KR102234421B1 - eGRASP를 이용한 세포 사이의 인접 표지 기술 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 사이의 인접 표지 기술에 대한 것이다. 본 발명의 일예에 의하면 세포들 사이의 인접을 세포 종류별로 구분할 수 있으며, 특히 신경세포의 시냅스들을 종류별로 구분할 수 있다.

Description

eGRASP를 이용한 세포 사이의 인접 표지 기술{Labeling of interaction between cells using eGRASP}
본 발명은 강화된 이중-GRASP (Green fluorescent protein Reconstitution Across Synaptic Partners; dual-eGRASP) 시스템 이용한 세포 사이의 인접 표지 방법 및 이를 이용한 기억과 관련된 신경계 네트워크 탐지방법에 관련한 것이다.
시냅스는 두 신경세포, 즉 신호를 주는 시냅스 전 신경세포와 신호를 받는 시냅스 후 신경세포 사이의 신호를 전달하는 연결지점이며, 신경계의 기능적 최소단위로 알려져 있다. 감각, 운동 등 신경계의 기본적인 기능에서부터 기억, 인지 등 고등한 능력까지 모두 시냅스를 기반으로 한다. 따라서 신경계를 시냅스단위에서 연구하는 것이 중요하다.
시냅스 단위에서 연구한다는 것은 크게 두 가지 의미로 나눌 수 있다. 첫 번째로, 신경계는 신경세포들의 네트워크이기 때문에, 신경세포 간의 연결을 시냅스단위까지 관찰하는 시도가 있다. 현재까지의 기술로는 한 부위에서 어느 부위로 축삭다발을 보내는지는 알 수 있지만, 정확히 어느 신경세포와 시냅스를 형성하는지 알 수 없었다. 또한, 어떠한 구조를 이루며 시냅스를 형성하는지를 알 수 없었다. 그러나, 신경계의 구조와 기능은 밀접하게 연관되어 있기 때문에, 신경계의 기능을 연구하기 위해서는, 신경세포의 연결구조를 시냅스단위에서 관찰하는 것이 중요하다.
두 번째로, 단일 시냅스 단위의 변화를 관찰하는 시도가 있다. 시냅스, 특히 시냅스 후 부위인 신경가시(spine)는 자극에 의해 그 구조와 기능이 변하는 가소성을 가지고 있다. 신경계는 가소성에 의해 자극을 받으면 신경가시의 크기와 기능이 변화하며, 이는 이후의 반응에 영향을 미친다. 따라서 특정한 자극이 시냅스의 구조와 기능을 어떻게 변화시키는지, 및 분자적 메커니즘을 연구하는 것은 신경계의 구조 및 기능을 연구하는데 있어 기초가 된다.
이제까지의 다수의 연구들을 통해, 특정 자극이 신경가시의 크기와 부피의 변화에 미치는 영향은 관찰할 수 있게 되었지만, 아직 하나의 신경세포의 신경가시를 두 종류 이상으로 분류하여 직접 비교하는 방법에 관해서는 알려진 바가 없다. 이는 신경가시를 시냅스 전 신경세포(presynaptic neuron)의 종류에 따라 분류할 수 없었기 때문이다. 이에 본 발명자들은 시냅스 전 신경세포의 종류를 구분해 시냅스를 표지 할 수 있는 새로운 기술인 본 발명을 개발하였다.
형광을 나타내는 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP)을 두 부분(S1-10, S11)으로 나누면 각각은 형광을 내지 않지만, 근접하여 재구성 (reconstruction) 되면 형광을 나타내게 되는데, 본 발명의 일예는 이러한 split-fluorescent protein 기술을 신경세포에 적용할 수 있다. 즉, 시냅스 전 신경세포 (presynaptic neuron)에 S11을, 시냅스 후 신경세포 (postsynaptic neuron)에 S1-10을 발현시키면, 두 신경세포 사이의 시냅스 (synapse)에서는 S1-10과 S11의 단백질 조각들이 결합하여 형광을 나타내고, 이를 통해 시냅스 후 뉴런 (postsynaptic neuron)의 수많은 시냅스 중에서 특정 presynaptic neuron과 결합하는 시냅스만을 특이적으로 표시하고 선별할 수 있다. 그러나, 이 경우 형광의 세기가 약해서 널리 적용하기 어렵고 현미경으로 관찰하기 어려우며, 녹색 파장대의 형광만 표시할 수 있었기 때문에 서로 다른 2 이상의 시냅스 전 신경세포(presynaptic neuron)에서 신호를 받는 시냅스를 구분할 수 없는 문제가 있다.
형광세기에 있어, 일반적인 형광단백질에 비해 S1-10과 S11의 단백질 조각들이 결합해 재구성(reconstruction)된 형광 단백질의 형광세기가 약한 문제가 있었다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 재구성된 형광 단백질의 형광세기를 강화하기 위해 몇 가지 돌연변이를 도입하였으며, 그 결과 본 발명의 일예에 따른 재구성된 형광 단백질의 형광 세기가 월등히 강해졌다. 또한, 추가적인 돌연변이를 도입하여, 서로 간섭 없이 구분이 가능한 split-cyan fluorescent protein과 split-yellow fluorescent protein을 제조하였다. 본 발명의 일예에 의하면, 이를 이용하여 하나의 신경세포에 존재하는 수많은 시냅스들을 presynaptic neuronal population의 종류에 따라서 각각 표시하는 것이 가능하였다.
즉, 재구성된 형광단백질의 세기가 세졌다는 점, 그리고 서로 구분 가능한 파장의 빛에 의해 excitation되는 system을 만들었다는 점이 큰 발전이라 할 수 있다. 이는 다양한 포유류의 뇌에 적용 가능하게 되었다. 또한, 형광의 색을 구분할 수 있게 되어 다양한 실험적 접근을 가능하게 하였다. 기존의 기술로는 한 가지 색만 가능했지만, 본 발명을 통해 두 가지 이상의 색 표지가 가능해졌기 때문에, 실험군과 대조군을 직접 비교할 수 있다는 점, 혹은 서로 다른 두 뇌 부위에서 어떠한 질서를 가지고 시냅스를 형성하고 있는지 비교하는 실험 등, 기존의 기술로는 하지 못했던 관찰을 할 수 있게 되었다.
기억은 뇌에 분산되어있는 엔그램 세포(engram cells)에 존재한다. 그러나 시냅스 가소성이 기억을 암호화한다는 사실을 일반적으로 받아들여지고 있지만, 엔그램세포 내의 위치 특이적 기질은 이론에 머물러 있는 상태이다. 본 발명자들은 기억 저장의 역할을 하는 특정 신경 부위를 식별하기 위해 엔그램 세포 사이의 시냅스를 검사하는 이중 eGRASP 기술을 개발했다. 본 발명의 일예를 동물모델에 적용해본 결과, CA3 엔그램 세포로부터 신호를 받는 CA1 엔그램 세포의 신경가시의 개수와 크기가 증가되었고, 공간적 공포(contextual fear) 조건에서, 기억 강도(memory strength)를 저장하는 기억세포 사이의 연결이 향상되었다. 이미 강화된 CA3 엔그램에서 CA1 엔그램으로의 연결은 장기 강화작용(long-term potentiation) 을 강력하게 막았다. 이러한 결과는 직접적으로 연결된 두 뇌 영역에 걸친 엔그램세포 간의 향상된 구조적, 기능적 연결성이 기억 형성에 관한 시냅스 상관관계를 형성함을 나타낸다.
본 발명의 일예는, 제 1 표지물질 및 제 2 표지물질을, 각각 제 1 세포 및 제 2 세포에 도입하는 단계; 및 신호를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 상기 신호를 발생시키는 것인, 세포 간 접촉 확인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는, 활성 의존성을 가지는 프로모터로 개시되며 제 1 표지물질을 암호화는 유전자를 시냅스 전 신경세포에 도입하고, 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자를 시냅스 후 신경세포에 도입하는 단계; 및 상기 제 1 표지물질과 제 2 표지물질의 결합에 의한 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 기억 저장 시냅스의 확인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는, 제 1 표지물질을 암호화하는 유전자가 도입된 제 1 세포, 및 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자가 도입된 제 2 세포를 포함하며, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 신호를 발생시키는 것인, 동물에 관한 것이다. 상기 동물은 인위적으로 제작된 (non-naturally occurring) 형질전환 동물일 수 있으며, 인간을 제외한 동물, 예를 들어 인간을 제외한 포유류일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예는, 제 1 표지물질을 암호화는 유전자를 동물의 제 1 세포에 도입하고, 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자를 동물의 제 2 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 신호를 발생시키는 것인, 동물 모델의 제조방법에 관한 것이다. 상기 동물은 인간을 제외한 동물, 예를 들어 인간을 제외한 포유류일 수 있다.
상기 제1 및 제2 표지물질은 통상적으로 사용되는 형광물질들 (소분자 화합물 및 단백질) 중에서 각각 독립적으로 선택된 형광물질로서, 서로 결합하여 형광을 발생시키는 것일 수 있고, 상기 신호는 형광신호일 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 일예는, 제 1 표지물질 및 제 2 표지물질을, 각각 제 1 세포 및 제 2 세포에 도입하는 단계; 및 신호를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 상기 신호를 발생시키는 것인, 세포 간 접촉 확인 방법에 관한 것이다.
상기 세포 간 접촉 확인 방법은, 상기 신호를 검출하는 단계 이후에, 신호가 검출될 경우 상기 제 1 세포 및 상기 제 2 세포가 접촉하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "세포 간 접촉"은, 세포와 세포 간의 접촉 또는 인접을 의미하나, 세포 간 물리적인 접촉이 수반되지 않더라도 근접하여 일정 거리 이하로 인접하여 위치할 경우, 세포 간 접촉이 발생하였다고 표현 가능함은 통상의 기술자가 명확하게 이해할 것이다. 예를 들어, 상기 제 1 세포 및 상기 제 2 세포가 100nm 이하, 90nm 이하, 80nm 이하, 70nm 이하, 60nm 이하, 50nm 이하, 40nm 이하, 30nm이하, 20nm이하, 10nm이하, 또는 5nm 이하의 간격을 가지고 위치할 경우 (하한값은 0nm 이상 또는 0nm 초과임), 상기 제 1 세포 및 상기 제 2 세포 간 접촉이 확인될 수 있다. 일예로, 상기 제 1 세포 및 상기 제 2 세포의 간격이 40nm 이하일 경우, 상기 제 1 세포 및 상기 제 2 세포의 접촉이 확인될 수 있다.
상기 "제 1 세포" 또는 상기 "제 2 세포"는, 세포 간 접촉 또는 인접을 확인하고자 하는 확인 대상 세포를 의미할 수 있다. 본 발명의 일예에 의하면, 상기 제 1 세포 또는 상기 제 2 세포는 원핵세포 및 진핵세포에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 구체적으로, 동물세포 (예를 들어, 포유류 세포 등), 동물 유래 세포주 (예를 들어, HEK293T), 식물세포, 식물 유래 세포주, 미생물세포 (예를 들어, 효모, 진균류 (곰팡이), 세균류 (대장균 등) 등), 동물에서 유래한 배양세포, 식물에서 유래한 배양세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 포유류 세포는 인간 세포, 인간을 제외한 포유동물 세포 (예를 들어, 마우스 세포, 래트 세포 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 세포는 생체 또는 인체(인간 세포인 경우)로부터 분리된 세포일 수 있다. 또한, 본 발명의 일예에 의하면, 상기 제 1 세포 또는 상기 제 2 세포는 서로 같거나 다를 수 있고, 각각 독립적으로 신경세포, 성상교세포, 미세아교세포, 희소돌기아교세포, 면역세포, T세포, 및 B세포로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제 1 세포 및 상기 제 2 세포는, 본 발명의 일예에 따른 dual-eGRASP 시스템에서 각각 pre-GRASP construct 및 post-GRASP construct에 해당할 수 있다.
상기 "제 1 표지물질"은 상기 제 1 세포에 도입되며, 상기 제 2 표지물질과 인접 또는 결합할 경우 신호를 발생시킬 수 있다. 본 발명의 일예에 의하면, 상기 제 1 표지물질은 통상적으로 사용되는 형광물질 (소분자 화합물 및 단백질) 중에서 선택된 형광물질일 수 있으며, 상기 신호는 형광신호일 수 있다. 일예로, 상기 제 1 표지물질은 상기 제 1 세포에 도입되며, 상기 제 2 표지물질과 인접 또는 결합할 경우 형광신호를 발생시킬 수 있다.
본 발명의 일예에 의하면, 상기 제 1 표지물질은 (1) 형광 단백질의 일부를 포함할 수 있다. 또는, 상기 제 1 표지물질은 (2) 상기 형광 단백질의 일부를 암호화는 유전자를 포함할 수 있다. 또는, 상기 제 1 표지물질은 (3) 상기 형광 단백질의 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 일예로, 상기 제 1 표지물질은 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터에 의해 상기 제 1 세포에 도입되어 발현될 수 있다.
상기 "제 2 표지물질"은 상기 제 2 세포에 도입되며, 상기 제 1 표지물질과 인접 또는 결합할 경우 신호를 발생시킬 수 있다. 본 발명의 일예에 의하면, 상기 제 2 표지물질은 통상적으로 사용되는 형광물질 (소분자 화합물 및 단백질) 중에서 선택된 형광물질일 수 있으며, 상기 신호는 형광신호일 수 있다. 일예로, 상기 제 2 표지물질은 상기 제 2 세포에 도입되며, 상기 제 1 표지물질과 인접 또는 결합할 경우 형광신호를 발생시킬 수 있다.
본 발명의 일예에 의하면, 상기 제 2 표지물질은 (1) 상기 제 1 표지물질에 포함되는 형광 단백질의 일부를 제외한 나머지 부분, 또는 나머지 부분 중 일부를 포함할 수 있다. 또는, 상기 제 2 표지물질은 (2) 상기 제 1 표지물질에 포함되는 형광 단백질의 일부를 제외한 나머지 부분, 또는 나머지 부분 중 일부를 암호화는 유전자를 포함할 수 있다. 또는, 상기 제 2 표지물질은 (3) 상기 제 1 표지물질에 포함되는 형광 단백질의 일부를 제외한 나머지 부분, 또는 나머지 부분 중 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 일예로, 상기 제 2 표지물질은 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터에 의해 상기 제 1 세포에 도입되어 발현될 수 있다.
상기 제 1 표지물질과 상기 제 2 표지물질이 인접할 경우, 결합하여 신호를 발생시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 제 1 표지물질은 (1) 형광 단백질의 일부, (2) 상기 형광 단백질의 일부를 암호화는 유전자, 또는 (3) 상기 형광 단백질의 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 제 2 표지물질은 (1) 상기 제 1 표지물질에 포함되는 형광 단백질의 일부를 제외한 나머지 부분, 또는 나머지 부분 중 일부, (2) 상기 제 1 표지물질에 포함되는 형광 단백질의 일부를 제외한 나머지 부분, 또는 나머지 부분 중 일부를 암호화는 유전자, 또는 (3) 상기 제 1 표지물질에 포함되는 형광 단백질의 일부를 제외한 나머지 부분, 또는 나머지 부분 중 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하여, 상기 제 1 표지물질과 상기 제 2 표지물질이 인접할 경우, 서로 결합하여 형광신호를 발생시킬 수 있다.
