit dieses Verfahrens zur Beobachtung des Mikrotubuliaufbaus, -abbaus und Umordnung wurde durch Behandlung von transient und stabil transfizierten Zellen mit Mikrotubuliarzneimitteln, wie Paclitaxel, Nocodazol, Vincristin oder Vinblastin gezeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt zellbasierte Screens mit hohem Gehalt und kombinierte Screens mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt für Antimikrotubuli-Arzneimittel zur Verfügung, insbesondere als ein Parameter in einem Multiparameterkrebszielscreen. Das hier verwendete EGFP-MAP4-Konstrukt kann auch verwendet werden als eine der Komponenten des Screens mit hohem Gehalt, der multiple Signaltransduktionswege oder physiologische Ereignisse misst. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein kombinierter Screen mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt eingesetzt, wobei viele Zellen in jedem der Orte, die Zellen enthalten, in einer Betriebsart mit hohem Durchsatz analysiert werden und nur eine Untergruppe der Orte, die Zellen enthalten, in der Betriebsart mit hohem Gehalt analysiert werden. Dieser Screen mit hohem Durchsatz könnte jeder Screen sein, der nützlich sein würde, um diese Orte zu identifizieren, die Zellen enthalten, die weiter analysiert werden sollten, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Identifizierung von Orten mit gesteigerter Lumineszenzintensität, die die Expression eines Reportergens zeigen, die die Calciumveränderungen durchleben und die die pH-Veränderungen durchleben.
Zusätzlich zu Arneimittel-Screeninganwendungen kann die vorliegende Erfindung angewendet werden auf klinische Diagnostik, den Nachweis von chemischen und biologischen Kriegswaffen und den Grundlagenforschungsmarkt, da grundlegende Zellprozesse, wie Zellteilung und Motilität stark abhängig sind von der Mikrotubulidynamik.
Bilderlangung und Analyse
Bilddaten können entweder von fixierten oder lebenden Indikatorzellen erhalten werden. Um morphologische Daten von jedem der Bilder, die erhalten wurden, zu extrahieren, wird das folgende Verfahren der Analyse verwendet:

1. Schwellenwertbestimmung jedes Kerns und cytoplasmatischen Bildes, um eine Maske zu erzeugen, die Wert = 0 für jeden Pixel außerhalb eines Kerns oder einer Zellgrenze hat.
2. Überlagern der Maske auf dem Originalbild, Nachweisen jedes Objekts in dem Feld (d. h. Kern oder Zelle) und Berechnen seiner Größe, Gestalt und integrierten Intensität.
3. Überlagern der gesamten Zellmaske, die vorstehend auf dem korrespondieren Lumineszenzmikrotubulibild erhalten wurde und Anwenden von einem oder mehreren der folgenden Sätze von Klassifizierern, um die Mikrotubulimorphologie und die Wirkung von Arzneimitteln auf Mikrotubulimorphologie zu bestimmen.

Die Mikrotubulimorphologie wird definiert unter Verwendung eines Satzes von Klassifizierern, um Aspekte der Mikrotubuliform, -größe, -aggregationsstatus und -polymerisierungsstatus zu quantifizieren. Diese Klassifizieren können auf Ansätzen basieren, die co-auftretende Matrices, Texturmessungen, Spektralverfahren, strukturelle Verfahren, Wellenlängentransformationen, statistische Verfahren oder Kombinationen davon einschließen. Beispiele von solchen Klassifizierern sind wie folgt:

1. Ein Klassifizieren, um Mikrotubulilänge und -breite zu quantifizieren, unter Verwendung von Randnachweisverfahren wie die, diskutiert in Kolega et al. ((1993). Biolmaging 1: 136–150), die ein nichtautomatisiertes Verfahren zur Bestimmung der Randstärke in individuellen Zellen offenbaren, um die Gesamtrandstärke in jeder Zelle zu berechnen. Um die Zellgröße zu normieren, kann die Gesamtrandstärke geteilt werden durch das Zellgebiet, um einen "Mikrotubulimorphologie"-Wert zu geben. Große Mikrotubulimorphologie-Werte sind mit starken Randstärken assoziiert und deshalb maximal in Zellen, die bestimmte Mikrotubulistrukturen enthalten. Ebenso sind geringe Mikrotubulimorphologie-Werte mit schwachen Randstärken-Werten assoziiert und minimal in Zellen mit depolymerisierten Mikrotubuli. Der physiologische Bereich der Mikrotubulimorphologie-Werte wird gesetzt durch Behandlung der Zellen mit entweder dem Mikrotubulistabilisierenden Arzneimittel Paclitaxel (10 μM) oder dem Mikrotubuli-depolymerisierenden Arzneimittel Nocodazol (10 μg/ml).
2. Ein Klassifizieren zur Quantifizierung von Mikrotubuliaggregation in punktierte Punkte oder Fokusse unter Verwendung der Verfahren der Rezeptorinternalisierungsvertahren, die oben diskutiert wurden.
3. Ein Klassifizieren zur Quantifizierung der Mikrotubulidepolymerisierung unter Verwendung eines Maßes der Bildtextur.
4. Ein Klassifizieren zur Quantifizierung der apparenten Zusammenschaltung oder Verzweigung (oder beides) der Mikrotubuli.
5. Messung der Kinetik von Mikrotubulireorganisation unter Verwendung der vorstehenden Klassifizieren in einer Zeitserie von Bildern von Zellen, die mit Testverbindungen behandelt wurden.

