ES2173573T5 - Un metodo para extraer informacion cuantitativa relacionada con una influencia sobre una respuesta celular. - Google Patents
Un metodo para extraer informacion cuantitativa relacionada con una influencia sobre una respuesta celular.Info
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Abstract
Una células son genéticamente modificadas de manera que expresen un luminoforo, por ejemplo una proteína fluorescente verde (GFP, EGFP) modificada (F64L, S65T, Y66H) acoplada a un componente de una vía de señalización intracelular, como un factor de transcripción, una proteína quinasa GMPc o AMPc dependiente, una serina/treonina quinasa dependiente de cilina, de calmodulina, o de fosfolípido o activada por mitógeno, una tirosina quinasa, o una proteína fosfatasa (por ejemplo PKA, PKC, Erk, Smad, VASP, actina, p38, Jnk1, PKG, I{ka}B, CDK2, Grk5, Zap70, p85, proteína-tirosina fosfatasa 1C, Stat5, NFAT, NFl{ka}B, RhoA, PKB). Una influencia permite modular la vía de señalización intracelular de tal manera que el luminóforo se redistribuye o transloca con el componente en células vivas de manera determinada experimentalmente, para una correlación con el grado de influencia. Se mide la redistribución registrando la intensidad luminosa, la duración de vida de la fluorescencia, la polarización, eldesplazamiento de longitud de onda, la transferencia de energía de resonancia o de otras propiedades mediante un aparato constituido, por ejemplo, por un microscopio de fluorescencia y una cámara CCD. Unos datos almacenados en forma de imágenes digitales son tratados para obtener números que representan el grado de redistribución. El procedimiento puede utilizarse como un programa de clasificación PATRA identificar un compuesto que modula un componente y es susceptible de tratar una enfermedad asociada a la función del componente.
Description
Un método para extraer información cuantitativa
relacionada con una influencia sobre una respuesta celular.
El presente invento se refiere a un método y unas
herramientas para extraer información cuantitativa en relación con
una influencia sobre una respuesta celular, en particular una
influencia causada por la puesta en contacto o la incubación de la
célula con una sustancia que influye sobre una respuesta celular,
en que la respuesta celular se manifiesta en una redistribución de
por lo menos un componente en la célula. En particular, el invento
se refiere a un método para extraer información cuantitativa en
relación con una influencia sobre una ruta intracelular que implica
una redistribución de por lo menos un componente asociado con la
ruta. El método del invento se puede usar como un procedimiento
muy eficiente para ensayar o descubrir la influencia de una
sustancia sobre un proceso fisiológico, por ejemplo en conexión con
el escrutinio para descubrir nuevos fármacos, el ensayo de
sustancias para determinar su toxicidad, la identificación de
dianas de fármacos para fármacos conocidos o nuevos. Otros usos
valiosos del método y de la tecnología del invento resultarán
evidentes para una persona experta sobre la base de la descripción
siguiente. En una realización particular del invento, el presente
invento se refiere a un método para detectar la translocación o
redistribución intracelular de polipéptidos biológicamente activos,
preferiblemente de una enzima, que afecta a procesos
intracelulares, y a una estructura artificial (construcción) de
ADN y a una célula para usarse en el método.
Las rutas intracelulares son reguladas
estrechamente por una cascada de componentes que experimentan
modulación de una manera característica en el tiempo y en el
espacio. Diversos estados morbosos pueden ser atribuidos a una
actividad alterada de componentes individuales de señalización (es
decir, cinasas de proteínas, fosfatasas de proteínas, factores de
transcripción). Estos componentes se convierten por lo tanto a sí
mismos como dianas atractivas para una intervención terapéutica.
Las cinasas y fosfatasas de proteínas son
componentes bien descritos de diversas rutas de señalización
intracelular. Se supone que la actividad catalítica de las cinasas
y fosfatasas de proteínas desempeña un cometido virtualmente en
todos los procesos celulares regulables. Aunque la implicación de
las cinasas de proteínas en la señalización y regulación celulares
se ha sometido a extensos estudios, con frecuencia es difícil
obtener un conocimiento detallado acerca, p.ej., las características
de temporización y espaciales exactas de los sucesos de
señalización, debido a la falta de una tecnología conveniente.
Se supone que las nuevas maneras de vigilar una
modulación específica de rutas intracelulares en células vivas
intactas, proporciona nuevas oportunidades en el descubrimiento de
fármacos, en las características genómicas funcionales, la
toxicología y la vigilancia de pacientes, etc.
Es posible que la orquestación en el espacio de
la actividad de las cinasas de proteínas sea esencial para el alto
grado de especificidad de cinasas de proteínas individuales. La
fosforilación mediada por cinasas de proteínas es equilibrada por
una actividad de fosfatasa. También dentro de la familia de las
fosfatasas se ha observado una translocación, p.ej. una
translocación de PTP2C a frunces de membranas [(Cossette y
colaboradores, 1996)], y similarmente es probable que sea indicativa
de una actividad de fosfatasa.
Las cinasas de proteínas muestran con frecuencia
una distribución intracelular específica antes de, durante y
después de la activación. Es por lo tanto probable que vigilancia
de los procesos de translocación y/o de la redistribución de cinasas
de proteínas individuales o de subunidades de ellas, sea
indicativa de su actividad funcional. Se ha mostrado una conexión
entre la translocación y la activación catalítica para cinasas de
proteínas tales como la cinasa C de proteínas (PKC, de Protein
kinase C), dependiente del diacil-glicerol
(DAG), la cinasa A de proteínas (PKA) dependiente de cAMP
[(DeBernardi y colaboradores, 1996)] y la cinasa de proteínas
Erk-1 activada por mitógenos [(Sano y
colaboradores, 1995)].
Los métodos corrientemente usados de detección de
la localización intracelular y la actividad de cinasas y fosfatasas
de proteínas son la precipitación inmunitaria, la transferencia de
borrones Western y la detección
inmuno-citoquímica.
Tomando como un ejemplo la familia de las cinasas
de proteínas C's (PKC's) dependientes de
diacil-glicerol (DAG), se ha mostrado que las
isoformas de PKC's individuales, que se distribuyen entre
diferentes tejidos y células, tienen diferentes requisitos de
activadores y experimentan una translocación diferencial como
respuesta a una activación. Las PKC's dependientes de DAG,
catalíticamente inactivas, se distribuyen generalmente por todo el
citoplasma, mientras que ellas, al ser activadas, se translocan
para quedar asociadas con diferentes componentes celulares, p.ej.
una membrana plasmática [(Farese, 1992), (Fulop Jr. y
colaboradores, 1995)], un núcleo [(Khalil y colaboradores, 1992)]
o un citoesqueleto [(Blobe y colaboradores 1996)]. El fenómeno de
la translocación, que es indicativo de una activación de PKC, ha
sido vigilado usando diferentes enfoques: a) la
inmuno-citoquímica en que la localización de
isoformas individuales se puede detectar después de permeabilización
y fijación de las células [Khalil y colaboradores, 1992)]; y b) la
marcación de todas las isoformas de PKC's dependientes de DAG con
un acetato-miristato de forbol (PMA, de phorbol
myristate acetate) marcado fluorescentemente [(Godson y
colaboradores, 1996)]; y c) la marcación química de la PKC b1 con
el fluoróforo Cy3 [(Bastiaens & Jovin 1996)]; y d) la marcación
genética de la PKC\alpha [(Schmidt y colaboradores, 1997)] y de
las PKC\gamma y PKC\varepsilon ([Sakai y colaboradores 1996]).
El primero de los métodos no proporciona ninguna información
dinámica mientras que los últimos métodos sí lo hacen. La marcación
de las PKC's con miristato-acetato de forbol
marcado fluorescentemente no puede distinguir entre diferentes
isoformas de PKC's dependientes de DAG sino que marcará y mostrará
el movimiento de todas las isoformas. Las marcaciones química y
genética de las PKC's dependientes de DAG, específicas,
confirmaron que ellas, de una manera específica para una isoforma
después de su activación, se mueven hacia la periferia o el núcleo
de una célula.
En un método alternativo, la actividad de una
cinasa A de proteínas ha sido medida en células vivas por marcación
química de una de las subunidades de las cinasas (Adams y
colaboradores, 1991). La base de la metodología es que la subunidad
reguladora y catalítica de la cinasa A de proteínas, purificada, es
marcada con fluoresceína y rodamina, respectivamente. A bajos
niveles de cAMP, la cinasa A de proteínas se ensambla en una forma
hetero-tetrámera que hace posible la transferencia
de energía por resonancia de fluorescencia entre dos colorantes
fluorescentes. La activación de la cinasa A de proteínas conduce a
una disociación del complejo, eliminando con ello la transferencia
de energía. Una desventaja de esta tecnología consiste en que la
cinasa A de proteínas, marcada, se ha de microinyectar en las
células que interesan. Esta técnica muy invasiva es complicada y no
es aplicable a un escrutinio a gran escala de sustancias
biológicamente activas. Una desventaja adicional de esta técnica,
en comparación con el invento que aquí se presenta, consiste en que
la cinasa A de proteínas, marcada, no puede ser introducida en
organismos o animales como un transgén.
Mochly-Rosen (Science 268,
páginas 247-51 (1995)) sugieren que la situación de
proteínas de anclaje proporciona algo de la especificidad de las
respuestas mediadas por cinasas. Se sugiere que los inhibidores de
la interacción entre las cinasas y sus proteínas de anclaje pueden
ser útiles como agentes terapéuticos.
Recientemente, se descubrió que la Proteína
Fluorescente Verde (GFP, de Green Fluorescent Protein)
expresada en muchos tipos diferentes de células, inclusive células
de mamíferos, se volvió muy fluorescente [(Chalfie y colaboradores,
1994)]. El documento de Solicitud de Patente Internacional WO
95/07463 describe una célula capaz de expresar la GFP y un método
para detectar una proteína que interesa en una célula basándose en
introducir dentro de una célula de una molécula de ADN que tiene
una secuencia de ADN que codifica la proteína que interesa enlazada
a una secuencia de ADN que codifica una GFP de tal manera que la
proteína producida por la molécula de ADN tendrá la proteína que
interesa fusionada a la GFP, luego cultivar las células en
condiciones que permiten la expresión de la proteína fusionada y
detectar la situación de la fluorescencia en la célula,
localizando con ello la proteína que interesa en la célula. Sin
embargo, no se proporcionan ejemplos de dichas proteínas fusionadas,
y no se ha sugerido el uso de proteínas de fusión con GFP para la
detección o cuantificación de una translocación o redistribución
de polipéptidos biológicamente activos que afectan a procesos
intracelulares después de una activación, tales como las proteínas
implicadas en rutas de señalización, p.ej. cinasas o fosfatasas de
proteínas. El documento WO 95/07463 describe además células que
son útiles para la detección de moléculas, tales como hormonas o
metales pesados, en una muestra biológica, enlazando operativamente
un elemento regulador del gen, que es afectado por la molécula que
interesa, con una GFP, la presencia de las moléculas afectará al
elemento regulador que a su vez afectará a la expresión de la GFP.
De esta manera, el gen que codifica la GFP es usado como un gen
reportero en una célula que está construida para vigilar la
presencia de una identidad molecular específica.
La Proteína Fluorescente Verde se ha usado en un
análisis para la detección de una translocación del receptor de
glucocorticoides (GR, de glucocorticoid receptor) [Carey,
KL y colaboradores, The Journal of Cell Biology (La Revista de
Biología Celular), volumen 133, nº 5, páginas
985-996 (1996)]. Se ha usado una fusión
GR-S65TGFP para estudiar los mecanismos implicados
en una translocación del receptor de glucocorticoides (GR) como
respuesta al agente agonista dexametasona procedente del citosol,
en donde está presente en la ausencia de un ligando, a través del
poro nuclear hacia el núcleo en donde permanece después de la
fijación a un ligando. El uso de una fusión GR-GFP
hace posible la reproducción en imágenes y la cuantificación en
tiempo real de relaciones nucleares y citoplasmáticas de la señal
de fluorescencia.
El documento WO 97/11094 describe nuevas
variantes de la proteína fluorescente verde, GFP, en las que el
aminoácido situado en posición 1 que precede al cromóforo, ha sido
mutado para proporcionar un aumento de la intensidad de
fluorescencia. Se describe además que dicha mutación da como
resultado una fluorescencia aumentada en la expresión por células
de la GFP, cuando las células son incubadas a una temperatura de
30ºC o mayor. Se sugiere además que puesto que las proteínas
descritas son significativamente más brillantes que una GFP de tipo
salvaje, se puede disminuir la concentración necesaria para la
visualización.
Schmidt (FASEB J volumen 11, nº 3, página 2924
(1997)) describe un análisis 3D (tridimensional) dinámico de la
translocación de una GFP mutada por S65T, fusionada a la
\alpha-PKC inducida p.ej. por suero y agentes
agonistas de PKC. Sakai y colaboradores (Japan J. Pharmacol. (73),
página 69, 1997) describen el uso de una fusión de una GFP y de
isoformas de PKC para visualizar la translocación de una PKC como
respuesta a diversos activadores.
Muchos programas de escrutinio actualmente
usados, que están diseñados para encontrar compuestos que afecten a
la actividad de una cinasa de proteínas, están basados en
mediciones de la fosforilación por la cinasa de substratos
artificiales o naturales, la fijación a receptores y/o la expresión
de genes reporteros.
El presente invento proporciona una importante
nueva dimensión en la investigación de sistemas celulares que
implican una redistribución, por el hecho de que el invento
proporciona una cuantificación de las respuestas o sucesos de
redistribución causados/as por una influencia, típicamente un
contacto con una sustancia química o una mezcla de sustancias
químicas, pero también cambios en el entorno físico. La
cuantificación hace posible establecer y ajustar relaciones
significantes, expresadas numéricamente, o en forma de curvas o
gráficos, entre las influencias (o el grado de las influencias)
sobre sistemas celulares y sobre la respuesta a una redistribución.
Esto es muy ventajoso puesto que, tal como se ha encontrado, la
cuantificación se puede conseguir de una manera a la vez rápida y
reproducible y - lo que posiblemente es incluso más importante -
los sistemas que se hacen cuantificables utilizando el método del
invento son sistemas a partir de los que se pueden obtener enormes
cantidades de nueva información y de discernimiento y
comprensión.
Los presentes análisis de escrutinio tienen la
manifiesta ventaja con relación a otros análisis de escrutinio,
p.ej. análisis de fijación a receptores, análisis enzimáticos, y
análisis de genes reporteros, de proporcionar un sistema en el que
se pueden identificar sustancias biológicamente activas con modos
de acción completamente nuevos, p.ej. inhibición o favorecimiento
de la redistribución o translocación de un polipéptido
biológicamente activo como una manera de regular su acción, en vez
de una inhibición o activación de la actividad enzimática, de una
manera que asegura una selectividad muy alta para la isoforma
particular del polipéptido biológicamente activo y el desarrollo
ulterior de la selectividad de un compuesto frente a otras
isoformas del mismo polipéptido biológicamente activo o de otros
componentes de la misma ruta de señalización.
En su aspecto más amplio, el invento se refiere a
un método para la identificación de un medicamento o de una
sustancia tóxica que influye directa o indirectamente sobre la
redistribución de por lo menos uno de los componentes de una ruta
intracelular, comprendiendo el método extraer una información
cuantitativa en relación con la influencia de las sustancias sobre
la redistribución mediante registro de la variación, causada por
la puesta en contacto o la incubación de una célula viva,
mecánicamente intacta, o de células vivas, mecánicamente intactas,
con la sustancia, en una luz distribuida en el espacio, emitida a
partir de un luminóforo que está presente en la célula o las
células y que es capaz de ser redistribuido de una manera que está
relacionada con el grado de la influencia, y/o que está asociado
con un componente que es capaz de ser redistribuido de una manera
que está relacionada con el grado de la influencia, comprendiendo
el luminóforo por lo menos una porción de un GFP en la que ha sido
mutado el aminoácido situado en posición 1 secuencia arriba desde el
cromóforo en la GFP, para proporcionar un aumento de la intensidad
de fluorescencia cuando la proteína fluorescente es expresada en
células a una temperatura por encima de alrededor de 30ºC, la
célula o las células se incuba(n) a una temperatura de 30ºC o
superior durante el período de tiempo a lo largo del que se
observa la influencia, y tratar la variación registrada en la luz
distribuida en el espacio para reducirla a uno o más números
representativos del grado de redistribución de acuerdo con una
calibración basada en respuestas a la redistribución, registradas
de la misma manera, a grados conocidos de una influencia
específica relevante, realizándose que el resultado del tratamiento
es indicativo de la actividad biológica de la sustancia.
En el invento, la célula y/o las células es (son)
mecánicamente intacta(s) y está(n) viva(s) durante
todo el experimento. En otra realización del invento, la célula o
las células está(n) fijada(s) en un momento después de la
aplicación de la influencia, en el que la respuesta ha sido
predeterminada como significante, y el registro se hace en un
momento posterior arbitrario.
La célula o las células viva(s),
mecánicamente intacta(s) se podrían seleccionar entre el
grupo que consiste en una célula o células fúngica(s), tal
como una célula o células de levadura(s); una célula o
células de invertebrado(s) inclusive una célula o células
de insecto(s); y una célula o células de vertebrado(s)
tales como una célula o células de mamífero(s). Esta célula
o estas células se incuba(n) a una temperatura de 30ºC o
por encima de ésta, preferiblemente a una temperatura de desde 32ºC
a 39ºC, más preferiblemente a una temperatura de desde 35ºC a
38ºC, y lo más preferiblemente a una temperatura de
aproximadamente 37ºC durante el período de tiempo por el que se
observa la influencia. En un aspecto del invento, la célula viva,
mecánicamente intacta, es parte de una matriz de células idénticas
o no idénticas.
