KR100414781B1

KR100414781B1 - ＮＦ-κＢ 발현을 인간 피부세포에서 정량적으로 측정하기위한 안정한 분석시스템 및 그의 용도

Info

Publication number: KR100414781B1
Application number: KR10-2000-0070557A
Authority: KR
Inventors: 김영식; 이진선; 문기영; 한범수; 안광석
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2000-11-24
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2004-01-13
Also published as: KR20020040494A

Abstract

본 발명은 NF-κB 발현을 인간 피부세포에서 정량적으로 측정하기 위한 안정한 분석시스템 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 NF-κB에 전사 리포터(transcription reporter)로 분비성 알칼라인 인산화효소(secretory alkaline phosphatase, SEAP)를 발현하는 유전자와 선별마커(selectable marker)로 네오마이신 인산화전이효소(neomycin phosphotransferase, NPT)를 발현하는 유전자를 융합시켜 제조한 발현벡터를 피부세포에 형질감염시킨 후, 상기 형질감염된 피부세포주에서 NF-κB 발현을 정량적으로 측정하는 분석시스템 및 상기 분석시스템을 피부 미백제, 항염증제 또는 항산화제의 스크리닝에 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 NF-κB 발현을 측정하는 분석시스템은 형광기질을 사용하여 민감성이 매우 우수하고 측정방법이 단순하여 다양한 천연물과 유기화합물로부터 미백제, 항염증제 또는 항산화제를 효율적으로 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＮＦ-κＢ 발현을 인간 피부세포에서 정량적으로 측정하기 위한 안정한 분석시스템 및 그의 용도{A cell-based stable assay system for monitoring NF-κB activity and a use thereof}

본 발명은 NF-κB 발현을 인간 피부세포에서 정량적으로 측정하기 위한 안정한 분석시스템 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 NF-κB에 전사 리포터(transcription reporter)로 분비성 알칼라인 인산화효소(secreted alkaline phosphatase, 이하 "SEAP"이라 약칭함)를 발현하는 유전자와 선별마커(selectable marker)로 네오마이신 인산화전이효소(neomycin phosphotransferase, 이하 "NPT"라 약칭함)를 발현하는 유전자를 융합시켜 제조한 발현벡터를 피부세포에 형질감염시킨 후 상기 형질감염된 패부세포주에서 NF-κB 발현을 정량적으로 측정하는 분석시스템 및 상기 분석시스템을 피부 미백제, 항염증제 또는 항산화제의 스크리닝에 사용하는 용도에 관한 것이다.

피부는 신체의 표면을 덮고 있는 조직으로 표피, 진피 및 피하지방층으로 이루어지며, 피부 부속기로는 한선, 피지선, 모발 및 손·발톱 등이 있다. 성인의 평균 피부 면적은 1.6 m²이고, 중량은 체중의 16%로 피부는 인체에서 가장 크고 구조, 기능, 해부학 및 생리학적으로 그 기능이 매우 복잡한 기관이다.

피부를 표면에서 수직으로 잘라 현미경으로 관찰하면 상피조직인 표피와 결체조직인 진피 그리고 피하지방층으로 이루어진 피부 조직의 단면을 관찰할 수 있다. 표피는 주로 중층 편평 각화 상피(stratified squamous cornifyingepithelium)로서 각질 형성 세포(keratinocyte)로 이루어져 있으며, 그 외에 멜라닌 세포(melanocyte), 랑게르한스 세포(Langerhans cell) 및 머켈 세포가(Merkel cell) 존재한다. 각질 형성 세포는 표피의 주요 구성성분으로서, 표피의 바깥부분에서부터 각질층, 투명층, 과립층, 유극층 및 기저층의 5개 층으로 이루어져 있다. 표피에서는 매일 수백만 개의 새로운 세포들이 만들어지는데, 이들은 한 장소에 머무르지 않고 표피의 가장 바깥쪽으로 계속해서 밀려나오며, 밀려 나오는 동안에 점점 딱딱한 각질로 바뀌어진다. 표피의 세포는 기저층에서 처음 만들어지며 점차 표면으로 밀려나오면서 모양과 기능이 변하게 된다. 표피는 각화됨에 따라 기저층 -> 유극층 -> 과립층 -> 투명층 -> 각질층으로 모양이 변하게 되며, 이들 세포들은 모두 각질을 형성하는 과정에서 만들어진 세포이므로 각질 형성 세포라고 부른다. 각질 형성 세포의 분화과정은 기저세포의 분열과정, 유극세포에서의 합성·정비과정, 과립세포에서의 자기분해 과정, 각질세포에서의 재구축 과정의 4단계에 걸쳐서 일어나며 분화의 마지막 단계로 각질층이 형성된다. 이와 같은 과정을 각화과정이라한다. 각질 형성 세포의 수명은 약 28일이며, 부위에 따라 조금씩 다르나 매일 수백만 개씩 떨어져 나가고 아래의 층으로부터 수백만 개의 새로운 세포가 생성되어 올라온다. 인체의 피부 표면에서는 노화된 각질세포가 계속 떨어져 나가고 있으며, 노화된 피부에서는 각질층이 떨어져 나가는데 더 많은 시간이 걸리므로 각질층이 두꺼워지게 된다. 따라서, 각질 형성 세포의 기능이 저하되면 죽은 세포가 더욱 늘어나게 되고 이것은 잔주름과 피부 거칠어짐의 원인이 된다.

