JP2003526772A - 細胞ベースのスクリーニング用のシステム - Google Patents
細胞ベースのスクリーニング用のシステムInfo
- Publication number
- JP2003526772A JP2003526772A JP2000601420A JP2000601420A JP2003526772A JP 2003526772 A JP2003526772 A JP 2003526772A JP 2000601420 A JP2000601420 A JP 2000601420A JP 2000601420 A JP2000601420 A JP 2000601420A JP 2003526772 A JP2003526772 A JP 2003526772A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- toxin
- activity
- reporter molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 187
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 107
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 97
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 72
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 901
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 118
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 116
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 116
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 100
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 98
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 71
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 71
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 70
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 65
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 62
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 57
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 45
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 37
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 35
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 33
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 30
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 30
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 26
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 22
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 20
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 20
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 20
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 19
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 claims description 18
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 16
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 15
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 claims description 12
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 claims description 12
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 claims description 10
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims description 8
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 8
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 7
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 7
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 claims description 6
- 230000033300 receptor internalization Effects 0.000 claims description 6
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 claims description 5
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 4
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 3
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010020004 Microtubule-Associated Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 claims 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 claims 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 claims 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000009211 stress pathway Effects 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 60
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 43
- 230000008827 biological function Effects 0.000 abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 120
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 103
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 98
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 96
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 93
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 92
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 88
- 239000000047 product Substances 0.000 description 82
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 76
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 72
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 65
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 65
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 64
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 60
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 57
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 56
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 56
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 53
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 53
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 53
- 238000002952 image-based readout Methods 0.000 description 50
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 50
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 47
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 45
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 44
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 42
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 40
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 39
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 39
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 39
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 37
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 36
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 36
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 35
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 33
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 31
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 30
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 30
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 30
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 29
- 230000008569 process Effects 0.000 description 29
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 27
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 27
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 26
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 26
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 25
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 24
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 24
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 23
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 23
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 23
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 23
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 23
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 23
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 23
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 23
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 22
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 22
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 22
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 21
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 20
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 20
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 20
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 20
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 20
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 20
- HONKEGXLWUDTCF-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-2-methyl-4-phosphonobutanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@](N)(C)CCP(O)(O)=O HONKEGXLWUDTCF-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 19
- 101000616438 Homo sapiens Microtubule-associated protein 4 Proteins 0.000 description 19
- 102100021794 Microtubule-associated protein 4 Human genes 0.000 description 19
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 18
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 17
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 17
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 17
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 16
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 16
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 16
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 16
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 15
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 15
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 15
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 15
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 15
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 14
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 14
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 14
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 13
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 13
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 13
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 13
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 13
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 13
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 13
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 12
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 12
- 238000012552 review Methods 0.000 description 12
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 11
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 11
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 11
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 description 11
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 11
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 11
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 11
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 11
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 11
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 10
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 10
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 10
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 10
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 238000003491 array Methods 0.000 description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- FYNNIUVBDKICAX-UHFFFAOYSA-M 1,1',3,3'-tetraethyl-5,5',6,6'-tetrachloroimidacarbocyanine iodide Chemical compound [I-].CCN1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2N(CC)C1=CC=CC1=[N+](CC)C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2N1CC FYNNIUVBDKICAX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 8
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 8
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 8
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 8
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 8
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 8
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004149 Annexin A2 Human genes 0.000 description 7
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 7
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 7
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 7
- 102000021160 microtubule binding proteins Human genes 0.000 description 7
- 108091011150 microtubule binding proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- -1 retinoids Substances 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 7
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 6
- 102000011195 Profilin Human genes 0.000 description 6
- 108050001408 Profilin Proteins 0.000 description 6
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 6
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 6
- 101710204001 Zinc metalloprotease Proteins 0.000 description 6
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 6
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 6
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 6
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 6
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 6
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 6
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 5
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 5
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108010066154 Nuclear Export Signals Proteins 0.000 description 5
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 5
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 5
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 5
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M mitoTracker Red Chemical compound [Cl-].C1=CC(CCl)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 5
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 5
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 5
- AOUOVFRSCMDPFA-QSDJMHMYSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-carboxypropanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O AOUOVFRSCMDPFA-QSDJMHMYSA-N 0.000 description 4
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 4
- RUVJFMSQTCEAAB-UHFFFAOYSA-M 2-[3-[5,6-dichloro-1,3-bis[[4-(chloromethyl)phenyl]methyl]benzimidazol-2-ylidene]prop-1-enyl]-3-methyl-1,3-benzoxazol-3-ium;chloride Chemical compound [Cl-].O1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=CC=C(N(C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C11)CC=2C=CC(CCl)=CC=2)N1CC1=CC=C(CCl)C=C1 RUVJFMSQTCEAAB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 4
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 4
- KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N Nocodazole Chemical compound C1=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=CC=C1C(=O)C1=CC=CS1 KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000007451 Steroid Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010085012 Steroid Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 102000000072 beta-Arrestins Human genes 0.000 description 4
- 108010080367 beta-Arrestins Proteins 0.000 description 4
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 4
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 4
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- SDZRWUKZFQQKKV-JHADDHBZSA-N cytochalasin D Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@H]\3[C@]2([C@@H](/C=C/[C@@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)C/C=C/3)OC(C)=O)C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 SDZRWUKZFQQKKV-JHADDHBZSA-N 0.000 description 4
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 4
- 210000001047 desmosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 4
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 4
- 229950006344 nocodazole Drugs 0.000 description 4
- 230000017111 nuclear migration Effects 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- YKJYKKNCCRKFSL-RDBSUJKOSA-N (-)-anisomycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@@H]1[C@H](OC(C)=O)[C@@H](O)CN1 YKJYKKNCCRKFSL-RDBSUJKOSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- YKJYKKNCCRKFSL-UHFFFAOYSA-N Anisomycin Natural products C1=CC(OC)=CC=C1CC1C(OC(C)=O)C(O)CN1 YKJYKKNCCRKFSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 101800001318 Capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 102000004018 Caspase 6 Human genes 0.000 description 3
- 108090000425 Caspase 6 Proteins 0.000 description 3
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031480 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Human genes 0.000 description 3
- 101710146529 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100023266 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 Human genes 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 3
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 3
- 108010068342 MAP Kinase Kinase 1 Proteins 0.000 description 3
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100027609 Rho-related GTP-binding protein RhoD Human genes 0.000 description 3
- 102000002215 Synaptobrevin Human genes 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 3
- MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N [(1S,2R,3S,4S,5R,6S)-2,3,5-trihydroxy-4,6-diphosphonooxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N 0.000 description 3
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 3
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 3
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 3
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 3
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 238000002179 total cell area Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 3
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 3
- MJKVTPMWOKAVMS-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-1-benzopyran-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(O)=CC2=C1 MJKVTPMWOKAVMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- IPJDHSYCSQAODE-UHFFFAOYSA-N 5-chloromethylfluorescein diacetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(CCl)=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 IPJDHSYCSQAODE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 description 2
- 102100038902 Caspase-7 Human genes 0.000 description 2
- 206010051914 Cholesterosis Diseases 0.000 description 2
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 2
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 2
- 108090000365 Cytochrome-c oxidases Proteins 0.000 description 2
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108091005942 ECFP Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102220547966 Gamma-tubulin complex component 5_A61P_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102000003638 Glucose-6-Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010086800 Glucose-6-Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108010036652 HSC70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100027421 Heat shock cognate 71 kDa protein Human genes 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 101000926939 Homo sapiens Glucocorticoid receptor Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 2
- 108010031792 IGF Type 2 Receptor Proteins 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 102000006835 Lamins Human genes 0.000 description 2
- 108010047294 Lamins Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 101150040099 MAP2K2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000019218 Mannose-6-phosphate receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 102000006270 Proton Pumps Human genes 0.000 description 2
- 108010083204 Proton Pumps Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000010632 Transcription Factor Activity Effects 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- 108010067973 Valinomycin Proteins 0.000 description 2
- OKSSKVHGKYJNLL-LJRZAWCWSA-N [(3as,4r,9s,10as)-2,6-diamino-10,10-dihydroxy-9-sulfooxy-3a,4,8,9-tetrahydro-1h-pyrrolo[1,2-c]purin-4-yl]methoxycarbonylsulfamic acid Chemical compound OS(=O)(=O)NC(=O)OC[C@@H]1N=C(N)N2C[C@H](OS(O)(=O)=O)C(O)(O)[C@@]22N=C(N)N[C@H]21 OKSSKVHGKYJNLL-LJRZAWCWSA-N 0.000 description 2
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000001946 anti-microtubular Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000003131 biological toxin Substances 0.000 description 2
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000298 carbocyanine Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 230000007960 cellular response to stress Effects 0.000 description 2
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol group Chemical group [C@@H]1(CC[C@H]2[C@@H]3CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)[C@H](C)CCCC(C)C HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- FCFNRCROJUBPLU-UHFFFAOYSA-N compound M126 Natural products CC(C)C1NC(=O)C(C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC1=O FCFNRCROJUBPLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 2
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 2
- 238000003366 endpoint assay Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 description 2
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 2
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000000301 hemidesmosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 2
- 238000003711 image thresholding Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 2
- 210000005053 lamin Anatomy 0.000 description 2
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000008880 microtubule cytoskeleton organization Effects 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- 239000002935 phosphatidylinositol 3 kinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 150000003906 phosphoinositides Chemical class 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000006659 positive regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 239000000985 reactive dye Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- FCFNRCROJUBPLU-DNDCDFAISA-N valinomycin Chemical compound CC(C)[C@@H]1NC(=O)[C@H](C)OC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)OC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)OC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)OC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)OC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)OC1=O FCFNRCROJUBPLU-DNDCDFAISA-N 0.000 description 2
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- AADVCYNFEREWOS-UHFFFAOYSA-N (+)-DDM Natural products C=CC=CC(C)C(OC(N)=O)C(C)C(O)C(C)CC(C)=CC(C)C(O)C(C)C=CC(O)CC1OC(=O)C(C)C(O)C1C AADVCYNFEREWOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIMKEUIWMFJVNB-UHFFFAOYSA-N 10-pyren-1-yldecanoic acid Chemical compound C1=C2C(CCCCCCCCCC(=O)O)=CC=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 PIMKEUIWMFJVNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNCRLPDJZXODHN-UHFFFAOYSA-N 12-cyclopenta[f]indazol-3-yldodecanoic acid Chemical compound C1=C2C=CC=C2C=C2N=NC(CCCCCCCCCCCC(=O)O)=C21 WNCRLPDJZXODHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTGGHNHGPURMEO-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-3,5-dimethylpyrazine Chemical compound CC1=CN=C(Cl)C(C)=N1 BTGGHNHGPURMEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUOYTFVLNZIELF-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1h-indole-4,6-dicarboximidamide Chemical compound N1C2=CC(C(=N)N)=CC(C(N)=N)=C2C=C1C1=CC=CC=C1 BUOYTFVLNZIELF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- QWZHDKGQKYEBKK-UHFFFAOYSA-N 3-aminochromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(N)=CC2=C1 QWZHDKGQKYEBKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWAUSMGZOHPBJJ-UHFFFAOYSA-N 4-nitro-1,2,3-benzoxadiazole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC2=C1N=NO2 UWAUSMGZOHPBJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001572 5'-adenylyl group Chemical group C=12N=C([H])N=C(N([H])[H])C=1N=C([H])N2[C@@]1([H])[C@@](O[H])([H])[C@@](O[H])([H])[C@](C(OP(=O)(O[H])[*])([H])[H])([H])O1 0.000 description 1
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 1
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 1
- OXMYYHNSVUCQCH-UHFFFAOYSA-N 9-cyclopenta[f]indazol-3-ylnonanoic acid Chemical compound C1=C2C=CC=C2C=C2N=NC(CCCCCCCCC(=O)O)=C21 OXMYYHNSVUCQCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015693 Actin Depolymerizing Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010038798 Actin Depolymerizing Factors Proteins 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 1
- 241000976983 Anoxia Species 0.000 description 1
- 102000007272 Apoptosis Inducing Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010033604 Apoptosis Inducing Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 description 1
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023441 Centromere protein J Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M Cetrimide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000122205 Chamaeleonidae Species 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 241000511343 Chondrostoma nasus Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000010831 Cytoskeletal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037414 Cytoskeletal Proteins Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003668 Destrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000082 Destrin Proteins 0.000 description 1
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- AADVCYNFEREWOS-OBRABYBLSA-N Discodermolide Chemical compound C=C\C=C/[C@H](C)[C@H](OC(N)=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C\C(C)=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C/[C@@H](O)C[C@@H]1OC(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H]1C AADVCYNFEREWOS-OBRABYBLSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 101100285518 Drosophila melanogaster how gene Proteins 0.000 description 1
- 206010013710 Drug interaction Diseases 0.000 description 1
- 102100021238 Dynamin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010022894 Euchromatin Proteins 0.000 description 1
- OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N Fluo-3 Chemical class CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(Cl)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(Cl)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091022623 Formins Proteins 0.000 description 1
- 102000020897 Formins Human genes 0.000 description 1
- YXWOAJXNVLXPMU-ZXXMMSQZSA-N Fructose 2,6-diphosphate Chemical compound OP(=O)(O)O[C@]1(CO)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O YXWOAJXNVLXPMU-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108090001064 Gelsolin Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100033417 Glucocorticoid receptor Human genes 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010045100 HSP27 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032606 Heat shock factor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710084528 Heat shock transcription factor hsf-1 Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000907924 Homo sapiens Centromere protein J Proteins 0.000 description 1
- 101001014196 Homo sapiens Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001115402 Homo sapiens Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000817607 Homo sapiens Dynamin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001040734 Homo sapiens Golgi phosphoprotein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000867525 Homo sapiens Heat shock factor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000693082 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase 11-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 101000879758 Homo sapiens Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652229 Homo sapiens Suppressor of cytokine signaling 7 Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 101000839464 Leishmania braziliensis Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101150100676 Map2k1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004232 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 1
- 101100456048 Mus musculus Map4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000822667 Mus musculus Something about silencing protein 10 Proteins 0.000 description 1
- 102000008934 Muscle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010074084 Muscle Proteins Proteins 0.000 description 1
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000008297 Nuclear Matrix-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010035916 Nuclear Matrix-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 1
- 102100021010 Nucleolin Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 101800000891 Phallacidin Proteins 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 102000012434 Phosphofructokinase-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010022678 Phosphofructokinase-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102100037392 Phosphoglycerate kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- 229920000776 Poly(Adenosine diphosphate-ribose) polymerase Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 102100027384 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src Human genes 0.000 description 1
- 101710122944 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 102000038012 SFKs Human genes 0.000 description 1
- 108091008118 SFKs Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037330 Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Human genes 0.000 description 1
- ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M Sodium salicylate Chemical compound [Na+].OC1=CC=CC=C1C([O-])=O ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102100030529 Suppressor of cytokine signaling 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100033130 T-box transcription factor T Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000003217 Tetany Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J ToTo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2S1 MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 1
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 102000003970 Vinculin Human genes 0.000 description 1
- 108090000384 Vinculin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 1
- 108091005971 Wild-type GFP Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J YoYo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000387 actin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N alstonine Natural products C1=CC2=C3C=CC=CC3=NC2=C2N1C[C@H]1[C@H](C)OC=C(C(=O)OC)[C@H]1C2 WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000007953 anoxia Effects 0.000 description 1
- 229940044684 anti-microtubule agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- AQLMHYSWFMLWBS-UHFFFAOYSA-N arsenite(1-) Chemical compound O[As](O)[O-] AQLMHYSWFMLWBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 238000011948 assay development Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N bucladesine Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](OC(=O)CCC)[C@@H]2N1C(N=CN=C2NC(=O)CCC)=C2N=C1 CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N 0.000 description 1
- 229960005263 bucladesine Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+) Chemical compound [Cd+2] WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004712 cancer cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000004106 carbohydrate catabolism Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester Chemical compound C=1C(OC(=O)C)=CC=C2C=1OC1=CC(OC(C)=O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 102000013515 cdc42 GTP-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010051348 cdc42 GTP-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 238000002782 cell morphology assay Methods 0.000 description 1
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000035289 cell-matrix adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000003570 cell-matrix junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001783 ceramides Chemical class 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- TUESWZZJYCLFNL-DAFODLJHSA-N chembl1301 Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1\C=C\C1=CC=C(C(N)=N)C=C1O TUESWZZJYCLFNL-DAFODLJHSA-N 0.000 description 1
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 1
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 229940038704 clostridium perfringens Drugs 0.000 description 1
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 1
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 1
- 210000003674 cytoplasmic vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013523 data management Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000012912 drug discovery process Methods 0.000 description 1
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 238000003708 edge detection Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000001159 endocytotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000317 environmental toxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 108010014507 erythroagglutinating phytohemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000632 euchromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 230000006126 farnesylation Effects 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000000198 fluorescence anisotropy Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000023266 generation of precursor metabolites and energy Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- WXPTWWFRTRQTBB-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid;pyrene Chemical compound CCCCCC(O)=O.C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 WXPTWWFRTRQTBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000050156 human MAP2K1 Human genes 0.000 description 1
- 102000050154 human MAP2K2 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229950005911 hydroxystilbamidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical class NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037427 ion transport Effects 0.000 description 1
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 1
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- YAFQFNOUYXZVPZ-UHFFFAOYSA-N liproxstatin-1 Chemical compound ClC1=CC=CC(CNC=2C3(CCNCC3)NC3=CC=CC=C3N=2)=C1 YAFQFNOUYXZVPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(C(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 108010045758 lysosomal proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006679 metabolic signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 235000020938 metabolic status Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000025090 microtubule depolymerization Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- AHEWZZJEDQVLOP-UHFFFAOYSA-N monobromobimane Chemical compound BrCC1=C(C)C(=O)N2N1C(C)=C(C)C2=O AHEWZZJEDQVLOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- VVEKAPJMXBKPAP-UHFFFAOYSA-N n'-[3-(2,4-dinitroanilino)propyl]-n'-methylpropane-1,3-diamine Chemical compound NCCCN(C)CCCNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O VVEKAPJMXBKPAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 239000000712 neurohormone Substances 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004942 nuclear accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 1
- 210000002353 nuclear lamina Anatomy 0.000 description 1
- 210000000299 nuclear matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 description 1
- 108010044762 nucleolin Proteins 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- YEHCICAEULNIGD-MZMPZRCHSA-N pergolide Chemical group C1=CC([C@H]2C[C@@H](CSC)CN([C@@H]2C2)CCC)=C3C2=CNC3=C1 YEHCICAEULNIGD-MZMPZRCHSA-N 0.000 description 1
- 229940088507 permax Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000037050 permeability transition Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- KUBDTFZQCYLLGC-VZORSVKHSA-N phallacidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KUBDTFZQCYLLGC-VZORSVKHSA-N 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000003114 pinocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- YEBIHIICWDDQOL-YBHNRIQQSA-N polyoxin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C(C=O)N)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C(O)=O)=C1 YEBIHIICWDDQOL-YBHNRIQQSA-N 0.000 description 1
- 230000018767 positive regulation of catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 108010087325 profilactin Proteins 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 108091006091 regulatory enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000002165 resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C(C=CC(N)=C2)C2=[O+]C2=C1C=CC(N)=C2 TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700038288 rhodamine-phalloidin Proteins 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001908 sarcoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-YFKPBYRVSA-N sn-glycero-3-phosphoethanolamine Chemical compound NCCO[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)CO JZNWSCPGTDBMEW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101150071892 snb-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229960004025 sodium salicylate Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 108010008054 testis specific phosphoglycerate kinase Proteins 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- XUDZMIGAJMGETI-UHFFFAOYSA-N tetramethylchloromethylrosamine Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(CCl)C=C1 XUDZMIGAJMGETI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- SRVJKTDHMYAMHA-WUXMJOGZSA-N thioacetazone Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(\C=N\NC(N)=S)C=C1 SRVJKTDHMYAMHA-WUXMJOGZSA-N 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000028973 vesicle-mediated transport Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/22—Anxiolytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
- A61P25/34—Tobacco-abuse
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
- G01N33/5079—Mitochondria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Addiction (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychology (AREA)
Abstract
Description
野にある。
、60/123,399(1999年3月8日)、09/352,141(19
99年7月12日)、60/151,797(1999年8月31日)、60/
168,408(1999年12月1日)に対する優先権を主張し、09/43
0,656(1999年10月29日)、1997年2月27に出願された米国
出願S/N 08/810983の一部継続出願である1998年2月27日に
出願された出願番号09/031,271の一部継続出願である1999年9月
17日に出願された09/398,965の一部継続出願である。
に基づくアッセイの開発、このアッセイの有効化、スクリーニングを得るための
アッセイの最適化および自動化、「ヒット」を同定するためのアッセイを用いる
化合物ライブラリの高スループットスクリーニング、ヒット有効化およびヒット
化合物の最適化を含む長い複数工程のプロセスである。このプロセスの結果は、
前臨床および、有効化されれば、結局は臨床試験に至る先導的化合物である。こ
のプロセスにおいては、スクリーニング相はアッセイ開発相から区別され、生き
た生物学的系において化合物の効率をテストすることを含む。
り、創製された薬物あたり数億ドルを消費する。ゲノミックスおよび高スループ
ットスクリーニングの領域における開発の結果、評定の同定およびスクリーニン
グした化合物の容量の領域において能力および効率が増大した。自動DNA配列
決定、PCR適用、位置クローニング、ハイブリッド形成アッセイおよび生物情
報学におけるかなりの進歩は、潜在的薬物標的をコードする遺伝子(および遺伝
子断片)の数を大いに増加させた。しかしながら、薬物スクリーニングについて
の基本的なスキームは依然として同一である。
ノム標的の有効化は、インビボ機能的モデル、組換えタンパク質の機能的分析、
および候補遺伝子の安定な細胞系発現等の、使用される遅い手動方法のため、薬
物発見プロセスにおいてネックとなった。自動配列決定を介して取得された一次
DNA配列データは遺伝子機能の同定を可能としないが、公知の配列データベー
スと比較すると、共通の「モチーフ」および特異的遺伝子相同性についての情報
を提供することができる。減算ハイブリッド形成およびRADE(分別発現の迅
速増幅)等のゲノム方法を用いて、病気状態モデルで上方または下方調節される
遺伝子を同定することができる。しかしながら、同定および有効化は依然として
同一経路を進む。いくつかのプロテオミック方法は逆遺伝学と組み合わせてタン
パク質同定(全体的発現アレイ、2D電気泳動、コンビナトリアルライブラリ)
を用いて注目する候補遺伝子を同定する。無傷cDNAとして単離されたそのよ
うな推定「病気関連配列」またはDASはこれらの方法に対して大きな利点があ
るが、それらは、コードされたタンパク質のタイプ、活性および分布に関するい
ずれの情報も提供する事なく多くのものによって同定される。薬物スクリーニン
グ標的としてのDASのサブセットの選択は「ランダム」であり、このように、
病気とのメカニズム的結合を提供するための機能的データなくして、極端に非効
率的である。従って、生物学的機能を達成するDASを迅速にスクリーニングし
、それにより、薬物発見における標的有効化および候補最適化を改良する新しい
技術を提供する必要がある。
情報取り扱い能力を提供するツールに対する要望がある。生物情報学はDNA配
列決定システムの迅速な発展およびゲノミックスデータベースの進化で花咲いた
。ゲノミックスは潜在的新しい標的の同定で非常に重要な役割を果たし始めてい
る。プロテオミックスは、薬物相互作用を予測するためにタンパク質標的の構造
および機能を関連づけるのに不可欠なものとなった。しかしながら、生物学的複
雑性の次のレベルは細胞である。従って、細胞からの多次元情報を取得し、管理
しサーチする要望がある。第2に、より高いスループットツールに対する要望が
ある。DNA配列決定および高スループット一次スクリーニングにおいてすでに
示されているように、自動化は生産性を改良する鍵である。本発明は、より高い
スループットのツールに対する要望を満足する細胞から複数パラメータ情報を抽
出する自動システムを提供する。また、本発明は、各アッセイで必要な試薬およ
びテスト化合物の容量を減少させつつ、この方法を小型化し、それにより増大し
たスループットを可能とすることを提供する。
ながら、より多い情報、より高いスループットおよび小型化に対する要望は、蛍
光検出の使用に向けてのシフトを引き起こした。蛍光−ベースの試薬は、スルー
プットおよび情報含有量が高いより強力な複数パラメータアッセイを生じさせる
ことができ、より低い容量の試薬およびテスト化合物を必要とする。また、蛍光
は放射能−ベースの方法よりも安全かつ安価である。
ている。レポータ分子としての修飾された緑色蛍光タンパク質(GFP)等の蛍
光タンパク質を生じる細胞の遺伝子工学に関連するかなり膨大な文献がある。野
生型GFPのいくつかの特性はモリス(Morise)ら(Biochemis
try 13(1974)2656−2662頁)およびワード(Ward)ら
(Photochem,Photobiol.31(1980),611−61
5頁)によって開示されている。オワンクラゲ(Aequorea victo
ria)のGFPは395nmにおける励起最大および510nmにおける発光
最大を有し、蛍光活性に外因的因子を要しない。文献に開示されたGFPの使用
は普及しており、細胞下小器官の可視化(リゾット(Rizzuto)ら,Cu
rr.Biology 5(1995),635−642頁)、分泌経路に沿っ
たタンパク質輸送の可視化(ケーサー(Kaether)およびゲルデス(Ge
rdes),FEBS Letters 369(1995),267−271
頁)、植物細胞(フー(Hu)およびチェン(Cheng),FEBS Let
ters 369(1995),331−334頁)およびショウジョウバエ肺
(デービス(Davis)ら,Dev.Biology 170(1995),
726−729頁)における発現のためのツールとして、および注目する別のタ
ンパク質に融合したレポータ分子として(米国特許第5,491,084号)、
遺伝子発現およびタンパク質位置決定(チャルフィー(Chalfie)ら,S
cience 263(1994),12501−12504頁)の研究を含む
。同様に、WO96/23898は、タンパク質キナーゼ活性化部位を有するG
FP構築体を利用することによる細胞内プロセスに影響する生物学的活性物質を
検出する方法に関する。この特許、および本出願で引用した全ての他の特許は参
照してその全体に組み込まれる。
96/09598はGFP様タンパク質の発現を利用する注目する細胞を単離す
るためのシステムを説明する。WO96/27675は植物におけるGFPの発
現を説明する。WO95/21191は、突然変異誘発を検出するための軽質転
換生物で発現された修飾GFPタンパク質を説明する。米国特許第5,401,
629号および第5,436,128号は、細胞表面受容体を発現し、細胞表面
受容体の活性に応答する転写調節要素を含むレポータ遺伝子構築体を含有する組
換え細胞を用いる細胞外シグナルの細胞内変換を検出し、評価するためのアッセ
イおよび組成物を説明する。
成分試薬の平行した取り扱いおよび処理を必要とする。標準的な高スループット
スクリーニング(「HTS」)は、96または384ウェルを備えた標準的なマ
イクロタイタープレート中のウェルのアレイに負荷されたいくつかのインジケー
タ化合物と共に化合物および生物学的試薬の混合物を用いる。各ウェルから測定
されたシグナル(蛍光または発光)、光学密度、または放射能はウェル中の全て
の物質からのシグナルを統合し、ウェル中の全ての分子の総じての集団平均を与
える。
e Applications International Corpora
tion(SAIC))(130 fifth Avenue,Seattle
,WA 98109)はイメージングプレートリーダーを説明する。このシステ
ムはCCDカメラを用いて、96ウェルプレートの全領域をイメージする。この
イメージは解析され、ウェル中のすべての物質につきウェル当たりの全蛍光が計
算される。
).(Sunnyvale,CA)は、標準的な96ウェルプレート中のウェル
の底部のほぼ200ミクロン内で選択的に蛍光を励起するのに低角レーザー走査
照射およびマスクを用いて、細胞単層をイメージする場合のバックグラウンドを
低下させるシステム(FLIPR)を説明する。このシステムはCCDカメラを
用いてプレート底部の全領域をイメージする。このシステムはウェルの底部の細
胞単層に由来するシグナルを測定するが、測定されたシグナルはウェルの領域に
わたって平均化され、従って、細胞の集団の平均的応答の測定であると依然とし
て考えられる。イメージを解析して、細胞−ベースのアッセイにつきウェル当た
りの全蛍光を計算する。FLIPRシステム等の流体送達デバイスを細胞ベース
のスクリーニングシステムに取り込んで、応答を開始させ、次いで、これは、マ
クロ−イメージングシステムを用いて全ウェル集団平均応答として観察される。
時間的−空間的動力学についてのより詳細な情報に対する必要性に対処するため
に、種々の高含有量スクリーニング(「HCS」)が開発されている。高含有量
スクリーニングは、細胞に取り込まれた特異的蛍光−ベースの試薬に由来する多
色蛍光情報の抽出を自動化する(ジュリアノ(Giuliano)およびテーラ
ー(Taylor)(1995),Curr.Op.Cell Biol.7:
4、ジュリアノ(Giuliano)ら(1995)Ann.Rev.Biop
hys.Biomol.Struct.24:405)。空間的、ならびに時間
的動力学を測定することができる光学システムを用いて細胞を分析する(ファー
カス(Farkas)ら(1993)Ann.Rev.Physol.55:7
85、ジュリアノ(Giuliano)ら(1990)In Optical
Microscopy for Biology.B.HermanおよびK.
Jacobson(編),543−557頁、Wiley−Liss,New
York、ハーン(Hahn)ら(1992)Nature 359:736、
ワグナー(Waggoner)ら(1996)フー(Hu)m.Pathol.