상기 제 1 표지물질 또는 상기 제 2 표지물질이 서로 결합하여 발생시키는 신호는, 형광 단백질에 의한 형광신호일 수 있으며, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP), 돌연변이 녹색 형광 단백질 (mutant GFP), 형광 세기가 강화된 돌연변이 녹색 형광 단백질, 노랑 형광 단백질 (YFP), 및 청록 형광 단백질 (CFP)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 제 1 표지물질은 돌연변이 녹색 형광 단백질의 S1 - S10 가닥, 상기 제 2 표지물질은 돌연변이 녹색 형광 단백질의 S11 가닥을 포함하여, 상기 제 1 표지물질과 상기 제 2 표지물질이 인접할 경우 강한 녹색 형광을 발할 수 있다. 일예로, 상기 제 1 표지물질은 (1) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, (2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 (3) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 일예로, 상기 제 2 표지물질은 (1) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, (2) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 (3) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 서열번호 2는 야생형 녹색 형광 단백질에서 S72A 돌연변이 (일반적인 야생형 GFP의 서열 기준 72번째 아미노산인 세린이 알라닌으로 치환된 돌연변이)를 가지는 돌연변이 녹색 형광 단백질의 S1부터 S10 가닥 (S1 - S10 가닥)의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 표 1의 서열번호 2에서 형광 세기가 강화된 돌연변이 녹색 형광 단백질 특이적인 S72A 돌연변이에 밑줄을 그어 표시하였다. 도 5c는 분리된 GFP의 1-10가닥에 S72A 추가 돌연변이가 발생하면 GRASP 신호가 증가함을 보여준다.
예를 들어, 상기 제 1 표지물질은 청록 형광 단백질의 S1 - S10 가닥, 상기 제 2 표지물질은 청록 형광 단백질의 S11 가닥을 포함하여, 상기 제 1 표지물질과 상기 제 2 표지물질이 인접할 경우 청록 형광을 발할 수 있다. 일예로, 상기 제 1 표지물질은 (1) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, (2) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 (3) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 일예로, 상기 제 2 표지물질은 (1) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, (2) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 (3) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 서열번호 3은 야생형 녹색 형광 단백질에서 S72A 돌연변이와 더불어 T65S 돌연변이 (일반적인 야생형 GFP의 서열 기준 65번째 아미노산인 트레오닌이 세린으로 치환된 돌연변이), Y66W 돌연변이 (일반적인 야생형 GFP의 서열 기준 66번째 아미노산인 타이로신이 트립토판으로 치환된 돌연변이), H148G 돌연변이 (일반적인 야생형 GFP의 서열 기준 148번째 아미노산인 히스티딘이 글리신으로 치환된 돌연변이), 및 T205S 돌연변이 (일반적인 야생형 GFP의 서열 기준 205번째 아미노산인 트레오닌이 세린으로 치환된 돌연변이)를 추가로 가지는 청록 형광 단백질의 S1 - S10 가닥의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 표 1의 서열번호 3에서 청록 형광 단백질 특이적인 T65S 돌연변이, Y66W 돌연변이, H148G 돌연변이, 및 T205S 돌연변이에 밑줄을 그어 표시하였다.
예를 들어, 상기 제 1 표지물질은 노랑 형광 단백질의 S1 - S10 가닥, 상기 제 2 표지물질은 노랑 형광 단백질의 S11 가닥을 포함하여, 상기 제 1 표지물질과 상기 제 2 표지물질이 인접할 경우 노랑 형광을 발할 수 있다. 일예로, 상기 제 1 표지물질은 (1) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, (2) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 (3) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 일예로, 상기 제 2 표지물질은 (1) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, (2) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 (3) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 서열번호 4는 야생형 녹색 형광 단백질에서 S72A 돌연변이와 더불어 T203Y 돌연변이 (일반적인 야생형 GFP의 서열 기준 203번째 아미노산인 트레오닌이 타이로신으로 치환된 돌연변이)를 추가로 가지는 노랑 형광 단백질의 S1 - S10 가닥의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 표 1의 서열번호 4에서 노랑 형광 단백질 특이적인 T203Y 돌연변이에 밑줄을 그어 표시하였다.
구분 서열 서열번호
분비신호펩티드 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAPV 1
초록 1-10 가닥 SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQTVLSKDPNEK 2
청록 1-10 가닥 SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLSWGVQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSGNVYITADKQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEK 3
노랑 1-10 가닥 SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQTVLSKDPNEK 4
공통 11 가닥 RDHMVLHEYVNAAGIT 5
Abl SH3 결합 펩티드 (p30) APTKPPPLPP 6
Abl SH3 결합 펩티드 (p32) SPSYSPPPPP 7
Abl SH3 영역 NDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGWVPSNYITPVNS 8
neurexin 1b EVPSSMTTESTATAMQSEMSTSIMETTTTLATSTARRGKPPTKEPISQTTDDILVASAECPSDDEDIDPCEPSSGGLANPTRVGGREPYPGSAEVIRESSSTTGMVVGIVAAAALCILILLYAMYKYRNRDEGSYHVDESRNYISNSAQSNGAVVKEKQPSSAKSANKNKKNKDKEYYV 9
neuroligin1 LELVPHLHNLNDISQYTSTTTKVPSTDITLRPTRKNSTPVTSAFPTAKQDDPKQQPSPFSVDQRDYSTELSVTIAVGASLLFLNILAFAALYYKKDKRRHDVHRRCSPQRTTTNDLTHAPEEEIMSLQMKHTDLDHECESIHPHEVVLRTACPPDYTLAMRRSPDDIPLMTPNTITMIPNTIPGIQPLHTFNTFTGGQNNTLPHPHPHPHSHS 10
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 상기 제 1 표지물질 또는 상기 제 2 표지물질은 각각 제 1 결합 강화 부위 또는 제 2 결합 강화 부위를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질이 근접하여 위치할 경우, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 신호를 발생시키며, 상기 결합을 돕기 위하여, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 각각 제 1 결합 강화 부위 및 제 2 결합 강화 부위를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제 1 결합 강화 부위 및 상기 제 2 결합 강화 부위는 서로 결합을 형성할 수 있으며, 따라서 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질이 인접하였을 경우, 상기 제 1 결합 강화 부위 및 상기 제 2 결합 강화 부위가 결합하여, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질의 결합을 보조할 수 있다. 예를 들어, 도 5a를 참조하면, 도 5a의 위쪽 도면은 mTagBFP2를 함께 발현하는 post-mGRASP 또는 mCherry 결합 pre-mGRASP 중 어느 하나가 nucleofection을 통해 각각 HEK293T 세포에 형질도입했을 때의 결과를 나타내는데, mCherry 양성 세포와 mTagBFP2 양성 세포의 인터페이스는 희미한 GRASP 신호를 나타냈다. 반면, 도 5a의 아래쪽 도면은 iRFP670와 공동 발현되는 post-eGRASP (SH3-S11-Nlg)이나 mCherry와 공동발현되는 (S1-10)-p40-Nrx 중 하나를 nucleofection을 통해 HEK293T 세포에 각각 형질도입했을 때의 결과를 나타내는데, 펩타이드 p40 (APTYSPPPPP)이 post-eGRASP 구조체에서 SH3 도메인에 결합하여 GRASP 신호를 강화하였으며, mCherry 양성 세포와 iRFP670 양성 세포의 인터페이스는 강력한 GRASP 신호를 나타냈다.
본 발명의 일예에 의하면, 상기 제 1 결합 강화 부위 및 상기 제 2 결합 강화 부위는 각각 Abl SH3 결합 펩티드 또는 Abl SH3 펩티드일 수 있다. 일예로, 상기 Abl SH3 결합 펩티드는 p32, p30, p41, p40, p8, 및 3BP-1로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일예로, 상기 제 1 결합 강화 부위는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드일 수 있다. 일예로, 상기 제 2 결합 강화 부위는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 제 1 결합 강화 부위 및 상기 제 2 결합 강화 부위는, 목적하는 바에 따라 결합력의 세기를 결정할 수 있으며, 예를 들어 제 1 표지물질이 지속적으로 발현되도록 실험을 디자인할 경우, 상기 제 1 표지물질은 보다 약한 결합을 형성하는 결합 강화 부위를 포함할 수 있으며, 예를 들어 제 1 표지물질이 특정 시간대에서부터 발현되도록 실험을 디자인할 경우, 상기 제 1 표지물질은 보다 강한 결합을 형성하는 결합 강화 부위를 포함할 수 있다. 일예로, 상기 제 1 표지물질이 지속적으로 발현될 경우에는 상기 제 1 결합 강화 부위로 p30을 포함하도록 디자인하고, 상기 제 1 표지물질이 특정 시간대에서부터 발현될 경우에는 상기 제 1 결합 강화 부위로 p32를 포함하도록 디자인하여, 신호 또는 형광 세기의 밸런스를 적절하게 조절할 수 있다 (도 5b).
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 각각 분비신호펩티드 및/또는 세포막통과영역을 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호펩티드는 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질이 세포막의 바깥쪽으로 향하도록 하는 기능을 수행한다. 상기 세포막통과영역은 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질이 상기 제 1 세포 및 상기 제 2 세포의 세포막을 통과하여 위치할 수 있게 하는 기능을 수행한다.
예를 들어, 상기 분비신호펩티드는 IgG kappa 신호 펩티드, SAP1 신호 펩티드, BiP1 신호 펩티드, ARS1 신호 펩티드, 및 CAH1 신호 펩티드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일예로, 상기 분비신호펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩티드일 수 있다.
예를 들어, 상기 세포막통과영역은 neuroligin1의 막통과영역, neurexin 1b의 줄기, neurexin 1b의 막통과영역, neurexin 1b의 세포내영역, M2의 막통과영역, Kdpf의 막통과영역, CorA의 막통과영역, 및 PDGFR의 막통과영역으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 일예로, 상기 세포막통과영역은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 펩티드일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 제 1 표지물질은 (1) 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, (2) 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 (3) 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.
상기 제 1 표지물질에 포함되거나 상기 제 1 표지물질에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드는, 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 7의 아미노산 서열, 서열번호 8의 아미노산 서열, 서열번호 9의 아미노산 서열, 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 표지물질에 포함되거나 상기 제 1 표지물질에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드는, (1) 서열번호 2 내지 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상, (2) 서열번호 6 내지 서열번호 8로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상, 및/또는 (3) 서열번호 9 내지 서열번호 10으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일예로, 상기 제 1 표지물질에 포함되거나 상기 제 1 표지물질에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드는, 서열번호 11 내지 서열번호 13으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 가지거나 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 제 2 표지물질은 (1) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, (2) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 (3) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.
상기 제 2 표지물질에 포함되거나 상기 제 2 표지물질에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드는, 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 7의 아미노산 서열, 서열번호 8의 아미노산 서열, 서열번호 9의 아미노산 서열, 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 2 표지물질에 포함되거나 상기 제 2 표지물질에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드는, (1) 서열번호 5, (2) 서열번호 6 내지 서열번호 8로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상, 및/또는 (3) 서열번호 9 내지 서열번호 10으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일예로, 상기 제 2 표지물질에 포함되거나 상기 제 2 표지물질에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드는, 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지거나 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 상기 제 1 표지물질은 서로 다른 2종 이상이며, 상기 2종 이상의 제 1 표지물질은 서로 다른 신호를 발생시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 표지물질은 서로 다른 형광신호를 발생시키는 서로 다른 2종 이상일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 표지물질은 (1) 녹색 형광 단백질 (GFP), 돌연변이 녹색 형광 단백질 (mutant GFP), 형광 세기가 강화된 돌연변이 녹색 형광 단백질, 노랑 형광 단백질 (YFP), 및 청록 형광 단백질 (CFP)로 이루어지는 군에서 선택된 2종 이상의 일부, (2) 상기 선택된 2종 이상의 일부를 암호화하는 유전자, 또는 (3) 상기 선택된 2종 이상의 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 표지물질은 (1) 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택된 2종 이상의 폴리펩티드, (2) 상기 선택된 2종 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 2종 이상의 유전자, 또는 (3) 상기 선택된 2종 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 2종 이상의 벡터를 포함할 수 있다.
상기 제 1 표지물질이 서로 다른 신호를 발생시키는 2종 이상일 경우, 서로 구분 가능한 신호, 예를 들어 서로 구분 가능한 파장의 빛에 의해 수많은 시냅스들 중 시냅스 전 신경세포의 종류에 따라서 구별할 수 있으며, 어떠한 매커니즘으로 시냅스를 형성하는지 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 상기 제 1 세포에 상기 제 1 표지물질이 도입되며, 상기 제 1 표지물질은 활성 의존성을 가지는 프로모터와 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 제 1 표지물질은 형광 단백질의 일부를 암호화하는 유전자, 또는 형광 단백질의 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 표지물질은 형광 단백질의 일부를 암호화하는 유전자가 활성 의존성을 가지는 프로모터에 의해 작동 가능하도록 연결되어, 상기 제 1 세포에 도입될 수 있다. 상기 형광 단백질 또는 상기 형광 단백질의 일부에 대해서는 전술한 바와 같다.
제 1 표지물질이 활성 의존성을 가지는 프로모터와 작동 가능하게 연결될 경우, 제 1 표지물질이 활성화 또는 발현되는 시점을 임의로 조절할 수 있어, 특정 시점에서부터 형성되는 제 1 세포 및 제 2 세포의 인접 또는 접촉을 확인하는 데 활용할 수 있다. 예를 들어, 기억 형성에 관여하는 시냅스 전 세포를 구별하기 위해서, 특정 기억이 형성되는 시점에 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터를 개시하여 상기 제 1 표지물질을 활성화 또는 발현시키면, 상기 제 1 표지물질과 상기 제 2 표지물질의 결합에 의한 신호 또는 형광이 검출되는 시냅스 전 세포가 상기 특정 기억 형성에 관여하는 기억 저장 세포, 즉 엔그램 (engram) 세포인 것으로 구별 또는 판단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 상기 제 1 표지물질 또는 상기 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자가 각각 상기 제 1 세포 또는 상기 제 2 세포에 도입되며, 상기 제 1 세포 또는 상기 제 2 세포에 도입되는 상기 유전자는 프로모터와 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 표지물질 또는 상기 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자는 CaMKII 프로모터, EF1a 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터 등과 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 상기 제 1 표지물질은 서로 다른 2종 이상이며, 상기 서로 다른 2종 이상의 제 1 표지물질을 각각 암호화하는 유전자가 상기 제 1 세포에 도입되며, 상기 제 1 세포에 도입되는 상기 유전자 중 적어도 1종 이상은 활성 의존성을 가지는 프로모터와 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 이 경우, 활성 의존성을 가지지 않는 프로모터와 작동 가능하게 연결된 제 1 표지물질 (이하, '활성 의존성을 가지지 않는 제 1 표지물질')은 계속해서 발현되도록 하고, 활성 의존성을 가지는 프로모터와 작동 가능하게 연결된 제 1 표지물질 (이하, '활성 의존성을 가지는 제 1 표지물질')은 특정 시점에서 발현되도록 조절하여, 특정 시점에서부터 형성되는 제 1 세포 및 제 2 세포의 인접 또는 접촉 확인의 정확도를 더욱 높일 수 있다. 이 때, 활성 의존성을 가지는 제1 표지물질과 활성 의존성을 가지지 않는 제1 표지물질은 서로 다른 종류의 것일 수 있다. 예를 들어, 신경세포의 시냅스들을 시냅스 전 세포의 종류에 따라 구분하여 기억 형성에 관여하는 시냅스를 구별하기 위해서, 상기 활성 의존성을 가지지 않는 제 1 표지물질은 계속해서 발현되고 있는 상태에서, 특정 기억이 형성되는 시점에 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터를 개시하여 활성 의존성을 가지는 제 1 표지물질 (상기 활성 의존성을 가지지 않는 제 1 표지물질과 상이한 표지물질임)을 작동시키면, 상기 활성 의존성을 가지는 제 1 표지물질과 상기 제 2 표지물질의 결합에 의한 형광이 검출되는 시냅스가 상기 특정 기억 형성에 관여하는 기억 저장 시냅스인 것으로 구별 또는 판단할 수 있으며, 상기 활성 의존성을 가지지 않는 제 1 표지물질 (상기 활성 의존성을 가지는 제 1 표지물질과 상이한 표지물질임)과 상기 제 2 표지물질의 결합에 의한 형광만이 검출되는 시냅스는 상기 특정 기억 형성에 관여하지 않는 것으로 구별 또는 판단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 상기 제 2 세포에 상기 제 2 표지물질이 도입되며, 상기 제 2 표지물질은 활성 의존성을 가지는 프로모터와 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 제 2 표지물질은 상기 제 1 표지물질이 포함 또는 발현하는 상기 형광 단백질의 나머지 부분을 암호화하는 유전자, 또는 상기 제 1 표지물질이 포함 또는 발현하는 상기 형광 단백질의 나머지 부분을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 2 표지물질은 상기 제 1 표지물질이 포함 또는 발현하는 상기 형광 단백질의 나머지 부분을 암호화하는 유전자가 활성 의존성을 가지는 프로모터에 의해 작동 가능하도록 연결되어, 상기 제 2 세포에 도입될 수 있다. 상기 형광 단백질 또는 상기 형광 단백질의 일부에 대해서는 전술한 바와 같다.