한편, 피부는 자외선이나 환경에 존재하는 여러 가지 화학 합성 물질과 같은 자극에 대한 1차 수용기관으로서, 자연적으로 발생하는 활성산소나 유리기 등을 소거하기 위하여 또는 자외선의 투과를 막기 위하여 멜라닌(melanin)을 생성한다. 각질 형성 세포와 멜라닌 세포는 사람의 피부에서 멜라닌을 생산하는 기능적 단위이다. 멜라닌의 합성을 조절하는 티로시나제(tyrosinase)는 멜라닌 세포에서만 만들어지며, 멜라닌 세포는 멜라닌을 합성해서 주위의 각질 형성 세포로 전달한다. 각질 형성 세포는 멜라닌 세포의 분열이나 분지정도(dendricity) 및 멜라닌의 합성에 영향을 미치는 주위인자(paracrine factor)를 합성하기 때문에, 멜라닌 세포의 성장에는 각질 형성 세포-멜라닌 세포 간의 긴밀한 상호작용이 필요하다.

멜라닌을 만드는 출발물질은 인체에 정상적으로 존재하는 아미노산의 일종인 티로신(tyrosin)이다. 티로신은 멜라닌 세포 내에서 티로시나제에 의해 산화되어 도파(DOPA)로 변하고, 도파는 더욱 산화되어 도파퀴논으로 바뀐다. 도파퀴논은 이후 자동산화반응이 일어나 5,6-디하이드록시인돌(5,6-dihydroxyindole)을 거치면서 인돌-5,6-퀴논(indole-5,6-quinone)이 형성되고 최종적으로 흑갈색의 멜라닌을 만들어 낸다. 이러한 멜라닌 생성에 관여하는 내적 요인으로는 유전적 요인, 호르몬 양의 부조화, 각종 소화기 계통의 질환 등이 있고, 외적 요인으로는 피부 또는 체내로 유입되는 각종 화장품·약물 등의 이물질, 피부염증성 질환 및 환경요인 등을 들 수 있다.

태양광선 중에서 자외선 A(320-400 nm)와 자외선 B(290-320 nm)는 지상에 도달하여 피부에 영향을 주는데, 자외선 A는 장파장의 자외선으로 진피 깊숙히 침투하여 색소침착 및 콜라겐(collagen) 손상 등을 일으키며, 자외선 B는 파장이 짧고 에너지가 높은 자외선으로 표피와 진피의 상부까지 침투하여 색소침착 및 일광화상을 일으킨다. 정상인의 각질 형성 세포는 자외선에 노출되면 NO를 방출하게 되고, 이와 같이 방출된 NO가 멜라닌 세포에서 티로시나제 활성을 증가시켜서 멜라닌의 합성을 유발한다. 따라서, NO는 자외선에 의한 멜라닌 합성에서 각질 형성 세포의 주위인자 역할을 한다. 결국 피부가 자외선 A나 자외선 B에 노출되면 멜라닌의 합성이 증가되고, 각질 형성 세포로 전달되는 멜라닌의 양도 증가되어 피부가 검게 되는 것이다. 또한, 멜라닌 생성 자극호르몬의 작용에 의해서 멜라닌의 생성이 증가되어 피부가 검게되기도 한다.

멜라닌은 일차적으로 피부에서 자외선을 흡수하거나 산란시켜 피부 내부의 세포나 조직들이 자외선에 의해 손상되는 것을 막아주는 작용을 하는데, 특별한 최대 흡수파장이 없으며 전 영역의 빛을 흡수한다. 반면, 멜라닌은 활성산소를 소거하는 능력이 탁월하나 때로는 멜라닌 자체가 활성산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조 내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고 멜라닌 자체가 유리기의 성질을 나타내기도 한다.

피부에서 멜라닌의 과도한 침착을 방지하기 위하여 멜라닌 생합성 경로 중 각 단계를 차단하는 방법들이 연구되어 왔는데, 1) 피부가 자외선에 노출되는 것을 방지하거나, 2) 티로시나제 저해제를 사용하여 멜라닌 합성을 억제하거나, 3) 멜라닌 세포에 특이적으로 독성을 나타내는 물질을 투여하거나, 4) 생성된 멜라닌의 배출을 촉진하는 방법들이 개발되었다.