27:494)。この概念は、標識された構成要素の活性についての空間的およ
び時間的情報を有する「ウェル」として各細胞を処理することである。
学的および分子的情報はイオン濃度、膜ポテンシャル、特異的移動、酵素活性、
遺伝子発現、ならびに代謝産物、タンパク質、脂質、炭水化物および核酸配列の
存在、量およびパターンを含む(デビアシオ(DeBiasio)ら(1996
)Mol.Biol.Cell.7:1259、ジュリアノ(Guiliano
)ら(1995)Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struc
t.24:405:ヘイム(Heim)およびTsien,(1996)Cur
r.Biol.6:178)。
/または核酸ハイブリッド形成プローブを用いて固定細胞につき、あるいは多色
蛍光インジケータおよび「バイオセンサー」を用いて生細胞につき行うことがで
きる。固定もしくは生細胞スクリーニングの選択は、必要な特異的細胞−ベース
のアッセイに依存する。
式における最初に生きる細胞のアレイは、テストすべき種々の化合物および用量
で処理することができ、次いで、細胞は固定し、特異的試薬で標識し、測定する
ことができるからである。固定後に、細胞の環境の制御は必要でない。空間的情
報が取得されるが、1つの時点におけるのみである。細胞に適用することができ
る数千の抗体、リガンドおよび核酸ハイブリッド形成の利用可能性は、これを、
多くのタイプの細胞−ベースのスクリーニングに対する魅力的アプローチとする
。固定および標識工程は自動化することができ、アッセイの効果的処理を可能と
する。
る生細胞のアレイは時間、ならびに空間にわたってスクリーニングすることがで
きるからである。細胞の環境的制御(温度、湿度および二酸化炭素)が測定の間
に必要である。なぜなら、細胞の生理学的健康が、時間にわたっての複数蛍光測
定で維持されなければならないからである。細胞内での生化学的および分子的活
性の変化を報告することができる蛍光生理学的インジケータおよび「バイオセン
サー」の増大するリストがある(ジュリアノ(Guiliano)ら(1995
)Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24:40
5、ハーン(Hahn)ら(1993)In Fluorescent and
Luminescent Probes for Biological A
ctivity.W.T.Nason(編),349−359頁,Academ
ic Press,San Diego)。
クリーニング双方の発達を進めるのを助けてきた。多色高含有量情報を自動的に
抽出するための装置化の進歩は、最近、HCSを自動ツールに開発するのを可能
とした。テーラー(Taylor)らによる論文(American Scie
ntist 80(1992),322−335頁)は、これらの方法およびそ
れらの適用の多くを説明する。例えば、Proffittら(Cytometr
y 24:204−213(1996))は、種々の組織培養プレート様式、特
に、96−ウェルマイクロタイタープレートウェルにおいて原位置で相対的細胞
数を定量するための半自動蛍光デジタルイメージングシステムを説明する。この
システムは電動段階を設けたエピ蛍光倒立顕微鏡、ビデオカメラ、イメージ増感
剤、およびPC−ビジョンデジタイザーを設けたマイクロコンピュータからなる
。Turbo Pascalソフトウェアは段階を制御し、プレートを走査し、
ウェル当たりの複数のイメージを撮る。このソフトウェアはウェル当たりの全蛍
光を計算し、日キャリブレーションを提供し、種々の組織培養プレート様式につ
き容易に配置を形成する。デジタルイメージの閾値設定および生細胞によって取
られる場合のみ蛍光を発する試薬を用いて、過剰の蛍光試薬を除去することなく
バックグラウンド蛍光を減少させる。
tical Biochemistry 247:210−215、ゴールドマ
ン(Goldman)ら(1995)Experimental Cell R
esearch 221:311−319)および多光子顕微鏡イメージング(
デンク(Denk)ら(1990)Science 248:73、グラトン(
Gratton)ら(1994)Proc.of the Microscop
ical Society of America,154−155頁)もまた
、顕微鏡試料の高分解能イメージを取得するための良く確立された方法である。
これらの光学系の主な利点は、非常に浅い焦点深度であり、これは限定された軸
方向の程度の特徴がバックグラウンドに対して分解されることを可能とする。例
えば、細胞表面の特徴から接着性細胞の内部細胞質特徴を分解するのが可能であ
る。走査多光子イメージングは必要な高光子束を達成するのに非常に短い持続の
パルスレーザー系が必要であるので、蛍光の寿命もまたこれらの系で測定するこ
とができ(ラコウィッツ(Lakowicz)ら(1992)Anal.Bio
chem.202:316−330、Gerrittsenら(1997),J
.of Fluorescence 7:11−15)、異なる検出モードに対
してさらなる能力を提供する。半導体レーザーによるポンプドレーザー等の小さ
くて信頼ができかつ比較的安価なレーザー系が、今日、多光子共焦点顕微鏡がか
なり日常的に適用されるのを可能とするために入手できる。
9),J.Cell.Physiol.141:410、ジュリアノ(Giul
iano),(1996)Cell Motil.Cytoskel.35:2
37))ならびに細胞内に存在する化学および分子情報の高い空間的および時間
的頻度の組合せは、現存の全マイクロタイタープレートリーダーを用いて脂肪の
集団から高含有量情報を抽出するのを不可能とする。個々に分析される細胞を用
いる多色蛍光ベースのスクリーニングでは、高含有量スクリーニングプラットフ
ォームでデザインされたものは現存しない。同様に、特にマイクロタイタープレ
ートで増殖した細胞からHCS分析によって同定される細胞応答を誘導する能力
につき化合物を組織的にスクリーニングする目的で、自動流体送達を細胞のアレ
インに組み合わせる方法現在利用できない。さらに、1つのアッセイで「ヒット
」を同定するための高スループットウェル間測定、続いてのヒットと同定された
ウェルのみの同一プレートについての第2の高含有量細胞間測定を組み合わせる
方法は当該分野では存在しない。
ピュータベースの特徴抽出、データ解析、および自動化と組み合わせることによ
って標的の有効化および候補の最適化を有意に改良し、その結果データ収集の質
およびスピードの増加、サイクル時間の短縮化、および最終的には有用な薬物候
補のより早い評価をもたらす高スループットスクリーニング(HTS)および高
含有量スクリーニング(HCS)を組み合わせるシステム、方法およびスクリー
ニングを提供する。また、本発明は、各アッセイで必要な試薬およびテスト化合
物の容量を減少させつつ、この方法を小型化し、それにより増大したスループッ
トを可能とすることを提供する。
供し、位置のアレイにおける細胞を1以上の試薬で処理し、各位置における多数
の細胞を蛍光光学でイメージングし、光学情報をデジタルデータに転換し、デジ
タルデータを利用して細胞中の蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性お
よび細胞の分布を測定し、次いで、生物学的機能についてテストすべき化合物の
陽性効果、陰性効果、または無効果の項目につきその情報を解釈することを含む
細胞の分析方法に関する。
に影響するものにつき非常に多数の化合物をスクリーニングする目的で細胞中の
蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性を迅速に測定する。位置のアレイ
は、マイクロタイタープレート、または位置のアレイに細胞を有するマイクロプ
レートであるマイクロチップであって良い。好ましい実施形態において、この方
法は受領したデータを取得し、処理し、表示し、保存するためのコンピュータ化
手段を含む。好ましい実施形態において、この特徴に係る特徴に係る方法は、さ
らに、細胞のアレイへの自動流体送達を含む。別の好ましい実施形態において、
同一プレートでの高スループット測定から得られた情報を用いて、プレート上の
細胞位置のサブセットのみについて選択的に高含有量スクリーニングを行う。
移動させ、細胞アレイ上に焦点を合わせるための手段を有するのに適したXY段
階、 ・デジタルカメラ、 ・細胞アレイに励起光を向けるための光学手段および細胞から放出された蛍光
をデジタルカメラに向けるための手段、および ・デジタルカメラからのイメージを受け取るためのデジタルフレームグラバー
、使用者対話のためのディスプレイおよびアッセイ結果のディスプレイ、データ
の保存および検索のためのデジタル保存媒体、結果の制御、取得、処理および表
示のための手段を含み、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取り、それ
を処理するためのコンピュータ手段とを具備する細胞スクリーニングシステムを
提供することである。
を表示するためのコンピュータと操作可能に関連するコンピュータ画面を含む。
別の好ましい実施形態において、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取
り、それを処理するためのコンピュータ手段はこのデータをバイオインフォマテ
ィクスデータベースに保存する。さらなる好ましい実施形態において、この細胞
スクリーニングシステムは、さらに、多くのまたは全てのウェルからのシグナル
を平行して測定するリーダーを含む。別の好ましい実施形態において、細胞スク
リーニングシステムは、さらに、システムの倍率を変化させて、高スループット
および高含有量スクリーニングの間のモードの変化を可能とする機械、光学手段
を含む。別の好ましい実施形態において、この細胞スクリーニングシステムは、
さらに、細胞を生かしておくために必要なレベルにプレートの周囲の温度、CO 2 濃度および湿度を維持するためのチャンバーおよび制御システムを含む。さら
なる好ましい実施形態において、この細胞スクリーニングシステムは共焦点走査
照明および検出システムを利用する。
び活性を規定するための手法を実行させるための指令の組を含有するプログラム
を含む機械読み取り可能保存媒体を提供することである。好ましい実施形態にお
いて、この細胞スクリーニングシステムは、細胞を保持するのに適した段階およ
び段階を移動させるための手段を備えた高倍率蛍光光学系、デジタルカメラ、デ
ジタルカメラからデジタルデータを受け取り、それを処理するための光源、およ
びデジタルカメラからのデジタルデータを受け取り、それを処理するためのコン
ピュータ手段を含む。機械読み取り可能保存媒体の好ましい実施形態は、細胞ス
クリーニングシステムが、図9、11、12、13、14または15に記載され
た手法を実行させるための指令の組を含むプログラムを含む。別の好ましい実施
形態は、細胞スクリーニングシステムが、特異的細胞の構成要素およびプロセス
の分布および活性を検出するための手法を実行させるための指令の組からなるプ
ログラムを含む。最も好ましい実施形態において、細胞プロセスは、限定される
ものではないが、タンパク質の核移動、細胞肥大、アポトーシス、およびタンパ
ク質のプロテアーゼ−誘導移動を含む。
胞形態、微小管構造、アポトーシス、受容体内部化、およびタンパク質のプロテ
アーゼ−誘導移動に影響する化合物を同定するためのスクリーニングを含めた種
々の細胞スクリーニング方法を提供することである。
酸配列、 b.少なくとも1つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第1の核
酸配列に作動可能に連結し、少なくとも1つのプロテアーゼ認識部位をコードす
る第2の核酸配列、および c.少なくとも1つのプロテアーゼ認識部位をコードする第2の核酸配列に作
動可能に連結し、少なくとも1つの反応体標的配列をコードする第3の核酸配列
、 とを具備するプロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸を提供するこ
とである。
することができる組換え発現ベクター、ならびにこの発現ベクターでトアンスフ
ェクトされた遺伝的に修飾された宿主細胞を提供する。
、 b.少なくとも1つのプロテアーゼ認識部位を含む第2のドメイン、および c.少なくとも1つの反応体標的配列を含む第3のドメイン、を含み、ここに
、第1のドメインおよび第3のドメインは第2のドメインによって分離されてい
ることを特徴とする組換えプロテアーゼバイオセンサーを提供する。
のアッセイおよび試薬を含む。この方法は種々のレベルのトキシンの特徴づけを
提供するためのトキシンバイオセンサーの検出器、分類器、識別子のクラスの使
用を含む。
込まれる。
に対して高親和性を有するルミネセンスプローブ。これらのプローブは、「標識
試薬」「環境インジケータ」または「バイオセンサー」として使用される小さな
ルミネセンス分子または蛍光タグ付きマクロ分子いずれかであり得る。
およびバイオセンサーを含めたルミネセンス標識マクロ分子、緑色蛍光タンパク
質およびその突然変異体とで形成されたものを含めたルミネセンスマクロ分子キ
メラ、生理学的応答に関与する細胞抗原と反応するルミネセンス標識一次または
二次抗体、ルミネセンス染料、色素および他の小分子を含む。
細胞ドメインから別のドメインに移動するルミネセンスタグ付きマクロ分子また
は小器官。移動マーカは細胞ドメインのマーカに対する単にレポート位置であり
得るか、あるいはそれらは同様にいくつかの生化学または分子活性を報告する「
バイオセンサー」でもあり得る。
起こる環境の変化を報告するルミネセンスプローブまたは複数プローブからなる
マクロ分子。これらの変化を検知しそれを報告するほうにデザインされたルミネ
センス標識マクロ分子のクラスは「蛍光−タンパク質バイオセンサー」と呼ばれ
てきた。バイオセンサーのタンパク質成分は高度に進化した分子認識部位を提供
する。活性部位に隣接するタンパク質成分に付着した蛍光分子は、環境の変化を
蛍光シグナルに変化させ、これは本発明の細胞スクリーニングシステム等の適当
な時間および空間分解能を持つシステムを用いて検出される。生細胞内の天然タ
ンパク質活性の変調は可逆的であるので、かつ蛍光−タンパク質バイオセンサー
はタンパク質活性の可逆的変化を検知するようにデザインできるので、これらの
バイオセンサーは実質的に再使用可能である。
に、一次DNA配列データ等の標準的な技術、減算ハイブリッド形成およびRA
DE等のゲノム方法、および逆遺伝子学と組み合わせたプロテオミック方法によ
って同定された核酸配列をいう。この用語は、配列が病気状態に関連するに過ぎ
ないということを意味しない。
子事象、ならびに限定されるものではないがアポトーシス、細胞分裂、細胞接着
、移動、エキソサイトーシスおよび細胞間通信を含めた細胞機能に対する薬物の
効果を測定することができる。多色蛍光は複数の標的および細胞プロセスが単一
のスクリーニングでアッセイできることを可能とする。細胞応答の交差−相関は
標的の有効化およびリード最適化に要する価値のある情報を生じるであろう。
イを備えたプレートを保持し、顕微鏡対物レンズとこの位置を整列させるために
プレートを移動させるための手段を有するXY段階、および焦点合わせを行う方
向にプレートを移動させるための手段を有する高倍率蛍光光学系、デジタルカメ
ラ、位置のアレイにおける細胞に励起光を向けるための光学手段および細胞から
放出された蛍光をデジタルカメラに向けるための手段を有する光源、およびデジ
タルカメラからのデジタルデータを受け取りそれを処理するためのコンピュータ
手段、ここに、このコンピュータ手段はこのカメラからのイメージを受け取るた
めのデジタルフレームグラバー、使用者対話のためのディスプレイおよびアッセ
イ結果のディスプレイ、データの保存および検索のためのデジタル保存媒体、お
よび結果の制御、取得、処理および表示のための手段を含む、を含む細胞スクリ
ーニングシステムを提供することである。
して1−100倍の倍率を持つ標準的な対物レンズ、および電源2を備えた白色
光源(例えば、100Wの水銀灯ランプまたは75Wキセノンランプ)を用いる
ツァイス・アキシオバート(Zeiss Axiovert)倒立蛍光顕微鏡等
の倒立蛍光顕微鏡1を用いる。顕微鏡対物レンズ上方にXY方向にプレート4を
移動させるためのXY段階3がある。Z−軸焦点駆動5は焦点合わせのために対
物レンズをZ方向に移動させる。操作レバー6はXYZ方向の段階の手動移動を
提供する。高分解能デジタルカメラ7はプレート上の各ウェルまたは位置からイ
メージを取得する。カメラ電源8、自動コントローラ9および中央処理ユニット
10がある。このPC11はディスプレイ12を提供し、関連するソフトウェア
を有する。プリンタ13はハードコピーレコードの印刷を提供する。
、XY段階3、Z−軸焦点合わせ駆動5、操作レバー6、光源2、および自動コ
ントローラ9を示す。コンピュータ15および顕微鏡16へのケーブルが各々設
けられる。加えて、図2はXY段階3上にXY方向に移動する96ウェルのマイ
クロタイタープレート17を示す。抗原2からの光はPC制御のシャッター18
を通って励起フィルタ20を備えた電動フィルタホイール19へと通過する。こ
の光は、ダイクロイックミラー26および発光フィルタ27を有するフィルタキ
ューブ25に通過する。励起光はこのダイクロイックミラーで反射されてマイク
ロタイタープレート17中のウェルに向かい、蛍光28はダイクロイックミラー
26および発光フィルタ27を通ってデジタルカメラ7へと通過する。
ッターおよび電源31を含有するデジタルカメラ7は顕微鏡アセンブリからの蛍
光28を受け取る。デジタルケーブル30はデジタルシグナルをコンピュータに
まで輸送する。
を直接的に生じさせて、この検体の高分解能イメージを取得するための顕微鏡光
学を使用する。この光学系は通常「広視野」顕微鏡といわれる。当業者であれば
、検体の高分解能イメージは、限定されるものではないが、検体にわたって操作
した照明の焦点を合わせた点または線の標準的な走査共焦点検出(ゴー(Go)
ら,1997,上記)、および多光子走査共焦点顕微鏡(デンク(Denk)ら
,1990,上記)(これらの双方はCCD検出器にて、または光電子増倍管の
アナログ出力の同調デジタル化によってイメージを形成できる)を含めた種々の
他の光学系によって生じさせることができるのを認識できるであろう。
用いて、それらの細胞の特定の特徴を利用するのが必要である。細胞培養の分野
の当業者であれば、いくつかの細胞系は接触阻止され、それらは他の細胞に囲ま
れるようになると増殖を停止することを意味し、他方、他の細胞はそれらの条件
下で継続して増殖し、細胞は文字通り積みあがり、多くの層を形成することを認
識するであろう。そのような細胞系の例はHEK293(ATCC CRL−1
573)系である。多層調製物における単一の細胞層のイメージを取得できる光
学系が、層を形成する蛍光にある細胞系での使用に必要である。広視野顕微鏡の
大視野深度は、多くの層の細胞を通じての投影であるイメージを生じ、層−形成
細胞で極端に困難な細胞下空間分布の解析を行う。別の方法として、共焦点顕微
鏡で達成することができる非常に狭い視野深度(約1ミクロン)は高分解能にて
単一の細胞層の区別を可能とし、細胞下空間分布の測定を単純化する。同様に、
蛍光寿命イメージング等の検出モードが必要な場合には共焦点イメージングが好
ましい。
メージであり、これは上述した他の細胞スクリーニングシステムの実施形態によ
って生じるイメージと同一の様式に変換でき、従って、イメージと正確に同一の
方法で処理できる。この実施形態における全制御、取得および解析は実質的に同
一である。共焦点顕微鏡システムの光学配置は、照明器および検出器を除いて上
述したものに実質的に同一である。共焦点顕微鏡に必要な照明および検出系は、
本発明のもののような標準的な顕微鏡光学系に取り付けられるアクセサリとして
デザインされてきた(ツァイス(Zeiss),ドイツ国)。従って、これらの
別の光学系は上述した体系に容易に取り込むことができる。
65,341に記載された、細胞アレイがマイクロプレート41上のマイクロウ
ェル40にある本発明の別の実施形態を示す。典型的には、このマイクロプレー
トは、86mm×129mmである標準的な96ウェルのマイクロタイタープレ
ートと比較して20mm×30mmである。マイクロプレート上の細胞のより高
い密度のアレイは、高スループットで画素当たり数ミクロンの低分解能にてイメ
ージされることを可能とし、このマイクロプレート上の特定の位置が画素当たり
0.5ミクロン未満の高分解能にてイメージされることを可能とする。これらの
2つの分解能濃度は、この系の全スループットを改良することを助ける。
送達システムとして働く。マイクロプレートチャンバー42中のマイクロプレー
ト41はXYマイクロプレートリーダー43に入れられる。デジタルデータは上
述したように処理される。このマイクロプレートシステムの小さなサイズはスル
ープットを増加させ、試薬容量を最小化し、速くて正確な細胞ベースの分析のた
めの細胞の分布および設置の制御を可能とする。処理されたデータはPC画面1
1上に表示でき、バイオインフォマティクスデータベース44の一部をなす。こ
のデータベースは本発明の方法を通じて得られたデータの保存および検索を可能
とするのみならず、細胞に関する外部データの取得および保存を可能とする。図
5は、ソフトウェアの操作を説明するPCディスプレイである。
ーム上または(ローカルエリアネットワークを介して)電子的に結合した2つの
別々のプラットフォーム上のHCSと直接連結される。デュアルモード光学系と
言われる本発明のこの実施形態は、それをHTSと連結させることによってHC
Sのスループットを増加させる利点を有し、それにより、連結したHTSにおけ
る応答を示すウェルの小さなサブセットについてのみより遅い高分解能データ取
得および分析を要する。
り、多数の化合物をスクリーニングするのに使用されるHTSシステムの成分と
して通常は使用される(ベグス(Beggs)(1997),J.of Bio
molec.Screening 2:71−78、マカフレー(Macaff
rey)ら(1996)J.Biomolec.Screening 1:18
7−190)。
ループット取得が1つのプラットフォームで起こり、高含有量取得が第2のプラ
ットフォームで起こる2つのプラットフォーム構築体を提供することである。(
図6)。処理は各プラットフォームで独立して起こり、結果はネットワークイン
ターフェースを通過し、あるいは単一のコントローラを用いて両プラットフォー
ムからのデータを処理する。
は2光の光学装備、高スループット60および高含有量プラットフォーム65よ
りなり、これはマイクロプレート上のマイクロタイタープレートまたはマイクロ
ウェルアレイ中で培養した細胞から放出された蛍光シグナルを読み取り、電子的
結合64を介して相互に通信する。高スループットプラットフォーム60は全プ
レート中の全てのウェルを平行してまたは迅速系列様式いずれかで分析する。ス
クリーニングの分野の当業者であれば、デュアルモード細胞ベースのスクリーニ
ングシステムに取り込むことができる多くのそのような商業的に入手可能な高ス
ループットリーダーシステムがあることを認識するであろう(Topcount
(パッカード・インスツルメント社(Packard Instruments
),Meriden,CT)、Spectramax,Lumiskan(モレ
キュラー・デバイス社(Molecular Devices),Sunnyv
ale,CA)、Fluoroscan(Labsystems,Beverl
y,MA))。上述した高含有量プラットフォーム65はウェル間を走査し、ウ
ェル内の個々の細胞から収集された高分解能イメージデータを取得し、それを分
析する。
装備を制御し、結果はモニター61に表示される。そのコンピュータのシステム
67に存在するHCSソフトウェアは高含有量装備ソフトウェア65、および任
意のデバイス(例えば、プレートローダー、環境チャンバー、流体ディスペンサ
ー)を制御し、プレートからのデジタルイメージデータを分析し、結果をモニタ
ー66に表示し、取り込まれたデータベースで測定されたデータを管理する。ま
た、2つのシステムは単一のコンピュータを共有し、この場合、全てのデータは
、データを移動するためのローカルエリアネットワークの必要性なくして、その
コンピュータで収集され、処理され、表示される。マイクロタイタープレートは
、当該分野で知られているように、手動により、またはロボットプレート移動デ
バイスによって、高スループットシステムから高含有量システム63に移動され
る(ベグス(Beggs)(1997),上記、マカフレー(Mcaffrey
)(1996),上記)。
を利用する(図7)。それは、2つの別々の光学モジュール、HCSモジュール
203およびHTSモジュール209よりなり、これは、一度に1つのみを用い
てマイクロタイタープレート201からのデータを収集することができるように
、独立してまたは集合的に移動させることができる。マイクロタイタープレート
201は電動X,Y段階に設置され、そこで、それはHTSまたはHCSモード
いずれかでのイメージングのために位置させることができる。後記するHTSデ
ータを収集し、それを分析した後、HTS光学モジュール209を光路から外し
て移動させ、HCS光学モジュール203が所定の位置に移動される。
タ213およびダイクロイックミラー210よりなり、これを用いて、通常の顕
微鏡ランプシステム(図示せず)からの特異的波長のバンドでプレート上の全底
部を照明する。蛍光発光は、センサー215を備えたカメラ216上にイメージ
を形成するレンズ212によってダイクロイックミラー210および発光波長フ
ィルタ211を通じて収集される。
タ207、ダイクロイックミラー204よりなり、これを用いて顕微鏡対物レン
ズ202の裏開口を照明し、それにより、標準的顕微鏡照明システム(図示せず
)からその対物レンズの視野を照明する。蛍光発光は顕微鏡対物レンズ202に
よって収集され、ダイクロイックミラー204および発光波長フィルタ205を
通って通過し、センサー215を備えた同一カメラ216上にイメージを形成す
るチューブレンズ206によって焦点を結ぶ。
胞スクリーニングの方法の生細胞実施形態での使用のための流体送達デバイスを
含む(以下参照)。図8は本発明のシステムで用いる流体送達デバイスを例示す
る。それは単一のモータ駆動によって駆動される12のシリンジポンプ701の
バンクからなる。各シリンジ702は各ウェルへ送達されるべき容量、典型的に
は、1および100μLの間に従ったサイズとされる。各シリンジは柔軟なチュ
ーブ703を介して、標準的なピペット先端705を許容するコネクタの同様の
バンクに付着される。ピペット先端のバンクは駆動システムに付着され、従って
、それは、マイクロタイタープレート706に対して下降および上昇させて各ウ
ェルへ流体を送達することができる。このプレートはX,Y段階に設置され、デ
ータ収集目的で光学系707に対する移動を行う。この設定はピペット先端の1
つの組、または単一のピペット先端のみでさえプレート上の全てのウェルに試薬
を送達するのを可能とする。シリンジポンプのバンクを用いて同時に12のウェ
ルに、または先端のいくつかを除くことによってより少数のウェルに流体を送達
することができる。
こに、この細胞は1以上の蛍光レポータ分子を含有し、細胞を含有する位置の各
々における複数細胞を走査して、細胞中の蛍光レポータ分子からの蛍光シグナル
が得られ、蛍光シグナルをデジタルデータに変換し、次いで、このデジタルデー
タを用いて、細胞内の蛍光レポータ分子の分布、環境または活性を測定すること
を含む細胞の分析方法を提供する。
ングは、細胞および試薬の平行した取り扱いのために細胞のアレイを調製するこ
とを必要とする。9mmピッチの6mm直径のウェルを備えた、86mm×12
9mmである標準的な96ウェルのマイクロタイタープレートは、現行の自動ロ
ーディングおよびロボット取り扱いシステムでの適合性にて使用される。このマ
イクロプレートは典型的には20mm×30mmであり、約500ミクロンのピ
ッチで寸法が100−200ミクロンである細胞位置を備えている。マイクロプ
レートを作成する方法は、参照してその全体に組み込まれる米国特許出願番号0
8/865,341に記載されている。マイクロプレートは、それに細胞が付着
しない材料でパターン化された、それに細胞が接着する材料の共平面層、または
同様にパターン化された材料のエッチングされた三次元表面からなることができ
る。以下の議論の目的では、用語「ウェル」および「マイクロウェル」とは、そ
れに細胞が接着し、その中で細胞がイメージされるいずれかの構築物のアレイに
おける位置をいう。マイクロプレートはウェルの間の空間に流体送達チャネルを
含むことができる。マイクロプレートの同様の様式は、調製の間の試薬、保存お
よび取り扱いの量ならびに走査操作に必要な全移動を最小化することによって、
システムの全効率を増加させる。加えて、マイクロプレートの全領域はより効果
的にイメージすることができ、本明細書中で後に説明するようにマイクロプレー
トリーダーのための第2のモードの操作を可能とする。
ロ分子および小器官の時間的および空間的分布、含有量および活性を測定するの
に使用される継続的に増大する一群の蛍光および蛍光試薬である。これらの試薬
のクラスは、生細胞および固定細胞における分子の分布および量、時間および空
間におけるシグナル変換事象を報告するための環境インジケータ、および生細胞
の標的分子活性を測定するための蛍光タンパク質バイオセンサーを測定する標識
試薬を含む。単一の細胞中でいくつかの試薬を組み合わせるマルチパラメータア
プローチは薬物発見のための強力な新しいツールである。
和性に基づく。特異的成分に対する親和性は、イオン相互作用、共有結合(これ
は、タンパク質ベースの発色団、フルオロフォア、およびルミフォアを含む)、
ならびに疎水性相互作用、電気的ポテンシャル、およびある場合には、細胞成分
内での単純な取得等の物理的力によって支配される。ルミネセンスプローブは、
限定されるものではないが緑色蛍光タンパク質キメラを含めた、小分子、標識さ
れたマクロ分子、または遺伝子工学作成タンパク質であり得る。
NAハイブリダイジングプローブ等の蛍光標識生体分子を含めた、広く種々の蛍
光レポータ分子を本発明で用いることができるのを認識するであろう。同様に、
特異的に結合または会合の特定の化学的特性で合成された蛍光試薬が蛍光レポー
タ分子として使用されてきた(バラク(Barak)ら(1997),J.Bi
ol.Chem.272:27497−27500、サウスウィック(Sout
hwick)ら(1990),Cotometry 11:418−430、T
sien(1989)in Methods in Cell Biology
,Vol.29 テーラー(Tayor)およびワン(Wang)(編),12
7−156頁)。蛍光標識抗体は、細胞または組織としての複合体としての分子
の混合物中の単一分子標的に付着させるためのそれらの高度な特異性のため特に
有用なレポータ分子である。
促進または能動輸送、シグナル配列−媒介輸送、およびエンドサイトーシスまた
はピノサイトーシス摂取を含めたいくつかの非機械的モーデを介して細胞に輸送
することができる。当該分野でよく知られた機械的バルクローディング方法を用
いて、ルミネセンスプローブを生細胞に負荷することもできる(バーバー(Ba
rber)ら(1996),Neuroscience Letters 20
7:17−20、ブライト(Bright)ら(1996),Cytometr
y 24:226−233、McNeil(1989)in Methods
in Cell Biology,Vol.29,テーラー(Tayor)およ
びワン(Wang)(編),153−173頁)。これらの方法はエレクトロポ
レーションおよびスクレイプ−ローディング、ビード−ローディング、インパク
ト−ローディング、シリンジ−ローディング、低張および高張ローディング等の
他の機械的方法を含む。加えて、細胞を遺伝子工学的に作成して、上述した注目
するタンパク質に連結された、GFP等のレポータ分子を発現するようにするこ
とができる(チャルフィー(チャルフィー(Chalfie)およびPrash
er,米国特許第5,491,084号、Cubittら(1995),Tre
nds in Biochemical Science 20:448−45
5)。
高親和性相互作用の結果として、あるいはシグナル配列−媒介輸送等の分子標的
化の他の様式にてそれらの標的において蓄積する。蛍光標識レポータ分子は、レ
ポータの位置、量および化学的環境を測定するのに有用である。例えば、レポー
タが親油性膜中にあるか、またはより水性の環境にあるかは決定することができ
る(ジュリアノ(Guiliano)ら(1995),Ann.Rev.of
Biophysics and Biomolecular Structur
e 24:405−434、ジュリアノ(Guiliano)およびテーラー(
Tayor)(1995),Methods in Neuroscience
27:1−16)。レポータのpH環境は測定することができる(ブライト(
Bright)ら(1988),J.Cell Biology 104:10
19−1033、ジュリアノ(Guiliano)ら(1987),Anal.
Biochem.167:362−371、トーマス(Thomas)ら(19
79),Biochemistry 18:2210−2218)。キレート化
基を有するレポータがCa++等のイオンに結合しているか否かは測定すること
ができる(ブライト(Bright)(1989),In Methods i
n Cell Biology,Vol.30,テーラー(Tayor)および
ワン(Wang)(編),157−192頁、Shimouraら(1988)
,J.of Biochemistry(Tokyo)251:405−410
、Tsiem(1989)In Methods in Cell Biolo
gy,Vol.30,テーラー(Tayor)およびワン(Wang)(編),
127−156頁)。
有することができ、これは他の細胞タイプでは起こり得ない。例えば、上皮細胞
は、しばしば、極性化膜成分を含有する。すなわち、組織細胞は、それらの原形
質膜に沿ってマクロ分子を非対称に分布させる。結合もしくは支持組織は、しば
しば、その細胞型に特異的な分子(例えば、ヘパリン、ヒスタミン、セロトニン
等)がそれに取得される顆粒を含有する。ほとんどの筋肉組織細胞は筋形質小胞
体、その機能が細胞質内のカルシウムイオンの濃度によって調節されるべき特殊
化された小器官を含有する。多くの神経組織細胞は、神経ホルモンまたは神経伝
達物質がそこに取得されている、分泌顆粒および小胞体を含有する。従って、蛍
光分子は、特異的細胞内の特異的成分のみならず、混合された細胞型の集団内の
特異的細胞も標識するようにデザインできる。
、いくつかの蛍光レポータは励起または発光スペクトルの変化を呈し、いくつか
は1つの蛍光レポータが蛍光を失い、他方、第2のものが蛍光の利得を得る共鳴
エネルギー移動を呈し、いくつかは蛍光の喪失(消光)または出現を呈し、他方
、いくつかは合理的移動を報告する(ジュリアノ(Guiliano)ら(19
95),Ann.Rev.of Biophysics and Biomol
.Structure 24:405−434、ジュリアノ(Guiliano
)ら(1995),Methods in Neuroscience 27:
1−16)。
−指向性パラメータ、試料内の蛍光シグナルの分布についての細胞スクリーニン
グシステムによるデータ取得、および対話形式のデータレビューおよび解析を含
む細胞を分析するための好ましい実施形態が提供される。自動走査の開始におい
て、オペレータは、試料を説明する情報100を入力し、フィルタ設定および蛍
光チャネルを測定して、使用される生物学的標識および求められる情報を適合さ
せ、カメラ設定を調整して、試料の明るさを適合させる。ある範囲の試料を取り
扱う柔軟性のためには、ソウトウェアは、核および細胞質を同定するのに使用さ
れる種々のパラメータ設定の選択および異なる蛍光試薬の選択、形態または明る
さに基づく注目する細胞の同定、およびウェル当たりの分析すべき細胞の数の同
定を可能とする。これらのパラメータは、各自動実行につき容易な検索のために
、システムに保存される。このシステムの対話形式細胞同定モードは、分析すべ
き細胞のサイズ、形状および同一性の範囲等の形態学的パラメータの限界の選択
を単純化する。使用者は、プレートのいずれのウェルをシステムが走査するか、
およびいくつの視野およびいくつの細胞を各ウェルで分析すべきかを特定する。
工程101において使用者によって選択された設定に基づいて、システムは、プ
レート102の「焦点を見出す」ためのオートフォーカス手法を用いて走査され
るべきプレートの領域を自動的に予め焦点合わせし、あるいは使用者は、走査さ
れるべき三角形領域を規定する3つの「タグ」点を選択することによって走査領
域を予め焦点合わせする103。次いで、それらのタグ点から最小二乗適合「焦
点面デモル」を計算して、自動走査の間に各ウェルの焦点を評価する。各ウェル
の焦点は、走査の間に焦点面モデルから内挿することによって評価される。
のウェル、それらが取得しつつある各独立した波長のイメージ、およびそれが決
定されつつある各ウェルのイメージを含めた、走査状態を動的に表示する。プレ
ート4(図1)はサーペンタインスタイルで走査される。なぜなら、ソウトウェ
アは、96−ウェルプレートの各ウェル内のウェル間および視野間から電動顕微
鏡XY段階3を自動的に移動させるからである。プログラミングの分野の当業者
であれば、24、48および384ウェルプレート等の他のマイクロプレート様
式の走査のためにソウトウェアをいかにして適合させるかを認識するであろう。
全プレートの走査パターンならびに各ウェル内の視野のパターンがプログラムさ
れる。システムは、Z軸焦点駆動5を介してオートフォーカス手法104(図9
)で試料の焦点を調整し、電動フィルタホイール19を介してフィルタ選択を制
御し、4つの異なる色(「チャネル」または「波長」)からなるイメージを取得
し解析する。
野、次いで各4−5の視野毎に1回、使用者が選択した頻度で呼ばれる。オート
フォーカス手法は、予め計算された面焦点モデルから内挿することによって出発
Z−軸を計算する。この設定点を超えるまたはそれ未満のプログラム可能な距離
で出発し、この手法は、多数の異なる位置を介して機械的Z−軸を指導させ、各
地点でイメージを取得し、各イメージのコントラストを評価する計算された焦点
スコアの最大を見出す。最大焦点スコアを持つイメージのZ位置は、特定の視野
のための最良焦点を決定する。当業者であれば、ハームス(Harms)ら,i
n Cytometry 5(1984),236−243,Gronenら,
in Cytometry 6(1985),81−91,およびファイヤスト
ン(Firestone)ら,in Cytometry 12(1991),
195−206に記載された自動焦点合わせ方法の変形としてこれを認識するで
あろう。
チャネルからの最高品質のイメージを保証する。ソフトウェア手法は、使用者の
オプションにより、いずれかのさらなる測定をなす前に波長間で線状(Xおよび
Y)シフトを説明することによって、波長間の登録シフトを修正するために呼ぶ
ことができる。電子シャッター18は、試料フォト−ブリーチングが最小に保持
されるように制御される。バックグラウンド遮光および不均一な照明は、当該分
野で知られている方法を用いるこのソフトウエアによって修正することができる
(ブライト(Bright)ら(1987),J.Cell Biol.104
:1019−1033)。
される」)一次マーカ105(図9)(典型的には、DAPIまたはPI蛍光色
素で逆染色された細胞核)からイメージが取得される。この適合閾値設定手法1
06を用いてバックグラウンドから細胞を分離するため、イメージの閾値を動的
に選択する。蛍光色素での細胞の染色は、マイクロタイタープレート試料中の細
胞を横切って、並びにマイクロタイタープレートの各ウェル内の細胞の視野のイ
メージ内で未知の程度変化し得る。この変化は、試料の調製および/または細胞
の動的性質の結果として起こり得る。全体的閾値は、バックグラウンドから細胞
を分離し、視野間変化を説明するために、完全なイメージについて計算される。
これらの全体的結合技術は当該分野で記載されているものの変形である。(キト
ラー(Kittler)ら,in Computer Vision,Grap
hics and Image Processing 30(1985),1
25−147,リドラー(Ridler)ら,in IEEE Trans.S
ystems,Man,and Cybernetics(1978),630
−632)。
値決定を利用する。局所領域のイメージ分析は、良好な総じての細分化に導く。
なぜなら、細胞核(ならびに他の標識成分)の染色はイメージを横切って変化し
得る。この全体的/局所的手法を用い、減少した分解能イメージ(2から4の因
子だけサイズが減少)を、(適合閾値設定を用いて)まず全体的に分割して、イ
メージ中の注目する領域を見出す。次いで、これらの領域を、十分な分解能にお
いて同一領域をより十分に分析するためのガイドとして働かせる。次いで、(再
度、適合閾値設定を用いて)注目する各領域につき、より局所化された閾値を計
算する。
イナリーイメージである。当該分野でマスクとも呼ばれるこのバイナリーイメー
ジを用いて、視野が物体107を含有するかを決定する。このマスクを小斑点標
識方法で標識し、それにより、各物体(または小斑点)は、それに帰属されるた
だ1つの数を有する。この小斑点の面積および形状等の形態学的特徴を用いて、
人口物と考えられるものから細胞であるように見える小斑点を区別する。既知の
細胞の形態学的特徴においてタイプ分けすることによって、あるいは対話形式ト
レーニング用途を用いることによって、使用者は形態学的選択基準をあらかじめ
設定する。注目する物体が視野で見出されれば、すべての他の活性はチャネル1
08についてイメージを取得し、そうでなければ、段階を現在のウェル中の次の
視野109に進める。注目する各物体をさらなる分析110のためにイメージ中
に位置させる。その形態学的特徴(サイズおよび形状)を測定することによって
、このソウトウェアは、物体が有効な細胞核111についての基準を満たすかを
決定する。各有効な細胞については、XYZ段階の位置を記録し、細胞の小さな
イメージを保存し、特徴を測定する112。
って、本発明の細胞スクリーニング方法を用いて、細胞試料について多くの異な
るアッセイを行うことができる。1つのそのようなアッセイの例は以下の測定を
提供する: 1.色1−4についての細胞核内の全蛍光強度 2.色1についての細胞核の面積(一次マーカ) 3.色1についての細胞核の形状は: a)周辺の四角の面積 b)ボックスの面積比 c)高さ幅比 によって記載される。
で割る) 5.色2−4について細胞の細胞質の蛍光を表す(細胞質マスク)核の外側の
リングの全蛍光強度(図10参照) 6.細胞質マスクの面積 7.色2−4についての細胞質マスクの平均蛍光強度(すなわち、番号6割る
番号6) 8.色2−4についての細胞核内の平均蛍光強度に対する細胞質マスクの平均
蛍光強度の比率(すなわち、番号7割る番号4) 9.色2−4についての細胞質マスクの平均蛍光強度および細胞核内の平均蛍
光強度の差(すなわち、番号7から番号4を引く) 10.色2−4について、細胞核内の蛍光ドメイン(スポット、ドットまたは
粒とも呼ばれる)の数 特徴1から4は、本発明の異なる細胞スクリーニングアッセイの一般的特徴で
ある。これらの工程は種々のイメージ解析適用で通常用いられ、当該分野でよく
知られている(Russ(1992)Image Processing ハン
(Han)dbook,CRC Press Inc.、Gonzalesら(
1987),Digital Image Processing.Addis
on−Wesley Publishing Co.391−448頁)。特徴
5−9は、細胞の局所細胞質領域内の細胞の蛍光分子および細胞質から核への蛍
光分子の移行(すなわち、移動)の測定を供するために特異的に開発された。こ
れらの特徴(工程5−9)は、各移動の阻害用のマイクロプレートにおいて細胞
を分析するために使用される。例えば、転写因子の核移動の阻害は、無傷細胞を
スクリーニングするための新規なアプローチを提供する(他のタイプのスクリー
ニングの詳細な例は後に提供する)。具体的な方法は、各細胞の核領域における
(特徴4)対局所細胞質領域における(特徴7)プローブの量を測定する。これ
らの2つの細胞下区画間の差異の定量は、多数の細胞質−核移動(特徴9)を提
供する。
ントで用いられるスクリーニングを説明する。例えば、プローブは、染色体−特
異的DNA配列を同定するために商業的に入手可能である(Life Tech
nologies,Gaithersburg,MD、Genosys,Woo
dlands,TX、Biotechnologies,Inc.,Richm
ond,CA、Bio 101,Inc.,Vista,CA)。細胞は性質が
三次元的であり、顕微鏡下で高倍率で調べると、1つのプローブは焦点内に有り
得るが、別のプローブは完全に焦点外となり得る。本発明の細胞スクリーニング