제 2 표지물질이 활성 의존성을 가지는 프로모터와 작동 가능하게 연결될 경우, Tet-On system을 이용하면 Doxycycline의 복강내 주사를 통해 제 2 표지물질이 활성화 또는 발현되는 시점을 임의로 조절할 수 있어 특정 기억을 저장하는 엔그램 세포를 표지 할 수 있고, 시냅스의 종류 (비-엔그램에서 엔그램(N-E), 엔그램에서 엔그램(N-N), 엔그램에서 비-엔그램(E-N), 및 비-엔그램에서 비-엔그램(N-N) 시냅스)를 구별하는 데 활용할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 2 표지물질은 상기 제 1 표지물질과의 결합에 의해 발생하는 형광과 구별 가능한 형광 단백질 (예를 들어 mScarlet-I, iRFP670 등)과 함께 발현되도록 디자인될 수 있다. 일예로, 상기 제 2 표지물질은 적어도 2 이상의 유전자 부위에서 발현되고, 각각은 서로 구별되는 형광 단백질과 함께 발현될 수 있으며, 상기 제 2 표지물질을 발현하는 유전자 부위들 중 적어도 하나의 부위는 활성 의존성을 가지는 프로모터와 작동 가능하게 연결될 수 있다. 구체적으로, 도 3a를 참조하면, 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터가 도입되는 CA1 부위에서, 제 2 표지물질은 적어도 2 이상의 유전자 부위에서 발현되며, 각각의 제 2 표지물질은 mScarlet-I, 또는 iRFP670 와 함께 발현되도록 디자인되었다. 이 경우, 적어도 하나의 부위 (mScarlet-I과 함께 발현되는 제 2 표지물질)는 활성 의존성을 가지는 프로모터 (일예로 도 3a에서 c-fos)와 작동 가능하게 연결되어, 특정 기억의 형성에 관여하는 시냅스 후 세포를 구별하여 표지할 수 있다. 이 때, 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터와 작동 가능하게 연결되도록 디자인된 형광 신호가 발생할 경우, 해당 시냅스 후 세포를 특정 기억의 형성에 관여하는 엔그램 세포로 구별할 수 있으며, 특히 상기 활성 의존성을 가지는 제 1 표지물질과 결합하여 발생하는 신호가 함께 발생할 경우, 해당 시냅스를 엔그램에서 엔그램(E-E) 시냅스로 구별할 수 있다.
하나의 신경세포에는 수 천개의 시냅스가 존재하는데, 시냅스는 신경계의 기능적 최소단위이기 때문에 시냅스 수준의 연구가 중요하다. 하지만 현재까지는 한 신경세포의 시냅스를 시냅스 전 세포에 따라 구분하는 것이 불가능하였다. 본 발명의 일예에 따른 dual-eGRASP 시스템을 이용하면, 한 신경세포의 시냅스를 시냅스 전 세포의 종류에 따라 구분할 수 있다. 예를 들어, 본 발명을 이용하여 기존에는 불가능하였던 서로 다른 뇌 영역에서 입력을 받는 하나의 신경세포에서 시냅스들을 구분하여 그 기능 및 위치분포 등을 비교분석, 서로 다른 세포 종류로부터 입력을 받는 하나의 신경세포에서 시냅스들을 구분하여 그 기능 및 위치분포 등을 비교분석, 또는 서로 다른 활성을 보이는 세포들로부터 입력을 받는 하나의 신경세포에서 시냅스들을 구분하여 그 기능 및 위치분포 등을 비교분석 하는 것 등이 가능하다. 또한, 상기 제 1 표지물질을 발현시키기 위한 바이러스 주입 수술 편차에 의해서 그 발현의 정도와 세기가 크게 영향 받아 결과 해석에 영향을 줄 수 있는데, 두 가지 이상의 색 (형광)을 이용하면 내부 대조군 (internal control)으로 사용 할 수 있는 효과가 존재한다.
상기 활성 의존성을 가지는 프로모터는 fos 프로모터, Fos-rtTA, Fos-creERT2, Arc 프로모터, 및 기타 Immediate Early Gene 프로모터로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터는 독시사이클린(Doxycycline), 또는 타목시펜(tamoxifen)에 의해 작동되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터는 전사인자 (transcription factor)를 발현하며, 상기 전사인자는 약물 의존적인 프로모터를 작동시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터는 rtTA (reverse tTA)를 발현하며, 상기 약물 의존적인 프로모터는 상기 rtTA에 의해 특정 약물의 존재 하에서 작동하는 것일 수 있다. 상기 약물 의존적인 프로모터는 tetO 프로모터 (독시사이클린에 의존적으로 작동함), 또는 EF1a-DIO-프로모터 (타목시펜에 의존적으로 활성화되는 creERT2에 의해 발현이 유도됨) 일 수 있다. 일예로, 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터는 상기 약물 의존적인 프로모터를 작동시키는 rtTA를 발현하고, 상기 약물 의존적인 프로모터 (예: TRE3G)는 상기 rtTA에 의해 독시사이클린의 존재 하에서 작동되어, 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터는 독시사이클린의 존재 하에서 작동되는 것일 수 있다. 또는, 상기 약물 의존적인 프로모터 (예: EF1a-DIO-프로모터)는 타목시펜(tamoxifen)의 존재 하에서 활성화되는 Cre recombinase (creERT2)에 의해 DIO sequence의 발현이 유도되어, 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터는 타목시펜의 존재 하에서 작동되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 활성 의존성을 가지는 프로모터로 개시되며, 제 1 표지물질을 암호화는 유전자를 시냅스 전 신경세포에 도입하고, 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자를 시냅스 후 신경세포에 도입하는 단계; 및 상기 제 1 표지물질과 제 2 표지물질의 결합에 의한 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 기억 저장 시냅스의 확인 방법에 관한 것이다.
상기 기억 저장 시냅스의 확인 방법은, 상기 도입하는 단계 이후에, 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터를 작동하는 단계; 및 특정 기억을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 기억 저장 시냅스의 확인 방법은, 상기 신호를 검출하는 단계 이후에, 상기 신호가 발생하는 시냅스 전 신경세포를 상기 특정 기억 형성에 관여하는 기억 저장 세포 (Engram Cell)로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 기억 저장 시냅스의 확인 방법은, 활성 의존성을 가지는 프로모터로 개시되며, 제 1 표지물질을 암호화는 유전자를 시냅스 전 신경세포에 도입하고, 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자를 시냅스 후 신경세포에 도입하는 단계; 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터를 작동하는 단계; 특정 기억을 형성하는 단계; 상기 제 1 표지물질과 제 2 표지물질의 결합에 의한 신호를 검출하는 단계; 및 상기 신호가 발생하는 시냅스 전 신경세포를 상기 특정 기억 형성에 관여하는 기억 저장 세포 (Engram Cell)로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제 1 표지물질, 상기 제 2 표지물질, 상기 제 1 세포, 상기 제 2 세포, 상기 신호, 상기 형광 단백질, 상기 형광 단백질의 일부, 또는 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터 등은 전술한 바와 같다.
상기 기억 저장 시냅스의 확인 방법은, 동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류, 래트, 마우스, 기니피그, 햄스터, 영장류, 개, 쥐, 양, 소, 닭, 말, 원숭이, 고릴라, 인간, 인간을 제외한 포유류, 또는 인간을 제외한 영장류에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 형광 단백질의 일부, 상기 형광 단백질의 일부를 암호화하는 유전자, 또는 상기 형광 단백질의 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 제 1 표지물질; 및 상기 형광 단백질의 그 외 부분, 상기 형광 단백질의 그 외 부분을 암호화하는 유전자, 또는 상기 형광 단백질의 그 외 부분을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 제 2 표지물질을 포함하는, 세포 간 인접 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 제 1 표지물질을 암호화하는 유전자가 도입된 제 1 세포, 및 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자가 도입된 제 2 세포를 포함하며, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은, 결합하여 신호를 발생시키는 것인, 동물에 관한 것이다.
상기 동물은 인위적으로 제작된 (non-naturally occurring) 형질전환 동물일 수 있으며, 인간을 제외한 동물, 인간을 제외한 포유류, 인간을 제외한 영장류, 포유류, 영장류, 설치류, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 원숭이, 고릴라, 예를 들어 인간을 제외한 동물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 제 1 표지물질을 암호화는 유전자를 동물의 제 1 세포에 도입하고, 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자를 동물의 제 2 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 신호를 발생시키는 것인, 동물 모델의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 형광세기를 강화시키고 두 가지 이상의 색으로 구분할 수 있는 재조합 형광단백질을 사용해 뇌의 신경 세포 사이의 시냅스를 검사하고, 이에 더 나아가 신경세포에 존재하는 수많은 시냅스들의 시냅스전 뉴런 군의 종류를 구분할 수 있는 eGRASP 기술을 제공한다. 또한, eGRASP 기술을 이용한 기억 형성에 관한 시냅스 상관관계를 분석하는 방법을 제공한다.
도 1a 내지 도 1e는 본 발명의 Dual-eGRASP를 사용해 하나의 뉴런에서 두 시냅스 군을 구별한 실험 결과를 나타낸다. 도 1a는 청록과 황색의 eGRASP의 개략도를 나타낸다. 공통된 post-eGRASP는 하나의 시냅스 후 세포에서 발현되는 반면, 청록 pre-eGRASP와 황색 pre-EGRASP는 두 개의 다른 시냅스전 군에서 발현된다.
도 1b는 HEK293T 세포에서 청록이나 황색 pre-eGRASP 중 어느 하나와 post-eGRASP 및 iRFP670과의 공통발현 사진을 나타낸다.
도 1c는 뉴클레오펙션을 이용하여 별도로 형질도입된 HEK293T 세포의 세 종류의 군을 나타낸다. 하나의 군은 청록 pre-eGRASP과 mCherry를 발현하고, 또다른 군은 황색 pre-eGRASP와 mCherry를 발현하며, 세번째 군은 post-eGRASP와 iRFP670을 발현한다.
도 1d는 청록 pre-eGRASP 과 황색 pre-eGRASP이 LEC와 MEC에서 각각 발현됨을 나타낸다. Post-eGRASP는 DG의 미리스토일화(myristoylated) TagRFP-T(myr_TagRFP-T)와 함께 발현된다.
도 1e는 청록 pre-eGRASP 및 황색 pre-eGRASP가 우측 CA3 및 좌측 CA3에 각각 발현됨을 나타낸다. Post-eGRASP는 CA1에서 myr_TagRFP-T와 함께 발현되었다.
도 2a 내지 도 2e는 CA3 엔그램에서 CA1 엔그램을 향하는 시냅스가 기억 형성 후 더 높은 시냅스 밀도와 더 큰 신경가시 크기를 나타냄을 확인한 실험 결과를 나타낸다. 도 2a의 왼쪽 도면은 주입된 AAV의 개략도를 나타내고, 중간도면은 바이러스 주입 위치를 나타내며, 각 위치에서의 주입은 각 위치에서 주입되는 바이러스의 최종 혼합액으로 이루어졌다. 오른쪽 도면은 실험 방법 개요도를 나타낸다.
도 2b의 왼쪽 도면은 엔그램과 비기억세포 사이에서 발생 가능한 네 가지 시냅스 군의 개략도를 나타낸다. 오른쪽 도면은 네 가지 색으로 인식되는 네 가지 시냅스 군의 분류를 나타낸다. 청록은 N-N, 주황은 E-N, 파랑은 N-E, 빨강은 E-E를 나타낸다. 각 그룹의 색은 도면 2와 3에 적용되었다.
도 2c는 실제 컨포칼 형광 이미지 및 3D 모델링의 대표도를 나타낸다.
도 2d는 수상돌기 길이당 청록/황색 eGRASP 표준화 결과를 나타낸다. 각 시냅스전 구성요소를 발현하는 CA3 세포의 개수 차이에 의한 영향을 제거하기 위해 빨강 수상돌기상에 청록만을 표시하거나(왼쪽) 또는 황색 점만을 표시(오른쪽)한 밀도를 동일 이미지의 근적외선 수상돌기의 청록단일 또는 황색 점에 의해 표준화하였다. 각 데이터 점은 수상돌기를 나타낸다. CA1 비엔그램 수상돌기 n=43, CA1 엔그램 수상돌기 n=45, 3마리의 마우스로부터 9개의 이미지 획득하였다. Mann Whitney two-tailed test, n.s.: not significant, **p=0.0017
도 2e는 개략도와 함께 나타낸 표준화된 신경가시 머리 직경과 신경가시 부피를 나타낸다. 왼쪽은 CA1 비엔그램세포의 수상돌기. 오른쪽은 엔그램세포의 수상돌기를 나타낸다. 황색점이 있는 신경가시의 크기는 동일한 수상돌기에서 청록단일 점을 가진 신경가시의 사이즈로 표준화하였다. 각 데이터 점은 신경가시를 나타낸다. N-N, n = 81; E-N, n = 107; N-E, n = 93; E-E, n = 55, Mann Whitney two-tailed test, n.s.: not significant, **p = 0.0014, ****p < 0.0001. 데이터는 mean ± SEM으로 표현하였다.
도 3a 내지 도 3f는 시냅스 전후 기억세포간의 시냅스 연결도가 기억 강도에 비례함을 확인한 실험 결과를 나타낸다. 도 3a는 주입된 AAV, 바이러스 주입 위치 및 실험 방법의 개략도를 나타낸다.
도 3b는 공간적 공포 조건과 기억 검색의 개략도를 나타낸다.
도 3c는 각 그룹의 공포반응 수준, 공간 n=6, 약한 충격 n= 5, 강한 충격 n= 5, one-way ANOVA 후 Tukey's multiple comparison test한 결과를 나타낸다. F(2,13) = 15.85, *p < 0.05, ***p < 0.001.
도 3d는 기억 강도가 증가하면 E-E 시냅스의 밀도가 더 높아진다는 가설의 결과를 나타내는 개략도이다.
도 3e는 각 연결의 시냅스 밀도를 나타낸다. n = 74, 공간 N-N; n = 67, 공간 N-E; n =79, 약한 충격 N-N; n = 80, 약한 충격 N-E; n = 92, 강한 충격 N-N; n = 91, 강한 충격 N-E; n = 74, 공간 E-N; n = 67, 공간 E-E; n = 79, 약한 충격 E-E; n = 80, 약한 충격 E-N; n = 92, 강한 충격 E-E; n = 91, 강한 충격 E-N. 공간에만 노출된 그룹의 마우스 6마리로부터 15개의 이미지를 얻었다. 약한 충격을 받은 그룹의 마우스 5마리에서 16개의 이미지, 강한 충격을 받은 그룹의 마우스 5마리로부터 19개의 이미지를 얻었다. Mann Whitney two-tailed test, n.s.: not significant, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.
도 3f는 각 연결에서의 신경가시 머리 직경을 나타낸다. n = 107, 공간 N-N; n = 64, 공간 E-N; n = 72, 약한 충격 N-N; n = 34, 약한 충격 E-N; n = 112, 강한 충격 N-N; n = 46, 강한 충격 E-N; n = 103, 공간 N-E; n = 77, 공간 E-E; n = 85, 약한 충격 N-E; n = 84, 약한 충격 E-E; n = 57, 강한 충격 N-E; n = 110, 강한 충격 E-E, 공간에만 노출된 그룹은 마우스 6마리, 약한 충격에 노출된 그룹은 마우스 5마리, 강한 충격에 노출된 그룹은 마우스 5마리를 사용하였다. Mann Whitney two-tailed test, n.s.: not significant, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 결과값은 mean ± SEM으로 표현하였다.