Una célula usada en el presente invento debería
contener una estructura artificial (construcción) de ácido
nucleico, que codifique un polipéptido de fusión como aquí se
define, y ser capaz de expresar la secuencia codificada por la
estructura artificial. La célula es una célula eucariótica
seleccionada entre el grupo que consta de células fúngicas, tales
como células de levaduras; células de invertebrados inclusive
células de insectos; células de vertebrados tales como células de
mamíferos. Las células preferidas son las células de
mamíferos.
En otro aspecto del invento, las células podrían
ser procedentes de un organismo que fuese portador, en al menos una
de sus células componentes, de una secuencia de ácido nucleico que
codifique un péptido de fusión como aquí se define y deberá ser
capaz de expresar dicha secuencia de ácido nucleico. El organismo se
selecciona entre el grupo que consta de organismos unicelulares y
multicelulares, tales como un mamífero.
El luminóforo es el componente que permite que la
redistribución sea visualizada y/o registrada por emisión de luz en
una distribución en el espacio que está relacionada con el grado
de la influencia. En una realización del invento, el luminóforo es
capaz de ser redistribuido de una manera que es fisiológicamente
relevante para el grado de la influencia. En otra realización, el
luminóforo es capaz de asociarse con un componente que es capaz de
ser redistribuido de una manera que es fisiológicamente relevante
para el grado de la influencia. En otra realización, la correlación
del luminóforo entre la redistribución del luminóforo y el grado
de la influencia se podría determinar experimentalmente. En un
aspecto preferido del invento, el luminóforo es capaz de ser
redistribuido sustancialmente de la misma manera que el por lo
menos un componente de una ruta intracelular. Todavía en otra
realización del invento, el luminóforo es capaz de ser sofocado o
apagado después de una asociación en el espacio con un componente
que es redistribuido por modulación de la ruta, siendo medido el
sofocamiento o apagamiento como un cambio en la intensidad de la
luminiscencia.
El luminóforo es una GFP en la que el aminoácido
situado en posición 1 secuencia arriba desde el cromóforo en la
GFP, ha sido mutado para proporcionar un aumento de la intensidad
de la fluorescencia cuando la proteína fluorescente es expresada en
células a una temperatura por encima de aproximadamente 30ºC. En
una realización preferida del invento, la GFP es codificada por, y
expresada a partir de, una secuencia de nucleótidos albergada en
la célula o las células. La GFP es preferiblemente un polipéptido
híbrido que comprende una fusión de por lo menos una porción de
cada uno de dos polipéptidos, uno de los cuales comprende la GFP y
el otro de los cuales comprende un polipéptido biológicamente
activo. La GFP se selecciona preferiblemente entre el grupo de las
proteínas fluorescentes verdes que tienen la mutación F64L, tales
como F64L-GFP,
F64L-Y666H-GFP,
F64L-S65T-GFP y EGFP.
La GFP se podría aplicar como marca en el extremo
terminal de N o de C, opcionalmente a través de un enlazador de
péptidos, a un polipéptido biológicamente activo, o a una parte o
una subunidad de éste. La sonda fluorescente podría ser un
componente de una ruta de señalización intracelular. La sonda es
codificada por una estructura artificial (construcción) de ácido
nucleico.
La ruta de investigación en el presente invento
podría ser una ruta de señalización intracelular.
En una realización preferida del invento, la
influencia podría ser un contacto entre la célula viva,
mecánicamente intacta, o el grupo de células vivas, mecánicamente
intactas, con una sustancia química, y/o una incubación de la célula
viva, mecánicamente intacta, o del grupo de células vivas,
mecánicamente intactas, con una sustancia química. La influencia
modulará los procesos intracelulares. En un aspecto, la modulación
podría ser una activación de los procesos intracelulares. En otro
aspecto, la modulación podría ser una desactivación de los procesos
intracelulares. Todavía en otro aspecto, la influencia podría
inhibir o favorecer la redistribución sin afectar directamente a
la actividad metabólica del componente de los procesos
intracelulares.
En una realización, el invento se usa como una
base para un programa de escrutinio, en el que el efecto de
influencias desconocidas, tales como las de una biblioteca de
compuestos, se podría comparar con la influencia de compuestos de
referencia conocidos en condiciones normalizadas.
Además de la intensidad, hay diversos parámetros
de fluorescencia o luminiscencia que se pueden modular por el
efecto de la influencia sobre los fenómenos celulares subyacentes,
y por lo tanto se pueden usar en el invento. Algunos ejemplos son
la transferencia de energía de resonancia, el tiempo de vida de la
fluorescencia, la polarización, o el desplazamiento de longitudes
de onda. Cada uno de estos métodos requiere una clase particular
de filtro en la trayectoria de la luz de emisión para seleccionar
el componente de la luz que se desea y rechazar otros componentes.
El registro de la propiedad de la luz podría hacerse en la forma de
un conjunto ordenado de valores tales como una conjunto de CCD (de
Charge Coupled Device = dispositivo acoplado a cargas) o un
dispositivo de tubo de vacío tal como un tubo vidicón.
En una realización del invento, la luz
distribuida en el espacio, emitida por un luminóforo, se podría
detectar por un cambio en la transferencia de energía de resonancia
entre el luminóforo y otra entidad luminiscente capaz de suministrar
energía al luminóforo, cada uno o cada una de los o las cuales se
ha seleccionado o tratado por ingeniería genética para resultar
parte de, unida a o asociada con componentes particulares de la
ruta intracelular. En esta realización, ya sea el luminóforo o la
entidad luminiscente capaz de suministrar energía al luminóforo,
experimenta una redistribución como respuesta a una influencia. La
transferencia de energía de resonancia sería medida como un cambio
en la intensidad de emisión procedente del luminóforo, percibida
preferiblemente por un único fotodetector de canales, que responde
solamente a la intensidad media del luminóforo de una manera no
resuelta en el espacio.
En una realización del invento, el registro de la
luz distribuida en el espacio se podría hacer en un único momento
después de la aplicación de la influencia. En otra realización, el
registro podría hacerse en dos momentos, siendo un momento anterior
a la aplicación de la influencia y siendo el otro momento posterior
a la aplicación de la influencia. El resultado o la variación se
determina a partir del cambio en fluorescencia comparado con la
fluorescencia medida antes de la influencia o modulación. En otra
realización del invento, el registro se podría realizar en una serie
de momentos, en los que la aplicación de la influencia se produce
algún tiempo después del primer momento en la serie de registros,
realizándose el registro, p.ej., con un espaciamiento en el tiempo
previamente determinado de desde 0,1 segundos a 1 hora,
preferiblemente desde 1 a 60 segundos, más preferiblemente desde 1
a 30 segundos, en particular desde 1 a 10 segundos, durante un
intervalo de tiempo de desde 1 segundo a 12 horas, tal como desde
10 segundos a 12 horas, p.ej., desde 10 segundos a una hora, tal
como desde 60 segundos a 30 minutos o 20 minutos. El resultado o
la variación se determina a partir del cambio de fluorescencia en
el curso del tiempo. El resultado o la variación se podría también
determinar como un cambio en la distribución en el espacio de la
fluorescencia durante el transcurso del tiempo.
El registro de la luminiscencia distribuida en el
espacio, emitida a partir del luminóforo, se realiza por un aparato
para medir la distribución de la fluorescencia en la célula o las
células, y por lo tanto cualquier cambio en la distribución de la
fluorescencia en la célula o las células, que incluye como mínimo
las siguientes partes componentes: (a) una fuente de luz, (b) un
método para seleccionar la o las longitud(es) de onda de la
luz procedente de la fuente que excitará la fluorescencia de la
proteína, (c) un dispositivo que puede bloquear o dejar pasar
rápidamente la luz de excitación hacia el resto del sistema, (d)
una serie de elementos ópticos para transportar la luz de
excitación a la muestra, recoger la fluorescencia emitida de una
manera resuelta en el espacio, y formar una imagen a partir de
esta emisión de fluorescencia, (e) un banco o estante que sostiene
el recipiente de las células que están siendo medidas en una
geometría previamente determinada con respecto a la serie de
elementos ópticos, (f) un detector para registrar la fluorescencia
resuelta en el espacio en la forma de una imagen, (g) un ordenador
o un sistema electrónico y un sistema lógico asociado para adquirir
y almacenar las imágenes registradas, y calcular el grado de
redistribución a partir de las imágenes registradas.
En una realización preferida del invento, el
sistema de aparatos está automatizado. En una realización, los
componentes en los apartados d) y e) antes mencionados comprenden
un microscopio de fluorescencia. En una realización, el componente
en el apartado f) antes mencionado es una cámara de CCD.
En una realización, la imagen es formada y
registrada por un sistema de exploración óptica.
En una realización, un sistema de adición de
líquidos se usa para añadir un compuesto conocido o desconocido a
una cualquiera o a la totalidad de las células en el soporte de
células en un momento determinado de antemano. Preferiblemente, el
sistema de adición de líquidos está bajo el control del ordenador o
sistema electrónico. Dicho sistema automático se podría usar para
un programa de escrutinio debido a su capacidad de generar
resultados a partir de un número de compuestos de ensayo mayor que
el que un operador humano podría generar usando el aparato de una
manera manual.
El registro de la variación o del resultado con
respecto a la luz emitida a partir del luminóforo se realiza
registrando la luz distribuida en el espacio como una o más
imágenes digitales, y el tratamiento de la variación registrada,
para reducirla a uno o más números representativos del grado de
redistribución, comprende un proceso de tratamiento de imágenes
digitales o una combinación de procesos de tratamiento de imágenes
digitales. La información cuantitativa que es indicativa del grado
de la respuesta celular a la influencia o al resultado de la
influencia sobre la ruta intracelular, se extrae a partir del
registro o de los registros de acuerdo con una calibración
previamente determinada, basada en respuestas o resultados,
registradas/os de la misma manera, a grados conocidos de una
influencia específica relevante. Este proceso de calibración es
desarrollado de acuerdo con los principios descritos seguidamente
(en Desarrollo de una Técnica de Análisis Basada en Imágenes). Las
descripciones específicas de los procesos para análisis
particulares se dan en los ejemplos.
Mientras que el proceso escalonado necesario para
reducir la imagen o las imágenes al valor representativo que es
particular para cada análisis, las operaciones individuales son
métodos generalmente bien conocidos de tratamiento de imágenes.
Algunos ejemplos de las operaciones individuales son operaciones
puntuales tales como resta, establecimiento de relaciones y
comparación con un umbral, métodos de filtración digital tales
como nivelación, agudización, y detección de aristas, métodos de
detección de aristas o bordes, métodos de frecuencia espacial tales
como una filtración de Fourier, correlación cruzada entre imágenes
y auto-correlación entre imágenes, descubrimiento
y clasificación de objetivos (análisis de heterogeneidad en
osciloscopio = blob) y manipulaciones en el espacio de los colores
para visualización. Además de los procesos algorítmicos se pueden
usar también métodos heurísticos tales como los de redes
neuronales.
Las estructuras artificiales (construcciones) de
ácidos nucleicos que se usan en el presente invento, codifican en
sus secuencias de ácidos nucleicos a polipéptidos de fusión que
comprenden un polipéptido biológicamente activo que es un componente
de una ruta de señalización intracelular, o una parte de ella, y
una GFP, preferiblemente una mutante F64L de GFP, fusionada en el
extremo terminal de N o de C, opcionalmente a través de un
enlazador de péptidos, con el polipéptido biológicamente activo o
una parte de éste.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es una cinasa o una fosfatasa de proteínas.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es un factor de transcripción o una parte de éste, que cambia la
localización celular después de su activación.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es una proteína, o una parte de ésta, que está asociada con la red
cito-esquelética y que cambia de localización
celular después de su activación.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es una cinasa de proteínas, o una parte de ésta, que cambia de
localización celular después de su activación.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es una cinasa de proteínas, serina/treonina, o una parte de ésta,
capaz de cambiar de localización intracelular después de su
activación.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es un cinasa de proteína, tirosina, o una parte de ésta, capaz de
cambiar de localización intracelular después de su activación.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es
una cinasa de proteínas, serina/treonina, dependiente de
fosfolípidos, o una parte de ésta, capaz de cambiar de localización
intracelular después de su activación.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es un cinasa de proteínas, dependiente de cAMP, o una parte de
ésta, capaz de cambiar de localización celular después de su
activación. En una realización preferida, el polipéptido
biológicamente activo codificado por la estructura artificial de
ácido nucleico, es una fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es una cinasa de proteínas, dependiente de cGMP, o una parte de
ésta, capaz de cambiar de localización celular después de su
activación.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es una cinasa de proteínas, serina/treonina, dependiente de
calmodulina, o una parte de ésta, capaz de cambiar de localización
celular después de su activación.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es una cinasa de proteínas, serina/treonina, activada por un
mitógeno, o una parte de ésta, capaz de cambiar de localización
celular después de su activación. En realizaciones preferidas, el
polipéptido biológicamente activo por las estructuras artificiales
de ácidos nucleicos, son una fusión
ERK1-F64L-S65T-GFP o
una fusión EGFP-ERK1.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es una cinasa de proteínas, serina/treonina, dependiente una
ciclina, o una parte de ésta capaz de cambiar de localización
celular después de su activación.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico,
es una fosfatasa de proteínas, o una parte de ésta, capaz de
cambiar de localización celular después de su activación.
En una realización preferida del invento, las
estructuras artificiales de ácidos nucleicos pueden ser estructuras
artificiales de ADN.
En una realización, el polipéptido biológicamente
activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico.
En una realización el gen que codifica GFP en la estructura
artificial de ácido nucleico se deriva de Aequorea victoria. En una
realización preferida, el gen que codifica GFP en la estructura
artificial de ácido nucleico es EGFP o una variante de GFP
seleccionada entre F64L-GFP,
F64L-Y66H-GFP y
F64L-S65T-GFP.
En realizaciones preferidas del invento, las
estructuras artificiales son las de ADN que se pueden identificar
por cualesquiera de las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID NO:
38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70,
72, 74, 76, 78, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126,
128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142 o son variantes de estas
secuencias capaces de codificar el mismo polipéptido de fusión o
un polipéptido de fusión que es equivalente biológicamente a éste,
p.ej. una isoforma, o una variante por empalme o un homólogo
procedente de otras especies.
\newpage
El presente invento describe un método que se
puede usar para establecer un programa de escrutinio para la
identificación de sustancias biológicamente activas que afectan
directa o indirectamente a las rutas de señalización intracelulares
y que a causa de esta propiedad son potencialmente útiles como
medicamentos. Basándose en mediciones en células vivas de la
redistribución de la luminiscencia resuelta en el espacio
procedente de luminóforos que experimentan un cambio en la
distribución después de la activación o desactivación de una ruta
de señalización intracelular, el resultado de la medición
individual de cada sustancia que está siendo escrutada indica su
actividad biológica potencial.
En una realización del invento, el programa de
escrutinio se usa para la identificación de una sustancia
biológicamente tóxica, como aquí se define, que ejerce su efecto
tóxico interfiriendo con una ruta de señalización intracelular.
Basándose en mediciones en células vivas de la redistribución de
una luminiscencia resuelta en el espacio, procedente de
luminóforos que experimentan un cambio en la distribución después
de la activación o desactivación de una ruta de señalización
intracelular, el resultado de la medición individual de cada
sustancia que está siendo escrutada indica su actividad tóxica
biológicamente potencial. En una realización de un programa de
escrutinio, se puede encontrar un compuesto que modula a un
componente de una ruta intracelular, como aquí se define, y la
cantidad terapéutica del compuesto se puede estimar por un método
de acuerdo con el invento. En una realización preferida, el
presente invento conduce al descubrimiento de una nueva manera de
tratar una condición o enfermedad relacionada con la función
intracelular de un polipéptido biológicamente activo, que comprende
la administración a un paciente, que padece de dicha condición o
enfermedad, de una cantidad efectiva de un compuesto que se ha
descubierto por un método cualquiera de acuerdo con el invento. En
otra realización preferida del invento se establece un método para
la identificación de una nueva diana de fármaco o de varias nuevas
dianas de fármacos entre el grupo de los polipéptidos
biológicamente activos que son componentes de rutas de señalización
intracelulares.
En otra realización del invento, se establece un
régimen de tratamiento individual para el tratamiento selectivo de
un paciente seleccionado, que padece de una afección en la que los
medicamentos disponibles, usados para el tratamiento de la
afección, se ensayan en una célula o en células primaria(s)
relevante(s) obtenida(s) de dicho paciente a partir
de uno o varios tejidos, usando un método que comprende transfectar
la célula o las células con por lo menos una secuencia de ADN que
codifica una sonda fluorescente de acuerdo con el invento,
transferir la célula o las células transfectada(s) de
retorno a dicho paciente, o cultivar la célula o las células en
condiciones que permitan la expresión de dichas sondas y
exponerla(s) a un conjunto de los medicamentos disponibles,
luego comparar los cambios en los modelos de fluorescencia o en los
modelos de redistribución de las sondas fluorescentes en la célula o
las células viva(s) intacta(s) con el fin de
detectar la respuesta celular a los medicamentos específicos (es
decir, obtener un perfil de acciones celulares), luego seleccionar
un medicamento o varios medicamentos basándose en la actividad
deseada y el nivel aceptable de efectos colaterales, y administrar
una cantidad eficaz de estos medicamentos al paciente
seleccionado.
El presente invento describe un método que se
puede usar para establecer un programa de escrutinio para el
retro-seguimiento de las rutas de transducción de
señales que aquí se definen. En una realización, el programa de
escrutinio se usa para establecer con más exactitud a qué nivel uno
o varios compuestos afectan a una ruta específica de transducción
de señales, ensayando de modo consecutivo o en paralelo la
influencia del compuesto o de los compuestos sobre la redistribución
de una luminiscencia resuelta en el espacio a partir de varios de
los luminóforos que experimentan un cambio en su distribución
después de la activación o desactivación de la ruta de
señalización intracelular que se está estudiando.