方法は、複数の焦点面からイメージを取得することによって、核中の三次元プロ
ーブの検出を提供する。このソウトウェアは小工程にてZ−軸モータ駆動5(図
1)を移動させ、ここに、広い範囲の異なる核の直径を説明するには、工程距離
は使用者が選択する。焦点工程の各々において、イメージが取得される。各イメ
ージ中の各画素からの最大灰色レベル強度が見出され、得られた最大投影イメー
ジに保存される。次いで、最大投影イメージを用いて、プローブをカウントする
。この方法は、別のものの上方または下方に直接積まれないプローブをカウント
するのによく働く。Z−方向に相互の頂部に積まれたプローブにつきカウントす
るには、使用者は、取得した焦点面の各々においてプローブを分析するというオ
プションを選択することができる。このモードにおいて、走査システムは、上述
した最大面投影方法を行い、このイメージ中の注目するプローブ領域を検出し、
次いで、さらに、すべての焦点面イメージにおいてこれらの領域を分析する。
ずれかの未処理物体があるかをチェックする。いずれかの未処理物体があれば、
それは次の物体110を位置付け、それが有効な細胞核111についての基準を
満たすか否かを決定しその特徴を測定する。一旦現在の視野中の全ての物体が処
理されれば、システムは、現在のプレートの分析が完了したか否かを決定する1
14、完了してなければ、それは現在のウェル115中により多くの細胞を見出
す必要性を判断する。その必要性が存在すれば、システムは現在のウェル109
内の次の視野にXYA段階を進め、あるいは段階をプレートの次のウェル116
に進める。
レビュー、データレビュー、および要約レビュー設備でレビューすることができ
る。走査からの全てのイメージ、データおよび設定は、後のレビューのために、
またはネットワーク情報管理システムとインターフェースするためにシステムの
データベースで検索される。また、データを他の第三者の統計的パッケージに輸
出して、結果を表にし、他の報告を作成することもできる。使用者は、対話形式
イメージレビュー手法117を備えたシステムによって分析された各細胞のイメ
ージ単独をレビューすることができる。使用者は、対話形式グラフ、測定された
特徴のデータスプレッドシート、および対話形式細胞間データレビュー手法11
8での注目する細胞の全ての蛍光チャネルのイメージの組合せを用い、細胞間ベ
ースでデータをレビューすることができる。ヒストグラムおよびばらつきプロッ
ト等の対話形式グラフを介してデータを解析することができるグラフプロッティ
ング能力が提供される。使用者は、対話形式ウェル間データレビュー手法119
でプレートの各ウェル内の全ての細胞について蓄積され、要約される要約データ
をレビューすることができる。グラフおよびイメージのハードコピーは、広い範
囲の標準的なプリンタで印刷することができる。
が作成できる。対話形式レポート作成手法120を用い、プレートの走査された
領域につきウェル間ベースで要約されたデータのグラフレポートを作成すること
ができる。このレポートは、試料についての表およびグラフ様式および同定情報
においてウェルによる統計の要約を含む。レポートウインドゥは、オペレータが
、後の検索のために走査についてコメントを入力することを可能とする。複数の
レポートが多くの統計について作成でき、1つのボタンに触れて印刷することが
できる。印字する前に、配置およびデータにつきレポートをあらかじめレビュー
することができる。
いう単一の高分解能モードで走査される。このHCSモードは、ウェル内、ウェ
ル中の個々の細胞内の物質の分布を規定するための(1μmのオーダーの)ウェ
ル内の十分な空間的分解を提供する。そのモードで接近可能な高度な情報含有量
は、必要なシグナル処理のスピードおよび複雑性を犠牲にして出現する。
ォーム、または(例えば、ローカルエリアネットワークを介して)電子的に結合
された2つの別々のプラットフォームいずれかでHCSに直接連結される。デュ
アルモード光学システムと言われる本発明のこの実施形態は、それをHCSと連
結されることによって、HCSのスループットを増加させる利点を有し、それに
より、連結されたHTSにおける応答を示すウェルの小さなサブセットについて
のみより遅い高分解能データ取得および分析を必要とする。
り、多数の化合物をスクリーニングするのに用いられるHTSシステムの成分と
して通常は使用される(ベグス(Beggs)ら(1997),上記、マカフレ
ー(McCaffrey)ら(1996),上記)。本発明のHTSは、十分な
分解能にてプレート中の多くのまたは全てのウェルを同時に読んで、ウェル間ベ
ースで測定を行うことによって、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェ
ルアレイで行われる。すなわち、各ウェル中の多くのまたは全ての細胞または多
量の物質の全シグナル出力を平均することによって計算がなされる。HTSにお
いていくつかの規定された応答を呈するウェル(「ヒット」)が、このシステム
によって伝えられる。次いで、同一のマイクロタイタープレートまたはマイクロ
ウェルアレイについて、ヒットとして同定された各ウェルは上述したようにHC
Sを介して測定される。このように、デュアルモードプロセスは以下のものを含
む: 1.マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイの多数のウェルの
迅速な測定、 2.ウェル間ベースで蛍光標識レポータ分子の全活性を測定して「ヒット」(
規定された応答を呈するウェル)を同定するためのデータの解釈、 3.各「ヒット」ウェルにおける多数の細胞のイメージング、および 4.個々の細胞中の蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性(すなわち
、細胞内測定)および細胞の分布を測定して、特異的生物学的機能につきテスト
するためのデジタルイメージデータの解釈。
始において、オペレータは、プレートおよびその内容を説明する情報302を入
力し、フィルタ設定および蛍光チャネルを特定して、使用される生物学的標識を
適合させ、求められる情報およびカメラ設定を測定して、試料の明るさを適合さ
せる。これらのパラメータは、各自動ランについての容易な検索のためにシステ
ムのデータベースに保存される。マイクロタイタープレートまたはマイクロウェ
ルアレイは、ロボットーローディングデバイスを制御することによって、手動ま
たは自動にて細胞スクリーニングシステム303にロードされる。任意の環境チ
ャンバー304はこのシステムによって制御されて、マイクロタイタープレート
またはマイクロウェルアレイ中の生細胞を囲う空気中の温度、湿度およびCO2 レベルを維持する。任意の流体送達デバイス305(図8参照)は、走査の間に
流体をウェルに分注するためのシステムによって制御される。
得し分析することによって、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルア
レイでまず行われる。高スループットモード307で行われる処理は図12に示
され、以下に述べる。この高スループットモードにおいていくつかの選択された
強度応答を呈するウェル(「ヒット」)はこのシステムによって同定される。こ
のシステムは、ヒットについてテストする条件付操作308を行う。ヒットが見
出されれば、それらの特異的ヒットウェルは、さらに、高含有量(ミクロレベル
)モード309で分析される。高含有量モード312で行われる処理は図13に
示される。次いで、システムは、プレート上の測定の結果と共に情報化学データ
ベース311を更新する310。分析すべきより多くのプレートがあれば313
、システムは次のプレート303をロードし、そうでなければ、プレートの分析
は終了する314。
の好ましい実施形態、単一プラットフォームデュアルモードのスクリーニングシ
ステムを説明する。当業者であれば、操作的にはデュアルプラットフォームシス
テムは、光学を移動させるよりはむしろ2つの光学系の間でプレートを移動させ
ることを単に含む。一旦システムが設定され、プレートがロードされれば、シス
テムはHTS取得および分析401を開始する。HTS光学モジュールは、デュ
アルモードシステムで電動任意位置決定デバイス402を制御することによって
選択される。1つの蛍光チャネルにおいて、プレート上の一次マーカからのデー
タが取得され403、マスキング手法404を用いてウェルをプレートのバック
グラウンドから単離する。また、使用されるべき他の蛍光チャネルでイメージが
取得される405。各ウェル406に対応する各イメージ中の領域が測定される
407。特定のウェルについての測定から計算された特徴をあらかじめ規定され
た閾値または強度応答408と比較し、結果に基づいて、ウェルを「ヒット」4
09として伝え、または伝えない。ヒットとして伝えられたウェルの位置は、引
き続いての高含有量モード処理のために記録される。処理すべきウェルが残って
いれば410、全てウェルが処理され411、且つシステムが高スループットモ
ードから出るまでプログラムはループバックする406。
を開始させる。このシステムは、電動位置決定システムを制御することによって
HCS光学モジュール502を選択する。高スループットモードでよく同定され
た各「ヒット」では、ウェルのXY段階位置をメモリーまたはディスクから検索
し、次いで、段階を選択された段階位置503まで移動させる。各ヒットウェル
における最初の視野、次いで、各ウェル内の5から8視野ごとに1回、オートフ
ォーカス手法504が求められる。1つのチャネルにおいて、一次マーカ505
(典型的には、DAPI、ヘキスト(Hoechst)またはPI蛍光色素で逆
染色した細胞核)でイメージが取得される。次いで、適合閾値決定手法506を
用いてイメージが分割される(核および非核の領域に分離される)。細分化手法
の出力はバイナリーマスクであり、ここに、物体は白色であって、バックグラウ
ンドは黒色である。当該分野でマスクとも呼ばれるこのバイナリーイメージを用
いて、視野が物体507を含有するかを決定する。マスクを小斑点標識方法で標
識し、それにより、各物体(または小斑点)はそれに帰属されるただ1つの数を
有する。物体が視野で見出されれば、全ての他の活性チャネル508でイメージ
が取得され、そうでなければ、段階は現在のウェル中の次の視野514に進めら
れる。さらなる分析509のために、各物体はイメージ中に位置させる。物体の
面積および形状等の形態学的特徴を用いて、細胞核510であるように見える物
体を選択し、人工物であると考えられるものを捨てる(それをさらに処理しない
)各有効細胞核では、XYZ段階の位置を記録し、細胞の小さなイメージを保存
し、アッセイ特異的特徴を測定する511。次いで、いくつかの分析方法を適用
していくつかの波長の各々で特徴を測定することによって、システムは細胞につ
いて多数のテストを行う。細胞の等張を測定した後、システムは、現在の視野5
12中にいずれかの未処理物体があるかをチェックする。いずれかの未処理物体
があれば、それは次の物体509を位置決定し、それが有効細胞核510につい
ての基準を満たしているか否かを決定し、その特徴を測定する。現在の視野中で
全ての物体を処理した後、システムは、それが現在のウェル513中により多く
の細胞または視野を見出す必要があるか否かを決定する。現在の視野中でより多
くの細胞または視野を見出す必要があれば、それはXYZ段階を現在のウェル5
15内の次の視野に進める。そうでなければ、システムは、それが測定すべきい
ずれかの残りのヒットウェルを有するか否かをチェックする515。そうであれ
ば、それは次のヒットウェル503に進み、取得および分析の別のサイクルを通
じて進め、そうでなければ、HCSモードは終了する516。
る。本発明のすでに記載した実施形態を用いて、時間において特定した時点で細
胞成分の空間的分布を特徴づける(化学的固定の時間)。それ自体、イメージ取
得の順次の性質およびプレート上の全てのウェルを読むのに必要な量のため、こ
れらの実施形態は動的ベースのスクリーニングを実行するための限定された利用
性を有する。例えば、プレートは全てのウェルを読み終えるのに30から60分
要するので、生細胞のプレートを単に調製し、次いで、1回以上全てのウェルを
読み終えることによって、非常にゆっくりとした動的プロセスが測定できるのに
すぎない。より速い動的プロセスは、次のウェルに進む前に各ウェルの複数の読
みを行うことによって測定できるが、最初および最後のウェルの間に経過する時
間はあまりにも長く、速い動的プロセスは最後のウェルに到達する前に完了する
ようである。
てその速度論によって生物学的プロセスを特徴づけるデザインおよびスクリーニ
ングの使用を可能とする。多くの場合、生細胞における応答は、試薬を特異的ウ
ェルに添加し、適当なタイミングでそのウェルについて複数の測定をなすことに
よって測定することができる。従って、本発明のこの動的生細胞実施形態は、ウ
ェルを読む進行において特定の時点に試薬を各ウェルに送達するためのシステム
の個々のウェルへの流体送達用の装置を含む。この実施形態は、それにより、動
的測定が、プレートの各ウェルについて数秒から数分の時間的分解でなすことを
可能とする。動的生細胞システムの全効率を改良するために、取得制御プログラ
ムを修飾して、プレートのサブ領域からの反復的データ収集を可能とし、システ
ムが個々のウェルに必要な時点の間に他のウェルを読むことを可能とする。
それは上述した。この設定は、ピペット先端705の1つの組、または単一のピ
ペット先端でさえ、プレート上の全てのウェルに試薬を送達するのを可能とする
。シリンジポンプ701のバンクを用いて、流体を12のウェルに同時に、また
は先端705のいくつかを取り除くことによってより少数のウェルに流体を送達
することができる。従って、システムの時間的分解は、以下のように、先端およ
び走査パターンの数を変更することによって、データ収集効率を犠牲にすること
なく調整することができる。典型的には、単一ウェルからのデータ収集および分
析は約5秒を要する。ウェル間の移動およびウェル中の焦点合わせは約5秒要し
、従って、ウェルについての全サイクル時間は約10秒である。従って、単一の
ピペット先端を用いて流体を単一のウェルに送達し、データをそのウェルから反
復して収集するならば、測定は約5秒の時間的分解にて行うことができる。6つ
のピペット先端を用いて流体を6つのウェルに同時に送達し、システムが全ての
6つのウェルを反復して走査するならば、各走査は60秒を要し、それにより、
時間的分解を確立する。8分ごとにデータ収集を要するにすぎないより遅いプロ
セスでは、流体送達相の間にプレートを移動させ、次いで、プレートのその半分
を反復して走査することによって、流体をプレートの半分まで送達することがで
きる。従って、プレート上で走査すべきサブ領域のサイズを調整することによっ
て、取得の間に待ち時間を挿入する必要なくして時間的分解を調整することがで
きる。システムは継続してデータを走査し取得することができるので、従って、
プレートからの動的データ組を収集するための全時間は、単に、プレートの単一
走査を行うための時間に必要な時点の数を乗じたものである。典型的には、化合
物の添加前の1時点および添加に続いての2または3時点はスクリーニング目的
で十分なはずである。
ムの配置であり、その多くは標準的なHCS配置と同一である。加えて、オペレ
ータは、サブ領域のサイズ、必要な時点の数、および必要な時間の増分等の、実
行すべき動的分析に特異的な情報802を入力しなければならない。サブ領域は
、動的データを蓄積するために反復して走査それるウェルの群である。サブ領域
のサイズは、単一時間増分の間に全サブ領域を1回走査し、このように、待ち時
間を最小化するように調整される。最適サブ領域サイズは設定パラメータから計
算され、必要であればオペレータが調整する。次いで、システムはプレートを第
1のサブ領域803に、およびそのサブ領域804中の最初のウェルに移動させ
て、予備刺激(時間=0)時点を取得する。各ウェルで行われる取得系列は、動
的モードで実行される特異的HCSで必要はものと正確に同一である。図15は
その処理についてのフローチャートを詳細に示す。開始901および復帰902
の間の工程の全ては、図13中の工程504−514として記載されたものと同
一である。
が処理されたか否か806(図14)をチェックし、全領域が処理されるまで全
てのウェルを通じてサイクルする。次いで、システムはプレートを流体添加のた
めの位置に移動させ、全サブ領域807への流体の流動システム送達を制御する
。これは、プレート上のいくつかの列にわたるサブ領域についての複数添加を必
要とし、システムはX,Y段階上のプレートを添加の間に移動させる。一旦流体
が添加されれば、システムは第1のウェルをサブ領域808まで移動させて、時
点の取得を開始する。データは各ウェル809から取得され、上述したように、
システムはサブ領域810中の全てのウェルを通じてサイクルする。各々がサブ
領域を通った後、システムは、全ての時点が収集されたか否かをチェックし81
1、そうでなければ、必要であれば812休み813、必要な時間増分と同調し
たままとする。そうでなければ、システムはプレート814上のさらなるサブ領
域をチェックし、次のサブ領域803まで移動するか、あるいは終了する815
。このように動的分析モードは、引き続いてのサブ領域中でのデータ取得に先立
ってのサブ領域内でのデータ取得と共に、調べるべき動的応答に基づいて、スク
リーニングすべきマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルのサブ領域の
オペレータによる同定を含む。
びプロセスの分布および活性を規定するための手法を細胞スクリーニングシステ
ムが実行させる指令の組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能保存媒体
を提供することである。好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステ
ムは、細胞を保持するのに適した段階および段階を移動させるための手段、デジ
タルカメラ、デジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するための光源
、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するためのコンピュ
ータ手段を含む。本発明のこの態様は、細胞スクリーニングシステムが、ルミネ
センスプローブ、任意のイメージングシステム、および本発明のパターン認識ソ
フトウェアを用いて、特異的細胞構成要素およびプロセスの分布および活性を規
定するように指令するプログラムを含む。機械読み取り可能保存媒体の好ましい
実施形態は、細胞スクリーニングシステムに図9、11、12、13、14また
は15に記載された手法を実行させるための指令の組からなるプログラムを含む
。別の好ましい実施形態は、細胞スクリーニングシステムら、特異的細胞構成要
素およびプロセスの分布および活性を検出するための手法を実行させるための指
令の組からなるプログラムを含む。最も好ましい実施形態において、細胞プロセ
スは、限定されるものではないが、タンパク質の核移動、細胞形態、アポトーシ
ス、受容体内部化、およびタンパク質のプロアーゼ−誘導移動を含む。
胞プロセスを修飾する化合物を同定する。細胞をテスト化合物と接触させ、特定
の細胞プロセスに対するテスト化合物の効果を分析することができる。別の方法
として、細胞をテスト化合物および特定の細胞プロセスを修飾する既知の剤と接
触させて、テスト化合物が既知の剤の効果を阻害または増強するかを測定するこ
とができる。このように、この特徴に係る方法を用いて、特定の細胞応答を増加
または減少させるテスト化合物を同定し、ならびに特定の細胞応答を増加または
減少させる他の剤の能力に影響するテスト化合物を同定することができる。
胞を含有する位置が分析させ、細胞を含有する位置のサブセットのみが高含有量
モードで分析させて、分析すべき細胞の細胞下区画においてルミネセンス標識受
容体分子からのルミネセンスシグナルが得られる。
定される本発明の範囲を限定されるものと解釈されるべきではない。
、Sigma Chemical(St.Louis,MO)、モレキュラー・
プローブ社(Molecular Probes)(Eugene,OR)、A
ldrich Chemical Company(Milwaukee,WI
)、Accurate Chemical Company(Westbury
,NY)、Jackson Immunolabsおよびクローンテック(Cl
ontech)(Palo Alto,CA)等の入手源から商業的に入手可能
である。
その結果、その因子は核に移動され、そこでそれは特定の遺伝子または複数遺伝
子の転写を開始することができる。転写因子分布のこの変化は、特定の遺伝子ま
たは遺伝子の群の転写を阻害または誘導する化合物を検出する細胞ベースのスク
リーニングシステムのためのスクリーニングの基礎である。スクリーニングの一
般的説明をし、続いて具体的な例を説明する。
特異的フルオロフォアで、および転写因子を特異的蛍光抗体で標識することによ
って測定される。ヘキスト(Hoechst)標識核に自動焦点合わせした後、
細胞ベースのスクリーニングシステムで核のイメージを取得し、それを用いて、
上述したように、いくつかの任意閾値設定方法のうちの1つによってマスクを作
成する。このマスクによって規定される領域の形態学的記述子を使用者規定のパ
ラメータと比較し、有効核マスクを同定し、転写因子分布を抽出するための以下
の方法で用いる。各有効核マスクを腐食させて、わずかにより小さな領域を規定
する。次いで、元の核マスクを2つの方法で膨張させて、核の周りのリング形状
領域を規定し、これは、細胞質領域を表す。これらの2つの領域の各々における
平均抗体蛍光を測定し、これらの平均の間の差異をNucCyt差異として規定
する。核移動を測定するための2つの例を以下で記載し、図10A−図10Jに
示す。図10Aは、青色フルオロフォアで標識したその核200および緑色フル
オロフォアで標識した細胞質201における転写因子を備えた未刺激細胞を示す
。図10Bは細胞ベースのスクリーニングシステムによって誘導された核マスク
202を示す。図10Cは緑色波長でイメージした未刺激細胞の細胞質203を
示す。図10Dは、核マスク202を一旦腐食させて(還元して)、最小細胞質
分布を持つ核サンプリング領域204を規定することを示す。核境界202を数
回膨張(拡大)して、2−3画素の広さであるリングを形成し、これを用いて、
同一細胞につき細胞質サンプリング領域205を規定する。図10Eは、さらに
側面図を示し、これは、核サンプリング領域204および細胞質サンプリング領
域205を示す。これらの2つのサンプリング領域を用い、細胞間ベースで細胞
ベーススクリーニングシステムによって、核移動についてのデータを自動的に分
析することができる。図10F−Jは刺激した細胞における核移動を測定するた
めの戦略を示す。図10Fは、青色フルオロフォアで標識した核206および緑
色フルオロフォアで標識した細胞質207における転写因子を備えた刺激細胞を
示す。図10Gにおける核マスク208は、細胞ベースのスクリーニングシステ
ムによって駆動される。図11は、緑色波長でイメージした刺激細胞の細胞質2
09を示す。図10Iは刺激細胞の核サンプリング領域211および細胞質サン
プリング領域212を示す。図10Iは、さらに、側面図を示し、これは核サン
プリング領域211および細胞質211を示す。
。ヒト細胞系を96ウェルマイクロタイタープレートで平板培養した。ウェルの
いくつかの列をIL−1(MF−KB転写因子の既知の誘導因子)で力価測定し
た。次いで、細胞を固定し、転写因子に対するフルオレセイン標識抗体、および
ヘキスト(Hoechst)33423での標準的な方法によって染色した。細
胞ベースのスクリーニングシステムを用いて、このプレートからのイメージを取
得し分析し、NucCyt差異は、図16に示すように、ウェルに添加されたア
ゴニストの量と強く相関することが見出された。第2の実験において、IL−1
、IL−1RAに対する受容体に対するアンタゴニストをIL−1αの存在下で
力価測定し、IL−1αによって誘導された移動を徐々に阻害した。NucCy
t差異は、図17に示すように、移動のこの阻害を強く相関することが見出され
た。
の細胞密度および試薬濃度にわたって合致する結果を与え、従って、これを日常
的に用いて特異的核移動活性のための化合物ライブラリをスクリーニングするこ
とができるのを示した。さらに、同一方法は、他の転写因子、またはGFP−転
写因子キメラ、あるいは生細胞または固定細胞に導入された蛍光標識転写因子に
対する抗体で用いて、転写因子活性の調節に対する効果につきスクリーニングす
ることができる。
ィスプレイである。グラフ1 180は、核サンプリング領域および細胞質サン
プリング領域における平均抗体蛍光の間の差異、NucCyt差異対ウェル番号
をプロットする。グラフ2 181は、核サンプリング領域における抗体の平均
蛍光、NP1平均、対ウェル番号をプロットする。グラフ3 182は、細胞質
サンプリング領域における平均抗体蛍光、LIP1平均、対ウェル番号をプロッ
トする。ソフトウェアは各細胞からのデータの表示を行わせる。例えば、図18
はスクリーンディスプレイ183、核イメージ184、および細胞番号26につ
いての蛍光抗体イメージ185を示す。
プローブ(蛍光レポータ分子)強度および平均核プローブ(蛍光レポータ分子)
強度の間の差異である。図18のグラフ2 181で言及したNP1平均は、核
サンプリング領域内の細胞質プローブ(蛍光レポータ分子)平均である。図18
のグラフ3 182で言及したL1P1平均は、細胞質サンプリング領域内の平
均プローブ(蛍光レポータ分子)強度である。
る他の転写因子を用いて実施できることを理解するであろう。別の特別の例にお
いて、細胞内のその空間的位置を規定することによって、c−fos転写因子の
活性化を評価した。活性化されたc−fosは核内のみに見出され、他方、不活
化c−fosは細胞質内に存在する。
ル当たり5000−10000細胞で平板培養した。細胞を付着させ、一晩増殖
した。細胞を100μlの無血清培地で2回濯ぎ、無血清MEM培養基中で24
−30時間インキュベートし、次いで、1−50ng/mlの範囲の濃度にて無
血清培地に直接希釈した血小板由来成長因子(PDGF−BB)(シグマ・ケミ
カル社(Sigma Chemical Co.)St.Louis,MO)で
平均20分間刺激した。
ムアルデヒドで20分間細胞を固定した。固定の後、細胞をHBSSで洗浄して
、残存する固定剤を除去し、HBSS中の0.5%トリトンX−100溶液で9
0秒間浸透させ、HBSSで2回洗浄して残存する洗剤を除去した。次いで、H
BSS中のBSAの0.5%溶液で細胞を15分間ブロックし、さらに、希釈さ
れた一次抗体溶液の希釈に先立ってHBSSで洗浄した。
HBSS中に1:50希釈し、50μlの希釈を各ウェルに適用した。室温にて
、一次抗体の存在下で細胞を1時間インキュベートし、次いで、ALEXATM 488(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes))に
コンジュゲートしたヤギ抗−ウサギ二次抗体を含む光密容器中、室温にて1時間
インキュベートし、HBSS中の100μg/mlストックから1:500希釈
した。次いで、ヘキスト(Hoechst) DNA色素(モレキュラー・プロ
ーブ社(Molecular Probes))を製造業者のストック溶液の1
:100希釈にて添加した(10mg/ml)。次いで、細胞をHBSSで洗浄
し、本発明の細胞スクリーニングシステムでの分析に先立ってプレートを密封し
た。これらの実験からのデータは本発明の方法を用いて、細胞内のその空間的位
置を規定することによってc−fosの転写活性化を測定することができるのを
示した。
細胞質から核に移動するいずれの転写因子の分析にも適用できることを当業者は
認識するであろう。そのような転写因子の例は、限定されるものではないが、f
osおよびjunホモログ、NF−KB(B細胞からの核因子κ)、NFAT(
活性化されたT−リンパ球の核因子)、およびSTAT(転写のシグナルトラン
スデューサおよびアクチベータ)因子を含む(例えば、Strehlow,I.
およびSchindler,C.1998.J.Biol.Chem.273:
28049−28056、Chowら,1997 Science.278:1
638−1641、Dingら,1998 J.Biol.Chem.273:
28897−28905、Baldwin,1996.Annu Rev Im
munol.14:649−83、Kuo,C.T.,およびJ.M.Leid
en.1999.Annu Rev Immunol.17:149−87、ラ
オ(Rao)ら,1997.Annu Rev Immunol.15:707
−47、マスダ(Masuda)ら,1998.Cell Signal.10
:599−611、Hoey,T.,およびU.Schindler.1998
.Curr Opin Genet Dev.8:582−7、リュー(Liu
)ら,1998.Curr Opin Immunol.10:271−8参照
)。
処理し、ルミネセンス標識転写因子の分布を、前述した開示のもののような細胞
スクリーニングシステムを用いて空間および時間にて測定する。ルミネセンス標
識転写因子は、テスト化合物と細胞とを接触させる前に、それと共に、またはそ
の後に細胞によって発現され得るか、または細胞に添加することができる。
ネセンス標識タンパク質キメラとして発現することができる。別の方法として、
ルミネセンス標識転写因子を、上述したように発現させ、単離し、インジケータ
細胞にバルク−ロードすることができるか、あるいは転写因子を単離後にルミネ
センス標識することができる。さらなる代替として、転写因子は、インジケータ
細胞によって発現され、これを引き続いて転写因子を検出する抗体等の蛍光標識
と接触させる。
方法を実施するために抗体を用いる指令を含む、転写因子活性化を分析するため
のキットを提供することである。好ましい実施形態において、転写因子−特異的
抗体、転写因子抗体を検出する二次抗体をルミネセンス標識する。さらなる好ま
しい実施形態において、このキットは、注目する転写因子を発現する細胞を含有
し、および/またはこのキットは、限定されるものではないが、共にfos活性
化を修飾する血小板由来成長因子(PDGF)および血清、および共にNF−K
B活性化を修飾するインターロイキン1(IL−1)および腫瘍壊死因子(TN
F)を含めた注目する転写因子の活性化を修飾することが知られている化合物を
含有する。
る注目する転写因子をコードする核酸を含む組換え発現ベクターおよび注目する
細胞において転写因子活性化を修飾する化合物を同定するのに発現ベクターを用
いる指令を含む。別の方法として、このキットは精製されたルミネセンス標識転
写因子を含有する。好ましい実施形態において、転写因子は、限定されるもので
はないが、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、またはその突然変異体もしく
は断片を含めた、蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現される。種々の
好ましい実施形態において、このキットは、さらに、発現ベクターでトランスフ
ェクトされた細胞、注目する転写因子に特異的に結合する抗体または断片、およ
び/または(上述した)注目する転写因子の活性化を修飾することが知られてい
る化合物を含む。
存在し、活性化に際して核に輸送されるか、あるいはリン酸化に際して細胞質か
ら核に移動する基質をリン酸化するいずれのプロテインキナーゼの活性化も分析
することができる。適当なプロテインキナーゼの例は、限定されるものではない
が、細胞外シグナル−調節プロテインキナーゼ(ERK)、c−Junアミノ末
端キナーゼ(JNK)、Fos調節プロテインキナーゼ(FRK)、p38マイ
トジェン活性化プロテインキナーゼ(p38MAPK)、プロテインキナーゼA
(PKA)、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ(MAPK
K)を含む。(例えば、ハル(Hall)ら,1999.J Biol Che
m.274:376−83、ハン(Han)ら,1995.Biochim.B
iophys.Acta.1265:224−227、Jaaroら,1997
.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:3742−37
47、テーラー(Taylor)ら,1994.J.Biol.Chem.26
9:308−318、Zhao,Q.,およびF.S.リー(Lee).199
9.J.Biol Chem.274:8355−8、Paolilloetら
,1999.J Biol Chem.274:6546−52、Cosoら,
1995.Cell 81:1137−1146、Tibbles,L.A.お
よびJ.R.Woodgett.1999.Cell Mol Life Sc
i.55:1230−54、Schaeffer,H.J.およびM.J.We
ber.1999.Mol Cell Biol.19:2435−44参照)
。
よってリン酸化された後、細胞質から核へのルミネセンス標識プロテインキナー
ゼ基質の移動をモニターすることによってアッセイされる。この実施形態におい
て、この基質は非リン酸化されており、リン酸化に先立っては細胞質のものであ
り、プロテインキナーゼによるリン酸化に際して核へ移動する。この実施形態で
は、プロテインキナーゼそれ自体が細胞質から核へ移動するという用件はない。
そのような基質(および対応するプロテインキナーゼ)の例は、限定されるもの
ではないが、c−jun(JNK基質)、fos(FRK基質)、およびp38
(p38MAPK基質)を含む。
で処理し、ルミネセンス標識プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質
の分布は、前述で開示したもののような細胞スクリーニングシステムを用いて空
間および時間において測定される。ルミネセンス標識プロテインキナーゼまたは
プロテインキナーゼ基質は、細胞とテスト化合物とを接触させる前、それと共に
またはその後に細胞によって発現され得るか、または細胞に添加することができ
る。例えば、プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質は、トランスフ
ェクトされたインジケータ細胞によってルミネセンス標識タンパク質キメラとし
て発現され得る。別の方法として、ルミネセンス標識プロテインキナーゼまたは
プロテインキナーゼ基質は、上述したように、発現され、単離され、インジケー
タ細胞にバルク−ロードできるか、あるいはプロテインキナーゼまたはプロテイ
ンキナーゼ基質は単離後にルミネセンス標識することができる。さらなる代替と
して、プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質はインジケータ細胞に
よって発現され、これは引き続いてプロテインキナーゼまたはプロテインキナー
ゼ基質を検出する標識抗体等のルミネセンス標識と接触させる。
基質のリン酸化状態(すなわち:リン酸化されているまたはリン酸化されていな
い)をモニターすることによってアッセイされる。この実施形態において、活性
化に際して、プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質が細胞質から核
へ移動する要件はない。好ましい実施形態において、リン酸化状態は、注目する
プロテインキナーゼ基質のリン酸化形態にのみ結合する抗体と細胞とを接触させ
ることによってモニターされる(例えば、米国特許第5,599,681号に開
示)。
えば、ルミネセンス標識タンパク質またはその断片は、(a)注目するプロテイ
ンキナーゼによって認識されるリン酸化部位、および(b)リン酸化によってマ
スク解除される核局所化シグナルを含有するように作成されたタンパク質に融合
させることができる。このように、そのようなバイオセンサーはリン酸化に際し
て核に移動し、その移動はプロテインキナーゼ活性化の尺度として用いることが
できる。
目するプロテインキナーゼ基質のリン酸化形態に特異的に結合する一次抗体およ
び注目する細胞においてプロテインキナーゼ活性化を修飾する化合物を同定する
一次抗体を用いる指令を含むプロテインキナーゼ活性化を分析するためのキット
を提供することである。好ましい実施形態において、一次抗体、またはこの一次
抗体を検出する二次抗体はルミネセンス標識される。他の好ましい実施形態にお
いて、このキットは、さらに、注目するプロテインキナーゼを発現する細胞、お
よび/または限定されるものではないが、ジブチリルcAMP(修飾されたPK
A)、フォルスコリン(PKA)、およびアニソマイシン(p38MAPK)を
含めた、注目するプロテインキナーゼの活性化を修飾することが知られている化
合物を含む。
目するプロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質をコードする発現ベク
ター、および注目する細胞においてプロテインキナーゼ活性化を修飾する化合物
を同定するために発現ベクターを用いる指令を含む。別の方法として、このキッ
トは、精製されたルミネセンス標識プロテインキナーゼまたはプロテインキナー
ゼ基質を含有する。好ましい実施形態において、注目するプロテインキナーゼま
たはプロテインキナーゼ基質は、蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現
される。さらなる好ましい実施形態において、このキットは、さらに、発現ベク
ターでトランスフェクトされた細胞、注目するプロテインキナーゼまたはプロテ
インキナーゼ基質に特異的に結合する抗体またはその断片、および/または(上
述した)注目するプロテインキナーゼの活性化を修飾することが知られている化
合物を含む。
プロテインキナーゼ活性化の分析につき開示した方法を実行させるための指令の
組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能保存媒体を含み、ここに、細胞
スクリーニングシステムは、細胞を含有するプレートを保持するのに適した段階
を備えた光学系、デジタルカメラ、細胞から放出された蛍光またはルミネセンス
をデジタルカメラに向けるための手段、およびデジタルカメラからのデジタルデ
ータを受領し処理するためのコンピュータ手段を含む。
死およびプログラムされた細胞死滅、細胞移動度、形態形成、チューブ形成、お
よびコロニー形成等の多数の細胞条件に関連する。
バーグラス上で増殖する接着性細胞で明瞭に見ることができる細胞サイズの変化
によって細胞培養で特徴づけることができる。
できる。細胞展延は、基質リガンドへの細胞表面受容体の選択的結合およびシグ
ナリング経路の細胞骨格への引き続いての活性化の結果である。基質分子に対す
る細胞の付着および展延は、癌細胞の転移、炎症反応の間の白血球活性化、創傷
治癒の間のケラチノサイトの移動、および血管形成の間の内皮細胞の移動のため
の重要な工程である。これらの表面受容体、シグナリング経路、または細胞骨格
に影響する化合物は細胞展延に影響し、細胞サイズを測定することによってスク
リーニングすることができる。
マーカ、細胞表面マーカを用いて全細胞体または細胞質を標識することによって
モニターすることができる。そのような標識(多くはモレキュラー・プローブ社
(Molecular Probes)(Eugene,OreGon)および
シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Co.)(St.Lou
is,Missouriから入手可能)の例は以下のものを含む。
る。細胞を生きたまま、または固定後に染色し、細胞面積を測定することができ
る。例えば、DiIC16で染色した生細胞は均一に標識された原形質膜を有し
、細胞の突出した断面積は色素の蛍光強度によってバックグラウンドから均一に
区別される。CMFDA等のサイトゾル染料で染色した生細胞は、細胞の厚みに
比例する蛍光強度を生じる。細胞標識は細胞の薄い領域では薄暗いが、全細胞面
積はバックグラウンドから区別することができる。固定細胞は、重合されたアク
チンを標識するALEXATM488ファロイジン等の細胞骨格マーカで染色す
ることができる。ファロイジンは細胞質を均一に染色しないが、依然として、全
細胞面積をバックグラウンドから区別する。
ト筋細胞を96ウェルプレート中で培養し、種々の化合物で処理し、次いで、固
定し、ヘキスト(Hoechst)等のDNA標識と組み合わせて、細胞表面マ
ーカまたはローダミン−ファロイジン等の細胞骨格のための蛍光マーカに対する
抗体等の、細胞膜または細胞質、または細胞骨格のための蛍光マーカで標識する
。
得し、1つはヘキスト(Hoechst)標識核のイメージであり、1つの蛍光
細胞質イメージである。この核は、閾値設定してマスクを形成させ、次いで、マ
スクの形態学的記述子を使用者規定記述子値の組と比較することによって同定さ
れる。次いで、各非核イメージ(または「細胞質イメージ」)を別々に処理する
。元の細胞質イメージは閾値設定でき、細胞質マスクイメージを生じる。細胞を
含有する局所領域が核のまわりに定義される。次いで、それらの領域における細
胞の制限は、蛍光抗体イメージ中の同一領域に対する局所的動的閾値操作によっ
て規定することができる。腐食および膨張の系列を用いて、わずかに触れる細胞
を分離し、形態学的記述子の第2の組を用いて単細胞を同定する。個々の細胞の
面積を表にして、正常および肥大細胞からのサイズデータとの比較のために細胞
サイズの分布を規定する。
答は上述した方法によって分析され、結果は、このアッセイがウェル間、プレー
ト間、および日間ベースで同一のものを実行することを示した(最大シグナルに
つき15%cov)。このデータは毎日について非常に良好な相関を示し、プレ
ート中のウェル位置による変動はないことを示した。
非ゼロ画素の数である。平均全核面積は凝集体全核面積を核の全数で割ったもの
である。各細胞質イメージでは、いくつかの値を計算することができる。これら
は全細胞質面積であり、これは細胞質マスクにおける非ゼロ画素のカウントであ
る。凝集体細胞質強度は細胞質マスクにおける全ての画素の強度の合計である。
核当たりの細胞質面積は全細胞質面積を全核カウントで割ったものである。核当
たりの細胞質強度は、凝集体細胞質強度を全核カウントで割ったものである。平
均細胞質強度は、凝集体細胞質強度を細胞質面積で割ったものである。細胞質核
比率は、全細胞質面積を全核面積で割ったものである。
抗体を含めることができる。これらのさらなる標識タンパク質のイメージを取得
し、後のレビューのために、このイメージに関して保存して、肥大細胞中のこれ
らのタンパク質の分布および形態の異常を同定することができる。マルチパラメ
ータスクリーニングのこの例は、細胞肥大およびアクチンもしくはミオシン分布
の変化の同時分析を可能とする。
細胞型における肥大または一般的な形態学的変化を分析するのに適用できること
を認識するであろう。
展延はリガンドの濃度に、または受容体−リガンド機能を低下させる化合物の濃
度に比例する。選択的な細胞−基質付着の1つの例は、細胞外マトリックスタン
パク質コラーゲンに対する前立腺癌細胞接着である。前立腺癌細胞はコラーゲン
に対する選択的接着を介して骨に転移する。
C3ヒト前立腺癌細胞を適当な刺激体を含む培地中で培養し、それをコラーゲン
被覆96プレートに継代する。リガンドの濃度は変化させることができ、あるい
は細胞展延の阻害剤をウェルに添加することができる。展延に影響し得る化合物
の例は、インテグリン−またはプロテオグリカン−ブロッキング抗体、ホスファ
チジルイノシトール−3キナーゼ阻害剤を含めたシグナリング阻害剤、およびサ
イトカラシンD等の細胞骨格阻害剤等の受容体アンタゴニストである。2時間後
、細胞を固定し、細胞肥大についてのプロトコルのように、ALEXATM48
8ファロイジン(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probe
s))およびヘキスト(Hoechst)33342で染色する。細胞質染色に
よって測定されたこれらの条件下での細胞のサイズは、バックグラウンドレベル
を超えて区別できる。視野当たりの細胞の数は、ヘキスト(Hoechst)
DNA色素で染色した核の数を測定することによって決定される。細胞当たりの
面積は、細胞質面積(ファロイジンイメージ)を細胞数(ヘキスト(Hoech
st)イメージ)で割ることによって見出される。細胞のサイズはリガンド−受
容体の機能に比例する。この面積はリガンド濃度によって、および細胞の得られ
た結果によって決定されるので、薬物の効力ならびに薬物能力はこの細胞ベース
のアッセイによって決定することができる。他の測定は細胞肥大について上述し
たようになすことができる。
クリーニングで用いることができる。1つの例において、高スループットモード
は蛍光ファロイジン強度の増加につき全ウェルを操作する。閾値は、核(ヘキス
ト(Hoechst)および細胞(ファロイジン)が高含有量モードで測定され
るものを超えるように設定される。別の例において、環境バイオセンサー(その