도 4a는 시냅스 전후 메커니즘을 통한 CA3 엔그램과 CA1 엔그램 사이의 향상된 시냅스 전달을 나타낸다. 도 4a의 왼쪽도면은 주입된 AAV의 개략도를 나타내며, 오른쪽 도면은 바이러스 주입 위치와 실험 방법을 나타낸다.
도 4b의 왼쪽도면은 전체 세포 기록 실험 도면이며, 오른쪽 도면은 네가지 색으로 표지된 네 종류 시냅스 군의 분류를 나타낸다. 청록, T-N; 주황, E-N; 파랑, T-E; 빨강, E-E. 각 군의 색은 도 4에 적용하였다.
도 4c는 PPR 기록 추적 결과를 나타낸다.
도 4d는 PPR 기록 결과를 나타낸다. T-N, n = 11; T-E, n = 10; E-N, n = 11; E-E, n = 12.
도 4e는 표시된 자극간 간격에서의 평균 PPR 결과를 나타낸다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, one-way ANOVA 후 Tukey's multiple comparison test 수행; (25 ms) F(3,40) = 8.259, *p = 0.0276; (50 ms) F(3,40) = 7.989, ***p = 0.0003; (75 ms) F(3,40) = 7.517, ***p = 0.0004.
도 4f는 Sr2+ 광으로 유도된 mEPSCs의 추적 결과를 나타낸다. 화살표는 비연속적 방출 현상을 가리킨다.
도 4g는 Sr2+ 광으로 유도된 mEPSCs의 평균 진폭을 나타낸다. T-N, n = 15; T-E, n = 18; E-N, n = 12; E-E, n = 13; **p < 0.01, one-way ANOVA 후 Tukey's multiple comparison test 수행, F(3,54) = 8.540, ***p < 0.0001.
도 4h는 기준선 기록 5분 후 주어진 자극에 대한 LTP 페어링 결과를 나타낸다. T-N, n = 14; T-E, n = 10; E-N, n = 11; E-E, n = 9.
도 4i는Average EPSC amplitude of the last 5 min of recording. *p < 0.05, one-way ANOVA 후 Tukey's multiple comparison test 수행 결과를 나타낸다. F(3,40) = 3.683, *p = 0.0197. 결과값은 mean ± SEM으로 표현하였다.
도 5는 GRASP 신호의 향상 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸다. 도 5a의 위쪽 도면은 mTagBFP2를 함께 발현하는 post-mGRASP 또는 mCherry 결합 pre-mGRASP 중 어느 하나가 nucleofection을 통해 각각 HEK293T 세포에 형질도입했을 때의 결과이다. mCherry 양성 세포와 mTagBFP2 양성 세포의 인터페이스는 더 강한 방출에서만 탐지할 수 있는, 오로지 희미한 GRASP 신호만을 나타냈다. 아래쪽 도면은 iRFP670와 공동 발현되는 post-eGRASP (SH3-S11-Nlg)이나 mCherry와 공동발현되는 (S1-10)-p40-Nrx 중 하나를 nucleofection을 통해 HEK293T 세포에 각각 형질도입했을 때의 결과이다. 펩타이드 p40 (APTYSPPPPP)은 post-eGRASP 구조체에서 SH3 도메인에 결합하여 GRASP 신호를 강화한다. mCherry 양성 세포와 iRFP670 양성 세포의 인터페이스는 강력한 GRASP 신호를 보인다.
도 5b는 SH3 결합 펩티드를 결합 강도가 낮은 것으로 바꾸었을 때 mGRASP에 비해 현저한 GRASP 신호를 보이지만, GRASP 신호가 줄어드는 결과를 나타낸다. SH3 도메인과 각 펩티드의 해리상수를 각 펩티드 아래에 표시하였다.
도 5c는 분리된 GFP의 1-10가닥에 S72A 추가 돌연변이가 발생하면 GRASP 신호가 증가함을 보여준다.
도 5d의 위쪽 도면은 pre-mGRASP가 CA3에서 발현되었고 막 표적 TagRFP-T를 갖는 post-mGRASP는 CA1에서 드문드문 발현되었음을 보여준다. 아래쪽 도면은 가장 약한 결합 펩티드(p30)을 가진 pre-eGRASP가 CA3에서 발현되었고, 막 표적 TagRFP-T를 가진 post-eGRASP with는 CA1에서 드물게 발현됨을 보여준다. mGRASP 신호는 본 실험 조건에서 탐지되지 않았고, eGRASP 신호는 가장 약한 결합 펩티드를 가진 경우에도 CA1 수상돌기의 가시에서 선명하게 보였다.
도 6a는 post-eGRASP 및 iRFP670가 HEK293T 세포에서 공동발현된 표시된 돌연변이의 pre-eGRASP 결과를 나타낸다. T65S, Y66W, S72A, H148G, T205S를 가지는 pre-eGRASP가 가장 밝은 청록 형광을 나타낸다.
도 6b는 post-eGRASP 및 iRFP670 가 HEK293T 세포에서 공동발현되었을 때의 표시된 돌연변이의 pre-eGRASP 결과를 나타낸다. S72A, T203Y를 포함하는 pre-eGRASP는 GFP와 YFP 필터 모두에서 밝은 신호를 나타냈지만, CFP 필터에서는 나타내지 않았다. 원래의 pre-eGRASP는 모든 필터를 사용했을 때 신호를 보였으며, GFP 필터에서 가장 밝게나타났다. 이 결과는 T203Y 돌연변이가 CFP 신호로부터 분리 가능한 적색 편이된 형광을 보였다.
도 7a 내지 도 7c는 dual-eGRASP 구성요소들의 발현이 기본 시냅스 전달에 영향을 미치지 않음을 확인한 도면으로, 도 7a는 대표적인 미니어처 EPSC (mEPSC) 기록 추적 결과를 나타낸다. 도 7b 및 도 7c는 각 표시된 대로 CA3과 CA1에서 eGRASP 구성요소를 발현하는 절편 내 CA1 피라미드 뉴런의 mEPSC의 진폭과 주파수를 나타낸다. No eGRASP (CA3과 CA1 모두에 eGRASP 구성요소 없음), n = 12; Post eGRASP (CA1에서 post-eGRASP), n = 10; Pre eGRASP (CA3에서 pre-eGRASP), n = 12; Pre-Post eGRASP (CA3d에서 pre-eGRASP 및 CA1에서 post-eGRASP), n = 11. 진폭의 One-way ANOV, n.s.: not significant, F(3,41) = 1.074, p = 0.3705. 주파수의 One-way ANOVA, n.s.: not significant, F(3,41) = 2.167, p = 0.1065. 결과 값은 mean ± SEM으로 표현하였다.
도 8a 내지 도 8c는 발작으로 Fos-rtTA 시스템 검증 실험결과를 나타낸다. 도 8a는 주입된 AAV의 개략도로, 핵 표적 mEmerald (mEmerald-Nuc)는 Fos 프로모터에 의해 발현되는 rtTA3G에 의해 조절되는 TRE3G 프로모터에 의해 조절되었으며. CaMKIIα에 의해 조절되는 핵 표적 mCherry가 발현 컨트롤로 이용되었다.
도 8b는 실험에 사용된 행위 시간표를 나타낸 도면이다.
도 8c는 발작으로 유도되는 Pentylenetetrazol (PTZ)의 주입이 DG에서 강한 mEmerald-Nuc 신호를 유도함을 나타낸 도면이다.
도 9a 내지 도 9d는 CFC를 이용한 Fos-rtTA시스템 검증 실험결과를 나타낸다. 도 9a는 주입된 AAV의 개략도를 나타낸 도면이다.
도 9b는 실험에 사용된 행위 시간표를 나타낸 도면이다.
도 9c는 활성 의존성 프로모터가 잘 작동하는 것을 보여주는 대표 도면을 나타낸다.
도 9d는 공간적 공포에서 CA3는 mEmerald-Nuc의 현저한 증가를 유도하고 CA1에서 강한 증가 경향을 보임을 나타낸 도면다. n=6, CA3 Homecage; n=5, CA3 Conditioned; n=8, CA1 Homecage; n=5, CA1 Conditioned. Unpaired two-tailed t test, **p < 0.01. 결과 값은 mean ± SEM으로 표현하였다.
도 10a 및 도 10b는 Doxycycline에 의해 조절되는 황색 eGRASP 발현의 검증 실험 결과를 나타낸다. 도 10a 및 도 10b는 doxycycline이 없을 때(도 10a) 또는 doxycycline이 주사되었을 때(도 10b)의 청록과 황색 eGRASP 발현 대표도를 나타낸다. myrTagRFP-T-P2A-post-eGRASP 뿐만 아니라 청록 pre-eGRASP도 CA1과 CA3 뉴런의 무작위 군에서 각 구성요소를 발현하는 DIO/Cre 시스템을 사용하여 지속적으로 발현되었고, 황색 pre-eGRASP는 Fos-rtTA 시스템을 사용하여 CA3에서만 발현되었다.
도 11은 뉴런 군의 중첩 비율을 표로 나타낸 것이다. 도 11의 A에 따르면 iRFP670 양성 수상돌기에서 황색 신호를 포함하는 청록 신호의 비율은 40.25%였다. iRFP670 양성 수상돌기에서 청록 신호를 포함하는 황색 신호의 비율은 78.38%였다. n=43. 마우스 세 마리로부터 43 iRFP670 수상돌기를 얻었다. 도 11의 B에 따르면 mScarlet-I 양성 수상돌기에서 황색 신호를 포함하는 청록 신호의 비율이 50.00%로 나타났다. mScarlet-I 양성 수상돌기에서 청록 신호를 포함하는 황색 신호의 비율은 80.37%였다. n=45, 마우스 3마리에서 45개의 mScarlet-I 수상돌기를 얻었다. 도 11의 C에 따르면 mScarlet-I 또한 발현하는 iRFP670 양성 세포의 비율은 20.93%이다. iRFP670 또한 발현하는 mScarlet-I 양성 세포의 비율은 11.61%이다. n=10, 마우스 세 마리로부터 10개의 CA1세포층 이미지를 얻었다.
도 12는 각 상호작용의 시냅스 밀도에 대한 효과를 나타낸다. 도 12의 A 및 B에 따르면 N-N 시냅스의 시냅스 밀도는 N-E 시냅스와 비슷하게 나타났다. 그러나 E-E 시냅스의 밀도는 E-N 시냅스보다 월등히 높았다. 각 데이터 점은 하나의 수상돌기를 의미한다. CA1 비엔그램 수상돌기의 n = 47이고, CA1 엔그램 수상돌기의 n = 64이며, 마우스 1마리로부터 11 이미지를 얻었다. Mann Whitney two-tailed test, n.s.: not significant, ****p < 0.0001. 청록과 황색 eGRASP의 결합 단백질은 모두 p32이다. 실험 설계는 빨강 형광단백질이 mScarlet-I 대신 TagRFP-T라는 점을 제외하고 도 2와 같았다. 도 12의 C 및 D에 따르면 N-N 시냅스의 시냅스 밀도는 N-E 시냅스와 비슷하다. 그러나 E-E 시냅스의 밀도는 E-N 시냅스보다 월등히 높게 나타났다. 각 데이터 점은 하나의 수상돌기를 의미한다. CA1 비엔그램 수상돌기의 n = 116이고, CA1 엔그램 수상돌기의 n = 48이며, 마우스 1마리로부터 9 이미지를 얻었다. Mann Whitney two-tailed test, n.s.: not significant, ****p < 0.0001. 청록 eGRASP의 결합 펩티드는 p30, 황색은 p32이었다. 실험 설계는 빨강 형광단백질이 mScarlet-I 대신 TagRFP-T라는 점을 제외하고 도 2와 같게 나타났다. 결과값은 mean ± SEM으로 표현했다.
도 13은 기억 강도의 차이에도 CA3와 CA1 엔그램 세포의 수가 비슷하게 나타남을 보여준다. 도 13의 A에 따르면 myr-mScarlet-I을 발현하는 CA1 엔그램 뉴런의 수는 세 그룹 사이에서 일정하게 나타났다 공간, n = 6; 약한 충격, n = 5; 강한 충격, n = 5, one-way ANOVA, n.s.: not significant, F(2,13) = 2.872, p = 0.0927. 도 13의 B는 청록 eGRASP 신호와 중첩되는 황색 eGRASP 신호의 비율로 측정된 CA3 엔그램 뉴런의 수는 세 그룹 사이에서 일정했다. 공간, n = 6; 약한 충격, n = 5; 강한 충격, n = 5. one-way ANOVA, n.s.: not significant, F(2,13) = 0.264, p = 0.7720. 결과 값은 mean ± SEM으로 표현됐다.
도 14는 전후 엔그램 세포 사이의 가시 부피가 기억 강도와 비례함을 보여준다. 도 14의 A는 모든 그룹에서 N-N 가시와 E-N 가시의 부피가 비슷하게 나타남을 보여주며, 도 14의 B는 조건화를 통한 E-E 가시의 가시 부피 증가도는 공간에만 노출된 그룹과 약한 충격을 받은 그룹보다 강한 충격을 받은 그룹에서 월등히 높게 나타났다. 도 14의 A 및 B에서 각 데이터 점은 가시 하나를 나타낸다. n = 107, 공간 N-N; n = 64, 공간 E-N; n = 72, 약한 충격 N-N; n = 34, 약한 충격 E-N; n = 112, 강한 충격 N-N; n = 46, 강한 충격 E-N; n = 103, 공간 N-E; n = 77, 공간 E-E; n = 85, 약한 충격 N-E; n = 84, 약한 충격 E-E; n = 57, 강한 충격 N-E; n = 110, 강한 충격 E-E, 공간에만 노출된 그룹에는 마우스 6마리, 약한 충격에 노출된 그룹에는 마우스 5마리, 강한 충격에 노출된 그룹에는 마우스 5마리가 사용되었다. Mann Whitney two-tailed test, n.s.: not significant, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 결과 값은 mean ± SEM으로 표현하였다.
도 15는 본 발명의 일예에 따른 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 Post-eGRASP의 아미노산 서열을 나타낸 도면으로, (1) IgG kappa 신호 펩티드 (주황색 글자로 표시함), (2) Abl Sh3 영역 (빨간색 글자로 표시함), (3) 돌연변이 GFP의 11가닥 (초록색 글자로 표시함), (4) neuroligin1의 줄기, 막 통과, 세포 내 영역 (파란색 글자로 표시함) 을 구분하여 표시한 도면이다.
도 16은 본 발명의 일예에 따른 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 청록(cyan) pre-eGRASP의 아미노산 서열을 나타낸 도면으로, (1) IgG kappa 신호 펩티드 (주황색 글자로 표시함), (2) S72A가 있는 GFP 1-10 가닥 (초록색 글자로 표시함, 청록 특이적 돌연변이인 T65S, Y66W, H148G, T205S 에 청록색 하이라이트로 강조함), (3) p30 (빨간색 글자로 표시함), (4) neurexin 1b의 줄기, 막 통과 및 세포 내 영역 (파란색 글자로 표시함) 을 구분하여 표시한 도면이다.
도 17은 본 발명의 일예에 따른 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 Pre-eGRASP (p30)의 아미노산 서열을 나타낸 도면으로, (1) IgG kappa 신호 펩티드 (주황색 글자로 표시함), (2) S72A가 있는 GFP의 1-10 가닥 (초록색 글자로 표시함, S72A에 초록색 하이라이트로 강조함), (3) p30 (빨간색 글자로 표시함), (4) neurexin 1b의 줄기 (stalk), 막 통과 (transmembrane) 및 세포 내 도메인 (intracellular domain) (파란색 글자로 표시함)을 구분하여 표시한 도면이다.