상기의 작용기전 별로 피부의 과색소 침착을 방지하기 위한 물질들을 분류해 보면 피부에 조사되는 자외선을 차단하기 위한 자외선 흡수제와 무기안료 등의 자외선 산란제; 비타민 C나 코지산(kojic acid), 알부틴(arbutin) 등의 티로시나제 저해제; 하이드로퀴논류의 멜라닌 세포에 독성을 나타내는 물질; 토코페롤 같이 멜라닌 생성을 촉진시키는 활성산소나 유리기를 소거하는 물질; 및 각질박리를 촉진하여 생성된 멜라닌을 제거하는 AHA(alpha-hydroxy acid) 등이 있다.

한편, 환경의 자극이나 화학물질은 포유동물에서 유전자의 발현을 변화시킬 수 있다. 유전자의 발현은 자극이나 화학물질에 대해서 세포가 반응하는 분자수준에서의 작용기전에 관한 연구를 통하여, 전사 수준에서 또는 다양한 전사 조절인자의 협동에 의해서 조절된다는 것이 알려져 있다. 이러한 전사 조절인자 가운데 NF-κB는 염증이나 면역반응에 관여하는 유전자의 조절에 있어서 중요한 역할을 하고 있다고 보고되었다. NF-κB는 평소에는 저해 단백질인 I-κB와 세포질 내에서 결합한 형태의 불활성 복합체를 형성하고 존재하다가 세포가 다양한 NF-κB 활성물질, 예를 들면 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 인터루킨-I, 리포다당류(lipopolysaccharide) 그리고 자외선 등에 노출되면 저해 단백질인 I-κB의 인산화가 유발되어 결국 I-κB가 분리된다. I-κB가 분리되면 NF-κB가 세포핵 내부로 이동하게 되고 여기에서 목표 유전자의 발현을 야기시킨다.

전술한 바와 같이, 피부는 여러 가지 자극, 예를 들면 자외선이나 환경의 화학물질 등에 대한 일차적인 수용기관이기 때문에 피부세포에서의 NF-κB의 활성은여러 가지 질환의 치료에 있어서 중요한 표적이 되고 있다. 따라서, 피부세포에서의 NF-κB의 활성을 측정하고자 하는 방법들이 개발되고 있으며, 이들 중 배양 세포나 완전한 조직 모델에서 NF-κB 활성을 측정하는 방법으로 전기영동 이동 전이법(electrophoretic mobility shift assay), p65의 세포핵으로의 이동(nuclear translocation), NF-κB에 의해 유도되는 유전자의 교차활성(transactivation) 그리고 NF-κB에 의해 조절되는 단백질 발현의 측정 등의 몇 가지 방법이 알려져 있었다. 하지만, 상기 측정방법들은 민감도가 떨어지고, 세포를 용혈(lysis)하거나 전기영동, 또는 UV를 사용해야하는 등의 번거로움이 문제점으로 지적되고 있으며 NF-kB의 활성을 정량적으로 측정할 수 없다.

이에 본 발명자들은 NF-κB의 활성을 보다 용이하게 정량적으로 측정하고 더 나아가 이를 이용하여 천연물과 유기합성화합물로부터 미백제, 항염증제 및 항산화제의 효율적인 스크리닝을 위한 분석시스템을 개발하고자 연구한 결과, 여러 가지 합성 화합물이나 천연물에 의한 NF-κB 활성의 변화를 정량적으로 측정하는 유용한 방법으로 전사리포터 SEAP과 선별마커 NPT를 이용하는 안정한 분석시스템을 개발하였고, 상기 분석시스템이 민감성이 매우 우수하고 측정방법이 단순하여 다양한 미백제, 항염증제 또는 항산화제의 효율적 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 외부 자극에 의해서 사람 피부세포에서 유도되는 NF-κB의 발현을 용이하게 정량적으로 측정할 수 있는 분석시스템을 개발하고, 상기 분석시스템을 다양한 천연물이나 유기합성화합물로부터 미백제, 항염증제 및 항산화제의 스크리닝에 사용하는 용도를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 발현벡터 pNF-κB-SEAP-NPT의 유전자 개열지도를 나타낸 것이고,

도 2는 제한효소로 절단한 pNPT의 아가로즈 젤 전기영동 사진이고,

1 ; λ 파지(phage) DNA를HindIII로 절단한 분자량 마커(marker)

2 ; φX174를HincII로 절단한 분자량 마커

3 ; pNPT (PCR 생성물, 1369 bp)

4 ; pNPT를HindIII로 절단한 DNA 단편(960 bp + 410 bp)

5 ; pNPT를PstI으로 절단한 DNA 단편(730 bp + 640 bp)