例は、限定されるものではないが、カルシウムおよびpH変化に感受性のバイオ
センサーを含む)を細胞に添加し、この細胞を化合物と接触させる。細胞を高ス
ループットモードで走査し、バイオセンサーのルミネセンスについての所定の閾
値を超えるウェルを高含有量モードで走査する。
胞骨格を特異的に標識するのに用いることができるルミネセンス化合物、および
この方法に従って細胞形態の変化を誘導または阻害するテスト刺激物を同定する
ために蛍光化合物を用いる指令を含む細胞形態を分析するためのキットを提供す
ることである。好ましい実施形態において、このキットは、さらに、細胞核につ
いての蛍光マーカを含む。さらなる好ましい実施形態において、このキットは、
限定されるものではないが、インテグリン−もしくはプロテオグリカン−ブロッ
キング抗体、ホスファチジルイノシトール−3キナーゼ阻害剤を含めたシグナリ
ング阻害剤、およびサイトカラシンD等の細胞骨格阻害剤を含めた細胞形態を修
飾することが知られている少なくとも1つの化合物を含む。
するための開示方法を実行させるための指令の組を含有するプログラムを含む機
械読み取り可能保存媒体を含み、ここに、この細胞スクリーニングシステムは、
細胞を含有するプレートを保持するのに適合した段階を備えた光学系、デジタル
カメラ、細胞から放出された蛍光またはルミネセンスをデジタルカメラに向ける
ための手段、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するため
のコンピュータ手段を含む。
されるG−プロテイン結合受容体(GPCR)の活性化のためのスクリーニング
である。本実施例は、どのようにして、細胞ベースのスクリーニングのためのデ
ュアルモードシステムにおいて高スループットスクリーニングを高含有量スクリ
ーニングと結合させることができるかを示す。
ラスである。これらの受容体についてのリガンドは細胞中で二次シグナルのカス
ケードを刺激し、これは、限定されるものではないが、Ca++トランジエント
、環状AMP生産、イノシトール三リン酸(IP3)およびリン酸化を含むこと
ができる。数秒から数分に起こる、これらのシグナルの各々は迅速であるが、一
般的でもある。例えば、多くの異なるGPCRは活性化されると二次Ca++シ
グナルを生じる。また、GPCRの刺激の結果、GPCRが、細胞表面膜から内
部の基部側核区画に輸送される。この内部化は、上述した二次シグナルよりも特
定の受容体の活性化のかなりより受容体−特異的なインジケータである。
GPCRと青色蛍光タンパク質(BFP)との安定なキメラを運ぶ細胞には、F
luo−3のアセトキシメチルエステル形態(エステルの加水分解によって生細
胞に取得される細胞浸透性カルシウムインジケータ(緑色蛍光))がロードされ
るであろう。次いで、それらをマイクロタイタープレート601のウェルに沈積
されるであろう。次いで、このウェルを流体送達システムを用いてテスト化合物
のアレイで処理し、全マイクロタイタープレートのFluo−3イメージの短い
系列が取得され、カルシウム応答を提示するウェルを分析する(すなわち、高ス
ループットモード)。このイメージは、図19においてマイクロタイタープレー
ト601の例のように見える。この例におけるウェルC4およびE9等の少数の
ウェルは、受容体の刺激に際して放出されるCa++のためより明るく蛍光を発
するであろう。次いで、応答602を誘導した化合物を含有するウェルの位置を
HCSプログラムに移し、核周辺領域へのGPCR移動の焦点となる青色蛍光の
詳細な細胞間分析のために光学をスイッチする。図19の底部は、高分解能細胞
データの分析の2つの可能な結果を示す。このカメラはウェル領域603のサブ
領域604をイメージし、蛍光細胞605のイメージを生じる。ウェルC4にお
いて、細胞中の蛍光の均一な分布は、受容体が内部化されていないことを示し、
これは観察されたCa++応答が細胞中のいくつかの他のシグナリングシステム
の刺激の結果であったことを意味する。他方、ウェルE9 606中の細胞は、
核周辺領域の受容体の濃度を明瞭に示し、これは受容体の十分な活性化を明瞭に
示す。少数のヒットウェルのみが高分解能で分析される必要があるため、デュア
ルモードシステムの全スループットはかなり高く、高スループットシステム単独
と匹敵する。
上述したように、GPCRの刺激の結果、約15分の時間経過で受容体が内部化
される。内部化されたまたはそうでないとして終点を単に検出するのは、GPC
Rアゴニストまたはアンタゴニストとしての化合物の効力を否定するのに十分で
はないであろう。しかしながら、5分間隔での3時点は、測定の時間経過の間の
効力についての情報を提供するのみならず、このデータのより長時間への外挿を
可能とする。このアッセイを行うには、サブ領域を2つの列として規定し、サン
プリング間隔を5分とし、時点3の全数とする。次いで、2つの列を走査し、次
いで、剤を二列に添加し、時間=0参照を確立することによってシステムを開始
させる。試薬の添加の後に、システムは二列のサブ領域を再び走査し、最初の時
点のデータを取得する。このプロセスはサブ領域の開始までの戻り走査を含めて
約250秒必要とするので、このシステムは第2の時点の取得を開始するのに5
0秒待つであろう。2以上のサイクルが3地点を生じ、システムは第2の二列サ
ブ領域に移動するであろう。最後の2つの二列サブ領域を走査してプレート上の
全てのウェルを終了し、その結果、全プレートにわたって各ウェルについて4時
点が得られる。ウェルについての時点は時間=0に対してわずかに相殺されるが
、時点の間隔は必要な5分に非常に近く、現実の取得時間および結果は固定され
た細胞スクリーニングよりもかなり正確に記録される。
トグルココルチコイド受容体(hGR(細胞の複雑な環境応答機構における単一
「センサー」)は、細胞に拡散したステロイド分子に結合する。リガンド−受容
体複合体は核に移動し、そこで転写活性化が起こる(Htunら,Proc.N
atl.Acad.Sci.93:4845,1996)。
ホルモン受容体は優れた薬物標的である。従って、hGR移動の高含有量スクリ
ーニングはインビトロリガンド−受容体結合アッセイよりも優れた区別された利
点を有する。本発明の細胞スクリーニングシステムにおける蛍光の2以上までの
チャネルの利用性は、スクリーニングが、他の受容体、他の区別される標的また
は他の細胞プロセス等の、2つのさらなるパラメータを平行して含有するのを可
能とする。
FP−hGR)キメラについてのコーディング配列を含有する真核生物発現プラ
スミドは、GFP突然変異体を用いて調製した(Palmら,Nat.Stru
ct.Biol.4:361(1997))。この構築体を用いてヒト頸癌細胞
系(HeLa)をトランスフェクトした。
2)はトリプシン処理し、トランスフェクションに12から24時間先立って、
5%木炭/デキストラン−処理胎児ウシ血清(FBS)(HyClone)およ
び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(C−DMEM)を含有するDMEMを
用いて平板培養し、37℃および5%CO2でインキュベートした。トランスフ
ェクションは、リン酸カルシウム共沈殿によって(GrahamおよびVan
der Eb,Virology 52:456,1973、Sambrook
ら(1989)。Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual,Second編,Cold Spring Harbor
Laboratory Press,Cold Spring Harbor
,1989)によって、またはリポフェクタミン(Life Technolo
gies,Gaithersburg,MD)で行った。リン酸カルシウムトラ
ンスフェクションでは、トランスフェクションに先立って、5%木炭/デキスト
ラン−処理FBSを含有するDMEMで培地を置き換えた。細胞を37℃および
5%CO2にてリン酸カルシウム−DNA沈殿と共に4から5時間インキュベー
トし、DMEMで3から4回洗浄して沈殿を除去し、続いて、C−DMEMを添
加した。
タミントランスフェクションを行った(Life Technologies,
Gaithersburg,MD)。DNA−リポソーム複合体での2から3時
間のインキュベーションに続き、培地を取り出し、C−DMEMで置き換えた。
96−ウェルマイクロタイタープレート中の全てのトランスフェクトされた細胞
を、薬物処理に先立って、33℃および5%CO2にて24時間から48時間イ
ンキュベートした。実験は、HeLa細胞中にて一過的に発現された受容体で行
った。
を得るために、トランスフェクトされた細胞の核を、まず、33℃および5%C
O2にて、C−DMEM中の5μg/mlのヘキスト(Hoechst) 33
342(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes))で
20分間標識した。細胞をハンクスの平衡食塩水(HBSS)中で1回洗浄し、
1%木炭/デキストラン−処理FBSと共にHBSS中の100nMデキサメタ
ゾンを添加した。固定時点デキサメタゾン滴定データを得るために、トランスフ
ェクトされたHeLa細胞をまずDMEMで洗浄し、次いで、1%木炭/デキス
トラン−処理FBSを含有するDMEM中の0から1000nMデキサメタゾン
の存在下で、33℃および5%CO2で1時間インキュベートした。細胞を生き
たまま分析するか、あるいはそれをHBSSで濯ぎ、HBSS中の3.7%ホル
ムアルデヒドで15分間固定し、ヘキスト(Hoechst)33342で染色
し、分析前に洗浄した。細胞内GFP−hGRルミネセンスシグナルはこの固定
手法によっては減少しなかった。
間隔で30分間、生細胞の視野から蛍光イメージ対(GFP−hGRおよびヘキ
スト(Hoechst)33342−標識核)を取得することによって収集した
。同様に、イメージ対は、デキサメタゾンの添加1時間後に、固定された時点の
スクリーニングプレートの各ウェルから得た。両方の場合において、各地点で得
られたイメージ対を用いて、各細胞中の核および細胞質領域を規定した。GFP
−hGRの移動は、核におけるGFP−hGRの積分した蛍光強度を細胞質中の
キメラの積分した蛍光強度で割ることによってあるいはGFP蛍光の核−細胞質
差異として計算した。固定時点スクリーニングにおいて、テストしたデキサメタ
ゾンの核濃度において少なくとも200細胞から得られたデータから計算した。
従って、細胞質から核へのGFP−hGRの薬物−誘導移動は移動比の増加と相
関した。
ら核252への移動を概略的に表示する。この概略図の上方対は、デキサメタゾ
ンでの刺激の前250(A)およびこの刺激の後251(B)の細胞内のGFP
−hGRの局所化を示す。これらの実験条件下で、薬物は細胞質GFP−hGR
の大部分を誘導して、核に移動させる。この再分布は、処理された255および
未処理の254細胞における細胞質および核蛍光の積分強度比率を決定すること
によって定量される。蛍光ミクログラフの下方対は、処理の前254および後2
55における、単一細胞中のGFP−hGRの同定再分布を示す。数100から
数1000の細胞を含有するウェルでHCSを行い、移動は、GFP蛍光を呈す
る視野中で各細胞につき定量した。安定にトランスフェクトされた細胞系の使用
は最も首尾一貫して標識された細胞を生じるが、一過性トランスフェクションに
よって誘導された異なるレベルのGFP−hGR発現は、本発明の細胞スクリー
ニングシステムによる分析に干渉しなかった。
ートの各ウェルを走査し、各々において細胞の集団をイメージし、個々に細胞を
分析する。ここに、2つのチャネルの蛍光を用いて、各細胞内でGFP−hGR
の細胞質および核分布を規定する。図21には、GFP−hGRスクリーニング
の終わり近くにおける細胞スクリーニングシステムのグラフによるユーザインタ
ーフェースが描かれる。ユーザインターフェースは、システムの平行データ収集
および分析能力を示す。「核」261および「GFP−hGR」262と記され
たウインドウは、単一視野で得られ分析した蛍光イメージの対を示す。「色オー
バーレイ」260と記されたウインドウは、このイメージを偽着色し、それらを
一緒にすることによって形成され、従って、使用者は細胞変化を直ちに同定する
ことができる。「保存された物体領域」ウインドウ265内では、各分析された
細胞およびその隣の細胞を検出するイメージが、それが検索されるにつれて提示
される。さらに、HCSデータが収集されるにつれて、それは分析され、GFP
−hGR移動のこの場合には、直後の「ヒット」応答に翻訳される。スクリーン
267の下方ウインドウに描かれた96ウェルプレートは、いずれのウェルが使
用者−規定のスクリーニング基準の組に合致するかを示す。例えば、白色ウェル
269は、薬物−誘導移動が50%の所定の閾値を超えたことを示す。他方、黒
色ウェル270は、テストすべき薬物が10%未満の移動を誘導したことを示す
。灰色ウェル268は、移動値が10%および50%の間にある「ヒット」を示
す。分析すべき96ウェルプレート266上の列「E」は、GFP−hGR移動
を活性化することが知られている薬物であるデキサメタゾンでの滴定を示す。本
実施例のスクリーニングは2つの蛍光チャネルを用いたに過ぎなかった。2つの
さらなるチャネル(チャネル3 263および4 264)は他の特異的標識、
細胞プロセス、または細胞毒性の平行した分析のために複数のパラメータスクリ
ーニングを作成するのに利用できる。
ータベースおよび情報データベースの間にリンクがある。スクリーニングの完了
において、使用者はイメージおよび計算されたデータに全てアクセスできる(図
22)。細胞スクリーニングシステムの包括的なデータ分析パッケージは、使用
者が、複数のレベルにおいてHCSデータを調べるのを可能とする。個々の細胞
についてのスプレッドシート279中のイメージ276および詳細なデータは別
々に見ることができるか、あるいは要約データをプロットすることができる。例
えば、96ウェルプレート中の各細胞についての単一パラメータの計算された結
果はグラフ1 275と記されたパネルに示される。このグラフ中で単一の点を
選択することによって、使用者は、存在するデータベースから要求された特定の
細胞についての全データ組を表示することができる。ここでは、単一細胞(細胞
番号118、灰色線277)からのイメージ対276および詳細な蛍光および形
態データが示される。大きなグラフ挿入278は、GFP−hGRの移動につい
てのデキサメタゾンの濃度の結果を示す。各点は少なくとも200細胞からのデ
ータの平均である。このアッセイにおいてデキサメタゾンについての計算された
EC50は2nMである。
蛍光および形態パラメータを用いる動的測定の能力である。時間および空間測定
は、視野中の細胞の集団内の単一細胞で行うことができる。図23は、単一視野
内のいくつかの細胞におけるGFP−hGRのデキサメタゾン−誘導移動につい
ての動的データを示す。GFP−hGRでトランスフェクトされたヒトHeLa
細胞を100nMデキサメタゾンで処理し、GFP−hGRの移動は単一細胞の
集団で経時的に測定した。グラフは、トランスフェクトされた細胞285、28
6、287および288および非トランスフェクト細胞289の応答を示す。ま
た、これらのデータは、異なる発現レベルでの細胞を分析する能力を示す。
る。このプロセスに対する薬物作用のメカニズムを理解するには、時間および空
間分解にて可能な限り多くのこれらの細胞内事象を測定するのが必須である。従
って、細胞試料調製をほとんど要求しないアポトーシススクリーニングは、いく
つかのアポトーシス−関連パラメータの自動読み出しを提供し、理想的であろう
。細胞スクリーニングシステムのためにデザインされた細胞ベースアッセイは、
パクリタキセル−誘導アポトーシスの形態学的、小器官およびマクロ分子ホール
マークのいくつかを同時に定量するのに用いられてきた。
9、ATCC CCL−1)および高度に侵入的な神経膠細胞腫細胞系(SNB
−19、ATCC CRL−2219)(ウェルチ(Welch)ら,In V
itro Cell.Dev.Biol.31:610,1995)であった。
アポトーシス誘導薬物での処理の前日、3500細胞を96−ウェルプレートの
各ウェルに入れ、湿潤5%CO2雰囲気中37℃にて一晩インキュベートした。
翌日、培養基を各ウェルから取り出し、DMS中で作成された20mMストック
からの種々の濃度のパクリタキセル(0−50μM)を含有する新鮮な培地で置
き換えた。これらの実験で用いたDMSOの最大濃度は0.25%であった。次
いで、細胞を上述したように26時間インキュベートした。パクリタキセル処理
時間の最後において、各ウェルに、750mM Mito Tracker R
ed(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes)、Eu
gene,OR)および3μg/mlのヘキスト(Hoechst)33342
DNA−結合色素(モレキュラー・プローブ社(Molecular Pro
bes))を含有する新鮮な培地を与え、上述したように20分間インキュベー
トした。次いで、プレート上の各ウェルをHBSSで洗浄し、室温にて、HBS
S中の3.7%ホルムアルデヒドで15分間固定した。ホルムアルデヒドをHB
SSで洗浄し、細胞を0.5%(v/v)トリトンX−100で90秒間浸透さ
せ、HBSSで洗浄し、2U ml−1 Bodipy FLファラシジン(モ
レキュラー・プローブ社(Molecular Probes))と共に30分
間インキュベートし、HBSSで洗浄した。次いで、プレート上のウェルに20
0μlのHBSSを満たし、密封し、必要であればプレートを4℃で保存した。
このようにして保存したプレートからの蛍光シグナルは調製後に少なくとも2週
間安定であった。核移動アッセイにおけるように、蛍光試薬を、生細胞高含有量
スクリーニングにこのアッセイを変換するようにデザインすることができる。
細胞内Mito Tracker Red,ヘキスト(Hoechst)333
42およびBodipy FLファラシジンの蛍光強度は、上述したように細胞
スクリーニングシステムで測定した。また、各ウェルから得られたイメージの各
対からの形態データを得て、イメージ視野中の各物体(例えば、細胞および核)
を検出し、そのサイズ、形状および積分強度を計算した。
の各視野については以下の計算を行った:(1)平均核面積(μm2)は、視野
中の全核面積を検出された核の数で割ることによって計算した。(2)平均核周
囲(μm)は、視野中の全ての核の周囲の合計をその視野で検出された核の数で
割ることによって計算した。高度に複雑なアポトーシス核は最大の核周囲値を有
した。(3)平均核明るさは、核の全視野の積分強度をその視野における核の数
で割ることによって計算した。核明るさの増加は増大したDNA含有量に相関し
た。(4)平均細胞明るさは、Mito Tracker色素で染色した細胞の
全視野の積分強度をその視野中の核の数で割ることによって計算した。ミトコン
ドリア内に蓄積されるMito Tracker色素の量はミトコンドリアポテ
ンシャルに比例するので、平均細胞明るさの増加はミトコンドリアポテンシャル
の増加と合致する。(5)平均細胞明るさは、Bodipy FLファラシジン
色素で染色した細胞の全視野の積分強度をその視野中の核の数で割ることによっ
て計算した。ファロトキシンは高い親和性を持ってアクチンの重合形態に結合す
るので、細胞内に蓄積するBodipy FLファラシジン色素の量はアクチン
重合状態に比例する。平均細胞明るさの増加はアクチン重合の増加と合致する。
導された変化を示す。増大させる量のパクリタキセルは核を拡大させ、断片化さ
せた293(アポトーシスのホールマーク)。細胞スクリーニングシステムによ
って得られたこれらのおよび他のイメージの定量分析は同一図面に提示する。測
定された各パラメータは、L−929細胞296がSNB−19細胞297より
も低濃度のパクリタキセルに対して感受性が低かったことを示した。しかし、よ
り高い濃度では、L−929細胞は測定された各パラメータにつき応答を示した
。このアッセイのマルチパラメータアプローチは、薬物作用のメカニズムを解剖
するのに有用である。例えば、核298の面積、明るさおよび断片化、ならびに
アクチン重合値294は、SNB−10細胞を10nMのパクリタキセルで処理
した場合に最大値に到達した(図24、頂部および底部グラフ)。しかしながら
、ミトコンドリアポテンシャル295は、パクリタキセルの同一濃度で最小であ
った(図24、中央グラフ)。測定された全てのパラメータは、増大するパクリ
タキセル濃度(>10nM)で対照レベルに到達したという事実は、SNB−1
0細胞が、薬物の十分に高いレベルで補償的である低親和性薬物代謝またはクリ
アランス経路を有することを示唆する。SNB−19細胞297の薬物感受性と
対照させると、L−929はパクリタキセル296に対して異なる応答を示した
。これらの繊維芽細胞は、5μMのパクリタキセル(SNB−19細胞よりも5
00倍高い用量)にて多くのパラメータで最大応答を示した。さらに、L−92
9細胞は、テストしたパクリタキセル濃度のいずれにおいてもミトコンドリアポ
テンシャル295の鋭い減少は示さなかった。この結果は、正常および癌細胞系
の間の唯一のアポトーシス経路の存在と合致する。従って、これらの結果は、比
較的単純な蛍光標識プロトコルを本発明の細胞スクリーニングシステムと連結さ
せて、プログラムされた細胞の死滅と関与する鍵となる事象の高含有量スクリー
ニングを得ることができることを示す。
胞および小器官の分解および再パッケージング、ヌクレオソームサイズの断片へ
のDNAの切断、および炎症応答を回避する断片化細胞の巻き込みを含む同一の
アポトーシス形態がもたらされるという発見であった。従って、アポトーシスは
、細胞に対する急性外傷によって媒介され、その結果、潜在的に毒性および抗原
性細胞成分が細胞媒体にこぼれ、炎症応答に至る壊死とは区別される。
Wyllie)ら,1980,Int Rev Cytol.68:251−3
06、Thompson,1995,Science.267:1456−62
、Majnoおよびヨリス(Joris),1995,Am J Pathol
.146:3−15、アレン(Allen)ら,1998,Cell Mol
Life Sci.54:427−45)は、細胞の外観の区別される形態学的
変化、ならびに生化学および分子マーカの変化を含む。例えば、アポトーシス細
胞は、しばしば、細胞質膜ブレッビングを受け、それらの染色体は迅速に凝縮し
、核周囲の回りに凝集し、核断片および小さなアポトーシス体が形成される。全
てではないが多くのアポトーシス細胞では、クロマチンはDNAを切断する特異
的ヌクレアーゼに対する標的となる。
化)およびDNAの段階的断片化が伴い、結局は200塩基対のモノ−および/
またはオリゴマー断片が形成される。ミトコンドリア膜ポテンシャル等の小器官
機能の特異的変化が起こる。加えて、特異的アスパラギン酸残基後のタンパク質
切断によってタンパク質分解の高度に選択的なパターンを触媒する特異的システ
インプロテアーゼ(カスパーゼ)が活性化される。加えて、ホスファチジルセリ
ン残基(通常は、内部膜リーフレット上にある)の外部表面暴露は、膜が破壊さ
れ、サイトゾルまたは小器官が細胞内空間にこぼれ、炎症反応を惹起する前に、
アポトーシス細胞の認識および排除を可能とする。さらに、アポトーシスを受け
つつある細胞は、減少した細胞内カリウムレベルも有しつつ、収縮する傾向にあ
る。
誘導因子の間で非常に似ている。しかしながら、この経路の詳細は、現実には細
胞型および誘導因子に応じてかなり変化する。アポトーシスに関与する種々のシ
グナル変換経路の依存性および独立性は、現在、盛んな研究のトピックスである
。我々は、ここに、この経路が特異的細胞型における誘導因子の用量に依存して
変化することを示す。
または凝縮を呈する((Majonoおよびヨリス(Joris),1995)
、(Earnshaw,1995))。所与の細胞型における応答は、アポトー
シス誘導因子に依存して変化するように見える。核断片化の間に、円形または長
円形の核は徐々に耳たぶ状になる。結局は、核は多数のサブ核に劇的に断片化す
る。時々、耳たぶ状の核内のクロマチンの密度は分布の空間的変化を示し得るが
(ヘテロクロマチン化)、核凝集で見られる縁形成に近づく。
Saunders)ら,1997.Int J Cancer.70:214−
20)。凝縮はユウクロマチン、核マトリックスおよび核ラミナの構造的一体性
の喪失の結果として生起するのである(Hendzelら,1998.J Bi
ol Chem.273:24470−8)。核凝縮の間、クロマチンは核の縁
近くで凝縮し、核の全体的収縮に至る。このように、アポトーシスの尺度として
の核形態の使用は凝縮および断片化を共に考慮しなければならない。
トに平板培養した。翌日、アポトーシス誘導因子を示された濃度にて添加し、細
胞を示された時間(通常、16から30時間)インキュベートした。翌日、培地
を除去し、細胞を新鮮な培地中の5μg/ml ヘキスト(Hoechst)(
モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))
で染色し、37℃にて30分間インキュベートした。細胞をハンクスの平衡食塩
水(HBSS)中で洗浄し、室温にてHBSS中の3.7%ホルムアルデヒドで
固定した。細胞を室温にてHBSSで2回洗浄し、プレートを密封した。
イズを測定し、(2)周囲の複雑性の程度を測定することによって達成された。
サイズパラメータは核凝縮のより感受性な尺度を提供し、他方、周囲尺度は各断
片化のより感受性の尺度を提供する。
)およびパクリタキセル(30時間)双方に対して応答した(図25Aおよび2
5B)。BHK細胞はわずかにより複雑であるが明瞭に見える応答を示した。ス
タウロスポリンはより低い用量で核凝縮を刺激し、より高い用量で核断片化を刺
激するように見えた(図25Cおよび25D)。対照的に、パクリタキセルは、
濃度を増加させていくと、核断片化の合致した増加を誘導した。MCF−7細胞
の応答は、アポトーシス誘導因子に依存して劇的に変化した。スタウロスポリン
は核凝縮を誘導するようにみえ、他方、パクリタキセルは核断片化を誘導した(
図25Eおよび25F)。
片化に先立つ核の膨潤があるようである。
量依存的に観察され、これは、このアッセイがアポトーシスの核特徴の変化を検
出するのに有用であることを示す。
格の変化を評価した。これは、蛍光ファロイジン標識で検出したf−アクチン含
有量の初期増加、f−アクチンの特異的染色の予備的観察に基づくことであった
(我々の未公表データ、Leveeら,1996,Am J Physiol.
271:C1981−92、Maekawaら,1996,Clin Exp
Immunol.105:389−96)。アポトーシスの間のアクチン細胞骨
格の変化は全ての細胞型で観察されなかった(Endresenら,1995.
Cytometry.20:162−71,van Engelandら,19
97,Exp Cell Res.235:421−30)。
トに平板培養した。翌日、アポトーシス誘導因子を示された濃度にて添加した。
細胞を示された時間(通常、16−30時間)インキュベートした。翌日、培地
を取り除き、細胞を、新鮮な培地中の5μg/mlのヘキスト(Hoechst
)(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.
))で染色し、30℃にて30分間インキュベートした。細胞をHBSS中で洗
浄し、室温にてHBSS中の3.7%ホルムアルデヒドで固定した。プレートを
HBSSで洗浄し、室温にてHBSS中の0.5%v/vトリトンX−10で浸
透させた。プレートをHBSS中で洗浄し、100μlの1U/mlのAlex
a488ファロイジンストック(100μl/ウェル,モレキュラー・プローブ
社(Molecular Probes),Inc)で染色した。細胞を室温に
てHBSSで2回洗浄し、プレートを密封した。
ことによって達成された。これは、強度の十分な細胞質平均の理想的な近似であ
ると判断された。この細胞質測定を近似するのに用いるマスクは、ヘキスト(H
oechst)染色によって規定された核マスクに由来した。誘導は、腐食およ
び膨張の組合せによって達成された。
化した(図27)。スタウロスポリン(30時間)はL929(図27A)およ
びBHK(図27B)細胞においてf−アクチンの増加を誘導した。MCF−7
細胞は濃度−依存的応答を呈した。低濃度(図27E)では、f−アクチン含有
量の減少があるようであった。より高い濃度では、f−アクチン含有量は増加し
た。パクリタキセル(30時間)処理は、広く種々の応答に至った。L929細
胞はf−アクチンの漸次の増加に応答し(図27B)、他方、BHKおよびMC
F−7応答は共に高度に変化した(各々、図27Bおよび27D)。
、濃度依存的応答を呈することが判明した。ある種の細胞系/アポトーシス誘導
因子対では、これは統計的に有意なアポトーシスインジケータとなり得た。
tおよびGrinstein,1996,J Exp Med.183:129
3−5)。ミトコンドリアは外方膜を通じてアポトーシス性因子を放出し、内方
膜の電気化学勾配を消失させる。これはミトコンドリア浸透性転移(MPT)の
形成を介して起こると考えられるが、それは全ての場合に当てはまるのではない
ようである。MPTの形成の明白な発現はミトコンドリア膜ポテンシャルの崩壊
である。抗−アポトーシスタンパク質Bcl−2の薬理学的介入またはミトコン
ドリア発現によるMPTの阻害は細胞死滅を妨げ、これは、MPTの形成は死滅
プロセスの律速事象であり得ることを示唆する(レビューについては:クレーマ
ー(Kroemer)ら,1998,Annu Rev Physiol.60
:619−42参照)。また、アポトーシスの刺激の間にミトコンドリアが増殖
できることも観察された(マンシーニ(Mancini)ら,1997,J C
ell Biol.138:449−69、Camilleri−Broetら
,1998,Exp Cell Res.239:277−92)。
ローチは、ミトコンドリア膜ポテンシャルを測定することである。利用できる方
法のうち、最も簡単な測定は、膜ポテンシャルに基づく細胞内小器官内で分布す
るカチオン色素の再分布である。そのようなアプローチは、伝統的には、測定に
生細胞を必要とする。Mito Tracker色素の最近の導入(ポート(P
oot)ら,1997,Cytometry.27:358−64、モレキュラ
ー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.),Orego
nから入手可能)は、固定後にミトコンドリア膜ポテンシャルを測定する手段を
提供する。
ば、ミトコンドリアを標識する色素の量は膜ポテンシャルおよびミトコンドリア
の数の双方に関連する。ミトコンドリアの数は一定であれば、色素の量は膜ポテ
ンシャルに直接関連する。ミトコンドリアの数が一定でなければ、シグナルは質
量の増加によって支配されるようである(Reipertら,1995,Exp
Cell Res.221:281−8)。
能とするプローブが入手できる。ミトコンドリア質量はMitotracker
Green FM(ポート(Poot)およびピアース(Pierce),1
999,Cytometry.35:311−7、モレキュラー・プローブ社(
Molecular Probes,Inc.),Oregonから入手可能)
で標識することによって直接測定される。この標識はミトコンドリア膜ポテンシ
ャルと独立しているが、ミトコンドリア質量に比例する。また、これはミトコン
ドリア質量に関して各細胞における他のミトコンドリア測定を正規化する手段を
提供する。
トに平板培養した。翌日、アポトーシス誘導因子を示した濃度で添加し、細胞を
示された時間(通常、16−30時間)インキュベートした。細胞を、新鮮な培
地中の5μg/mlのヘキスト(Hoechst)(モレキュラー・プローブ社
(Molecular Probes,Inc.))および750nM Mit
otracker Red(CMXRos,モレキュラー・プローブ社(Mol
ecular Probes,Inc.))で染色し、37℃にて30分間イン
キュベートした。細胞をHBSS中で洗浄し、室温にてHBSS中の3.7%ホ
ルムアルデヒドで固定した。プレートをHBSSで洗浄し、室温にて、HBSS
中の0.5%v/vトリトンX−100で浸透させた。細胞を室温にてHBSS
で2回洗浄し、プレートを密封した。ミトコンドリアのデュアル標識では、細胞
を200nM Mitotracker Greenおよび200nMのMit
otracker Redで固定前に0.5時間処理した。
に応じて種々のミトコンドリア変化に至った。L929は、増大するスタウロス
ポリン濃度でミトコンドリア質量の明瞭な増加を呈した(図28)。BHK細胞
は、低濃度のスタウロスポリンにて膜ポテンシャルの減少、または高濃度のスタ
ウロスポリンにて質量の増加を呈した(図28C)。MCF−7細胞は、増大す
る濃度のスタウロスポリンに応答してミトコンドリア膜ポテンシャルの終始一貫
した減少によって応答した(図28E)。増大する濃度のパクリタキセルは、ミ
トコンドリア質量の終始一貫した増加を引き起こした(図28B、28Dおよび
28F)。
Green FMおよびMitotracker Red(モレキュラー・プ
ローブ社(Molecular Probes,Inc))双方で標識すること
によって測定される。Mitotracker Red標識は質量および膜ポテ
ンシャル双方に比例する。Mitotracker Green FM標識は質
量に比例する。Mitotracker Green FMシグナルに対するM
itotracker Redシグナルの比率は、ミトコンドリア膜ポテンシャ
ルの尺度を提供する(ポート(Poot)およびピアース(Pierce)),
1999)。この比率はMitotracker Redシグナルに関してミト
コンドリア質量を正規化する(図28参照)。ミトコンドリア質量に対して正規
化する能力を膜ポテンシャルの尺度と組み合わせると、両方のパラメータの独立
した評価を可能とする。
よび誘導因子に依存して観察された。用量依存的相関は、これが有望なアポトー
シスインジケータであることを示す。
数尺度を組み合わせることが可能である。事実、前述で示した核形態/f−アク
チン含有量/ミトコンドリア質量/ミトコンドリアポテンシャルデータの全ては
マルチパラメータアッセイとして収集されたが、明瞭性のため個々に提示された
。
のプロテアーゼ誘導移動 プラスミド構築体。緑色タンパク質−カスパーゼ(Cohen(1997),
Biochemical J.326:1−16、梁(Liang)ら(199
7),J.of Molec.Biol.274:291−302)キメラにつ
いてのコーディング配列を含有する真核生物発現プラスミドは、GFP突然変異
体を用いて調製される。この構築体を用いて真核生物細胞をトランスフェクトす
る。
し、37℃および5%CO2でインキュベートした。トランスフェクションは、
限定されるものではないが、リン酸カルシウム共沈殿またはリポフェクションを
含めた方法によって行われる。細胞を、37℃および5%CO2にて、リン酸カ
ルシウム−DNA沈殿と共に4から5時間インキュベートし、DMEMで3から
4回洗浄して沈殿を除去し、続いてC−DMEMを添加する。リポフェクタミン
トランスフェクションは、製造業者の指示に従って抗生物質を含まない無血清D
MEM中で行う。DNA−リポソーム複合体との2から3時間のインキュベーシ
ョンに続き、培地を除去し、c−DMEMで置き換えた。
ータを得るには、トランスフェクトされた細胞の核を、37℃および5%CO2 にて、C−DMEM中の5μg/mlのヘキスト(Hoechst)33342
(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes))でまず2
0分間標識する。細胞をハンクスの平衡食塩水(HBSS)中で1回洗浄し、続
いて、アポトーシスを誘導する化合物を添加する。これらの化合物は、限定され
るものではないが、パクリタキセル、スタウロスポリン、セラミドおよび腫瘍壊
死因子を含む。固定時点滴定データを得るには、トランスフェクトされた細胞を
まずDMEMで洗浄し、DMEM中の0から1000nMの化合物の存在下37
℃および5%CO2にて1時間インキュベートする。細胞を生きたまま分析する
か、あるいはそれをHBSSですすぎ、HBSS中の3.7%ホルムアルデヒド
で15分間固定し、ヘキスト(Hoechst)33342で染色し、分析前に
洗浄する。
隔にて生細胞の視野から蛍光イメージ対(カスパーゼ−GFPおよびヘキスト(
Hoechst)33342−標識核)を取得することによって収集する。同様
に、イメージ対は、化合物の添加から1時間後に固定された時点のスクリーニン
グプレートの各ウェルから得られる。両方の場合、各時点で得られたイメージ対
を用いて、各細胞中の核および細胞質領域を規定する。カスパーゼ−GFPの移
動は、核中のカスパーゼ−GFPの積分蛍光強度を細胞質中のキメラの積分蛍光
強度で割ることによって、あるいはGFP蛍光の核−細胞質差異として計算され
る。固定時点スクリーニングにおいては、この移動比率は、テストした各濃度の
化合物にて少なくとも200細胞から得られたデータから計算される。細胞質か
ら核へのカスパーゼ−GFPの薬物−誘導移動は、従って、移動比率の増加に相
関する。限定されるものではないが、アポトーシス−活性化酵素の推定アクチベ
ータまたはインヒビターを含むものを含めた分子相互作用ライブラリを用いて、
インジケータ細胞系をスクリーニングし、DASに対する特異的リガンド、およ
び化合物活性によって活性化された経路を同定する。
るには材料および/または情報の2つの源が必要である。まず、哺乳動物細胞へ
のトランスフェクションに適したcDNA配列を含有する病気関連配列バンクを
用いることができる。各RADEまたは異なる発現実験は数100の配列を生成
するので、DASの豊富な供給を得るのが可能である。第2に、限定されるもの
ではないが、シグナル配列、7つの膜貫通モチーフ、保存されたプロテアーゼ活
性部位ドメイン、または他の同定可能なモチーフを含有するものを含めた、一次
配列データベースサーチからの情報を用いてDASを広いカテゴリーに入れるこ
とができる。これらの源から取得された情報に基づいて、方法タイプおよびトラ
ンスフェクトすべきインジケータ細胞系を選択する。多数のモチーフがすでによ
く特徴づけられており、現存するゲノムデータベース中の多数の遺伝子内に含有
された線状配列にコードされている。
物学的プロセスを選択するための基礎として用いる(例えば、細胞周期変調、ア
ポトーシス、転移プロテアーゼ等については腫瘍系からのDAS参照)。
グナル配列、7−膜貫通ドメイン、保存されたプロテアーゼ活性部位ドメイン等
)。この最初のグループ分けは、上述したように、蛍光タグ付け戦略、宿主細胞
系、インジケータ細胞系、およびスクリーニングすべき生物活性分子のバンクを
決定するであろう)。
クターにDASを連結する。一般化された発現ベクターは、一過性発現のために
細胞に標的配列を送達するプロモータ、エンハンサーおよびターミネータを含有
する。そのようなベクターは、宿主によって発現された場合に検出を容易にする
ために、抗体タグ付け配列、直接的会合配列、GFP等の発色団融合配列等を含
有することもできる。
ポリカチオン媒介、ウイルス媒介、またはエレクトロポレーションを含めた標準
的なトランスフェクションプロトコルを用い、細胞をDAS含有ベクターで一過
的にトランスフェクトし、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレ
イに平板培養する。別の方法として、トランスフェクションはマイクロタイター
プレートそれ自体中で直接行うことができる。
、DNA結合ドメイン、アミノ末端変調ドメイン、ヒンジ領域、またはカルボキ
シ末端リガンド結合ドメイン)を保有することが示されたDASを利用して、新
規ステロイド受容体を同定する。
Pをコードする遺伝子に基部側に融合した、発現ベクターへのDASの挿入を介
してGFPキメラを作成することによるDASのタグ付けを含む。別の方法とし
て、発現されたDASのいくつかの部分に対する高親和性を持つ一本鎖抗体断片
は、当該分野で利用できる技術(Cambridge Antibody Te
chnologies)を用いて構築し、フルオロフォア(FICT)に連結し
て、細胞中の推定転写アクチベータ/受容体をタグ付けすることができた。この
別の方法は、DNAトランスフェクションを必要としない外部タグを提供し、従
って、分布データが、DASを作成するのに使用される元の一次培養から集める
べき場合には有用であろう。
含有する真核生物発現プラスミドは、GFP突然変異体を用いて調製される。こ
の構築体を用いて、HeLa細胞をトランスフェクトする。このプラスミドは、
宿主細胞にトランスフェクトされると、GFP−DASppと命名されたDAS
タンパク質産物に融合したGFPを生じる。
トランスフェクションに12から24時間先立って、5%木炭/デキストラン−
処理胎児ウシ血清(FBS)(Hyclone)および1%ペニシリン−ストレ
プトマイシン(C−DMEM)を含有するDMEMを用いて平板培養し、37℃
および5%CO2にてインキュベートする。トランスフェクションはリン酸カル
シウム共沈殿によって、またはリポフェクタミン(Life Technolo
gies)で行う。リン酸カルシウムトランスフェクションでは、トランスフェ
クションに先立って培地を5%木炭/デキストラン−処理FBSを含有するDM
EMで置き換える。細胞を37℃および5%CO2にて4から5時間リン酸カル
シウム−DNA沈殿と共にインキュベートし、DMEMで3から4回洗浄して、
沈殿を除去し、続いてC−DMEMを添加する。リポフェクタミントランスフェ
クションは、製造業者の指示に従って、抗生物質を含有しない無血清DMEM中
で行う。DNA−リポソーム複合体との2から3時間のインキュベーションに続
き、培地を除去し、C−DMEMで置き換える。96−ウェルマイクロタイター
プレート中の全てのトランスフェクトされた細胞を、薬物処理の24から48時
間先立って、33℃および5%CO2にてインキュベートする。実験は、HeL
a細胞中で一過的に発現された受容体で行う。
めには、トランスフェクトされた細胞の核を、33℃および5%CO2にて、2
0分間、C−DMEM中の5μg/mlのヘキスト(Hoechst)3334
2(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes))でまず
標識する。細胞をハンクスの平衡食塩水(HBSS)中で1回洗浄する。細胞を
生きたまま分析するか、あるいはそれをHBSSですすぎ、HBSS中の3.7
%ホルムアルデヒドで15分間固定し、ヘキスト(Hoechst)33342
で染色し、分析前に洗浄する。
リーニングシステムを用いて行う。細胞内GFP−DASpp蛍光シグナルは、
視野細胞からの蛍光イメージ対(GFP−DASppおよびヘキスト(Hoec
hst)33342−標識核)を取得することによって収集する。各時点で得ら
れたイメージ対を用いて、各細胞において核および細胞質領域を規定する。細胞
質における分散したシグナルを示すデータは、DNA転写アクチベータである既
知のステロイド受容体と合致するであろう。
としての、GFP−DASppの適切な発現につき確認されたこの構築体を用い
、限定されるものではないが、エストロゲン、プロゲステロン、レチノイド、成
長因子、アンドロゲン、および多くの他のステロイドおよびステロイドベースの
分子を含めた、種々のステロイドタイプのリガンドを用いて、種々の脂質のスク
リーニングを行う。イメージの取得および分析は、本発明の細胞スクリーニング
システムを用いて行う。細胞内GFP−DASpp蛍光シグナルは、視野細胞か
らの蛍光イメージ対(GFP−DASppおよびヘキスト(Hoechst)3
3342−標識核)を取得することによって収集する。各時間で得られたイメー
ジ対を用いて、各ウェルにおいて核および細胞質領域を規定する。GFP−DA
Sppの移動は、核中のGFP−DASppの積分蛍光強度を細胞質中のキメラ
の積分蛍光強度で割ることによって、あるいはGFP蛍光の核−細胞質差異とし
て計算される。細胞質から核への移動は、DASppのリガンド結合活性化を示
し、このように、潜在的受容体クラスおよび作用を同定する。このデータをステ
ロイド受容体の既知のインヒビダーおよびモディファイアーを用いて同様に得ら
れた他のデータと組み合わせると、DASppを標的として有効化し、より多く
のデータは種々の源から生じるであろう。
の実施形態において、プロフィリン膜結合の蛍光タンパク質バイオセンサーは、
精製されたプロフィリン(Federovら(1994),J.Molec.B
iol.241:480−482、Lanbrechtsら(1995),Eu
r.J.Biochem.230:281−286)を、2−300n秒の範囲
の蛍光寿命を保有するプローブで標識することによって調製される。バルクロー
ディング方法を用い、標識されたプロフィリンを生きたインジケータ細胞に導入
し、インジケータ細胞をテスト化合物で処理する。蛍光非等方性イメージング顕
微鏡(ゴフ(Gough)およびテーラー(Taylor)(1993),J.