En general, una sonda, es decir una fusión
"GenX"-GFP o una fusión GFP-"GenX", se construye usando
una PCR (de Polymerase Chain Reaction = reacción en cadena
de polimerasa) con cebadores específicos para el "GenX" seguido
por una operación de clonación para fusionar el "GenX" dentro
del marco con GFP. La fusión puede contener una corta secuencia
derivada de un vector entre el "GenX" y la GFP (p.ej. parte
de una región de múltiples sitios de clonación en el plásmido),
dando como resultado un enlazador de péptidos entre el "GenX"
y la GFP en la resultante proteína de fusión.
- Identificación de la secuencia del gen. Ésta se
realiza con la máxima facilidad buscando e investigando un
depositario de información genética, p.ej. la Base de Datos de
Secuencias GenBank, que está ampliamente disponible y es usada
rutinariamente por los biólogos moleculares. En los ejemplos
específicos que se dan más adelante, se proporciona el número de
Acceso al GenBank del gen en cuestión.
- Diseño de cebadores específicos para el gen. La
inspección de la secuencia del gen permite el diseño de cebadores
específicos para el gen que se han de usar en una reacción PCR.
Típicamente, el cebador de hebra superior abarca el codón de
iniciación ATG del gen y los alrededor de 20 nucleótidos que le
siguen, mientras que el cebador de hebra inferior abarca el codón
de detención y los alrededor de 20 nucleótidos que le preceden, si
el gen ha de ser fusionado detrás de GFP, es decir una fusión
GFP-"GenX". Si el gen ha de ser fusionado delante de GFP, es
decir una fusión "GenX"-GFP, se debe de evitar un codón de
detención. Opcionalmente, puede no usarse en la fusión la secuencia
de plena longitud del GenX, sino meramente la parte que se localiza
y redistribuye como el GenX como respuesta a una señal.
Además de secuencias específicas para el gen, los
cebadores contienen por lo menos una secuencia de reconocimiento
para una enzima de restricción, con el fin de permitir la
clonación subsiguiente del producto de la PCR. Los sitios se escogen
de manera tal que sean singulares en el producto de la PCR y
compatibles con sitios existentes en el vector de clonación.
Además, puede ser necesario incluir un número exacto de
nucleótidos entre el sitio para la enzima de restricción y la
secuencia específica para el gen, con el fin de establecer el
cuadro de lectura correcto del gen de fusión y/o una secuencia de
consenso para la iniciación de la traducción. Por último, los
cebadores siempre contienen unos pocos nucleótidos delante del
sitio para la enzima de restricción con el fin de permitir una
digestión eficiente con la enzima.
- Identificación de una fuente del gen que se ha
de amplificar. Con el fin de que una reacción PCR produzca un
producto con cebadores específicos para el gen, la secuencia del
gen debe estar presente inicialmente en la reacción, p.ej. en la
forma de un ADNc (ADN cromosomal). La información existente en el
GenBank o en la bibliografía científica indicará usualmente en qué
tejido(s) es expresado el gen, y las bibliotecas
(genotecas) de ADNc procedentes de una gran variedad de tipos de
tejidos o células procedentes de diversas especies están
disponibles comercialmente, p.ej. a partir de Clontech (Palo
Alto), Stratagene (La Jolla) e Invitrogen (San Diego). Muchos genes
también están disponibles en forma clonada a partir de la American
Type Tissue Collection [Colección Americana de Tejidos Tipo]
(Virginia).
- Optimización de la reacción PCR. Se conoce que
varios factores influyen sobre la eficiencia y la especificidad de
una reacción PCR, incluyendo la temperatura de reanillamiento de
los cebadores, la concentración de iones, particularmente Mg^{2+}
y K^{+}, presentes en la reacción, así como el pH de la reacción.
Si se estima que el resultado de una reacción PCR es
insatisfactorio, esto puede ser debido a que los parámetros antes
mencionados no son óptimos. Se deberán ensayar diversas temperaturas
de reanillamiento, p.ej. en una máquina para PCR con un gradiente
de temperatura incluido, disponible p.ej. de Stratagene (La
Jolla), y/o se deberán probar diversas composiciones tamponadoras,
p.ej. el sistema tamponador OptiPrime procedente de Stratagene (La
Jolla).
- Clonación del producto de la PCR. El vector en
el que será clonado y fusionado con la GFP el producto del gen
amplificado, ya habrá sido tomado en consideración cuando los
cebadores fueron diseñados. Cuando se escoge un vector, se deberá
considerar por lo menos en cuáles de los tipos de células será
expresada la sonda subsiguientemente, de manera tal que el
promotor que controla la expresión de la sonda sea compatible con
las células. La mayor parte de los vectores de expresión contienen
también uno o más marcadores selectivos, p.ej. que confieren
resistencia a un fármaco, la cual es una característica útil
cuando se desea agentes transfectantes más estables. El marcador
selectivo deberá ser también compatible con las células que se hayan
de usar.
La clonación real del producto de la PCR no
deberá presentar ninguna dificultad, puesto que típicamente será
una clonación en una sola etapa de un fragmento digerido con dos
diferentes enzimas de restricción dentro de un vector digerido con
las mismas dos enzimas. Si la clonación demuestra ser
problemática, esto puede ser debido a que las enzimas de
restricción no trabajan bien con el fragmento de la PCR. En este
caso se podrían añadir prolongaciones más largas al extremo de los
cebadores con el fin de solventar una posible dificultad de
digestión cerca de un extremo de fragmento, o se podría introducir
una operación de clonación intermedia que no estuviera basada en
una digestión con enzimas de restricción. Diversas compañías
ofrecen sistemas para este enfoque, p.ej. Invitrogen (San Diego) y
Clontech (Palo Alto).
Una vez que el gen ha sido clonado y, en el
proceso, fusionado con el gen de GFP, el producto resultante,
usualmente un plásmido, deberá ser comprobado cuidadosamente para
asegurarse de que es tal como se espera. El ensayo más exacto
podría consistir en obtener la secuencia de nucleótidos del gen de
fusión.
Una vez que se ha generado una estructura
artificial de ADN para una sonda, se pueden ensayar su
funcionalidad y su utilidad sometiéndola a los siguientes
ensayos:
- Transfectarla a células capaces de expresar la
sonda. La fluorescencia de la célula se inspecciona pronto después
de ello, típicamente al día siguiente. En ese momento, se observan
dos características de fluorescencia celular: la intensidad y la
localización sub-celular.
La intensidad deberá ser usualmente al menos tan
fuerte como la de la GFP no fusionada en las células. Si no lo es,
la secuencia o la calidad del ADN de sonda puede ser defectuosa, y
se deberá comprobar con cuidado.
La localización sub-celular es
una indicación de si la sonda es susceptible de comportarse bien.
Si ésta se localiza, tal como se espera para el gen en cuestión,
p.ej. es excluida del núcleo, puede pasar inmediatamente a ser
sometida a un ensayo funcional. Si la sonda no es localizada pronto
después del proceso de transfección, esto puede ser debido a una
sobreexpresión en este momento, puesto que la célula habrá sido
tomada entre muchísimas copias del plásmido, y la localización se
desarrollará en un tiempo, p.ej. en el transcurso de unas pocas
semanas, en el que disminuyan el número de copias de plásmidos y el
nivel de expresión. Si no se produce la localización después de un
período de tiempo prolongado, esto puede ser debido a que la fusión
con la GFP ha destruido una función de localización, p.ej. ha
enmascarado una secuencia de proteína esencial para la interacción
con su proteína de anclaje celular normal. En este caso, la fusión
opuesta puede trabajar, p.ej. si la de GenX-GFP no
trabaja, la de GFP-GenX puede trabajar, puesto que
dos partes diferentes del GenX serán afectadas por la proximidad a
la GFP. Si ésta no trabaja, la proximidad de la GFP en cualquiera
de los extremos puede ser un problema, y se podría intentar el
recurso de aumentar la distancia por incorporación de un enlazador
más largo entre el GenX y la GFP en la estructura artificial de
ADN.
Si no existe un conocimiento previo de la
localización, y no se observa la localización, esto puede ser
debido a que la sonda no debería ser localizada en este punto,
puesto que tal es la naturaleza de la proteína fusionada con la GFP.
Entonces, la sonda se debería someter a un ensayo funcional.
En un ensayo funcional, las células que expresan
la sonda son tratadas con por lo menos un compuesto que sea
conocido por perturbar, usualmente por activación, a la ruta de
señalización en la que se espera que la sonda se reporte
redistribuyéndose por sí misma dentro de la célula. Si la
redistribución es tal como se espera, p.ej. si el conocimiento
previo hubiese señalado que ella se había translocado desde el
sitio X al sitio Y, se ha pasado el primer ensayo crítico. En este
caso se puede pasar a una caracterización y cuantificación
ulteriores de la respuesta.
Si no se comporta tal como se espera, esto puede
ser debido a que la célula carece de por lo menos un componente de
la ruta de señalización, p.ej. un receptor superficial de células,
o hay una incompatibilidad entre especies, p.ej. si la sonda se
modela sobre una información de secuencias de un producto génico
humano, y la célula se origina de un hámster. En ambos casos se
deberán identificar otros tipos de células para el proceso de
ensayo en el que estos problemas potenciales no se produjesen.
Si no hay conocimiento previo acerca del modelo
de redistribución, el análisis de la redistribución tendrá que
hacerse en mayor profundidad para identificar cuáles son las
características esenciales e indicativas, y cuando esto se ha puesto
en claro, se puede pasar a una caracterización y cuantificación
ulteriores de la respuesta. Si no se puede identificar un modelo
característico de redistribución, el problema puede ser tal como
antes se ha mencionado, y la sonda se deberá volver a ensayar en
condiciones celulares más óptimas.
Si la sonda no se comporta en condiciones
celulares óptimas se devuelve al panel de diseño.
El proceso de desarrollar un análisis de la
redistribución basada en imágenes comienza o bien con la
observación experimental no planificada de que un fenómeno de
redistribución puede ser visualizado, o con el diseño de una sonda
para seguir de manera específica un fenómeno de redistribución que
ya se conoce como realizado. En cualquier caso, la primera y mejor
técnica de exploración consiste en que un científico o técnico
entrenado observe el fenómeno. Incluso con los rápidos avances en la
técnica de computación en ordenadores, la combinación de los ojos
y del cerebro humanos es todavía el sistema más potente conocido
de reconocimiento de modelos, y no requiere un conocimiento de
antemano del sistema con el fin de detectar modelos potencialmente
interesantes y útiles en datos en bruto. Esto es así especialmente
si esos datos son presentados en la forma de imágenes, que son los
"tipos de datos" naturales para el tratamiento visual humano.
Puesto que el tratamiento visual humano funciona de la manera más
efectiva en un intervalo de frecuencias relativamente estrecho, es
decir, que los seres humanos no podemos observar cambios ni muy
rápidos ni muy lentos en nuestro campo visual, puede ser necesario
registrar los datos y reproducirlos con dilación en el tiempo o
compresión en el tiempo.
Algunos fenómenos de luminiscencia no pueden ser
observados directamente por el ojo humano. Ejemplos de ellos
incluyen la polarización y el tiempo de vida de la fluorescencia.
Sin embargo, con apropiados filtros o detectores, estas señales se
pueden registrar como imágenes o secuencias de imágenes y
representar visualmente a los seres humanos de la manera que se
acaba de describir. De esta manera, los modelos se pueden detectar
y se pueden aplicar los mismos métodos.
Una vez que se ha determinado que la
redistribución es un fenómeno reproducible, se generan uno o más
conjuntos de datos con la finalidad de desarrollar un proceso para
extraer la información cuantitativa a partir de los datos. En
paralelo, se determinan las condiciones biológicas y ópticas que
proporcionarán los datos en bruto de la mejor calidad para el
análisis. Esto puede convertirse en un proceso iterativo; puede ser
necesario desarrollar un proceso cuantitativo con el fin de
averiguar el efecto sobre el análisis de manipular las condiciones
de análisis.
Los conjuntos de datos son examinados por una
persona o por varias personas que tengan conocimiento del fenómeno
biológico y experiencia en la aplicación de las técnicas de
tratamiento de imágenes. La meta de este ejercicio es determinar, o
por lo menos proponer, un método que reduzca la imagen o la
secuencia de imágenes que constituyen el registro de una
"respuesta" a un valor que corresponda al grado de la
respuesta. Usando ya sea un programa lógico de tratamiento
interactivo de imágenes o una "caja de herramientas" para
tratamiento de imágenes y un lenguaje de programación, el método es
codificado como un proceso o algoritmo que toma como su entrada la
imagen o las imágenes y genera el grado de respuesta (en
cualesquiera unidades) como su salida. Algunos de los criterios
para evaluar la validez de un proceso particular son:
- \bullet
- ¿Varía el grado de la respuesta de una manera significativa biológicamente, es decir éste muestra la dependencia conocida o putativa sobre la concentración del agente o la condición estimulante?
- \bullet
- ¿Es reproducible el grado de la respuesta, es decir que la misma concentración o el mismo nivel del agente o de la condición estimulante da la misma respuesta con una varianza aceptable?
- \bullet
- ¿Es suficiente el alcance dinámico de la respuesta para la finalidad del análisis?. Si no lo es, ¿puede un cambio en el proceso o de uno de sus parámetros mejorar el alcance dinámico?
- ¿Exhibe el proceso cualesquiera "patologías" manifiestas, es decir proporciona valores ridículos para la respuesta si hay imperfecciones que aparezcan corrientemente en el proceso de reproducción en imágenes? ¿Se pueden eliminar, controlar o tomar en cuenta estas patologías?
- \bullet
- ¿Puede el proceso abordar la variación normal en el número y/o en el tamaño de las células en una imagen?.
En algunos casos el método puede ser evidente; en
otros, se pueden sugerir automáticamente un cierto número de
procesos posibles. Incluso si un método aparece como claramente
superior a otros, se puede requerir una optimización de parámetros.
Los diversos procesos se aplican al conjunto de datos y se
determinan los criterios antes sugeridos, o el proceso singular se
aplica repetidamente con ajuste del parámetro o de los parámetros
hasta que se llegue a la combinación más satisfactoria de señal,
ruido, alcance, etc. Esto es equivalente ala calibración de
cualquier tipo de sensor de un único canal.
El número de maneras de extraer un único valor a
partir de una imagen es extremadamente grande, y por lo tanto se
debe adoptar un enfoque inteligente para la operación inicial de
reducir este número a un número finito y pequeño de posibles
procesos. Esto no quiere decir que el proceso al que se haya llegado
sea necesariamente el proceso óptimo - pero una investigación
global en cuanto al proceso óptimo está simplemente fuera de
consideración debido al número cabal de posibilidades
implicadas.
Los análisis basados en imágenes no son
diferentes de otras técnicas de análisis en el hecho de que su
utilidad está caracterizada por parámetros tales como la
especificidad para el componente deseado de la muestra, el alcance
dinámico, la varianza, la sensibilidad, el intervalo de
concentraciones en el que el análisis trabajará, y otros
parámetros de este tipo. Aunque no es necesario caracterizar todos y
cada uno de éstos antes de usar el análisis, ellos representan la
única manera de comparar un análisis con otro.
La GLUT4 es un miembro de la clase de moléculas
transportadoras de glucosa que son importantes en la recogida
celular de glucosa. Se conoce translocar a la membrana plasmática
en ciertas condiciones de estimulación de la recogida de glucosa. La
capacidad de visualizar la respuesta a la recogida de glucosa de
una manera no invasiva, sin medir realmente la recogida de
glucosa, constituiría un análisis muy útil para cualquiera que
buscase, por ejemplo, tratamientos para la diabetes del tipo II.
Una línea de células CHO que expresaba
establemente al receptor humano de insulina se usó como la base
para una nueva línea celular que expresase establemente una fusión
entre GLUT4 y GFP. Se esperaba que esta línea celular que mostrase
la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática tal como se
visualiza por el movimiento de la GFP. La translocación se podría
observar de una manera definida en la forma de la aparición de
aumentos locales en la fluorescencia en regiones de la membrana
plasmática que tenían una forma o un modelo característico. Esto se
muestra en la Figura 12.
Estos objetos se conocieron como "marañas" y
el fenómeno de su aparición como "enmarañamiento". Con el fin
de cuantificar su aparición se ha de encontrar un método con el
fin de aislarlos como objetos en el campo de imagen, y luego
contarlos, medir su área o determinar algún cierto parámetro
acerca de ellos, que se correlacione de una manera dependiente de
la dosis con la concentración de insulina a la que las células
habían sido expuestas. Con el fin de separar las "marañas", se
aplicó un proceso de binarización, en el que una copia de la
imagen nivelada con un núcleo gaussiano relativamente severo (sigma
= 2,5) se restó de otra copia a la que se había aplicado solamente
una nivelación gaussiana relativamente ligera (sigma = 0,5). La
imagen resultante se volvió a cambiar de escala a su intervalo
mínimo/máximo, y se aplicó un umbral automático para dividir la
imagen en dos niveles. La imagen comparada con un umbral contiene
un fondo de un valor de objeto totalmente encontrado con otro
valor. Los objetos encontrados fueron primeramente filtrados a
través de un filtro para eliminar los objetos demasiado grandes y
demasiado pequeños para ser "marañas". Los objetos remanentes,
que representan "marañas" y otras aberraciones procedentes de
la imagen aproximadamente con el mismo tamaño y las mismas
características de identidad que las "marañas", se hacen
pasar a un proceso de clasificación que ha sido entrenado
previamente con muchas imágenes de "marañas" para reconocer las
"marañas" y excluir las otras aberraciones. El resultado de
este proceso es una imagen binaria que muestra solamente las
"marañas" encontradas en la medida en el que el proceso de
clasificación puede identificarlos con exactitud. El área total de
las "marañas" se suma luego y este valor es la medida
cuantitativa del grado de "enmarañamiento" para esa imagen.
En la memoria descriptiva y en las
reivindicaciones presentes, el término "una influencia" cubre
la puesta en contacto o la incubación de la célula o las células
con sustancias que sean conocidas por, o sospechosas de, ejercer
una influencia sobre la respuesta celular que implica una
contribución a la redistribución. En otra realización del invento,
la influencia podría ser la de sustancias procedentes de una
biblioteca de fármacos de compuestos.
En el presente contexto, el término "proteína
fluorescente verde" (GFP) está destinado a indicar una proteína
que, cuando es expresada por una célula, emite fluorescencia al ser
expuesta a una luz con la longitud de onda de excitación correcta
(compárese [(Chalfie y colaboradores 1994)]). En lo sucesivo, una
GFP en la que uno o más aminoácidos han sido reemplazados,
introducidos o suprimidos, se denomina con la máxima frecuencia
"GFP modificada". El término "GFP" como se usa aquí,
significa una GFP modificada, que ha sido modificada de manera tal
que exhibe una fluorescencia aumentada cuando es expresada en
células a una temperatura por encima de 30ºC como se describe en el
documento de PCT/DK96/00051, publicado como WO 97/11094 el 27 de
Marzo de 1997, y que comprende una proteína fluorescente derivada de
la Proteína Fluorescente Verde (GFP) de Aequorea o cualquier
compuesto análogo funcional a ésta, en que el aminoácido situado en
posición 1 secuencia arriba desde el cromóforo ha sido mutado para
proporcionar un aumento de la intensidad de fluorescencia cuando la
proteína fluorescente del invento es expresada en células. En un
aspecto, la GFP se deriva de la medusa Aequorea victoria. La
GFP está modificada opcionalmente de modo adicional tal como la
variante fluorescente azul de GFP, descrita por Heim y
colaboradores (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91:12501. Las variantes
preferidas de GFP son F64L-GFP,
F64L-Y66H-GFP y
F64L-S65T-GFP. Una variante de GFP
especialmente preferida para usarse en todos los aspectos de este
invento es la EGFP (el ADN que codifica la EGFP que es una
variante F64L-S65T con codones optimizados para su
expresión en células de mamíferos, está disponible de Clontech, Palo
Alto, acerca de los plásmidos que contienen la secuencia de ADN de
la EGFP, compárense los números de acceso al GenBank U55762 y
U55763).
Los términos "ruta de señalización
intracelular" y "ruta de transducción de señales" están
destinados a indicar los procesos intracelulares coordinados con
los que una célula viva transduce una señal externa o interna a la
forma de respuestas celulares. Dicha transducción de señales
implicará una reacción enzimática, dichas enzimas incluyen, pero no
están limitadas a, cinasas de proteínas, GTPasas, ATPasas,
fosfatasas de proteínas y fosfolipasas. Las respuestas celulares
incluyen, pero no están limitadas a, transcripción de genes,
secreción, proliferación, actividad mecánica, actividad metabólica
y muerte celular.
El término "luminóforo" se usa para indicar
una GFP.
El término "célula viva, mecánicamente
intacta" se usa para indicar una célula que es considerada como
viva de acuerdo con los criterios clásicos para ese tipo particular
de célula, tales como el mantenimiento del potencial de membrana,
del metabolismo de energía y de la capacidad proliferativa
normales, y no ha experimentado ningún tipo de tratamiento
físicamente invasivo proyectado para introducir sustancias externas
en la célula, tal como microinyección.
El término "fisiológicamente relevante",
cuando se aplica a la redistribución determinada experimentalmente
de un componente intracelular, tal como se mide por el cambio en
las propiedades o la distribución de luminiscencia, se usa para
indicar que dicha redistribución puede ser explicada en términos
del fenómeno biológico no derivado que da lugar a la
redistribución.
Los términos "tratamiento de imágenes" y
"análisis de imágenes" se usan para describir una gran familia
de técnicas para el análisis de datos digitales o una combinación
de dichas técnicas, que reducen los conjuntos ordenados de números
(imágenes) a una información cuantitativa que describe estos
conjuntos ordenados de números. Cuando dichos conjuntos ordenados
de números representan valores medidos de un proceso físico, la
información cuantitativa obtenida de ellos es por lo tanto una
medida del proceso físico.
El término "sonda fluorescente" se usa para
indicar un polipéptido de fusión fluorescente que comprende una GFP
o cualquier parte funcional de ésta que está fusionada en el
extremo terminal de N o de C con un polipéptido biológicamente
activo como aquí se define, opcionalmente a través de un enlazador
de péptidos que consta de uno o más residuos de aminoácidos, en
donde el tamaño del péptido enlazador por sí mismo no es crítico,
siempre y cuando que se mantenga la deseada funcionalidad de la
sonda fluorescente. Una sonda fluorescente de acuerdo con el invento
es expresada en una célula e imita básicamente el comportamiento
fisiológico del resto de polipéptido biológicamente activo del
polipéptido de fusión.
El término "célula de mamífero" está
destinado a indicar cualquier célula viva originada de un mamífero.
La célula puede ser una línea celular establecida muchas de las
cuales están disponibles de The American Type Culture Collection [La
Colección Americana de Cultivos Tipo] (ATCC, Virginia, EE.UU.) o
una célula primaria con un intervalo de vida limitado, que se
deriva de un tejido de mamífero, inclusive tejidos derivados de un
animal transgénico, o una línea celular inmortal recientemente
establecida que se derive de un tejido de mamífero, inclusive
tejidos transgénicos, o una célula o línea celular híbrida que se
obtiene por fusión de diferentes tipos de células originadas de un
mamífero, p.ej. líneas celulares de hibridomas. Las células pueden
expresar opcionalmente uno o más productos de genes no nativos,
p.ej. receptores, enzimas, substratos de enzimas, antes de, o
además de, la sonda fluorescente. Las líneas celulares preferidas
incluyen, pero no se limitan a, las que tienen origen de
fibroblastos, p.ej. BHK, CHO, BALB, o de origen endotelial, p.ej.
HUVEC, BAE (de bovine artery endothelial = endotelial de
arteria de bovino), CPAE (de cow pulmonary artery
endothelial = endotelial de arteria pulmonar de vaca) o de
origen pancreático, p.ej. RIN, INS-1, MIN6, bTC3,
aTC6, bTC6, HIT, o de origen hematopoyético, p.ej. origen en
adipocitos, p.ej. 3T3-L1, con origen neuronal o
neuroendocrino, p.ej. AtT20, PC12, GH3, con origen en músculos,
p.ej. SKMC, A10, C2C12, con origen renal, p.ej. HEK 293,
LLC-PK1.
Se pretende que el término "polipéptido
híbrido" indique un polipéptido que es una fusión de por lo
menos una porción de cada una de dos proteínas, en este caso por lo
menos una porción de la proteína fluorescente verde, y de por lo
menos una porción de un dominio catalítico y/o regulador de una
cinasa de proteínas. Además, se pretende que un polipéptido
híbrido indique un polipéptido de fusión que comprende una GFP o
por lo menos una porción de la proteína fluorescente verde que
contiene un fluoróforo funcional, y por lo menos una porción de un
polipéptido biológicamente activo como aquí se define, con la
condición de que dicha fusión no sea la
PKC\alpha-GFP, PKC\gamma-GFP y
PKC\varepsilon-GFP descrita por Schmidt y
colaboradores y por Sakai y colaboradores, respectivamente. Por lo
tanto, una GFP puede ser aplicada como marca en el extremo
terminal de N o C a un polipéptido biológicamente activo,
opcionalmente a través de una porción de enlazador o de un péptido
enlazador que consta de una secuencia de uno o más aminoácidos. El
polipéptido híbrido o el polipéptido de fusión puede actuar como
una sonda fluorescente en células vivas intactas que llevan una
secuencia de ADN que codifica el polipéptido híbrido en condiciones
que permiten la expresión de dicho polipéptido híbrido.
El término "cinasa" está destinado a indicar
una enzima que es capaz de fosforilar a un componente celular.
El término "cinasa de proteínas" está
destinado a indicar una enzima que es capaz de fosforilar a serina
y/o treonina y/o tirosina en péptidos y/o proteínas.
El término "fosfatasa" está destinado a
indicar una enzima que es capaz de desfosforilar a
fosfo-serina y/o fosfo-treonina y/o
fosfo-tirosina en péptidos y/o proteínas.
En el presente contexto, el término
"polipéptido biológicamente activo" está destinado a indicar
un polipéptido que afecta a procesos intracelulares después de su
activación, tal como una enzima que es activa en procesos
intracelulares, o una porción de ella, que comprende una deseada
secuencia de aminoácidos que tiene una función biológica o ejerce
un efecto biológico en un sistema celular. En el polipéptido se
pueden haber suprimido, introducido o reemplazado uno o varios
aminoácidos con el fin de alterar su función biológica, p.ej.
haciendo inactivo a un sitio catalítico. Preferiblemente, el
polipéptido biológicamente activo se selecciona entre el grupo que
consta de proteínas que toman parte en una ruta de señalización
intracelular, tales como enzimas implicadas en los procesos de
fosforilación y desfosforilación intracelulares, inclusive cinasas,
así como cinasas y fosforilasas de proteínas como aquí se definen,
pero también las proteínas que constituyen el citoesqueleto
desempeñan cometidos importantes en la transducción de señales
intracelulares y por lo tanto se incluyen en el significado de
"polipéptido biológicamente activo" que aquí se considera. Más
preferiblemente, el polipéptido biológicamente activo es una
proteína que, de acuerdo con su estado como activado o no
activado, cambia de localización dentro de la célula,
preferiblemente como un componente intermedio en una ruta de
transducción de señales. Se incluyen en este grupo preferido de
polipéptidos biológicamente activos las cinasas A de proteínas
dependientes de cAMP.
El término "una sustancia que tiene actividad
biológica" está destinado a indicar cualquier muestra que tenga
una función biológica o ejerza un efecto biológico en un sistema
celular. La muestra puede ser una muestra de un material biológico,
tal como una muestra de un fluido corporal inclusive sangre,
plasma, saliva, leche, orina, o un extracto microbiano o vegetal,
una muestra ambiental que contenga contaminantes inclusive metales
pesados o toxinas, o puede ser una muestra que contenga un
compuesto o una mezcla de compuestos que se hayan preparado por
síntesis orgánicas o técnicas genéticas.
La frase "cualquier cambio en la
fluorescencia" significa cualquier cambio en las propiedades de
absorción, tales como longitud de onda e intensidad, o cualquier
cambio en las propiedades espectrales de la luz emitida, tal como
un cambio de longitud de onda, tiempo de vida de la fluorescencia,
intensidad o polarización, o cualquier cambio en la localización
intracelular del fluoróforo. Este se puede localizar por lo tanto
en un componente celular específico (p.ej. orgánulo, membrana,
citoesqueleto o estructura molecular) o se puede distribuir
uniformemente por toda la célula o por partes de la célula.
El término "organismo" tal como se usa en el
presente contexto, indica cualquier organismo unicelular o
multicelular que se origine preferiblemente del reino animal,
inclusive protozoos, pero también se incluyen en esta definición
organismos que son miembros del reino vegetal tales como algas,
hongos, briofitos y plantas vasculares.
El término "ácido nucleico" está destinado a
indicar cualquier tipo de secuencia de ácidos poli- u
oligo-nucleicos tales como una secuencia de ADN, una
secuencia de ADNc o una secuencia de ARN.
El término "biológicamente equivalente" en
cuanto que se relaciona con proteínas, está destinado a significar
que una primera proteína es equivalente a una segunda proteína si
las funciones celulares de las dos proteínas pueden sustituirse unas
a otras, p.ej. si las dos proteínas son isoformas relacionadas
estrechamente, codificadas por genes diferentes, si son variantes
por empalme, o son variantes alélicas derivadas del mismo gen, si
éstas desarrollan funciones celulares idénticas en diferentes tipos
de células, o en especies diferentes. El término "biológicamente
equivalente" en cuanto se relaciona con un ADN, está destinado
a significar que una primera secuencia de ADN que codifica un
polipéptido es equivalente a una segunda secuencia de ADN que
codifica un polipéptido, si las proteínas funcionales codificadas
por los dos genes son biológicamente equivalentes.
La frase "retro-seguimiento de
una ruta de transducción de señales" está destinada a indicar un
proceso con el fin de definir con mayor exactitud a qué nivel es
afectada una ruta de transducción de señales, o bien por la
influencia de compuestos químicos o un estado morboso en un
organismo. Se considera una específica ruta de transducción de
señales representada por los péptidos bioactivos A - B - C - D, con
transducción de señales desde A hacia D. Cuando se investigan todos
los componentes de esta ruta de transducción de señales, se puede
considerar que los compuestos o estados morbosos que influyen
sobre la actividad o la redistribución solamente de D, actúan
sobre C o secuencia abajo de C, mientras que se puede considerar que
los compuestos o estados morbosos que influyen sobre la actividad o
la redistribución de C y D, pero no sobre la de A y B, actúan
secuencia abajo de B.
El término "células fijas" se usa para
significar células tratadas con un agente fijador citológico tal
como glutaraldehído o formaldehído, cuyos tratamientos sirven para
reticular químicamente y estabilizar proteínas solubles e insolubles
dentro de la estructura de la célula. Una vez que se encuentran en
este estado, dichas proteínas no se pueden perder desde la
estructura de la célula, que ahora está muerta.
Figura 1. Células CHO, que expresan la proteína
híbrida
PKAc-F64L-S65T-GFP,
se han tratado en un medio F-12 de HAM con
forskolina 50 mM a 37ºC. Las imágenes de la fluorescencia de GFP en
estas células se han tomado a diferentes intervalos de tiempo
después de un tratamiento, que eran de: a) 40 segundos, b) 60
segundos, c) 70 segundos, d) 80 segundos. La fluorescencia cambia
de un punteado a una distribución más uniforme dentro del
citoplasma (no nuclear).
Figura 2. Análisis de los intervalos de tiempo de
la redistribución de
PKAc-F64L-S65T-GFP
inducida por forskolina. Células CHO, que expresan la proteína de
fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP,
se analizaron por microscopia de fluorescencia a intervalos de
tiempo. Se adquirieron micrografías de fluorescencia a intervalos
regulares desde 2 min antes de la adición de un agonista hasta 8
min después de esta adición. Las células se estimularon con
forskolina 1 mM inmediatamente después de que hubo adquirido la
imagen izquierda superior (t = 0). Se recogieron fotogramas en los
siguientes momentos: i) 0, ii) 1, iii) 2, iv) 3, v) 4 y vi) 5
minutos. Barra de escala 10 mm.
Figura 3. Análisis de los intervalos de tiempo de
la redistribución de
PKAc-F64L-S65T-GFP
como respuesta a diversos agentes agonistas. Los efectos de
forskolina 1 mM (A), forskolina 50 mM (B), dbcAMP 1 mM (C) e IBMX
100 mM (D) (las adiciones son indicadas por flechas huecas) sobre
la localización de la proteína de fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP
se analizaron por microscopia de fluorescencia a intervalos de
tiempo de células
CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP.
El efecto de la adición de forskolina 10 mM (flecha hueca),
seguida breve tiempo después por lavado repetido con un tampón
(flecha maciza), sobre la localización de la proteína de fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP,
se analizó (E) en las mismas células. En un experimento en
paralelo, se analizó (F) el efecto de la adición de forskolina 10
mM e IBMX 100 mM (flecha hueca) seguida por un lavado repetido con
un tampón que contenía IBMX 100 mM (flecha maciza). La retirada de
la forskolina dio lugar a que la proteína de fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP
volviese a los agregados citoplasmáticos, mientras que esto es
impedido por la presencia continuada de IBMX (F). El efecto de
glucagón 100 nM (Figura 3G, flecha hueca) sobre la localización de
la proteína de fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP
es mostrado también por células BHK/GR,
PKAc-F64L-S65T-GFP.
El efecto de norepinefrina 10 mM (H), flecha maciza, sobre la
localización de la proteína de fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP,
se analizó similarmente en células
CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP,
transfectadas transitoriamente, previamente tratadas con forskolina
10 mM, flecha hueca, para aumentar la concentración [cAMP],.
Observación: en la Figura 3H el eje de las x cuenta los números de
imágenes, transcurriendo 12 segundos entre imágenes. Los datos en
bruto de cada experimento constaban de 60 micrografías de
fluorescencia adquiridas a intervalos reguladores inclusive varias
imágenes adquiridas antes de la adición de un tampón o agente
agonista. Los diagramas (A-G) muestran en cada caso
una cuantificación de la respuesta observada en la totalidad de
las 60 imágenes, realizada tal como se describe en el método de
análisis 2. El cambio en el área total de los agregados muy
fluorescentes, en relación con el área inicial de los agregados
fluorescentes se representa gráficamente como las ordenadas en
todos los gráficos en la Figura 3, en función del tiempo para cada
experimento. Barra de escala 10 mm.
Figura 4. Curva de respuesta a la dosis (dos
experimentos) para la redistribución inducida por forskolina de la
fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP.
Figura 5. Tiempo que transcurre desde la
iniciación de una respuesta a una redistribución semimáxima
(t_{1/2max}) y máxima (t_{max}) de
PKAc-F64L-S65T-GFP.
Los datos se extrajeron a partir de curvas tales como la que se
muestra en la "Figura 2". Todos los valores t_{1/2max} y
t_{max} se dan como media \pm DT [desviación típica] y están
basados en un total de 26-30 células procedentes
de 2-3 experimentos independientes para cada
concentración de forskolina. Puesto que la redistribución
observada se mantiene en el curso del tiempo, los valores de
t_{max} se tomaron en el momento más temprano en el que se
alcanza la redistribución completa. Obsérvese que los valores no se
relacionan con el grado de redistribución.
Figura 6. Análisis paralelos de respuesta a las
dosis de la elevación de cAMP y la redistribución de
PKAc-F64L-S65T-GFP,
inducidas por forskolina. Los efectos de un tampón o de 5
concentraciones crecientes de forskolina sobre la localización de
la proteína de fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP
en células
CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP,
que han crecido en una placa de 96 pocillos, se analizaron tal como
antes se describe. El cálculo de la relación de las DT's de
micrografías de fluorescencia tomadas en el mismo campo de
células, antes de, y 30 minutos después de, la adición de forskolina
dieron una medida reproducible de la redistribución de
PKAc-F64L-S65T-GFP.
El gráfico muestra las 48 mediciones individuales y una pista de
sus valores de media \pm etm (error típico de la media) con cada
concentración de forskolina. Como comparación, los efectos de un
tampón o de 8 concentraciones crecientes de forskolina sobre el
[cAMP]_{i} se analizó por un análisis de la proximidad de
escintilación en células que han crecido en las mismas
condiciones. El gráfico muestra una pista de la media \pm etm de 4
experimentos, expresada en unidades arbitrarias.
Figura 7. Células BHK se transfectaron
establemente con el receptor muscarínico humano (hM1) y con la
fusión
PKCa-F64L-S65T-GFP.
El carbacol (100 mM, añadido a 1,0 segundo) indujo una
redistribución transitoria de la
PKCa-F64L-S65T-GFP
desde el citoplasma hacia la membrana plasmática. Las imágenes se
tomaron en los siguientes momentos: a) 1 segundo antes de la
adición de carbacol, b) 8,8 segundos después de la adición y c)
52,8 segundos después de la adición.
Figura 8. Células BHK, transfectadas establemente
con el receptor hM1 y la fusión
PKCa-F64L-S65T-GFP,
se trataron con carbacol (1 mM, 10 mM, 100 mM). En células
individuales, la [Ca^{2+}] intracelular se vigiló simultáneamente
con la redistribución de
PKCa-F64L-S65T-GFP.
La línea de trazos indica los momentos de la adición del carbacol.
El panel superior muestra los cambios en la concentración
intracelular de Ca^{2+} de células individuales en función del
tiempo para cada tratamiento. El panel central muestra los cambios
en la fluorescencia de GFP citoplasmática media para células
individuales en función del tiempo para cada tratamiento. El panel
inferior muestra los cambios en la fluorescencia de la periferia
de células individuales, dentro de regiones que incluyen
específicamente el borde circunferencial de una célula, como se
observa en proyección normal, que son las regiones que ofrecen la
óptima oportunidad para vigilar los cambios en la intensidad de
fluorescencia de la membrana plasmática.
a) La fusión
hERK1-F64L-S65T-GFP
se expresó en células HEK293 tratadas con 100 mM del agente
inhibidor de MEK1, PD98059, en F-12 de HAM (sin
suero) durante 30 minutos a 37ºC. Los núcleos se vaciaron de
fluorescencia durante este tratamiento.
b) Las mismas células que en a) después del
tratamiento con 10% de suero de ternero fetal durante 15 minutos a
37ºC.
c) Perfiles de tiempo para la redistribución de
la fluorescencia de GFP en células HEK293 después de un
tratamiento con diversas concentraciones de EGF en el tampón Hepes
(el F-12 de HAM se reemplaza por el tampón Hepes
directamente antes del experimento). La redistribución de la
fluorescencia se expresa como el cambio en el valor de la relación
entre zonas en el núcleo y en el citoplasma de células
individuales. Cada perfil de tiempo es la media para los cambios
observados en seis células individuales.
d) Diagrama de barras para las mediciones de
punto final, a los 600 segundos después del comienzo de los
tratamientos con EGF, del cambio de fluorescencia (núcleo:
citoplasma) como consecuencia de diversas concentraciones de
EGF.
a) La fusión SMAD2-EGFP se
expresó en células HEK293 dejadas en ayunas de suero durante una
noche en el F-12 de HAM. El F-12 de
HAM se reemplazó luego por el tampón Hepes de pH 7,2 inmediatamente
antes del experimento. La barra de escala es de 10 mm.
b) Células HEK293 que expresan la fusión
SMAD2-EGFP tratadas con las diversas
concentraciones de TGF-beta que se indican, y se
vigiló la redistribución de la fluorescencia en función del
tiempo.
Las representaciones gráficas de los perfiles de
tiempo representan aumentos en la fluorescencia dentro del núcleo,
normalizados a valores iniciales en cada célula medida. Cada pista
es el perfil en el tiempo para un único núcleo de célula.
c) Un diagrama de barras que representa el cambio
del punto final en la fluorescencia dentro de los núcleos (después
de 850 segundos de tratamiento) para diferentes concentraciones de
TGF-beta. Cada barra es el valor para un único
núcleo en cada tratamiento.
Figura 11. La fusión
VASP-F64L-S65T-GFP
en células CHO se transfectó establemente con el receptor de
insulina humana. Las células se dejaron en ayunas durante dos horas
en un F-12 de HAM sin suero, luego se trataron con
10% de suero de ternero fetal. La imagen muestra la redistribución
resultante de la fluorescencia después de un tratamiento durante 15
minutos. La fluorescencia de GFP resulta localizada en estructuras
identificadas como adhesiones focales a lo largo de la longitud de
fibras con estrés por actinas.
Figura 12. Intervalo de tiempo en que se registra
la redistribución de GLUT4-GFP en células
CHO-HIR. El tiempo indica los minutos después de la
adición de insulina 100 nM.
Son útiles para vigilar la actividad de rutas de
señalización que conducen a concentraciones alteradas de cAMP,
p.ej. la activación de receptores acoplados a proteínas G, que se
acoplan a proteínas G de la clase G_{s} o G_{l}.
La subunidad catalítica de la cinasa de proteínas
(PKAc) dependiente de cAMP, murina, se fusionó en el extremo
terminal de C a un derivado F64L-S65T de GFP. La
fusión resultante
(PKAc-F64L-S65T-GFP)
se usó para vigilar in vivo la translocación y con ello la
activación de la PKA.
Se introdujeron sitios convenientes para
endonucleasas de restricción en los ADNc's que codifican la PKAc
murina (número de acceso al GenBank: M12303) y
F64L-S65T-GFP (secuencia descrita
en el documento WO 97/11094) mediante una reacción en cadena de
polimerasa (PCR). Las reacciones PCR se llevaron a cabo de acuerdo
con protocolos clásicos con los siguientes cebadores:
El producto de amplificación de la PKAc se
digirió luego con el Hindlll+Ascl y el producto
F64L-S65T-GFP se digirió con
Ascl+Xhol. Los dos productos de PCR digeridos se ligaron
subsiguientemente dentro de un plásmido digerido con Hindlll+Xhol
(vector de expresión de mamífero pZeoSV®, Invitrogen, San Diego,
CA, EE.UU.). La resultante estructura artificial de fusión (SEQ ID
NO: 68 & 69) estaba bajo el control del promotor SV40.
Células de ovario de hámster chino (CHO, de
Chinese Hamster Ovary) se transfectaron con el plásmido que
contenía la fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP
usando el método de precipitación con fosfato de calcio en una
solución salina tamponada con HEPES (Sambrook y colaboradores,
1989). Se seleccionaron transfectantes estables usando 1.000 mg de
Zeocin/ml (Invitrogen) en el medio de crecimiento (DMEM con 1.000 mg
de glucosa/l, 10% de suero de bovino fetal (FBS, de Fetal
Bovine Serum), 100 mg de una mezcla de penicilina y
estreptomicina ml^{-1}, 2 mM de L-glutamina
adquirida de Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.). Se
usaron como testigo células CHO no transfectadas. Para averiguar
el efecto del glucagón sobre la translocación de la proteína de
fusión, la fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP
fue expresada establemente en células de riñón de hámster cachorro
que sobreexpresan el receptor de glucagón humano (células BHK/GR,
de Baby Hamster Kidney/Glucagon Receptor). Se usaron como
testigo células BHK/GR no transfectadas. La expresión del GR se
mantuvo con 500 mg de G418/ml (marcador Neo) y la de
PKAc-F64L-S65T-GFP
se mantuvo con 500 mg de Zeocin/ml (marcador Sh ble).
Células CHO se co-transfectaron también
simultáneamente con vectores que contenían la fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP y
el adrenoceptor a2a humano (hARa2a).
Para efectuar la microscopia de fluorescencia, se
dejó que las células se adhiriesen a cubreobjetos provistos de
cámaras Lab-Tek (Nalge Nunc Int., Naperville, IL.
EE.UU.) durante al menos 24 horas y se cultivaron a una confluencia
de aproximadamente 80%. Antes de los experimentos, las células se
cultivaron durante una noche sin presión de selección en el medio
F-12 de HAM con glutamax (Life Technologies), 100 mg
de una mezcla de penicilina y estreptomicina ml^{-1} y 0,3% de
FBS. Este medio tenía una baja auto-fluorescencia
que hacía posible la microscopia por fluorescencia de células
directamente desde la incubadora.
Las adquisiciones de imágenes de células vivas se
recogieron usando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovert
135M equipado con un objetivo en inmersión en aceite Fluar 40X,
NA: 1,3 y acoplado a una cámara de dispositivo acoplado por cargas
(CCD) Photometrics CH250. Las células fueron iluminadas con una
lámpara de arco HBO de 100 W. En la trayectoria de la luz había un
filtro de excitación a 470 \pm 20 nm, un espejo dicroico a 510
nm y un filtro de emisión a 515 \pm 15 nm para el fondo de imagen
mínima. Las células se mantuvieron y vigilaron para que estuviesen
a 37ºC con un calentador en etapas hecho por encargo.
Las imágenes se trataron y analizaron de la
siguiente manera:
Método
1
1. La imagen se corrigió para corriente oscura
realizando una resta de pixel por pixel de una imagen oscura (una
imagen tomada en las mismas condiciones que la imagen real, excepto
que el obturador de la cámara no se dejó abrir).
2. La imagen se corrigió en cuanto a falta de
uniformidad de la iluminación realizando una relación de pixel por
pixel con una imagen de corrección en campo liso (es decir, una
imagen tomada en las mismas condiciones que la imagen real de una
muestra uniformemente fluorescente).
3. Se calculó el histograma de imagen, es decir
la frecuencia de aparición de cada valor de intensidad de la
imagen.
4. Se calculó una segunda derivada suavizada del
histograma y se determinó el segundo cero. Este cero corresponde al
punto de inflexión del histograma en el lado alto del pico
principal que representa la cantidad principal de los valores de
pixeles de imagen.
5. El valor determinado en la operación 4 se
restó de la imagen. Se desecharon todos los valores negativos.
6. Se determinó la varianza (cuadrado de la
desviación típica) de los remanentes valores de pixeles. Este valor
representa la "respuesta" para esa imagen.
7. Análisis de la proximidad de escintilación
(SPA, de Scintillation Proximity Assay) para la
cuantificación independiente de cAMP.
Método
2
1. Los agregados fluorescentes son segmentados a
partir de cada imagen usando un umbral encontrado automáticamente,
basado en la maximización de la medida de información entre el
objeto y el fondo. La entropía a priori del histograma de
imagen se usa como la medida de información.
2. El área de cada imagen ocupada por los
agregados se calcula contando los pixeles en las zonas
segmentadas.
3. El valor obtenido en la operación 2 para cada
imagen en una serie, o un par en tratamiento, se normaliza para el
valor encontrado para la primera imagen (no estimulada) recogida.
Un valor de cero (0) indica ninguna redistribución de fluorescencia
desde la condición de partida. Un valor de uno (1) obtenido por
este método es igual a la redistribución completa.
Las células se cultivaron en un medio
F-12 de HAM como antes se describe, pero en placas
de 96 pocillos. El medio se intercambió con un tampón
Ca^{2+}-HEPES que incluía IBMX 100 mM y las
células se estimularon con concentraciones diferentes de forskolina
durante 10 min. Las reacciones se detuvieron con la adición de NaOH
a 0,14 M y se midió la cantidad de cAMP producido con el estuche
cAMP-SPA kit, RPA538 (Amersham) tal como se
describe por el fabricante.
Se usaron los siguientes compuestos para hacer
variar los niveles de cAMP: forskolina, que es un agente activador
de la adenilato-ciclasa; dbcAMP, que es un compuesto
análogo a cAMP permeable a membranas que no es degradado por
fosfodiesterasas; IBMX, que es un agente inhibidor de
fosfodiesterasas.
Las células CHO que expresan establemente la
PKAc-F64L-S65T-GFP,
mostraron una espectacular translocación de la proteína de fusión
desde una distribución punteada a una distribución uniforme por
todo el citoplasma después de una estimulación con forskolina 1 mM
(n=3), forskolina 10 mM (n=4) y forskolina 50 mM (n=4) (Figura 1),
o con dbcAMP a 1 mM (n=6).
La Figura 2 muestra la progresión de la respuesta
en el curso del tiempo después de un tratamiento con forskolina 1
mM.
La Figura 3 presenta una comparación de los
perfiles temporales medios de la redistribución de una proteína de
fusión y una medida de la extensión de cada respuesta a las tres
concentraciones de forskolina (Figura 3A, E, B), y a la dbcAMP 1 mM
(Figura 3C) que causó una respuesta similar pero más lenta, y a la
adición de IBMX 100 mM (n=4, Figura 3D) que causó también una
respuesta lenta, incluso en la ausencia de estimulación por
adenilato-ciclasa. La adición de un tampón (n=2) no
tuvo ningún efecto (no se muestran datos).
Como un testigo para el comportamiento de la
proteína de fusión, se expresó
F64L-F65T-GFP a solas en células CHO
y a éstas se les añadió también forskolina 50 mM (n=5); la
característica de distribución difusa uniforme de GFP en estas
células no fue afectada por dicho tratamiento (datos no
mostrados).
La translocación de
PKAc-F64L-S65T-GFP
inducida por forskolina mostró una cierta relación de respuesta a
dosis (Figuras 4 y 6), véanse los procesos cuantitativos
anteriores.
La liberación de la sonda de PKAc a partir de sus
"puntos calientes" (de valores grandes) de anclaje
citoplasmático era reversible. El recurso de lavar repetidamente las
células (5-8 veces) con un tampón después del
tratamiento con forskolina 10 \muM restauró completamente el
modelo punteado en el transcurso de 2-5 min (n=2,
Figura 3E). De hecho, la proteína de fusión volvió a un modelo de
agregados citoplasmáticos fluorescentes que era indistinguible
virtualmente del observada antes de la estimulación con
forskolina.
Para ensayar si el retorno de la proteína de
fusión a los agregados citoplasmáticos reflejaba una
[cAMP]_{i} disminuida, las células se trataron con una
combinación de forskolina 10 mM e IBMX 100 mM (n=2) y luego se
lavaron repetidamente (5-8 veces) con un tampón
que contenía IBMX 100 mM (Figura 3F). En estos experimentos, la
proteína de fusión no vuelve a su localización de antes de la
estimulación después de la eliminación de forskolina.
Ensayo de la sonda de
PKA-F64L-S65T-GFP
con agentes fisiológicamente relevantes. Para ensayar la respuesta
de la sonda a la activación por receptores de la adenilatociclasa,
células BHK transfectadas establemente con el receptor de glucagón
y la sonda de
PKA-F64L-S65T-GFP se
expusieron a estimulación con glucagón. El receptor de glucagón se
acopla a una proteína G_{s} que activa a la
adenilato-ciclasa, aumentando con ello el nivel de
cAMP. En estas células. la adición de glucagón 100 nM (n=2) causó
la liberación de la sonda de
PKA-F64L-S65T-GFP a
partir de los agregados citoplasmáticos y una translocación
resultante de la proteína de fusión a una distribución
citoplasmática más uniforme en el transcurso de 2-3
min (Figura 3G). Se observaron efectos similares, pero menos
pronunciados, a menores concentraciones de glucagón (n=2), datos no
mostrados. La adición de un tampón (n=2) no tenía ningún efecto en
el transcurso del tiempo (datos no mostrados).
Células CHO transfectadas transitoriamente, que
expresaban hARa2a, y la sonda de
PKA-F64L-S65T-GFP se
trataron con forskolina 10 mM durante 7,5 minutos, y luego, en la
presencia continuada de forskolina, se expusieron a norepinefrina 10
mM para estimular a los adrenorreceptores exógenos que se acoplan a
una proteína G_{i}, que inhibe a la
adenilato-ciclasa. Este tratamiento condujo a la
aparición renovada de fluorescencia en los agregados
citoplasmáticos, que es indicativa de una disminución en la
[cAMP]_{i} (Figura 3H).
Como antes se describe, el tiempo que se necesitó
para que una respuesta pasase a completarse era dependiente de la
dosis de forskolina (Figura 5). Además, el grado de respuestas era
también dependiente de la dosis. Para ensayar la translocación de
la proteína de fusión
PKA-F64L-S65T-GFP en
un sistema de caudal semi-alto, células CHO
transfectadas establemente con la fusión
PKA-F64L-S65T-GFP se
estimularon con un tampón y con 5 dosis crecientes de forskolina
(n=8). Usando el algoritmo de análisis de imágenes antes descrito
(Método 1), se observó una relación de respuesta a dosis en el
intervalo de 0,01-50 mM de forskolina (Figura 6). Se
observó una estimulación semimáxima con aproximadamente 2 mM de
forskolina. En paralelo, las células se estimularon con un tampón y
con 8 concentraciones crecientes de forskolina (n=4) en el
intervalo de 0,01-50 mM. La cantidad producida de
cAMP se midió en un análisis por SPA. Se observó un aumento
pronunciado en unas concentraciones de forskolina entre 1 y 5 mM,
coincidente con la parte más pronunciada de la curva para la
translocación de la proteína de fusión (véase también la Figura
6).
Sonda para la detección de la actividad de PKC en
tiempo real dentro de células vivas:
La sonda se construyó ligando dos productos de
amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) tratados
con enzimas de restricción del ADNc, para PKC\alpha murina
(número de acceso al GenBank: M25811) y
F64L-S65T-GFP (secuencia descrita en
el documento WO 97/11094) respectivamente. Se usaron para la PCR
una polimerasa Taq® y los siguientes cebadores de
oligonucleótidos:
La hebra de ADN híbrido se insertó dentro del
vector de expresión de mamífero pZeoSV® como una casete para
Hindlll-Xhol como se describe en el Ejemplo 1.
Células BHK que expresan el receptor M1 humano
bajo el control del promotor de metalotioneína inducible, y
mantenidas con el marcador dihidrofolato-reductasa,
se transfectaron con la sonda de
PKC\alpha-F64L-S65T-GFP
usando el método de precipitación con fosfato de calcio en una
solución salina tamponada con HEPES (HBS [pH 7,10]). Se
seleccionaron los transfectantes estables usando 1.000 \mug
Zeocin®/ml en el medio de crecimiento (DMEM con 1.000 mg de
glucosa/l, 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 mg de una mezcla
de penicilina y estreptomicina ml^{-1}, e
I-glutamina 2 mM). El receptor hM1 y la proteína
de fusión
PKC\alpha-F64L-S65T-GFP
se mantuvieron con metotrexato 500 nM y con 500 \mug de
Zeocin®/ml respectivamente. 24 horas antes de cualquier
experimento, las células se transfirieron al medio
F-12 de HAM con glutamax, 100 \mug de una mezcla
de penicilina y estreptomicina ml^{-1} y 0,3% de FBS. Este medio
alivia la presión de selección, proporciona una baja inducción de
rutas de transducción de señales y tiene una baja
auto-fluorescencia a la longitud de onda relevante,
que hace posible la microscopia por fluorescencia de células
directamente desde la incubadora.
Imágenes digitales de células vivas se recogieron
usando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovert 135M equipado
con un objetivo en inmersión en aceite 40X, NA: 1,3 aceite y
acoplado a una cámara de dispositivo acoplado por cargas (CCD)
Photometrics CH250. Las células se iluminaron con una lámpara de
arco de 100 W. En la trayectoria de luz había un filtro de
excitación a 470 \pm 20 nm, un espejo dicroico a 510 nm y un
filtro de emisión a 515 \pm 15 nm para un fondo de imagen minima.
Las células se mantuvieron y vigilaron para que estuviesen a 37ºC
con un calentador en etapas hecho por encargo.
Las imágenes se analizaron usando el paquete de
programas lógicos software IPLab para Macintosh.
Después de estimulación con carbacol de las
células M1-BHK que expresan establemente la fusión
PKC\alpha-F64L-S65T-GFP
los autores del invento hemos observado una translocación
transitoria dependiente de la dosis desde el citoplasma a la
membrana plasmática (Figuras 7a, b, c). La medición simultánea de
la concentración de calcio libre citosólico muestra que la
movilización del calcio inducida por carbacol precede a la
translocación (Figura 8).
1. La imagen se corrigió para corriente oscura
realizando una resta de pixel por pixel de una imagen oscura (una
imagen tomada en las mismas condiciones que la imagen real, excepto
que el obturador de la cámara no se dejó abrir).
2. La imagen se corrigió en cuanto a falta de
uniformidad de la iluminación realizando una relación de pixel por
pixel con una imagen de corrección en campo liso (es decir, una
imagen tomada en las mismas condiciones que la imagen real de una
muestra uniformemente fluorescente).
3. Se hizo una copia de la imagen en la que los
bordes se identifican. Los bordes de la imagen son encontrados por
un proceso clásico de detección de los bordes - convolucionando la
imagen con un núcleo que elimina cualesquiera componentes que no
cambian a gran escala (es decir, el fondo) y acentúa cualesquiera
cambios a pequeña escala (es decir, los bordes nítidos). Esta
imagen se convirtió luego en una imagen binaria por comparación
con un umbral. Los objetos existentes en la imagen binaria, que
son demasiado pequeños para representar los bordes de células, se
desecharon. Una dilatación de la imagen binaria se realizó para
cerrar cualesquiera intersticios en los bordes de imágenes.
Cualesquiera objetos de bordes en la imagen que estaban en contacto
con los rebordes de la imagen se desechan. Esta imagen binaria
representa la máscara de borde.
4. Se hizo otra copia de imagen por medio del
procedimiento expuesto en la etapa 3. Esta copia se trató
adicionalmente para detectar objetos que encierran "agujeros"
y ajustando todos los pixeles dentro de los agujeros al valor
binario del borde, es decir uno. Esta imagen representa la máscara
de célula entera.
5. La imagen original se enmascaró con la máscara
de borde procedente de la operación 3 y se determinó la suma total
de todos los valores de pixeles.
6. La imagen original se enmascaró con la máscara
de célula entera procedente de la operación 4 y se determinó la
suma total de todos los valores de pixeles.
7. El valor procedente de la operación 5 se
dividió por el valor procedente de la operación 6 para dar el
resultado final, a saber la fracción de la intensidad de
fluorescencia en las células que se localizó en los bordes.
Son útiles para vigilar rutas de señalización que
implican a una MAPK, p.ej. para identificar compuestos que modulan
la actividad de la ruta en células vivas.
La Erk1, que es una cinasa de proteínas, de
serina/treonina, es un componente de una ruta de señalización que
es activada p.ej. por muchos factores de crecimiento.
La cinasa regulada por señales extracelulares
(ERK-1, de Extracellular signal Regulated
Kinase, una cinasa de proteínas activada por mitógenos, MAPK, de
Mitogen Activated Protein Kinase) se fusiona en el extremo
terminal de N o C a un derivado de GFP. Las fusiones resultantes
expresadas en diferentes células de mamífero se usan para vigilar
in vivo la translocación nuclear, y de este modo la
activación de ERK1 en respuesta a estímulos que activan la ruta de
MAPK.
Convenientes sitios de restricción con
endonucleasas se introducen en los ADNc's que codifican ERK1 de
murino (número de acceso al GenBank: Z14249) y
F64L-S65T-GFP (secuencia descrita
en el documento WO 97/11094) por una reacción en cadena de
polimerasa (PCR). Las reacciones PCR se realizan de acuerdo con
protocolos clásicos con los siguientes cebadores:
Para generar la fusión
mERK1-F64L-S65T-GFP
(SEQ ID NO: 56 & 57) el producto de la amplificación de ERK1 se
digiere con Hindlll+Ascl y el producto
F64L-S65T-GFP se digiere con
Ascl+Xhol. Para generar la fusión
F64L-S65T-GFP-mERK1
el producto de amplificación de ERK1 se digiere luego con
Hindlll+Bsu36l y el producto
F64L-S65T-GFP se digiere con
Bsu36l+Xhol. Los dos pares de productos de PCR digeridos se ligan
subsiguientemente dentro de un plásmido digerido con Hindlll+Xhol
(vector de expresión de mamífero pZeoSV®, Invitrogen, San Diego,
CA, EE.UU.). Las resultantes estructuras artificiales de fusión
están bajo el control del promotor de SV40.
b) El gen de Erk1 humano (número de acceso al
GenBank: X60188) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos normalizados, con los cebadores
Erk1-superior (SEQ ID NO: 9) y
Erk1-inferior/+detención (SEQ ID NO: 10). El
producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1
y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech,
Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con EcoR1 y
BamH1. Esto produce una fusión EGFP-Erk1 (SEQ ID NO:
38 & 39) bajo el control de un promotor de CMV
(citomegalovirus).
El plásmido que contiene la fusión
EGFP-Erk1 se transfectó dentro de células HEK293
empleando el reactivo para transfección FUGENE (de Boehringer
Mannheim). Antes de los experimentos, las células se hicieron
crecer a una confluencia de 80%-90% en cámaras de 8 pocillos en un
medio DMEM con 10% de FCS. Las células se lavaron en el medio
F-12 de HAM puro (sin FCS) y luego se incubaron
durante 30-60 minutos en el medio
F-12 de HAM (sin FCS) puro con PD98059 100
micromolar, que es un agente inhibidor de MEK1, una cinasa que
activa a la Erk1; esta operación vacía de manera efectiva al núcleo
de EGFP-Erk1. Justamente antes de comenzar el
experimento, el F-12 de HAM se reemplazó con el
tampón Hepes a continuación de un lavado con el tampón Hepes. Esto
elimina al agente inhibidor PD98059; si todavía se desea un bloqueo
de MEK1 (p.ej. en experimentos testigos) el agente inhibidor es
incluido en el tampón Hepes.
El ajuste experimental del microscopio era tal
como se describe en el Ejemplo 1.
Se recogieron 60 imágenes con 10 segundos entre
cada una, y añadiéndose el compuesto de ensayo después de la imagen
número 10.
La adición de EGF (1-100 nM)
causó en el transcurso de unos pocos minutos una redistribución de
EGFP-Erk1 desde el citoplasma al núcleo (Figura 9a,
b).
La respuesta se cuantificó tal como se describe
seguidamente y se encontró una relación dependiente de la dosis
entre la concentración de EGF y la translocación nuclear de
EGFP-Erk1 (Figuras 9c, d). La redistribución de la
fluorescencia GFP es expresada en este ejemplo como el cambio en
el valor de la relación entre zonas en compartimientos nucleares
frente a zonas en compartimientos citoplasmáticos de la célula. Cada
perfil de tiempo es la media de las relaciones de nucleares a
citoplasmáticos de seis células en cada tratamiento.
Son útiles para vigilar las rutas de señalización
que implican a la MAPK, p.ej. para identificar compuestos que
modulan la actividad de la ruta en células vivas.
La Erk2, que es una cinasa de proteínas,
serina/treonina, está estrechamente relacionada con la Erk1 pero no
es idéntica; es un componente de una ruta de señalización que es
activada p.ej. por muchos factores de crecimiento.
a) El gen de Erk2 de rata (número de acceso al
GenBank: M64300) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores Erk2-superior
(SEQ ID NO: 11) y Erk2-inferior/+detención (SEQ ID
NO: 13). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de
pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión
EGFP-Erk2 (SEQ ID NO: 40 & 41) bajo el control
de un promotor de CMV.
b) El gen de Erk2 de rata (número de acceso al
GenBank: M64300) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores Erk2-superior
(SEQ ID NO: 11) y Erk2-inferior/-detención (SEQ ID
NO: 12). El producto de la PCR se digirió con enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de
pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión
Erk2-EGFO (SEQ ID NO: 58 & 59) bajo el control
de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectaron dentro
de células CHO y células BHK. Las células se hicieron crecer en
condiciones normalizadas. Antes de los experimentos, las células se
dejaron en ayunas en medios sin suero durante 48-72
horas. Esto condujo a una localización predominantemente
citoplasmática de ambas sondas, especialmente en células BHK. Se
añadió suero de ternero fetal al 10% a las células y se registró la
fluorescencia de las células tal como se explica en el Ejemplo 3. La
adición del suero hizo que las muestras se redistribuyesen dentro
del núcleo en el transcurso de unos pocos minutos desde la adición
del suero.
\newpage
Son útiles para vigilar las rutas de señalización
activadas por algunos miembros de la familia de factor de
crecimiento en transformación-beta, p.ej. para
identificar los compuestos que modulan la actividad de la ruta en
células vivas.
El Smad2, que es un transductor de señales, es un
componente de una ruta de señalización que es inducido por algunos
miembros de la familia TGFbeta de citocinas.
a) El gen de Smad2 humano (número de acceso al
GenBank: AF027964) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores
Smad2-superior (SEQ ID NO: 24) y
Smad2-inferior/+detención (SEQ ID NO: 26). El
producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1 y
Acc65l, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech;
Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con EcoR1 y
Acc65l. Esto produce una fusión EGFP-Smad2 (SED ID
NO: 50 & 51) bajo el control de un promotor de CMV.
b) El gen de Smad2 humano (número de acceso al
GenBank: AF027964) se amplificó una PCR de acuerdo con protocolos
clásicos con los cebadores Smad2-superior (SEQ ID
NO: 24) y Smad2-inferior/-detención (SEQ ID NO: 25).
El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción
EcoR1 y Acc65l, y se ligó dentro de pEGFP:N1 (Clontech, Palo Alto;
número de acceso al GenBank U55762) digerido con EcoR1 y Acc65l.
Esto produce una fusión Smad2-EGFP (SEQ ID NO: 74
& 75) bajo el control de un promotor de CMV.
El plásmido que contenía la fusión
EGFP-Smad2 se transfectó dentro de células HEK293,
en donde mostró una distribución citoplasmática. Antes de los
experimentos, las células se hicieron crecer en cámaras Nunc de 8
pocillos en un medio de DMEM con 10% de FCS a una confluencia de
80% y se dejaron en ayunas durante una noche en el medio
F-12 de HAM sin FCS.
Para los experimentos, el medio
F-12 de HAM se reemplazó con el tampón Hepes de pH
7,2.
El ajuste experimental del microscopio fue tal
como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Se recogieron 90 imágenes con 10 segundos entre
cada una, y añadiéndose el compuesto de ensayo después de la imagen
número 5.
Después del ayuno sin suero de las células, cada
núcleo contiene menos fluorescencia de GFP que el citoplasma
circundante (Figura 10a). La adición de TGFbeta causó en el
transcurso de unos pocos minutos una redistribución de la
EGFP-Smad2 desde el citoplasma al núcleo (Figura
10b).
La redistribución de fluorescencia dentro de las
células tratadas se cuantificó simplemente como el aumento
fraccionario en la fluorescencia nuclear normalizado al valor de
partida de la fluorescencia de GFP en el núcleo de cada célula no
estimulada.
Es útil para vigilar las rutas de señalización
que implican la redisposición de elementos del citoesqueleto,
p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la
ruta en células vivas.
La VASP, que es una fosfoproteína, es un
componente de las estructuras del citoesqueleto, que se
redistribuye como respuesta a señales que afectan a adhesiones
focales.
a) El gen de VASP humano (número de acceso al
GenBank: Z46389) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores VASP-superior
(SEQ ID NO: 94) y VASP-inferior/+detención (SEQ ID
NO: 95). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de
restricción Hind3 y BamH1, y se ligó dentro de
pEGFP-C1 (Clontech; Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55763) digerido con Hind3 y BamH1. Esto produce una fusión
EGFP-VASP (SEQ ID NO: 124 & 125) bajo el control
de un promotor de CMV.
El plásmido resultante se transfectó dentro de
células CHO que expresan el receptor de insulina humana usando el
método de transfección con fosfato de calcio. Antes de los
experimentos, las células se hicieron crecer en cámaras Nunc de 8
pocillos y se dejaron en ayunas durante una noche en un medio sin
FCS.
Los experimentos se realizan en un ajuste de
microscopio como se describe en el Ejemplo 1.
Se añadió 10% de FCS a las células y se
recogieron imágenes. La fusión EGFP-VASP se
redistribuyó desde una distribución algo uniforme cerca de la
periferia a estructuras más localizadas, identificadas como puntos
de adhesión focal (Figura 11).
Se han hecho un gran número de otras fusiones con
GFP o están en el proceso de hacerse, tal como resulta evidente en
los siguientes Ejemplos 7-22 que también sugieren
apropiadas células hospedantes y sustancias para la activación de
las rutas de señalización celulares que se han de vigilar y
analizar.
Es útil para vigilar rutas de señalización que
implican la redisposición o la formación de filamentos de actina,
p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de rutas
que conducen a las redisposiciones del citoesqueleto en células
vivas.
La actina es un componente de estructura del
citoesqueleto, que se redistribuye como respuesta a muchísimas
señales celulares.
El dominio de fijación a actina del gen de
alfa-actinina humana (número de acceso al GenBank
X15804) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos
clásicos con los cebadores ABD-superior (SEQ ID
NO: 90) y ABD-inferior/-detención (SEQ ID NO: 91).
El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción
Hind3 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-N1
(Clontech, Palo Alto, número de acceso al GenBank U55762) digerido
con Hind3 y BamH1. Esto produjo una fusión de dominio de fijación a
actina-EGFP (SEQ ID NO: 128 & 129) bajo el
control de un promotor de CMV.
El plásmido resultante se transfectó dentro de
células CHO que expresan el receptor de insulina humana. Las
células se estimularon con insulina, lo que dio lugar a que la
sonda de dominio de fijación a actina-EGFP
resultase redistribuida a estructuras asociadas a membranas,
morfológicamente distinguibles.
Útiles para vigilar rutas de señalización que
responden a diversas situaciones de estrés celular p.ej. para
identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en
células vivas, o como una contra-pantalla.
La p38, que es una cinasa de proteínas,
serina/treonina, es un componente de una ruta de señalización
inducida por estrés que es activada por muchos tipos de estrés
celular, p.ej. por TNFalfa, anisomicina, UV y mitomicima C.
a) El gen de p38 humano (número de acceso al
GenBank: L35253) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores p38-superior
(SEQ ID NO: 14) y p38-inferior/+detención (SEQ ID
NO: 16). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de
pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55763) digerido con Xhol y BamH1. Esto produjo una fusión
EGFP-p38 (SEQ ID NO: 46 & 47) bajo el control de
un promotor de CMV.
b) El gen de p38 humano (número de acceso al
GenBank: L35253) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores p38-superior
(SEQ ID NO: 13) y p38-inferior/-detención (SEQ ID
NO: 15). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de
pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produjo una fusión
p38-EGFP (SEQ ID NO: 64 & 65) bajo el control de
un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una línea celular apropiada, p.ej. la HEK293, en la que la
sonda de EGFP-p38 y la sonda de
p38-EGFP deberían cambiar su distribución celular
desde predominantemente citoplasmática a nuclear en el transcurso
de unos pocos minutos como respuesta a una activación de la ruta de
señalización p.ej. con anisomicina.
Útiles para vigilar las rutas de señalización que
responden a diversas situaciones de estrés celular, p.ej. para
identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en
células vivas, o como una contra-pantalla.
La Jnk1, que es una cinasa de proteínas,
serina/treonina, es un componente de una ruta de señalización
inducida por estrés que es diferente de la p38 antes descrita,
aunque también es activada por muchos tipos de estrés celular,
p.ej. TNFalfa anisomicina y UV.
a) El gen de Jnk1 humano (número de acceso al
GenBank: L26318) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores Jnk-superior
(SEQ ID NO: 17) y Jnk-inferior/+detención (SEQ ID
NO: 19). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de
pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produjo una fusión
EGFP-Jnk1 (SEQ ID NO: 44 & 45) bajo el control
de un promotor de CMV.
b) El gen de Jnk1 humano (número de acceso al
GenBank: L26318) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores Jnk-superior
(SEQ ID NO: 17) y Jnk-inferior/-detención (SEQ ID
NO: 18). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de
pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produjo una fusión
Jnk1-GFP (SEQ ID NO: 62 & 63) bajo el control de
un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una apropiada línea celular, p.ej. HEK293, en que la sonda de
EGFP-Jnk1 y/o la sonda de Jnk1-EGFP
deberían cambiar su distribución celular desde predominantemente
citoplasmática a nuclear como respuesta a una activación de la ruta
de señalización p.ej. con anisomicina.
Útiles para vigilar las rutas de señalización que
implican cambios en los niveles de GMP cíclico, p.ej. para
identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en
células vivas.
La PGK, que es una cinasa de proteínas,
serina/treonina, dependiente de cGMP, media en la señal de
guanilil-ciclasa/cGMP.
a) El gen de PKG humano (número de acceso al
GenBank: Y07512) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores PKG-superior
(SEQ ID NO: 81) y PKG-inferior/+detención (SEQ ID
NO: 83). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de
pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión
EGFP-PKG (SEQ ID NO: 134 & 135) bajo el control
de un promotor de CMV.
b) El gen de PKG humano (número de acceso al
GenBank: Y07512) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores PKG-superior
(SEQ ID NO: 81) y PGK-inferior/-detención (SEQ ID
NO: 82). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de
pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión
PKG-EGFP (SEQ ID NO: 136 & 137) bajo el control
de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una apropiada línea celular, p.ej. la A10, en que la sonda de
EGFP-PKG y/o la sonda de PKG-EGFP
deberían cambiar su distribución celular desde citoplasmática a una
asociada con elementos del citoesqueleto en el transcurso de unos
pocos minutos como respuesta a un tratamiento con agentes que
aumentan los niveles de óxido nítrico (NO).
Útiles para vigilar rutas de señalización que
conducen a la activación de NFkappaB, p.ej. para identificar
compuestos que modulan la actividad de la ruta en células
vivas.
La cinasa IkappaB, que es una cinasa de
serina/treonina, es un componente de una ruta de señalización que
es activada por una diversidad de inductores que incluyen
citocinas, linfocinas, factores de crecimiento y estrés.
a) La subunidad alfa del gen de cinasa de IkappaB
humano (número de acceso al GenBank: AF009225) se amplifica usando
una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores
IKK-superior (SEQ ID NO: 96) e
IKK-inferior/+detención (SEQ ID NO: 98). El
producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción EcoR1 y
Acc65l, y se liga dentro de pEGFP-C1 (Clontech,
Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con EcoR1 y
Acc65l. Esto produce una fusión EGFP-cinasa de
IkappaB (SEQ ID NO: 120 & 121) bajo el control de un promotor de
CMV.
b) La subunidad alfa del gen de cinasa de IkappaB
humano (número de acceso al GenBank: AF009225) se amplifica usando
una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores
IKK-superior (SEQ ID NO: 96) e
IKK-inferior/-detención (SEQ ID NO: 97). El
producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción EcoR1 y
Acc65l, y se liga dentro de pEGFP-N1 (Clontech,
Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con EcoR1 y
Acc65l. Esto produce una fusión cinasa de
IkappaB-EGFP (SEQ ID NO: 122 & 123) bajo el
control de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una línea celular apropiada, p.ej. la Jurkat, en que la sonda
de EGFP-cinasa de IkappaB y/o la sonda de cinasa de
IkappaB-EGFP deberían conseguir una distribución más
citoplasmática en el transcurso de unos pocos segundos a
continuación de una estimulación p.ej. con TNFalfa.
Útiles para vigilar las rutas de señalización del
ciclo celular, p.ej. para identificar compuestos que modulan la
actividad de la ruta en células vivas.
La CDK2, que es una cinasa de serina/treonina
dependiente de ciclina, es un componente del sistema de
señalización que regula el ciclo celular.
a) El gen de CDK2 humano (número de acceso al
GenBank: X61622) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores CDK2-superior
(SEQ ID NO: 102) y CDK2-inferior/+detención (SEQ ID
NO: 104). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de
pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión
EGFP-CDK2 (SEQ ID NO: 114 & 115) bajo el control
de un promotor de CMV.
b) El gen de CDK2 humano (número de acceso al
GenBank: X61622) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores CDK2-superior
(SEQ ID NO: 102) y CDK2-inferior/-detención (SEQ ID
NO: 103). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de
pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión
CDK2-EGFP (SEQ ID NO: 112 & 113) bajo el control
de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una línea celular apropiada, p.ej. la HEK293, en la que la
sonda de EGFP-CDK2 y/o la sonda de
CDK2-EGFP deberían cambiar su distribución celular
desde citoplasmática en células inhibidas de entrar en contacto, a
una localización nuclear como respuesta a una activación con un
cierto número de factores de crecimiento, p.ej. IGF.
Útiles para vigilar las rutas de señalización que
implican una desensibilización de receptores acoplados a la
proteína G, p.ej. para identificar compuestos que modulan la
actividad de la ruta en células vivas.
La Grk5, que es una cinasa de receptor acoplado a
la proteína G, es un componente de rutas de señalización que
implican a receptores acoplados a la proteína G unidos a
membranas.
a) El gen de Grk5 humano (número de acceso al
GenBank: L15388) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores Grk5-superior
(SEQ ID NO: 27) y Grk5-inferior/+detención (SEQ ID
NO: 29). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción EcoR1 y BamH1, y se liga dentro de
pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55763) digerido con EcoR1 y BamH1. Esto produce una fusión
EGFP-Grk5 (SEQ ID NO: 42 & 43) bajo el control
de un promotor de CMV.
b) El gen de Grk5 humano (número de acceso al
GenBank: L15388) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores Grk5-superior
(SEQ ID NO: 27) y Grk5-inferior/-detención (SEQ ID
NO: 28). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción EcoR1 y BamH1, y se liga dentro de
pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55762) digerido con EcoR1 y BamH1. Esto produce una fusión
Grk5-EGFP (SEQ ID NO: 60 & 61) bajo el control
de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una apropiada línea celular, p.ej. la HEK293, que expresa un
receptor D1A de dopamina de rata, en que la sonda de
EGFP-Grk5 y/o la sonda de Grk5-EGFP
deberían cambiar su distribución celular desde predominantemente
citoplasmática a periférica como respuesta a una activación de la
ruta de señalización p.ej. con dopamina.
Útiles para vigilar las rutas de señalización que
implican al receptor de células T, p.ej. para identificar
compuestos que modulan la actividad de la ruta en células
vivas.
La Zap70, que es una cinasa de tirosina, es un
componente de rutas de señalización que es activa, p.ej., para la
diferenciación de células T.
a) El gen de Zap70 humano (número de acceso al
GenBank: L05148) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores
Zap70-superior (SEQ ID NO: 105) y
Zap70-inferior/+detención (SEQ ID NO: 107). El
producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción EcoR1
y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-C1 (número de
acceso al GenBank U55763) digerido con EcoR1 y BamH1. Esto produce
una fusión EGFP-Zap70 (SEQ ID NO: 108 & 109)
bajo el control de un promotor de CMV.
b) El gen de Zap70 humano (número de acceso al
GenBank: L05148) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores
Zap70-superior (SEQ ID NO: 105) y
Zap70-inferior/-detención (SEQ ID NO: 106). El
producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción EcoR1
y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-N1 (Clontech,
Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con EcoR1 y
BamH1. Esto produce una fusión Zap70-EGFP (SEQ ID
NO: 110 & 111) bajo el control de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una apropiada línea celular, p.ej. la Jurkat, en que la sonda
de EGFP-Zap70 y/o la sonda de
Zap70-EGFP deberían cambiar su distribución
celular desde citoplasmática a asociada con membranas en el
transcurso de unos pocos segundos como respuesta de la activación
de la ruta de señalización de receptor de células T p.ej. con
anticuerpos para CD3epsilón.
Útiles para vigilar las rutas de señalización que
implican a la cinasa de PI-3, p.ej. para
identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en
células vivas.
La p85alfa es la subunidad reguladora de la
cinasa de P13, que es un componente de muchas rutas que implican a
los receptores de cinasas de tirosina, unidos a membranas y los
receptores acoplados a la proteína G.
a) El gen de p85alfa humano (número de acceso al
GenBank: M61906) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores
p85-superior-C (SEQ ID NO: 22) y
p85-inferior/+detención (SEQ ID NO: 23). El producto
de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Bgl2 y BamH1,
y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto;
número de acceso al GenBank U55763) digerido con Bgl2 y BamH1. Esto
produjo una fusión EGFP-p85alfa (SEQ ID NO: 48 &
49) bajo el control de un promotor de CMV.
b) El gen de p85alfa humano (número de acceso al
GenBank: M61906) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores
p85-superior-N (SEQ ID NO: 20) y
p85-inferior/-detención (SEQ ID NO: 21). El producto
de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1 y BamH1,
y se ligó dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto;
número de acceso al GenBank U55762) digerido con EcoR1 y BamH1.
Esto produjo una fusión p85alfa-EGFP (SEQ ID NO: 66
& 67) bajo el control de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una apropiada línea celular, p.ej. la CHO, que expresa el
receptor de insulina humano, en que la sonda de
EGFP-p85 y la sonda de p85-EGFP
pueden cambiar su distribución celular desde citoplasmática a
asociada con membranas en el transcurso de unos pocos minutos como
respuesta de la activación del receptor con insulina.
Útiles para vigilar las rutas de señalización que
implican cinasas de tirosina, p.ej. para identificar compuestos
que modulan la actividad de la ruta en células vivas.
La fosfatasa de proteína-tirosina
1C, que es una fosfatasa específica para tirosina, es un
componente inhibidor en rutas de señalización que implican p.ej. a
algunos factores de crecimiento.
a) El gen de fosfatasa de
proteína-tirosina 1C humano (número de acceso al
GenBank: X62055) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores PTP-superior
(SEQ ID NO: 99) y PTP-inferior/+detención (SEQ ID
NO: 101). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción Xho1 y EcoR1, y se liga dentro de
pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55763) digerido con Xho1 y EcoR1. Esto produce una fusión
EGFP-PTP (SEQ ID NO: 116 & 117) bajo el control
de un promotor de CMV.
b) El gen de fosfatasa de
proteína-tirosina 1C humano (número de acceso al
GenBank: M62055) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores PTP-superior
(SEQ ID NO: 99) y PTP-inferior/-detención (SEQ ID
NO: 100). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción Xho1 y EcoR1, y se liga dentro de
pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55762) digerido con Xho1 y EcoR1. Esto produce una fusión
PTP-EGFP (SEQ ID NO: 118 & 119) bajo el control
de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una apropiada línea celular, p.ej. la MCF-7, en
que la sonda de EGFP-PTP y/o la sonda de
PTP-EGFP deberían cambiar su distribución celular
desde citoplasmática a la membrana plasmática en el transcurso de
unos pocos minutos como respuesta a una activación de la ruta de
señalización inhibidora del crecimiento p.ej. con
somatostatina.
Útiles para vigilar rutas de señalización que
implican a la mayor parte de los miembros de la familia del factor
beta de crecimiento en transformación, p.ej. para identificar
compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.
El Smad4, que es un transductor de señales, es un
componente corriente de rutas de señalización inducidas por
diversos miembros de la familia TGFbeta de citocinas.
a) El gen de Smad4 humano (número de acceso al
GenBank: U44378) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores
Smad4-superior y
Smad4-inferior/+detención (SEQ ID NO: 35). El
producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1
y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech,
Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con EcoR1 y
BamH1. Esto produce una fusión EGFP-Smad4 (SEQ ID
NO: 52 & 53) bajo el control de un promotor de CMV.
b) El gen de Smad4 humano (número de acceso al
GenBank: U44278) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores
Smad4-superior (SEQ ID NO: 33) y
Smad4-inferior/-detención (SEQ ID NO: 34). El
producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1
y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-N1 (Clontech,
Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con EcoR1 y
BamH1. Esto produjo una fusión Smad4-EGFP (SEQ ID
NO: 76 & 77) bajo el control de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una línea celular, p.ej. la HEK293, en que la sonda de
EGFP-Smad4 y/o la sonda de
Smad4-EGFP deberían cambiar su distribución celular
en el transcurso de unos pocos minutos desde citoplasmática a
nuclear como respuesta a una activación de la ruta de señalización
p.ej. con TGFbeta.
Útiles para vigilar rutas de señalización que
implican a la activación de cinasas de tirosina de la familia Jak,
p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la
ruta en células vivas.
El Stat5, que es un transductor de señales y
activador de la transcripción, es un componente de rutas de
señalización que son inducidas p.ej. por muchas citocinas y muchos
factores de crecimiento.
a) El gen de Stat5 humano (número de acceso al
GenBank: L41142) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores
Stat5-superior (SEQ ID NO: 30) y
Stat5-inferior/+detención (SEQ ID NO: 32). El
producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Bgl2
y Acc65l, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech,
Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Bgl2 y
Acc65l. Esto produjo una fusión EGFP-Stat5 (SEQ ID
NO: 54 & 55) bajo el control de un promotor de CMV.
b) El gen de Stat5 humano (número de acceso al
GenBank: L41142) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores
Stat5-superior (SEQ ID NO: 30) y
Stat5-inferior/-detención (SEQ ID NO: 31). El
producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Bgl2
y Acc65l, y se ligó dentro de pEGFP-N1 (Clontech,
Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Bgl2 y
Acc65l. Esto produjo una fusión Stat5-EGFP (SEQ ID
NO: 78 & 79) bajo el control de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una apropiada línea celular, p.ej. la MIN6, en la que la sonda
EGFP-Stat5 y/o la sonda Stat5-EGFP
deberán cambiar su distribución celular desde citoplasmática a
nuclear en el transcurso de unos pocos minutos como respuesta a la
activación de la ruta de señalización, p.ej. con prolactina.
Útiles para vigilar las rutas de señalización que
implican a una activación de NFAT, p.ej. para identificar
compuestos que modulan la actividad de la ruta en células
vivas.
El NFAT, que es un activador de la transcripción,
es un componente de las rutas de señalización que está implicado
p.ej. en respuestas inmunitarias.
a) El gen de NFAT1 humano (número de acceso al
GenBank: U43342) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores NFAT-superior
(SEQ ID NO: 84) y NFAT-inferior/+detención (SEQ ID
NO: 86). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción Xho1 y EcoR1, y se liga dentro de
pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55763) digerido con Xho1 y AcoR1. Esto produce una fusión
EGFP-NFAT (SEQ ID NO: 130 & 131) bajo el control
de un promotor de CMV.
b) El gen de NFAT humano (número de acceso al
GenBank: U43342) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores NFAT-superior
(SEQ ID NO: 84) y NFAT-inferior/-detención (SEQ ID
NO: 85). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción Xho1 y EcoR1, y se liga dentro de
pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank 055762) digerido con Xho1 y EcoR1. Esto produce una fusión
NFAT-EGFP (SEQ ID NO: 132 & 133) bajo el control
de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una apropiada línea celular, p.ej. la Jurkat, en que la sonda
de EGFP-NFAT y/o la sonda de
NFAT-EGFP deberán cambiar su distribución celular
desde citoplasmática a nuclear en el transcurso de unos pocos
minutos como respuesta a una activación de la ruta de señalización,
p.ej. con anticuerpos para CD3epsilón.
Útiles para vigilar rutas de señalización que
conducen a la activación de NFkappaB, p.ej. para identificar
compuestos que modulan la actividad de la ruta en células
vivas.
El NFkappaB, que es un activador de la
transcripción, es un componente de rutas de señalización que son
capaces de responder a una diversidad de inductores inclusive
citocinas, linfocinas y algunos agentes supresores de inmunidad.
a) El gen de la subunidad p65 de NFkappaB humano
(número de acceso al GenBank: M62399) se amplifica usando una PCR
de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores
NFkappaB-superior (SEQ ID NO: 87) y
NFkappaB-inferior/+detención (SEQ ID NO: 89). El
producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1
y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-C1 (Clontech,
Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Xho1 y
BamH1. Esto produce una fusión EGFP-NFkappaB (SEQ
ID NO: 142 & 143) bajo el control de un promotor de CMV.
b) El gen de la subunidad p65 de NFkappaB humano
(número de acceso al GenBank: M62399) se amplifica usando una PCR
de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores
NFkappaB-superior (SEQ ID NO: 87) y
NFkappaB-inferior/-detención (SEQ ID NO: 88). El
producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1
y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-N1 (Clontech,
Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Xho1 y
BamH1. Esto produce una fusión NFkappaB-EGFP (SEQ
ID NO: 140 & 141) bajo el control de un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una apropiada línea celular, p.ej. la Jurkat, en que la sonda
de EGFP-NFkappaB y la sonda de
NFkappaB-EGFP deberían cambiar su distribución
celular desde citoplasmática a nuclear como respuesta a una
activación de la ruta de señalización, p.ej. con TNFalfa.
Útil para vigilar las rutas de señalización que
implican a la RhoA, p.ej. para identificar compuestos que modulan
la actividad de la ruta en células vivas.
La RhoA, que es una GTPasa pequeña, es un
componente de muchas rutas de señalización que son capaces de
responder a una diversidad de inductores, p.ej. redisposiciones en
el citoesqueleto inducidas por LPA.
El gen de RhoA humano (número de acceso al
GenBank: L25080) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores RhoA-superior
(SEQ ID NO: 92) y RhoA-inferior/+detención (SEQ ID
NO: 93). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de
restricción Hind3 y BamH1, y se ligó dentro de
pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55763) digerido con Hind3 y BamH1. Esto produjo una
fusión EGFP-RhoA (SEQ ID NO: 126 & 127) bajo el
control de un promotor de CMV. El plásmido resultante se
transfecta dentro de una apropiada línea celular, p.ej. la
Swiss3T3, en que la sonda de EGFP-RhoA debería
cambiar su distribución celular desde una distribución
razonablemente homogénea a una distribución periférica en el
transcurso de unos pocos minutos desde la activación de la ruta de
señalización, p.ej. con LPA.
Útiles para vigilar las rutas de señalización que
implican a la PKB, p.ej. para identificar compuestos que modulan
la actividad de la ruta en células vivas.
La PKB, que es una cinasa de serina/treonina, es
un componente en diversas rutas de señalización, muchas de las
cuales son activadas por factores de crecimiento.
a) El gen de PKB humano (número de acceso al
GenBank: M63167) se amplifica usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores PKB-superior
(SEQ ID NO: 36) y PKB-inferior/+detención (SEQ ID
NO: 80). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de
pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión
EGFP-PKB (SEQ ID NO: 138 & 139) bajo el control
de un promotor de CMV.
b) El gen de PKB humano (número de acceso al
GenBank: M63167) se amplificó usando una PCR de acuerdo con
protocolos clásicos con los cebadores PKB-superior
(SEQ ID NO: 36) y PKB-inferior/-detención (SEQ ID
NO: 37). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de
restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de
pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al
GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produjo una fusión
PKB-EGFP (SEQ ID NO: 70 & 71) bajo el control de
un promotor de CMV.
Los plásmidos resultantes se transfectan dentro
de una apropiada línea celular, p.ej. la CHO, que expresa el
receptor de insulina humana, en que la sonda de
EGFP-PKB y/o la sonda de PKB-EGFP
describen un ciclo entre situaciones citoplasmáticas y de membranas
durante el proceso de activación y desactivación a continuación de
la adición de insulina. La transición debería ser evidente en el
transcurso de unos pocos minutos.
Adams, S.R., Harootunian, A.T.,
Buechler, Y.J., Taylor, S.S. & Tsien, R.Y.
1991) Nature 349, 694-697
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Schmidt, D.J., Ikebe, M.,
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J. 11, 2924 (Resumen)
Sakai. N., Sasaki, K.,
Hasegawa, C., Ohkura, M., Suminka, K.,
Shirai, Y. & Saito, N. (1996) Soc.
Neuroscience 22, 69P (Resumen)
Sakai. N., Sasaki, K.,
Hasegawa, C., Ohkura, M., Sumioka.,
Shirai, Y. & Naoaki, S. (1997) Japanese
Journal of Pharmacology 73, 69P (Resumen de un Congreso
celebrado el 22-23 de Marzo).
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: NovoNordisk, Biolmage
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Un método para detectar la translocación celular de polipéptidos biológicamente activos utilizando imágenes fluorescentes
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 143
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: NovoNordisk, Biolmage
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Mø rkøjbygade 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Søborg
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: DK
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: DINAMARCA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 2860
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ for Windows Versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: PV& PR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGACACAA GCTTTGGACA CGGCGCGCCA TGAGTAAAGG AGAAGAACTT TTC
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCATCTTCT CGAGTCTTAC TCCTGAGGTT TGTATAGTTC ATCCATGCCA TGT
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGACACAA GCTTTGGACA CCCTCAGGAT ATGGGCAACG CCGCCGCCGC CAAG
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCATCTTCT CGAGTCTTTC AGGCGCGCCC AAACTCAGTA AACTCCTTGC CACAC
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGACACAA GCTTTGGACA CCCTCAGGAT ATGGCTGACG TTTACCCGGC CAACG
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCATCTTCT CGAGTCTTTC AGGCGCGCCC TACTGCACTT TGCAAGATTG GGTGC
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGACACAA GCTTTGGACA CCCTCAGGAT ATGGCGGCGG CGGCGGCGGC TCCGGGGGGC
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGG
\hfill64
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCATCTTCT CGAGTCTTTC AGGCGCGCCC GGGGCCCTCT GGCGCCCCTG GCTGG
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGAATTCAA CCATGGCGGC GGCGGCGGCG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGGATCCCT AGGGGGCCTC CAGCACTCC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACTCGAGTA ACCATGGCGG CGGCGGCGGC G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGGATCCAT AGATCTGTAT CCTGG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGGATCCTT AAGATCTGTA TCCTGG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTCGAGGG AAAATGTCTC AGGAGAGG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGATCCTC GGACTCCATC TCTTCTTG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGATCCTC AGGACTCCAT CTCTTCTTG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTCGAGCC ATCATGAGCA GAAGCAAG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCCA CTGCTGCACC TGTGCTA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCTC ACTGCTGCAC CTGTGCTA
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGAATTCC GCCACCATGA GTGCTGAGGG GTACCAGTAC
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCT GTCGCCTCTG CTGTGCATAT AC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: p85-top-C
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAGATCTA TGAGTGCTGA GGGGTACCAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCGGATCC TCATCGCCTC TGCTGTGCAT ATAC
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAATTCGA CCATGTCGTC CATCTTGCCA TTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGTACCCA TGACATGCTT GAGCAACGCA C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGTACCTT ATGACATGCT TGAGCAACGC AC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAATTCGT CAATGGAGCT GGAAAACATC G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCCT GCTGCTTCCG GTGGAGTTCG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCCT AGCTGCTTCC GGTGGAGTTC G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAGATCTAC CATGGCGGGC TGGATCCAGG CC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGTACCCA TGAGAGGGAG CCTCTGGCAG A
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGTACCTC ATGAGAGGGA GCCTCTGGCA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAATTCAA CCATGGACAA TATGTCTATT ACG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCCA GTCTAAAGGT TGTGGGTCTG C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCTC AGTCTAAAGG TTGTGGGTCT GC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTCGAGGC ACCATGAGCG ACGTGGC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGATCCGA GGCCGTGCTG CTGGCCG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1896 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1891
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 631 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1818 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1815
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 605 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2529 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2526
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 842 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1902 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1899
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 633 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1824 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1821
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 607 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEO ID NO: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2907 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2904
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 968 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2160 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2157
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 719 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2421 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2418
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 806 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3120 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...3117
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1039 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1875 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1872
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 624 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1815 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1811
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 604 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2511 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2508
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 836 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1893 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1890
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 630 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1821 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1818
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 606 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2913 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2910
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 970 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1788 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1785
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 595 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2181 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2178
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 726 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2751 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2748
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 916 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2157 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2154
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 718 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2397 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2394
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 796 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3138 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...3135
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1045 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGATCCTC AGGCCGTGCT GCTGGCCG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 81:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTCGAGGG AGCATGGGCA CCTTGCG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 82:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGATCCGA GAAGTCTATA TCCCATC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGATCCTT AGAAGTCTAT ATCCCATC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTCGAGCC ATGAACGCCC CCGAGCGG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 85:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAATTCTC GTCTGATTTC TGGCAGGAGG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 86:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAATTCTT TACGTCTGAT TTCTGGCAGG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 87:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTCGAGCC ATGGACGAAC TGTTCCCCCT CATC
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 88:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCAA GGAGCTGATC TGACTCAGCA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 89:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCTT AGGAGCTGAT CTGACTCAGC AG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 90:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 90:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCCTAAGC TTATCATGGA CCATTATGAT TC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 91:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 91:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCCTGGAT CCCTGCGCAG GATGATGGTC CAG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 92:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATGGAAGC TTCAATGGCT GCCATCCGGA AGAAACTGGT GATTG
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 93:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 93:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATGGGGAT CCTCACAAGA CAAGGCAACC AGATTTTTTC TTCCC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 94:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAAGCTTC CATGAGCGAG ACGGTCATC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 95:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 95:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGGATCCT CAGGGAGAAC CCCGCTTC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 96:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAATTCGA CCATGGAGCG GCCCCCGGGG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 97:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 97:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGTACCCA TTCTGTTAAC CAACTCC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 98:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 98:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGTACCTC ATTCTGTTAA CCAACTCC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 99:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 99:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTCGAGAG ATGCTGTCCC GTGGGTGG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 100:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 100:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAATTCGC TTCCTCTTGA GGGAACC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 101:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 101:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAATTCAC TTCCTCTTGA GGGAACC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 102:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 102:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTCGAGCC ATGGAGAACT TCCAAAAGG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 103:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 103:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCCA GAGTCGAAGA TGGGGTAC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 104:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 104:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCTC AGAGTCGAAG ATGGGGTAC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 105:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 105:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAATTCGG CGATGCCAGA CCCCGCGGCG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 106:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 106:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCCA GGCACAGGCA GCCTCAGCCT TC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 107:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 107:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCTC AGGCACAGGC AGCCTCAGCC TTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 108:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2616 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2613
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 108:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 109:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 871 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 109:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 110:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2598 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTER(STICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2595
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 110:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 111:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 865 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 111:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 112:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1635 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1632
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 112:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 113:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 544 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 113:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 114:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1635 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1632
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 114:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 115:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 544 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 115:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 116:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2532 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2529
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 116:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 117:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 843 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 117:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 118:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2562 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2559
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 118:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 119:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 853 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 119:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 120:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2994 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2991
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 120:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 121:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 997 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 121:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 122:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTER(STICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2991 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2988
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 122:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 123:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 996 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 123:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 124:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1908 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1905
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 124:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 125:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 635 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 125:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 126:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1329 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1326
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 126:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 127:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 442 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 127:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 128:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1140 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...1137
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 128:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 129:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 379 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 129:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 130:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3516 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...3513
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 130:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 131:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1171 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 131:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 132:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3546 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...3543
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 132:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 133:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1181 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 133:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 134:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2802 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2799
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 134:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 135:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 933 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 135:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 136:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2799 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2795
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 136:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 137:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 932 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 137:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 138:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2184 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2181
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 138:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 139:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 727 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 139:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 140:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2394 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2391
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 140:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 141:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 797 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 141:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 142:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2394 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...2391
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 142:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 143:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 797 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 143:
Claims (22)
1. Un método para la identificación de un
medicamento o una sustancia tóxica que influye directa o
indirectamente sobre la redistribución de por lo menos uno de los
componentes de una ruta intracelular, comprendiendo el método:
extraer una información cuantitativa relacionada
con la influencia de las sustancias sobre la redistribución,
mediante registro de la variación,
- causada por la puesta en contacto o la incubación de una célula viva de mamífero, mecánicamente intacta, o de células vivas de mamífero, mecánica- mente intactas, con la sustancia,
en una luz distribuida en el
espacio, emitida a partir de un
luminóforo,
- que está presente en la célula o en las células y que es capaz de ser redistribuido de una manera que está relacionada con el grado de la influencia, y/o de ser asociado con un componente que es capaz de ser distribuido de una manera que está relacionada con el grado de la influencia,
- comprendiendo el luminóforo por lo menos una-porción de una GFP en la que el aminoácido en posición 1 secuencia arriba desde el cromóforo en la GFP ha sido mutado para proporcionar un aumento de la intensidad de fluorescencia cuando la proteína fluorescente es expresada en células a una temperatura de 32ºC a 39ºC,
- la célula o las células se incuba(n) a una temperatura de 32ºC a 39ºC o superior durante el período de tiempo en el que se observa la influencia, y
- tratamiento de la variación registrada en la luz distribuida en el espacio para reducirla a uno o más números que es(son) representativo(s) del grado de redistribución de acuerdo con una calibración basada en respuestas a la redistribución, registradas de la misma manera, a grados conocidos de una influencia específica relevante,
en que el resultado del tratamiento
es indicativo de la actividad biológica de la
sustancia.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el luminóforo es un luminóforo que es capaz de ser
redistribuido de una manera que está relacionada con el grado de
la influencia, siendo el luminóforo un polipéptido híbrido que
comprende una fusión de por lo menos una porción de cada uno de dos
polipéptidos, uno de los cuales comprende una GFP modificada de
manera tal que exhibe una fluorescencia aumentada cuando es
expresada en células a una temperatura de 32ºC a 39ºC y el otro de
los cuales comprende una proteína que de acuerdo con su estado,
como activado o no activado, cambia de localización dentro de la
célula.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que la mutación del aminoácido en posición 1 corriente arriba
del cromóforo en la GFP es F64L.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que la GFP modificada es una variante de GFP seleccionada
entre F64L-GFP,
F64L-Y66H-GFP y
F64L-S65T-GFP.
5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 2-4, en que el otro de los
polipéptidos se selecciona entre el grupo que consta de proteínas
que toman parte en una ruta de señalización intracelular, enzimas
implicadas en los procesos intracelulares de fosforilación y
desfosforilación, cinasas, cinasas y fosforilasas de proteínas y
proteínas que constituyen el citoesqueleto.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5,
en que la otra de la parte del polipéptido híbrido es una cinasa de
proteínas, una fosfatasa de proteínas, un factor de transcripción,
una proteína o una parte de ella, que está asociada con la red del
citoesqueleto, una cinasa de proteínas, serina/treonina, una cinasa
de proteína, tirosina, una cinasa de proteínas, serina/treonina,
dependiente de fosfolípidos, una cinasa de proteínas dependiente
de cAMP, una cinasa de proteínas dependiente de cGMP, una cinasa de
proteínas, serina/treonina, dependiente de calmodulina, una cinasa
de proteínas, serina/treonina, activada por un mitógeno, o una
cinasa de proteínas, serina/treonina, dependiente de ciclina.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la célula o las células en
que está presente el luminóforo son transfectantes estables.
8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el luminóforo es capaz de
ser redistribuido de una manera que es fisiológicamente relevante
para el grado de la influencia.
9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el registro se hace en un
único momento después de la aplicación de la influencia.
\newpage
10. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el registro se hace en
dos momentos, estando un momento antes de la aplicación de la
influencia y el otro momento después de esta aplicación de la
influencia.
11. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-8, en el que el registro se
realiza en una serie de momentos, realizándose la aplicación de la
influencia en un momento posterior al primer momento en la serie de
registros.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la variación o el
resultado con respecto a la luz distribuida en el espacio que ha
sido emitida por el luminóforo se detecta por un cambio en la
transferencia de energía de resonancia entre el luminóforo y otra
entidad luminiscente capaz de suministrar energía al luminóforo,
cada uno de los cuales se ha seleccionado o tratado por ingeniería
genética para resultar parte de, unido a, o asociado con,
componentes particulares de la ruta intracelular, y uno de los
cuales experimenta redistribución como respuesta a la influencia,
cambiando con ello la cantidad de transferencia de energía de
resonancia, siendo medido el cambio en la transferencia de energía
de resonancia como un cambio en la intensidad de emisión
procedente del luminóforo.
13. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la propiedad de la luz
que se está registrando es la intensidad, el tiempo de vida de la
fluorescencia, la polarización, el desplazamiento de longitud de
onda, u otra propiedad que es modulada como un resultado de la
respuesta celular subyacente.
14. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el registro de la
distribución en el espacio de la propiedad registrable de la luz
se realiza usando un dispositivo de transferencia de cargas tal
como un conjunto de CCD o un dispositivo de tubos de vacío tal como
un tubo vidicón.
15. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el registro en la
distribución en el espacio de la propiedad registrable de luz se
realiza mediante microscopia de fluorescencia.
16. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes en el que el registro de la
variación o del resultado con respecto a la luz emitida desde el
luminóforo se realiza registrando la luz distribuida en el espacio
como una o más imágenes digitales, y el tratamiento de la variación
registrada para reducirlo a uno o más números representativos del
grado de la redistribución comprende un proceso de tratamiento de
imágenes digitales o una combinación de procesos de tratamiento de
imágenes digitales.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16
en el que la célula o células vivas mecánicamente intactas
es(son) incubadas durante el período de tiempo a lo largo
del cual se observa la influencia, a una temperatura de 35ºC a
38ºC.
18. Un método de acuerdo con la reivindicación
17, en el que la célula viva, mecánicamente intacta, o las células
vivas, mecánicamente intactas, es(son) incubadas durante el
período de tiempo a lo largo del cual se observa la influencia, a
una temperatura de aproximadamente 37ºC.
19. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-18, en el que el luminóforo
es una fusión
ERK1-F64L-S65T-GFP.
20. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-18, en el que el luminóforo
es una fusión
PKAc-F64L-S65T-GFP.
21. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-18, en el que el luminóforo
es una fusión EGFP-ERK1.
22. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-18, en el que el luminóforo
es un luminóforo seleccionado entre el grupo que consta de
luminóforos codificados por SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50,
52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 108, 110,
112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136,
138, 140 y 142, o es una variante de ellos, que es equivalente
biológicamente a ellos, como se definen aquí.
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