도 3은제한효소로 절단한 pNF-κB-SEAP-NPT의 아가로즈 젤 전기영동 사진이고,

1 ; λ 파지 DNA를HindIII로 절단한 분자량 마커

2 ; φX174를HincII로 절단한 분자량 마커

3 ; pNF-κB-SEAP-NPT를MluI으로 절단한 DNA 단편

4 ; pNF-κB-SEAP-NPT를KpnI으로 절단한 DNA 단편

5 ; pNF-κB-SEAP-NPT를HindIII으로 절단한 DNA 단편

도 4는 pNF-κB-SEAP-NPT에 감염된 HaCaT 세포에서, 비타민 C의 농도에 따른 SEAP의 검출 변화를 시간별로 확인한 그래프이고,

□ ; 대조군 ▨ ; 10 mM ▧ ; 50 mM

도 5는pNF-κB-SEAP-NPT에 감염된 HaCaT 세포에서, NAC의 농도에 따른 SEAP의 검출 변화를 시간별로 확인한 그래프이고,

□ ; 대조군 ▨ ; 10 mM ▧ ; 50 mM

도 6은pNF-κB-SEAP-NPT에 감염된 HaCaT 세포에서, PMA의 농도에 따른 SEAP의 검출 변화를 시간별로 확인한 그래프이고,

□ ; 대조군 ▨ ; 600 nM ▧ ; 1200 nM

□ ; 대조군 ▨ ; 10 mM ▧ ; 50 mM

도 7은 pNF-κB-SEAP-NPT에 감염된 HaCaT 세포에서, 코지산의 농도에 따른 SEAP의 검출 변화를 시간별로 확인한 그래프이고,

□ ; 대조군 ▨ ; 10 mM ▧ ; 25 mM

도 8은 pNF-κB-SEAP-NPT에 감염된 HaCaT 세포에서, 각각 10 mM의 코지산, 알부틴, NAC 그리고 비타민 C를 첨가한 후 48시간에 SEAP의 검출 변화를 확인한 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NF-κB에 전사리포터 SEAP와 선별인자 NPT 유전자를 융합시킨 발현벡터(pNF-κB-SEAP-NPT)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 형질감염시킨 형질감염 사람 피부세포주를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 형질감염된 피부세포주를 이용하여 NF-κB 활성을 정량적으로 측정하는 분석시스템을 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 상기 형질감염 피부세포주를 이용한 분석시스템을 천연물과 유기합성화합물로부터 미백제, 항염증제 및 항산화제의 스크리닝에 이용하는 효율적인 새로운 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 NF-κB에 전사리포터 SEAP와 선별인자 NPT 유전자를 융합시킨 발현벡터(pNF-κB-SEAP-NPT)를 제공한다.

본 발명자들은 NF-κB에 SEAP와 NPT가 융합된 발현벡터를 제조하기 위하여우선 PCR을 수행하여 SV40 인핸서(enhancer)와 초기 프로모터(early promoter), SV40의 최소 복제근원(minimum origin of replication), NPT의 코딩부위 및 폴리아데닐화 신호서열을 포함하는 전체길이(full-length) 1369 bp의 네오마이신 선별 마커 클론(neomycin selectable marker clone)을 제조하였다. 상기 PCR 생성물을 제한효소 처리 후 전기영동하여 전체 길이의 네오마이신 선별 마커 클론이 증폭되었음을 확인하였고(도 2참조) 이를 pNPT라 명명하였다.

상기에서 제조된 네오마이신 선별 마커 클론 DNA를 전사리포터인 SEAP가 포함된 NF-κB 발현벡터에 클로닝하여 융합 발현벡터를 제조하였고(도 1참조) 이를 pNF-κB-SEAP-NPT라 명명하였다. 상기 발현벡터에 네오마이신 선별마커클론 DNA가 클로닝되었음을 벡터 DNA에 제한효소를 처리한 후 전기영동을 수행하여 확인하였다. 또한, 상기 제한효소 처리에 의해 얻은 발현벡터의 삽입부분을 자동 DNA 분석기로 염기서열을 분석한 결과, 발현벡터에 네오마이신 선별 마커 클론 DNA 단편이 올바르게 삽입되었음을 확인하였다.

상기에서 전사리포터로 사용된 SEAP는 세포 밖으로 분비되기 때문에 전사리포터로서 몇 가지 장점을 가지고 있다. 먼저, SEAP은 세포 밖으로 분비되는 리포터 단백질이므로 상기 효소의 활성을 측정하기 위하여 세포를 용혈(lysis)시킬 필요가 없으며, 감염된 세포가 손상되지 않고 남아있기 때문에 유전자 발현의 동역학(kinetics)이 동일한 배양액에서 반복적으로 측정될 수 있고 상기 세포는 이후의 실험에 계속 사용될 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 대부분의 내인성 알칼라인 인산화효소와는 달리 SEAP는 열에 안정하기 때문에, 내인성 알칼라인 인산화효소에 의한 배경 신호(background signal)를 활성 측정 전에 세포배양 검체를 65℃에서 가열함으로써 제거할 수 있어 민감성이 매우 우수하다.