Cell Biol.121:1095−1107)を用いて、0.1秒から1
0時間の範囲の処理後の時間に、細胞質および膜の間のプロフィリンの蛍光誘導
体のテスト−化合物依存性移動を測定する。
胞をテスト化合物で処理し、次いで、固定し、洗浄し、浸透させる。インジケー
タ細胞原形質膜、細胞質および核を全て着色マーカで区別して標識し、続いて、
第4の色で標識された抗体でのRhoタンパク質で免疫化する(Selfら(1
995),Methods in Enzymology 256:3−10、
Tanakaら(1995))。4つの標識の各々を、細胞スクリーニングシス
テムを用いて別々にイメージし、このイメージを用いて、テスト化合物によって
行われた移動の阻害または活性化の量を計算する。この計算を行うには、原形質
膜および細胞質をマークするのに使用されるプローブのイメージを用いて、細胞
内Rhoタンパク質の位置をマークする免疫学的プローブのイメージをマスクす
る。各マスク下の単位面積当たりの積分明るさを用いて、原形質膜積分明るさ/
面積を細胞質積分明るさ/免疫によって割ることによって、移動商を形成する。
対照および実験ウェルからの移動商値を比較することによって、パーセント移動
を、各潜在的リード化合物につき計算する。
胞質から原形質膜へのβ−アレスチンタンパク質の移動は細胞処理に応答して測
定される。この移動を測定するには、蛍光ドメインマーカを含有する生きたイン
ジケータ細胞をテスト化合物で処理し、β−アレスチンマーカの移動を、本発明
の細胞スクリーニングシステムを用いて時間および空間において測定する。好ま
しい実施形態においては、インジケータ細胞は、一過性または安定な細胞トラン
スフェクションを通じてインジケータ細胞によって発現される緑色蛍光タンパク
質β−アレスチン(GFP−β−アレスチン)タンパク質キメラ(バラク(Ba
rak)ら(1997),J.Biol.Chem.272:27497−27
500、Daakaら(1998),J.Biol.Chem.273:685
−688)および細胞質および膜ドメインをマークするのに使用される他のレポ
ータからなる蛍光マーカを含有する。インジケータ細胞が休止状態にある場合、
ドメインマーカ分子は原形質膜または細胞質に支配的に分配される。高含有量ス
クリーニングにおいて、これらのマーカを用いて、蛍光の区別されるチャネルに
おいて細胞質および原形質膜を描く。インジケータ細胞をテスト化合物で処理す
ると、GFP−β−アレスチンの動的再分布は、0.1秒から10時間の範囲の
時間スケールにわたって一連のイメージとして記録される。好ましい実施形態に
おいて、この時間スケールは1時間である。各イメージは、原形質膜および細胞
質の間のGFP−β−アレスチンタンパク質キメラの移動を定量する方法によっ
て分析される。この計算を行うには、原形質膜および細胞質をマークするのに使
用されるプローブのイメージを用いてGFP−β−アレスチンプローブのイメー
ジをマスクし、細胞内GFP−β−アレスチンタンパク質の位置をマークする。
各マスク下の単位面積当たりの積分明るさを用いて、原形質膜積分明るさ/面積
を細胞質積分明るさ/面積で割ることによって、移動商を形成する。対照および
実験ウェルからの移動商値を比較することによって、パーセント移動を各潜在的
リード化合物につき計算する。高含有量スクリーニングの出力は、注目するテス
ト化合物で処理されている多数の個々の細胞内の移動の大きさを説明する定量的
データに関する。
おいて、小胞体からゴルジ体ドメインへの水疱性口内炎ウイルスのts045突
然変異体株(エレンバーグ(Ellenberg)ら(1997),J.Cel
l Biol.138:1193−1206、プレスリー(Presley)ら
(1997)Nature 389:81−85)からのVSVGタンパク質の
移動が細胞処理に応答して測定される。この移動を測定するには、ルミネセンス
レポータを含有するインジケータ細胞をテスト化合物で処理し、レポータの移動
を、本発明の細胞スクリーニングシステムを用いて空間および時間において測定
する。このインジケータ細胞は、一過性または安定な細胞トランスフェクション
の使用を介してインジケータ細胞によって発現されるGFP−VSVGタンパク
質および小胞体およびゴルジ体ドメインの位置を測定するのに用いられる他のド
メインマーカからなるルミネセンスレポータを含有する。インジケータ細胞が4
0℃にてその休止状態にある場合、このGFP−VSVGタンパク質キメラ分子
は小胞体に支配的に分配される。この高含有量スクリーニングにおいて、区別さ
れる色のドメインマーカを用いて、蛍光の区別されるチャネルにおいて小胞体お
よびゴルジ体ドメインを描く。インジケータ細胞をテスト化合物で処理し、かつ
温度を同時に32℃まで低下させる場合、このGFP−VSVGタンパク質キメ
ラの動的再分布は、0.1秒から10時間の範囲の時間スケールにわたって一連
のイメージとして記録される。各イメージは、小胞体およびゴルジ体ドメインの
間のGFP−VSVGタンパク質キメラの移動を定量する方法によって分析され
る。この計算を行うためには、小胞体およびゴルジ体ドメインをマークするのに
使用されるプローブのイメージを用いて、GFP−VSVGプローブのイメージ
をマスクし、細胞内GFP−VSVGタンパク質の位置をマークする。各マスク
下の単位面積当たりの積分明るさを用いて、小胞体積分明るさ/面積をゴルジ体
積分明るさ/面積で割ることによって移動商を形成する。対照および実験ウェル
からの商値を比較することによって、各潜在的リード化合物につき%移動を計算
する。高含有量スクリーニングの出力は、1分から10時間の範囲の間の時間、
10−12Mから10−3Mの範囲の最終濃度にて注目するテスト化合物で処理
されている多数の個々の細胞内の移動の大きさを説明する定量的データに関する
。
を提供することである。この実施形態において、インジケータ細胞をテスト化合
物で処理し、ルミネセンス微小管−標識分子の分布を、前述で開示のもののよう
な細胞スクリーニングシステムを用いて空間および時間において測定する。ルミ
ネセンス微小管−標識分子は、細胞をテスト化合物と接触させる前、それと共に
、またはその後に細胞によって発現され得るか、または細胞に添加することがで
きる。
ク質に融合した微小管を標識するタンパク質を含む、微小管の動力学のルミネセ
ンス標識タンパク質バイオセンサーを発現する。本発明のこの態様についての適
切な微小管−標識タンパク質は、限定されるものではないが、αおよびβチュー
ブリンイソ形態およびMAP4を含む。ルミネセンスタンパク質の好ましい実施
形態は、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質(GFP)およびGF
P突然変異体を含む。好ましい実施形態において、この方法は微小管標識ルミネ
センスタンパク質で細胞をトランスフェクトすることを含み、ここに、微小管標
識タンパク質は、限定されるものではないが、α−チューブリン、β−チューブ
リン、または微小管−結合タンパク質4(MAP4)であり得る。ここに概説し
たアプローチは、当業者が、生細胞測定を行って、チューブリンの活性および微
小管の安定性に対するリード化合物のインビボでの効果を決定するのを可能とす
る。
victoria)緑色蛍光タンパク質(GFP)の修飾されたバージョンに
融合させる。(クローンテック(Clontech)から入手可能な)EGFP
コーディング配列およびマウスMAP4についてのコーディング配列の間の融合
からなるDNA構築体は作成されている(オルソン(Olson)ら(1995
),J.Cell Biol.130(3):639−650)。MAP4は、
相間の微小管並びにマイトジェン細胞と相互作用することが知られている普遍的
微小管−結合タンパク質である(OlmstedおよびMurofushi,(
1993),MAP4.In「Guidebook to the CYtos
keleton and Motor Proteins」Oxford Un
iversity Press.T.KreisおよびR.Vale,編)。次
いで、その位置は、細胞ベースのHCSアッセイについての細胞周期の全ての段
階において、生きた(または固定した)細胞中の微小管の位置、組織化および一
体性のインジケータとして働くことができる。MAP2およびタウ(ニューロン
細胞で特異的に発現される微小管結合タンパク質)を用いてGFPキメラが形成
されているが(Kaechら(1996)Neuron.17:1189−11
99、ハル(Hall)ら(1997),Proc.Nat.Acad.Sci
.94:4733−4738)、束微小管に対するそれらの制限された細胞型分
布およびこれらのタンパク質の傾向は、過剰発現されると、これらのタンパク質
を、種々の組織および器官に由来する生細胞中での分析のための分子試薬として
より望ましくなくする。GFP−MAP4の中程度の過剰発現は微小管の機能ま
たは一体性を破壊しない(オルソン(Olson)ら,1995)。同様の構築
体は、当該分野における標準的な技術を介してβ−チューブリンまたはα−チュ
ーブリンを用いて作成することができる。これらのキメラは、細胞周期の全ての
段階の間に生細胞における微小管活性を観察し分析する手段を提供するであろう
。
ンサーを、マイクロインジェクション、スクレイプローディング、およびインパ
クト−媒介ローディング等のバルクローディング技術を介して、発現させ、単離
し、分析すべき細胞に添加する。この実施形態において、細胞内に過剰発現の論
争はなく、このように、αおよびβチューブリンイソ形態、MAP4、MAP2
および/またはタウは全て用いることができる。
れ、細胞は、タンパク質バイオセンサー、タンパク質抗原の内因性レベル、また
は双方を検出する、標識抗体等の、蛍光標識と引き続いて接触させる。この実施
形態において、αおよびβチューブリンイソ形態、MAP4、MAP2および/
またはタウを検出するルミネセンス標識を用いることができる。
tech),California)GFP突然変異体を含めた種々のGFP突
然変異体が入手でき、その全ては本発明で効果的であろう。
T3,HeLa,HEK 293,LLCPK)に導入されており、チューブリ
ンの組織化および局所化は、MAP4局所化のインジケータとしてのGFP蛍光
によって生細胞で可視化されている。この構築体は一過的に発現できるか、安定
な細胞系は標準的な方法によって調製することができる。EGFP−MAP4キ
メラを発現する安定なHeLa細胞系が得られており、これは、このキメラの発
現が毒性ではなく、有糸分裂に干渉しないことを示す。
ではないが、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、ゼオシ
ン抵抗性遺伝子、ピューロマイシン抵抗性遺伝子、ブレオマイシン抵抗性遺伝子
、およびブラスタシジン抵抗性遺伝子を含む。
、パクリタキセル、ノコタゾール、ビンクリスチンまたはビンブラスチン等の微
小管薬物での一過的および安定にトランスフェクトされた細胞の処理によって照
明されている。
パラメータとして、抗−微小管薬物についての高含有量および組み合わせた高ス
ループット−高含有量細胞ベースのスクリーニングを提供する。ここに用いられ
るEGFP−MAP4もまた、複数シグナリング経路または生理学的事象を測定
する高含有量スクリーニングの構成要素の1つとして用いることができる。好ま
しい実施形態において、組み合わせた高スループットおよび高含有量スクリーニ
ングが用いられ、ここに、細胞を含有する位置の各々における複数細胞が高スル
ープットモードで分析され、細胞を含有する位置のサブセットのみが高含有量モ
ードで分析される。高スループットスクリーニングは、限定されるものではない
が、増大したルミネセンス強度を持つ位置、レポータ遺伝子の発現を呈するもの
、カルシウム変化を受けているもの、およびpH変化を受けているものの同定を
含めた、さらに分析すべき細胞を含有する位置を同定するのに有用であろういず
れのスクリーニングでもあり得る。
の検出、および基本的な研究市場に適用することができる。なぜなら、細胞分裂
および移動度等の基本的な細胞プロセスは微小管動力学に大いに依存するからで
ある。
できる。得られたイメージの各々から形態データを抽出するには、以下の分析方
法が用いられる: 1.各核および細胞質イメージを閾値設定して、核または細胞境界の外側の各
画素について値=0を有するマスクを作成する。
細胞)を検出し、そのサイズ、形状および積分強度を計算する。
以上の分類器の以下の組を適用して、微小管の形態および微小管の形態に対する
薬物の効果を測定する。
するための分類器の組を用いて規定される。これらの分類器は、共出現マトリッ
クス、テクスチャ測定、スペクトル方法、構造方法、小波トランス形態、統計的
方法、その組合せを含むアプローチに基づくことができる。そのような分類器の
例は以下の通りである: 1.各細胞内で全エッジ強度を計算するために、Kolegaら(個々の細胞
においてエッジ郷土を測定するための非自動方法を開示する(1993).Bi
oImaging 1:136−150)に記載されたもののようなエッジ検出
方法を用いて微小管の長さおよび幅を定量する分類器。細胞のサイズにつき正規
化するには、全エッジ強度を細胞面積で割って、「微小管形態」値を得ることが
できる。大きな微小管形態値は強いエッジ強度値と関連し、従って、区別される
微小管構造を含有する細胞において最大である。同様に、小さな微小管形態値は
弱いエッジ強度に関連し、脱重合微小管を持つ細胞で最小である。微小管形態値
の生理学的範囲は、微小管安定化薬物パクリタキセル(10μM)または微小管
脱重合薬物ノコダゾール(10μg/ml)いずれかで細胞を処理することによ
って設定される。
微小管凝集を定量するための分類器。
。
分類器。
類器を用いる微小管再組織化の速度論の測定。
クター、および上述した方法を実施するための発現ベクターを用いる指令を含む
、微小管の安定性を分析するためのキットを提供することである。好ましい実施
形態において、発現ベクターは、さらに、ルミネセンスタンパク質をコードする
核酸を含み、ここに、微小管結合タンパク質およびそのルミネセンスタンパク質
は融合タンパク質として発現される。別の方法として、このキットは微小管−標
識タンパク質に特異的に結合する抗体を含有することができる。さらなる実施形
態において、このキットは微小管標識タンパク質を発現する細胞を含む。好まし
い実施形態において、細胞を発現ベクターでトランスフェクトする。別の好まし
い実施形態において、このキットは、さらに、限定されるものではないが、クラ
シン、ノコダゾール、ビンクリスチンまたはビンブラスチンを含めた、微小管構
造を破壊することが知られている化合物を含有する。別の好ましい実施形態にお
いて、このキットは、さらに、限定されるものではないが、タキソール(パクリ
タキセル)およびディスコデルモリドを含めた、微小管構造を安定化させること
が知られている化合物を含む。
分析するための開示された方法を実行させるための指令の組を含有するプログラ
ムを含む機械読み取り可能保存媒体を含み、ここに、この細胞スクリーニングシ
ステムは、細胞を含有するプレートを保持するのに適した段階を備えた光学系、
デジタルカメラ、細胞から放出された蛍光またはルミネセンスをデジタルカメラ
に向ける手段、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するコ
ンピュータ手段を含む。
の機能的局所化を生細胞内で測定する。
態において、鍵となる解糖調節酵素の活性を処理細胞において測定する。酵素活
性を測定するには、ルミネセンス標識試薬を含有するインジケータ細胞をテスト
化合物で処理し、レポータの活性を、本発明の細胞スクリーニングシステムを用
いて空間および時間において測定する。
ン酸、2−キナーゼ/フラクトース−2,6−ビスリン酸(PFK−2)、その
リン酸化状態が細胞内炭水化物同化および異化を示す調節酵素である(デプレ(
Deprez)ら(1997)J.Biol.Chem.272:17269−
17275、Kealerら(1996)FEBS Letters 395:
225−227、リー(Lee)ら(1996),Biochemistry
35:6010−6019)。インジケータ細胞は、PFK−2−リン酸化の蛍
光タンパク質バイオセンサーからなるルミネセンスレポータを含有する。蛍光タ
ンパク質バイオセンサーは、環境的に感受性の蛍光色素を、この酵素の既知のリ
ン酸化部位近くに導入することによって構築される(デプレ(Deprez)ら
(1997),上記、ジュリアノ(Giuliano)ら(1995),上記)
。この色素はケトシアニンクラスのものである(ケスラー(Kessler)お
よびWolfbeis(1991),Spectrochimica Acta
47A:187−192)、あるいはタンパク質反応性部位、およびその励起
または発光スペクトルが溶液極性に対して感受性であるフルオロクロームを含有
するいずれかのクラスであり得る。蛍光タンパク質バイオセンサーは、バルクロ
ーディング方法を用いて、インジケータ細胞に導入される。
0−3Mの範囲の最終濃度にて、テスト化合物で処理する。好ましい実施形態に
おいて、比率イメージデータは、各時点において、蛍光イメージのスペクトル対
を収集することによって、生きた処理インジケータから得られる。各時点から形
態データを抽出するには、各時点における2つのスペクトルイメージを数字的画
素間に分割することによって、イメージの各対の間で比率が取られる。次いで、
各画素値を用いて、PFK−2のリン酸化分率を計算する。リン酸化の小さな分
率値では、PFK−2は炭水化物異化を刺激する。リン酸化の高い分率値では、
PFK−2は炭水化物同化を刺激する。
ニングの別の実施形態において、インジケータ細胞内のドメイン局所化およびプ
ロテインキナーゼA(PKA)の活性双方が、テスト化合物での処理に応答して
測定される。
ミネセンスレポータを含有する。蛍光タンパク質バイオセンサーは、環境的に感
受性の蛍光色素を、PKAの調節ブユニットと相互作用することが知られている
部位近くにPKAの触媒サブユニットを導入することによって構築される(ハル
ーツニアン(Harootunian)ら(1993),Mol.Biol.o
f the Cell 4:993−1002、Johonsonら(1996
),Cell 85:149−158、ジュリアノ(Giuliano)ら(1
995),上記。この色素はケトシアニンクラスのものであるか(ケスラー(K
essler)、およびWolfbeis(1991), Spectroch
imica Acta 47A:187−192)、あるいはタンパク質反応性
部位およびその励起もしくは発光スペクトルが溶液極性に対して感受性であるフ
ルオロクロームを含有するいずれかのクラスであり得る。PKA活性化の蛍光タ
ンパク質バイオセンサーは、バルクローディング方法を用いてインジケータ細胞
に導入される。
の間、10−12Mから10−3Mの範囲の最終濃度にて、テスト化合物で処理
する。好ましい実施形態において、比率イメージデータは、生きた処理インジケ
ータ細胞から得られる。各時点からバイオセンサーデータを抽出するには、イメ
ージの各対の間で比率を取り、次いで、各画素を用いて、PKAの分率活性化を
計算する(例えば、cAMP結合後における触媒および調節サブユニットの分離
)。活性の高い分率値において、PGK−2は生細胞内の生化学カスケードを刺
激する。
有するインジケータ細胞をテスト化合物で処理し、レポータの移動は、細胞スク
リーニングシステムを用いて空間および時間において測定する。インジケータ細
胞は、細胞質および核ドメインの位置を測定するのに使用されるドメインマーカ
からなるルミネセンスレポータを含有する。インジケータ細胞をテスト化合物で
処理すると、PKA蛍光タンパク質バイオセンサーの動的再分布を、0.1秒か
ら10時間の時間スケールにわたって一連のイメージとして細胞内で記録される
。各イメージは、細胞質および核ドメインの間のPKAの移動を定量する方法に
よって分析される。この計算を行うには、細胞質および核ドメインをマークする
のに使用されるプローブのイメージを用いて、PKA蛍光タンパク質バイオセン
サーのイメージをマスクする。各マスク下の単位面積当たりの積分明るさを用い
て、細胞質積分明るさ/面積を核積分明るさ/面積で割ることによって、移動商
を形成する。対照および実験ウェルからの移動商値を比較することによって、パ
ーセント移動が、各潜在的リード化合物につき計算される。高含有量スクリーニ
ングの出力は、10−12Mから10−3Mの濃度範囲のテスト化合物で処理さ
れている多数の個々の細胞内の移動の大きさを説明する定量的データと関係する
。
間接着、シグナル変換、細胞周期事象、媒介およびシグナリング分子代謝、細胞
移行、細胞間通信、および細胞死滅を含めた、細胞の生理学的応答の一般的クラ
スの調節は、このクラスの生理学的応答を測定するようにデザインすることがで
きる。
イブリダイズでき、そのルミネセンスシグナルを変更できるオリゴヌクレオチド
である。好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドは分子ビーコン(T
yagiおよびクレーマー(Kramer)(1996)Nat.Biotec
hnol.14:303−308)、そのルミネセンスシグナルが分子間および
分子内相互作用に依存するルミネセンス−ベースの試薬である。蛍光バイオセン
サーは、試薬の各端部(5’および3’)に1つがあるように、蛍光色素の蛍光
エネルギー移動対を導入することによって構築される。この色素はタンパク質反
応性部位、およびその励起および発光スペクトルが十分重複して、限定されるも
のではないが、フルオレセインおよびローダミン(モレキュラー・プローブ社(
Molecular Probes,Inc.))を含めた、休止状態にある色
素の間の蛍光エネルギー移動を供する。好ましい実施形態において、β−アクチ
ンをコードするメッセージの部分(Kislauskisら(1994),J.
Cell Biol.127:441−451、マッキャン(McCann)ら
(1997),Proc.Natl.Acad.Sci.94:5679−56
84、Sutoh(1982),Biochemistry 21:3654−
3661)を、分子内ハイブリッド形成により一緒に連結された端部を持つヘア
ピン−形状のオリゴクレオチドのループ領域に挿入される。バイオセンサーの各
端部において、蛍光ドナー(フルオレセイン)および蛍光アクセプタ(ローダミ
ン)が共有結合している。連結状態において、蛍光エネルギー移動は最大であり
、従って、非ハイブリダイズ分子を示す。β−アクチンをコードするmRNAと
ハイブリダイズすると、この連結体は破壊され、エネルギー移動は喪失される。
完全な蛍光バイオセンサーは、バルクローディング方法を用いてインジケータ細
胞に導入される。
の範囲の間、10−12Mから10−3Mの最終濃度にて、テスト化合物で処理
する。好ましい実施形態において、比率イメージデータは生きた処理インジケー
タ細胞から得られる。各時点からの形態データを抽出するには、イメージの各対
の間で比率を取り、次いで、各画素値を用いて、標識されたヌクレオチドの分率
ハイブリッド形成を計算する。ハイブリッド形成の小さな分率値では、β−アク
チンの発現はほとんど示されない。ハイブリッド形成の大きな分率値では、β−
アクチンの最大発現が示される。さらに、インジケータ細胞の細胞室内のハイブ
リダイズした分子の分布もまたインジケータ細胞の生理学的応答の尺度である。
膜ドメインが特定の色の標識試薬で標識されている細胞を、適当な条件下で、適
当な時間、異なる色のルミネセンスプローブで標識されたインスリン分子を含有
する溶液と共にインキュベートした(リー(Lee)ら(1997)、Bioc
hemistry 36:2701−2708、Nartinez−Zagui
lanら、(1996)、Am.J.Physiol.270:C1438−C
1446)。インキュベーションの後、未結合インスリン分子を洗浄除去し、細
胞を固定し、原形質膜上のインスリンの分子および濃度を測定する。これを行う
ために、細胞膜イメージを、インスリンイメージのためのマスクとして用いる。
マスクされたインスリンイメージからの積分強度を、既知量の標識インスリンを
含有するイメージの組と比較する。細胞に結合したインスリンの量は標準から測
定し、細胞と共にインキュベートした全濃度のインスリンと用いて、その細胞表
面受容体に対するインスリンの解離定数を計算する。
分析することによって経時的に測定できるように、細胞成分を標識することによ
って達成される。
の膜−浸透分子は、原形質膜中のタンパク質成分を通って拡散し、それと反応す
る。色素分子は細胞内分子と反応して、各分子から放出されたルミネセンスシグ
ナルを増大させ、生細胞内で蛍光色素を取得する。これらの分子は、アミノクマ
リン、ヒドロキシクマリン、エオシンジアセテート、フルオレセインジアセテー
ト、いくつかのBodipy色素誘導体、およびテトラメチルローダミンの反応
性クロロメチル誘導体を含む。マクロ分子に向けられたこれらの色素の飯能性は
、遊離第1級アミノ基および遊離スルフヒドリル基を含む。
応する傾向標識抗体またはレクチン(Sigma Chemical Coma
pny,St.Louis,MO)と相互作用されることによって標識される。
緑色蛍光タンパク質またはその突然変異体成分を含有する注目する細胞によって
発言された細胞表面タンパク質キメラを用いて、全細胞表面を蛍光標識する。一
旦全細胞が標識されれば、全細胞または細胞アレイのイメージは、高含有量スク
リーニングにおけるパラメータとなることができ、細胞の形状、移動度、ならび
に増殖および分裂の測定に関連する。
した同一の方法のいくつかを使用する 。全細胞表面を標識するルミネセンス分
子は原形質膜を描くように作用する。
および細胞内表面は別々に標識することができ、高含有量スクリーニングの成分
として用いられる。最初の実施形態において、細胞外表面は、スクシンイミジル
エステル等の反応性蛍光分子またはフルオレセイン、ローダミン、シアニン、B
odipys等の蛍光色素のヨードアセトアミド誘導体での簡単な処理を用いて
標識する。
つ蛍光標識マクロ分子を用いて標識する。これらは、タチナタマメ(Con A
)、インゲンマメ(エリスロアグルチニンPHA−E)、または小麦胚芽に由来
するレクチンのシアニン誘導体に由来するレクチンのフルオレセイン、ローダミ
ン、およびシアニン誘導体等の蛍光標識レクチンを含む。
を用いて、原形質膜の細胞外領域を標識する。細胞表面受容体およびイオンチャ
ネルの細胞外領域は、抗体で標識することができるタンパク質の例である。
の分子は、原形質膜脂質二層の中央にある疎水性領域と強く相互作用する長鎖疎
水性分子に付着した蛍光色素を含む。これらの色素の例は色素のPKHシリーズ
(米国特許第4,783,401号、第4,762,701号および第4,85
9,584号、Sigma Chemical Company,St.Loi
us,MO)、ニトロベンゾオキサジアゾールグリセロホスホエタノールアミン
およびフルオレセイン−誘導体化ジヘキサデカノイルグリセロホスホエタノール
アミン等の蛍光リン脂質、5−ブチル−4,4−ジフルオロ−4−ボラ−3a,
4a,ジアザ−s−インダセン−3−ノナン酸および1−ピレンデカン酸(モレ
キュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))等の
蛍光脂肪酸、コレステリル4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−
3a,4,ジアザ−s−インダセン−3−ドデカノエートおよびコレステリル1
−ピレンヘキサノエートを含めた蛍光ステロール、およびアネキシンVのフルオ
レセイン誘導体(Caltag Antibody Co,Burlingam
e,CA)等の脂質二層成分と特異的に相互作用する蛍光標識タンパク質を含む
。
の分子の例はトリマーG−プロテイン受容体、アデニリルシクラージ、およびイ
オン輸送タンパク質の細胞内成分である。これらの分子は、蛍光標識特異的抗体
への密接な結合の結果として、または膜−結合タンパク質および緑色蛍光タンパ
ク質、およびその突然変異体である蛍光タンパク質キメラの取り込みによって標
識することができる。
送されるリガンドを用いて、エンドソーム小器官の動力学を追跡する。標識リガ
ンドの例はBodipy FL−標識低密度リポタンパク質複合体、テトラメチ
ルローダミントランスフェリンアナログ、および蛍光標識表皮成長因子(モレキ
ュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))を含む
。
一次または二次抗体(シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical C
o.)St.Louis,MO、モレキュラー・プローブ社(Molecula
r Probes,Inc.)Eugene,OR、Caltag Antib
ody Co.)を用いて細胞中のエンドソーム区画をマークする。
内部化がエンドソームを標識する受容体と融合させることによって形成されたタ
ンパク質キメラを発現する細胞において、エンドソームを蛍光標識する。EGF
、トランスフェリン、および低密度リポタンパク質受容体のキメラはこれらの分
子の例である。
胞および固定細胞のリソソーム区画を標識する。これらの試薬は、蛍光分子ニュ
ートラルレッド、N−(3−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)プロピル
)−N−(3−アミノプロピル)メチルアミン、およびリソソーム内pHならび
にリソソームの動的分布を報告するLysoTracker Probes(モ
レキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))を
含む。
(Sigma Chemical Co.)、モレキュラー・プローブ社(Mo
lecular Probes,Inc.)、Caltag Antibody
Co.)を用いて、特異的リソソームドメインに局在するリソソーム成分を標
識する。これらの成分の例はコレステロースエステル加水分解に関与する分解酵
素、膜タンパク質プロテアーゼ、およびヌクレアーゼならびにATP−駆動リソ
ソームプロトンポンプである。
性ルミネセンスタンパク質に遺伝子的に融合したリソソームタンパク質からなる
タンパク質キメラを用いてリソソームドメインを標識する。これらの成分の例は
コレステロースエステル加水分解に関与する分解酵素、膜タンパク質プロテアー
ゼ、およびヌクレアーゼならびにATP−駆動リソソームプロトンポンプである
。
プローブ社(Molecular Probes,Inc.))を生細胞と反応
させる。モノブロモビマン、5−クロロメチルフルオレセインジアセテート、カ
ルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル、およびクロロ
メチルテトラメチルローダミンを含めた反応性色素は、細胞の細胞質の長期標識
で用いられる細胞浸透蛍光色素の例である。
ースの蛍光色素(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probe
s,Inc.))等の極性トレーサー分子をバルクローディング方法を用いて細
胞に導入し、細胞質標識で用いる。
igma Chemical Co.)、モレキュラー・プローブ社(Mole
cular Probes,Inc.)、Caltag Antibody C
o.)を用いて細胞質を蛍光標識する。細胞質抗原の例は、中間代謝に関与する
酵素の多くである。エノラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、およびアセチル−C
oAデヒドロゲナーゼは均一に分布した細胞質抗原の例である。
性蛍光タンパク質に遺伝子的に融合した細胞質タンパク質からなるタンパク質キ
メラを用いて細胞質を標識する。均一に分布したタンパク質の蛍光キメラを用い
て、全細胞質ドメインを標識する。これらのタンパク質の例は、中間代謝に関与
するタンパク質の多くであり、エノラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびヘキソ
キナーゼを含む。
igma Chemical Co.)、モレキュラー・プローブ社(Mole
cular ProbesInc.)、Caltalg Antibody C
o.)を用いて、特異的細胞質サブドメインに局在する。細胞質成分を標識する
。これらの成分の例は細胞骨格タンパク質アクチン、チューブリン、およびサイ
トケラチンである。細胞内のこれらのタンパク質の集団を、この場合線維状であ
る区別される構造に組み立てる。従って、抗体−ベースの試薬でのこれらのタン
パク質の蛍光標識は、細胞質の特異的サブドメインを標識する。
ースの蛍光標識分子を用いて、特異的細胞質成分を標識する。1つの例は酵素D
NAse Iの蛍光アナログである(モレキュラー・プローブ社(Molecu
lar Probes,Inc.))。この酵素の蛍光アナログは細胞質アクチ
ンに密接かつ特異的に結合し、このように、細胞質のサブドメインを標識する。
別の例において、キノコの毒素ファロイジンまたは薬物パクリタキセルの蛍光ア
ナログ(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,In
c.))を用いて、各々、アクチン−および微小管−細胞骨格の成分を標識する
。
蛍光タンパク質に遺伝子的に融合した細胞質タンパク質からなるタンパク質キメ
ラを用いて、細胞質の特異的ドメインを標識する。強度に局所化したタンパク質
の蛍光キメラを用いて、細胞質サブドメインを標識する。これらのタンパク質の
例は、細胞骨格を調節するのに関与するタンパク質の多くである。それらは構造
タンパク質アクチン、チューブリン、およびサイトケラチンならびに調節タンパ
ク質微小管結合タンパク質4およびαーアクニチンを含む。
ー・プローブ社(Molecular Probes),Inc,)を用いて、
生細胞および固定細胞の核を標識する。これらはシアニンベースの色素(例えば
TOTOR,YOYORおよびBOBOTM)、フェナンチジンおよびアクリジン
(例えば、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、およびアクリジンオレンジ)
、インドールおよびイミダゾール(例えば、Hoechest33258,Ho
echest33342および4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)
、および他の同様の試薬(例えば、7−アミノアクチノマイシンD、ヒドロキシ
スチルバミジン、およびプソラレン)を含む。
l Co,、モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes)
,Icn.、Caltag Antibody Co.)を用い、特異的核ドメ
インに局在する核成分を標識する。これらの成分の例はDNAの構造および機能
を維持するのに関与するマクロ分子である。DNA、RNA、ヒストン、DNA
ポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、ラミン、およびアクチン等の細胞質タンパ
ク質の核変種は核抗原の例である。
性蛍光タンパク質に遺伝子的に融合した核タンパク質からなるタンパク質キメラ
を用いて核ドメインを標識する。これらのタンパク質の例は、DNAの構造およ
び機能を維持するのに関与するタンパク質の多くである。ヒストン、DNAポリ
メラーゼ、RNAポリメラーゼ、ラミン、およびアクチン等の細胞質タンパク質
の核変種は核タンパク質の例である。
モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))
を用いて、生細胞および固定細胞のミトコンドリアを標識する。これらの試薬は
ローダミン123、テトラメチルロザミン、JC−1、およびMitoTrac
ker反応性色素を含む。
ル社(Sigma Chemical Co.)、モレキュラー・プローブ社(
Molecular Probes,Inc.)、Caltag Antibo
dy Co.)を用いて、特異的ミトコンドリアドメインに局在するミトコンド
リア成分を標識する。これらの成分の例は、ミトコンドリアDNAの構造および
機能を維持するに関与するマクロ分子である。DNA、RNA、ヒストン、DN
Aポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、およびミトコンドリアtRNAおよびr
RNA等の細胞質マクロ分子のミトコンドリア変種はミトコンドリア抗原の例で
ある。ミトコンドリア抗原の他の例は、ミトコンドリアで見出される酸化的リン
酸化系の成分である(例えば、チトクロームc、チトクロームcオキシダーゼ、
およびコハク酸デヒドロゲナーゼ)。
性ルミネセンスタンパク質に遺伝子的に融合したミトコンドリアタンパク質から
なるタンパク質キメラを用いて、ミトコンドリアドメインを標識する。これらの
成分の例は、ミトコンドリアDNAの構造および機能を維持するのに関与するマ
クロ分子である。その例はヒストン、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ
、およびミトコンドリアで見出される酸化的リン酸化系の成分を含む(例えば、
チトクロームc、チトクロームcオキシダーゼ、およびコハク酸デヒドロゲナー
ゼ)。
ラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))を用いて
、生細胞および固定細胞の小胞体を標識する。これらの試薬は短鎖カルボシアニ
ン色素(例えば、DiOC6およびDiOC3)、長鎖カルボシアニン色素(例
えば、DiIC16およびDiIC18)およびコンカナバリンA等のルミネセ
ンス標識レクチンを含む。
igma Chemical Co.)、モレキュラー・プローブ社(Mole
cular Probes,Inc.)、Antibody Co.)を用いて
、特異的小胞体ドメインに局在する小胞体成分を標識する。これらの成分の例は
、脂肪酸延長系に関与するマクロ分子、グルコース−6−ホスファターゼ、およ
びHMG CoA−レダクターゼである。
ク質に遺伝子的に融合した小胞体タンパク質からなるタンパク質キメラを用いて
、小胞体ドメインを標識する。これらの成分の例は脂肪酸延長系に関与するマク
ロ分子、グルコース−6−ホスファターゼ、およびHMG CoA−レダクター
ゼである。
ュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))を用い
て、生細胞および固定細胞のゴルジ体を標識する。これらの試薬は小麦胚芽アグ
ルチニンおよびブレフェルジンA等の蛍光標識マクロ分子ならびにルミネセンス
標識セラミドを含む。
Sigma Chemical Co.)、モレキュラー・プローブ社(Mol
ecular Probes,Inc.)、Caltag Antibody
Co.)を用いて、特異的ゴルジ体ドメインに局在するゴルジ体成分を標識する
。これらの成分の例はN−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、ゴ
ルジ体−特異的ホスホジエステラーゼ、およびマンノース−6−リン酸受容体タ
ンパク質である。
性ルミネセンスタンパク質に遺伝子的に融合したゴルジ体タンパク質からなるタ
ンパク質キメラを用いて、ゴルジ体ドメインを標識する。これらの成分の例はN
−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、ゴルジ体−特異的ホスホジ
エステラーゼ、およびマンノース−6−リン酸受容体タンパク質である。
、説明のみの目的を意図する。複数パラメータ高含有量スクリーニングは、いく
つかの単一パラメータスクリーニングをマルチパラメータ高含有量スクリーニン
グに組み合わせることによって、あるいは細胞パラメータをいずれかの既存の高
含有量スクリーニングに付け加えることによって作り出すことができる。さらに
、各実施例は生細胞または固定細胞のいずれかに基づくものとして記載したが、
各高含有量スクリーニングは、生細胞および固定細胞双方で用いられるようにデ
ザインすることができる。
種々のスクリーニングを認識するであろう。細胞内の特異的成分の移動または再
組織化に関係する細胞中の既知の生化学および分子プロセスの大きくかつ増大す
るリストがある。細胞内の部位を標的化する細胞表面からのシグナリング経路は
、原形質膜−結合タンパク質から細胞質への移動を含む。例えば、タンパク質チ
ロシンキナーゼのsrcファミリーの1つ、pp60c−src(Walker
ら(1993),J.Biol.Chen.268:19552−19558)
は、血小板、由来成長因子(PDGF)での繊維芽細胞の刺激に際して原形質膜
から細胞質に移動することが知られている。加えて、スクリーニングのための標
的は、それ自体、リガンド−結合および移動後修飾を含めた分子の変化を報告す
る蛍光−ベースの試薬に変換することができる。
分解断片。
メインに付与するアミノ酸配列。
の特定の細胞下ドメインに付与するアミノ酸配列。生成物が最初に膜結合区画内
に局在すれば、生成物標的配列は、この生成物を膜結合区画から外に輸送する能
力を持っていなければならない。まず、生成物を膜−結合区画の外に移動し、次
いで、この生成物を最終区画に標的化する二機能性配列を用いることができる。
一般に、同一のアミノ酸配列を、反応体標的配列および生成物標的配列いずれか
または双方として作用することができる。この例外は、核エンベロープ、ゴルジ
装置、小胞体を標的化し、ファルネシル化に関与し、反応体標的配列としてより
適したアミノ酸配列を含む。
よび切断部位を供することによって特異性を付与するアミノ酸配列。典型的には
、アミノ酸の短い配列はプロテアーゼのための最小切断部位を表すが(例えば、
カスパーゼ−3ではDEVD、Villa,P.,S.H.Kaufmann,
およびW.C.Earnshaw,1997,Caspases and ca
spase inhibitors,Trends Biochem Sci.