도 18은 본 발명의 일예에 따른 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 황색 pre-eGRASP(p30)의 아미노산 서열을 나타낸 도면으로, (1) IgG kappa 신호 펩티드 (주황색 글자로 표시함), (2) S72A가 있는 1-10 가닥 (초록색 글자로 표시함, 황색 특이적 돌연변이인 T203Y 에 노란색 하이라이트로 강조함), (3) p30 (빨간색 글자로 표시함), (4) neurexin 1b의 줄기, 막 통과 및 세포 내 영역 (파란색 글자로 표시함) 을 구분하여 표시한 도면이다.
도 19는 본 발명의 일예에 따른 eGRASP의 모식도를 나타낸 도면이다.
기억의 저장 및 검색은 기억 형성 중 뉴런 활동이 증가된 특정 뉴런 모집단을 필요로 한다. 여러 연구에서 여러 뇌 영역에 걸쳐 이러한 기억 세포를 확인했고, 활성화된 기억 세포가 저장된 기억의 인위적인 검색을 유도할 수 있음을 증명했다. Donald O. Hebb은 엔그램에 기억이 저장되는 방법을 설명하기 위해, 종종 "같이 활성화되면, 서로 연결된다(fire together, wire together)"로 표현되는 가설을 제시했다. 이 가설은 공동 활성화 뉴런 사이의 시냅스 강화가 기억의 신경 영역(neural substrate)을 형성함을 시사한다. 그러나 시냅스 전 부위가 기억세포와 비기억세포 중 어디에서 유래하는지 구별할 수 없기 때문에, 기억 형성이 연결된 뇌 부위에서 기억세포 사이의 시냅스를 향상시키는지를 설명하는 것은 불가능한 실정이다.
본 발명자들은 기억 저장의 역할을 하는 특정 신경 부위를 식별하기 위해 엔그램 세포 사이의 시냅스를 검사하는 이중 eGRASP 기술을 개발했다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> Pre-eGRASP 및 Post-eGRASP의 제작
1-1. Pre-eGRASP 제작
Pre-eGRASP는 (1) IgG kappa 신호 펩티드 kSP, (2) 돌연변이 GFP의 1-10 가닥, (3) Abl SH3 결합 펩티드, 및 (4) neurexin 1b의 줄기 (stalk), 막통과 영역, 및 세포내 영역으로 구성되도록 제작하였다 (도 19 참조).
Pre-eGRASP 에 포함되는 (3) Abl SH3 결합 펩티드는 p30 (APTKPPPLPP) 또는 p32 (SPSYSPPPPP) 서열을 가졌다. p32는 p30보다 post-eGRASP의 Abl SH3 펩티드와 더 강하게 결합한다. 따라서, 본 실시예에서 지속적으로 발현되도록 디자인된 청록 pre-eGRASP는 p30을 사용하여 제작하고, 본 실시예에서 기억이 형성되기 시작하는 특정 시간대에서부터 발현되기 시작하도록 디자인된 황색 pre-eGRASP는 p32를 사용하여 제작하여, 청록색 형광 및 황색 형광의 밸런스를 맞추었다.
Pre-eGRASP는 기존 GRASP 돌연변이에 GFP 1-10 가닥의 S72A (GFP 서열의 아미노산 개수 기준) 돌연변이를 추가하였다 (도 17). 도 17은 Pre-eGRASP (p30)의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, (1) IgG kappa 신호 펩티드 (주황색 글자로 표시함), (2) S72A가 있는 GFP의 1-10 가닥 (초록색 글자로 표시함, S72A에 초록색 하이라이트로 강조함), (3) p30 (빨간색 글자로 표시함), (4) neurexin 1b의 줄기 (stalk), 막 통과 (transmembrane) 및 세포 내 도메인 (intracellular domain) (파란색 글자로 표시함)을 구분하여 표시하였다. p32 버전은 APTKPPPLPP의 서열을 SPSYSPPPPP로 변경한 것이다. Pre-eGRASP (p30)의 아미노산 서열을 표 2에 서열번호 11로 나타내었다 (S72A를 밑줄과 굵은 글씨로 표시하였다).
구분 서열 서열번호
Pre-eGRASP (p30) METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAPVGGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCF A RYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQTVLSKDPNEKTGGSGGSGGSRAPTKPPPLPPGGGSGGGSGTEVPSSMTTESTATAMQSEMSTSIMETTTTLATSTARRGKPPTKEPISQTTDDILVASAECPSDDEDIDPCEPSSGGLANPTRVGGREPYPGSAEVIRESSSTTGMVVGIVAAAALCILILLYAMYKYRNRDEGSYHVDESRNYISNSAQSNGAVVKEKQPSSAKSANKNKKNKDKEYYV 11
청록 pre-eGRASP (p30) METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAPVGGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTL SW GVQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNS G NVYITADKQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQ S VLSKDPNEKTGGSGGSGGSRAPTKPPPLPPGGGSGGGSGTEVPSSMTTESTATAMQSEMSTSIMETTTTLATSTARRGKPPTKEPISQTTDDILVASAECPSDDEDIDPCEPSSGGLANPTRVGGREPYPGSAEVIRESSSTTGMVVGIVAAAALCILILLYAMYKYRNRDEGSYHVDESRNYISNSAQSNGAVVKEKQPSSAKSANKNKKNKDKEYYV 12
황색 pre-eGRASP (p30) METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAPVGGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLS Y QTVLSKDPNEKTGGSGGSGGSRAPTKPPPLPPGGGSGGGSGTEVPSSMTTESTATAMQSEMSTSIMETTTTLATSTARRGKPPTKEPISQTTDDILVASAECPSDDEDIDPCEPSSGGLANPTRVGGREPYPGSAEVIRESSSTTGMVVGIVAAAALCILILLYAMYKYRNRDEGSYHVDESRNYISNSAQSNGAVVKEKQPSSAKSANKNKKNKDKEYYV 13
Post-eGRASP METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAPVGGNDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGWVPSNYITPVNSTGGGSGGGSGRDHMVLHEYVNAAGITGGGSGGGSGTLELVPHLHNLNDISQYTSTTTKVPSTDITLRPTRKNSTPVTSAFPTAKQDDPKQQPSPFSVDQRDYSTELSVTIAVGASLLFLNILAFAALYYKKDKRRHDVHRRCSPQRTTTNDLTHAPEEEIMSLQMKHTDLDHECESIHPHEVVLRTACPPDYTLAMRRSPDDIPLMTPNTITMIPNTIPGIQPLHTFNTFTGGQNNTLPHPHPHPHSHS 14
1-2. 청록(cyan) Pre-eGRASP 제작
청록(cyan) pre-eGRASP는 돌연변이 GFP의 S72A 돌연변이에 더하여 T65S, Y66W, H148G, T205S 돌연변이를 추가하였다 (도 16). 도 16은 청록 pre-eGRASP(p30)의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, (1) IgG kappa 신호 펩티드 (주황색 글자로 표시함), (2) S72A가 있는 GFP 1-10 가닥 (초록색 글자로 표시함, 청록 특이적 돌연변이인 T65S, Y66W, H148G, T205S 에 청록색 하이라이트로 강조함), (3) p30 (빨간색 글자로 표시함), (4) neurexin 1b의 줄기, 막 통과 및 세포 내 영역 (파란색 글자로 표시함) 을 구분하여 표시하였다. p32 버전은 APTKPPPLPP의 서열을 p32인 SPSYSPPPPP로 변경한 것이다. 청록(cyan) pre-eGRASP의 아미노산 서열을 표 2에 서열번호 12로 나타내었다 (T65S, Y66W, H148G, T205S를 밑줄과 굵은 글씨로 표시하였다).
1-3. 황색(yellow) Pre-eGRASP 제작
황색(yellow) pre-eGRASP는 돌연변이 GFP의 S72A 돌연변이에 더하여 T203Y 돌연변이를 가진다 (도 18). 도 18은 황색 pre-eGRASP(p30)의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, (1) IgG kappa 신호 펩티드 (주황색 글자로 표시함), (2) S72A가 있는 1-10 가닥 (초록색 글자로 표시함, 황색 특이적 돌연변이인 T203Y 에 노란색 하이라이트로 강조함), (3) p30 (빨간색 글자로 표시함), (4) neurexin 1b의 줄기, 막 통과 및 세포 내 영역 (파란색 글자로 표시함) 을 구분하여 표시하였다. p32 버전은 APTKPPPLPP의 서열을 SPSYSPPPPP로 변경한 것이다. 황색(yellow) pre-eGRASP의 아미노산 서열을 표 2에 서열번호 13으로 나타내었다 (T203Y를 밑줄과 굵은 글씨로 표시하였다).
1-4. Post-eGRASP 제작
Post-eGRASP는 (1) IgG kappa 신호 펩티드, (2) Abl SH3 펩티드, (3) 돌연변이 GFP의 11 가닥, 그리고 (4) neuroligin1의 줄기, 막통과 도메인과 마지막 4개의 아미노산이 제거된 세포 내 영역 도메인으로 구성되어 있다. 원치 않는 단백질과 수용체의 결합을 피하기 위해서 PDZ 영역 결합 부위를 가지고 있는 마지막 4개의 아미노산을 제거하였다. 도 15는 Post-eGRASP의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, (1) IgG kappa 신호 펩티드 (주황색 글자로 표시함), (2) Abl Sh3 영역 (빨간색 글자로 표시함), (3) 돌연변이 GFP의 11가닥 (초록색 글자로 표시함), (4) neuroligin1의 줄기, 막 통과, 세포 내 영역 (파란색 글자로 표시함) 을 구분하여 표시하였다. Post-eGRASP의 아미노산 서열을 표 2에 서열번호 14로 나타내었다.
<실시예 2> Fos-rtTA 시스템 디자인
특정 시간에서만 활성을 가지도록 조절되는 시간-조절 의존적 유전자 발현 (Temporally-controlled activity dependent transgene expression)은 Fos 프로모터에 의해 발현되는 rtTA3G 발현을 이용하였으며, mRNA의 빠른 분해를 위해 fos mRNA의 AU-rich 가 추가된 rtTA3G를 사용하였다. 도입된 유전자는 TRE3G 프로모터에 의해 발현되어, rtTA3G 발현에 의존적이고, 독시사이클린 (doxycycline) 의존적이었다. 도 3a는 본 실시예에서 디자인한 Fos-rtTA 시스템을 나타낸 도면으로, 황색 pre-eGRASP는 독시사이클린이 주입되었을 때 TRE3G에 의해 발현되기 시작했다. 반면, 청록 pre-eGRASP는 항시 발현되고 있는 상태였다. 따라서, 기억형성 과정 2시간 전쯤 독시사이클린을 복강내 주사로 주입하여, 기억이 형성될 때에는 독시사이클린이 뇌까지 확산되어 프로모터에 영향을 미칠 수 있는 상태가 되도록 하였다. 황색 pre-eGRASP가 발현되는 부분을 관찰하여 기억 형성 과정을 시각화 할 수 있도록 디자인하였다.
<실시예 3> Adeno-Associated Virus (AAV) 생성
AAV serotype 1과 2의 캡시드를 모두 포함하고 있는 AAV serotype 1/2를 사용하였다. AAV1/2는 AAV2 ITRs 사이의 유전자, p5E18, p5E18-RXC1 그리고 pAd-ΔF6가 transfection된 HEK293T 세포에서 추출하였고, 150mm와 100mm 접시에 Opti-MEM (Gibco-BRL/Invitrogen, cat# 31985070) 각각 18ml과 8ml로 배양되었다.
4일 후 AAV1/2를 포함하고 있는 미디어를 3000rpm으로 10분동안 원심 분리하였다. poly-prep chromatography column (Bio-Rad Laboratories, Inc. cat# 731-1550)에 heparin-agarose suspension (Sigma, cat# H6508) 1ml을 넣은 뒤, 상층액을 조심스럽게 부었다. 컬럼은 4ml의 Buffer 4-150 (150 mM NaCl, pH4 10 mM citrate buffer)와 12ml의 Buffer 4-400 (400 mM NaCl, pH4 10 mM citrate buffer)로 불순물을 제거하였다.
바이러스는 4ml의 Buffer 4-1200 (1.2 M NaCl, pH4 10 mM citrate buffer)로 용출되었다. 용출된 용액은 Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit (Millipore, cat# UFC910024)를 이용하여 PBS로 바뀌었으며 농축되었다. 바이러스의 농도는 quantitative RT-PCR을 통해 측정되었다.
<실시예 4> 동물 모델의 제조
모든 실험은 Samtako Bio Korea 로부터 구입한 8 내지 10주 된 수컷 C57BL/6N 마우스를 사용하였다. 마우스는 표준 실험 케이지에서 12시간마다 낮/밤 사이클로 키웠으며, 먹이와 물은 자유롭게 공급되었다. 모든 과정과 동물 관리는 서울대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)의 가이드라인에 따라 수행하였다.
마우스를 ketamine/xylazine로 마취한 후, stereotaxic apparatus (Stoelting Co.) 에 올렸으며, 바이러스를 원하는 부위에 0.1 μl/min의 속도로 33 gauge의 Hamilton syringe를 이용해 주입했다. 이 때 원하는 깊이보다 0.05mm 더 들어가서 2분을 기다린 후 원하는 위치로 돌아가서 주입하였다. 그 상태에서 바이러스를 주입한 후 7분동안 기다린 뒤 천천히 바늘을 제거하였다. 각 부위에 따른 좌표는 다음과 같다: 도 1d에서, lateral entorhinal cortex (AP: -3.4/ ML: -4.4/ DV: -4.1), medial entorhinal cortex (AP: -4.6/ ML: -3.5/ DV -3.5), DG (AP: -1.75/ ML: -1.5/ DV: -2.2, 두개골 표면에서부터); 도 1e에서, CA3 (AP: -1.9/ ML: ±2.35/ DV: -2.45), CA1 (AP: -1.9/ ML: -1.5/ DV: -1.6); 도 2와 3에서, left CA3 (AP: -1.75/ ML: -2.35/ DV: -2.45), CA1 (AP: -1.8/ ML: +1.5/ DV: -1.65, 두개골 표면에서부터); 도 4에서, 이중 주입: AP: -1.75/ ML: -2.35/ DV: -2.45, AP: -2.25/ ML: -2.7/ DV: -2.65), right CA1 (AP:-1.8/ ML:+1.5/ DV: -1.65, 두개골 표면에서부터).
도 2a는 바이러스 주입의 모식도를 나타낸 도면이다. 도 2a에서, 실시예 1-2에서 제작된 청록 pre-eGRASP 및 실시예 1-3에서 제작된 황색 Pre-eGRASP를 동물 모델에 발현시키기 위해, 바이러스 혼합액 0.5ul (Fos-rtTA3G 1.6x106 바이러스 게놈(vg)/ul, TRE3G-Yellow 2.0x108vg/ul, CaMKIIα-iCre 4.0x107 vg/μl, EF1α-DIO-Cyan pre-eGRASP 7.5x108 vg/μl)을 좌측 CA3에 주입하였다. 또한, 실시예 1-4에서 제작한 Post-eGRASP를 동물 모델에 발현시키기 위해, 바이러스 혼합액 0.5ul(Fos-rtTA3G 1.6x106 vg/μl, TRE3G-myr_mScarlet-I-P2A-post-eGRASP 8.0x109 vg/μl, CaMKIIα-iCre 1.0x106 vg/μl, EF1α-DIO-myr_iRFP670-P2A-post-eGRASP 8.0x108 vg/μl)를 우측 CA1에 주입하였다.
도 3a에서, 바이러스 혼합액 0.5ul(Fos-rtTA3G 1.6x106 vg/μl, TRE3G-Yellow pre-eGRASP 2.0x108 vg/μl, CaMKIIα-iCre 3.0x107 vg/μl, 및 EF1α-DIO-Cyan pre-eGRASP 7.5x108 vg/μl)를 좌측 CA3에, 바이러스 혼합액 0.5ul(Fos-rtTA3G 1.6x106 vg/μl, TRE3G-myr_mScarlet-I-P2A-post-eGRASP 8.0x109 vg/μl, CaMKIIα-iCre 1.0x106 vg/μl, EF1α-DIO-myr_iRFP670-P2A-post-eGRASP 8.0x108 vg/μl)를 우측 CA1에 주입하였다.