상기에서 전사리포터는 SEAP, 루시퍼라제(luciferase), β-갈락토시다제(β-galactosidase) 및 GFP(green fluorescent protein)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 선별 마커 유전자는 NPT, CAT(chloramphenicol acetyltransferase), β-갈락토시다제(β-galactosidase, lacZ)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 형질감염시킨 형질감염 피부세포주를 제공한다.

본 발명자들은 인간의 피부세포에서 다양한 화학물질 및 천연물질에 의해 유도되는 NF-κB 발현의 변화를 정량적으로 측정하기 위하여, 전사리포터 SEAP와 선별마커 NPT를 포함하는 NF-κB 융합 발현벡터를 인간 피부세포인 HaCaT 세포에 형질감염시킨 안정적인 분석시스템을 개발하였다. HaCaT 세포는 인간의 피부세포가 인위적으로 형질전환되어서(transformed) 죽지 않게된(immortalized) 인간 각질 형성 세포이며 상기 HaCaT 세포는 정상의 각질 형성 세포와 유사한 형태로 분화하며 또한 유사한 성질을 가지므로 피부세포주로 선택 사용되었다.

상기 HaCaT 세포에 pNF-κB-SEAP-NPT 발현벡터를 형질감염 시키기 위하여 HaCaT 세포에 NF-κB-SEAP-NPT 발현벡터를 리포펙타민을 이용하여 형질감염 시킨 후 형질감염된 HaCaT 세포를 선별하고 안정하게 유지하기 위하여 제네티신이 포함된 배지에서 세포를 배양하였다.

NF-κB에 전사리포터 SEAP 발현 유전자와 선별마커 NPT 발현 유전자가 융합된 발현벡터에 의해 형질감염된 HaCaT 세포는 선별마커인 NPT의 발현에 의해 항생제인 제네티신에 저항성이 생겨 제네티신 함유배지에서 생장하게 되고, 이로부터 상기 발현벡터가 안정하게 발현되는 형질감염된 HaCaT 세포를 확보하였으며 이를 한국세포주연구재단에 2000년 11월 13일 자로 기탁하였다(수탁번호: KCLRF-BP-00035).

상기에서 NF-κB 융합 발현벡터로 형질감염된 선별된 피부세포주가 NF-κB의 활성에 대한 전사리포터로서 SEAP를 발현하여 세포 외로 분비하는지 확인하기 위하여 리포터 효소의 활성도를 측정하였다.

우선 리포터 유전자 분석 반응을 위하여, 비타민 C와 NAC(N-acetyl-L-cystein) 등과 같은 NF-κB 활성저해제와 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)와 같은 NF-κB 활성촉진제를 사용하여 SEAP의 발현량을 측정하였다. 이때 형질감염 피부세포주로부터 발현되어 세포 외로 분비된 SEAP의 효소 활성을 측정하기 위한 형광기질로서 4-메틸움벨리페릴 인산염(4-methylumbelliferyl phosphate, MUP)를 사용하였다. MUP는 NF-κB의 발현과 동시에 분비된 SEAP에 의해 분해되고, 이로부터 생성된 분해물의 형광을 측정하여 NF-κB의 발현 변화를 검출할 수 있다.

그 결과, 대조군의 경우에는 배양 후 3시간 경과한 때부터 SEAP가 검출되어배양기간 동안 시간 의존적인 방법으로 그 양이 증가하였다. NF-κB의 활성저해제로 알려진 비타민 C와 NAC로 처리된 음성실험군에서는 대조군에 비하여 NF-κB의 활성이 농도 의존적으로 저해되었다. 반면, NF-κB 활성 촉진제인 PMA가 처리된 양성실험군에서는 NF-κB의 활성이 대조군에 비하여 상당히 증가되었음을 확인하였다. 코지산 및 알부틴 등의 티로시나제 저해제 역시 NF-κB 유전자의 발현을 저해하였다(도 4내지도 8참조).

상기의 결과로부터, 본 발명의 NF-κB에 SEAP 발현유전자 및 NPT 발현유전자가 융합된 발현벡터가 형질감염된 형질감염 피부세포주에서 NF-κB의 발현과 동시에 전사리포터 효소인 SEAP가 발현되어 세포 외로 분비되며, 이와 같이 분비된 SEAP의 효소활성을 형광기질을 이용한 형광측정법으로 측정함으로써 NF-κB의 발현을 시간 및 시료물질농도 측면에서 정량적으로 측정할 수 있는 분석시스템임을 확인하였다.

상기에서, 형광기질은 4-메틸움벨리페릴 인산염 (4-methylumbellifery phosphate, MUP) 및 p-니트로페닐 인산(p-nitrophenyl phosphate)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 피부세포에서 NF-κB의 활성을 측정하는 분석시스템은 NF-κB의활성과 동시에 전사리포터인 SEAP가 발현되어 세포 외로 분비되며 이와 같이 분비된 SEAP의 양을 형광기질을 이용한 형광측정법으로 측정하여 NF-κB의 발현을 정량적으로 모니터링할 수 있다. 따라서, 본 발명의 NF-κB 발현을 측정하는 분석시스템은 민감성이 매우 우수하고 측정방법이 단순하여 다양한 미백제, 항염증제 또는 항산화제의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> NF-κB 발현벡터의 제조

<1-1> 네오마이신 선별마커 클론의 제조

본 발명자들은 NF-κB에 SEAP 발현유전자와 NPT 발현유전자가 융합된 발현벡터를 제조하기 위하여 우선 네오마이신 선별마커 클론을 하기와 같이 제조하였다.

구체적으로, SV40 인핸서(enhancer)와 초기 프로모터(early promoter), SV40의 최소 복제근원(minimum origin of replication), NPT의 코딩부위 및 폴리아데닐화 신호서열을 포함하는 전체길이(full-length) 1369 bp의 네오마이신 선별 마커 클론(neomycin selectable marker clone)을 제조하기 위하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 네오마이신 선별 마커에 상보적으로 디자인된 것으로서 Applied Biosystems Inc. 사의 Model 380B DNA 합성기를 이용하여 제조되었으며,서열번호 1및서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지고 있다. PCR 반응액은 주형으로 사용되는 pCl-neo 벡터(Promega) 10 ng, 상기 프라이머 각각 100 pmol, dNPT 0.2 mM, 1×반응 완충용액, 2.5 unit의 Taq 중합효소를 포함하며 전체부피를 100 ㎕로 맞추어 사용하였다. PCR은 95℃에서 60초, 55℃에서 60초, 72℃에서 90초의 반응조건에서 30회 수행하였다. 이로부터 얻은 PCR 생성물을 제한효소HindIII와PstI(New England Biolabs, Beverly, MA)으로 각각 절단한 후 1.2% 아가로즈 젤에서 전기영동을 수행하였다.

그 결과HindIII 처리에 의해 960 및 410 bp의 DNA 단편이 검출되고PstI 처리에 의해 730 및 640 bp의 DNA 단편이 검출되어(도 2) 상기 PCR 생성물이 전체길이의 네오마이신 선별 마커 클론임을 확인하고 이를 pNPT라 명명하였다.

<1-2> 융합 발현벡터의 제조

상기 실시예 <1-1>에서 제조된 네오마이신 선별 마커 클론 pNPT와 pNF-κB-SEAP(Palo Alto, CA)에 2 내지 10 unit의 제한효소MluI을 처리하여 37℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 이와같이 절단된 pNPT와 pNF-κB-SEAP DNA를 1% 아가로즈 젤에서 전기영동하여 각각의 DNA 단편을 얻고, Bio101 키트(New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 젤로부터 DNA 단편을 분리하였다. 이로부터 얻은 pNPT와 pNF-κB-SEAP DNA 단편을 포함하는 융합 발현벡터를 제조하기 위하여 라이게이션(ligation)을 수행하였다.MluI 제한효소에 의해서 절단된 pNF-κB-SEAP 4 ㎕와 pNPT 12 ㎕ 혼합물에 2 유니트의 T4 DNA 라이게이즈(ligase, UnitedStates Biochemicals, Cleveland, OH)를 첨가한 후 4℃에서 밤새 반응시켜 융합 발현벡터를 제조하였고 이를 pNF-κB-SEAP-NPT라 명명하였다(도 1). 상기 발현벡터 pNF-κB-SEAP-NPT에 pNPT가 클로닝(cloning)되었는지 확인하기 위하여 벡터 DNA 10 ㎕를HindIII,MluI 또는KpnI으로 절단한 후 전기영동을 수행하여 밴드의 크기를 확인하였다.

그 결과, pNF-κB-SEAP-NPT 발현벡터는KpnI에 의해서는 절단되지 않고MluI과Hind III에 의해 절단되어 약 1370 bp 크기의 pNPT 밴드와 4850 bp 크기의 pNF-κB-SEAP 밴드가 검출되어 상기 발현벡터에 pNPT가 클로닝되었음을 확인하였다(도 3). 또한, 상기 제한효소 처리에 의해 얻은 발현벡터의 삽입부분을 프리즘 디데옥시 종결 싸이클 염기서열 분석키트를 이용하여 시퀀싱한 후 자동 DNA 분석기로 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 발현벡터 pNF-κB-SEAP-NPT에 pNPT DNA 단편이 올바르게 삽입되었음을 확인하였다.

<실시예 2> 발현벡터 pNF-κB-SEAP-NPT의 형질감염

본 발명자들은 인간의 피부세포에서 다양한 화학물질 및 천연물질에 의해 유도되는 NF-κB 발현의 변화를 정량적으로 측정하기 위하여 상기 실시예에서 제조된 발현벡터 pNF-κB-SEAP-NPT를 인간 HaCaT 세포에 형질감염시켜 안정적인 분석시스템을 개발하였다. 구체적으로, HaCaT 세포는 10%의 소태아혈청, 100 unit/㎖의 페니실린 그리고 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하는 DMEM 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY)에 접종하여 95% 공기, 5% 이산화탄소 존재 하에서 37℃ 세포배양기를 사용하여 아포화(subconfluence) 상태로 배양하였다. 세포의 수는 헤모사이토미터(homocytometer)를 사용하여 세었고, 살아있는 세포는 트립판 블루(trypan blue)로 염색하여 확인하였다.

상기 HaCaT 세포를 pNF-κB-SEAP-NPT 발현벡터를 형질감염시키기 위하여 부착세포의 안정한 감염을 위해 일반적으로 사용되는 방법(Staedel C., Remy J.S., et al.J. Invest. Dermatol. 102,768-772,1994)을 약간 변형시켜 하기와 같이 수행하였다. 우선, 3×10⁵cells/ml 농도의 HaCaT 세포 2 ml을 상기 DMEM 배지가 첨가된 6-웰 플레이트(35 mm, costar, Cambridge, MA)에 접종하여 밤새 배양하였다. 배양된 세포를 혈청이 제거된 DMEM 배지로 두번 세척한 후 상기 세포에 6 ㎍/100 ㎕의 pNF-κB-SEAP-NPT 발현벡터와 25 ㎍/100 ㎕의 리포펙타민(lipofectamine, Life Technologies)을 포함하는 복합체를 첨가한 혈청이 없는 DMEM 배지로 최종부피를 1 ml로 맞춘 뒤 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상기 세포를 혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 후, 발현벡터 pNF-κB-SEAP-NPT가 형질감염된 HaCaT 세포를 선별하고 안정하게 유지하기 위하여 500 ㎍/㎖의 제네티신(Gibco BRL)이 포함된 배지를 사용하여 세포를 배양하였다.

그 결과, 발현벡터 pNF-κB-SEAP-NPT가 형질감염된 세포는 선별마커인 NPT 유전자의 발현에 의해 제네티신 저항성이 생겨 제네티신 함유배지에서 생장하게 되고 이로부터 pNF-κB-SEAP-NPT 벡터가 안정하게 발현되는 형질감염된 HaCaT 세포를 확보하였다. 상기와 같이 선별된 형질감염 HaCaT 세포주를 한국세포주은행에 2000년 11월 13일 자로 기탁하였다(수탁번호: KCLRF-BP-00035).

<실시예 3> 리포터 유전자 (SEAP) 분석

상기 실시예 2에서 선별된 pNF-κB-SEAP-NPT 발현벡터가 형질감염된 인간 HaCaT 세포가 NF-κB의 활성으로 인해 전사리포터 효소인 SEAP를 발현하여 세포 외로 분비하는지 확인하기 위하여 리포터 효소의 활성도를 측정하였다.

우선 형질감염된 세포(3×10⁶세포)를 제네티신(500 ??g/ml)이 포함된 DMEM 배지(5 ㎖)로 T-25 플라스크에서 24시간 동안 배양한 후에 상기 세포를 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)으로 2번 세척하고 새로운 배지를 넣어줌으로써 리포터 효소의 활성도 측정을 시작하였다. 24 시간 후에 NF-κB의 활성저해제로서 비타민 C와 NAC 또는 NF-κB의 활성촉진제로서 PMA를 상기 배지에 첨가하였다. 대조군과 상기 화합물이 처리된 배지를 배양하면서 0, 3, 20, 24, 48 그리고 72 시간 경과때마다 25 ㎕의 배양액 시료를 취하였다. 상기 시료에서 내인성(endogenous) 알칼라인 포스파타제 활성을 제거하기 위하여 배양액을 65℃에서 5분간 가열하였고 이를 즉시 분석에 사용하거나 -20℃에 저장하여 보관하였다. 비타민 C와 NAC는 배지에 직접 용해하여 사용하였으며, PMA는 배지에 대한 DMSO의 최종농도가 0.1%가 되도록 DMSO에 용해한 후 24시간 경과한 뒤에 상기 배지에 첨가하였다. 유전자 리포터 효소의 활성도 측정을 하기 위하여, 25 ㎕의 희석 완충용액(dilution buffer), 97 ㎕의 분석 완충용액(assay buffer), 25 ㎕의 세포배양액 시료 그리고3 ㎕의 형광기질 4-메틸움벨리페릴 인산염(4-methylumbelliferyl phosphate, MUP, 1 mM)을 포함하는 반응 혼합물을 최종부피 150 ㎕로 맞추어 96-웰 플레이트에 첨가한 후 어두운 곳에서 실온으로 60분 동안 반응시켰다. NF-κB의 발현과 동시에 분비되는 SEAP에 의해 형광기질로 첨가된 MUP가 분해되고, 이로부터 생성된 분해물의 형광을 측정하여 NF-κB의 발현변화를 정량적으로 검출하기 위하여 SEAP 형광검출 키트(Great EscApe SEAP System Kit, Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA)를 사용하였다. 상기 SEAP/MUP의 분해물로부터 나오는 형광은 360 nm의 파장에서 여기(excitation)하며, 449 nm에서 방출되는 빛의 양을 96-웰 플레이트 플루오로미터(fluorometer, Molecular Devices, F max)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 대조군의 경우에는 배양 후 3시간 경과한 때부터 SEAP가 검출되었으며 72시간까지 시간 의존적인 방법으로 그 양이 증가하였다(도 4내지도 7). NF-κB의 활성을 저해한다고 알려진 비타민 C 및 NAC가 첨가된 경우 각각 10 mM 농도로 처리된 음성실험군에서는 대조군에 비하여 NF-κB의 활성이 처리 후 24시간 경과 뒤에 각각 25%와 50% 저해되어 NF-κB의 활성이 첨가된 활성억제제의 농도에 의존적으로 저해됨을 알 수 있었다(도 4내지도 5). 반면, NF-κB 활성 촉진제인 PMA가 600 nM와 1200 nM의 농도로 처리된 양성실험군에서는 NF-κB의 활성이 대조군에 비하여 처리 후 24시간에 70% 증가하였다(도 6). 티로시나제 저해제로 알려진 코지산(천연물)과 알부틴(유기합성화합물)이 NF-κB 의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 상기와 동일한 실험을 한 결과, 이 물질들이 NF-κB 의 활성을 저해하는 물질로 판명되었다(도 7내지도 8). 상기의 결과로부터 본 발명의 pNF-κB-SEAP-NPT 발현벡터가 형질감염된 인간 HaCaT 세포에서 NF-κB의 발현과 동시에 SEAP가 분비되며, 이와 같이 NF-κB 활성의 결과로 분비된 SEAP의 활성도를 측정함으로서 NF-κB의 발현을 정량적으로 측정할 수 있으므로, 본 발명의 분석시스템이 천연물이나 유기합성물질로부터 NF-κB의 활성에 영향이 있는 물질을 효율적으로 스크리닝할 수 있는 분석시스템임을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 인간 피부세포에서 NF-κB의 활성을 측정하는 분석시스템은 NF-κB의 활성과 동시에 전사리포터인 SEAP가 발현되어 세포 외로 분비되며 이와 같이 분비된 SEAP의 양을 형광기질을 이용한 형광측정법으로 측정하여 NF-κB의 발현을 정량적으로 모니터링할 수 있다. 따라서, 본 발명의 NF-κB 발현을 측정하는 분석시스템은 민감성이 매우 우수하고 측정방법이 단순하여 효율적으로 다양한 천연물과 유기화합물로부터 미백제, 항염증제 또는 항산화제를 스크리닝하는데에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

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NF-κB에 전사리포터 유전자 SEAP(secretory alkaline phosphatase)와 선별마커 유전자 NPT(neomycin phosphotransferase)가 융합된 것을 특징으로 하는, NF-κB의 활성을 정량적으로 측정하기 위한 pNF-κB-SEAP-NPT 발현벡터.
제 4항의 발현벡터 pNF-κB-SEAP-NPT로 형질감염된 HaCaT 세포 (수탁번호: KCLRF-BP-OOO35).
1) 제 5항의 형질감염 HaCaT 세포를 배양하는 단계;

2) 배지에 NF-κB 활성 저해제 또는 촉진제의 후보물질을 첨가하는 단계; 및

3) 세포외로 분비된 SEAP의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 미백제, 항염증제 또는 항산화제의 선별 방법.
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제 6항에 있어서, 단계 3)의 SEAP의 활성 측정은 4-메틸움벨리페릴 인산염(4-methylumbelliferyl phosphate, MUP) 또는 p-니트로페닐 인산(p-nitrophenyl phosphate)을 형광기질로 이용하는 형광측정법으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 선별 방법.
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