22:388−93)、より大きな特異性は、確立された基質からのより長い配
列を用いて確立する事ができる。
かかわらず、細胞のいずれかの細胞サブ−構造またはマクロ分子成分。それはマ
クロ分子アセンブリまたは小器官(膜で境界が定められた細胞成分)で有り得る
。区画は、限定されるものではないが、細胞質、核、核小体、核エンベロープの
内部および外部表面、細胞骨格、ペルオキシソーム、エンドソーム、リソソーム
、原形質膜の内部リーフレット、原形質膜の外部リーフレット、ミトコンドリア
膜の外部リーフレット、ミトコンドリア膜の内部リーフレット、ゴルジ体、小胞
体、または細胞外空間を含む。
が、固有に蛍光性のタンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質、蛍光または蛍光
タンパク質を必要とする補因子(例えば、フィコビリプロテインまたはルシフェ
ラーゼ)、および、限定されるものではないが、蛍光またはルミネセンス標識さ
れた、色素、酵素補因子および作成された結合分子を含めた、特異的抗体または
他の特異的天然または非天然結合プローブによって認識できるエピトープを含む
。タンパク質の部位−特異的標識のための方法は、限定されるものではないが、
作成された色素−反応性アミノ酸(Postら,J.Biol.Chem.26
9:12880−12887(1994))、タンパク質へのルミネセンス基質
の酵素−ベースの取り込み(バックラー(Buckler)ら,Analyt.
Biochem.209:20−31(1993)、タカシ(Takashi)
,Biochemistry.27:938−943(1988))、およびタ
ンパク質への非天然標識アミノ酸の取り込み(ノーレン(Noren)ら,Sc
ience.244−:182−188(1989))を含む。
チは、シグナルが固有に蛍光性であれば直接的であり、または例えば、シグナル
が標識抗体で引き続いて検出されなければならないエピトープであれば間接的で
有り得る。検出の様式は、限定されるものではないが、蛍光、ルミネセンスまた
はリン光の空間的位置:(1)強度、(2)偏光、(3)寿命、(4)波長、(
5)エネルギー移動、および(6)フォトブリーチング後の回復を含む。
間に生じた生成物から反応体を空間的に分離することである。反応体からの生成
物の分離は、バイオセンサー内のプロテアーゼ認識部位のタンパク質分解切断に
際して起こり、生成物が、反応体のものとは異なる細胞の区画に結合し、それに
拡散し、またはそれに輸入されるのを可能とする。この空間的分離は、生成物ま
たは固定細胞においてタンパク質分解プロセスを間接的に定量する手段を提供す
る。バイオセンサーのデザインは、バイオセンサーを細胞の区画に結合させ、ま
たはそこに輸入するタンパク質配列(「反応体標的配列」)によって反応体(未
切断バイオセンサー)を特定の区画に制限する手段を提供する。これらの区画は
、限定されるものではないが、いずれかの細胞構造、マクロ分子細胞成分、膜−
制限小器官、または細胞外空間を含む。タンパク質分解反応の特徴は、生成物濃
度を反応体濃度で割ったものに関係すると仮定すれば、生成物および反応体の空
間的分離は、単一細胞中の生成物および反応体を独自に定量する手段を提供し、
タンパク質分解活性のより直接的な測定を可能とする。
されたトランスフェクションおよび発現されたキメラタンパク質を介して細胞に
導入することができる。それらは、例えば、原核生物または真核生物発現系にお
ける生産によってあらかじめ形成することもでき、精製されたタンパク質は、限
定されるものではないが、マイクロインジェクション、スクレイプローディング
、エロクトロポレーション、シグナル配列媒介ローディングを含めた多数の物理
的メカニズムを介して細胞に導入される。
比率または差異:(a)強度−(b)偏光、または(c)反応体および生成物の
間の寿命を含むことができる。これらの後者の様式は、生成物および反応体の間
の適当な分光学的差異を要する。例えば、限定された移動性シグナルを含有する
反応体を非常に小さな移動成分および比較的大きな非移動性成分に分割すること
は偏光によって検出することができる。別の方法として反応体および生成物の間
のかなり異なる発光寿命は、イメージングおよび非イメージングの様式での検出
を可能とする。
1つの例はこのカスパーゼである。カスパーゼは、アポトーシスの間に広く種々
の標的のタンパク質分解切断を触媒するタンパク質のクラスである。アポトーシ
スの開始に続き、クラスII「下流」カスパーゼを活性化し、それは細胞の死滅
に至る経路における復帰なしの地点であり、その結果、下流の標的タンパク質が
切断される。具体的な例において、ここに説明するバイオセンサーは、カスパー
ゼ活性化の測定可能なインジケータとして切断されたGFPの核移動を用いるよ
うに作成された。加えて、天然に生じるタンパク質における二次構造形成に関与
する周囲のアミノ酸を取り込む特異的認識配列の使用は、このクラスのバイオセ
ンサーの特異性および感度を増加させることができる。
の別の例は亜鉛メタロプロテアーゼである。このクラスの2つの具体的な例は、
クロストリジウム(Clostridial)種(ボツリヌス菌(C.botu
linum)およびテタニー菌(C.tetani))および炭疽菌(Baci
llus anthracis.)に由来する生物学的トキシンである(エレロ
ス(Herreos)ら,In The Comprehensive Sou
rcebook of Bacterial Protein Toxins.
J.E.AloufおよびJ.H.Freer編,第2版,San Diego
,Academic Press,1999、202−228頁)。これらの細
菌は、真核生物細胞に侵入し、種々の標的タンパク質を特異的に切断する亜鉛メ
タロプロテアーゼを発現し、それを分泌する。例えば、炭疽菌(Bacillu
s anthracis)からの炭疽プロテアーゼは、アクセサリポア−形成タ
ンパク質を介して標的細胞の細胞質に送達され、そこで、そのタンパク質分解活
性は、マイトジェン活性化プロテアーゼキナーゼのキナーゼ1または2(MEK
1またはMEK2)の切断を通じてMAP−キナーゼシグナリングカスケードを
不活性化する(Leppla,S.A.In the Comprehensi
ve Sourcebook of Bacterial Protein T
oxins.J.E.AloufおよびJ.H.Freer編,第2版,San
Diego,Academic Press,1999、243−263頁)
。ここに記載されたトキシンバイオセンサーは、反応体標的化を達成するために
、これらおよび他の標的タンパク質の天然細胞下局所化を利用する。切断に際し
て、シグナル(生成物標的配列を含むまたは含まない)は反応対から分離されて
高含有量バイオセンサーを生じる。
この構築物のいずれかにおける適切なプロテアーゼ認識部位の置換によって、プ
ロテアーゼのカスパーゼファミリーのいずれかのメンバー、ならびにいずれかの
他のプロテアーゼの活性を報告することができるのを認識するであろう(図29
B参照)。これらのバイオセンサーは、高含有量スクリーニングで用いて、酵素
活性のインビボ活性化を検出し、既知の認識モチーフの切断にもどいて特異的活
性を同定することができる。このスクリーニングは生細胞および固定終点アッセ
イ双方で用いることができ、さらなる測定と組み合わせてマルチパラメータアセ
イを提供することができる。
酸配列、 b.少なくともつのプロテアーゼ認識部位をコードする第2の核酸配列、ここ
に、第2の核酸配列は、少なくともふつの検出可能なポリペプチドシグナルをコ
ードする第1の核酸配列に作動可能に連結され、および c.少なくとも1つの反応体標的配列をコードする第3の核酸配列、ここに、
第3の核酸配列は、少なくとも1つのプロテアーゼ認識部位をコードする第2の
核酸配列に作動可能に連結し、 を含む、プロテアーゼバイオセンサーをードする組換え核酸を提供する。
ードする第2の核酸配列によって分離されている。
核酸は少なくとも1つの生成物標的配列をコードする第4の核酸配列を含み、こ
こに、第4の核酸配列は、少なくとも1つの検出可能なポリペプチドシグナルを
コードする第1の核酸配列に作動可能に連結している。
核酸は、少なくとも1つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第5の
核酸配列を含み、ここに、第5の核酸配列は、反応体表解き配列をコードする第
3の核酸配列に作動可能に連結している。
質、ルミネセンスタンパク質、および配列エピトープからなる群から選択される
。最も好ましい実施形態において、ポリペプチド配列をコードする第1の核酸は
配列番号:35、37、39、41、43、45、47、49および51からな
る群から選択される配列を含む。
酸は配列番号:53、55、57、59、61、63、65、67、69、71
、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95
、97、99、101、103、105、107、109、111、113、1
15、117、119および121からなる群から選択される配列を含む。別の
好ましい実施形態において、反応体標的配列をコードする第3の核酸は配列番号
:123、125、127、129、131、133、135、137、139
、141、143、145、147、149および151からなる群から選択さ
れる配列を含む。
換え核酸は配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、2
1、23、25、27、29、31および33よるなる群から選択される配列と
実質的に同様の配列を含む。
配列を含む組換え発現ベクターを提供する。なおさらなる態様において、本発明
は、本発明の組換え発現ベクターでトランスフェクトされている遺伝子工学作成
宿主細胞を提供する。
、 b.少なくとも1つのプロテアーゼ認識部位を含む第2のドメイン、および c.少なくとも1つの反応体標的配列を含む第3のドメイン、 を含み、ここに、この第1のドメインおよび第3のドメインは第2のドメインに
よって分離されていることを特徴とする組換えプロテアーゼバイオセンサーを提
供する。
生成物の再分布は活性化(すなわち、プロテアーゼ切断)後に起こるという概念
でる。この再分布は生成物および反応体の完全な隔離を必要としない。なぜなら
、生成物の分布は、生成物標的シグナルの不存在下で反応体分布と部分的に重複
することができるからである(以下参照)。
少なくとも1つの生成物標的配列を含み第4のドメインを含み、ここに、この第
4のドメインおよび第1のドメインは作動可能に連結しており、第2のドメイン
によって第3のドメインから分離されている。別の実施形態において、組換えプ
ロテアーゼバイオセンサーは、さらに、少なくとも1つの検出可能なポリペプチ
ドシグナルを含む第5のドメインを含み、ここに、この第5のドメインおよび第
3のドメインは作動可能に連結しており、第2のドメインによって第1のドメイ
ンから分離されている。
または第5ドメイン)は蛍光タンパク質、ルミネセンスタンパク質および配列エ
ピトープからなる群から選択される。最も好ましい実施形態において、検出可能
なポリペプチドシグナルドメインは、配列番号:36、38、40、42、44
、46、48、50および52からなる群から選択される配列を含む。
は、配列番号:54、56、58、60、62、64、66、68、70、72
、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96
、98、100、102、104、106、108、110、112、114、
116、118、120および122からなる群から選択される配列を含む。別
の好ましい実施形態において、反応体および/または標的配列ドメインは、配列
番号:124、126、128、130、132、134、136、138、1
40、142、144、146、148、150および152からなる群から選
択される配列を含む。
番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、2
6、28、30、32および34からなる群から選択される配列と実質的に同様
の配列を含む。
サーを保有して、プロテアーゼ活性に影響する化合物を同定することを含む、細
胞の自動分析の方法およびキットを提供する。この方法は、種々の可能なマルチ
パラメータアッセイにおいて、本発明の他の方法と組み合わせることができる。
少なくとも第1の検出可能なポリペプチドシグナルドメイン、少なくとも1つの
反応体標的ドメイン、および少なくとも1つのプロテアーゼ認識ドメインを含め
た複数ドメインから構成され、ここに、検出可能なシグナルドメインおよび反応
体標的ドメインはプロテアーゼ認識ドメインによって分離される。このように、
プロテアーゼ認識ドメインが反応体標的および第1の検出可能なシグナルドメイ
ンを分離する限り、分子中のドメインの正確な順序は一般的に臨界的ではない。
各ドメインでは、1以上の特定された認識配列が存在する。
/または反応体を適切な細胞区画に適切に標的化するのに臨界的であり得る。例
えば、生成物または反応体をペルオキシソームに標的化することは、ペルオキシ
ソーム標的化ドメインがこのタンパク質の最後の3つのアミノ酸を含むことを必
要とする。バイオセンサー内の標的化ドメインの相対的な配置が臨界的であるバ
イオセンサーの決定は、日常的な実験を通じて当業者が判断することができる。
図30に示される。当業者であれば、適当なコーディング配列をマルチドメイン
構築体に置き換えることによって、本発明のタンパク質バイオセンサーにおける
種々の組合せで、広く種々のプロテアーゼ認識部位、生成物標的配列、ポリペプ
チドシグナルおよび/または生成物標的配列の内のいずれか1つを用いることが
できるのを認識するであろう。そのような代替配列の非限定的な例は図29A−
図29Cに示される。同様に、当業者であれば、このドメインの機能を保持しつ
つ、このバイオセンサー内の各個々のドメインのコーディング配列およびアミノ
酸配列に対して修飾、置換および欠失をなすことができるのを認識するであろう
。個々のドメインのそのような種々の組合せおよび個々のドメインに対する修飾
、置換および欠失は本発明の範囲内のものである。
チド配列を「コードする」配列は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合にイ
ンビトロまたはインビボにてポリペプチドに転写(DNAの場合)および翻訳(
mRNAの場合)される核酸配列をいう。コーディング配列の境界は、5’(ア
ミノ)末端における開始コドンおよび3’(カルボキシ)末端における翻訳呈停
止コドンによって決定される。コーディング配列は、限定されるものではないが
、原核生物または真核生物mRNAからのcDNA、原核生物または真核生物D
NAからのゲノムDNA配列、および合成DNA配列を含むことができる。転写
終止配列は通常はコーディング配列の3’側に位置するであろう。
リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイ
ン、エンハンサー等を集合的にいい、これは宿主細胞におけるコーディング配列
の転写および翻訳を集合的に提供する。注目するDNA配列が適切に転写、翻訳
され得る限り、これらの制御配列の全てが組換えベクターに常に存在する必要は
ない。
素がその通常の機能を行うように配置される要素の配置をいう。このように、コ
ーディング配列に作動可能に連結した制御配列は、コーディング配列の発現を行
うことができる。その発現を指令するように機能する限り、制御配列はコーディ
ング配列に隣接する必要はない。このように、例えば、翻訳されていないが転写
された配列への介入は、プロモータ配列およびコーディング配列の間に存在させ
ることができ、プロモータ配列は依然として、コーディング配列に「作動可能に
連結している」と考えることができる。
レームにおいて発現できる場合、核酸コーディング配列は別の核酸コーディング
配列に作動可能に連結している。同一のリーディングフレームにおいて発現でき
る限り、核酸配列は隣接する必要はない。このように、例えば、コーディング領
域への介入は、特定された核酸コーディング配列の間に存在でき、特定された核
酸コーディング領域は、依然として、「作動可能に連結している」と考えること
ができる。
インの機能が保持される限り、いずれの長さのものであっても良い。一般に、こ
れは、介入タンパク質配列の二次元および三次元構造が、生成物または反応体の
標的化、注目するプロテアーゼのバイオセンサーへの結合、検出可能なポリペプ
チドシグナルの蛍光またはルミネセンス、または蛍光標識エピトープ−特異的抗
体の結合等の、バイオセンサーのドメインの結合または相互作用要件を排除しな
いことを要する。
蛍光共鳴エネルギー移動対を生じさせるのが目標の場合である。この場合、ドナ
ーおよびアクセプタの距離がエネルギー移動を可能とするのに十分小さければ、
FRETシグナルは存在する(Tsien ヘイム(Heim) および Cu
bbit,WO97/28261)。ドナーおよびアクセプタ部位の間の平均距
離は1nmおよび10nmの間であるべきであり、1nmおよび6nmの間が好
ましい。これは、ドナーおよびアクセプタの間の物理的距離である。ぺピチドの
三次元構造はドナーおよびアクセプタの間の物理的距離を決定するので、介入配
列の長さはかなり変動し得る。
産物の発現を行うことができるいずれかのプロモータに作動可能に連結するベク
ターを含む。プロテアーゼバイオセンサーの発現を駆動するのに用いられるプロ
モータ配列は構成的(限定されるものではないが、CMV、SV40、RSV、
アクチン、EFを含めた種々のプロモータのいずれかによって駆動される)、ま
たは誘導性(限定されるものではないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステ
ロイド−応答性を含めた多数の誘導プロモータのいずれかによって駆動される)
であって良い。発現ベクターは、エピソームとして、または宿主染色体DNAへ
の組込によって、宿主生物中で複製可能でなければならない。好ましい実施形態
において発現ベクターはプラスミドを含む。しかしながら、本発明はウイルスベ
クター等のいずれかの他の適当な発現ベクターを含むことを意図する。
または置換を含めた、ここに開示するプロモータバイオセンサー配列からの1以
上の保存的または非保存的変形を有する、DNAのヌクレオチド配列、またはタ
ンパク質のアミノ酸配列を参照する場合に用い、ここに、得られた核酸および/
またはアミノ酸配列はここに開示し特許請求する配列と機能的に同等である。機
能的に同等な配列は、実質的に同一に機能して、ここに開示し特許請求する核酸
およびアミノ酸組成物と実質的に同一のプロテアーゼバイオセンサーを生じる。
例えば、機能的に同等なDNAは、ここに開示するものと同一である、または他
の非極性残基に代えての非極性残基の置換または同様に荷電した残基に代えての
荷電残基の置換、機能には臨界的でないプロテアーゼバイオセンサーの領域への
負荷/この領域からの欠失等の、1以上の保存的アミノ酸変形を有するプロテア
ーゼバイオセンサーをコードする。これらの変化は、タンパク質の三次構造を実
質的に変更しない置換、欠失および/または負荷として当業者に認識されている
ものを含む。
列は、少なくとも70%−75%同一性、より好ましくは80−85%同一性、
最も好ましくは90%−95%同一性を保有する。しかしながら、(遺伝子暗号
の縮重により)上述したレベル未満の相同性を含む,または保存的アミノ酸置換
(または縮重コドンの置換)によって修飾されたそのタンパク質(およびそのよ
うなタンパク質をコードするDNAおよびmRNA)は本発明の範囲内にあると
考えることができると認識される。
する場合には、組換え構築体の領域に通常は結合しておらず、および/または特
定の細胞に通常は会合していない配列を示す。このように、核酸構築体の「異種
」領域は、天然では他の分子と会合して見出されない別の核酸分子内にあるまた
はそれに付着した核酸の同定可能なセグメントである。例えば、構築体の異種領
域は、天然ではコーディング配列と会合して見出されない配列によって近接挟ま
れたコーディング配列を含み得る。異種コーディング配列の別の例は、コーディ
ング配列それ自体が天然で見出されない構築体である(例えば、天然遺伝子とは
異なるコドンを有する合成配列)。同様に、通常は宿主差異ぼに存在しない構築
体で形質転換した宿主細胞は本発明の目的では異種と考えられるであろう。
loning:A Laboratory Manual(Sambrookら
,1989,Cold Spring Harbor Laboratoy P
ress),Gene Expression Technology(Met
hods in Enzymology,Vol.185,D.Goeddel
編,1991,Academic Press,San Diego,CA),
「Guide to Protein Purificaion」in Met
hods in Enzymology(M.P.Deutshcer編,(1
990)Academic Press,Inc.)、PCR Protoco
ls:A Guide to Methods and Applicatio
n(Innisら,1990,Academic Press,San Die
go,CA),Culture of Animal Cells:A Man
ual of Basic Techniques第2版(R.I.Fresh
ney.1987.Liss,Inc.New York,NY),Gene
Transfer and Expression Protcols,109
−128頁,E.J.Murray編,The フー(Hu)mana Pre
ss Ins.,Clifton,N.J.),およびthe Ambion
1998 Catalog(Ambion Austin,TX)等のいくつか
の良く知られた文献のいずれかで見出すことができる。
構築し、それを用いて宿主細胞をトランスフェクトする。その全部が本発明の範
囲内にあるいずれかの数のそのような技術を用いて、プロテアーゼバイオセンサ
ー−をコードするDNA構築体およびこのバイオセンサーを発現する遺伝子的に
トランスフェクトされた宿主細胞を得ることができる。以下の非限定的実施例は
、本発明のバイオセンサーを構築するための1つのそのような技術を示す。
イオセンサーが、4つのプライマー(2つのセンスおよび2つのアンチセンス)
の組を用いて構築された。これらのプライマーはその末端に重複する領域を有し
、プライマーウォーキング技術を介してPCRで用いられる(Sambrook
,J.,Fritch,E.F.およびManiatis,T.(1989)M
olecular Cloning:A Laboratoy Manual.