<실시예 5> 공간적 공포 기억생성
모든 쥐들은 AAV 주입 후 2~4주 뒤에 학습되었다. 각 쥐들은 학습 10일 전에 단일사육 하였으며, 실험자와 마취 통에 7일 연속으로 각 3분간 적응시켰다. 마지막 적응 날로부터 2일 뒤 학습이 이루어졌다. 학습 날에는, 학습 2시간 전에 마취 한 상태에서 250 ㎕의 5 mg/ml Doxycycline 용액을 복강 내 주사로 주입하였다.
발작 유도 또는 공간적 공포 조건화(contextual fear conditioning; CFC) 2시간 전 독시사이클린(Doxycycline) 주사하여 각 사건동안 활성화된 세포를 성공적으로 라벨링하였다 (도 8a 내지 도 8c 및 도 9a 내지 도 9d). 도 8a 내지 도 8c는 발작으로 Fos-rtTA 시스템 검증 실험결과를 나타낸다. 도 8a는 주입된 AAV의 개략도로, 핵 표적 mEmerald (mEmerald-Nuc)는 Fos 프로모터에 의해 발현되는 rtTA3G에 의해 조절되는 TRE3G 프로모터에 의해 조절되었으며. CaMKIIα에 의해 조절되는 핵 표적 mCherry가 발현 컨트롤로 이용되었다. 도 8b는 실험에 사용된 행위 시간표를 나타낸 도면이며, 도 8c는 발작으로 유도되는 Pentylenetetrazol (PTZ)의 주입이 DG에서 강한 mEmerald-Nuc 신호를 유도함을 나타낸 도면이다. 도 9a 내지 도 9d는 CFC를 이용한 Fos-rtTA시스템 검증 실험결과를 나타낸다. 도 9a는 주입된 AAV의 개략도를 나타낸 도면이다. 도 9b는 실험에 사용된 행위 시간표를 나타낸 도면이다. 도 9c는 대표적인 도면을 나타낸다. 도 9d는 공간적 공포에서 CA3는 mEmerald-Nuc의 현저한 증가를 유도하고 CA1에서 강한 증가 경향을 보임을 나타낸 도면이다.
학습 과정은 도 2a에서는 square chamber with a steel grid (Med Associates Inc., St Albans, VT)에서 총 300초간 진행되었으며 0.6mA의 충격이 208 s, 238 s, 268 s에 2초간 주어졌다. 학습이 끝난 후 쥐들은 즉시 원래의 우리로 옮겨졌다. 학습 2일 뒤, 뇌를 추출하였다.
도 3a에서는 약한 충격과 강한 충격을 위해 각각 0.35mA 한 번, 0.75mA 세 번의 전기충격이 268 s과 208 s, 238 s, 268 s에 주어졌다. 공간노출만을 위해서는 같은 공간에 300초간 노출되었다. 2일뒤, 공포반응을 측정한 후 뇌를 추출하였다.
<실시예 6> 시료준비 및 이미징
추출된 뇌는 4% paraformaldehyde (PFA)에 밤새도록 고정한 후 30% sucrose에 담겨서 2일 간 탈수시켰다. 뇌를 얼린 뒤 Cryostat을 이용하여 50㎛의 두께로 절편화하였으며, VECTASHIELD mounting medium (Vector Laboratories) 또는 Easy-index mounting medium (Live Cell Instrument)으로 마운팅시켰다. 뇌 절편의 CA1의 수상돌기 부분은 증류수에 담가 Leica SP8 또는 Zeiss LSM700 confocal microscope의 63배 렌즈를 이용하여 이미징화를 수행했다. 2차/3차 수상돌기는 Z-stack으로 이미징화 하였다.
<실시예 7> 이미지 분석
3D 모델링을 통한 분석을 위하여 Imaris (Bitplane, Zurich, Switzerland) 프로그램을 사용하였다. myr_mScarlet-I와 myr_iRFP670를 발현하고 있는 수상돌기들 중 추적이 가능한 것들을 골라서 필라멘트라고 지정하였다. 이 때 다른 3개의 채널은 보이지 않게 하여 실험자의 편견을 없앴다. 또한 청록, 혹은 황색 eGRASP 신호를 각각 청록, 황색 구체로 지정하였다. 이때 청록과 황색 신호가 겹치면 황색 신호로 간주하였다. 왜냐하면 그 시냅스 전 신경세포는 학습 때 활성을 나타낸 세포이기 때문이다. 또한 만약 청록색 신호가 없거나, 혹은 myr_mScarlet-I와 myr_iRFP670이 동시에 보였다면 그 필라멘트들은 분석에서 제외하였다.
다음으로, eGRASP 밀도분석을 위하여 각 필라멘트에 대하여 청록과 황색 구체를 직접 손으로 세었다. 수상돌기의 길이는 Imaris FilamentTracer를 통해 측정하였다. 각 수상돌기의 청록, 혹은 황색 eGRASP 밀도는 한 이미지 내에서 myr_iRFP670가 발현된 수상돌기의 청록, 혹은 황색 eGRASP 밀도 평균으로 각각 표준화시켰다. 구조분석을 위해서는 위와 같은 방법으로 수상돌기와 eGRASP 신호를 표지 한 뒤, eGRASP 신호가 있는 신경가시만 Imaris FilamentTracer를 이용하여 3D 모델링 후 측정하였다. 3D 모델링하는 실험자는 eGRASP 신호의 색을 모르게 하여 편견을 최소화하였다.
<실시예 8> 전기생리학
성체 해마 절편의 상태를 향상시키기 위하여, N-메틸-D-글루카민(NMDG) 용액(93 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM Glucose, 5 mM sodium ascorbate, 2 mM Thiourea, 3mM sodium pyruvate, 10 mM MgSO4, 0.5 mM CaCl2)을 뇌 절개 및 회복에 사용하였다. 마우스는 Ketamine/Xylazine 혼합물을 복강 내 주사하여 깊이 마취시켰고, 얼음처럼 차가운(ice-cold) NMDG 용액으로 심장관류시켰다. 심장관류 후, 얼음처럼 차가운 NMDG 용액에서 vibratome(VT1200S; Leica)를 사용하여 관상절편(300~400um 두께)을 제작하고, 32~34℃의 NMDG 용액에서 10분간 회복시켰다. 회복 후, 절편은 상온의 ACSF를 함유한 변형 HEPES(92 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM Glucose, 5 mM sodium ascorbate, 2 mM Thiourea, 3 mM sodium pyruvate, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2)로 옮겨 적어도 1시간 동안 회복되었다. 회복 후 절편은 RT의 표준 ACSF(124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM glucose, 2 mM CaCl2, and 2 mM MgSO4)를 살포한 기록실로 옮겨졌다. 기록 피펫(3 ~ 5 MΩ)은 145mM K-gluconate, 5mM NaCl, 10mM HEPES, 1mM MgCl2, 0.2mM EGTA, 2mM MgATP, 및 0.1mM Na3GTP(280 ~ 300 mOsm, KOH로 pH 7.2로 조절)를 포함하는 내용액으로 채워졌다. GABA-R-매개 전류를 막기위해 ACSF에 피크로톡시(Picrotoxin, 100uM)이 첨가되었다. 청록색 빛은 473nm DPSS 레이저 (Laserglow Technologies Inc.)로, 황색 빛은 593 nm DPSS 레이저 (OEM Laser Systems)를 사용했다. 빛의 세기를 안정적인 시냅스 반응을 유도하도록 조절했다. Sr2+광에 의한 mEPSC 실험을 위해, CaCl2 대신 4 mM MgCl2과 4 mM SrCl2을 포함하는 ACSF를 사용했다. 빛은 300ms 동안 쪼였다. 동시 방출 요소들을 제거하기 위해, 광 자극 후 60~400ms 동안의 mEPSC 사건(event)을 MiniAnalysis 프로그램(Synaptosoft)으로 분석했다.
페어링(쌍)-LTP 실험에서, EPSC는 0.05Hz에서 유발되었고, 3개의 연속적인 EPSC를 평균 내어 표준화된 기준선에 대해 나타냈다. 페어링-LTP를 유도하기 위해, 네 개의 짧은 고주파 tetani(4초 간격으로 각각 20Hz의 50 펄스)와 긴 탈분극(0mV, 3분)을 짝을 지어 긴 탈분극 뒤에 수행했다. 해마 뉴런은 Axopatch 200B (Molecular Devices)을 이용해 -70mV에서 전압으로 고정시켰다. 접근 저항 변화 20% 미만인 세포만을 분석에 사용했다. mEmerald-nuc 발현은 냉각된 CCD 카메라(ProgRes MF cool; Jenoptik)와 형광 현미경(BX51WI; Olympus)으로 확인했다.
<실시예 9> 통계분석
데이터는 Prism 프로그램을 통해 분석하였다. Mann Whitney two-tailed test 와 one-way ANOVA 후 Tukey's multiple comparison test 를 통계적 유의성을 판단하기 위해 사용하였다.
<실험예 1> 특정 사건의 기억세포로부터 유래한 시냅스 라벨링
본 발명자들은 Dual-eGRASP를 두 개의 다른 영역에서 유래한 기억세포간의 시냅스 연결에 적용하기 위해, 특정 시간 지점에서 기억 세포 내에서 목적 유전자를 발현시키기 위해 아데노바이러스의존 바이러스(adeno-associated virus; AAV)에 의해 전달된 Fos 프로모터로 조절되는 역 테트라사이클린-조절 전사촉진인자(reverse tetracycline-controlled transactivator; rtTA)를 이용했다. 발작 유도 또는 공간적 공포 조건화(contextual fear conditioning; CFC) 2시간 전에 독시사이클린(Doxycycline)을 주사하여, 각 사건동안 활성화된 세포를 성공적으로 라벨링하였다(도 8 및 9). 이러한 Fos-rtTA 시스템을 이용하여, CA1 기억세포에서 일방적으로 post-eGRASP를 막표적화된 mScarlet-I과 함께 발현시키고, pre-eGRASP와 post-eGRASP의 공동 발현 가능성을 제거하기 위해, pre-eGRASP를 반대편의 CA3 세포에서 발현시켰다. 이 시스템은 적색 형광 표지된 수상돌기에서 CA3 엔그램에서 CA1 엔그램 (E-E)을 향하는 시냅스를 황색 eGRASP 신호로 라벨링하였다.
이 시냅스를 다른 시냅스(비-엔그램에서 엔그램(N-E), 엔그램에서 비-엔그램(E-N) 및 비-엔그램에서 비-엔그램(N-N) 시냅스)와 비교하기 위해, 반대쪽 CA3에서 무작위의 신경군에 청록 pre-eGRASP를 발현시키면서, CA1에서 산재한 신경군에 post-eGRASP를 막표적화 iRFP670과 함께 발현시켰다. 높은 농도의 DIO(double-floxed Inverted open reading frame) AAV를 낮은 농도의 Cre 재조합효소 발현 AAV와 함께 사용하여 무작위의 신경군에서 강한 발현을 얻었다(도 2a).
황색 pre-eGRASP의 발현은 독시사이클린 의존적임이 확인하였고, 이는 본 발명의 실시예에서 디자인된 시스템이 특정 사건의 기억세포로부터 유래한 시냅스를 라벨링할 수 있음을 나타낸다 (도 10a 및 도 10b). 도 10a는 doxycycline이 없을 때, 도 10b는 doxycycline이 주사되었을 때(도 10b)의 청록과 황색 eGRASP 발현 대표도를 나타낸다. 공간적 공포 조건실험 후 동일한 뇌 절편에서 4가지의 시냅스가 성공적으로 분류되었다. 형광 중첩 비율에 기초하여, 청록 pre-eGRASP, 황색 pre-eGRASP를 발현한 CA3세포, iRFP와 mScarlet-I를 발현하는 CA1 세포는 각각 78.38 %, 40.25 %, 11.61 %, 및 20.93 %로 측정되었다 (도 11). 근적외선(iRF670) 수상돌기의 청록과 황색 점은 각각 N-N 및 E-N 시냅스를 나타내는 반면, 빨강(mScarlet-I) 수상돌기의 청록과 황색 점은 각각 N-E 및 E-E 시냅스를 나타낸다 (도 2b와 도 2c). 청록과 황색 형광 모두를 나타내는 점은 기억세포로부터의 시냅스로 고려하였다. 청록 pre-eGRASP(무작위 선택군)과 황색 pre-eGRASP(엔그램 세포) 모두를 발현하는 CA3 세포로부터 유래한 시냅스이기 때문이다.
N-N과 N-E 시냅스의 밀도는 별다른 차이점을 보이지 않았지만 (도 2d, 도 12의 A 및 C), E-E 시냅스의 밀도는 E-N 시냅스보다 월등히 높았다 (도 2d, 도 12의 B 및 D). 이러한 차이는 CA3 엔그램 세포의 시냅스 전 말단이 CA1 비-엔그램세포보다는 주로 CA1 엔그램세포와 시냅스를 형성했다는 것을 의미한다.
또한, 각 시냅스군에서의 신경가시 크기를 검사했다. N-N과 E-N에서는 두드러진 차이가 없었던 반면, E-E 신경가시 머리 직경과 신경가시 부피는 N-E 시냅스 신경가시보다 월등히 크게 나타났다 (도 2e). 이는 CA3 기억세포로부터의 연결을 받는 CA1 세포의 신경가시가 선택적으로 강화(potentiation) 되어있음을 의미한다.
<실험예 2> dual-eGRASP 시스템의 확립
본 발명자들은 하나의 시냅스 후 뉴런을 두 개의 다른 시냅스 전 개체군과 비교하기 위해, 시냅스 파트너를 통한 청록 형광단백질 재구성 기술(Green fluorescent protein Reconstitution Across Synaptic Partners; GRASP)을 보완하였다. GRASP는 시냅스 전과 후 막에서 각각 발현되어 시냅스 틈새에서 결합해 완전한 GFP를 형성하는 상보적인 변이 GFP 조각을 사용하였다. GFP 신호는 시냅스 전 부분을 발현하는 뉴런과 시냅스 후 부분을 발현하는 뉴런 사이에 형성된 시냅스를 표시한다. 본 발명자들은 GFP 재구성을 촉진하는 약한 상호작용 도메인과 가장 개선된 변이 GFP에서 흔히 발견되는 단일 돌연변이를 도입함으로써 GRASP 신호 강도가 증가한, 향상된 GRASP 기술(eGRASP)을 개발했다 (도 5 참조). 나아가, 청록 혹은 황색 형광단백질을 재구성하도록 하여 eGRASP를 발전시켰다 (도 1a 및 도 1b, 도 6). 시냅스 전 뉴런에 색 결정 도메인을 배치(청록/황색 pre-eGRASP)하고 시냅스 후 뉴런에 공통 도메인을 배치(post-eGRASP)하여 하나의 시냅스 후 뉴런을 향한 두 개의 서로 다른 시냅스 뉴런 집단에서 유래한 두 시냅스 군의 시각화를 가능케 했다. 본 발명자들은 상기 기술을 dual-eGRASP라고 명명했다 (도 1a).
<실험예 3> dual-eGRASP 시스템의 적용
실험예 2에서 확립한 dual-eGRASP 시스템이 실제로 적용 가능한지 확인하기 위해, 인간신장세포, 신경세포 등에 dual-eGRASP 시스템을 적용해보았다.
3-1: HEK293T 세포에서 dual-eGRASP 시스템의 적용
도 1c는 뉴클레오펙션을 이용하여 별도로 형질도입된 HEK293T 세포의 세 종류의 군을 나타낸다. 하나의 군은 청록 pre-eGRASP과 mCherry를 발현하고, 또다른 군은 황색 pre-eGRASP와 mCherry를 발현하며, 세번째 군은 post-eGRASP와 iRFP670을 발현한다. 도 1c에 의하면, HEK293T cell에 dual-eGRASP pre construct (cyan, yellow) 및 post construct를 각각 따로 발현 시킨 후, 같이 섞어서 접촉하였을 때 eGRASP signal이 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 두 가지 색상이 공통 도메인을 발현하는 HEK293T 세포와 색 결정 도메인 중 어느 하나를 발현하는 세포의 접촉 결합부를 나타냄을 밝혔다.
3-2: 신경세포에서 dual-eGRASP 시스템의 적용
도 1d는 신경세포에서 dual-eGRASP 의 적용 예시를 나타낸 도면이다. Pre cyan GRASP를 Lateral entorhinal cortex(LEC)에, pre yellow GRASP는 Medial entorhinal cortex(MEC)에 발현시키고, post eGRASP construct를 치아 이랑 (Dentate gyrus; DG)에 발현시켰다. 도 1d는 청록 pre-eGRASP 과 황색 pre-eGRASP이 LEC와 MEC에서 각각 발현됨을 나타낸다. Post-eGRASP는 DG의 미리스토일화(myristoylated) TagRFP-T(myr_TagRFP-T)와 함께 발현된다.
그 결과, 치아 이랑(Dentate gyrus; DG)의 외부 혹은 내부 분자층 각각을 향하는, 외측 내후각뇌피질(Lateral Entorhinal Cortex; LEC) 또는 내측 내후각뇌피질(Medial Entorhinal Cortex; MEC)에서 유래한 치아 이랑(DG) 과립 세포의 시냅스에 dual-eGRASP 시스템이 성공적으로 적용됨을 확인할 수 있었다(도 1d). 따라서, 서로 다른 뇌의 영역에서 온 projection을 확인할 수 있는 dual-eGRASP 기술의 활용성을 확인할 수 있었다.
도 1e의 경우, cyan pre GRASP를 Right CA3에 yellow pre GRASP를 left CA3에 발현시켜서 양쪽 CA3로부터의 connection을 post GRASP가 발현되어있는 CA1에서 확인하였다. 도 1e는 청록 pre-eGRASP 및 황색 pre-eGRASP가 우측 CA3 및 좌측 CA3에 각각 발현됨을 나타낸다. Post-eGRASP는 CA1에서 myr_TagRFP-T와 함께 발현되었다. 따라서, 반대편 혹은 같은편의 CA3에서 유래한 CA1 피라미드 뉴런에서 특유의 공간 분포를 보이지 않는 혼합된 시냅스를 별도로 라벨링할 수 있었다 (도 1e).
3-3: dual-eGRASP 시스템이 세포의 전기생리학에 영향을 미치지 않음
도 7a 내지 도 7c는 dual-eGRASP 구성요소들의 발현이 기본 시냅스 전달에 영향을 미치지 않음을 확인한 도면이다. 도 7a는 대표적인 미니어처 EPSC (mEPSC) 기록 추적 결과를 나타낸다. 도 7b 및 도 7c는 각 표시된 대로 CA3과 CA1에서 eGRASP 구성요소를 발현하는 절편 내 CA1 피라미드 뉴런의 mEPSC의 진폭과 주파수를 나타낸다.
그 결과, 본 발명의 일예에 따른 dual-eGRASP 시스템을 세포 또는 동물 등에 도입하더라도, 세포 또는 동물이 기존에 가지고 있던 전기생리학적 특성에는 영향을 주지 않고, 목적하는 바를 표지할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, eGRASP 시스템을 적용할 경우에도, eGRASP 시스템에 의해 pre-eGRASP와 post-eGRASP를 발현하는 뉴런 간 시냅스 전달 강화 등이 발생하지 않았으며, 이는 본 발명의 일예에 따른 dual-eGRASP 시스템이 기존의 전기생리학적 특성에 영향을 미치지 않음을 의미한다.
<실험예 4> 기억 강도 및 기억세포의 연결도의 상관관계 규명
다음으로, 본 발명자들은 다양한 기억 강도에서 기억세포의 수는 일정하게 유지되더라도, 전후 기억세포간의 연결도가 기억의 강도를 암호화할 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. 도 2에서 나타낸 것과 같은 조합의 AAV와 주입 위치를 동일하게 하여 기억 강도가 기억세포간의 연결도와 비례하는지를 관찰하였다 (도 3a).
구체적으로, 각기 다른 강도의 기억을 유도하기 위해, 마우스들을 세 그룹으로 나누었다. 한 그룹은 마우스의 발 부분에 전기충격 없이 공간에만 노출시킨 반면, 다른 그룹의 마우스는 공간적 공포 기억 생성하기 위해 약하거나(0.35mA, 1회 충격) 강한(0.75mA, 3회 충격) 발 부분 전기충격에 노출시켰다(도 3b).
그 결과, 기억 생성 중 전기 충격의 강도를 올리면 더 높은 공포반응 수준(freezing)을 보였다 (도 3c). 반면, CA3과 CA1 기억세포의 수를 정량할 때에는 세 그룹간 눈에 띄는 차이는 발견되지 않았다 (도 13).
모든 그룹에서 N-N과 N-E 시냅스간의 밀도에서는 유의미한 차이가 없었다. 그러나 강한 충격을 받은 그룹에서 충격이 없거나 낮은 그룹과 비교할 때 E-E 시냅스의 밀도가 현저히 증가했다 (도 3d 및 도 3e). 나아가, 신경가시의 크기는 기억 강도와 양의 상관관계를 나타냈다. N-N과 E-N은 모든 그룹에서 특별한 변화가 없었던 반면, E-E 신경가시 머리 직경과 신경가시 부피는 다른 그룹에서보다 강한 충격을 받은 그룹에서 월등히 크게 나타났다(도 3f, 및 도 14).
<실험예 5> 시냅스 강도 조사
다음으로, 본 발명자들은 기억 형성 이후 CA3과 CA1 기억세포 사이에서 구조적 연결도의 증가가 관찰되었으므로, 각 시냅스의 시냅스 강도를 조사했다. 각각 청록과 황색 파장의 레이저로 활성화시킬 수 있는 Chronos와 ChrimsonR의 두 옵신을 사용하여, CA3 뉴런으로부터의 두 가지 인풋을 선택적으로 주었다. 먼저 CA3 흥분 뉴런에서, 칼슘/칼모둘린 의존성 단백질 키나아제 타입 II 알파(CaMKIIa) 프로모터로 조절되는 Chronos를, Fos-rtTA를 이용하여 CA3 엔그램 뉴런에서 ChrimsonR을 발현시켰다 (도 4a). Fos-rtTA를 사용하여 CA1 엔그램 뉴런을 핵표적화 mEmerald(mEmerald-Nuc)로 라벨링하고 CA1 엔그램 또는 비-엔그램 뉴런으로부터 전체 세포 기록을 수행했다. 공간적 공포 조건 실험 후 단일 해마 절편에서 전체 흥분뉴런에서 비엔그램(T-N), 전체 흥분뉴런에서 엔그램(T-E), 엔그램에서 비엔그램(E-N), 엔그램에서 엔그램(E-E)의 네 가지 조합의 시냅스 반응을 조사했다 (도 4b).
먼저, 쌍-펄스 비율(paired-pulse ratio, PPR)을 이용하여 시냅스전 전달을 살폈다(도4c 및 도 4d). CA3 엔그램 인풋에서의 PPR은 자극간 간격 25-, 50- 및 75-ms에서 눈에 띄게 감소하였으며, CA3 엔그램으로부터 CA1으로의 인풋 방출이 증가함을 확인했다. 이러한 감소는 E-E 시냅스 반응에서 가장 두드러지게 나타났다(도 4e). 외부 기록 용액(external recording solution)에서 Ca2+를 Sr2+로 대체하여 각 4개 시냅스 반응 조합으로부터 개별 시냅스의 시냅스 후 알파-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid; AMPA) 수용체 수준을 측정하였다.
Sr2+는 유도 방출을 비동기화하여 비동시성 방출의 연장을 유발하고 비연속적 시냅스 반응의 측정을 가능케 한다(도 4f). 광 자극 60-400 ms 후 유발된 미니어처EPSCs(mEPSCs)의 진폭을 측정했다. CA1 엔그램 세포로부터의 시냅스는 CA1 비엔그램세포와 비교할 때, 현저히 증가한 시냅스 후 AMPA 수용체 레벨을 보였다 (도 4g). 이러한 결과는 CA1 기억세포의 시냅스가 기억 형성 후에 강화되었지만, CA1 비-엔그램세포는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 시냅스 전 방출의 개연성과 시냅스 후 강화 모두에서의 변화는 장기 강화작용(LTP)에 중요한 역할을 한다. 기억 형성 동안의 LTP 존재를 측정하기 위해, 네 가지 시냅스 유형에서 각각 LTP를 유도하여 LTP 폐색 범위를 살폈다 (도 4h). 기준선 기록 5분 후, 쌍-LTP 자극을 주었다. 매우 강화된 TN 시냅스 반응이 관찰되었다(~150%). T-E와 E-N 시냅스 반응은 T-N 시냅스 반응보다 낮은 범위로 강화(~120%)되었으나, 이러한 차이는 현저하지 않았다. 흥미롭게도 E-E 시냅스 반응에서 쌍 LTP는 완전히 차단되었고, 강화는 T-N 시냅스 반응보다 현저히 낮게 나타났다 (도 4i).
기억 형성 동안 함께 활성화된 시냅스 군이 강한 연결을 보인 본 발견은 CA3에서 CA1를 향하는 시냅스에서 전형적인 Hebbian 가소성이 학습과 기억 과정에서 실제로 발생한다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 더 높은 연결도를 가진 세포는 학습 후에 연결도가 향상된 것과 대조적으로 기억 회로에 함께 할당된다는 가설을 제안한다. 그러나 강한 기억의 연결도가 현저히 향상되는 반면, 할당된 세포의 수는 기억 강도와 관계 없이 일정하게 유지된다. 이러한 발견은 이미 정해진 연결도에 대해 사후 학습으로의 향상이 지대하게 기여함을 나타낸다. 기억력과 시냅스 연결도 사이의 관계는 직접 연결된 뇌 영역간 기억세포 사이의 이런 특정한 연결이 기억의 시냅스 기질을 형성함을 시사한다.
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Lys Thr Arg Ala Val Val Lys 100 105 110 Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Thr Asp 115 120 125 Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe 130 135 140 Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 145 150 155 160 Lys Ala Asn Phe Thr Val Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln 165 170 175 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 180 185 190 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Val Leu Ser Lys 195 200 205 Asp Pro Asn Glu Lys 210 <210> 3 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyan pre-eGRASP strand 1-10 <400> 3 Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly 20 25 30 Glu Gly Asp Ala Thr Ile Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr 35 40 45 Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Ser 50 55 60 Trp Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His 65 70 75 80 Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr 85 90 95 Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Val Val Lys 100 105 110 Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Thr Asp 115 120 125 Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe 130 135 140 Asn Ser Gly Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 145 150 155 160 Lys Ala Asn Phe Thr Val Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln 165 170 175 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 180 185 190 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys 195 200 205 Asp Pro Asn Glu Lys 210 <210> 4 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yellow pre-eGRASP strand 1-10 <400> 4 Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly 20 25 30 Glu Gly Asp Ala Thr Ile Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr 35 40 45 Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr 50 55 60 Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His 65 70 75 80 Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr 85 90 95 Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Val Val Lys 100 105 110 Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Thr Asp 115 120 125 Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe 130 135 140 Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 145 150 155 160 Lys Ala Asn Phe Thr Val Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln 165 170 175 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 180 185 190 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Thr Val Leu Ser Lys 195 200 205 Asp Pro Asn Glu Lys 210 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Post-eGRASP strand 11 <400> 5 Arg Asp His Met Val Leu His Glu Tyr Val Asn Ala Ala Gly Ile Thr 1 5 10 15 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p30 <400> 6 Ala Pro Thr Lys Pro 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Glu Pro Tyr Pro Gly Ser Ala Glu Val Ile 85 90 95 Arg Glu Ser Ser Ser Thr Thr Gly Met Val Val Gly Ile Val Ala Ala 100 105 110 Ala Ala Leu Cys Ile Leu Ile Leu Leu Tyr Ala Met Tyr Lys Tyr Arg 115 120 125 Asn Arg Asp Glu Gly Ser Tyr His Val Asp Glu Ser Arg Asn Tyr Ile 130 135 140 Ser Asn Ser Ala Gln Ser Asn Gly Ala Val Val Lys Glu Lys Gln Pro 145 150 155 160 Ser Ser Ala Lys Ser Ala Asn Lys Asn Lys Lys Asn Lys Asp Lys Glu 165 170 175 Tyr Tyr Val <210> 10 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> neuroligin1 <400> 10 Leu Glu Leu Val Pro His Leu His Asn Leu Asn Asp Ile Ser Gln Tyr 1 5 10 15 Thr Ser Thr Thr Thr Lys Val Pro Ser Thr Asp Ile Thr Leu Arg Pro 20 25 30 Thr Arg Lys Asn Ser Thr Pro Val Thr Ser Ala Phe Pro Thr Ala Lys 35 40 45 Gln Asp Asp Pro Lys Gln Gln Pro Ser Pro Phe Ser Val Asp Gln Arg 50 55 60 Asp Tyr Ser Thr Glu Leu Ser Val Thr Ile Ala Val Gly Ala Ser Leu 65 70 75 80 Leu Phe Leu Asn Ile Leu Ala Phe Ala Ala Leu Tyr Tyr Lys Lys Asp 85 90 95 Lys Arg Arg His Asp Val His Arg Arg Cys Ser Pro Gln Arg Thr Thr 100 105 110 Thr Asn Asp Leu Thr His Ala Pro Glu Glu Glu Ile Met Ser Leu Gln 115 120 125 Met Lys His Thr Asp Leu Asp His Glu Cys Glu Ser Ile His Pro His 130 135 140 Glu Val Val Leu Arg Thr Ala Cys Pro Pro Asp Tyr Thr Leu Ala Met 145 150 155 160 Arg Arg Ser Pro Asp Asp Ile Pro Leu Met Thr Pro Asn Thr Ile Thr 165 170 175 Met Ile Pro Asn Thr Ile Pro Gly Ile Gln Pro Leu His Thr Phe Asn 180 185 190 Thr Phe Thr Gly Gly Gln Asn Asn Thr Leu Pro His Pro His Pro His 195 200 205 Pro His Ser His Ser 210 <210> 11 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pre-eGRASP (p30) <400> 11 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Pro Val Gly Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu 20 25 30 Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn 35 40 45 Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Ile 50 55 60 Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val 65 70 75 80 Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe 85 90 95 Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 100 105 110 Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp 115 120 125 Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Val Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu 130 135 140 Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Thr Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn 145 150 155 160 Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr 165 170 175 Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Thr Val 180 185 190 Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 195 200 205 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 210 215 220 Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Thr 225 230 235 240 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Arg Ala Pro Thr Lys Pro Pro 245 250 255 Pro Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Glu Val 260 265 270 Pro Ser Ser Met Thr Thr Glu Ser Thr Ala Thr Ala Met Gln Ser Glu 275 280 285 Met Ser Thr Ser Ile Met Glu Thr Thr Thr Thr Leu Ala Thr Ser Thr 290 295 300 Ala Arg Arg Gly Lys Pro Pro Thr Lys Glu Pro Ile Ser Gln Thr Thr 305 310 315 320 Asp Asp Ile Leu Val Ala Ser Ala Glu Cys Pro Ser Asp Asp Glu Asp 325 330 335 Ile Asp Pro Cys Glu Pro Ser Ser Gly Gly Leu Ala Asn Pro Thr Arg 340 345 350 Val Gly Gly Arg Glu Pro Tyr Pro Gly Ser Ala Glu Val Ile Arg Glu 355 360 365 Ser Ser Ser Thr Thr Gly Met Val Val Gly Ile Val Ala Ala Ala Ala 370 375 380 Leu Cys Ile Leu Ile Leu Leu Tyr Ala Met Tyr Lys Tyr Arg Asn Arg 385 390 395 400 Asp Glu Gly Ser Tyr His Val Asp Glu Ser Arg Asn Tyr Ile Ser Asn 405 410 415 Ser Ala Gln Ser Asn Gly Ala Val Val Lys Glu Lys Gln Pro Ser Ser 420 425 430 Ala Lys Ser Ala Asn Lys Asn Lys Lys Asn Lys Asp Lys Glu Tyr Tyr 435 440 445 Val <210> 12 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyan pre-eGRASP (p30) <400> 12 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Pro Val Gly Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu 20 25 30 Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn 35 40 45 Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Ile 50 55 60 Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val 65 70 75 80 Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Ser Trp Gly Val Gln Cys Phe 85 90 95 Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 100 105 110 Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp 115 120 125 Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Val Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu 130 135 140 Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Thr Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn 145 150 155 160 Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser Gly Asn Val Tyr 165 170 175 Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Thr Val 180 185 190 Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 195 200 205 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 210 215 220 Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Thr 225 230 235 240 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Arg Ala Pro Thr Lys Pro Pro 245 250 255 Pro Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Glu Val 260 265 270 Pro Ser Ser Met Thr Thr Glu Ser Thr Ala Thr Ala Met Gln Ser Glu 275 280 285 Met Ser Thr Ser Ile Met Glu Thr Thr Thr Thr Leu Ala Thr Ser Thr 290 295 300 Ala Arg Arg Gly Lys Pro Pro Thr Lys Glu Pro Ile Ser Gln Thr Thr 305 310 315 320 Asp Asp Ile Leu Val Ala Ser Ala Glu Cys Pro Ser Asp Asp Glu Asp 325 330 335 Ile Asp Pro Cys Glu Pro Ser Ser Gly Gly Leu Ala Asn Pro Thr Arg 340 345 350 Val Gly Gly Arg Glu Pro Tyr Pro Gly Ser Ala Glu Val Ile Arg Glu 355 360 365 Ser Ser Ser Thr Thr Gly Met Val Val Gly Ile Val Ala Ala Ala Ala 370 375 380 Leu Cys Ile Leu Ile Leu Leu Tyr Ala Met Tyr Lys Tyr Arg Asn Arg 385 390 395 400 Asp Glu Gly Ser Tyr His Val Asp Glu Ser Arg Asn Tyr Ile Ser Asn 405 410 415 Ser Ala Gln Ser Asn Gly Ala Val Val Lys Glu Lys Gln Pro Ser Ser 420 425 430 Ala Lys Ser Ala Asn Lys Asn Lys Lys Asn Lys Asp Lys Glu Tyr Tyr 435 440 445 Val 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190 Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 195 200 205 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 210 215 220 Tyr Leu Ser Tyr Gln Thr Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Thr 225 230 235 240 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Arg Ala Pro Thr Lys Pro Pro 245 250 255 Pro Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Glu Val 260 265 270 Pro Ser Ser Met Thr Thr Glu Ser Thr Ala Thr Ala Met Gln Ser Glu 275 280 285 Met Ser Thr Ser Ile Met Glu Thr Thr Thr Thr Leu Ala Thr Ser Thr 290 295 300 Ala Arg Arg Gly Lys Pro Pro Thr Lys Glu Pro Ile Ser Gln Thr Thr 305 310 315 320 Asp Asp Ile Leu Val Ala Ser Ala Glu Cys Pro Ser Asp Asp Glu Asp 325 330 335 Ile Asp Pro Cys Glu Pro Ser Ser Gly Gly Leu Ala Asn Pro Thr Arg 340 345 350 Val Gly Gly Arg Glu Pro Tyr Pro Gly Ser Ala Glu Val Ile Arg Glu 355 360 365 Ser Ser Ser Thr Thr Gly Met Val Val Gly Ile Val Ala Ala Ala Ala 370 375 380 Leu Cys Ile Leu Ile Leu Leu Tyr Ala Met Tyr Lys Tyr Arg Asn Arg 385 390 395 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Val Pro Ser Thr Asp Ile Thr Leu Arg Pro Thr Arg Lys Asn Ser 145 150 155 160 Thr Pro Val Thr Ser Ala Phe Pro Thr Ala Lys Gln Asp Asp Pro Lys 165 170 175 Gln Gln Pro Ser Pro Phe Ser Val Asp Gln Arg Asp Tyr Ser Thr Glu 180 185 190 Leu Ser Val Thr Ile Ala Val Gly Ala Ser Leu Leu Phe Leu Asn Ile 195 200 205 Leu Ala Phe Ala Ala Leu Tyr Tyr Lys Lys Asp Lys Arg Arg His Asp 210 215 220 Val His Arg Arg Cys Ser Pro Gln Arg Thr Thr Thr Asn Asp Leu Thr 225 230 235 240 His Ala Pro Glu Glu Glu Ile Met Ser Leu Gln Met Lys His Thr Asp 245 250 255 Leu Asp His Glu Cys Glu Ser Ile His Pro His Glu Val Val Leu Arg 260 265 270 Thr Ala Cys Pro Pro Asp Tyr Thr Leu Ala Met Arg Arg Ser Pro Asp 275 280 285 Asp Ile Pro Leu Met Thr Pro Asn Thr Ile Thr Met Ile Pro Asn Thr 290 295 300 Ile Pro Gly Ile Gln Pro Leu His Thr Phe Asn Thr Phe Thr Gly Gly 305 310 315 320 Gln Asn Asn Thr Leu Pro His Pro His Pro His Pro His Ser His Ser 325 330 335

Claims (27)

  1. 제 1 표지물질 및 제 2 표지물질을, 각각 제 1 세포 및 제 2 세포에 도입하는 단계; 및
    신호를 검출하는 단계를 포함하며,
    상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 상기 신호를 발생시키는 것이고,
    상기 제 1 표지물질은 서로 다른 2종 이상이며, 상기 2종 이상의 제 1 표지물질은 서로 다른 신호를 발생시키는 것이며,
    상기 제 1 표지물질은 Abl SH3 결합 펩티드, 상기 Abl SH3 결합 펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 Abl SH3 결합 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 포함하며,
    상기 제 2 표지물질은, Abl SH3 펩티드, 상기 Abl SH3 펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 Abl SH3 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 포함하며,
    상기 Abl SH3 펩티드 및 상기 Abl SH3 결합 펩티드의 결합에 의해 상기 제 1 표지물질 및 제 2 표지물질의 결합을 강화하는 것인,
    세포 간 접촉 확인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신호를 검출하는 단계 이후에, 신호가 검출될 경우 상기 제 1 세포 및 상기 제 2 세포가 접촉하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제 1 표지물질은 형광 단백질의 일부, 상기 형광 단백질의 일부를 암호화하는 유전자, 또는 상기 형광 단백질의 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하며,
    상기 제 2 표지물질은 상기 형광 단백질의 나머지 부분, 상기 형광 단백질의 나머지 부분을 암호화하는 유전자, 또는 상기 형광 단백질의 나머지 부분을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 형광단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP), 노랑 형광 단백질 (YFP), 및 청록 형광 단백질 (CFP)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 제 1 표지물질은 서로 다른 2종 이상이며, 상기 서로 다른 2종 이상의 제 1 표지물질을 각각 암호화하는 유전자가 상기 제 1 세포에 도입되며, 상기 제 1 세포에 도입되는 상기 유전자 중 적어도 1종 이상은 활성 의존성을 가지는 프로모터와 작동가능하게 연결된 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제 2 표지물질은 상기 제 2 세포에서 적어도 2 이상의 유전자 부위에서 발현되고, 상기 제 2 표지물질은 각각 서로 구별되는 형광 단백질과 함께 발현되며, 상기 유전자 부위들 중 적어도 하나의 부위는 활성 의존성을 가지는 프로모터와 작동 가능하게 연결된 것인, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 활성 의존성을 가지는 프로모터는 fos 프로모터, Arc 프로모터, 및 Immediate Early Gene 프로모터로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 세포 간 접촉은, 상기 제 1 세포 및 상기 제 2 세포가 40nm 이하의 간격을 가지고 위치하는 것인, 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 각각 분비신호펩티드 및 세포막통과영역을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 분비신호펩티드는 IgG kappa 신호 펩티드, SAP1 신호 펩티드, BiP1 신호 펩티드, ARS1 신호 펩티드, 및 CAH1 신호 펩티드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 Abl SH3 결합 펩티드는 p32, p30, p41, p40, p8, 및 3BP-1로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 세포막통과영역은 neuroligin1의 막통과영역, neurexin 1b의 줄기, neurexin 1b의 막통과영역, neurexin 1b의 세포내영역, M2의 막통과영역, Kdpf의 막통과영역, CorA의 막통과영역, 및 PDGFR의 막통과영역으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 방법.
  13. 제 1 표지물질 및 제 2 표지물질을, 각각 제 1 세포 및 제 2 세포에 도입하는 단계; 및
    신호를 검출하는 단계를 포함하며,
    상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 상기 신호를 발생시키는 것이고,
    상기 제 1 표지물질은,
    서열번호 11의 폴리펩타이드, 상기 서열번호 11의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 서열번호 11의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터;
    서열번호 12의 폴리펩타이드, 상기 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터; 및
    서열번호 13의 폴리펩타이드, 상기 서열번호 13의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 서열번호 13의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터
    로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 제 2 표지물질은 서열번호 14의 폴리펩타이드, 상기 서열번호 14의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 및 상기 서열번호 14의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인,
    세포 간 접촉 확인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 세포는 신경세포, 성상교세포, 미세아교세포, 희소돌기아교세포, 면역세포, T세포, 및 B세포로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  15. 제1항 내지 제4항, 제6항, 제7항, 제9항 및 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 세포 및 상기 제 2 세포는 인간을 제외한 동물세포, 또는 분리된 인간 세포인, 방법.
  16. 활성 의존성을 가지는 프로모터로 개시되며 제 1 표지물질을 암호화하는 유전자를 시냅스 전 신경세포에 도입하고, 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자를 시냅스 후 신경세포에 도입하는 단계; 및
    상기 제 1 표지물질과 제 2 표지물질의 결합에 의한 신호를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 제 1 표지물질은 서로 다른 2종 이상이며, 상기 2종 이상의 제 1 표지물질은 서로 다른 신호를 발생시키는 것이며,
    상기 제 1 표지물질은 Abl SH3 결합 펩티드, 상기 Abl SH3 결합 펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 Abl SH3 결합 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 포함하며,
    상기 제 2 표지물질은, Abl SH3 펩티드, 상기 Abl SH3 펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 Abl SH3 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 포함하며,
    상기 Abl SH3 펩티드 및 상기 Abl SH3 결합 펩티드의 결합에 의해 상기 제 1 표지물질 및 제 2 표지물질의 결합을 강화하는 것인,
    기억 저장 시냅스의 확인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 도입하는 단계 이후에,
    상기 활성 의존성을 가지는 프로모터를 작동하는 단계; 및
    특정 기억을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 신호를 검출하는 단계 이후에, 상기 신호가 발생하는 시냅스 전 신경세포를 상기 특정 기억 형성에 관여하는 기억 저장 세포 (Engram Cell)로 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 제 1 표지물질은 형광 단백질의 일부를 포함하며,
    상기 제 2 표지물질은 상기 형광 단백질의 나머지 부분을 포함하는 것인, 방법.
  20. 활성 의존성을 가지는 프로모터로 개시되며 제 1 표지물질을 암호화하는 유전자를 시냅스 전 신경세포에 도입하고, 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자를 시냅스 후 신경세포에 도입하는 단계; 및
    상기 제 1 표지물질과 제 2 표지물질의 결합에 의한 신호를 검출하는 단계를 포함하며,
    상기 제 1 표지물질은,
    서열번호 11의 폴리펩타이드, 서열번호 12의 폴리펩타이드, 및 서열번호 13의 폴리펩타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 제 2 표지물질은 서열번호 14의 폴리펩타이드인, 기억 저장 시냅스의 확인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 방법은 인간을 제외한 동물에서 수행되는 것인, 방법.
  22. 형광 단백질의 일부, 상기 형광 단백질의 일부를 암호화하는 유전자, 또는 상기 형광 단백질의 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 제 1 표지물질; 및
    상기 형광 단백질의 그 외 부분, 상기 형광 단백질의 그 외 부분을 암호화하는 유전자, 또는 상기 형광 단백질의 그 외 부분을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 제 2 표지물질을 포함하고,
    상기 제 1 표지물질은 서로 다른 2종 이상이며, 상기 2종 이상의 제 1 표지물질은 서로 다른 신호를 발생시키는 것이며,
    상기 제 1 표지물질은 Abl SH3 결합 펩티드, 상기 Abl SH3 결합 펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 Abl SH3 결합 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 포함하며,
    상기 제 2 표지물질은, Abl SH3 펩티드, 상기 Abl SH3 펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 Abl SH3 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 포함하며,
    상기 Abl SH3 펩티드 및 상기 Abl SH3 결합 펩티드의 결합에 의해 상기 제 1 표지물질 및 제 2 표지물질의 결합을 강화하는 것인, 세포 간 인접 검출용 조성물.
  23. 제 1 표지물질을 암호화하는 유전자가 도입된 제 1 세포, 및
    제 2 표지물질을 암호화하는 유전자가 도입된 제 2 세포를 포함하며,
    상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 신호를 발생시키는 것이고,
    상기 제 1 표지물질은 서로 다른 2종 이상이며, 상기 2종 이상의 제 1 표지물질은 서로 다른 신호를 발생시키는 것이며,
    상기 제 1 표지물질은 Abl SH3 결합 펩티드, 상기 Abl SH3 결합 펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 Abl SH3 결합 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 포함하며,
    상기 제 2 표지물질은, Abl SH3 펩티드, 상기 Abl SH3 펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 Abl SH3 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 포함하며,
    상기 Abl SH3 펩티드 및 상기 Abl SH3 결합 펩티드의 결합에 의해 상기 제 1 표지물질 및 제 2 표지물질의 결합을 강화하는 것인,
    동물.
  24. 제 1 표지물질을 암호화하는 유전자를 동물의 제 1 세포에 도입하고, 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자를 동물의 제 2 세포에 도입하는 단계를 포함하며,
    상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 신호를 발생시키는 것이고,
    상기 제 1 표지물질은 서로 다른 2종 이상이며, 상기 2종 이상의 제 1 표지물질은 서로 다른 신호를 발생시키는 것이며,
    상기 제 1 표지물질은 Abl SH3 결합 펩티드, 상기 Abl SH3 결합 펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 Abl SH3 결합 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 포함하며,
    상기 제 2 표지물질은, Abl SH3 펩티드, 상기 Abl SH3 펩티드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 Abl SH3 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 포함하며,
    상기 Abl SH3 펩티드 및 상기 Abl SH3 결합 펩티드의 결합에 의해 상기 제 1 표지물질 및 제 2 표지물질의 결합을 강화하는 것인,
    동물 모델의 제조방법.
  25. 제 1 표지물질; 및
    제 2 표지물질을 포함하며,
    상기 제 1 표지물질은 서열번호 11의 폴리펩타이드, 상기 서열번호 11의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 서열번호 11의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터;
    서열번호 12의 폴리펩타이드, 상기 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터; 및
    서열번호 13의 폴리펩타이드, 상기 서열번호 13의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 또는 상기 서열번호 13의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터
    로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 제 2 표지물질은 서열번호 14의 폴리펩타이드, 상기 서열번호 14의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 및 상기 서열번호 14의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인,
    세포 간 인접 검출용 조성물.
  26. 서열번호 11의 폴리펩타이드, 서열번호 12의 폴리펩타이드, 및 서열번호 13의 폴리펩타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 제 1 표지물질을 암호화하는 유전자가 도입된 제 1 세포, 및
    서열번호 14의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자가 도입된 제 2 세포를 포함하며,
    상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 신호를 발생시키는 것인, 동물.
  27. 서열번호 11의 폴리펩타이드, 서열번호 12의 폴리펩타이드, 및 서열번호 13의 폴리펩타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 제 1 표지물질을 암호화하는 유전자를 동물의 제 1 세포에 도입하고,
    서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 제 2 표지물질을 암호화하는 유전자를 동물의 제 2 세포에 도입하는 단계를 포함하며,
    상기 제 1 표지물질 및 상기 제 2 표지물질은 서로 결합하여 신호를 발생시키는 것인, 동물 모델의 제조방법.
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