In einem weiteren Aspekts werden Kits zur Analyse der Mikrotubulistabilität zur Verfügung gestellt, umfassend einen Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure, die ein Mikrotubulimarkierendes Protein kodiert, und Instruktionen zur Verwendung des Expressionsvektors zur Ausführung der vorstehend beschriebenen Verfahren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Expressionsvektor weiterhin eine Nukleinsäure, die ein lumineszierendes Protein kodiert, wobei das Mikrotubuli-bindende Protein und das lumineszierende Protein davon in einem Fusionsprotein exprimiert werden. Alternativ kann der Kit einen Antikörper enthalten, der spezifisch an das Mikrotubuli-markierende Protein bindet. In einem weiteren Aspekt schließt der Kit Zellen ein, die das Mikrotubuli-markierende Protein exprimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen mit dem Expressionsvektor transfiziert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die Kits weiterhin eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie Mikrotubulistruktur zerstört, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf Curacin, Nocodazol, Vincristin oder Vinblastin. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die Kits weiterhin eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie Mikrotubulistruktur stabilisiert, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Taxol (Paclitaxel) und Discodermolid.
In einem anderen Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein maschinenlesbares Speichermedium, das ein Programm umfasst, das einen Satz von Instruktionen enthält zur Veranlassung eines Zellscreeningsystems, die offenbarten Verfahren zur Analyse der Mikrotubulistabilität auszuführen, wobei das Zellscreeningsystem ein optisches System umfasst, mit einer Bühne, die zum Halten einer Platte, die Zellen enthält, angepasst ist, eine digitale Kamera, eine Vorrichtung zur Führung der Fluoreszenz oder Lumineszenz, die von den Zellen emittiert wird, zu der digitalen Kamera und eine Computervorrichtung zum Empfang und zur Prozessierung der digitalen Daten von der digitalen Kamera.
Screens mit hohem Gehalt, die die funktionelle Lokalisierung von Makromolekülen einschließen
In dieser Klasse von Screens mit hohem Gehalt wird die funktionelle Lokalisierung von Makromolekülen in Antwort auf externe Stimuli in lebenden Zellen gemessen.
Glycolytische Enzymaktivitätsregulierung. In einer bevorzugten Ausführungsform eines zellulären Enzymaktivitätsscreens mit hohem Gehalt wird die Aktivität von glycolytischen regulatorischen Schlüsselenzymen in behandelten Zellen gemessen. Um Enzymaktivität zu messen, werden Indikatorzellen, die lumineszierend markierte Reagenzien enthalten, mit Testverbindungen behandelt und die Aktivität der Reporter wird in Raum und Zeit gemessen unter Verwendung des Zellscreeningsystems der vorliegenden Erfindung.
In einer Ausführungsform ist der Reporter der intrazellulären Enzymaktivität Fructose-6-phosphat, 2-Kinase/Fructose-2,6-bisphosphatase (PFK-2), ein regulatorisches Enzym, dessen Phosphorylierungsstatus intrazellulären Kohlehydratanabolismus oder -katabolismus anzeigt (Deprez et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 17269–17275; Kealer et al. (1996) FEBS Letters 395: 225–227; Lee et al. (1996), Biochemistry 35: 6010–6019). Die Indikatorzellen enthalten lumineszierende Reporter, die aus einem Fluoreszenzproteinbiosensor der PFK-2-Phosphorylierung bestehen. Der fluoreszierende Proteinbiosensor ist konstruiert durch die Einführung eines umgebungssensitiven Fluoreszenzfarbstoffs nahe der bekannten Phosphorylierungsstelle des Enzyms (Deprez et al. (1997), oben; Giuliano et al. (1995), oben). Der Farbstoff kann aus der Ketocyaninklasse sein (Kessler und Wolfbeis (1991), Spectrochimica Acta 47A: 187–192) oder jeder Klasse, die eine Protein-reaktive Gruppe und ein Fluorochrom enthält, dessen Anregungs- oder Emissionsspektrum empfindlich für Lösungspolarität ist. Der fluoreszierende Proteinsensor wird in die Indikatorzellen eingebracht unter Verwendung des Gesamtbeladungsverfahrens.
Lebende Indikatorzellen werden mit Testverbindungen mit einer Endkonzentrationen im Bereich von 10^–12 M bis 10^–3 M für Zeiten im Bereich von 0,1 s bis 10 h behandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Verhältnisbilddaten von lebend behandelten Indikatorzellen erhalten durch Sammeln eines Spektralpaars von Fluoreszenzbildern zu jedem Zeitpunkt. Um morphometrische Daten von jedem Zeitpunkt zu extrahieren, wird ein Quotient aus jedem Paar von Bildern durch numerisches Teilen der zwei Spektralbilder zu jedem Zeitpunkt, Pixel für Pixel gebildet. Jeder Pixelwert wird dann verwendet, um die fraktionelle Phosphorylierung von PFK-2 zu errechnen. Bei geringen fraktionellen Werten der Phosphorylierung stimuliert PFK-2 Kohlehydratkatabolismus. Bei hohen fraktionellen Werten der Phosphorylierung stimuliert PFK-2 Kohlehydratanabolismus.
Proteinkinase A-Aktivität und Lokalisierung von Untereinheiten. In einer anderen Ausführungsform des Screens mit hohem Gehalt werden sowohl die Bereichlokalisierung als auch die Aktivität der Proteinkinase A (PKA) in Indikatorzellen gemessen, in Antwort auf Behandlung mit Testverbindungen.
Die Indikatorzellen enthalten lumineszierende Reporter, die einen Fluoreszenzproteinbiosensor der PKA-Aktivierung einschließen. Der Fluoreszenzproteinbiosensor ist konstruiert durch Einführen eines umgebungsempfindlichen fluoreszierenden Farbstoffs in die katalytische Untereinheit der PKA nahe der Stelle, von der bekannt ist, dass sie mit der regulatorischen Untereinheit der PKA interagiert, eingeführt (Harootunian et al. (1993), Mol. Biol. of the Cell 4: 993–1002; Johnson et al. (1996), Cell 85: 149–158; Giuliano et al. (1995), oben). Der Farbstoff kann aus der Ketocyaninklasse (Kessler und Wolfbeis (1991), Spectrochimica Acta 47A: 187–192) oder aus jeder anderen Klasse, die eine Protein-reaktive Gruppe und ein Fluorochrom enthält, sein, dessen Anregungs- oder Emissionsspektrum empfindlich gegen Lösungspolarität ist. Der fluoreszierende Proteinbiosensor der PKA-Aktivierung ist in die Indikatorzellen eingeführt unter Verwendung von Gesamtladungsverfahren.
In einer Ausführungsform werden lebende Indikatorzellen mit einer Testverbindung bei einer Endkonzentration im Bereich von 10^–12 M bis 10^–3 M für Zeiten im Bereich von 0,1 s bis 10 h behandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Verhältnisbilddaten von lebend behandelten Indikatorzellen erlangt. Um Biosensordaten von jedem Zeitpunkt zu extrahieren, wird ein Quotient zwischen jedem Paar von Bildern gebildet und jeder Pixelwert wird dann verwendet, um die fraktionelle Aktivierung der PKA (z. B. Trennung der katalytischen und regulatorischen Untereinheiten nach cAMP-Bindung) zu berechnen. Bei hohen fraktionellen Werten der Aktivität stimuliert PFK-2 biochemische Kaskaden in lebenden Zellen.
Um die Translokation der katalytischen Untereinheit der PKA zu messen, werden Indikatorzellen, die lumineszierende Reporter enthalten, mit Testverbindungen behandelt und die Bewegung der Reporter wird in Raum und Zeit gemessen unter Verwendung des Zellscreeningsystems. Die Indikatorzellen enthalten lumineszierende Reporter, bestehend aus einem Bereichsmarker, der verwendet wird, um die Lokalisierung der cytoplasmatischen und Kernbereiche zu messen. Wenn die Indikatorzellen mit einer Testverbindung behandelt werden, wird eine dynamische Umverteilung von einem PKA-Fluoreszenzproteinbiosensor intrazellulär aufgenommen als eine Reihe von Bildern über einen Zeitraum, der von 0,1 s bis 10 h reicht. Jedes Bild wird analysiert von einem Verfahren, das die Bewegung der PKA zwischen den cytoplasmatischen und Kernregionen quantifiziert. Um diese Berechnung durchzuführen, werden die Bilder der Sonden, die verwendet wurden, um die cytoplasmatischen und Kernregionen zu markieren, verwendet, um das Bild des PKA-Fluoreszenzproteinbiosensors zu maskieren. Die integrierte Helligkeit pro Einheitsbereich unter jeder Maske wird verwendet, um einen Translokationsquotienten durch Teilen der cytoplasmatisch integrierten Helligkeit/Bereich durch die kernintegrierte Helligkeit/Bereich zu bilden. Durch Vergleichen der Translokationsquotientenwerte von Kontroll- und experimentellen Vertiefungen wird die prozentuale Translokation für jede potentielle Leitverbindung berechnet. Die Ausgabe des Screens mit hohem Gehalt bezieht sich auf quantitative Daten, die das Maximum der Translokation in einer großen Anzahl von individuellen Zellen beschreibt, die mit Testverbindungen in dem Konzentrationsbereich von 10^–12 M bis 10^–3 M behandelt wurden.
Screens mit hohem Gehalt, die die Induktion oder Inhibierung der Genexpression einschließen
RNA-basierte Fluoreszenzbiosensoren
Cytoskelett-Proteintranskription und Message (Botschaft) -Lokalisierung. Die Regulation einer generellen Klasse von zellphysiologischen Antworten einschließlich Zellsubstratadhäsion, Zell-Zell-Adhäsion, Signaltransduktion, Zellzyklusereignissen, intermediärer und Signalmolekülmetabolismus, Zelllokomotion, Zell-Zell-Kommunikation und Zelltod können die Veränderung der Genexpression einschließen. Screens mit hohem Gehalt können auch konstruiert werden, um diese Klasse der physiologischen Antwort zu messen.
In einer Ausführungsform ist der Reporter der intrazellulären Genexpression ein Oligonukleotid, das mit einer Ziel-mRNA hybridisieren kann und sein Fluoreszenzsignal verändert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein molekulares Lichtsignal ("Beacon") (Tyagi und Kramen (1996) Nat. Biotechnol. 14: 303–308), ein lumineszenzbasiertes Reagens, dessen Fluoreszenzsignal abhängig von intermolekularen und intramolekularen Interaktionen ist. Der Fluoreszenzbiosensor wird durch Einführen eines Fluoreszenzenergietransferpaares von Fluoreszenzfarbstoffen konstruiert, so dass dort eins an jedem Ende (5' und 3') des Reagens ist. Die Farbstoffe können aus jeder Klasse sein, die eine Proteinreaktive Gruppe enthält und Fluorochrome, deren Anregungs- und Emissionsspektrum ausreichend überlappen, um Fluoreszenzenergietransfer zwischen den Farbstoffen in dem Ruhezustand zur Verfügung zu stellen, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf Fluorescein und Rhodamin (Molecular Probes, Inc.). In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Teil der Message (Botschaft), die für β-Actin kodiert (Kislauskis et al. (1994), J. Cell Biol. 127: 441–451; McCann et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 5679–5684; Sutoh (1982), Biochemistry 21: 3654–3661) in die Schleifenregion eines Haarpin-geformten Oligonucleotids inseriert, mit den Enden zusammengebunden aufgrund der intramolekularen Hybridisierung. An jedem Ende des Biosensors ist ein Fluoreszenzdonor (Fluorescein) und ein Fluoreszenzakzeptor (Rhodamin) kovalent gebunden. In dem zusammengebundenen Status ist der Fluoreszenz-Energietransfer maximal und deshalb ein Maß für ein unhybridisiertes Molekül. Wenn mit einer mRNA, die für β-Actin kodiert, hybridisiert wird, wird die Bindung gebrochen und Energietransfer geht verloren. Der vollständige Fluoreszenzbiosensor wird in die Indikatorzellen eingeführt unter Verwendung des Gesamtbeladungsverfahrens.
In einer Ausführungsform werden lebende Indikatorzellen mit Testverbindungen bei einer finalen Konzentration im Bereich von 10^–12 M bis 10^–3 M für Zeiten im Bereich von 0,1 s bis 10 h behandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Verhältnisbilddaten von lebend behandelten Indikatorzellen erhalten. Um morphometrische Daten von jedem Zeitpunkt zu extrahieren, wird ein Verhältnis zwischen jedem Paar von Bildern gebildet und jeder Pixelwert wird dann verwendet, um die fraktionelle Hybridisierung der markierten Nucleotide zu berechnen. Bei geringen fraktionellen Werten der Hybridisierung wird geringe β-Actinexpression angezeigt. Bei hohen fraktionellen Werten der Hybridisierung wird maximale Expression von β-Actin angezeigt. Weiterhin ist die Verteilung von hybridisierten Molekülen in dem Cytoplasma der Indikatorzellen auch ein Maß der physiologischen Antwort der Indikatorzellen.
Zelloberflächenbindung eines Liganden
Bindung von markiertem Insulin an seinen Oberflächenrezeptor in lebenden Zellen. Zellen, deren Plasmamembranbereich mit einem Markierungsreagens einer bestimmten Farbe markiert wurde, werden mit einer Lösung, die Insulinmoleküle enthält, inkubiert (Lee et al. (1997), Biochemistry 36: 2701–2708; Martinez-Zaguilan et al. (1996), Am. J. Physiol. 270: C1438–C1446), die mit einer lumineszierenden Sonde einer anderen Farbe markiert sind, für eine angemessene Zeit unter angemessenen Bedingungen. Nach der Inkubation werden ungebundene Insulinmoleküle weggewaschen, die Zellen werden fixiert und die Verteilung und Konzentration des Insulins auf der Plasmamembran wird gemessen. Um dies zu tun, wird ein Zellmembranbild verwendet als eine Maske für das Insulinbild. Die integrierte Intensität von dem maskierten Insulinbild wird mit einem Satz von Bildern, die bekannte Mengen von markiertem Insulin enthalten, verglichen. Die Menge an gebundenem Insulin an die Zelle wird aus den Standards bestimmt und in Verbindung mit der Gesamtkonzentration des Insulins, das mit der Zelle inkubiert wurde, verwendet, um eine Dissoziationskonstante oder Insulin zu seinem Oberflächenrezeptor zu berechnen.
Markierung von zellulären Komparfimenten
Gesamtzellmarkierung
Gesamtzellmarkierung wird erreicht durch Markieren zellulärer Bestandteile, so dass die Dynamik der Zellform und Beweglichkeit der Zelle über die Zeit gemessen werden kann durch Analysieren der Fluoreszenzbilder der Zelle.
In einer Ausführungsform werden kleine reaktive fluoreszierende Moleküle in lebende Zellen eingebracht. Diese membrandurchdringenden Moleküle diffundieren beide durch und reagieren mit Proteinbestandteilen in der Plasmamembran. Farbstoffmoleküle reagieren mit intrazellulären Molekülen, um sowohl das emittierte Fluoreszenzsignal von jedem Molekül zu verstärken als auch, um den Fluoreszenzfarbstoff in lebenden Zellen zu fangen. Diese Moleküle schließen reaktive Chlormethylderivate von Aminocoumarinen, Hydroxycoumarinen, Eosindiacetat, Fluoresceindiacetat, einige Bodipy-Farbstoffderivate und Tetramethylrhodamin ein. Die Reaktivität dieser Farbstoffe gegen Makromoleküle schließt freie Aminogruppen und freie Sulfhydrylgruppen ein.
In einer anderen Ausführungsform wird die Zelloberfläche markiert, indem es der Zelle ermöglicht wird, mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder Lektinen (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) zu interagieren, die spezifisch mit Molekülen auf der Zelloberfläche reagieren. Zelloberflächenproteinchimären, die von der interessierenden Zelle exprimiert werden, die eine grünfluoreszierende Proteinkomponente oder Mutante davon enthalten, können auch verwendet werden, um die gesamte Zelloberfläche fluoreszenzzumarkieren. Sobald die gesamte Zelle markiert ist, können Bilder der gesamten Zelle oder von Zellarrays ein Parameter in Screens mit hohem Gehalt werden, was die Messung der Zellform, Beweglichkeit, Größe und Wachstum und Teilung einschließt.
Plasmamembran-Markierung
In einer Ausführungsform werden für die Markierung der gesamten Plasmamembran einige der gleichen Verfahren, die vorstehend für die Markierung von Gesamtzellen beschrieben wurden, verwendet. Lumineszierende Moleküle, die die gesamte Zelloberfläche markieren, wirken, um die Plasmamembran zu beschreiben.
In einer zweiten Ausführungsform können Unterdomänen der Plasmamembran, die extrazelluläre Oberfläche, die Lipiddoppelschicht und die intrazelluläre Oberfläche separat markiert werden und als Bestandteile des Screens mit hohem Gehalt verwendet werden. In der ersten Ausführungsform wird die extrazelluläre Oberfläche markiert, unter Verwendung einer kurzen Behandlung mit einem reaktiven Fluoreszenzmolekül, wie dem Succinimidylester oder lodacetamidderivaten von Fluoreszenzfarbstoften, wie den Fluoresceinen, Rhodaminen, Cyaninen und Bodipys.
In einer dritten Ausführungsform wird die extrazelluläre Oberfläche markiert unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Makromolekülen mit hoher Affinität für Zelloberflächenmoleküle. Diese schließen fluoreszenzmarkierte Lektine, wie das Fluorescein, Rhodamin und Cyanderivate von Lectinen, abgeleitet von der Jack-Bohne (Con A), der Roten Gartenbohne (Erythroagglutinin PHA-E) oder Weizenkeim ein.
In einer vierten Ausführungsform werden fluoreszenzmarkierte Antikörper mit hoher Affinität für Zellobertlächenbestandteile vennrendet, um die extrazelluläre Region der Plasmamembran zu markieren. Extrazelluläre Regionen der Zelloberflächenrezeptoren und Ionenkanäle sind Beispiele für Proteine, die mit Antikörpern markiert werden können.
In einer fünften Ausführungsform wird die Lipiddoppelschicht der Plasmamembran mit Fluoreszenzmolekülen markiert. Diese Moleküle schließen Fluoreszenzfarbstoffe ein, die an Langketten-hydrophobische Moleküle angeheftet werden, die stark mit der hydrophobischen Region in dem Zentrum der Plasmamembranlipiddoppelschicht interagieren. Beispiele dieser Farbstoffe schließen die PKH-Serie von Farbstoffen (U. S. 4,783,401, 4,762,701, und 4,859,584; kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), fluoreszierende Phospholipide, wie Nitrobenzoxadiazolglycerophosphoethanolamin und Fluoresceinderivatisiertes Dihexadecanoylglycerophosphoethanolamin, fluoreszierende Fettsäuren, wie 5-Butyl-4,4-difluor-4-bor-3a,4a-diazo-s-indacen-3-nonainsäure und 1-Pyrendecanoinsäure (Molecular Probes, Inc.), fluoreszierende Sterine, einschließlich Cholesterin 4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bor-3a,4a-diaza-s-indacen-3-dodecanoat und Cholesterin-1-pyrenhexanoat und fluoreszenzmarkierte Proteine, die spezifisch mit Lipiddoppelschichtbestandteilen, wie dem Fluoresceinderivat von Annexin V (Caltag Antibody Co., Burlingame, CA) interagieren, ein.
In einer weiteren Ausführungsform wird der intrazelluläre Bestandteil der Plasmamembran mit Fluoreszenzmolekülen markiert. Beispiele dieser Moleküle sind die intrazellulären Bestandteile des trimeren G-Proteinrezeptors, Adenylylcyclase und Ionentransportproteine. Diese Moleküle können markiert werden als ein Ergebnis der engen Bindung an fluoreszenzmarkierte spezifische Antikörper oder durch die Inkorporation einer Fluoreszenzproteinchimäre, die in einem Membran-assoziierten Protein und dem grünfluoreszierenden Protein enthalten ist und Mutanten davon.
Endosomen Fluoreszenzmarkierung
In einer Ausführungsform werden Liganden, die in die Zelle durch Rezeptor-vermittelte Endocytose transportiert werden, verwendet, um die Dynamik der endosomalen Organellen zu verfolgen. Beispiele von markierten Liganden schließen Bodipy FL-markierte Lipoproteinkomplexe geringer Dichte, Tetramethylrhodamintransferrinanaloga und fluoreszenzmarkierten epidermalen Wachstumsfaktor (Molecular Probes, Inc.) ein.
In einer zweiten Ausführungsform werden fluoreszenzmarkierte primäre oder sekundäre Antikörper (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Molecular Probes, Inc. Eugene, OR; Caltag Antibody Co.), die spezifisch endosomale Liganden markieren, verwendet, um das endosomale Kompartiment in der Zelle zu markieren.
In einer dritten Ausführungsform werden Endosomen fluoreszenzmarkiert in Zellen, die Proteinchimären exprimieren, die aus der Fusion eines grünfluoreszierenden Proteins oder Mutanten davon mit einem Rezeptor, dessen Internalisierung Endosomen-markiert gebildet wurden. Chimären der EGF, Transferrin und Lipoproteinrezeptoren geringer Dichte sind Beispiele für diese Moleküle.
Lysosomen Markierung
In einer Ausführungsform werden membrandurchdringende Lysosomen-spezifische lumineszierende Reagenzien verwendet, um das lysosomale Kompartiment von lebenden und fixierten Zellen zu markieren. Diese Reagenzien schließen die Lumineszenzmoleküle Neutral-Rot, N-(3-((2,4-Dinitrophenyl)amino)propyl)-N-(3-aminopropyl)methylamin und LysoTracker-Sonden, die intralysosomalen pH genauso wie die dynamische Verteilung von Lysosomen (Molecular Probes, Inc.) berichten, ein.
In einer zweiten Ausführungsform werden Antikörper gegen lysosomale Antigene (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) verwendet, um lysosomale Bestandteile zu markieren, die in spezifischen lysosomalen Bereichen lokalisiert sind. Beispiele für diese Bestandteile sind degradative Enzyme, die in der Cholesterinesterhydrolyse involviert sind, Membranprotein-Proteasen und -Nukleasen genauso wie ATP-betriebene lysosomale Protonenpumpen.
In einer dritten Ausführungsform werden Proteinchimären, die aus einem lysosomalen Protein, das genetisch an ein intrinsisches lumineszierendes Protein, wie das grünfluoreszierende Protein oder Mutanten davon, fusioniert ist, verwendet, um den lysosomalen Bereich zu markieren. Beispiele dieser Bestandteile sind degradative Enzyme, die in der Cholesterinesterhydrolyse involviert sind, Membranprotein-Proteasen und -Nukleasen, genauso wie die ATP-angetriebene lysosomale Protonenpumpe.
Cytoplasmatische Fluoreszenzmarkierung
In einer Ausführungsform reagieren zelldurchdringende Fluoreszenzfarbstoffe (Molecular Probes, Inc.) mit einer reaktiven Gruppe mit lebenden Zellen. Reaktive Farbstoffe schließen Monobrombiman, 5-Chlormethylfluoresceindiacetat, Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester und Chlormethyltetramethylrhodamin als Beispiele für zelldurchdringende Fluoreszenzfarbstoffe ein, die für Langzeitmarkierungen des Cytoplasmas von Zellen verwendet werden.
In einer zweiten Ausführungsform werden polare Markierungsmoleküle, wie Lucifer-Gelbund Kaskade-Blau-basierte Fluoreszenzfarbstofte (Molecular Probes, Inc.) in Zellen unter Verwendung der Gesamtbeladungsverfahren eingeführt und auch für cytoplasmatische Markierung verwendet.
In einer dritten Ausführungsform werden Antikörper gegen cytoplasmatische Bestandteile (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) verwendet, um das Cytoplasma fluoreszenzzumarkieren. Beispiele für cytoplasmatische Antigene sind viele der Enzyme, die in den intermediären Metabolismus involviert sind. Enolase, Phosphofructokinase und Acetyl-CoA-Dehydrogenase sind Beispiele von gleichmäßig verteilten cytoplasmatischen Antigenen.
In einer vierten Ausführungsform werden Proteinchimären, bestehend aus einem cytoplasmatischen Protein, das genetisch an ein intrinsisches Lumineszenzprotein, wie das Grüne Fluoreszenzprotein oder Mutanten davon fusioniert ist, verwendet, um das Cytoplasma zu markieren. Fluoreszenzchimäre der gleichmäßig verteilten Proteine werden verwendet, um den gesamten Cytoplasmabereich zu markieren. Beispiele dieser Proteine sind viele der Proteine, die in den intermediären Metabolismus involviert sind und schließen Enolase, Lactatdehydrogenase und Hexokinase ein.
In einer fünften Ausführungsform werden Antikörper gegen cytoplasmatische Antigene (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) verwendet, um cytoplasmatische Bestandteile zu markieren, die in spezifischen cytoplasmatischen Unterbereichen lokalisiert sind. Beispiele für diese Bestandteile sind Cytoskelettproteineactin, Tubulin und Cytokeratin. Eine Population dieser Proteine wird in den Zellen zusammengebaut in einzelne Strukturen, die in diesem Fall faserförmig sind. Die Fluoreszenzmarkierung dieser Proteine mit Antikörper-basierenden Reagenzien markieren deshalb einen spezifischen Unterbereich des Cytoplasmas.
In einer sechsten Ausführungsform werden Nichtantikörper-basierte fluoreszenzmarkierte Moleküle, die stark mit cytoplasmatischen Proteinen interagieren, verwendet, um spezifische cytoplasmatische Bestandteile zu markieren. Ein Beispiel ist ein Fluoreszenzanalogon des Enzyms DNAse 1 (Molecular Probes, Inc.). Fluoreszenzanaloga dieses Enzyms binden eng und spezifisch an cytoplasmatisches Actin, und markieren somit einen Unterbereich des Cytoplasmas. In einem anderen Beispiel werden Fluoreszenzanaloga des Pilztoxins Phalloidin oder des Arzneimittels Paclitaxel (Molecular Probes, Inc.) verwendet, um jeweils Bestandteile des Actin- und Mikrotubuli-Cytoskeletts zu markieren.
In einer siebten Ausführungsform werden Proteinchimären, die aus einem cytoplasmatischen Protein, das genetisch an ein intrinsisches lumineszierendes Protein, wie das grünfluoreszierende Protein oder Mutanten davon fusioniert ist, verwendet, um spezifische Bereiche des Cytoplasmas zu markieren. Fluoreszenzchimären von stark lokalisierten Proteinen werden verwendet, um cytoplasmatische Unterbereiche zu markieren. Beispiele dieser Proteine sind viele der Proteine, die in der Regulation des Cytoskeletts involviert sind. Sie schließen die Strukturproteine Actin, Tubulin und Cytokeratin genauso wie die regulatorischen Proteine, Mikrotubuli-assoziiertes Protein 4 und α-Actinin ein.
Kernmarkierung
In einer Ausführungsform werden membrandurchdringende Nukleinsäure-spezifische lumineszierende Reagenzien (Molecular Probes, Inc.) vennrendet, um den Kern von lebenden und fixierten Zellen zu markieren. Diese Reagenzien schließen Cyanin-basierte Farbstoffe (z. B. TOTO^®, YOYO^® und BOBO^TM, Phenanthidine und Acridine (z. B. Ethidiumbromid, Propidiumiodid und Acridin-Orange), Indole und Imidazole (z. B. Hoechst 33258, Hoechst 33342 und 4',6-Diamidin-2-phenylindol) und andere ähnliche Reagenzien (z. B. 7-Aminoactinomycin D, Hydroxystilbamidin und Psoralene) ein.
In einer zweiten Ausführungsform werden Antikörper gegen Kernantigene (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) verwendet, um Kernbestandteile, die in spezifischen Kernregionen lokalisiert sind, zu markieren. Beispiele dieser Bestandteile sind die Makromoleküle, die in der Aufrechterhaltung der DNA-Struktur und -Funktion involviert sind. DNA, RNA, Histone, DNA-Polymerasen, RNA-Polymessen, Lamine und Kernvarianten von cytoplasmatischen Proteinen, wie Actin, sind Beispiele für Kernantigene.
In einer dritten Ausführungsform werden Proteinchimären, die aus einem Kernprotein, das genetisch an ein intrinsisches lumineszierendes Protein, wie das grünfluoreszierende Protein oder Mutanten davon, fusioniert ist, verwendet, um den Kernbereich zu markieren. Beispiele für diese Proteine sind viele der Proteine, die in der Aufrechterhaltung von DNA-Struktur und -Funktion involviert sind. Histone, DNA-Polymerase, RNA-Polymerse, Lamine und Kernvarianten von cytoplasmatischen Proteinen, wie Actin, sind Beispiele für Kernproteine.
Mitochondrienmarkierung
In einer Ausführungsform werden membrandurchdringende Mitochondrien-spezifische lumineszierende Reagenzien (Molecular Probes, Inc.) verwendet, um die Mitochondrien von lebenden und fixierten Zellen zu markieren. Diese Reagenzien schließen ein Rhodamin 123, Tetramethylrosamin, JC-1 und die MitoTracker-reaktiven Farbstoffe.
In einer zweiten Ausführungsform werden Antikörper gegen mitochondriale Antigene (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) verwendet, um mitochondriale Bestandteile, die in spezifischen mitochondrialen Bereichen lokalisiert sind, zu markieren. Beispiele für diese Bestandteile sind Makromoleküle, die in der Aufrechterhaltung der mitochondrialen DNA-Struktur und -Funktion involviert sind. DNA, RNA, Histone, DNA-Polymerase, RNA-Polymerase und mitochondriale Varianten der cytoplasmatischen Makromoleküle, wie mitochondriale tRNA und rRNA sind Beispiele mitochondrialer Antigene. Andere Beispiele mitochondrialen Antigene sind die Bestandteile des oxidativen Phosphorylierungssystems, das in Mitochondrien gefunden wird (z. B. Cytochrom C, Cytochom C-Oxidase und Succinatdehydrogenase).
In einer dritten Ausführungsform werden Proteinchimären, die aus einem mitochondrialen Protein, das genetisch an ein intrinsisches lumineszierendes Protein, wie das grünfluoreszierende Protein oder Mutanten davon, fusioniert ist, verwendet, um den mitochondrialen Bereich zu markieren. Beispiele für diese Bestandteile sind Makromoleküle, die in der Aufrechterhaltung der mitochondrialen DNA-Struktur und -Funktion involviert sind. Beispiele schließen Histone, DNA-Polymerase, RNA-Polymerase und die Bestandteile des oxidativen Phosphorylierungssystems, das in Mitochondrien gefunden wird, ein (z. B. Cytochrom C, Cytochom C-Oxidase und Succinatdehydrogenase).
Markierung des endoplasmatischen Reticulums
In einer Ausführungsform werden membrandurchdringende endoplasmatisches Reticulumspezifische lumineszierende Reagenzien (Molecular Probes, Inc.) verwendet, um das endoplasmatische Reticulum von lebenden und fixierten Zellen zu markieren. Diese Reagenzien schließen Kurzketten-Carbocyaninfarbstofte (z. B. DiOC₆ und DiOC₃), Langketten-Carbocyaninfarbstoffe (z. B. DiIC₁₆ und DiIC₁₈) und Lumineszenz-markierte Lectine wie Concanavalin A ein.
In einer zweiten Ausführungsform werden Antikörper gegen endoplasmatisches Reticulum-Antigene (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) verwendet, um Bestandteile des endoplasmatischen Reticulums zu markieren, die in spezifischen Bereichen des endoplasmatischen Reticulums lokalisiert sind. Beispiele für diese Bestandteile sind die Makromoleküle, die in die Fettsäureverlängerungssysteme involviert sind, Glucose-6-phosphatase und HMG CoA-Reduktase.
In einer dritten Ausführungsform werden Proteinchimäre, die aus einem Protein des endoplasmatischen Reticulums, das genetisch an ein intrinsisches lumineszierendes Protein, wie das grünfluoreszierende Protein oder Mutanten davon, fusioniert ist, verwendet, um den Bereich des endoplasmatischen Reticulums zu markieren. Beispiele für diese Bestandteile sind die Makromoleküle, die in dem Fettsäureverlängerungssystem involviert sind, Glucose-6-phosphatase und HMG CoA-Reduktase.
Golgi-Markierung
In einer Ausführungsform werden membrandurchdringende Golgi-spezifische lumineszierende Reagenzien (Molecular Probes, Inc.) verwendet, um den Golgi von lebenden und fixierten Zellen zu markieren. Diese Reagenzien schließen lumineszierend markierte Makromoleküle, wie Weizenkeimagglutinin und Brefeldin A, genauso wie lumineszierend markiertes Ceramid ein.
In einer zweiten Ausführungsform werden Antikörper gegen Golgi-Antigene (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) verwendet, um Bestandteile des Golgis, die in spezifischen Bereichen des Golgis lokalisiert sind, zu markieren. Beispiele für diese Bestandteile sind N-Acetylglucosaminphosphotransferase, Golgi-spezifische Phosphodiesterase und Mannose-6-phosphatrezeptorprotein.
In einer dritten Ausführungsform werden Proteinchimären, die aus Golgi-Protein, das genetisch an ein intrinsisches lumineszierendes Protein, wie das grünfluoreszierende Protein oder Mutanten davon, fusioniert ist, besteht, verwendet, um den Golgi-Bereich zu markieren. Beispiele für diese Bestandteile sind N-Acetylglucosaminphosphotransferase, Golgi-spezifische Phosphodiesterase und Mannose-6-phosphatrezeptorprotein.
Obwohl viele der dargestellten Beispiele die Messung von zellulären Einzelprozessen einschließen, ist dies nur zum Zweck der Darstellung gedacht. Multiple Parameterscreens mit hohem Gehalt können erzeugt werden durch Kombinieren verschiedener Einzelparameterscreen in einem Multiparameterscreen mit hohem Gehalt oder durch Zufügen von zellulären Parametern zu einem bereits existierenden Screen mit hohem Gehalt. Weiterhin kann jeder Screen mit hohem Gehalt so konstruiert werden, um mit sowohl lebenden als auch fixierten Zellen verwendet zu werden, obwohl jedes Beispiel so beschrieben ist, dass es entweder auf lebenden oder fixierten Zellen basiert.
Der Fachmann wird eine weite Brandbreite von verschiedenen Screens kennen, die, basierend auf der hier zur Verfügung gestellten Offenbarung entwickelt werden können. Es gibt eine große und wachsende Liste von bekannten biochemischen und molekularen Prozessen in Zellen, die Translokationen oder Reorganisationen spezifischer Komponenten in Zellen involvieren. Der Signaltransduktionsweg von der Zelloberfläche zu Zielstellen in der Zelle schließt die Translokation von Plasmamembran-assoziierten Proteinen in das Cytoplasma ein. Zum Beispiel ist es bekannt, dass ein Mitglied der src-Familie von Proteintyrosinkinasen, pp60c-src (Walker et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 19552–19558) aus der Plasmamembran in das Cytoplasma nach Stimulierung von Fibroblasten mit Blutplättchen-abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF) transloziert. Weiterhin können die Screeningziele selbst in fluoreszenzbasierte Reagenzien umgewandelt werden, die molekulare Veränderungen, einschließlich Ligandenbindung und posttranslokationale Modifikationen berichten.
Beispiel 10. Proteasebiosensoren
(1) Hintergrund
Wie hier verwendet, werden die folgenden Ausdrücke wie folgt definiert:

– Reaktant – der Biosensor, der mit dem proteolytischen Enzym interagiert.
– Produkt – das (die) signalenthaltende(n) proteolytische(n) Fragment(e), erzeugt durch Interaktion des Reaktanten mit dem Enzym.
– Reaktantenzielseguenz – eine Aminosäuresequenz, die eine Beschränkung der zellulären Verteilung von dem Reaktanten auf einen bestimmten subzellulären Bereich der Zelle gewährt.
– Produktzielsequenz – eine Aminosäuresequenz, die eine Beschränkung der zellulären Verteilung des (der) signalenthaltende(n) Produkte) der enzymatischen Ziel-Reaktion auf einen bestimmten subzellulären Bereich der Zelle gewährt. Wenn das Produkt anfänglich in einem membrangebundenen Kompartiment lokalisiert ist, dann muss die Produktzielsequenz die Fähigkeit haben, das Produkt aus dem membrangebundenen Kompartiment zu exportieren. Eine bifunktionale Sequenz kann verwendet werden, die zunächst das Produkt aus dem membrangebundenen Kompartiment bewegt und dann das Produkt zu dem finalen Kompartiment bringt. Im Allgemeinen können die gleichen Aminosäuresequenzen sowohl als Reaktantenzielsequenzen als auch als Produktzielsequenzen wirken. Ausnahmen davon schließen Aminosäuresequenzen, die die Kernhülle, den Golgi-Apparat, das endoplasmatische Reticulum aufspüren und die, die in die Farnesylierung involviert sind, ein, da sie mehr geeignet sind als Reaktantenzielsequenzen.
– Proteaseerkennungsstelle – eine Aminosäuresequenz, die Spezifität durch Emittieren des Substrats gewährleistet, was eine spezifische Bindung und Spaltstelle für eine Protease bereitstellt. Obwohl typischerweise eine kurze Sequenz von Amino säuren die minimale Spaltstelle für eine Protease darstellt (z. B. DEVD für Caspase-3, Villa, P., S. H. Kaufmann und W. C. Earnshaw. 1997. Caspasen und Caspaseinhibitoren. Trends Biochem. Sci. 22: 388–93), kann eine größere Spezifität unter Verwendung einer längeren Sequenz eines etablierten Substrats zur Verfügung gestellt werden.
– Kompartiment – jede zelluläre Unterstruktur oder makromolekulare Bestandteil der Zelle, falls sie aus Protein, Lipid, Kohlenhydrat oder Nukleinsäure besteht. Es könnte ein makromolekularer Aufbau oder eine Organelle sein (ein membranbegrenzter zellulärer Bestandteil). Kompartimente schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Cytoplasma, Kern, Kernkörperchen, innere und äußere Oberfläche der Kernhülle, Cytoskelett, Peroxisom, Endosom, Lysosom, innere Hülle der Plasmamembran, äußere Hülle der Plasmamembran, äußere Hülle der mitoGolgi,chondrialen Membran, innere Hülle der mitochondrialen Membran, endoplasmatisches Reticulum oder extrazellulärer Raum. Signal – eine Aminosäuresequenz, die detektiert werden kann. Dies schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf inhärent fluoreszierende Proteine (z. B. Grün-Fluoreszierendes Protein), Cofaktor benötigende Fluoreszenz- oder Lumineszenzproteine (z. B. Phycobiliproteine oder Luciferasen), und Epitope, die durch spezifische Antikörper oder andere spezifische natürliche oder unnatürliche bindende Sonden erkannt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Farbstoffe, Enzym-Cofaktoren und konstruierte Bindemoleküle, die fluoreszierend oder lumineszierend markiert sind. Auch sind ortsgerichtet markierte Proteine, die einen Lumineszenzfarbstoff enthalten, eingeschlossen. Verfahren für die ortsgerichtete Markierung von Proteinen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf konstruierte farbstoffreaktive Aminosäuren (Post et al., J. Biol. Chem. 269: 12880–12887 (1994)), Enzym-basierte Inkorporation von Lumineszenzsubstraten in Proteine (Buckler et al., Analyt. Biochem. 209: 20–31 (1993); Takashi, Biochemistry. 27: 938– 943 (1988)) und die Inkorporation von unnatürlich markierten Aminosäuren in Proteine (Noren et al., Science. 244: 182–188 (1989)).
– Detektion – ein Mittel für die Aufzeichnung der Anwesenheit, Position oder Menge des Signals. Der Ansatz kann direkt sein, wenn das Signal inhärent fluoreszierend ist oder indirekt, wenn das Signal zum Beispiel ein Epitop ist, das nachfolgend mit einem markierten Antikörper detektiert werden muss. Verfahren der Detektion schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die räumliche Position der Fluoreszenz, Lumineszenz oder Phosphoreszenz: (1) Intensität; (2) Polarisierung; (3) Lebenszeit; (4) Wellenlänge; (5) Energietransfer; und (6) Rückgewinnung nach Photoausbleichung.

Das grundlegende Prinzip der Proteasebiosensoren der vorliegenden Erfindung ist, die Reaktanten räumlich von den erzeugten Produkten während einer proteolytischen Reaktion zu trennen. Die Trennung der Produkte von den Reaktanten tritt auf nach proteolytischer Spaltung der Proteaseerkennungsstelle in dem Biosensor, was es dem Produkt ermöglicht zu binden an, zu diffundieren in oder importiert werden in Kompartimente der Zelle, die sich von denen der Reaktanten unterscheiden. Diese räumliche Trennung stellt ein Mittel zur Quantifizierung eines proteolytischen Verfahren direkt in lebenden oder fixierten Zellen zur Verfügung. Einige Entwürfe des Biosensors stellen ein Mittel zur Beschränkung der Reaktanten (ungespaltene Biosensoren) auf ein bestimmtes Kompartiment zur Verfügung, durch eine Proteinsequenz ("Reaktantenzielsequenz"), die an Biosensoren bindet oder die Biosensoren in ein Kompartiment der Zelle importieren. Diese Kompartimente schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf jede zelluläre Struktur, makromolekulare zelluläre Bestandteile, membranbegrenzte Organellen oder extrazellulärer Raum. Unter der Voraussetzung, dass die Eigenschaften der proteolytischen Reaktion mit der Produktkonzentration, geteilt durch die Reaktantenkonzentration, in Beziehung steht, stellt die räumliche Trennung von Produkten und Reaktanten ein Mittel zur eindeutigen Quantifizierung der Produkte und Reaktanten in Einzelzellen zur Verfügung, was eine direktere Messung von proteolytischer Aktivität ermöglicht.
Die molekularbasierten Biosensoren können in Zellen durch Transfektion eingebracht werden und die exprimierten chimären Proteine können in transienten Zellpopulationen oder stabilen Zelllinien analysiert werden. Sie können auch vorgebildet werden, zum Beispiel durch Herstellung in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionssystem und die gereinigten Proteine werden in die Zelle eingebracht über eine Anzahl von physikalischen Mechanismen, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf Mikroinjektionen, Scrape-Beladung, Elektroporation, Signalsequenz-vermittelte Beladung, usw.
Messverfahren können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf das Verhältnis oder die Differenz der Fluoreszenz, Lumineszenz oder Phosphoreszenz: (a) Intensität; (b) Polarisierung; oder (c) Lebenszeit zwischen Reaktant und Produkt Diese letzteren Verfahren erfordern geeignete spektroskopische Differenzen zwischen Produkten und Reaktanten. Zum Beispiel Spalten eines Reaktanten, der ein beschränkt mobiles Signal enthält, in einen sehr kleinen Translokationsbestandteil und ein verhältnismäßig großer nicht translozierender Bestandteil können durch Polarisation nachgewiesen werden. Alternativ können die signifikant unterschiedlichen Emissionslebenszeiten zwischen Reaktanten und Produkten den Nachweis in Bild- und Nichtbildverfahren ermöglichen.
Ein Beispiel einer Familie von Enzymen, für die dieser Biosensor konstruiert werden kann, um die Aktivität zu berichten, sind Caspasen. Caspasen sind eine Klasse von Proteinen, die die proteolytische Spaltung einer großen Anzahl von Zielen während Apoptose katalysieren. Nach Initiation der Apoptose werden die Klasse II (Stromabwärts)-Caspasen aktiviert und sind ein Point of no Return in dem Signalweg, der zum Zelltod führt, was in Spaltung von Zielproteinen stromabwärts resultiert. In spezifischen Beispielen werden die hier beschriebenen Biosensoren so konstruiert, um die Kerntranslokation von gespaltenem GFP als einen messbaren Indikator der Caspaseaktivierung zu verwenden. Zusätzlich kann die Verwendung von spezifischen Erkennungssequenzen, die umgebende Aminosäuren, die in der Sekundärstrukturbildung involviert sind, inkorporieren in natürlich vorkommenden Proteinen, die Spezifität und Empfindlichkeit von dieser Klasse von Biosensoren steigern.
Ein anderes Beispiel einer Proteaseklasse, für die dieser Biosensor konstruiert werden kann, um die Aktivität zu berichten, sind Zinkmetalloproteasen. Zwei spezifische Beispiele dieser Klasse sind die biologischen Toxine, abgeleitet von Clostridien-Spezies (C. botulinum und C. tetani) und Bacillus anthracis. (Herreros et al. in The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. J. E. Alouf und J. H. Freer, Hrsg. 2. Auflage, San Diego, Academic Press, 1999; S. 202–228). Diese Bakterien exprimieren und sekretieren Zinkmetalloproteasen, die in eukaryotische Zellen eindringen und spezifisch bestimmte Zielproteine spalten. Beispielsweise wird die Anthraxprotease von Bacillus anthracis in das Cytoplasma von Zielzellen geliefert durch ein accessorisches porenbildendes Protein, wo seine proteolytische Aktivität die MAP-Kinasesignalkaskade durch Spaltung von Mitogen-aktivierter Proteinkinasen 1 oder 2 (MEK1 oder MEK2) inaktiviert. (Leppla, S. A. in The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxines. J. E. Alouf und J. H. Freer, Hrsg. 2. Auflage, San Diego, Academic Press, 1999; S. 243–263). Die Toxinbiosensoren, die hier beschrieben werden, ziehen ihren Vorteil aus der natürlichen subzellulären Lokalisation von diesen und anderen Zielproteinen, um Reaktanten-Aufspürung zu erreichen. Nach Spaltung wird das Signal (mit oder ohne eine Produktzielsequenz) von dem Reaktanten getrennt, um einen Biosensor mit hohem Gehalt zu erzeugen.
Der Fachmann weiß, dass die Proteinbiosensoren dieses Aspekts der Erfindung angepasst werden können, um die Aktivität von jedem Mitglied der Caspasefamilie von Proteasen, genauso wie von jeder anderen Protease, berichten kann, durch eine Substitution von geeigneten Proteaseerkennungsstellen in jedem der Konstrukte (siehe 29B). Diese Biosensoren können verwendet werden in Screens mit hohem Gehalt, um in vivo Aktivierung von enzymatischer Aktivität nachzuweisen und um spezifische Aktivität, basierend auf Spal tung eines bekannten Erkennungsmotivs, zu identifizieren. Dieser Screen kann vennrendet werden für sowohl lebende, als auch fixierte Endpunktassays und kann mit zusätzlichen Messungen kombiniert werden, um einen Multiparameterassay zur Verfügung zu stellen.
Somit stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt rekombinante Nukleinsäuren, die einen Proteasebiosensor kodieren, zur Verfügung, umfassend:

a. eine erste Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein nachweisbares Polypeptidsignal kodiert;
b. eine zweite Nukleinsäuresequenz, die wenigstens eine Proteaseerkennungsstelle kodiert, wobei die zweite Nukleinsäuresequenz funktionell mit der ersten Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die wenigstens ein nachweisbares Polypeptidsignal kodiert; und
c. eine dritte Nukleinsäuresequenz, die wenigstens eine Reaktantenzielsequenz kodiert, wobei die dritte Nukleinsäuresequenz funktionell verbunden ist mit der zweiten Nukleinsäuresequenz, die wenigstens eine Proteaseerkennungsstelle kodiert.

In diesem Aspekt werden die erste und dritte Nukleinsäuresequenz durch die zweite Nukleinsäure getrennt, die die Proteaseerkennungsstelle kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform kodiert die rekombinante Nukleinsäure einen Proteasebiosensor, der eine vierte Nukleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens eine Produktzielsequenz kodiert, wobei die vierte Nukleinsäuresequenz funktionell verbunden ist mit der ersten Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein nachweisbares Polypeptidsignal kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die rekombinante Nukleinsäure, die einen Proteasebiosensor kodiert, eine fünfte Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein nachweisbares Polypeptidsignal kodiert, wobei die fünfte Nukleinsäuresequenz funktionell verbunden ist mit der dritten Nukleinsäuresequenz, die eine Reaktantenzielsequenz kodiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das detektierbare Polypeptidsignal ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fluoreszenzproteinen, Lumineszenzproteinen und Sequenzepitopen. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Nukleinsäure, die eine Polypeptidsequenz kodiert, eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49 und 51.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Nukleinsäure, die eine Proteaseerkennungsstelle kodiert, eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOS: 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119 und 121. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die dritte Nukleinsäuresequenz, die eine Reaktantenzielsequenz kodiert, eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS: 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149 und 151.
In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform umfasst die rekombinante Nukleinsäure, die einen Proteasebiosensor kodiert, eine Sequenz, im Wesentlichen ähnlich zu den Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 und 33.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor zur Verfügung, umfassend Nukleinsäurekontrollsequenzen, funktionell verbunden mit den oben beschriebenen rekombinanten Nukleinsäuren. In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung genetisch konstruierte Wirtszellen zur Verfügung, die mit den erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren transfiziert wurden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung rekombinante Proteasebiosensoren zur Verfügung, umfassend:

a. eine erste Domäne, umfassend wenigstens ein nachweisbares Polypeptidsignal;
b. eine zweite Domäne, umfassend wenigstens eine Proteaseerkennungsstelle; und
c. eine dritte Domäne, umfassend wenigstens eine Reaktantenzielsequenz; wobei der erste Bereich und der dritte Bereich durch den zweiten Bereich getrennt sind.

Inhärent in dieser Ausführungsform ist das Konzept, dass die Reaktantenzielsequenz, die zelluläre Verteilung von den Reaktanten beschränkt, mit Umverteilung des Produkts, das nach Aktivierung auftritt (d. h.: Proteasespaltung). Diese Umverteilung erfordert keine vollständige Sequestration von Produkten und Reaktanten, da die Produktverteilung teilweise die Reaktantenverteilung in Abwesenheit eines Produktzielsignals überlappen kann (siehe nachstehend).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der rekombinante Proteasebiosensor weiterhin eine vierte Domäne, umfassend wenigstens eine Produktzielsequenz, wobei die vierte Domäne und die erste Domäne funktionell verbunden sind und von der dritten Domäne durch die zweite Domäne getrennt werden. In einer anderen Ausführungsform umfasst der rekombinante Proteasebiosensor weiterhin eine fünfte Domäne umfassend wenigstens ein nachweisbares Polypeptidsignal, wobei die fünfte Domäne und die dritte Domäne funktionell verbunden sind und von der ersten Domäne durch die zweite Domäne getrennt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die nachweisbare Polypeptidsignaldomäne (erste oder fünfte Domäne) ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fluoreszenzproteinen, Lumineszenzproteinen und Sequenzepitopen. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform umfasst die nachweisbare Polypeptidsignaldomäne eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS: 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 und 52.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Domäne eine Proteaseerkennungsstelle, die eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOS: 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120 und 122, umfasst. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Reaktanten und/oder Zielsequenzdomänen eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOS: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150 und 152.
In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform umfasst der rekombinante Proteasebiosensor eine Sequenz, im Wesentlichen gleich zu den Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und 34.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Kits zur automatisierten Analyse von Zellen zur Verfügung, umfassend die Verwendung von Zellen, die die erfindungsgemäßen Proteasebiosensoren besitzen, um Verbindungen zu identifizieren, die Proteaseaktivität beeinflussen. Das Verfahren kann mit anderen erfindungsgemäßen Verfahren in einer Vielzahl von möglichen Multiparameterassays kombiniert werden.
In diesen verschiedenen Ausführungsformen ist der Basisproteasebiosensor zusammengesetzt aus multiplen Domänen, einschließlich wenigstens einer ersten nachweisbaren Polypeptidsignaldomäne, wenigstens einer Reaktantenzieldomäne und wenigstens einer Proteaseerkennungsdomäne, wobei die nachweisbare Signaldomäne und die Reaktantenzieldomäne voneinander getrennt sind durch die Proteaseerkennungsdomäne. Somit ist die genaue Anordnung der Domänen in dem Molekül nicht generell kritisch, solange die Proteaseerkennungsdomäne die Reaktantenziel- und erste nachweisbare Signaldomäne trennt. Für jede Domäne liegt ein oder mehrere der spezifizierten Erkennungssequenzen vor.
In einigen Fällen kann die Anordnung der Domänen in dem Biosensor kritisch sein für die geeignete Aufspürung von Produkten) und / oder Reaktant in dem (den) geeigneten zellulären Kompartiment(en) sein. Beispielsweise erfordert das Aufspüren von Produkten oder Reaktanten in den Peroxisomen, dass die peroxisomale Zielsequenz wenigstens drei Aminosäuren des Proteins umfasst. Die Bestimmung von den Biosensoren, in denen die relative Platzierung von Zieldomänen in dem Biosensor kritisch ist, kann von dem Fachmann durch Routineexperimente bestimmt werden.
Einige Beispiele von Basisorganisationen von Domänen in dem Proteasebiosensor sind in 30 gezeigt. Der Fachmann weiß, dass jede der Vielzahl von Proteaseerkennungsstellen, Produktzielsequenzen, Polypeptidsignalen und/oder Produktzielsequenzen verwendet werden kann in verschiedenen Kombinationen in dem erfindungsgemäßen Proteinbiosensor, durch Substitution der geeigneten Kodierungssequenzen in das Multidomänenkonstrukt. Nichtbeschränkende Beispiele solcher alternativer Sequenzen sind in 29A-29C gezeigt. Ähnlich weiß der Fachmann, dass Modifikationen, Substitutionen und Deletionen der kodierenden Sequenzen und der Aminosäuresequenzen jeder individuellen Domäne in dem Biosensor durchgeführt werden können, während die Funktion der Domäne aufrechterhalten wird. Solche verschiedenen Kombinationen von den Domänen und Modifikationen, Substitutionen und Deletionen von individuellen Domänen liegen im Rahmen der Erfindung.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "kodierende Sequenz" oder eine Sequenz, die eine bestimmte Polypeptidsequenz "kodiert", auf eine Nukleinsäuresequenz, die transkribiert wird (im Fall von DNA) und translatiert (im Fall von mRNA) in ein Polypeptid in vitro oder in vivo, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gebracht wird. Die Grenzen der Kodiersequenz werden bestimmt durch ein Startcodon an dem 5' (Amino)-Terminus und ein Translations-Stoppcodon an dem 3' (Carboxy)-Terminus. Eine Kodiersequenz kann einschließen, ist jedoch nicht beschränkt auf cDNA von prokaryotischer oder eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von prokaryotischer oder eukaryotischer DNA und synthetische DNA-Sequenzen. Eine Transkriptionsterminationssequenz wird normalerweise am 3'-Ende der kodierenden Sequenz lokalisiert sein.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff DNA-"Kontrollsequenzen" kollektiv auf Promotorsequenzen, Ribosomenbindestellen, Polyadenylierungssignale, Transkriptions-Terminations-Sequenzen, stromaufwärts-regulatorische Domänen, Verstärker und dergleichen, die kollektiv die Transkription und Translation einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle zur Verfügung stellen. Nicht all diese Kontrollsequenzen müssen immer in einem rekombinanten Vektor vorliegen, solange die DNA-Sequenz von Interesse in der Lage ist, angemessen transkribiert und translatiert zu werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "funktionell verbunden" auf eine Anordnung von Elementen, wobei die Bestandteile so angeordnet sind, um ihre gewöhnliche Funktion durchzuführen. Somit sind Kontrollsequenzen, die funktionell mit einer kodierenden Sequenz verbunden sind, in der Lage, die Expression der kodierenden Sequenz zu bewirken. Die Kontrollsequenzen müssen nicht benachbart sein mit den kodierenden Sequenzen, solange sie wirken, um ihre Expression zu steuern. Somit können beispielsweise dazwischenliegende untranslatierte, aber bereits transkribierte Sequenzen vorliegen zwischen einer Promotorsequenz und der kodierenden Sequenz und die Promotorsequenz kann immer noch "funktionell verbunden" sein mit der kodierenden Sequenz.
Weiterhin ist eine Nukleinsäure-kodierende Sequenz funktionell verbunden mit einer anderen Nukleinsäure-kodierenden Sequenz, wenn der kodierende Bereich für beide Nukleinsäuremoleküle in der Lage ist, in dem gleichen Leserahmen zu exprimieren. Die Nukleinsäuresequenzen müssen nicht benachbart sein, solange sie in der Lage sind, in dem gleichen Leserahmen exprimiert zu werden. Somit können beispielsweise zwischenliegende kodierende Regionen zwischen den spezifizierten Nukleinsäure-kodierenden Sequenzen vorliegen und die spezifizierten Nukleinsäure-kodierenden Regionen können immer noch als "funktionell verbunden" angesehen werden.
Die dazwischenliegenden kodierenden Sequenzen zwischen den verschiedenen Domänen der Biosensoren können von jeder Länge sein, solange die Funktion von jeder Domäne aufrechterhalten wird. Generell erfordert dies, dass die zweidimensionale und dreidimensionale Struktur der dazwischenliegenden Proteinsequenz die Bindung oder Interaktionserfordernisse der Domänen des Biosensors nicht ausschließt, wie eine Produkt- oder Reaktantenaufspürung, Bindung der Protease von Interesse an den Biosensor, Fluoreszenz oder Lumineszenz des nachweisbaren Polypeptidsignals oder Bindung von fluoreszenzmarkierten Epitop-spezifischen Antikörpern.
Ein Fall, in dem die Distanz zwischen Domänen des Proteasebiosensors wichtig ist, ist, wenn es das Ziel ist, ein Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar zu erzeugen. In diesem Fall wird das FRET-Signal nur existieren, wenn die Distanz zwischen dem Donor und Akzeptor ausreichend gering ist, um den Energietransfer zu ermöglichen (Tsien, Heim und Cubbit, WO 97/28261). Die durchschnittliche Entfernung zwischen den Donor- und Akzeptorgruppen sollte zwischen 1 nm und 10 nm mit einer Bevorzugung zwischen einem 1 nm und 6 nm liegen. Dies ist die physikalische Distanz zwischen Donor und Akzeptor. Die dazwischenliegende Sequenzlänge kann beachtlich variieren, da die dreidimensionale Struktur des Polypeptids die physikalische Distanz zwischen Donor und Akzeptor bestimmen wird.
"Rekombinanter Expressionsvektor" schließt Vektoren ein, die funktionell eine Nukleinsäurekodierende Region oder Gen mit jedem Promotor, der in der Lage ist, das Genprodukt effektiv zu exprimieren, verbindet. Die Promotorsequenz, die verwendet wird, um die Expression des Proteasebiosensors zu betreiben, kann konstitutiv sein (betrieben durch jeden einer Vielzahl von Promotoren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf CMV, SV40, RSV, Actin, EF) oder induzierbar (betrieben durch jeden einer Anzahl von induzierbaren Promotoren, einschließlich, nicht jedoch nicht beschränkt auf, Tetracyclin, Ecdyson, Steroidresponsiv). Der Expressionsvektor muss in dem Wirtsorganismus replizieren können, entweder als ein Episom oder durch Integration in die wirtschromosomale DNA. IN einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Expressionsvektor ein Plasmid. Allerdings ist die Erfindung dazu gedacht, auch jegliche andere geeignete Expressionsvektoren, wie virale Vektoren, einzuschließen.
Der Ausdruck "im Wesentlichen ähnlich" wird hier verwendet in Bezug auf die Nucleotidsequenz der DNA oder die Aminosäuresequenz von Protein, die ein oder mehrere konservative oder nichtkonservative Variationen von den Proteasebiosensorsequenzen, die hier offenbart sind, hat, einschließen, jedoch nicht beschränkt auf Deletionen, Additionen oder Substitutionen, wobei die resultierende Nukleinsäure und/oder Aminosäuresequenz funktionell äquivalent zu den Sequenzen, die hier offenbart und beansprucht sind, ist. Funktionell äquivalente Sequenzen werden im Wesentlichen in der gleichen Weise funktionieren, um im Wesentlichen den gleichen Proteasebiosensor wie die Nukleinsäure- oder Aminosäurezusammensetzungen, die offenbart wurden und beansprucht wurden, zu erzeugen. Beispielsweise kodieren funktionell äquivalente DNAs Proteasebiosensoren, die die gleichen sind, wie die hier offenbarten oder die eine oder mehrere konservative Aminosäurevariationen, wie Substitutionen von nicht polaren Resten für andere nicht polare Reste oder geladene Reste gegen ähnlich geladene Reste oder Addition zu/Deletion von Regionen des Proteasebiosensors, die nicht kritisch für die Funktionalität sind. Diese Veränderungen schließen die ein, die von dem Fachmann als Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen erkannt werden, die nicht im Wesentlichen die Tertiärstruktur des Proteins verändern.
Wie hier verwendet, teilen im Wesentlichen ähnliche Sequenzen von Nukleotiden oder Aminosäuren wenigstens 70–75% Identität, stärker bevorzugt 80–85% Identität und am stärks ten bevorzugt 90–95% Identität. Es ist jedoch anerkannt, dass Proteine (und DNA oder mRNA, die solche Proteine kodieren) weniger als die vorstehend beschriebenen Spiegel von Homologie (aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes) enthalten oder dass sie modifiziert sind durch konservative Aminosäuresubstitutionen (oder Substitutionen von degenerierten Codons) die in dem Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.
Der Ausdruck "heterolog", wenn er sich auf Nukleinsäuresequenzen, wie kodierende Sequenzen und Kontrollsequenzen bezieht, bezeichnet Sequenzen, die nicht normalerweise mit einer Region eines rekombinanten Konstrukts assoziiert sind und/oder nicht normalerweise mit einer bestimmten Zelle assoziiert sind. Somit ist eine "heterologe" Region eines Nukleinsäurekonstrukts ein identifizierbares Segment der Nukleinsäure in oder angeheftet an ein anderes Nukleinsäuremolekül, das nicht in Zusammenhang mit dem anderen Molekül in der Natur gefunden wird. Beispielsweise könnte eine heterologe Region eines Konstrukts eine kodierende Sequenz einschließen, flankiert von Sequenzen, die nicht in Zusammenhang mit der kodierenden Sequenz in der Natur gefunden werden. Ein weiteres Beispiel einer heterologen kodierenden Sequenz ist ein Konstrukt, in dem die kodierende Sequenz selbst nicht in der Natur gefunden wird (z. B. synthetische Sequenzen, die Codons haben, die sich von nativen Genen unterscheiden). Ähnlich würde eine Wirtszelle, die mit einem Konstrukt, das nicht normalerweise in der Wirtszelle vorkommt, als heterolog für die Zwecke dieser Erfindung angesehen werden.
In dieser Anmeldung können die verwendeten Techniken, falls nicht anderweitig angegeben, in einer der verschiedenen gut bekannten Referenzen gefunden werden, wie: Molecular Cloning: A Laboraton Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Bd. 185, herausgegeben von D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M. P. Deutshcer, Hrsg., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2. Aufl. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, S. 109–128, Hrsg. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N. J.) und der Ambion 1998-Katalog (Ambion, Austin, TX).
Die Biosensoren der vorliegenden Erfindung sind konstruiert und werden verwendet, um Wirtszellen unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie zu transfizieren. Jede Anzahl solcher Techniken, die alle im Rahmen dieser Erfindung liegen, kann verwendet werden, um Proteasebiosensor-kodierende DNA-Konstrukte zu erzeugen und genetisch transfizierte Wirtszellen, die die Biosensoren exprimieren. Die nichteinschränkenden Bei spiele, die folgen, zeigen eine solche Technik zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Biosensoren.
BEISPIEL DER PROTEASEBIOSENSORKONSTRUKTION UND VERWENDUNG:
In den folgenden Beispielen wurden Caspase-spezifische Biosensoren mit spezifischen Produktzielseguenzen konstruiert unter Verwendung von Sätzen von 4 Primern (2 Sense (Sinn) und 2 Antisense (Gegensinn)). Diese Primer besitzen überlappende Regionen an ihren Enden und werden verwendet für PCR nach einer Primer-Walking-Technik (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Narbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Die zwei Senseprimer wurden ausgewählt, um von dem 5'-Polylinker (BspI) des GFP-enthaltenden Vektors (Clontech, Kalifornien) zu starten zu der Mitte der konstruierten Biosensorsequenz. Die zwei Antisenseprimerstarten von einer 3'-GFP-Vektorstelle (Bam HI) und überlappen mit den Senseprimern über 12 Nukleotide in der Mitte.
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 94 °C für 30 Sekunden zur Denaturierung, 55 °C für 30 Sekunden für Anlagerung und 72 °C für 30 Sekunden für Extension für 15 Zyklen. Die Primer besitzen Restriktionsendonucleasestellen an beiden Enden, was nachfolgende Klonierung des resultierenden PCR-Produkts erleichtert.
Das resultierende PCR-Produkt wurde gelgereinigt, geschnitten an den BspE1- und BamH1-Restriktionsstellen, die in den Primern vorlagen und die resultierenden Fragmente wurden gelgereinigt. Ähnlich wurde der GFP-Vektor (Clontech, San Francisco, CA) verdaut an den BspE1- und BamH1-Stellen in dem Polylinker. Ligation des GFP-Vektors und des PCR-Produkts wurde durchgeführt unter Verwendung von Standardtechniken bei 16 °C über Nacht. E. coli-Zellen wurden dann mit Ligationsgemischen unter Verwendung von Standardtechniken transfiziert. Die transformierten Zellen wurden ausgewählt auf LB-Agar mit geeigneten Antibiotika.
Zellen und Transfektionen. Für DNA-Transfektion wurden BHK-Zellen und MCF-7-Zellen kultiviert zu 50–70 %-iger Konfluenz in Platten mit 6 Vertiefungen, enthaltend 3 ml Minimal-Eagles-Medium (MEM) mit 10% fötalem Kälberserum, 1 mM L-Glutamin, 50 μg/ml Streptomycin, 50 μg/ml Penicillin, 0,1 mM nichtessentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 10 μg/ml Kälberinsulin (nur für MCF-7-Zellen) bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator für etwa 36 Stunden. Die Zellen wurden gewaschen mit serumfreiem MEM-Medium und für 5 Stunden inkubiert mit 1 ml Transfektionsgemisch, enthaltend 1 μg des geeigneten Plasmids und 4 μg Lipofectimin (BRL) in serumfreiem MEM-Medium. Nachfolgend wurde das Transfektionsmedium entfernt und mit 3 ml normalem Kulturmedium ersetzt. Die transfizierten Zellen wurden in Wachstumsmedium für wenigstens 16 Stunden gehalten, bevor die Auswahl von stabilen Zellen, basierend auf standardmolekularbiologischen Verfahren (Ausubel. et al 1995) durchgeführt wurde.
Apoptoseassay. Für Apoptoseassays wurden die Zellen (BHK, MCF-7), die mit dem geeigneten Proteasebiosensorexpressionsvektor transfiziert wurden, auf Gewebekultur-behandelten Platten mit 96 Vertiefungen bei einer Konfluenz von 50–60 % plattiert und über Nacht bei 37°C, 5% CO₂, kultiviert. Variierende Konzentrationen von Cis-Platin, Staurosporin oder Paclitaxel in normalem Kulturmedium wurden frisch präpariert aus dem Stock und den Zellkulturschälchen zugesetzt, um das alte Kulturmedium zu ersetzen. Die Zellen wurden dann mit dem Zellscreeningsystem der vorliegenden Erfindung zu den angegebenen Zeitpunkten entweder als lebende Zellexperimente oder als fixierte Endpunktexperimente beobachtet.
1. Konstruktion von Proteasebiosensoren mit 3 Domänen
a. Caspase-3 Biosensor mit einer Annexin 11-Reaktanten-Zieldomäne (pIjkGFP).
Der Aufbau des Biosensors ist in 31 dargestellt und seine Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigt.
Primer für Caspase 3, Produktzielsequenz = keine (CP3GFP-CYTO):
Dieser Biosensor ist auf das Cytoplasma durch die Reaktantenzielsequenz beschränkt. Die Reaktantenzielsequenz ist die Annexin II-Cytoskelett-bindende Domäne (MSTVHEILCKLSLEGVHSTPPSA) (SEQ ID NO: 124) (29C) (Eberhard et al. 1997. Mol. Biol. Cell 8: 293a). Die Enzymerkennungsstelle korrespondiert mit zwei Kopien der Aminosäuresequenz DEVD (SEQ ID NO: 60) (29B), die als Erkennungsstelle für Caspase-3 dient. Andere Beispiele mit verschiedener Anzahl von Proteaseerkennungsstellen und/oder zusätzlichen Aminosäuren aus einer natürlich vorkommenden Proteaseerkennungsstelle werden nachstehend gezeigt. Die Signaldomäne ist EGFP (SEQ ID NO: 46) (29A) (Clontech, Kalifornien). Der parentale Biosensor (der Reaktant) ist auf das Cytoplasma beschränkt durch Binden der Annexin II-Domäne an das Cytoskelett und wird deshalb aus dem Kern ausgeschlossen. Nach Spaltung der Proteaseerkennungsstelle durch Caspase 3 wird die Signaldomäne (EGFP) von der Reaktantenzieldomäne (Annexin II) entlassen und wird durch das ganze Volumen der Zelle verteilt, da ihm eine spezifische Zielsequenz fehlt und es klein genug ist, um passiv in den Kern zu gelangen (32).
Die Biosensorantwort wird gemessen durch Quantifizieren der effektiven Cytoplasmazu-Kern-Translokation des Signals (siehe oben). Messung der Antwort erfolgt durch eines von verschiedenen Verfahren, einschließlich integrierter oder Durchschnittskernerkennungsintensität, dem Verhältnis oder der Differenz von integrierter oder durchschnittlicher Cytoplasmaintensität zu integrierter oder durchschnittlicher Kernintensität. Der Kern wird definiert unter Verwendung eines DNA-spezifischen Farbstoffs, wie Hoechst 33342.
Dieser Biosensor stellt ein Maß für die proteolytische Aktivität um die Annexin 11-Cytoskelett-Bindestelle in der Zelle zur Verfügung. Ausgehend von der verteilten Natur des Cytoskelett und dem effektiv diffusen Status von cytosolischen Enzymen stellt dies eine effektives Maß des Cytoplasmas generell dar.
Ergebnisse und Diskussion:
32 veranschaulicht Bilder vor und nach Stimulierung von Apoptose durch cis-Platin in BHK-Zellen, transfiziert mit dem Caspase 3-Biosensor. Die Bilder zeigen klar die Akkumulation von Fluoreszenz in dem Kern. Die Erzeugung von räumlichen Änderungen in der Fluoreszenz ist nichtreversibel und somit ist das Timing des Assays flexibel. Kontrollen für diesen Biosensor schließen die Verwendung einer Version ein, in der die Caspase-3-spezifische Stelle entfernt wurde. Zusätzlich erzeugte die Zerstörung des Cytoskeletts mit nachfolgender Zellumrundung keine Veränderung in der Fluoreszenzverfeilung. Unsere Experimente zeigen die Korrelation der Kernkondensation mit Aktivierung von Caspaseaktivität. Wir haben auch diesen Biosensor in MCF-7-Zellen getestet. Ein Bericht hat kürzlich eine Peak-Antwort in Caspase-3-Aktivität 6 h nach Stimulierung von MCF-7-Zellen mit Etoposid berichtet, begleitet von Spaltung von PARP (Benjamin et al. 1998. Mol. Pharmacol. 53: 446–50). Allerdings wurde in einem anderen Bericht kürzlich gefunden, dass MCF-7-Zellen keine Caspase-3-Aktivität besitzen und tatsächlich ist das Caspase-3-Gen funktionell deletiert (Janicke et al. 1998. J. Biol. Chem. 273: 9357–60). Caspase-3-Aktivität wurde nicht mit Caspasebiosensoren in MCF-7-Zellen nach 15 h Behandlung mit 100 μM Etoposid nachgewiesen.
Janicke et al., (1998) wies auch darauf hin, dass viele der konventionellen Substrate der Caspase-3 in MCF-7-Zellen nach Behandlung mit Staurosporin gespalten werden. Unsere Experimente zeigen, dass Caspase-3-Aktivität gemessen werden kann unter Verwendung des Biosensors in MCF-7-Zellen, wenn mit Staurosporin behandelt wird. Das maximale Ausmaß der Aktivierung durch Staurosporin war etwa bei der Hälfte, die mit cis-Platin in BHK-Zellen gezeigt wurde. Dies legt auch nahe, dass der vorliegende Biosensor, obwohl er konstruiert wurde, um Caspase-3-spezifisch zu sein, tatsächlich spezifisch für eine Klasse von Caspasen ist, eher als eindeutig spezifisch für Caspase-3. Der wahrscheinlichste Kandidat ist Caspase-7 (Janicke et al., 1998). Diese Experimente zeigen auch, dass der Biosensor in Multiparameterexperimenten verwendet werden kann, mit der Korrelation von Verringerung des mitochondrialen Membranpotentials, Kernkondensation und Caspaseaktivierung.
Wir haben spezifisch die Wirkung von Paclitaxel auf Caspaseaktivierung unter Verwendung des Biosensors getestet. Caspaseaktivität in BHK und MCF-7-Zellen wurde durch Paclitaxel stimuliert. Es erscheint auch so, dass Caspaseaktivierung nach Kernmorphologieveränderungen auftrat. Ein Vorbehalt ist, dass, basierend auf der vorstehenden Diskussion die von dem Biosensor in diesem Assay berichtete Caspaseaktivität wahrscheinlich auf die Kombination von Caspase-3- und wenigstens Caspase-7-Aktivität zurückzuführen ist.
In Übereinstimmung mit den vorstehenden Ergebnissen unter Verwendung von Staurosporinstimulation in MCF-7-Zellen stimulierte Paclitaxel auch die Aktivierung von Caspaseaktivität. Die Stärke war ähnlich der von Staurosporin. Dieses Experiment verwendete einen viel engeren Bereich von Paclitaxel als frühere Experimente, in denen Kernkondensation die Antwort zu dominieren schien.
b. Caspasebiosensor mit der Mikrotubuli-assoziierten Protein 4 (MAP4)-Projektionsdomäne (CP8GFPNLS-SIZEPROJ)
Ein weiterer Ansatz zur Beschränkung der Reaktanten auf das Cytoplasma ist, den Biosensor zu groß zu machen, um die Kernporen zu durchdringen. Die Spaltung eines solchen Biosensors setzt ein Produkt frei, das in der Lage ist, in den Kern zu diffundieren.
Die zusätzlich benötigte Größe für diesen Biosensor wird zur Verfügung gestellt durch Verwendung der Projektionsdomäne von MAP4 (SEQ ID NO: 142) (29C) (CP8GFPNLS-SIZEPROJ). Die Projektionsdomäne von MAP4 interagiert nicht mit Mikrotubuli selbst, und, wenn sie exprimiert wird, ist sie diffus über das ganze Cytoplasma verteilt, aber sie ist von dem Kern aufgrund ihrer Größe (120 kD) ausgeschlossen. Somit unterscheidet sich dieser Biosensor von dem, der die Gesamtlängen-MAP4-Sequenz verwendet (siehe nachstehend). Der Fachmann weiß, dass viele andere solche Domänen die MAP4-Projektionsdomäne ersetzen können, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf multiple Kopien von einem GFP oder eine oder mehrere Kopien von jedem anderen Protein, dem ein aktives NLS fehlt und das die maximale Größe zur Diffusion in den Kern überschreitet (etwa 60 kD; Alberts, B., Bray, D., Raft, M., Roberts, K., Watson, J. D. (Hrsg.) Molecular Biology of the Cell, dritte Ausgabe, New York: Garland Publishing, 1994, S. 561–563). Die vollständige Sequenz des resultierenden Biosensors ist in SEQ ID NO: 3–4 gezeigt. Ein ähnlicher Biosensor mit einer anderen Proteaseerkennungsdomäne ist in SEQ ID NO: 5–6 gezeigt.
c. Caspasebiosensor mit einem Kernexportsignal
Ein weiterer Ansatz zur Beschränkung der Reaktanten auf das Cytoplasma ist, die Reaktanten aktiv von dem Kern auszuschließen durch Verwendung eines Kernexportsignals. Die Spaltung eines solchen Biosensors setzt ein Produkt frei, das in der Lage ist, in den Kern zu diffundieren.
Das Bacillus anthracis Bakterium exprimiert einen Zinkmetalloproteaseproteinkomplex, Anthraxprotease genannt. Die humane Mitogen-aktivierende Proteinkinase Kinase 1 (MEK 1) (Seger et al., J. Biol. Chem. 267: 25628–25631, 1992) besitzt eine Anthraxproteaseerkennungsstelle (Aminosäuren 1-13) (SEQ ID NO: 102) (29B), die nach Aminosäure 8 gespalten wird, genauso wie ein Kernexportsignal bei Aminosäuren 32-44 (SEQ ID NO: 140) (29C). Humane MEK 2 (Zheng und Guan, J.
Biol. Chem. 268: 11435–11439, 1993) besitzt eine Anthraxproteaseerkennungsstelle, umfassend die Aminosäurereste 1-16 (SEQ ID NO: 104) (29B) und ein Kernexportsignal bei Aminosäuren 36-48 (SEQ ID NO: 148) (29C).
Der Anthraxproteasebiosensor umfasst Fret25 (SEQ ID NO: 48) (29A) als Signal, die Anthraxproteaseerkennungsstelle und das Kernexportsignal von MEK 1 oder MEK2 (SEQ ID NO: 7–8 (MEK1); 9–10 (MEK2)). Der intakte Biosensor wird in dem Cytoplasma zurückbleiben durch Wirkung dieses Kernexportsignals (z. B. die Reaktantenzielsequenz). Nach Spaltung des Fusionsproteins durch Anthraxprotease wird die NES von dem GFP getrennt, was es dem GFP erlaubt, in den Kern zu diffundieren.
2. Konstruktion von Biosensoren mit 4 und 5 Domänen
Für alle der vorstehend dargestellten Beispiele für Proteasebiosensoren mit 3 Domänen kann eine Produktzielsequenz, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf diese in 29C, wie eine Kernlokalisierungssequenz (NLS), funktionell mit der Signalsequenz verbunden werden und somit die Signalsequenz veranlassen, von der Reaktantenzieldomäne nach proteolytischer Spaltung zu segregieren. Die Addition einer zweiten nachweisbaren Signaldomäne, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf diese in 29A, die funktionell mit der Reaktantenzieldomäne verbunden sind, ist auch nützlich für die Messung der Reaktion durch mehrere Mittel. Spezifische Beispiele solcher Biosensoren sind nachstehend dargestellt.
a. Biosensoren mit 4 Domänen
1. Caspase-Biosensoren mit Kernlokalisierungssequenzen
(pcas3nIsGFP; CP3GFPNLS-CYTO):
Der Aufbau des Biosensors ist in 33 dargestellt und seine Sequenz ist in SEQ ID NO: 11–12 gezeigt. PCR- und Klonierungsverfahren wurden durchgeführt wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, dass die folgenden Oligonukleotide vennrendet wurden: Primer für Caspase 3, Produktzielsequenz = NLS (CP3GFPNLS-CYTO):
Der Biosensor ist dem in SEQ ID NO: 2 ähnlich, mit der Ausnahme, dass nach Erkennung und Spaltung der Proteaseerkennungsstelle das Produkt entlassen wird und das Signal spezifisch in dem Kern akkumuliert aufgrund der Anwesenheit einer Kernlokalisierungssequenz, RRKRQK (SEQ ID NO: 128) (29C) (Briggs et al., J. Biol. Chem. 273: 22745, 1998), angehängt an das Signal. Ein spezifischer Nutzen dieses Konstrukts ist, dass die Produkte klar von den Reaktanten getrennt sind. Die Reaktanten bleiben im Cytoplasma, wohingegen das Produkt der enzymatischen Reaktion auf das Kernkompartiment beschränkt ist. Die Antwort wird gemessen durch Quantifizieren der effektiven Translokation aus dem Cytoplasma in den Kern des Signals, wie vorstehend beschrieben.
Mit der Anwesenheit von sowohl dem Produkt als auch der Reaktantenzielsequenz in dem parentalen Biosensor sollte die Reaktantenzielsequenz vor der Aktivierung des Biosensors (z. B. Proteasespaltung) dominieren. Ein Weg, um dies zu erreichen, ist die Maskierung der Produktzielsequenz in dem parentalen Biosensor bis nach der Proteasespaltung. In einem solchen Beispiel ist die Produktzielsequenz nur funktionell, wenn sie relativ nahe dem Ende der Polypeptidkette (d. h.: nach Proteasespaltung) ist. Alternativ kann der Biosensor so konstruiert werden, dass seine Tertiärstruktur die Funktion der Zielsequenz maskiert bis nach der Proteasespaltung. Diese beiden Ansätze schließen den Vergleich von Zielsequenzen mit verschiedenen relativen Stärken für die Aufspürung ein. Unter Verwendung des Beispiels für die Kernlokalisierungssequenz (NLS) und Annexin 11-Sequenzen wurden verschiedene Stärken von NLS versucht mit Klonauswahl, basierend auf cytoplasmatischer Beschränkung des parentalen Biosensors. Nach Aktivierung wird die Produktzielsequenz natürlicherweise die Lokalisierung von seinen assoziierten nachweisbaren Sequenzdomänen dominieren, da sie dann von der Reaktantenzielsequenz getrennt ist.
Ein zusätzlicher Nutzen zur Verwendung des Biosensors ist, dass das Produkt aufgespürt wird und somit in einer kleineren Region der Zelle konzentriert wird. Somit können geringere Mengen des Produkts nachweisbar sein aufgrund der gesteigerten Konzentration des Produkts. Diese Konzentrationswirkung ist verhältnismäßig unempfindlich gegen zelluläre Konzentrationen des Reaktanten. Das Signal-zu-Lärm-Verhältnis (SNR) einer solchen Messung wird verbessert durch die verstreutere Verteilung von Biosensor #1.
Ähnliche Biosensoren, die entweder die Caspase 6 (SEQ ID NO: 66) (29B) oder die Caspase 8 Proteaseerkennungssequenz (SEQ ID NO: 74) (29B) inkorporieren, können unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden, jedoch unter Verwendung der folgenden Primersets: Primen für Caspase 6, Produktzielsequenz = NLS (CP6GFPNLS-CYTO)
Primer für Caspase 8, Produktzielsequenz = NLS (CP8GFPNLS-CYTO)
Die Sequenz des resultierenden Biosensors ist in SEQ ID NO: 13–14 (Caspase 6) und SEQ ID NO: 15–16 (Caspase 8) gezeigt. Weiterhin können viele Kopien der Protease erkennungssteile in den Biosensor inseriert werden, was die Biosensoren, die in SEQ ID NO: 17–18 (Caspase 3) und SEQ ID NO: 19–20 (Caspase 8) gezeigt sind
2. Caspase 3-Biosensor mit einer zweiten Signaldomäne
Eine alternative Ausführungsform verwendet eine zweite Signaldomäne, die funktionell mit der Reaktantenzieldomäne verbunden ist. In diesem Beispiel dient Ganzlängen-MAP4 als Reaktantenzielsequenz. Nach Erkennung und Spaltung bleibt ein Produkt der Reaktion, das die Reaktantenzielsequenz enthält, an die Mikrotubuli im Cytoplasma mit seinem einzigartigen Signal gebunden, wohingegen das andere Produkt, das die Produktzielsequenz enthält, in den Kern diffundiert. Dieser Biosensor stellt ein Mittel zur Verfügung, um zwei Aktivitäten gleichzeitig zu messen: Caspase 3-Aktivität unter Verwendung einer Translokation von GFP in den Kern und Mikrotubulicytoskelettintegrität in Antwort auf Signalkaskaden, die während Apoptose initiiert werden, beobachtet durch die MAP4-Reaktantenzielsequenz.
Die grundlegende Voraussetzung für diesen Biosensor ist, dass der Reaktant an das Mikrotubulicytoskelett aufgrund der Reaktantenzielsequenz, die das Ganzlängenmikrotubuli-assoziierte Protein MAP4 (SEQ ID NO: 152) (29C) enthält, gebunden ist. In diesem Fall ist ein DEVD (SEQ ID NO: 60) (29B)-Erkennungsmotiv lokalisiert zwischen dem EYFP-Signal (SEQ ID NO: 44) (29A) funktionell verbunden mit der Reaktantenzielsequenz, genauso wie dem EBFP-Signal (SEQ ID NO: 48) (29A) funktionell verbunden mit dem C-Terminus von MAP4. Der resultierende Biosensor ist in SEQ ID NO: 21–22 gezeigt.
Dieser Biosensor kann auch eine Produktzieldomäne, wie ein NLS, funktionell an die Signaldomäne gebunden, einschließen.
Mit diesem Biosensor entlässt Caspase-3 immer noch das N-terminate GFP, das Translokation in den Kern (geführt dorthin durch NLS), durchlebt. Das MAP4-Fragment, das nach Proteolyse durch Caspase-3 noch intakt ist, berichtet auch weiterhin die Integrität des Mikrotubulicytoskeletts während des Prozesses der Apoptose durch das zweite GFP-Molekül, das an den C-Terminus des Biosensors fusioniert ist. Somit erlaubt dieses einzelne chimäre Protein die simultane Analyse der Caspase-3-Aktivität und des Polymerisierungsstatus des Mikrotubulicytoskeletts während Apoptose, die durch eine Vielzahl von Mitteln induziert wurde. Dieser Biosensor ist auch nützlich zur Analyse von potentiellen Arzneimittelkandidaten, die speziell auf Mikrotubulicytoskelett abzielen, da man unterscheiden kann, ob eine bestimmtes Arzneimittel Apoptose induziert, zusätzlich zur Beeinflussung der Mikrotubuli.
Dieser Biosensor kombiniert potentiell ein einzigartiges Signal für den Reaktanten, Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) von Signal 2 zu Signal 1 und eine einzigartige Signallokalisierung des Produkts, Kernakkumulation von Signal 1. Die Menge des erzeugten Produkts wird auch durch das Ausmaß des Verlustes in FRET angezeigt, aber dieses wird ein geringerer SNR sein als die Kombination von FRET-Nachweis von Reaktant und räumlicher Lokalisierung des Produkts.
FRET kann auftreten, wenn das Emissionsspektrum eines Donors signifikant mit dem Absorptionsspektrum eines Akzeptormoleküls überlappt (dos Remedios, C. G., und P. D. Moens. 1995. Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Spektroskopie ist ein verlässlicher "Regler" zur Messung von strukturellen Veränderungen in Proteinen, was das Problem des unbekannten Orientierungsfaktors zerstreut. J Struct Biol. 115: 175–85; Emmanouilidou, E., A. G. Teschemacher, A. E. Pouli, L. I. Nicholls, E. P. Seward und G. A. Rutter. 1999. Das Abbilden von Ca(2+)-Konzentrationsveränderigen an der sekretorischen Vesikeloberfläche mit einem rekombinanten abgezielten Chamäleon. Curr Biol. 9: 915–918). Die durchschnittliche physikalische Entfernung zwischen den Donor- und Akzeptormolekülen sollte zwischen 1 nm und 10 nm mit einer Bevorzugung von zwischen 1 nm und 6 nm liegen. Die dazwischenliegende Sequenzlänge kann beachtlich variieren, da die dreidimensionale Struktur des Peptids die physikalische Entfernung zwischen Donor und Akzeptor bestimmen wird. Dieses FRET-Signal kann gemessen werden als (1) die Menge von Quenching des Donors in Anwesenheit des Akzeptors, (2) die Menge von Akzeptoremission, wenn der Donor angeregt wird, und/oder (3) als das Verhältnis zwischen Donor und Akzeptoremission. Alternativ können Fluoreszenzlebenszeiten von Donor und Akzeptor gemessen werden.
Dieser Fall steigert den Wert des vorstehenden FRET-Biosensors durch die Natur der Existenz von der Reaktantenzielsequenz. Diese Sequenz ermöglicht die Einbringung des Biosensors in spezifische Kompartimente der Zelle für eine direktere Ausgabe der Aktivität in diesen Kompartimenten, wie der inneren Oberfläche der Plasmamembran.
Das cytoplasmatische zweite Signal repräsentiert sowohl den Originalreaktanten plus einen Teil des Produkts. Das erste Kernsignal repräsentiert ein anderes Produkt der Reaktion. Somit wurde der enzymatischen Reaktion Flexibilität zugefügt, die dargestellt werden kann als (1) Kernintensität; (2) Kern/Cytoplasma Verhältnis; Kern / Cytoplasma FRET-Verhältnis; (4) cytoplasmatisches /cytoplasmatisches FRET-Verhältnis.
Der vorliegende FRET-Biosensoraufbau unterscheidet sich von früheren FRETbasierten Biosensoren (vgl. WO 97/28261; WO98/37226), in der die Signalmessung eher auf räumlicher Position als auf Intensität beruht. Die Produkte der Reaktion werden von den Reaktanten segregiert. Es ist diese Veränderung der räumlichen Position, die gemessen wird. Der FRET-basierte Biosensor basiert auf der Trennung, jedoch nicht in ein anderes Kompartiment, eines Donor- und Akzeptorpaars. Die Veränderung der Intensität ist auf die physikalische Trennung von Donor und Akzeptor nach proteolytischer Spaltung zurückzuführen. Die Nachteile von FRET-basierten Biosensoren sind (1) die SNR ist eher gering und schwer zu messen, (2) das Signal ist nicht fixierbar. Es muss unter Verwendung lebender Zellen aufgenommen werden. Chemische Fixierung, beispielsweise mit Formaldehyd, kann nicht das parentale und das resultierende Signal konservieren; (3) der Bereich der Wellenlängen ist limitierend und deckt einen weiten Bereich des Spektrums ab, aufgrund der Anwesenheit von zwei Fluorophoren oder einer Fluorophore und einer Chromophore; (4) die Konstruktion hat größere Beschränkungen darin, dass der Donor und Akzeptor präzise angebracht werden müssen, um sicherzustellen, dass die Distanz zwischen ihnen zwischen 1–10 nm liegt.
Nutzen dieser positionellen Biosensoren schließen ein: (1) die Fähigkeit, das Signal zu konzentrieren, um höhere SNR zu erreichen. (2) Die Fähigkeit, mit entweder lebenden oder fixierten Zellen verwendet zu werden; (3) nur ein einzelfluoreszierendes Signal wird benötigt; (4) die Anordnung der Domänen des Biosensors ist flexibler. Der einzige limitierende Faktor in der Anwendung des Positionsbiosensors ist die Notwendigkeit, die räumliche Position des Signals zu definieren, was ein Bildverfahren mit ausreichender räumlicher Auflösung erfordert, um die Unterschiede zwischen dem Reaktantenkompartiment und dem Produktkompartiment aufzulösen.
Der Fachmann weiß, dass dieser Ansatz angepasst werden kann, um jede gewünschte Kombination von Aktivitäten zu berichten, durch einfache Durchführung der geeigneten Substitutionen der Proteaseerkennungssequenz und der Reaktantenzielsequenz, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf diese Sequenzen, die in 29A-C gezeigt sind.
3. Caspase 8-Biosensor mit einer Kernlokalisierungsdomäne (CP8GFPNUC-CTYO)
Dieser Ansatz (grafisch dargestellt in 34) verwendet einen Biosensor für den Nachweis von Caspase 8-Aktivität. In diesem Biosensor wurde ein Kernlokalisierungssignal (RKRIRTYLKSCRRMKRSGFEMSRPIPSHLT) (SEQ ID NO: 130) (29C) (Ueki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 252: 97–100, 1998) verwendet als Produktzielsequenz und hergestellt durch PCR unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Primen. Dieses PCR-Produkt wurde mit BspE1 und Pvu1 verdaut und gelgereinigt. Der Vektor und das PCR-Produkt wurden ligiert, wie vorstehend beschrieben.
Primen für Caspase 8, Kernlokalisierungssignal (CP8GFPNUC-CYTO):
Die Sequenz des resultierenden Biosensors ist in SEQ ID NO: 23–24 gezeigt. Dieser Biosensor schließt die Proteaseerkennungsstelle für Caspase 8 (SEQ ID NO: 74) (29B) ein. Ein ähnlicher Biosensor verwendet die Proteaseerkennungsstelle von Caspase-3 (SEQ ID NO: 25–26).
Diese Biosensoren können mit anderen Biosensoren verwendet werden, die die gleiche Produktsignalfarbe besitzen, die auf andere getrennte Kompartimente gerichtet sind, wie CP3GFPNLS-CYTO. Die Produkte von jeder Biosensorreaktion können einzeln gemessen werden aufgrund der Trennung der Produkte, basierend auf den Produktzielsequenzen. Beide Produkte aus CP8GFPNUC-CYTO und CP3GFPNLS-CYTO sind trennbar aufgrund der unterschiedlichen räumlichen Positionen, Kern gegenüber Kern-Körperchen, auch wenn die Farben der Produkte genau die gleichen sind. Die Bestimmung der Nichtkern, Kernregion, um die räumliche Überlappung von zwei Signalen zu verhindern, würde die Messung von CP3GFPNLS in Anwesenheit von CP8GFPNUC durchführen. Der Verlust der Region des Kernkörperchens von dem Signalsignal ist nicht signifikant und beeinflusst die SNR nicht signifikant. Das Prinzip der Bestimmung mehrerer Parameter unter Verwendung der gleichen Produktfarbe erweitert signifikant die Anzahl von Parametern, die gleichzeitig in lebenden Zellen gemessen werden können. Dieses Konzept kann auf andere nichtüberlappende Produktzielkompartimente ausgedehnt werden.
Messung der Translokation in das Nucleoluskompartiment wird durchgeführt durch (1) Definieren einer Maske, korrespondierend zu dem Nucleolus, basierend auf einem Nucleolus-spezifischen Marken, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf einen Antikörper gegen Nucleolin (Lischwe et al., 1981 Exp. Cell Res. 136: 101–109); (2) Definieren einer Maske für das Reaktantenzielkompartiment und (3) Bestimmen der relativen Verteilung des Signals zwischen diesen beiden Kompartimenten. Diese relative Verteilung könnte dargestellt werden durch die Differenz in zwei Intensitäten oder vorzugsweise das Verhältnis der Intensitäten zwischen den Kompartimenten.
Die Kombination von mehreren positionellen Biosensoren kann kompliziert werden, wenn die Reaktantenkompartimente überlappen. Obwohl jedes Signal gemessen werden könnte durch einfaches Bestimmen der Menge des Signals in jedem Produktzielkompartiment, wird eine höhere SNR ermöglicht, wenn jeder Reaktant einzeln identifiziert und quantifiziert werden kann. Dieser höhere SNR kann maximmiert werden durch Zusatz einer zweiten Signaldomäne und einer entgegengesetzten Fluoreszenzeigenschaft. Dieses zweite Signal kann erzeugt werden durch eine Signal domäne, die funktionell mit der Produktzielsequenz verbunden ist oder durch FRET siehe oben) oder durch eine Reaktantenzielsequenz, die sie allein in einem Reaktantenkompartiment, basierend auf der Farbe, der räumlichen Verteilung oder der Fluoeszenzeigenschaft, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Polarisierung oder Lebenszeit, identifiziert. Alternativ ist es für große Kompartimente wie das Cytoplasma mögich, verschiedene gleichfarbige Biosensoren in verschiedene Teile des gleichen Kompartiments zu bringen.
4. Proteasebiosensoren mit mehreren Kopien einer zweiten Sigaldomäne, die als eine Reaktantenzieldomäne dient
In einem weiteren Beispiel (CP8YFPNLS-SIZECFPn) wird ein Anstieg der Größe des Reaktanten erreicht durch Verwendung mehrerer Inserts in eine zweite Signalsequenz, zum Beispiel ECFP (SEQ ID NO: 50) (29A) (Tsien, R. Y. 1998. Annu Rev Biochem. 67: 509–44). Somit dienen die mehreren Kopien der zweiten Signalsequenz als eine Reaktantenzieldomäne durch Ausschluss der Möglichkeit für den Biosensor, in den Kern zu diffundieren. Dieser Typ Biosensor stellt den zusätzlichen Nutzen durch Zufügung eines zusätzlichen Signals, das durch Biosensormoleküle erhältlich ist zur Verfügung. Die Aggregation von mehreren Fluoreszenzsonden kann auch in manifestierten einheitlichen Signalen resultieren, wie FRET, Selbstquenching, Eximerbildung, usw. Dies könnte den Reaktanten ein einzigartiges Signal zufügen.
5. Tetanus/Botulinum Biosensor mit Transmembran-Zieldomäne.
In einer alternativen Ausführungsform wird eine Transmembranzielsequenz verwendet, um den Reaktanten an cytoplasmatische Vesikel zu heften und eine alternative Proteaseerkennungsstelle wird verwendet. Der Tetanus/Botulinum Biosensor (SEQ ID NO: 27–28) (Cellubrevin); 29–30 (Synaptobrevin) besteht aus einer NLS (SEQ ID NO: 128) (29C), Fret25-Signaldomäne (SEQ ID NO: 52) (29A), einer Tetanus- oder Botulinum-Zinkmetalloprotease-Erkennungsstelle aus Cellubrevin (SEQ ID NO: 106) (29B) (McMahon et aI., Nature 364: 346–349, 1993; Martin et al., J. Cell Biol., im Druck) oder Synaptobrevin (SEQ ID NO: 108) (29B) (Genbank Zugangs.-#U64520 und einer Transmembransequenz aus Cellubrevin (SEQ ID NO: 146 (29C) oder Synaptobrevin (SEQ ID NO: 144) (29C) an dem 3-Ende, die den Biosensor an zelluläre Vesikel heftet. Der N-Terminus jedes Proteins ist Richtung Cytoplasma gerichtet. In dem intakten Biosensor wird GFP an Vesikel geheftet. Nach Spaltung durch Tetanus oder Botulinumzinkmetalloprotease ist GFP nicht länger mit dem Vesikel assoziiert und ist frei, um durch das Cytoplasma und den Kern zu diffundieren.
b. Biosensor mit 5 Domänen
1. Caspase 3 Biosensor mit einer Kernlokalisierungsdomäne und einer zweiten Signaldomäne, funktionell verbunden mit einer Annexin II-Domäne
Der Aufbau dieser Biosensors ist dargestellt in 35 und die Sequenz ist in SEQ ID NO: 33–34 gezeigt. Dieser Biosensor unterscheidet sich von SEQ ID NO: 11–12 durch Einschließen eines zweiten nachweisbaren Signals, ECFP (SEQ ID NO: 50) (29A) (Signal 2), funktionell verbunden mit der Reaktantenzielsequenz.
2. Caspase 3 Biosensor mit einer Kernlokalisierungssequenz und einer zweiten Signaldomäne, funktionell verbunden mit einer MAP4-Projektionsdomäne (CP3YFPNLS-CFPCYTO)
In diesem Biosensor (SEQ ID NO: 31–32) liegt eine NLS-Produktzieldomäne (SEQ ID NO: 128) (29C) stromaufwärts der EYFP-Signaldomäne (SEQ ID NO: 44) (29A) vor. Eine DEVD-Proteaseerkennungsdomäne (SEQ ID NO: 60) (29B) liegt zwischen der EYFP-Signaldomäne und vor der MAP4-Projektionsdomäne (SEQ ID NO: 142) (29C).
Beispiel 11. Fluoreszenzbiosensor Toxincharakterisierung
Wie hier verwendet, bezieht sich "Toxin" auf jeden Organismus, jedes Makromolekül oder organische oder anorganische Molekül oder Ion, das normale physiologische Prozesse, die in der Zelle vorkommen, verändern, oder auf jeden Organismus, jedes Makromolekül oder organische oder anorganische Molekül oder Ion, das physiologische Antworten auf Modulatoren bekannter physiologischer Prozesse verändert. Somit kann ein Toxin einen normalen Zellstimulus nachahmen oder eine Antwort auf einen normalen Zellstimulus verändern.
Lebende Zellen sind Ziele für toxische Mittel, die Organismen, Makromoleküle oder organische oder anorganische Moleküle umfassen können. Ein zellbasierter Ansatz der Toxindetektion, -klassifikation und -Identifikation würde das sensitive und spezifische molekulare Detektions- und Amplifikationssystem, das von Zellen entwickelt wurde, um geringste Veränderungen in ihrem externen Milieu aufzuspüren, ausnutzen. Durch Kombinieren der entwickelten Aufspürfähigkeit von Zellen mit den lumineszierenden Reportermolekülen und hier beschriebenen Assays, können intrazelluläre molekulare und chemische Ereignisse, die durch toxische Mittel verursacht wurden, in nachweisbare räumliche und zeitliche lumineszierende Signale umgewandelt werden.
Wenn ein Toxin mit einer Zelle interagiert, entweder an der Zelloberfläche oder in einem spezifischen intrazellulären Kompartiment, untergräbt das Toxin immer eine oder mehrere Bestandteile des molekularen Signalwegs, der in der Zelle aktiv ist. Da die Zelle in einem komplexen Netzwerk von miteiner verbundenen molekularen Signalwegen enthalten ist, werden die Wirkungen des Toxins wahrscheinlich auf viele zelluläre Signalwege übertragen. Deshalb ist es unsere Strategie, molekulare Marken in Schlüsselsignalwegen zu verwenden, die wahrscheinlich von Toxinen beeinflusst werden, einschließend, jedoch nicht auf beschränkt auf Stresssignalwege, metabolische Signalwege, Signaltransduktionswege und Wachstums- und Teilungssignalwege.
Wir haben drei Klassen zellbasierter lumineszenter Reportermoleküle entwickelt und charakterisiert, die als Reporter toxisch bedrohlicher Mittel dienen. Diese 3 Klassen sind wie folgt:
(1) Detektoren: generelle Zellstressdetektion eines Toxins;
(2) Klassifikator: Störung von molekularen Schlüssel-Signalwegen) zur Detektion und Klassifikation eines Toxins; und
(3) Identifikatoren: aktivitätsvermittelte Detektion und Identifikation eines Toxins oder einer Gruppe von Toxinen.
Somit werden in einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung lebende Zellen verwendet als Biosensoren, um die Umgebung auf die Anwesenheit von toxischen Mitteln zu untersuchen. In einer Ausführungsform dieses Aspekts wird ein automatisiertes Verfahren zur Zellbasierten Toxincharakterisierung offenbart, das die Zur-Verfügung-Stellung eines Arrays von Orten umfasst, der Zellen enthält, die mit einer Testsubstanz getestet werden sollen, wobei die Zellen wenigstens ein erstes lumineszierendes Reportermolekül, umfassend einen Detektor, und ein zweites lumineszierendes Reportermolekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Klassifikator oder einem Identifikator, besitzen; In-Kontakt-Bringen der Zellen mit der Testsubstanz, entweder vor oder nach dem Besitz des ersten und zweiten lumineszierenden Reportermoleküls der Zellen; Abbilden oder Scannen vieler Zellen an jedem der Orte, die viele Zellen enthalten, um Lumineszenzsignale von dem Detektor zu erhalten; Konvertieren der Lumineszenzsignale von dem Detektor in digitale Daten, um automatisch Veränderungen der Lokalisierung, der Verteilung oder Aktivität des Detektors auf oder in der Zelle zu messen, was die Anwesenheit eines Toxins in der Testsubstanz anzeigt; selektives Abbilden oder Scannen der Orte, die Zellen enthalten, die mit Testproben, die anzeigten, dass sie ein Toxin in sich tragen, in Kontakt gebracht wurden, um Lumineszenzsignale von einem zweiten Reportermolekül zu erhalten; Konvertieren der Lumineszenzsignale von dem zweiten Lumineszenzreportermolekül in digitale Daten, um automatisch Veränderungen der Lokalisierung, der Verteilung oder Aktivität von Klassifikatoren oder Identifikatoren auf oder in der Zelle zu messen, wobei eine Veränderung der Lokalisierung, der Verteilung, der Struktur oder Aktivität des Klassifikators einen Zellsignalweg identifiziert, der durch das anwesende Toxin in der Testsubstanz gestört ist, oder wobei eine Veränderung der Lokalisierung, der Verteilung, der Struktur oder Aktivität des Identifikators das spezifische Toxin, das in der Testsubstanz anwesend ist, identifiziert. In einer bevorzugten Aus führungsform besitzen die Zellen wenigstens einen Detektor, einen Klassifikator und einen Identifikator. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die digitalen Daten, die von dem Klassifikator abgeleitet wurden, verwendet um zu bestimmen, welcher (welche) Identifikator eingesetzt werden sollen zur Identifikation des spezifischen Toxins oder der Gruppe von Toxinen.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "die Zellen besitzen ein oder mehrere Lumineszenzreportermoleküle", dass das Lumineszenzreportermolekül als ein Lumineszenzreportermolekül von den Zellen exprimiert werden kann, den Zellen als ein Lumineszenzreportermolekül zugesetzt werden kann oder lumineszenzmarkiert werden kann durch In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem lumineszenzmarkierten Molekül, das an das Reportermolekül bindet, wie ein Farbstoff oder Antikörper, der an das Reportermolekül bindet. Das Lumineszenzreportermolekül kann exprimiert werden oder der Zelle entweder vor oder nach Behandlung mit der Testsubstanz zugefügt werden.
Die Lumineszenzreporter, die Detektoren, Klassifikatoren und Identifikatoren umfassen, können auch getrennt in Einzel- oder viele Zelltypen verteilt werden. Beispielsweise kann ein Zelltyp einen Toxindetektor enthalten, der dem Benutzer nahe legt, wenn er durch toxische Aktivität aktiviert wird, dass die gleiche Toxinprobe mit Reportern des Klassifikator- oder Identifikatortyps gescreent werden sollte, in noch einer anderen Population von Zellen, die identisch ist, mit oder sich unterscheiden von, den Zellen, die den Toxindetektor enthalten.
Der Detektor, Klassifikator und Identifikator können das gleiche Reportermolekül umfassen oder sie können verschiedene Reporter umfassen.
Das Screenen auf Veränderungen in der Lokalisierung, Verteilung, Struktur oder Aktivität von den Detektoren, Klassifikator und/oder Identifikatoren kann entweder in einer Betriebsart mit hohem Durchsatz oder in einer Betriebsart mit hohem Gehalt durchgeführt werden. Generell kann ein Assay mit hohem Gehalt in einen Assay mit hohem Durchsatz konvertiert werden, wenn die räumliche Information durch den Assay mit hohem Gehalt in solch einer Weise entschlüsselt werden kann, dass nicht länger eine optische räumliche Auflösung auf zellulärer oder subzellulärer Ebene erforderlich ist. Beispielsweise kann ein Assay mit hohem Gehalt für Mikrotubulireorganisation ausgeführt werden durch optische Auflösung lumineszenzmarkierter zellulärer Mikrotubuli und Messen ihrer Morphologie (z. B. Bündel gegenüber Nichtbündeln oder normal). Die Version mit hohem Durchsatz eines Mikrotubulireorganisierungsassays würde nur eine Messung der gesamten Mikrotubulipolymermasse nach zellulärer Extraktion mit einem Detergens einschließen. Das heißt, dass destabilisierte Mikrotubuli, die leichter extrahiert werden, in einem geringeren Gesamtmikrotubuli-Massenlumineszenzsignal resultieren würden als ungestörte oder arzneimittelstabilisierte lumineszenzmarkierte Mikrotubuli in einer anderen behandelten Zellpopulation. Das Lumineszenzsignal, das von einer Domäne, die eine oder mehrere Zellen enthält, ausgestrahlt wird, ist deshalb proportional zu der Gesamtmikrotubulimasse, die in der Zelle nach Toxinbehandlung und Detergensextraktion zurückbleibt.
Die Verfahren zur Detektion, Klassifizierung und Identifikation von Toxinen können die gleichen Screeningvertahren verwenden, die über ganze vorliegende Anmeldung hin beschrieben wurden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Nachweisen von Veränderungen in Cytoplasma-zu-Kern-Translokation, Kern oder Kernkörperchen-zu-Cytoplasma-Translokation, Rezeptorinternalisation, mitochondriales Membranpotential, Signalintensität, die Spektralantwort der Reportermoleküle, Phosphorylierung, intrazelluläre freie Ionenkonzentration, Zellgröße, Zellform, Cytoskelettorganisation, metabolische Prozesse, Zellbeweglichkeit, Zellsubstratanhaftung, Zellzyklusereignisse und Organellenstruktur und -funktion.
In all diesen Ausführungsformen können die Verfahren ausgeführt werden in sowohl Toxinnachahmender Betriebsart als auch in Toxin-inhibierender Betriebsart.
Solche Techniken zur Bestimmung der Anwesenheit von Toxinen sind nützlich für Verfahren, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf, Beobachten der Anwesenheit von Umgebungstoxinen in Testproben und für Toxine, die in chemischen und biologischen Waffen verwendet werden; und zum Nachweis der Anwesenheit und Eigenschaften von Toxinen während Umgebungssanierungen, Arzneimittelentdeckung, klinischen Anwendungen und während der normalen Entwicklungs- und Herstellungsverfahren bei so gut wie jedem Typ von Industrie, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf, Landwirtschaft, Nahrungsmittelindustrie, Automobil-, Elektronik-, Textil-, Medizingeräte und Petroleumindustrie.
Wir haben Beispiele für lumineszierende zellbasierte Reporter entwickelt und charakterisiert über 3 Sensorklassen. Die hier offenbarten Verfahren können verwendet werden in Verbindung mit Computerdatenbanken und Datenmanagement, Abbau, Abfrage und Anzeigeverfahren, um Muster mit Bedeutung aus dem enormen Datensatz, der bei jedem individuellen Reporter oder einer Kombination von Reportern in Antwort auf toxische Mittel erzeugt wird, zu extrahieren. Solche Datenbanken und Bioinformatik-Verfahren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die, die offenbart sind in US-Patentanmeldung Nr. 09/437,976, eingereicht am 10. November 1999, 60/145,770, eingereicht am 27. Juli 1999 und US-Patentan meldung Seriennr. muss noch zugewiesen werden, eingereicht am 19. Februar 2000 (98,068-C).
Es kann jeder Zelltyp verwendet werden, um diesen Aspekt der Erfindung auszuführen, einschließlich Prokaryoten, wie Bakterien und Archaebakterien, und Eukaryoten, wie Einzelzellpilze (z. B. Hefe), Schimmelpilze (z. B. Dictyostelium) und Protozon (z. B. Euglena). Höhere Eukaryoten, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Vögel-, Amphibien-, Insekten- und Säugerzellen können auch verwendet werden.
Beispiele für Biosensoren
Beispiele für Detektoren: Diese Klasse von Sensoren stellt ein erstes Signal zur Verfügung, das die Anwesenheit eines toxischen Mittels anzeigt. Diese Klasse von Sensoren stellt den Nachweis von generellem zellulären Stress zur Verfügung, der Auflösung nur in der Domäne erfordert, in der die Messung durchgeführt wird, und sie sind auch für Screens mit hohem Gehalt, zugänglich. Somit kann entweder ein Screen mit der Betriebsart des hohem Durchsatzes oder der Betriebsart mit hohem Gehalt verwendet werden, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf, Translokation von Hitzeschockfaktoren aus dem Cytoplasma zu dem Kern und Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials, Nachweis der intrazellulären freien Ionenkonzentration (z. B. Ca²⁺; N⁺), genereller metabolischer Status, Zellzykluszeit-bestimmende Ereignisse, oder Organellenstruktur und -funktion.
1. Mitochondriales Potential
Ein Schlüssel zur Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase ist eine konstante ATP-Energieladung. Der Zyklus von ATP und seine Metaboliten ADP, AMP, anorganischem Phosphat und Lösungsphasenprotonen ist kontinuierlich eingestellt, um die katabolischen und anabolischen Bedürfnisse der Zelle zu befriedigen. Mitochondrien sind primär verantwortlich für die Aufrechterhaltung einer konstanten Energieladung für die gesamt e Zelle. Um ATP aus seinen Bestandteilen herzustellen, müssen Mitochondrien ein konstantes Membranpotential in der Organelle selbst aufrechterhalten. Deshalb stellt d e Messung des elektrischen Potentials mit spezifischen Lumineszenzsonden eine empfindliche und schnelle Ausgabe zellulären Stresses zur Verfügung.
Wir haben einen positiv geladenen Cyaninfarbstoff, JC-1 (Molecular Probes, Eugene, OR) verwendet, der in die Zelle diffundiert und leicht Teil der mitochondrialen Membran wird, zur Messung des mitochondrialen Potentials. Die fotophysikalischen Eigenschaften von JC-1 sind so, dass, wenn die Sonde in die mitochondriale Membran eindringt und sie ein elektrisches Potential von > 140 mV zeigt, die Sonde aggregiert und ihre Spektralantwort zu rot verschoben wird. Bei Membranpotentialwerten von < 140 mV ist JC-1 primär monomer und seine Spektralantwort ist Richtung blau verschoben. Somit stellt das Verhältnis von zwei Emissionswellenlängen (645 nm und 530 nm) von JC-1, das in Mitochondrien ist, ein sensitives und kontinuierliches Maß des mitochondrialen Membranpotentials zur Verfügung.
Wir haben Lebendzellmessungen durchgeführt in einer Betriebsart mit hohem Durchsatz, als Basis eines generalisierten Indikators von toxischem Stress. Das Ziel unserer anfänglichen Experimente war es, das Verhältnis von J-Aggregaten von JC-1-Farbstoff zu seiner monomeren Form, sowohl vor als auch nach toxischem Stress, zu bestimmen.
Ablauf

1. Die Zellen wurden plattiert und bis zu über Nacht kultiviert.
2. Die Zellen wurden mit JC-1 (10 μg/ml) für 30 Minuten bei 37°C in einem CO₂-Inkubator gefärbt.
3. Die Zellen wurden dann schnell mit HBSS bei 37 °C (2 mal, 150 μl/Vertiefung) gewaschen, die Toxine wurden, falls erforderlich, zugesetzt und die ganze Platte wurde in einem Plattenlesegerät gescannt. Das JC-1-Monomer wurde optimal mit einem 485 nm Anregungs-/530 nm Emissionswellenlängen Filtersatz gemessen und die Aggregate wurden am Besten mit einem 590 nm Anregungs-/645 nm Emissionswellenlängen Set gemessen.

Ergebnisse
Das mitochondriale Potential in verschiedenen Typen lebender Zellen und die Wirkung von Toxinen auf das Potential wurden gemessen unter Verwendung des Fluoreszenzverhältnisses Ein 645 (590)/Em 530 (485) (Anregungswellenlängen in Klammern). Beispielsweise haben wir die Wirkung von 10 μM Valinomycin auf das mitochondriale Potential in LLCPK-Zellen (Schweineepithel) gemessen. Innerhalb von Sekunden der Behandlung induzierte das Toxin einen schnelleren und größeren Abfall (eine etwa 50%-ige Verringerung) des mitochondrialen Potentials, als es in unbehandelten Zellen gefunden wurde. Es wurde auch bestimmt, dass Hepatocyten gegenüber Valinomycin empfindlich sind und die Veränderungen im mitochondrialen Potential waren fast vollständig in Sekunden bis Minuten nach Zusatz von verschiedenen Konzentrationen des Toxins.
Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit dem mitochondrialen Potential als ein Modell eines intrazellulärer Detektors des Zellstresses. Da diese Messungen keine räumliche Auflösung in individuellen Zellen erfordern, können mitochondriale Potentialmessungen schnell in einem Gesamtzellassay (z. B. hoher Durchsatz) durchgeführt werden. Dies bedeutet beispielsweise, dass komplexe Arrays mit vielen Zelltypen simultan und kontinuierlich als eine generalisierte Toxinantwort getestet werden können. Solch ein Indikator kann ein Erstliniensignal zur Verfügung stellen, um anzuzeigen, dass generell toxischer Stress in einer Probe vorliegt. Weitere Assays können dann durchgeführt werden, um spezifischer das Toxin zu identifizieren, unter Verwendung von Klassifikator- oder Identifikatortyp von Reportermolekülen.
2. Hitzeschockproteine
Die meisten Säugerzellen antworten auf eine Vielzahl von Umgebungsstimuli mit der Induktion einer Familie von Proteinen, Stressproteine genannt. Sauerstoffmangel, Aminosäureanaloga, Sulfhydryl-reagierende Reagenzien, Übergangsmetallionen, Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung, virale Infektionen, Ethanol, Antibiotika, Ionophoren, nicht steroide anti-inflammatorische Arzneimittel, Hitzestress und Metallchelatoren sind alle Induktoren von Zellstressproteinsynthese, Funktion oder beidem. Nach Induktion spielen Stressproteine eine Rolle in der Faltung und Entfaltung von Proteinen, der Stabilisierung von Proteinen in abnormalen Konfigurationen und in der Reparatur von DNA-Schaden.
Es gibt Hinweise darauf, dass wenigstens vier Hitzeschockproteine von dem Cytoplasma in den Kern nach Stressaktivierung der Zelle translozieren. Diese Proteine schließen die Hitzeschockproteine HSP27 und HSP70 ein, den hitzeschock-verwandten HSC70 und den Hitzeschock-Transkriptionsfaktor HSF1. Deshalb stellt die Messung der Translokation dieser Proteine (und anderer Stressproteine, die von dem Cytoplasma in den Kern nach Zellstress translozieren) vom Cytoplasma in der Kern, eine schnelle Ausgabe des zellulären Stress zur Verfügung.
Wir haben die Antwort auf einen HSP27-GFP-Biosensor (SEQ ID 169–170) in zwei Zelllinien (BHK und HeLa) getestet, unter Verwendung einer Bibliothek von chemischen Schwermetall Verbindungen, wie biologischen Toxinstimulanzien, um die Zellen zu stressen. Kurz, Zellen, die den HSP27-GFP-Biosensor exprimieren, werden in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen plattiert und es wird ihnen ermöglicht, anzuheften. Die Zellen werden dann mit einer Reihe von Zellstress-induzierenden Verbindungen behandelt. Cytoplasmatische Lokalisierung des Fusionsproteins wurde nur in unstimulierten Zellen gefunden.
Andere ähnliche Hitzeschockproteinbiosensoren (HSP-70, HSC70 und HSF1, fusioniert an GFP) können als Detektoren verwendet werden und sind in SEQ ID NO: 171– 176 gezeigt.
Beispiele von Klassifikatoren:
Diese Klasse von Sensoren detektiert die Anwesenheit von Toxinen und klassifiziert Toxine weiterhin durch Identifizieren der zellulären Signalwege (des Signalwegs), die durch das Toxin gestört werden. Somit kann diese Art von Sensoren Toxine nachweisen und/oder klassifizieren in breite Kategorien, einschließlich, jedoch nicht beschränkt, auf "Toxine, die Signaltransduktion beeinflussen", "Toxine, die das Cytoskelett beeinflussen" und "Toxine, die Proteinsynthese beeinflussen". Es kann entweder ein Screen in der Betriebsart mit hohem Durchsatz oder in der Betriebsart mit hohem Gehalt verwendet werden. Klassifikatoren können Verbindunaen umfassen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt, auf Tubulin, Mikrotubuli-assoziierte Proteine, Actin, Actin-bindende Proteine, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Vinculin, α-Actinin, Actin-Depolymerisierungsfaktor/Cofilin, Profilin und Myosin; NF-κB, IκB, GTP-bindende Proteine, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, rac, rho und cdc42 und stressaktivierte Proteinkinasen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, p38-Mitogen-aktivierte Proteinkinase.
1. Tubulin-C oskelett
Das Zellcytoskelett spielt eine Hauptrolle in zellulären Funktionen und Prozessen, wie Endo- un Exocytose, Vesikeltransport und Mitose. Cytoskelett-beeinflussende Toxine, der proteinösen oder nichtproteinösen Form, wie C2-Toxin und verschiedene Klassen von Enteotoxinen, wirken entweder direkt auf das Cytoskelett oder indirekt über regulatorische Bestandteile, die die Organisation des Cytoskeletts kontrollieren. Deshalb kann die Messung struktureller Veränderungen des Cytoskeletts eine Klassifikation des Toxins in Klassen von Cytoskelett-beeinflussenden Toxinen ermöglichen. Dieser Assay kann durchgeführt werden in einer Betriebsart mit hohem Gehalt, wie früher beschrieben, oder in einer Betriebsart mit hohem Durchsatz. Die Betriebsart mit hohem Durchsatz wird durchgeführt, wie vorher beschrieben.
Solche Messungen sind wertvoll für die Identifikation von Toxinen, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf, Antimikrotubuli-Mittel, Mittel, die generell Zellzyklusprogressior und Zellproliferation beeinflussen, intrazelluläre Signaltransduktion und metabolische Prozesse.
Für den Mikrotubulizerstörungsassay wurden LLCPK-Zellen, stabil transfiziert mit einem Tubulin-GFP-Biosensorplasmid, auf Zellkulturschälchen mit 96 Vertiefungen bei einer 50-60%-igen Konfluenz plattiert und über Nacht bei 37°C, 5% CO₂, kultiviert. Eine Reihe von Konzentrationen (10–500 nM) von 5 Verbindungen (Paclitaxel, Curacin A, Norcidazol, Vinblastin und Colchicin) in normalem Medium wurden frisch aus dem Stock präpariert und wurden den Zellkulturschälchen zugesetzt, um das alte Kulturme dium zu ersetzen. Die Zellen wurden dann in einem Zellscreeningsystem, wie vorstehend beschrieben, zu einem 12 Stunden-Zeitpunkt beobachtet.
Unsere Daten weisen darauf hin, dass Tubulinchimären sich in Mikrotubuli über die ganze Zelle lokalisieren und in Mikrotubuli aufbauen. Die Mikrotubuliarrays in Zellen, die die Chimären exprimieren, antworten wie folgt auf eine Vielzahl von Antimikrotubuliverbindungen:

Arzneimittel Antwort

Vinblastin Destabilisierung

Nocodazol Destabilisierung

Paclitaxel Stabilisierung

Colchicin Destabilisierung

Curacin A Destabilisierung
Ähnliche Daten wurden erhalten unter Verwendung von Zellen, die den Tubulinbiosensor exprimieren, die auf Zellarrays gemustert wurden (so wie die, beschrieben in US-Patentanmeldung, Seriennr. 08/965,341, eingereicht am 29. Mal 1997, hier durch Referenz in ihrer Gesamtheit eingeschlossen) und wie vorstehend dosiert.
2. NF-κß
NF-κB ist bei einem Grundniveau der Stimulation cytoplasmatisch, jedoch nach Angriff transloziert es in den Kern, wobei es spezifisch DNA-Antwortelemente bindet und die Transkription einer Anzahl von Genen aktiviert. Translokation tritt auf, wenn IkB durch das Proteosom in Antwort auf spezifische Phosphorylierungs- und Ubiquitinierungsereignisse degradiert wird. IkB hält normalerweise NF-κB im Cytoplasma über direkte Interaktion mit dem Protein und Maskierung der NLS-Sequenz von NF-κB. Deshalb kann NF-κB-Translokation zum Kern als ein Indikator von Zellstress dienen, obwohl dies kein initiales oder definierendes Ereignis der gesamten Signalkaskade ist.
Wir haben NF-κB-GFP-Chimären zur Analyse in lebenden Zellen erzeugt. Dies wurde erreicht unter Verwendung von Standardpolymerasekettenreaktionstechniken unter Verwendung einer charakterisierten NF-κB p65-cDNA, erhalten von Invitrogen (Carlsbad, CA), fusioniert an EYFP PCR-Amplimer, der von Clontech Laboratories (Palo Alto, CA) erhalten wurde. Die resultierende Chimäre ist in SEQ ID NO: 177–178 gezeigt. Die zwei PCR-Produkte wurden in einen eukaryotischen Expressionsvektor ligiert, der dazu konstruiert wurde, das chimäre Protein in großen Mengen zu produzieren unter Verwendung des ubiquitären CMV-Promotors.
NF-κB-Immunlokalisation
Für weitere Studien haben wir endogene NF-κB-Aktivierung durch Immunlokalisation in Toxin-behandelten Zellen charakterisiert. Die in dieser Studie verwendeten NF-κB-Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) bezogen und sekundäre Antikörper sind von Molecular Probes (Eugene, OR).
Für die 3T3- und SNB19-Zelltypen haben wir die wirksamen Konzentrationen bestimmt, die Antwortspiegel von 50% des Maximums (EC50) erreichten, ausgedrückt in Einheiten der Masse pro Volumen (ng/ml) und Einheiten der Molarität. Basierend auf den Molekulargewichten von 17 kD für sowohl TNFa- als auch IL-1α, werden die EC50-Spiegel für diese zwei Verbindungen mit 3T3- und SNB19-Zelltypen in Einheiten der Molarität in Tabelle 1 angegeben. Unsere Ergebnisse zeigten die Reproduzierbarkeit von relativen Antworten von Null- bis Maximaldosis, allerdings gab es von Probe zu Probe gelegentliche Verschiebungen der Basislinienintensitäten der Antwort bei Null-Konzentration.
In diesen Experimenten wurden entweder 10 oder 100 TNFα-behandelte 3T3- oder SNB19-Zellen pro Vertiefung getestet. Auf der Grundlage von Standardabweichungsmessungen für diese Proben und durch Nehmen der T-Werte für den Studenten-T-Test haben wir die minimal nachweisbare Dosis für jeden Fall von Zelltyp, Verbindung, Anzahl der Zellen pro Vertiefung und für verschiedene Auswahlen, wie viele Vertiefungen pro Bedingung getestet werden, eingeschätzt. Der letzte Faktor bestimmt die Anzahl von Freiheitsgraden, die in der Probe von Daten zur Verfügung gestellt werden. Steigerung der Anzahl der Vertiefungen von 4 auf 16 und Steigern der Anzahl der Zellen pro Vertiefung von 10 auf 100 verbessert die minimal nachweisbare Dosis beträchtlich. Für 3T3-Zellen, die geringere minimal nachweisbare Dosen zeigten als die SNB19-Zellen und für den Fall von 1 % falsch negativen und 1% falsch positiven Raten, schätzen wir, dass 100 Zellen pro Vertiefung und einer Probengröße von 12 bis 16 Vertiefungen ausreichend ist, um eine Dosis von etwa gleich dem EC50-Wert von 0,15 ng/ml nachzuweisen. Wenn die falsch positive Rate bis zu 20% aufgelockert wird, kann eine Konzentration von etwa der Hälfte des Wertes nachgewiesen werden (0,83 ng/ml). Einhundert Zellen können bequem auf einem Zellkulturoberflächenbereich von weniger als 1 mm² getestet werden.
Tabelle 1. EC50-Spiegel für TNFa- und 1L-1a (basierend auf Molekulargewichten von 17 kD für beide)
3. Phospho-p38-Mitogen-aktivierte Proteinkinase (pp38MAPK)
MAPKs spielen nicht nur eine Rolle im Zellwachstum und in der Zellteilung, sondern auch als Mediatoren der zellulären Stressantwort. Eine MAPK, p38, wird durch chemische Stressinduktoren, wie hyperosmotisches Sorbitol, Wasserstoffperoxid, Arsenit, Cadmiumionen, Anisomycin, Natriumsalicylat und LPS aktiviert. Die Aktivierung von p38 wird auch von ihrer Translokation in den Kern aus dem Cytoplasma begleitet.
MAPK p38 liegt in einem Signalweg, der eine Kaskade von Kinasen ist. Somit ist p38 ein Substrat für eine oder mehrere Kinasen und sie phosphoryliert ein oder mehrere Substrate in Zeit und Raum in lebenden Zellen.
Der Assay, den wir hier zeigen, misst als eine von ihren Parametern p38-Aktivierung unter Verwendung von Immunolokalisierung der phosphorylierten Form von p38 in Toxin-behandelten Zellen. Der Assay wurde so entwickelt, um flexibel genug zu sein, um die simultane Messung von anderen Parametern in der gleichen individuellen Zelle einzuschließen. Da der Signaltransduktionsweg, der durch den Transkriptionsfaktor NF-κB vermittelt wird, auch dafür bekannt ist, dass er in die Zellstressantwort involviert ist, haben wir die Aktivierung von NF-κB als einen zweiten Parameter in den gleichen Assay eingeschlossen.
Unsere Experimente zeigen einen Immunofluoreszenzansatz, der verwendet werden kann, um p38 MAPK-Aktivierung, entweder allein oder in Kombination mit NF-κB-Aktivierung in der gleichen Zelle zu messen. Viele Zelltypen, Modelltoxine und Antikörper wurden getestet und signifikante Stimulation von beiden Signalwegen wurde in der Betriebsart mit hohem Gehalt gemessen. Die Phospho-p38-Antikörper, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) bezogen. Wir berichten, dass wenigstens zwei Zellstresssignalwege nicht nur gleichzeitig gemessen werden können, sondern sie sind unterschiedlich responsiv auf Klassen von Modelltoxinen. 36 zeigt die differentielle Antwort von p38 MAPK- und NF-κB-Signalwegen über drei Modelltoxine und zwei verschiedene Zelltypen. Es ist beachtenswert, dass drei der Modelltoxine (II1α, TNFα und Anisomycin) durch die zwei Assays als Aktivatoren spezifischer Signalwege unterschieden werden konnten, wenn sie allein zugesetzt wurden.
IκB-Chimäre
IκB-Abbau ist das Schlüsselereignis, das zur Kerntranslokation von NF-κB führt und zur Aktivierung der NF-κB-vermittelten Stressantwort. Wir haben diesen Sensor gewählt, um den NF-κB-Sensor als einen Klassifikator in einer Betriebsart mit hohem Durchsatz zu ergänzen: Die Messung von Signalverlust aufgrund der Degradation von IκB-GFP-Fusionsprotein erfordert keine räumliche Auflösung in individuellen Zellen und als solche sehen wir IκB-Abbaumessungen als schneller durchführbar auf Ganzzellsubstraten an.
Dieser Biosensor basiert auf der Fusion der ersten 60 Aminosäuren von IkB an die Fred25-Variante von GFP. SEQ ID NO: 79–180. Dieser Bereich von IkB enthält alle regulatorischen Sequenzen, einschließlich Phosphorylierungsstellen und ubiquitären Stellen, die notwendig sind, um Proteosomendegradation auf den Biosensor zu übertragen. Wenn man dies weiß, resultiert die Stimulierung von jedem Signalweg, der typischerweise zu NFκB-Translokation führen würde, in dem Abbau des Biosensors. Die Beobachtung der Fluoreszenzintensität von Zellen, die IκB-GFP exprimieren, identifiziert den Degradationsprozess.
Beispiele für Identifikatoren:
In unserer Identifikationsstrategie sichern die ersten beiden Stufen der Charakterisierung ein schnelles Ergebnis der Toxinklasse, ohne die Fähigkeit zu verwerfen, viele neue Mutantentoxine nachweisen zu können oder verschiedene komplexe Gemische von bekannten Toxinen analysieren zu können. Die dritte Stufe der Biosensoren sind Identifikatoren, die ein spezifisches Toxin oder eine Gruppe von Toxinen identifizieren können. In einer Ausführungsform umfasst ein Identifikator einen Proteasebiosensor, der auf die Aktivität eines spezifischen Toxins antwortet. Andere Identifikatoren wurden hergestellt mit Reportern/Biosensoren, die spezifisch für ihre Aktivitäten sind. Diese schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, posttranslationale Modifikationen, wie Phosphorylierung oder ADP-Ribosylierung, Translokation zwischen zellulären Organellen oder Kompartimenten, Wirkungen auf spezifische Organellen oder zelluläre Bestandteile (z. B. Membranpermeabilisierung, Cytoskelettneuanordnung, usw.).
ADP-ribosylierende Toxine – Diese Toxine schließen Pseudomonas Toxin A, Diphtherie Toxin, Botulinum Toxin, Pertussis Toxin und Cholera Toxin ein. Beispielsweise induziert C. botulinum C2-Toxin die ADP-Ribosylierung von Arg177 in dem Cytoskelettprotein Actin und verändert somit seine Aufbau-Eigenschaften. Neben der Konstruktion eines Klassifiziererassays, um Actin-Cytoskelett Regulierung zu messen, kann ein Identifikatorassay konstruiert sein, um die spezifische Actin-ADP-Ribosylierung nachzuweisen. Da die ADP-Ribosylierung eine Konformationsänderung induziert, die es dem modifizierten Actin nicht länger erlaubt zu polymerisieren, kann diese Konformationsänderung intrazellulär auf verschiedenen möglichen Wegen unter Verwendung von Lumineszenzreagenzien nachgewiesen werden. Beispielsweise kann Actin lumineszenzmarkiert werden unter Verwendung eines Fluoreszenzreagens mit einer angemessen Lebenszeit des Anregungsstatus, die die Messung der turnusmäßigen Diffusion des intrazellulären Actins erlaubt, unter Verwendung einer Gleichgewichts-Fluoreszenzanisotropie. Das heißt, Toxin-modifiziertes Actin wird nicht länger in der Lage sein, sich zu festen Filamenten zusammenzusetzen und wird deshalb nur Lumineszenzsignale mit relativ geringer Anisotropie erzeugen, die leicht mit einem Bildgebungssystem gemessen werden können. In einer anderen Ausführungsform kann Actin mit einem polaritätsempfindlichen Fluoreszenzreagens markiert werden, das Veränderungen der Actinkonformation durch Spektralverschiebungen des angehefteten Reagens berichtet. Das heißt, Toxinbehandlung induziert eine Konformationsänderung im intrazellulären Actin, so dass das Verhältnis von zwei Fluoreszenzwellenlängen ein Maß der Actin-ADP-Ribosylierung zur Verfügung stellt.
Cytotoxische Phospholipasen – Verschiedene Gram-positive Bakterienspezies erzeugen cytotoxische Phospholipasen. Beispielsweise produziert Clostridium perfringens eine Phospholipase C, die spezifisch für die Spaltung von Phosphoinositiden ist. Diese Phosphoinositide (z. B. Inositol-1,4,5-triphosphat) induziert die Entlassung von Calciumionen aus intrazellulären Organellen. Ein Assay, der entweder als Assay mit hohem Gehalt oder Assay mit hohem Durchsatz durchgeführt werden kann, kann konstruiert werden, um die Entlassung von Calciumionen unter Verwendung von Fluoreszenzreagenzien zu messen, die geänderte spektrale Eigenschaften haben, werdn sie mit Metallionen komplexiert werden. Somit kann eine direkte Konsequenz der Wirkung eines Phospholipase C-basierten Toxins als eine Veränderung der zellulären Calciumionenkonzentration gemessen werden.
Exfoliative Toxine – Diese Toxine werden von verschiedenen Staphylococcen Spezies erzeugt und bestehen aus verschiedenen Serotypen. Ein spezifischer Identifikator für diese Toxine kann konstruiert werden durch Messung der morphologischen Veränderungen in ihrem Zielorganell, dem Desmosom, das an Verbindungen zwischen Zellen auftritt. Es ist bekannt, dass die exfoliativen Toxine die Morphologie der Desmosomen in zwei kleinere Bestandteile, Hemidesmosomen genannt, verändern. In dem Assay mit hohem Gehalt für exfoliative Toxine werden Epithelialzellen, deren Desmosomen lumineszenzmarkiert sind, einer Bildanalyse unterworfen. Ein Verfahren, das die morphologischen Veränderungen zwischen Desmosomen und Hemidesmosomen nachweist, wird verwendet, um die Aktivität des Toxins auf die Zellen zu quantifizieren.
Die meisten dieser Identifikatoren können in Assays mit hohem Durchsatz verwendet werden, die keine räumliche Auflösung erfordern, genauso wie in Assays mit hohem Gehalt.
Verschiedene biologische Bedrohungsmittel können als spezifische Proteasen wirken und somit haben wir auf die Entwicklung von Fluoreszenzproteinbiosensoren fokussiert, die die proteolytische Spaltung von spezifischen Aminosäuresequenzen, die in Zielproteinen gefunden werden, berichten.
Eine Anzahl solcher Proteasebiosensoren (einschließlich FRET-Biosensoren) sind vorstehend offenbart, wie die Caspase-Biosensoren, Anthrax, Tetanus, Botulinum und die Zinkmetalloproteasen. FRET ist eine kraftvolle Technik, in der kleine Veränderungen der Proteinkonformation, von denen viele mit Toxinaktivität assoziiert sind, nicht nur gemessen werden können mit hoher Präzision in Zeit und Raum in lebenden Zellen, sondern auch in einer Betriebsart mit hohem Durchsatz gemessen werden können, wie vorstehend diskutiert.
Wie vorstehend beschrieben, weiß der Fachmann, dass die Proteasebiosensoren dieses Aspekts der Erfindung angepasst werden können, durch eine Substitution der geeigneten Proteaseerkennungsstelle in jedem der Konstrukte (vgl. 29B), um die Aktivität von jeder Protease berichten zu können,. Wie vorstehend offenbart, können diese Biosensoren verwendet werden in Screens mit hohem Gehalt oder mit hohem Durchsatz, um in vivo Aktivierung von enzymatischer Aktivität durch Toxine nachzuweisen und um spezifische Aktivität, basierend auf Spaltung eines bekannten Erkennungsmotivs, zu identifizieren. Diese Biosensoren können sowohl in lebenden Zellen als auch in fixierten Endpunktassays verwendet werden und sie können mit zusätzlichen Messungen kombiniert werden, um einen Multiparameterassay zur Verfügung zu stellen.
Anthrax LF
Anthrax ist ein gutbekanntes Mittel der biologischen Kriegsführung und es ist ein exzellentes Ziel für die Entwicklung eines Biosensors, der Identifikator-Klasse. Der Lethalfaktor (LF) ist eines der Proteinbestandteile, die Toxizität auf Anthrax übertragen und kürzlich wurden zwei seiner Ziele in der Zelle identifiziert. LF ist eine Metalloprotease, die spezifisch Mek1- und Mek2-Proteine spaltet, Kinasen, die einen Teil des MAP-Kinase Signaltransduktionswegs sind. Die Konstruktion des Lethalfaktor Proteasebiosensors ist vorstehend beschrieben (SEQ ID NO: 7–8; 9–10). Das grünfluoreszierende Protein (GFP) wird im Leserahmen an den Aminoterminus von entweder Mek1 oder Mek2 (oder von beiden) fusioniert, was in einem Chimären Protein resultiert, das in dem Cytoplasma aufgrund der Anwesenheit einer Kernexportsequenz (NES), die in beiden Zielmolekülen enthalten ist, zurückgehalten wird. Nach Spaltung durch den aktiven Lethalfaktor wird GFP aus der Chimäre entlassen und ist frei, um in den Kern zu diffundieren. Deshalb stellt die Messung der Akkumulation von GFP in dem Kern ein direktes Maß der LF-Aktivität gegen sein natürliches Ziel, die lebende Zelle, zur Verfügung.
Obwohl eine bevorzugte Form der Erfindung in den Zeichnungen gezeigt und beschrieben wurde und da Variationen der bevorzugten Form dem Fachmann klar sein werden, sollte die Erfindung nicht als beschränkt auf die spezifische Form, die gezeigt und beschrieben wurde, ausgelegt werden, sondern statt dessen wie in den Ansprüchen dargelegt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein automatisiertes Verfahren für Zell-basierte Toxin-Charakterisierung, umfassend – Bereitstellung einer Anordnung („Array") von Stellen, die Zellen enthalten, die mit einer Testsubstanz behandelt werden sollen, wobei die Zellen wenigstens ein erstes lumineszierendes Reportermolekül, das einen Detektor umfasst und ein zweites lumineszierendes Reportermolekül besitzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Klassifikatar („classifier") oder einem Identifikator („identifier"); – in Kontakt bringen der Zellen mit der Testsubstanz entweder vor oder nachdem die Zellen die ersten und zweiten lumineszierenden Reportermoleküle enthalten; wobei die Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des ersten und zweiten lumineszierenden Reportermoleküls modifiziert wird, wenn die Zelle mit dem Toxin in Kontakt gebracht wird, – Aufnahme oder Scanning multipler Zellen an allen Stellen, die multiple Zellen enthalten, um lumineszierende Signale vom Detektor zu erhalten; – Konvertierung der lumineszierenden Signale vom Detektor in digitale Daten: – Verwendung der digitalen Daten vom Detektor zur automatischen Messung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des Detektors auf oder in der Zelle, wobei eine Veränderung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des Detektors die Anwesenheit eines Toxins in der Testsubstanz zeigt; – selektive Aufnahme oder Scanning der Stellen, die Zellen enthalten, die mit einer Testprobe in Kontakt gebracht wurden, die als Toxin-enthaltend gekennzeichnet ist, zum Erhalt von lumineszierenden Signalen vom zweiten Reportermolekül; – Konvertierung der lumineszierenden Signale vom zweiten lumineszierenden Reportermolekül in digitale Daten; – Verwendung der digitalen Daten vom zweiten lumineszierenden Reportermolekül zur automatischen Messung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des Klassifikators oder Identifikators auf oder in der Zelle, wobei eine Veränderung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des Klassifikators einen zellulären Weg identifiziert, der durch das in der Testsubstanz anwesende Toxin gestört wird, oder wobei eine Veränderung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des Identifikators das spezifische Toxin oder die Gruppe von Toxinen identifiziert, die in der Testsubstanz anwesend sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das zweite lumineszierende Reportermolekül ein Klassifikator ist und die von dem Klassifikator abgeleiteten digitalen Daten dazu verwendet werden, einen geeigneten. Identifikator für die ldentifizierung des spezifischen Toxins oder von Gruppen von Toxinen auszuwählen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das zweite lumineszierende Reportermolekül ein Klassifikator ist un die Zellen weiterhin ein drittes lumineszierendes Reportermolekül umfassen, wobei das dritte lumineszierende Reportermotekül einen Identifikator umfasst; wobei die Zellen entweder vor oder nachdem sie das Brüte lumineszierende Reportermolekül enthalten mit der Testsubstanz in Kontakt gebracht werden; wobei die Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des dritten lumineszierenden Reportermolekül modifiziert wird, wenn die Zelle mit dem Toxin in Kontakt gebracht wird, wobei das Verfahren weiter umfasst: – selektive Aufnahme oder Scanning der Stellen, die Zellen enthalten, die mit einer Testprobe in Kontakt gebracht wurden, die als Toxin-enthaltend gekennzeichnet ist, um lumineszierende Signale vom Identifikator zu erhalten; – Konvertierung der lumineszierenden Signale vom Identifikator in digitale Daten; un – Verwendung der digitalen Daten vom Identifikator zur automatischen Messung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des Identifikators auf oder in der Zelle, wobei eine Veränderung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des Identifikators das spezifische Toxin oder die Gruppe von Toxinen identifiziert, die in der Testsubstanz anwesend ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die digitalen Daten, die vom Klassifikator abgeleitet sind, dazu verwendet werden, einen geeigneten Identifikator für die ldentifizierung eines spezifischen Toxins oder einer Gruppe von Toxinen auszuwählen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei der Detektor ein Molekül umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hitzeschockproteinen und Verbindungen, die auf Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials, der intrazellulären freien Ionenkonzentration, der Organisation des Zytoskeletts, des allgemeinen metabolischen Status, der zeitlich regulierten Ereignisse im Zellzyklus und der Struktur und Funktion von Organellen reagieren.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, wobei der Klassifikator ein Molekül umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tubulin, Microtubuli-assoziierten Proteinen, Actin, Actin-bindenden Proteinen, NF-κB, IκB und stress-aktivierten Kinasen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–6, wobei der zelluläre Weg ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zell-Stresswegen, Zell-Metabolismuswegen, Zell-Signalübertragungswegen, Zellwachstumswegen und Zellteilungswegen.
Verfahran gemäß Anspruch 1, wobei das zweite lumineszierende Reportermolekül ein Identifikator ist, und der Identifikator identifiziert ein Toxin oder eine Gruppe von Toxinen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteasen, ADP-ribosylierenden Toxinn, cytotoxischen Phospholipasen und entbiätternden Toxinn.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3–7, wobei der Identifikator ein Toxin oder in Gruppe von Toxinn identifiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteasen, ADP-ribosylierenden Toxinen, cytctoxischen Phospholipasen und entblätternden Toxinen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–9, wobei die Veränderung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität der ersten, zweiten oder dritten lumineszierenden Reportermoleküle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Translokation vom Cytoplasma in den Nukleus, Translokation vom Nukleus oder Nukleolus ins Cytoplasma, Rezeptorinternalisation, mitochondriales Membranpotential, Signalverlust, spektrale Antwort des Reportermoleküls, Phosphorylierung, intrazelluläre Konzentration freier Ionen, Zollgröße, Zellform, Organisation- des Zytoskeletts, metabolische Vorgänge, Zellmotilität, Zoll-Substratanheftung, Zellzyklusereignisse und Struktur und Funktion von Organellen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–10, wobei die Aufnahme oder das Scanning multipler Zellen an alten Stellen, die multiple Zellen enthalten, zum Erhalt lumineszierender Signale vom Detektor in einem Modus mit hohem Durchsatz durchgeführt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–10, wobei die Aufnahme oder das Scanning multipler Zellen an allen Stellen, die multiple Zellen enthalten, zum Erhalt lumineszierender Signale vom Detektor in einem Modus mit hohem Informationsgehalt („high content mode") durchgeführt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1–10, wobei die selektive Aufnahme oder das Scanning der Stellen, die Zellen enthalten, die mit einer Testprobe in Kontakt gebracht wurden, die als Toxin-enthaltend gekennzeichnet ist, zum Erhalt lumineszierender Signale vom zweiten oder dritten. Reportermolekül in einem Modus mit hohem Durchsatz durchgeführt werden.
Verfahren. gemäß Anspruch 1–10 wobei die selektive Aufnahme oder das Scanning der Steilen, die Zallen enthalten, die mit einer Testprobe in Kontakt gebracht wurden. die als Toxin-enthaltend gekennzeichnet ist, zum Erhalt lumineszierender Signale vom zweiten oder dritten Reportermolekül in einem Modus mit hohem Informationsgehalt durchgeführt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–14, weiter umfassend die Bereitstellung eines digitalen Speichermediums für die Datenspeicherung und zur Archivirung.
Verfahren gemäß Anspruch 1 , waiter umfassend ein Hilfsmittel für die automatisierte Kontrolle, Erfassung, Verarbeitung und Darstellung von Daten.
Ein computerlesbares Speichermedium, umfassend ein Programm, das einen Satz von Instruktionen enthält, damit ein Zellscreeningsystem das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–16 ausführt, wobei das Zellscreening-System ein optisches System mit einem Gestell umfasst, das dazu geeignet ist, eine Platte, die Zellen enthält, zu halten, ein Hilfsmittel zur Bewegung des Gestells oder des optischen Systems, eine Digitalkamera, ein Hilfsmittel zur Ausrichtung des von. den Zellen emittierten Lichtes zur Digitalkamera, und einen Computer zum Erhalt und zur Verarbeitung der digitalen Daten von der digitalen Kamera.
Ein automatisiertes Verfahren für Zell-basierte Toxin-Charakterisierung, umfassend – Bereitstellung einer ersten Anordnung („Array") von Stellen, die Zellen enthalten, die mit einer Testsubstanz behandelt werden sollen, wobei die Zellen wenigstens ein erstes lumineszierendes Reportermolekül, umfassend ein Reportermolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Detektoren und Klassifikatoren, besitzen; – In Kontakt bringen der Zellen mit der Testsubstanz entweder vor oder nachdem die Zellen das erste Reportermolekül enthalten; wobei die Lokalisation, Verteilung, Struktur, oder Aktivität des ersten lumineszierenden Reportermoleküls modifiziert wird, wenn die Zelle mit dem Toxin in Kontakt gebracht wird, – Aufnahme oder Scanning multipler Zellen an allen Stellen, die multiple Zellen enthalten, um lumineszierende Signale vom wenigstens ersten lumineszierenden Reportermolekül zu erhalten; – Konvertierung der lumineszierenden Signale vom wenigstens ersten lumineszierenden Reportermolekül in digitale Daten: – Verwendung der digitalen Daten vom wenigstens ersten lumineszierenden Reportermolekül zur automatischen Messung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des wenigstens ersten lumineszierenden Reportermoleküls auf oder in der Zelie, wobei eine Veränderung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des wenigstens ersten lumineszierenden Reportermolekül die Anwesenheit eines Toxins in der Testsubstanz zeigt; – Sereitstellung einer zweiten Anordnung von Steilen, die Zellen enthalten, die mit einer Testsubstanz behandelt werden sollen, wobei die Zellen wenigstens ein zweites lumineszierendes Reportermolelül, umfassend ein Reportermolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Klassifikatoren und Identifikationen besitzen, und wobei die zweite Anordnung von Stehen, die Zellen enthalten, entweder den gleichen oder einen anderen Zelltyp als die erste Anordnung von Stellen, die Zellen enthält, umfassen kann; – In Kontakt bringen der zweiten Anordnung von Stellen mit der Testsubstanz entweder vor oder nachdem die Zellen das zweite lumineszierende Reportermolekül enthalten; wobei die Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des zweiten lumineszierenden Reportermoleküls modifiziert wird, wenn die Zelle mit dem Toxin in Kontakt gebracht wird, – Verwendung der digitalen Daten vom zweiten lumineszierenden Reportermolekül zur automatischen Messung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des Klassifikators oder Identifikators auf oder in der Zelle, wobei eine Veränderung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des Klassifikators einen zellulären Weg identifiziert, der durch das in der Testsubstanz anwesende Toxin gestört wird, oder wobei eine Veränderung der Lokalisation, Verteilung, Struktur oder Aktivität des Identifikators das spezifische Toxin oder die Gruppe von Toxinen identifiziert, die in der Testsubstanz anwesend sind.