Cold Spring Harbor Laboratoy Press,C
old Spring Harbor,New York)。2つのセンスプラ
イマーを選択して、GFP−含有ベクター(クローンテック(Clontech
),California)の5’ポリリンカー(BspI)から示されたバイ
オセンサー配列の中央にかけて出発した。2つのアンチセンスプライマーは3’
GFPベクター部位BamHIから出発し、中央の12個のヌクレオチドだけセ
ンスプライマーと重複する。
ングのための30秒間の55℃、および延長のための30秒間の75℃で15サ
イクル。このプライマーは両方の端部に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、得
られたPCR産物の引き続いてのクローニングを容易とする。
amH1制限部位で切断し、得られた断片をゲル精製した。同様に、GFPベク
ター(クローンテック(Clontech),San Francisco,C
A)をポリリンカー中のBspE1およびBamH1部位で消化した。GFPベ
クターとPCR産物の連結は、標準的な技術を用いて16℃にて一晩行った。大
腸菌細胞は標準的な技術を用いて連結混合物でトランスフェクトした。トランス
フェクトした細胞は適当な抗生物質を含むLB−寒天で選択した。
で、10%胎児ウシ血清、1mM L−グルタミン、50μg/mlストレプト
マイシン、50μg/mlペニシリン、0,1mM非必須アミノ酸1mMピルビ
ン酸ナトリウムおよび(MCF−7細胞のみについては)10μg/mlを含む
3mlの最小イーグル培地(MEM)を含有する6ウェルプレート中で、DNA
トランスフェクションのために、BHK細胞およびMCF−7細胞を約36時間
で50−70%密集まで培養した。細胞を無血清MEM培地で洗浄し、無血清M
EM培地中に1μgの適当なプラスミドおよび4μgのリポフェクタミン(BR
L)を含有する1mlのトランスフェクション混合物と共に5時間インキュベー
トした。引き続いて、トランスフェクション培地を除去し、3mlの通常培養基
で置き換えた。標準的な分子生物学的方法(Ausubelら,1995)に基
づいて安定な細胞の選択を行う前に、このトランスフェクトした細胞を増殖培地
中に少なくとも16時間維持した。
オセンサー発現ベクターで安定にトランスフェクトした細胞(BHK,MCF−
7)を、50−60%密集にて、組織培養処理96−ウェルプレート上で平板培
養し、37℃、5%CO2にて一晩培養した。通常の培養基中の変更する濃度の
シスプラチン、スタウロスポリンまたはパクリタキセルをストックから新たに調
製し、細胞培養皿に添加して、古い培養基を置き換えた。次いで、生細胞実験と
して、または固定終点実験として、示された時点において、本発明の細胞スクリ
ーニングシステムで細胞を観察した。
ー(pljkGFP) このバイオセンサーのデザインは図31に概略を示し、その配列は配列番号:
1および2に示す。
CYTO): 1) TCA TCA TCC GGA GCT GGA GCC GGA GCT GGC CGA TCG GCT GTT AAA TCT GAA GGA AAG AGA AAG TGT GAC GAA GTT GAT GGA ATT GAT GAA GTA GCA(配列番号:153) 2) GAA GAA GGA TCC GGC ACT TGG GGG TGT AGA ATG AAC ACC CTC CAA GCT GAG CTT GCA CAG GAT TTC GTG GAC AGT AGA CAT AGT ACT TGC TAC TTC ATC(配列番号:154
) 3) TCA TCA TCC GGA GCT GGA(配列番号:155
) 4) GAA GAA GGA TCC GGC ACT(配列番号:156
) このバイオセンサーは反応体標的配列によって細胞質に制限される。反応体標
的配列はアネキシンII細胞骨格結合ドメインである(MSTVHEILCKL
SLEGVHSTPPSA)(配列番号:124)(図29C)(エーベルハル
ト(Eberhard)ら,1997,Mol.Biol.Cell 8:29
3a)。酵素認識部位は2コピーのアミノ酸DEVD(配列番号:60)(図2
9B)に対応し、これはカスパーゼ−3の認識部位として働く。天然に生じるプ
ロテアーゼ認識部位からの異なる数のプロテアーゼ認識部位および/またはさら
なるアミノ酸を持つ他の例は以下に示す。シグナルドメインはEGFP(配列番
号:46)(図29A)(クローンテック(Clontech),Califo
rnia)である。親バイオセンサー(反応体)は、アネキシンIIドメインを
細胞骨格に結合させることによって細胞質に制限され、したがって、核から排除
される。カスパーゼ3によるプロテアーゼ認識部位の切断に際して、シグナルド
メイン(EGFP)が反応体標的化ドメインから放出され(アネキシンII)、
これは全容量の細胞を通じて分布する。なぜなればそれはいずれかの特定の標的
化配列を欠き、受動的に核に侵入するのに十分小さいからである(図32)。
ることによって測定される(前述を参照)。この応答の測定は、積分もしくは平
均核領域強度、積分もしくは平均核強度に対する積分もしくは平均細胞質強度の
比率または差異を含めたいくつかの様式の内の1つによる。核はヘキスト(Ho
echst)33342等のDNA−特異的色素を用いて規定される。
分解活性の尺度を提供する。細胞骨格の分散された性質およびサイトゾルの酵素
の効果的に拡散した状態を仮定すれば、これは、一般に、細胞質の効果的な尺度
を提供する。
胞中でのシスプラチンによるアポトーシスの刺激の前および後におけるイメージ
を示す。このイメージは核中の蛍光の蓄積を明瞭に示す。蛍光の空間的変化の創
製は非可逆的であり、このように、このアッセイのタイミングは柔軟的である。
このバイオセンサーについての制御は、カスパーゼ−3−特異的部位が省かれた
バージョンの使用を含む。加えて、引き続いて細胞が丸くなる細胞骨格の破壊は
蛍光分布の変化を生じなかった。我々の実験は、核凝縮とカスパーゼ活性の活性
化との相関を示す。また、我々は、MCF−7細胞においてこのバイオセンサー
をテストした。最近の報告では、PARPの切断を伴うMCF−7細胞のエトポ
シドの刺激から6時間後にカスパーゼ−3活性においてピーク応答が測定されて
いる(ベンジャミン(Benjamin)ら,1998,Mol Pharma
col.53:446−50)。しかしながら、別の最近の報告は、MCF−細
胞がカスパーゼ−3活性を保有せず、事実、カスパーゼ−3遺伝子は機能的に欠
失されていることを見出している(イェーニッケ(Janicke)ら,199
8,J.Biol.Chem.273,9357−60)。カスパーゼ−3活性
は、100μMのエトポシドでの15時間の処理の後にMCF−7細胞でカスパ
ーゼバイオセンサーにて検出されなかった。
通常の基質の多くがスタウロスポリンでの処理に際してMCA−7細胞で切断さ
れたことを示した。我々の実験は、カスパーゼ活性が、スタウロスポリンで処理
された場合にMCF−7細胞でバイオセンサーを用いて測定できることを示す。
スタウロスポリンによる活性の最大の大きさは、BHK細胞においてシスプラチ
ンで示されたもののほぼ半分であった。また、これは、カスパーゼ−3−特異的
であるように設計されたが、現行のバイオセンサーは、事実、カスパーゼ−3に
対して独自に特異的であるよりもむしろカスパーゼのあるクラスに対して特異的
であることを意味する。もっともありそうな候補はカスパーゼ−7である(イェ
ーニッケ(Janicke)ら,1998)。また、これらの実験は、バイオセ
ンサーがマルチパラメータ実験で使用できることを示し、ミトコンドリア膜ポテ
ンシャル、核凝縮およびカスパーゼ減少の相関がある。
リタキセルの効果をテストした。BHKおよびMCF−7細胞におけるカスパー
ゼ活性はパクリタキセルによって刺激された。また、カスパーゼの活性化は核形
態の変化後に起こったように見える。1つの抗議は、この考察に基づき、このア
ッセイにおいてバイオセンサーによって報告されたカスパーゼ活性は、カスパー
ゼ−3および、少なくともカスパーゼ−7の活性の組合せによるものらしいとい
うことである。
パクリタキセルもまたカスパーゼ活性の活性化を刺激した。その大きさはスタウ
ロスポリンのものと同様であった。この実験は先の実験よりもかなりせまい範囲
のパクリタキセルを用い、ここに、核凝縮はこの応答を支配するように見える。
オセンサー(CP8GFPNLS−SIZEPROJ) 反応体を細胞質に制限するための別のアプローチは、バイオセンサーを核ポア
を貫通するにはあまりにも大きくすることである。そのようなバイオセンサーの
切断は、核に拡散することができる生成物を遊離する。
(配列番号:142)(図29C)(CP8GFPNLS−SIZEPROJ)
を用いて提供される。MAP4の突出ドメインはそれ自体上の微小管と相互作用
せず、発現されると細胞質を通じて拡散により分布するが、そのサイズ(〜12
0kD)のため核から排除される。このように、このバイオセンサーは全長MA
P4配列を用いるものとは区別される(以下参照)。当業者であれば、限定され
るものではないが、いずれかのGFPの複数コピー、または活性なNLSを欠き
、核への拡散のための最大サイズを超える(ほぼ60kD、Alberts,B
.,Bray,D.,Raff,M.,Roberts,K.,Watson,
J.D.(編)Molecular Biology of the Cell
,第3版,New York:Garland publishing,199
4.561−563頁)いずれかの他のタンパク質の1以上のコピーを含めた多
くの他のそのようなドメインが、MAP4突出ドメインに代えて置き換えること
ができるのを認識するであろう。得られたバイオセンサーの完全な配列は配列番
号:3−4に示す。異なるプロテアーゼ認識ドメインを持つ同様のバイオセンサ
ーは配列番号:5−6に示す。
ことによって核から反応体を能動的に制限することである。そのようなバイオセ
ンサーの切断は、核へ拡散できる生成物を遊離する。
れる亜鉛メタロプロテアーゼタンパク質複合体を発現する。ヒトマイトジェン活
性化プロテインキナーゼのキナーゼ1(MEK1)(Segerら,J.Bio
l.Chem.267:25628−25631,1992)は、アミノ酸8の
後で切断された炭疽プロテアーゼ認識部位(アミノ酸1−13)(配列番号:1
02)(図29B)、並びにアミノ酸32−44における核輸出シグナル(配列
番号:140)(図29C)を保有する。ヒトMEK2(ZhengおよびGu
an,J.Biol.Chem.268:11435−11439,1993)
は、アミノ酸残基1−16を含む炭疽プロテアーゼ認識部位(配列番号:104
)(図29B)およびアミノ酸36−48における核輸出シグナル(配列番号:
148)(図29C)を保有する。
:48)(図29A)、炭疽プロテアーゼ認識部位、MEK1またはMEK2か
らの核輸出シグナル(配列番号:7−8(MEK1)、9−10(MEK2))
を含む。無傷バイオセンサーは、この各輸出シグナル(例えば、反応体標的部位
によって細胞質に保持されるであろう)。炭疽プロテアーゼによる融合タンパク
質の切断に際して、NESはGFPから分離され、GFPを核に拡散させる。
いて、核局所化配列(NLS)等の、制限されるものではないが図29Cにおけ
るものを含めた生成物標的化配列はシグナル配列に作動可能に連結でき、このよ
うに、シグナル配列が、タンパク質分解切断後に反応体標的ドメインから分離す
るようにする。反応体標的ドメインと作動可能に連結した、限定されるのではな
いが図29Aにおけるものを含めた第2の検出可能なシグナルドメインの付加は
、複数手段による反応の測定を行うのに有用である。そのようなバイオセンサー
の具体的な例を以下に示す。
−12に示される。以下のオリゴヌクレオチドを用いた以外は、上述したように
にPCRおよびクローニング手法を行った。
NLS−CYTO): 1) TCA TCA TCC GGA AGA AGG AAA CGA CAA AAG CGA TCG GCT GTT AAA TCT GAA GGA AAG AGA AAG TGT GAC GAA GTT GAT GGA ATT GAT GAA GTA GCA(配列番号:157) 2) GAA GAA GGA TCC GGC ACT TGG GGG TGT AGA ATG AAC ACC CTC CAA GCT GAG CTT GCA CAG GAT TTC GTG GAC AGT AGA CAT AGT ACT TGC TAC TTC ATC(配列番号:154
) 3) TCA TCA TCC GGA AGA AGG(配列番号:158
) 4) GAA GAA GGA TCC GGC ACT(配列番号:156
) プロテアーゼ認識部位の認識および切断に際して、生成物が放出され、このシ
グナルに付着した核局所化配列RRKRQK(配列番号:128)(図29C)
(ブリッグズ(Briggs)ら,J.Biol.Chem.273:2274
5,1998)の存在のためこのシグナルは核に特異的に蓄積する以外は、この
バイオセンサーは配列番号:2に示したものと同様である。この構築体の特別の
利点は、生成物が明らかに反応体から分離されることである。反応体は細胞質に
止まるが、酵素反応の生成物は核区画に制限される。応答は、上述したように、
シグナルの効果的な細胞質から核への移動を定量することによって測定される。
的配列はバイオセンサーの活性化(例えば、プロテアーゼ切断)に先だって支配
的であるはずである。これを達成するための1つの方法は、プロテアーゼ切断後
までに親バイオセンサーにおける生成物標的化配列をマスクすることによる。そ
のような例の1つにおいて、生成物標的配列は、ポリペプチド鎖の末端に比較的
近い場合にのみ(すなわち、プロテアーゼ切断後)機能的である。別の方法とし
て、その三次構造がプロテアーゼ切断後まで標的配列の機能をマスクするように
バイオセンサーをデザインすることができる。これらのアプローチは共に標的化
配列を標的化のために異なる相対的長さと比較することを含む。核局所化配列(
NLS)およびアネキシンII配列の例を用い、異なる長さのNLSを、親バイ
オセンサーの細胞質制限に基づくクローン選択で試した。活性化に際して、生成
物標的化配列は、当然に、その結合した検出可能な配列ドメインの局所化を支配
するであろう。なぜならば、それは次いで反応体標的化配列から分離させるから
である。
うに、細胞のより小さな領域に濃縮されるからである。このように、生成物の増
大した濃度のため、より少量の生成物が検出可能である。この濃度効果は、反応
体の細胞濃度に対して比較的非感受性である。そのような測定のシグナル−対−
ノイズ比率(SNR)はバイオセンサー番号1のより分散された分布よりも改良
される。
ゼ認識配列(配列番号:74)(図29B)いずれかを取り込む同様のバイオセ
ンサーは、以下のプライマー組を用いる以外は上述した方法を用いて作成するこ
とができる。
NLS−CYTO) 1) TCA TCA TCC GGA AGA AGG AAA CGA CAA AAG CGA TCG ACA AGA CTT GTT GAA ATT GAC AAC(配列番号:159) 2) GAA GAA GGA TCC GGC ACT TGG GGG TGT AGA ATG AAC ACC CTC CAA GCT GAG CTT GCA CAG GAT TTC GTG GAC AGT AGA CAT AGT ACT GTT GTC AAT TTC(配列番号:160
) 3) TCA TCA TCC GGA AGA AGG(配列番号:158
) 4) GAA GAA GGA TCC GGC ACT(配列番号:156
) カスパーゼ8についてのプライマー、生成物標的配列=NLS(CP8GFP
NLS−CYTO) 1) TCA TCA TCC GGA AGA AGG AAA CGA CAA AAG CGA TCG TAT CAA AAA GGA ATA CCA GTT GAA ACA GAC AGC GAA GAG CAA CCT TAT(配列番号:161) 2) GAA GAA GGA TCC GGC ACT TGG GGG TGT AGA ATG AAC ACC CTC CAA GCT GAG CTT GCA CAG GAT TTC GTG GAC AGT AGA CAT AGT ACT ATA AGG TTG CTC(配列番号:162
) 3) TCA TCA TCC GGA AGA AGG(配列番号:158
) 4) GAA GAA GGA TCC GGC ACT(配列番号:156
) 得られたバイオセンサーの配列を配列番号:13−14(カスパーゼ6)およ
び配列番号:15−16(カスパーゼ8)に示す。さらに、プロテアーゼ認識部
位の複数コピーをバイオセンサーに挿入し、配列番号:17−18(カスパーゼ
3)および配列番号:19−20(カスパーゼ8)に示されたバイオセンサーが
得られる。
メインを用いる。この例では、全長MAP4は反応体標的配列として働く。認識
および切断に際して、反応体標的配列を含有する反応の1つの生成物はそれ自体
の唯一のシグナルで細胞質中の微小管に結合したままであり、他方、生成物標的
配列を含有する他の生成物は核に拡散する。このバイオセンサーは一度に2つの
活性を測定する手段を提供する:シグナリングカスケードに応答した、核および
微小管細胞骨格一体へのGFPの移動を用いるカスパーゼ3活性は、MAP4反
応体標的配列によってモニターして、アポトーシスの間に開始された。
ンパク質MAP4(配列番号:152)(図29C)を含む反応体標的配列によ
って微小管細胞骨格に連結されていることである。この場合、DEVD(配列番
号:60)(図29B)認識モチーフは、反応体標的配列に作動可能に連結した
EYFPシグナル(配列番号44)(図29A)、並びにMAP4のC−末端に
作動可能に連結したEDFPシグナル(配列番号:48)(図29A)の間に位
置する。得られたバイオセンサーは配列番号:21−22に示される。
S等の、生成物標的化ドメインを含むことができる。
放出し、これは(NLSによって指令され)核への移動を受ける。また、カスパ
ーゼ−3によるタンパク質分解後に依然として無傷であるMAP4は、バイオセ
ンサーのC−末端に融合した第2のGFP分子を介して、アポトーシスのプロセ
スの間に微小管細胞骨格の一体性について報告し続ける。したがって、この単一
キメラタンパク質は、種々の剤によって誘導されたアポトーシスの間のカスパー
ゼ−3活性および重合状態の同時分析を可能とする。また、このバイオセンサー
は微小管細胞骨格に特異的に標的化する潜在的薬物候補の分析で有用である。な
ぜなら、微小管に影響するに加えて、特定の薬物がアポトーシスを誘導したか否
かを判断することができるからである。
グナル1への蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、および生成物についてのシ
グナル局所化、シグナル1の核蓄積を潜在的に組み合わせる。また、FRETに
おける喪失の大きさによって生じた生成物の量が示されるが、これは、反応体の
FRET検出および生成物の空間的局所化の組合せよりも小さなSNRであろう
。
なり重複する場合にのみ起こり得る(dos Remedios,C.G.,お
よびP.D.Moens,1995,蛍光共鳴エネルギー移動分光学は、タンパ
ク質における構造変化を測定できるため信頼性のある「ものさし」である。知ら
れていないオリエンテーション因子の問題の払拭、Emmanouilidou
,E.,A.G.Teschemacher,A.E.Prouli,L.I.
Nicholls,E.P.Seward,およびG.A.Rutter.19
99.組換え目標カメレオンを備えた分泌気孔表面でのCa(2+)の濃度変化
のイメージング。Curr Biol.9:915−918)。ドナーおよびア
クセプタ分子の間の平均物理的距離は1nmおよび10nmの間であるべきであ
り、1nmおよび6nmの間が好ましい。ペプチドの三次元構造はドナーおよび
アクセプタの間の物理的距離を決定するので、介入配列長さはかなり変化し得る
。このFRETシグナルは、(1)アクセプタの存在下でのドナーの消光の量、
(2)ドナーを励起した場合のアクセプタ発光の量、および/または(3)ドナ
ーおよびアクセプタの発光の間の比率として測定することができる。別の方法と
して、ドナーおよびアクセプタの蛍光および寿命を測定することができる。
ンサーに価値を付け加える。この配列は、原形質膜の内部表面等の区画において
、活性のより直接的な読み出しのための細胞の特異的区画へのバイオセンサーの
設置を可能とする。
第1のシグナルは反応の別の生成物を表す。このように、酵素反応は、それが(
1)核強度、(2)核/細胞質比率、(3)核/細胞質FRET比率、(4)細
胞質/細胞質FRET比率として表すことができる点で柔軟性を付け加えた。
ろ空間的位置に基づく点で以前のFRET−ベースのバイオセンサー(WO97
/28261、WO9837226参照)とは異なる。反応の生成物は反応体か
ら分離される。測定されるのは空間的位置におけるこの変化である。FRET−
ベースのバイオセンサーはドナーおよびアクセプタ対の分離に基づくが、次の区
画に対してはそうではない。強度の変化は、タンパク質分解切断に際してのドナ
ーおよびアクセプタの物理的分離による。FRET−ベースのバイオセンサーの
不利な点は、(1)SNRがかなり低く、測定が困難であり、(2)シグナルが
固定できないことである。それは生細胞を用いて記録されなければならない。例
えばホルムアルデヒドでのか化学的固定は親および得られたシグナル双方を保持
できる、(3)波長の範囲は制限され、2つのフルオロフォアまたはフルオロフ
ォアおよび発色団の存在のためスペクトルの大きな範囲をカバーする、(4)構
築は、ドナーおよびアクセプタが正確に配置されて、距離が1−10nm内に入
ることを保証しなければならない点で大きな制限を有する。
を濃縮する能力、(2)生細胞または固定細胞いずれかで使用される能力、(3
)単一の蛍光シグナルが必要なのに過ぎない、(4)バイオセンサーのドメイン
の配置がより柔軟であることを含む。位置バイオセンサーの適応における唯一の
制限因子は、反応体区画および生成物区画の間の差異を分解するのに十分な空間
的分解能を持つイメージング方法を必要とするシグナルの空間的位置を規定する
必要性である。
含めた、プロテアーゼ認識配列および反応体標識配列のための適当な置換を単に
なすことによって、このアプローチを適合させていずれかの所望の活性の組合せ
を報告することができるのを認識するであろう。
NUC−CYTO) (図34に示された)このアプローチはカスパーゼ−8活性の検出にバイオセ
ンサーを利用する。このバイオセンサーでは、核小体局所化シグナル(RKRI
RTYLKSCRRMKRSGFEMSRPIPSHLT)(配列番号:130
)(図29C)(Uekiら,Biochem.Biophys.Res.Co
mm.252:97−100,1998)を生成物標識配列として用い、これは
後記するプライマーを用いてPCRによって作成した.PCR産物BspE1お
よびPvu1で消化し、ゲル精製した。ベクターおよびPCR産物を上述したよ
うに連結した。
C−CYTO) 1) TCA TCA TCC GGA AGA AAA CGT ATA CGT ACT TAC CTC AAG TCC TGC AGG CGG ATG AAA AGA(配列番号:163) 2) GAA GAA CGA TCG AGT AAG GTG GGA AGG AAT AGG TCG AGA CAT CTC AAA ACC ACT TCT TTT CAT(配列番号:164) 3) TCA TCA TCC GGA AGA AAA(配列番号:165
) 4) GAA GAA CGA TCG AGT AAG(配列番号:166
) 得られたバイオセンサーの配列を配列番号:23−24に示す。このバイオセ
ンサーはカスパーゼー8についてのプロテアーゼ認識部位(配列番号:74)(
図29B)を含む。同様のバイオセンサーはカスパーゼ−3についてのプロテア
ーゼ認識部位(配列番号:25−26)を利用する。
するために標的化された同一の生成物シグナル色を保有する他のバイオセンサー
で用いることができる。各バイオセンサー反応の生成物は、生成物標的化配列に
基づく生成物の分離のため独自に測定することができる。CP8GFPNUC−
CYTOおよびCP3GFPNLS−CYTOからの双方の生成物は、異なる空
間的位置(核対核小体)のため分離可能であるが、生成物の色は正確に同一であ
る。2つのシグナルの空間的重複を回避するための非核小体、核領域の評価は、
CP8GFPNUCの存在下でCP3GFPNLSの測定を行う。核シグナルか
らの核小体領域の喪失は重要ではなく、SNRに有意には影響しない。同一の生
成物色を用いる複数パラメータの評価の原理は、生細胞で同時に評価することが
できるパラメータの数をかなり拡張する。この概念は、他の非重複生成物標的区
画まで拡大することができる。
ンに対する抗体(Lischeweら,1981,Exp.Cell Res.
136:101−109)を含めた、核小体−特異的マーカに基づく核小体に対
応するマスクを規定し、(2)反応体標的区画に対するマスクを規定し、(3)
これらの2つの区画の間のシグナルの相対的分布を測定することによって行う。
この相対的分布は、2つの強度の差異、または好ましくは、区画の間の強度の比
率によって表すことができる。
る。各シグナルは、各生成物標的区画におけるシグナルの量を単に決定すること
によって測定できるが、各反応体が独自に同定され定量されれば、より高いSN
Rが可能であろう。このより高いSNRは、蛍光特性を対比する第2のシグナル
ドメインを付加することによって最大化することができる。この第2のシグナル
は、生成物標的化配列に作動可能に連結したシグナルドメインによって、または
FRET(上記参照)によってまたは色、空間的位置、または限定されるもので
はないが、偏光または寿命を含めた蛍光特性に基づいて反応体区画内でそれを独
自に同定する反応体標的化配列によって生じさせることができる。別の方法とし
て、細胞質等の大きな区画では、同一区画の異なる部分に異なる点同一のバイオ
センサーを置くのが可能である。
つプロテアーゼバイオセンサー 別の例において、反応体のサイズを増加させる(CP8YFPNLS−SIZ
ECFPn)は、第2のシグナル配列の複数挿入、例えば、ECFP(配列番号
:50)(図29C)(Tsien,R.Y,1998,Annu Rev B
iochem.67:509−44)を用いることによって達成される。このよ
うに、第2のシグナル配列の複数コピーは、核へ拡散するバイオセンサーの能力
を排除することによって反応体標的ドメインとして働く。このタイプのバイオセ
ンサーは、バイオセンサー分子あたりの利用できるさらなるシグナルの付加的利
点を提供する。また、複数ルミネセンスプローブの集合の結果、RFET、自己
消光、エキサイマー形成等の、発言される唯一のシグナルがもたらされ得る。こ
れは反応体に唯一のシグナルを提供できる。
結し、別のプロテアーゼ認識部位を用いる。破傷風/ボツリヌスバイオセンサー
(配列番号:27−28)(セルブレビン)、29−30(シナプトブレビン)
は、NLS(配列番号:128)(図29C)、Fret25シグナルドメイン
(配列番号:52)(図29A)、セルブレビン(配列番号:106)(図29
B)(マクマホーン(McMahon)ら,Nature 364:346−3
49,1993、マーティン(Martin)ら,J.Cell Biol.,
in press)またはシナプトブレビン(配列番号:108)(図29B)
(GenBank Accession #U64520)からの破傷風または
ボツリヌス亜鉛メタロプロテアーゼ認識部位、および細胞小胞へバイオセンサー
を連結する3’−末端におけるセルブレビン(配列番号:146)(図29C)
またはシナプトブレビン(配列番号:144)(図29C)からの膜貫通配列か
らなる。各タンパク質のN−末端は細胞質に向けられる。無傷バイオセンサーに
おいて、GFPは小胞に連結される。破傷風またはボツリヌス亜鉛メタロプロテ
アーゼによる切断に際しGFPは小胞ともはや会合せず、遊離されて細胞質およ
び核全体に拡散する。
2のシグナルドメインを持つカスパーゼ3バイオセンサー このバイオセンサーのデザインは図35に概略が示され、配列は配列番号:3
3−34に示される。このバイオセンサーは、反応体標的配列に作動可能に連結
した第2の検出可能なシグナルECFP(配列番号:50)(図29A)(シグ
ナル2)を含めることによって配列番号:11−12とは異なる。
グナルドメインを持つカスパーゼ−3バイオセンサー(CP3YFPNLS−C
FPCYTO) このバイオセンサー(配列番号:31−32)においては、NLS生成物標的
化ドメイン(配列番号:128)(図29C)はEYFPシグナルドメイン(配
列番号:44)(図29A)の上流に存在する。DEVDプロテアーゼ認識ドメ
イン(配列番号:60)(図29B)は、EYFPシグナルドメインの後および
MAP4突出ドメイン(配列番号:142)(図29C)の前の間にある。
学的プロセスを変更するいずれかの生物、マクロ分子、または有機もしくは無機
の分子もしくはイオン、あるいは既知の生理学的プロセスのモジュレータに対す
る生理学的応答を変更するいずれかの生物、マクロ分子、または有機もしくは無
機の分子もしくはイオンをいう。このように、トキシンは正常な細胞の刺激体を
模倣することができるか、あるいは正常な細胞刺激体に対する応答を変更するこ
とができる。
る毒性剤の標的である。トキシン検出、分類および同定に対する細胞−ベースの
アプローチは、その外部媒体中の微小な変化を検知する細胞によって発達された
感度が良くて特異的な分子検出および増幅系を開発するであろう。細胞の進化し
た検知能力と本明細書中に記載したルミネセンスレポータ分子およびアッセイと
を組み合わせることによって、毒性剤によって引き起こされた細胞内分子および
化学事象を検出可能な空間および時間ルミネセンスシグナルに変換することがで
きる。
細胞内区画内になるかを問わず、このトキシンは細胞内で活性な分子経路の1以
上の成分を不可避的に害する。細胞は相互結合した分子経路の複雑なネットワー
クから構成されるので、トキシンの効果は多くの細胞経路を通じて伝達されるよ
うである。したがって、我々の戦略は、限定されるものでないが、細胞ストレス
経路、代謝経路、シグナリング経路、および増殖および分裂経路を含めた、トキ
シンによって影響されるようである鍵となる経路内で分子マーカを用いることで
ある。
センスレポータ分子を開発し、特徴づけた。これらの3つのクラスは以下の通り
である。
および (3)識別子:トキシンまたは一群のトキシンの活性媒介検出および同定 このように、本発明の他の特徴は、毒性剤の存在についての環境を問うバイオ
センサーとして生細胞が使用される。この態様の1つの実施形態において、細胞
ベースのトキシン特徴づけのための自動方法が開示され、これは、テスト物質で
処理すべき細胞を含有する位置のアレイを提供し、ここに、細胞は、検出器を含
む第1のルミネセンスレポータ、および検出器および分類器または識別子からな
る群から選択される第2のルミネセンスレポータ分子を保有し、細胞が第1およ
び第2のルミネセンスレポータ分子を保有する前または後に細胞をテスト物質と
接触させ、複数細胞を含有する位置の各々において複数細胞をイメージまたは走
査して検出器からルミネセンスシグナルを得、検出器からのルミネセンスシグナ
ルをデジタルデータに変換して、テスト物質中のトキシンの存在を示す、細胞上
または中の検出器の位置、分布または活性の変化を自動的に測定し、その中にト
キシンを有することが示されたテスト試料と接触された細胞を含有する位置を選
択的にイメージし走査して、第2のレポータ分子からのルミネセンスシグナルを
得、第2のルミネセンスレポータ分子からのルミネセンスシグナルをデジタルデ
ータに変換して、細胞上または中の分類器または識別子の位置、分布または活性
の変化を自動的に測定し、ここに、分類器の位置、分布、構造または活性の変化
は、テスト物質に存在するトキシンによって乱された細胞経路を同定し、または
ここに、識別子の位置、分布、構造または活性の変化は、テスト物質に存在する
特異的トキシンを同定することを含む。好ましい実施形態において、細胞は少な
くとも1つの検出器、分類器、および識別子を保有する。さらなる好ましい実施
形態において、分類器からのデジタルデータを用いて、特異的トキシンまたはト
キシンの群を同定するのにいずれの識別子を使用するかを決定する。
保有する」は、ルミネセンスレポータ分子を、細胞によるルミネセンスレポータ
分子として発現でき、ルミネセンスレポータ分子として細胞に添加することがで
き、またはレポータ分子に結合する色素または抗体等の、レポータ分子に結合す
るルミネセンス標識分子と細胞を接触させることによってルミネセンス標識する
ことができる。ルミネセンスレポータ分子は、テスト物質での処理の前または後
に発現させることができるか、または細胞に添加することができる。
は複数の細胞型に分布させることができる。例えば、1つの細胞型はトキトン検
出器を含有し、これは、トキシン活性によって活性化されると、トキシン検出器
を含有する細胞と同一またはそれと異なる細胞のさらに別の集団において分類器
または識別子型のレポータで同一トキシンがスクリーニングされるべきことを使
用者に伝える。
いはそれらは異なるレポータを含むことができる。
ついてのスクリーニングは高スループットまたは高含有量モードで行うことがで
きる。一般に、高含有量アッセイにより描かれる空間的情報が、もはや細胞また
は細胞下レベルで光学的空間分解能を要しないように記録することができれば、
高含有量アッセイは高スループットアッセイに変換することができる。例えば、
微小管再組織化についての高含有量アッセイは、ルミネセンス標識細胞微小管を
光学的に分解し、それらの形態(例えば、束となった−対−束となっていない、
または正常)を測定することによって行うことができる。微小管再組織化アッセ
イの高スループットバージョンは、洗剤で細胞を抽出した後に全微小管ポリマー
質量を測定することのみを含むであろう。すなわち、より容易に抽出される脱安
定化微小管の結果、別の処理細胞集団において、乱されないまたは薬物−安定化
ルミネセンス標識微小管よりも低い全微小管質量がもたらされるであろう。従っ
て、1以上のウェルを含有するドメインから放出されるルミネセンスシグナルは
、トキシン処理および洗剤抽出の後には細胞に残存する全微小管質量に比例する
であろう。
胞質から核への移動、核から核小体への移動、受容体内部化、ミトコンドリア膜
ポテンシャル、シグナル強度、レポータ分子の空間的応答、リン酸化、細胞内遊
離イオン濃度、細胞サイズ、細胞形状、細胞骨格組織化、代謝プロセス、細胞移
動度、細胞基質付着、細胞周期事象、および小器官の構造および機能を含めた、
本出願を通じて記載された同一スクリーニング方法を利用することができる。
ード双方で操作することができる。
テスト試料中の環境トキシンの存在をモリタリングする方法で、および化学兵器
および生物兵器で利用されるトキシンで、および環境矯正の間のトキシンの存在
および特徴の測定、薬物発見、臨床的適用で、および限定されるものではないが
、農業、食品加工、自動車、電子、テキスタイル、医療機器、および石油産業を
含めたいずれかの種々の産業による通常の開発および製造の間に有用である。
ポータの例を開発し特徴づけた。ここに開示された方法は、毒性剤に応答しての
各個々のレポータまたはレポータのコンビナトリアルによって創製された膨大な
データ組から有意義なパターンを抽出するために、コンピュータデータベース、
およびデータの管理、採用、検索、および表示方法と組み合わせて利用すること
ができる。そのようなデータベースおよび生物情報学方法は、限定されるもので
はないが、1999年11月10日に出願された米国特許出願第09/437,
976号、1999年7月27日に出願された第60/145,770号および
2000年2月19日に出願された、割り当てられるべき米国特許出願(98,
067−C)に開示されたものを含む。
(例えば、Dictyostelium)、および原生動物(例えば、Eugl
ena)等の真核生物を含めた、いずれの細胞型を用いて本発明の態様を行うこ
ともできる。限定されるものではないが、鳥類、両生類、昆虫、および哺乳動物
細胞を含めた高等真核生物にも使用できる。
ンまたはトキシンの群の識別子 モデルトキシンは、一般に、Sigma Chemical Company
(St.Louis,MO)から購入できる。
ルを提供する。このクラスのセンサーは、測定がなされるドメインのみに限定さ
れる分解を要する一般的細胞ストレスの検出を提供し、それらは同様に高含有量
スクリーニングに使用できる。このように、限定されるものではないが、細胞質
から核への熱ショック因子の移動、およびミトコンドリア膜ポテンシャル、細胞
内遊離イオン濃度検出(例えば、Ca2+、H+)、一般的代謝状態、細胞周期
タイミング事象、および小器官の構造および機能を含めた、高スループットおよ
び高含有量スクリーニングモードいずれかを使用することができる。
る。ATPおよびその代謝産物ADP、AMP、無機リン酸塩、および溶液−相
プロトンのサイクリングを連続的に調整して、細胞の異化および同化必要性に適
合させる。ミトコンドリアは、一義的には、全細胞を通じて一定のエネルギーチ
ャージの維持を担う。その構成要素からATPを生産するには、ミトコンドリア
はオルガモラそれ自体内に一定の膜ポテンシャルを維持しなければならない。従
って、特異的ルミネセンスプローブでのこの電気ポテンシャルの測定は、細胞ス
トレスの感受性で迅速な読み出しを提供する。
ンドリア膜に容易に分配される、正に荷電したシアニン色素JC−1(モレキュ
ラー・プローブ社(Molecular Probes),Eugene,OR
)を利用した。JC−1の光物理学は、プローブがミトコンドリア膜に分配され
、それが電気ポテンシャル>140mVを経験すると、プローブが集合し、その
スペクトル応答が赤色にシフトするようなものである。膜ポテンシャル値<14
0mVにおいて、JC−1は一義的にモノマーであり、そのスポクトル応答は青
色にシフトする。従って、ミトコンドリアに分配されたJC−1の2つの発光(
645nmおよび530nm)の比率は、ミトコンドリア膜ポテンシャルの感受
性で連続的測定を提供する。
プットモードにおいて生細胞測定を行ってきた。我々の初期実験の目標は、トキ
シンストレスの前および後におけるそのモノマー形態に対するJC−1色素のJ
−凝集体の比率を測定することであった。
)で30分間染色した。
ェル)、必要であれば、トキシンを添加し、全プレートをプレートリーダーで走
査した。JC−1モノマーは485nm励起/530nm発光波長フィルタ組で
最適に測定され、凝集体は590nm励起/645nm発光波長組で最良に測定
された。
ャルに対するトキシンの効果は、蛍光比率Em645(590)/Em530(
485)(括弧中は励起波長)を用いて測定した。例えば、我々は、LLCPK
細胞(ブタ上皮)内のミトコンドリアポテンシャルに対する10μMバリノマイ
シンの効果を測定した。数秒の測定内で、トキシンは、未処理細胞で見出される
ものよりもミトコンドリアポテンシャルでより迅速で高い大きさの減少(ほぼ5
0%減少)を誘導した。また、肝臓細胞は、バリノマイシンに感受性であると測
定され、ミトコンドリアポテンシャルの変化は、種々の濃度のトキシンの添加後
に数秒から数分内でほとんど完了した。
テンシャルと合致する。これらの測定は、個々の細胞内で空間的分解能を要しな
いので、ミトコンドリアポテンシャル測定は全細胞アレイで迅速になすことがで
きる(例えば、高スループット)。これは、例えば、多くの細胞型の複合体アレ
イが、一般化されたトキシン応答として同時に連続的にプローブできることを意
味する。そのようなインジケータは、一般的なトキシンストレスが試料に存在す
ることを示す第1の系のシグナルを提供することができる。次いで、さらなるア
ッセイを行って、細胞分類器もしくは識別子タイプのレポータ分子を用いトキシ
ンをより特異的に同定することができる。
ミリーの誘導で種々の環境刺激に応答するであろう。酸素欠乏、アミノ酸アナロ
グ、スルフヒドリル−反応試薬、遷移金属イオン、酸化的リン酸化脱カップラー
、ウイルス感染、エタノール、抗生物質、イオノフォア、非ステロイド抗炎症薬
物、熱ストレスおよび金属キレーターは、全て、細胞ストレスタンパク質合成、
機能または双方の誘導因子である。誘導に際しては、細胞ストレスタンパク質は
タンパク質を折り畳み、ほどき、異常立体配置でタンパク質を安定化し、DNA
損傷を修復するのに役割を演じる。
胞質から核に移動する証拠がある。これらのタンパク質は熱ショックタンパク質
HSP27およびHSP70、熱ショック同族体HSC70、および熱ショック
転写因子HSF1を含む。従って、これらのタンパク質(および細胞ストレスに
際して細胞質から核へ移動する他のストレスタンパク質)の細胞質から核への移
動の測定は、細胞ストレスの迅速な読み出しを提供するであろう。
のライブラリを用いて、2つの細胞系において(BHKおよびHeLa)HSP
27−GFPバイオセンサー(配列番号169−170)の応答をテストした。
略言すれば、HSP27−GFPバイオセンサーを発現する細胞を96−ウェル
マイクロプレートに平板培養し、付着させる。次いで、細胞を細胞ストレス−誘
導化合物のパネルで処理する。融合タンパク質の絶対的細胞質局所化が未刺激細
胞で見出された。
、およびGFPに融合したHSF1)を検出器として使用することができ、これ
を配列番号:171−176に示す。
て、トキシンの存在を検出し、さらにそれを分類する。それ自体、この組のセン
サーは、トキシンを検出しおよび/または限定されるものではないが、「シグナ
ル変換に影響するトキシン」、「細胞骨格に影響するトキシン」および「タンパ
ク質合成に影響するトキシン」を含めた広いカテゴリーにトキシンを分類するこ
とができる。高スループットまたは高含有量スクリーニングモードいずれかを用
いることができる。分類器は、限定されるものではないが、チューブリン、微小
管−結合タンパク質、アクチン、限定されるものではないがビンキュリン、α−
アクチン、アクチン脱重合因子/コフィリン、プロフィリン、およびミオシンを
含めたアクチン−結合タンパク質、NF−κB、IκB、限定されるものではな
いがrac、rhoおよびcdc42を含めたGTP−結合タンパク質、および
限定されるものではないがp38マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼを含
めたストレス−活性化プロテインキナーゼを含めた化合物を含むことができる。
有糸分裂等の、細胞機能およびプロセスで主要な役割を演じる。C2トキシン、
およびいくつかのクラスのエンテロトキシン等のタンパク質性および非タンパク
質性形態の細胞骨格−影響トキシンは細胞骨格に直接的に作用するか、あるいは
細胞骨格の組織化を制御する調節成分を介して間接的に作用する。従って、細胞
骨格における構造変化の測定は、トキシンの細胞骨格−影響トキシンへの分類を
提供することができる。このアッセイは、上述したように高含有量モードで、あ
るいは高スループットモードで行うことができる。高スループットについては、
上述した通りである。
行および細胞増殖、細胞会シグナル変換、および代謝プロセスに一般に影響する
剤を含めたトキシンの同定で価値があるであろう。
安定に形質転換したLLCPK細胞を50−60%密集にて96ウェル細胞培養
皿で平板培養し、37℃、5%CO2で一晩培養した。通常の培養培地中の一連
の濃度(10−500nM)の5つの化合物(パクリタキセル、クラシンA、ノ
コダゾール、ビンクラスチン、およびコルヒチン)をストックから新たに調製し
、細胞培養皿に添加して、古い培養培地を置き換えた。次いで、12時間時点で
、細胞を上述した細胞スクリーニングシステムで観察した。
に組み立てられることを示す。このキメラを発現する細胞における微小管アレイ
は、以下のように、種々の抗−微小管化合物に応答する:薬物 応答 ビンブラスチン 脱安定化 ノコダゾール 脱安定化 パクリタキセル 安定化 コルヒチン 脱安定化 クラシンA 脱安定化 (出典明示して全体に参照として組み込まれる、1997年5月29日に出願
された米国特許第08/865,341号に記載されたもののような)細胞アレ
イにパターン化されたチューブリンバイオセンサーを発現する細胞を用いて同様
のデータが得られ、上述したように投与した。
、そこで、それは特異的DNA応答要素に結合し、多数の遺伝子の転写を活性化
する。特異的リン酸化および普遍的事象に応答してプロテオソームによってIκ
Bが分解されると、移動が起こる。IκBは、通常は、タンパク質との直接的相
互作用を介してNF−κBを細胞質に保持し、NF−κBのNLS配列をマスク
する。従って、全シグナルカスケードの初期または規定する事象ではないが、核
へのNF−κB移動は細胞ストレスのインジケータとして働くことができる。
これは、Clontech Laboratories(Palo Alto,
CA)から得られたEYFP PCRアンプリマーに融合したInvitrog
en(Carlsbad,CA)から購入した特徴づけられたNF−κB p6
5 cDNAを用いて、標準的なポリメラーゼ鎖反応を用いて達成された。得ら
れたキメラは配列番号:177−178に示す。2つのPCR産物を、普遍的C
MVプロモータを用いて高レベルでキメラタンパク質を生じるように設計された
真核生物発現ベクターに連結した。
て内因性NF−κB活性化を特徴づけた。この実験で使用したNF−κB抗体は
Santa Cruz Biotechnology,Inc.(Santa
Cruz,CA)から購入し、二次抗体はモレキュラー・プローブ社(Mole
cular Probes)(Eugene,OR)からのものである。
ml)の単位およびモル濃度の単位で表した、最大の50%の応答レベル(EC 50 )を生じた有効濃度を決定した。TNFαおよびIL−1α双方についての
17kDの分子量に基づき、3T3およびSNB19細胞型でのこれらの2つの
化合物についてのEC50レベルを表1にモル濃度の単位で与える。我々の結果
は、ゼロから最大用量の相対応答の再現性を示し、しかし試料間では、ゼロ濃度
での応答のベースライン強度で場合によってはシフトがあった。
細胞/ウェルをテストした。これらの試料について測定された標準偏差に基づき
、かつスチューデントt−検定でt−値を取ることによって、我々は、細胞型、
化合物、ウェル当たりの細胞数の各々の場合につき、および条件当たりいくつの
ウェルがサンプリングされたかの異なる選択につき、最小検出可能用量を評価し
た。後者の因子は、データの試料で提供される自由度の数を決定する。ウェルの
数を4から16に増加させ、ウェル当たりの細胞の数を10から100に増加さ
せると、最小検出可能用量をかなり改良する。SNB19細胞よりも低い最小検
出可能用量を示す3T3細胞では、および1%偽陰性および1%偽陽性率の場合
では、我々は、ウェル当たり100細胞および12または16ウェルのサンプリ
ングが、0.15ng/mlのEC50値とほぼ等しい用量を検出するのに十分
である。偽陽性率が20%まで緩和されると、その値のほぼ半分の濃度が検出す
ることができる(0.83ng/ml)。便宜には、1mm2未満の細胞培養表
面にわたり、100細胞をサンプリングすることができる。
対するEC50レベル
K) MAPKは細胞増殖および分裂においてのみならず、細胞ストレス応答のメデ
ィエイターとして役割を演じる。1つのMAPKであるp38は、超オスモルソ
ルビトール、過酸化水素、亜ヒ酸塩、カドミウムイオン、アニソマイシン、サリ
チル酸ナトリウムおよびLPS等の化学ストレス誘導因子によって活性化される
。p38の活性化もまた核から細胞質への移動によって達成される。
38は1以上のキナーゼの基質であり、それは、生細胞内で時間および空間的に
1以上の基質をリン酸化するように作用する。
酸化形態の免疫局所化を用い、そのパラメータの1つとしてp38活性化を測定
する。このアッセイは同一の個々の細胞内で他のパラメータの同時測定を誘導す
るのに十分柔軟であるように開発された。転写因子NF−κBによって媒介され
るシグナル変換経路もまた細胞ストレス応答に関与することが知られているので
、我々はNF−κBの活性化を同一アッセイにおける第2のパラメータとして含
めた。
で、または同一細胞におけるNF−κB活性化と組み合わせて測定することがで
きる。複数細胞型、モデルトキシン、および抗体をテストし、双方の経路の有意
な刺激を高含有量モードで測定した。この実験で用いたホスホ−p38抗体は、
シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Company)(St
.Louise,MO)から購入した。我々は、少なくとも1つの細胞ストレス
シグナリング経路が同時に測定できるのみならず、モデルトキシンのクラスに異
なって応答することを報告する。図36は3zkモデルトキシンおよび2つの異
なる細胞型を横切ったp38 MAPKおよびNF−κB経路の異なる応答を示
す。単独で添加すると、モデルトキシン(IL 1α、TNFαおよびアニソマ
イシン)の3つは、特異的経路のアクチベータして2つのアッセイによって区別
できることに注意されたし。
化に至る鍵となる事象である。我々は、高スループットモードで分類器としてN
F−κBセンサーを補充するためにこのセンサーを選択した:IκB−GFP融
合タンパク質の分解のためシグナルの喪失の測定は、個々の細胞内で空間的分解
能は必要とせず、それ自体は、我々はIκB分解測定は全細胞基質で迅速になさ
れると考える。
5変種への融合に基づく。配列番号179−180。IκBのこの領域は、プロ
テオソーム分解をバイオセンサーに付与するのに必要なリン酸化部位および普遍
化部位を含めた、全ての調節配列を含有する。これを知り、NFκB移動に典型
的には至るいずれかの経路の刺激の結果、このバイオセンサーの分解がもたらさ
れる。IκB−GFPを発現する細胞の蛍光強度のモニタリングは、分解プロセ
スを同定する。
い突然変異体トキシンを検出し、または既知のトキシンのいくつかの複雑な混合
物を明らかにする能力を犠牲とすることなく、トキシンクラスの迅速な読み出し
を確実とする。第3のレベルのバイオセンサーは識別子であり、これは、特異的
なトキシンまたはトキシンの群を同定することができる。1つの実施形態におい
て、識別子は、特異的トキシンの活性に応答するプロテアーゼバイオセンサーを
含む。他の識別子はそれらの活性に特異的なレポータ/バイオセンサーで生成さ
れる。これらは、限定されるものではないが、リン酸化またはADP−リボシル
化、細胞小器官または区画の間の移動、特異的小器官または細胞構成要素に対す
る効果(例えば、膜浸透性、細胞骨格再配置等)等の翻訳後修飾を含む。
A(Pseudomonas toxin A)、ジフテリアトキシン、ボツリ
ヌストキシン、百日咳トキシンおよびコレラトキシンを含む。例えば、ボツリヌ
ス菌(C.botulinum)C2トキシンは細胞骨格タンパク質アクチンに
おいてArg177のADP−リボシル化を誘導し、このように、この組み立て
特性を改変する。アクチン−細胞骨格調節を測定するための分類器アッセイの構
築以外に、特異的アクチンADP−リボシル化を検出するために識別子アッセイ
を構築することができる。ADP−リボシル化は、もはや修飾されたアッセイに
重合させない立体配置変化を誘導するので、ルミネセンス試薬を用いて、いくつ
かの可能な方法で、この立体配置変化を細胞内で検出することができる。例えば
、アクチンは、定常状態蛍光異方性を用いて細胞内アクチンの回転拡散の測定を
可能とする適当な励起状態寿命を持つ蛍光試薬を用いて、ルミネセンス標識する
ことができる。すなわち、トキシン−修飾アクチンは、もはや、剛直なフィラメ
ントに組み立てることができず、従って、比較的低い異方性を持つルミネセンス
シグナルを生じるに過ぎず、これは、シメージングシステムで容易に測定するこ
とができる。別の実施形態において、アクチンは、付着された試薬のスペクトル
シフトを通じてアクチン−立体配置の変化を報告する極性−感受性蛍光試薬で標
識することができる。すなわち、トキシン−処理は、2つの蛍光波長の比率がア
クチンADP−リボシル化の測定を提供するように、細胞内アクチンの立体配置
変化を誘導するであろう。
ーゼを生産する。例えば、ウェルチ菌(Clostridium perfri
ngens)は、ホスホイノシチドの切断に特異的なホスホリパーゼCを生産す
る。これらのホスホイノシチド(例えば、イノシトール1,4,5−三リン酸)
は、細胞内小器官からカルシウムイオンを放出する。高含有量または高スループ
ットいずれかとして行うことができるアッセイは、金属イオンと複合体化させた
場合に改変されたスペクトル特性を有する蛍光試薬を用いてカルシウムイオンの
放出を測定するように構築することができる。従って、ホスホリパーゼCベース
のトキシンの作用の直接的結果は、細胞カルシウムイオン濃度の変化として測定
することができる。
ococcal species)によって生産され、いくつかの血清型からな
る。これらのトキシンの特異的識別子は、それらの標的小器官であるデスモソー
ムの形態的変化(これは細胞間の接合で起こる)を測定することによって構築す
ることができる。剥離トキシンは、デスモソームの形態を、ヘミデスモソームと
呼ばれる2つのより小さい区画に変化させることが知られている。剥離トキシン
についての高含有量アッセイにおいて、そのデスモソームがルミネセンス標識さ
れた上皮細胞はイメージ分析に付される。デスモソームおよびヘミデスモソーム
の間の形態変化を検出する方法を用いて、細胞に対するトキシンの活性を定量す
る。
、ならびに高含有量アッセイで用いることができる。
我々は、標的タンパク質内に見出される特異的アミノ酸配列のタンパク質分解切
断を報告する蛍光タンパク質バイオセンサーの開発に焦点を当ててきた。
ロテアーゼ等の多数のそのようなプロテアーゼバイオセンサー(FRETバイオ
センサーを含む)を前述で開示する。FRETは、そのうち多くがトキシン活性
に関連するタンパク質立体配置の小さな変化が生細胞内で時間および空間にて高
い精度で測定できるのみならず、上述したように高スループットモードで測定す
ることができる点で強力な技術である。
ンサーは、構築体のいずれかにおいて適当なプロテアーゼ認識部位の置換によっ
て、いずれかのプロテアーゼの活性を報告するように適合できることを認識する
であろう(図29B)。前述で開示したように、これらのバイオセンサーは高含
有量または高スループットスクリーニングで用いて、トキシンによる酵素活性の
インビボ活性化を検出し、既知の認識モチーフの切断に基づく特異的活性を同定
することができる。これらのバイオセンサーは生細胞および固定終点がアッセイ
双方で用いることができ、さらなる測定と組み合わせてマルチパラメータアッセ
イを提供することができる。
サーの開発のための優れた標的である。致死因子(LF)は、炭疽に毒性を付与
するタンパク質成分の1つであり、最近、細胞内のその標的の2つが同定された
。LFは、MAP−キナーゼシグナリング経路の一部であるキナーゼであるMe
k1およびMek2タンパク質を特異的に切断するメタロプロテアーゼである。
致死因子プロテアーゼバイオセンサーの構築は前述する。(配列番号:7−8、
9−10)。緑色蛍光タンパク質(GFP)はMek1またはMek2(または
双方)のアミノ末端でインフレーム融合しており、その結果、標的分子の双方に
存在する核輸出配列(NES)の存在のため細胞質に保持されるキメラタンパク
質が得られる。活性致死因子による切断に際して、GFPはキメラから放出され
、遊離されて核に拡散する。従って、核におけるGFPの蓄積を測定すると、そ
の天然標的(生細胞)に対するLF活性の直接的測定を提供する。
変形は当業者に明らかであるので、本発明は示され記載された特定の形態に限定
されるものと解釈されるべきではなく、その代わり、特許請求の範囲に記載した
ように解釈されるべきである。
を読むために望遠鏡レンズを用い、第2のプラットフォームがウェル中の個々の
細胞を読むために高倍率レンズを用いる、細胞ベースのスクリーニングのための
デュアルモードシステムの2つのプラットフォーム構築体のブロック図である。
望遠鏡」レンズおよびウェル中の個々の細胞を読むための移動可能な高倍率レン
ズを用いる、細胞ベースのスクリーニングのためのデュアルモードシステムの単
一プラットフォーム構築体についての光学系の詳細である。
るための流体送達システムの説明である。
る。
ーニングを組み合わせる細胞ベースのスクリーニングのためのデュアルモードシ
ステムにおける処理工程を規定するフローチャートである。
ードにおける処理工程を規定するフローチャートである。
おける処理工程を規定するフローチャートである。
おいて動的データを取得するのに必要な処理工程を規定するフローチャートであ
る。
ローチャートである。
ードからのデータ、高含有量モードまで通過したデータの例、高含有量モードで
取得されたデータ、そのデータの解析の結果の説明である。
フェイスを示す。
。
スポリン(A)およびパクリタキセル(B)はL929細胞において古典的な核
断片化を誘導する。BHK細胞はスタウロスポリン(C)に応答するが、パクリ
タキセル(D)に対してより古典的に応答する濃度依存的変化を呈する。MCF
−7細胞は、各々、スタウロスポリンおよびパクリタキセルに応答する核凝縮(
E)または断片化(F)いずれかを呈する。全ての場合において、細胞は化合物
に30時間暴露された。
ポリンに対する細胞の用量応答を示す。
パクリタキセルによるアポトーシスの誘導を示すグラフ。(A,B)双方のアポ
トーシス刺激体はL929細胞においてf−アクチン含有量の用量−依存的増加
を誘導する。(C)BHK細胞においては、スタウロスポリンはf−アクチンの
用量−依存的増加を誘導し、他方、パクリタキセル(D)はより変化する結果を
生じる(E)MCF−7細胞は、スタウロスポリンの濃度に応じて減少または増
加いずれかを呈する。(F)f−アクチン含有量のパクリタキセル誘導変化はか
なり変化し、有意ではなかった。細胞は30時間化合物に暴露した。
L929(A,B)およびBHK(C,D)細胞はスタウロスポリン(A,C)
およびパクリタキセル(B,D)双方に応答し、ミトコンドリア質量の増加が伴
った。MCF−7細胞は刺激体に応じて、膜ポテンシャルの減少(E,スタウロ
スポリン)またはミトコンドリア質量の増加(F,パクリタキセル)いずれかを
呈する。細胞は30時間化合物に暴露した。
テンシャルに対するスタウロスポリン効果の同時測定を示すグラフである。
核酸およびアミノ酸配列を示す。(A)シグナル配列。(B)プロテアーゼ認識
部位。(C)生成物/反応体標的配列。
核酸およびアミノ酸配列を示す。(A)シグナル配列。(B)プロテアーゼ認識
部位。(C)生成物/反応体標的配列。
核酸およびアミノ酸配列を示す。(A)シグナル配列。(B)プロテアーゼ認識
部位。(C)生成物/反応体標的配列。
の基本的組織化を概略的に示す。
ーでトランスフェクトされたBHK細胞に対するシスプラチンによるアポトーシ
スの刺激の効果を示す写真である。
バイオセンサーの概略図である。
MAPKおよびNF−κB経路のデュアル標識アッセイにおける異なる応答を示
す。星印でマークした処理は99%信頼レベル(p<0.01)で対照とは異な
る。
Claims (20)
- 【請求項1】 検出器を含む第1のルミネセンスレポータ分子、および分類
器または識別子からなる群から選択される第2のルミネセンスレポータ分子を保
有し、テスト物質で処理すべき細胞を含有する位置のアレイを提供し、 前記細胞による前記第1および第2のルミネセンスレポータの保有の前または
後に前記細胞とテスト物質とを接触させ、ここに、第1および第2のルミネセン
スレポータ分子は前記細胞がトキシンと接触されると修飾され、 前記複数細胞を含有する位置の各々において前記複数細胞をイメージまたは走
査して前記検出器からルミネセンスシグナルが得られ、 前記検出器からの前記ルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換し、 前記検出器からの前記デジタルデータを利用して細胞上または細胞中の検出器
の位置、分布または活性を自動的に測定し、ここに、前記検出器の位置、分布、
構造または活性の変化は前記テスト物質におけるトキシンの存在を示し、 その中に前記トキシンを有することが示されたテスト試料と接触された前記細
胞を含有する位置を選択的にイメージまたは走査して、第2のレポータ分子から
ルミネセンスシグナルが得られ、 前記第2のルミネセンスレポータ分子からの前記ルミネセンスシグナルをデジ
タルデータに変換し、 前記第2のルミネセンスレポータ分子からの前記デジタルデータを利用して細
胞上または細胞中の分類器または識別子の位置、分布または活性を自動的に測定
し、ここに、前記分類器の位置、分布、構造または活性の変化は、テスト物質に
存在するトキシンによって乱される細胞経路を同定し、または識別子の位置、分
布、構造または活性の変化は、テスト物質に存在する特異的トキシンまたはトキ
シンの群を同定することを含む細胞ベースのトキシンを特徴づける自動方法。 - 【請求項2】 前記第2のルミネセンスレポータ分子が分類器であって、前
記分類器に由来するデジタルデータを用いて、特異的トキシンまたはトキシンの
群の同定に適した識別子を選択する請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 検出器を含む少なくとも第1のルミネセンスレポータ分子、
分類器を含む第2のルミネセンスレポータ分子、および識別子を含む第3のルミ
ネセンスレポータ分子を保有しテスト物質で処理すべき細胞を含有する位置のア
レイを提供し、 前記細胞による前記前記第1、第2および第3のルミネセンスレポータ分子の
保有の前または後に前記細胞をテスト物質と接触させ、ここに、第1、第2およ
び第3のルミネセンスレポータ分子の位置、分布、構造または活性は、細胞をト
キシンと接触させると修飾され、 前記複数細胞を含有する位置の各々における前記複数細胞をイメージまたは走
査して前記検出器からルミネセンスシグナルが得られ、 前記検出器からの前記ルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換し、 前記検出器からの前記デジタルデータを利用して、細胞上または細胞中の検出
器の位置、分布または活性を自動的に測定し、ここに、検出器の位置、分布、構
造または活性の変化はテスト物質中のトキシンの存在を示し、 その中にトキシンを有することが示されたテスト試料と接触させた前記細胞を
含有する位置を選択的にイメージまたは走査して、分類器からルミネセンスシグ
ナルが得られ、 前記分類器からのルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換し、 前記分類器からのデジタルデータを利用して、細胞上または細胞中の分類器の
位置、分布または活性を自動的に測定し、ここに、分類器の位置、分布、構造ま
たは活性の変化は、テスト物質に存在するトキシンによって乱される細胞経路を
同定し、 その中にトキシンを有することが示されたテスト試料と接触させた細胞を含有
する位置を選択的にイメージまたは走査して、識別子からルミネセンスシグナル
が得られ、 前記識別子からのルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換し、次いで、 前記識別子からのデジタルデータを利用して、細胞上または細胞中の識別子の
位置、分布または活性を自動的に測定し、ここに、識別子の位置、分布、構造ま
たは活性の変化は、テスト物質に存在する特異的トキシンまたはトキシンの数を
同定することを含む細胞ベースのトキシンを特徴づける自動方法。 - 【請求項4】 前記分類器に由来するデジタルデータを用いて、特異的トキ
シンまたはトキシンの群の同定に適した識別子を選択する請求項3に記載の方法
。 - 【請求項5】 前記検出器が熱ショックタンパク質、およびミトコンドリア
膜ポテンシャル、細胞内遊離イオン濃度、細胞骨格組織化、一般的な代謝状態、
細胞周期タイミング事象、および小器官の構造および機能の変化に応答する化合
物からなる群から選択される分子を含む請求項1乃至4のいずれか1項に記載の
方法。 - 【請求項6】 前記分類器がチューブリン、微小管−関連タンパク質、アク
チン、アクチン−結合タンパク質、NF−κB、IκBおよびストレス−活性化
キナーゼからなる群から選択される分子を含む請求項1乃至5のいずれか1項に
記載の方法。 - 【請求項7】 前記細胞経路が細胞ストレス経路、細胞代謝経路、細胞シグ
ナリング経路、細胞増殖経路および細胞分裂経路からなる群から選択される請求
項1乃至6のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項8】 前記第2のルミネセンスレポータ分子が識別子であって、前
記識別子がプロテアーゼ、ADP−リボシル化トキシン、細胞毒性ホスホリパー
ゼおよび剥奪性トキシンからなる群から選択されるトキシンまたはトキシンの群
を同定する請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 前記識別子がプロテアーゼ、ADP−リボシル化トキシン、
細胞毒性ホスホリパーゼおよび剥奪性トキシンからなる群から選択されるトキシ
ンまたはトキシンの群を同定する請求項3乃至7のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項10】 前記第1、第2または第3のルミネセンスレポータ分子の
位置、分布、構造または活性の変化が、細胞質から核への移動、核または核小体
から細胞質への移動、受容体内部化、ミトコンドリア膜ポテンシャル、シグナル
の喪失、レポータ分子のスペクトル応答、リン酸化、細胞内遊離イオン濃度、細
胞サイズ、細胞形状、細胞骨格組織化、代謝プロセス、細胞移動度、細胞基質付
着、細胞周期事象、および小器官の構造および機能からなる群から選択される請
求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項11】 前記検出器からルミネセンスシグナルを得るための複数細
胞を含有する位置の各々における複数細胞のイメージングまたは走査が高スルー
プットモードで行われる請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項12】 前記検出器からルミネセンスシグナルを得るための複数細
胞を含有する位置の各々における複数細胞のイメージングまたは走査が高含有量
モードで行われる請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項13】 前記第2または第3のレポータ分子からルミネセンスシグ
ナルを得るための、その中にトキシンを有することが示されたテスト試料と接触
させた細胞を含有する位置の選択的イメージングまたは走査が高スループットモ
ードで行われる請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項14】 前記第2または第3のレポータ分子からルミネセンスシグ
ナルを得るための、その中にトキシンを有することが示されたテスト試料と接触
させた細胞を含有する位置の選択的イメージングまたは走査が高含有量で行われ
る請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項15】 さらに、データ保存および集積のためのデジタル保存媒体
を提供することを含む請求項1乃至14のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項16】 さらに、結果の自動制御、取得、処理および表示のための
手段を含む請求項15に記載の方法。 - 【請求項17】 細胞を含有するプレートを保持するのに適合した段階を備
えた光学系、前記段階または光学系を移動させるための手段、デジタルカメラ、
細胞から放出された光をデジタルカメラに向けるための手段、および前記デジタ
ルカメラからのデジタルデータを受け取りそれを処理するためのコンピュータ手
段を含む細胞スクリーニングシステムに請求項1乃至16のいずれか1項に記載
の方法を実行させるための指令の組を含有するプログラムを含むコンピュータ読
み取り可能保存媒体。 - 【請求項18】 (a)少なくとも1つのレポータ分子、ここに、前記レポ
ータ分子の位置、分布、構造または活性は、細胞をトキシンと接触させると修飾
され、 (b)請求項1乃至16のいずれか1項に記載の方法を実行するためにレポー
タ分子を用いてテスト物質中のトキシンを検出するための指令 を含む細胞ベースのトキシン検出用のキット。 - 【請求項19】 さらに、請求項17に記載のコンピュータ読み取り可能保
存媒体を含む請求項18に記載のキット。 - 【請求項20】 検出器および分類器からなる群から選択されるレポータ分
子を含む少なくとも第1のルミネセンスレポータ分子を保有しテスト物質で処理
すべき細胞を含有する位置の第1のアレイを提供し、 前記細胞による前記第1のルミネセンスレポータ分子の保有前または後に細胞
をテスト物質と接触させ、ここに、前記第1のルミネセンスレポータ分子の位置
、分布、構造または活性は、細胞をトキシンと接触させると修飾され、 前記複数細胞を含有する位置の各々における前記複数細胞をイメージまたは走
査して前記検出器からのルミネセンスシグナルが得られ、 前記検出器からの前記ルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換し、 前記検出器からの前記デジタルデータを利用して、細胞上または細胞中の検出
器の位置、分布または活性を自動的に測定し、ここに、前記検出器の位置、分布
、構造または活性の変化がテスト物質中のトキシンの存在を示し、 テスト物質で処理すべき細胞を含有する位置の第2のアレイを提供し、ここに
、前記細胞は前記分類器および識別子からなる群から選択されるレポータ分子を
含む少なくとも第2のルミネセンスレポータ分子を保有し、ここに、前記細胞を
含有する位置の第2のアレイが、前記細胞を含有する位置の第1のアレイと同一
または異なる細胞型いずれかを含むことができ、 前記細胞による前記第2のルミネセンスレポータ分子の保有の前または後に、
前記細胞を含有する位置の第2のアレイをテスト物質と接触させ、ここに、前記
第2のルミネセンスレポータ分子の位置、分布、構造または活性は、細胞がトキ
シンと接触されると修飾され、 前記第2のルミネセンスレポータ分子からのデジタルデータを利用して、細胞
上または細胞中の分類器または識別子の位置、分布または活性を自動測定し、こ
こに、前記分類器の位置、分布、構造または活性の変化は、テスト物質に存在す
るトキシンによって乱される細胞経路を同定し、または、ここに、識別子の位置
、分布、構造または活性は、テスト物質に存在する特異的トキシンまたはトキシ
ンの群を同定することを特徴とする細胞ベースのトキシンを特徴づける自動方法
。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US12215299P | 1999-02-26 | 1999-02-26 | |
US60/122,152 | 1999-02-26 | ||
US12339999P | 1999-03-08 | 1999-03-08 | |
US60/123,399 | 1999-03-08 | ||
US09/352,171 | 1999-07-12 | ||
US09/352,171 US6759206B1 (en) | 1997-02-27 | 1999-07-12 | System for cell-based screening |
PCT/US2000/004794 WO2000050872A2 (en) | 1999-02-26 | 2000-02-25 | A system for cell-based screening |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003526772A true JP2003526772A (ja) | 2003-09-09 |
JP3576491B2 JP3576491B2 (ja) | 2004-10-13 |
Family
ID=27382740
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000601420A Expired - Lifetime JP3576491B2 (ja) | 1999-02-26 | 2000-02-25 | 細胞ベースのスクリーニング用のシステム |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1155304B1 (ja) |
JP (1) | JP3576491B2 (ja) |
AT (1) | ATE239907T1 (ja) |
AU (1) | AU3605600A (ja) |
CA (1) | CA2362117C (ja) |
DE (1) | DE60002562T2 (ja) |
IL (1) | IL144797A0 (ja) |
WO (1) | WO2000050872A2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007049943A (ja) * | 2005-08-18 | 2007-03-01 | Kyoto Univ | 細胞内カルシウムイオン指示機能を有するポリペプチド |
JP2017509340A (ja) * | 2014-03-17 | 2017-04-06 | エージェンシー フォー サイエンス, テクノロジー アンド リサーチ | 核因子−κBの移行に基づいて化合物の毒性を予測するための方法 |
JP2017195834A (ja) * | 2016-04-28 | 2017-11-02 | 富士フイルム株式会社 | 生体試料評価システムおよび生体試料評価方法並びに生体試料評価制御プログラム |
CN108031658A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-05-15 | 泰州海天电子科技股份有限公司 | 一种三极管测试编带后印记不良检测方法 |
Families Citing this family (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5989835A (en) | 1997-02-27 | 1999-11-23 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
US7853411B2 (en) | 1997-02-27 | 2010-12-14 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
US6759206B1 (en) | 1997-02-27 | 2004-07-06 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
US7160687B1 (en) | 1997-05-29 | 2007-01-09 | Cellomics, Inc. | Miniaturized cell array methods and apparatus for cell-based screening |
US7236888B2 (en) | 1998-03-06 | 2007-06-26 | The Regents Of The University Of California | Method to measure the activation state of signaling pathways in cells |
US6743576B1 (en) | 1999-05-14 | 2004-06-01 | Cytokinetics, Inc. | Database system for predictive cellular bioinformatics |
US7151847B2 (en) | 2001-02-20 | 2006-12-19 | Cytokinetics, Inc. | Image analysis of the golgi complex |
WO2000070528A2 (en) * | 1999-05-14 | 2000-11-23 | Cytokinetics, Inc. | Method and apparatus for predictive cellular bioinformatics |
US6651008B1 (en) | 1999-05-14 | 2003-11-18 | Cytokinetics, Inc. | Database system including computer code for predictive cellular bioinformatics |
AU7131900A (en) * | 1999-06-21 | 2001-01-09 | Cellomics, Inc. | A system for cell-based screening |
WO2001007889A2 (en) * | 1999-07-27 | 2001-02-01 | Cellomics, Inc. | Miniaturized cell array methods and apparatus for cell-based screening |
WO2001011341A2 (en) * | 1999-08-05 | 2001-02-15 | Cellomics, Inc. | A system for cell-based screening |
US6986993B1 (en) | 1999-08-05 | 2006-01-17 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
AU1656401A (en) * | 1999-11-09 | 2001-06-06 | Cellomics, Inc. | A system for cell-based screening |
US6614452B1 (en) | 1999-11-15 | 2003-09-02 | Xenogen Corporation | Graphical user interface for in-vivo imaging |
US7581191B2 (en) | 1999-11-15 | 2009-08-25 | Xenogen Corporation | Graphical user interface for 3-D in-vivo imaging |
AU2073801A (en) | 1999-12-09 | 2001-06-18 | Cellomics, Inc. | A system for cell-based screening |
AU2001262906A1 (en) | 2000-02-11 | 2001-08-20 | Cellomics, Inc. | Peptide biosensors for anthrax protease |
US6775567B2 (en) | 2000-02-25 | 2004-08-10 | Xenogen Corporation | Imaging apparatus |
US20030096315A1 (en) | 2000-05-03 | 2003-05-22 | Sanders Mitchell C. | Device for detecting bacterial contamination and method of use |
JP2004504854A (ja) * | 2000-05-03 | 2004-02-19 | エクスプレッシブ コンストラクツ,インコーポレイテッド | 細菌汚染検出装置および使用方法 |
WO2002041064A1 (en) | 2000-11-17 | 2002-05-23 | Universal Imaging Corporation | Rapidly changing dichroic beamsplitter |
EP1336101B1 (en) * | 2000-11-22 | 2006-02-08 | The Regents Of The University Of California | A method to measure the activation state of signaling pathways in cells |
US7218764B2 (en) | 2000-12-04 | 2007-05-15 | Cytokinetics, Inc. | Ploidy classification method |
US7016787B2 (en) | 2001-02-20 | 2006-03-21 | Cytokinetics, Inc. | Characterizing biological stimuli by response curves |
US6999607B2 (en) | 2001-02-20 | 2006-02-14 | Cytokinetics, Inc. | Method and apparatus for automated cellular bioinformatics |
US6956961B2 (en) | 2001-02-20 | 2005-10-18 | Cytokinetics, Inc. | Extracting shape information contained in cell images |
WO2002073200A1 (en) | 2001-03-12 | 2002-09-19 | Cellomics, Inc. | Methods to increase the capacity of high content cell-based screening assays |
WO2002077903A2 (en) | 2001-03-26 | 2002-10-03 | Cellomics, Inc. | Methods for determining the organization of a cellular component of interest |
WO2002079391A2 (en) * | 2001-04-02 | 2002-10-10 | Cytoprint, Inc. | Methods and apparatus for discovering, identifying and comparing biological activity mechanisms |
CA2474458A1 (en) | 2002-01-31 | 2003-08-07 | Mitchell C. Sanders | Method for detecting microorganisms |
US7474398B2 (en) | 2002-02-22 | 2009-01-06 | Xenogen Corporation | Illumination system for an imaging apparatus with low profile output device |
US7474399B2 (en) | 2002-02-22 | 2009-01-06 | Xenogen Corporation | Dual illumination system for an imaging apparatus and method |
US6922246B2 (en) | 2002-02-22 | 2005-07-26 | Xenogen Corporation | Bottom fluorescence illumination assembly for an imaging apparatus |
EP1543332A2 (en) * | 2002-09-16 | 2005-06-22 | Sense Proteomic Limited | Protein arrays and uses thereof |
US20050014217A1 (en) | 2003-07-18 | 2005-01-20 | Cytokinetics, Inc. | Predicting hepatotoxicity using cell based assays |
US7235353B2 (en) | 2003-07-18 | 2007-06-26 | Cytokinetics, Inc. | Predicting hepatotoxicity using cell based assays |
WO2005010677A2 (en) | 2003-07-18 | 2005-02-03 | Cytokinetics, Inc. | Characterizing biological stimuli by response curves |
AU2004286342B2 (en) | 2003-11-03 | 2008-10-02 | Systagenix Wound Management Ip Co. B.V. | Methods, peptides and biosensors useful for detecting a broad spectrum of bacteria |
US7323318B2 (en) | 2004-07-15 | 2008-01-29 | Cytokinetics, Inc. | Assay for distinguishing live and dead cells |
EP2562266B1 (en) * | 2005-03-30 | 2016-02-24 | Olympus Corporation | Predetermined site luminescence measuring method, predetermined site luminescence measuring apparatus, expression amount measuring method, and measuring apparatus |
WO2007136724A2 (en) | 2006-05-17 | 2007-11-29 | Cellumen, Inc. | Method for automated tissue analysis |
JP5058962B2 (ja) | 2008-12-22 | 2012-10-24 | オリンパス株式会社 | 細胞画像解析装置、細胞画像解析方法、及びプログラム |
WO2012059784A1 (en) | 2010-11-03 | 2012-05-10 | Reametrix Inc | Method and device for fluorescent measurement of samples |
AU2012205772B2 (en) * | 2011-01-10 | 2015-10-08 | President And Fellows Of Harvard College | Method for delivering agents into cells using bacterial toxins |
AU2012229102B2 (en) | 2011-03-17 | 2016-02-04 | Cernostics, Inc. | Systems and compositions for diagnosing Barrett's esophagus and methods of using the same |
JP2015509501A (ja) | 2012-02-23 | 2015-03-30 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | 剤を細胞へ送達するための改変型微生物毒素受容体 |
EP2769204B1 (en) | 2012-05-02 | 2016-02-17 | Charles River Laboratories, Inc. | Cell capture system and use thereof |
US9709500B2 (en) | 2012-05-02 | 2017-07-18 | Charles River Laboratories, Inc. | Optical method for detecting viable microorganisms in a cell sample |
JP6285915B2 (ja) | 2012-05-02 | 2018-02-28 | チャールズ リバー ラボラトリーズ, インコーポレイテッド | 生死判別染色法 |
JP5639670B2 (ja) | 2013-02-01 | 2014-12-10 | 浜松ホトニクス株式会社 | 画像取得装置及び撮像装置 |
EP3172563B1 (en) | 2014-07-23 | 2019-06-12 | Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) | Methods for detecting interactions in eukaryotic cells using microtubule structures and dynamics |
CN104483103B (zh) * | 2014-12-22 | 2017-01-04 | 北京市产品质量监督检验院 | 显示屏分辨率的测试方法 |
CN107290338A (zh) * | 2017-06-19 | 2017-10-24 | 亿信标准认证集团四川有限公司 | 采用图像识别系统的试纸型甲醛检测系统 |
CN109406769A (zh) * | 2018-09-28 | 2019-03-01 | 李军 | Akr在min6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用 |
EP3867641A1 (en) * | 2018-10-15 | 2021-08-25 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Compounds for treatment of diseases and methods of screening therefor |
CA3206837A1 (en) * | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Q-State Biosciences, Inc. | Microscope with spatial imaging and beam homogenizer |
US20230003647A1 (en) * | 2021-06-30 | 2023-01-05 | Q-State Biosciences, Inc. | Multiplex optical stimulus and readout |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000509827A (ja) * | 1997-02-27 | 2000-08-02 | セロミックス インコーポレイテッド | 細胞に基づくスクリーニングシステム |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6399296B1 (en) * | 1994-07-20 | 2002-06-04 | The General Hospital Corporation | Interaction trap systems for detecting protein interactions |
ATE269975T1 (de) * | 1997-04-07 | 2004-07-15 | Bioimage As | Verfahren zum screenen von substanzen die einen effekt auf intrazelluläre translokation haben |
-
2000
- 2000-02-25 EP EP00914701A patent/EP1155304B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-25 AU AU36056/00A patent/AU3605600A/en not_active Abandoned
- 2000-02-25 DE DE60002562T patent/DE60002562T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-25 WO PCT/US2000/004794 patent/WO2000050872A2/en active IP Right Grant
- 2000-02-25 JP JP2000601420A patent/JP3576491B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-25 CA CA002362117A patent/CA2362117C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-25 EP EP03004224A patent/EP1314980B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-25 AT AT00914701T patent/ATE239907T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-02-25 IL IL14479700A patent/IL144797A0/xx unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000509827A (ja) * | 1997-02-27 | 2000-08-02 | セロミックス インコーポレイテッド | 細胞に基づくスクリーニングシステム |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007049943A (ja) * | 2005-08-18 | 2007-03-01 | Kyoto Univ | 細胞内カルシウムイオン指示機能を有するポリペプチド |
JP2017509340A (ja) * | 2014-03-17 | 2017-04-06 | エージェンシー フォー サイエンス, テクノロジー アンド リサーチ | 核因子−κBの移行に基づいて化合物の毒性を予測するための方法 |
JP2017195834A (ja) * | 2016-04-28 | 2017-11-02 | 富士フイルム株式会社 | 生体試料評価システムおよび生体試料評価方法並びに生体試料評価制御プログラム |
WO2017187908A1 (ja) * | 2016-04-28 | 2017-11-02 | 富士フイルム株式会社 | 生体試料評価システムおよび生体試料評価方法並びに生体試料評価制御プログラム |
CN108031658A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-05-15 | 泰州海天电子科技股份有限公司 | 一种三极管测试编带后印记不良检测方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE60002562T2 (de) | 2004-04-15 |
WO2000050872A3 (en) | 2001-03-08 |
WO2000050872A9 (en) | 2001-11-15 |
EP1314980A3 (en) | 2004-03-24 |
EP1314980B1 (en) | 2009-12-09 |
EP1314980A2 (en) | 2003-05-28 |
JP3576491B2 (ja) | 2004-10-13 |
CA2362117A1 (en) | 2000-08-31 |
IL144797A0 (en) | 2002-06-30 |
AU3605600A (en) | 2000-09-14 |
WO2000050872A2 (en) | 2000-08-31 |
EP1155304B1 (en) | 2003-05-07 |
CA2362117C (en) | 2004-11-30 |
ATE239907T1 (de) | 2003-05-15 |
EP1155304A2 (en) | 2001-11-21 |
DE60002562D1 (de) | 2003-06-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3576491B2 (ja) | 細胞ベースのスクリーニング用のシステム | |
JP3863372B2 (ja) | プロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸、組換え発現ベクター、プロテアーゼバイオセンサー、化合物を同定する方法、及び化合物を同定するためのキット | |
US6875578B2 (en) | System for cell-based screening | |
JP4693382B2 (ja) | 光学システムによる細胞の解析 | |
JP3683591B2 (ja) | 細胞に基づくスクリーニングシステム | |
US6986993B1 (en) | System for cell-based screening | |
JP3466568B2 (ja) | 細胞ベースのスクリーニング用のシステム | |
US6756207B1 (en) | System for cell-based screening | |
JP2002525603A (ja) | 細胞ベースのスクリーニングのためのシステム | |
WO2000070342A2 (en) | Optical system analysis of cells | |
MXPA01002684A (en) | A system for cell-based screening |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040122 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20040302 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040615 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040707 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3576491 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080716 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090716 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100716 Year of fee payment: 6 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100716 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110716 Year of fee payment: 7 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120716 Year of fee payment: 8 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120716 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130716 Year of fee payment: 9 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |