CN1653331A - 测定细胞形态学参数变化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定细胞形态学参数变化的方法，例如，细胞的位置和/或形状。该方法包括采用一种当受到合适的第一波长光照射时由不可检测状态变成可检测状态的标记物质来标记细胞群。当用合适的第一波长光以预定模式对标记细胞的亚群进行照射时，则可确定细胞亚群，其中由细胞亚群所覆盖的区域符合采用的照射模式。接着，采用选定的适合于检测标记物的第二波长的照射光来检测至少部分细胞群，可显示指示所述细胞形态学参数变化的标记物质的分布模式。本申请还描述和请求保护了一种筛选测试试剂的方法，所述试剂对细胞形态学参数的影响尚待测定。

Description

测定细胞形态学参数变化的方法
本发明涉及一种测定细胞形态学参数变化的新方法，例如细胞的位置和/或形状，该方法提高了通量并适于自动操作。
细胞运动性是各种正常和异常细胞过程的必要因素。许多细胞类型形态上显示了显著的变化，例如神经轴索的运动、延长以及细胞分裂过程中的形状变化。伤口愈合、胚胎发生及免疫系统反应例如趋化性，都需要特定的细胞类型来识别并通过细胞运动对外部刺激作出响应。研究控制细胞运动的机制和开发一些能够调节细胞运动的试剂，对于开发新的治疗法是非常有意义的。测定神经突的长出和候选药物对该过程的影响是评估对包括中风和脊髓损伤的各种伤害，对神经变性状况如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病的可能治疗的关键。
已经有多种关于测定细胞运动方法的描述，它们大体可分为两类。第一类涉及将细胞固定于膜屏障的一侧，并测定细胞穿过屏障的运动的方法(Hagedom等人，Biochim.Biophys.Acta，(1995)，1269(3)，221-232；Bock和Mrowietz，J.Biochim.Biophys.Methods，(2001)，48(3)，257-268；Dunzendorfer等人，Immunol.Lett.，(2000)，71(1)，5-11)。第二类利用光学方法测定细胞运动，该方法通常涉及获得一系列细胞的慢过程图像，并接着对图像进行分析来测定细胞运动(Thurston等人，Cytometry，(1988)，9，411-417；Thurston等人，Experimental Cell Research，(1986)，165，380-390)。
对中枢神经系统研究的主要尝试集中于鉴别影响神经突生长的化合物上。促进神经生长的制剂对多种疾病及创伤具有治疗潜力，包括中风、脊髓损伤，以及神经变性状况如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。目前测定神经突长出的方法依赖于对单个细胞的手工测定，或者采用复杂的图像分析方法，以确定神经突从细胞体长出的程度(Jiang，Z.G.等人，Brain Res Dev.Brain Res.，(1995)，85(2)，212-9；Patrick，C.W.等人，Exp.Neurol.，(1996)，138(2)，277-85)。在WO01/11340中描述了利用带有报告细胞位置的发光标记的报道分子和报告神经突长出的第二种发光标记报道分子的神经元细胞，来测定神经突长出的方法。通过数字成像来测定细胞上或细胞内第一种和第二种发光标记报道分子的分布、环境或活性的变化。这种方法尽管是对纯粹基于形态学分析的图像分析方法的改进，仍然需要复杂的分析步骤来测定两种发光报道分子的相对空间排列。
至今，测定细胞运动的方法的建立通常是劳动密集型的，虽然设计了多种使用一次性成分和化学分析方法测定穿过屏障膜的细胞数量的变形方法(Frevert等人，J.Immunol.Methods，(1998)，213(1)，41-52)，但是这些方法不适于高通量的应用。成像法具有如下缺点，即由于必须收集足够的图像从而能够从一系列图像中的一个到下一个对单个细胞示踪，导致分析过程极其复杂。此外，由于哺乳动物细胞在培养时可达到1-2μm/分钟的相当大的相对运动速率，(Zicha等人，J.Cell Sci.，(1999)，112，447-454；Thurston和Palcic，Cell Motility and the Cytoskeleton，(1987)，7，361-367)，一个大小为10-20μm的单个细胞在10-30分钟内，可以很容易的运动到与其先前的位置不一致的位置。由于细胞迁移测定可以在数小时或更长的时间内进行，慢过程胶卷或录像纪录必须收集足够的信息来示踪所有细胞，以避免图像之间细胞的错误识别。此外，一旦得到图像，需要大量的人工分析或者复杂的软件来分析数据，并测定一群细胞中每个细胞的移位(Thurston等人，(1988)，在上述引文中；Thurston等人，(1986)，在上述引文中)。
进行了一些尝试来简化检测，以使它们更适合于高通量自动操作。这些检测采用在标准培养或在膜屏障上培养的标记细胞的荧光强度测定(CrouchM.E，J.Neurosci.Methods，(2000)，104(1)，87-91)，测定穿过膜的荧光标记细胞的神经突的生长。这些检测单独采用荧光强度测定，可对神经突长出进行定量。然而，对标准培养物进行强度测定不能准确辨别荧光标记的神经元细胞体和神经突，导致神经突长出测定的不准确性。屏障法虽然可辨别细胞体和神经突，但存在与前述屏障细胞迁移法同样的检测方法建立的问题。
前述方法以采用物理屏障和/或单个细胞识别来测定细胞形态学变化为特征。结果，它们对人工介入和/或分析努力要求很高，要结合复杂的仪器及软件，这排除大量并行的分析。因此，需要最小限度建立过程并适于高通量筛选及自动操作的方法，来测定细胞的形态学变化。本发明提供了一种测定细胞形态学特征变化，尤其是测定细胞位置和/或细胞形状变化的方法，该方法避免了需要物理屏障来隔离细胞群，而且还避免了对单个细胞进行示踪的需要。因此本发明提供的细胞分析方法可用于很宽范围的细胞类型及培养条件，其结果可采用现有的仪器进行分析。
因此，本发明的第一方面，提供了一种测定细胞形态学参数变化的方法，该方法包括：
a)将细胞群中的细胞亚群暴露于第一波长光，其中所述的细胞群采用当暴露于第一波长光时，能够从基本上不可检测状态转变为可检测状态的标记物质标记；
b)在第一时间将所述细胞群的至少部分暴露于第二波长光，并检测所述标记物质的第一分布模式；和
c)在第二时间将所述细胞群的所述部分暴露于第二波长光，并检测所述标记物质的第二分布模式；
其中所述标记物质的所述第一与第二分布模式的差别，指示所述细胞形态学参数的变化。
优选地，细胞形态学参数选定为细胞大小、细胞位置和/或细胞形状，并且所述标记物质在所述细胞亚群中的分布模式变化指示了细胞大小和/或位置和/或细胞形状的变化。在一个特别优选的实施例中，细胞形状的变化指示了神经突长出。
因此，根据本发明的方法，可通过采用非检测状态的、但当受到合适的第一波长光照射时能够变成可检测状态的标记物质对细胞群进行标记，来实现细胞形态学参数的测定。当将标记细胞的亚群以预定模式暴露于合适的第一波长光时，可确定该细胞亚群，其中该亚群所覆盖的面积符合所采用的照射模式。随后采用选定的适合于检测标记物的第二波长的照射光检测至少部分细胞群，将仅仅显示那些标记物受到第一波长光照射过的细胞。
按照步骤b)和c)采用第二波长光检测的部分细胞群，可以是：
i)整个细胞群，其中所有的细胞都暴露于第二波长光，并且标记物质的分布模式横过所有细胞进行记录，该检测可通过移去用于进行第一波长光照射的光模式装置来实现；或者，
ii)细胞亚群，其中将用第一波长光照射过的同一细胞亚群暴露于第二波长光，并记录标记物质的分布模式，该检测可通过保留用于进行第一波长光照射的光模式装置的空间位置来实现，并采用该装置来施加第二波长光照射；或者，
iii)细胞亚群，其中将用第一波长光照射过的不同细胞亚群暴露于第二波长光，并记录标记物质的分布模式，该检测可通过改变用于进行第一波长光照射的光模式装置的空间位置来实现，并采用该装置来施加第二波长光照射。
根据本发明的方法，可用于可采用标准组织培养方法培养的任何贴壁细胞类型。这些细胞类型包括所有来自于关于物种(如人、鼠、猿)，组织来源(如脑、肝、肺、心脏、肾、皮肤、肌肉)及细胞类型(如上皮细胞、内皮细胞)的任何公认来源的正常和转化细胞。另外，用重组基因转染的细胞也可在本发明的方法中培养和利用。培养多种细胞类型有公认可用的方法。(例如参看Freshney，R.I.，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，2nd Edition，Alan R.Liss Inc.1987)。该方法可要求采用专门的包被物和选择性培养基以允许细胞生长和表达特定细胞形态学参数。
适合地，活细胞的形态学参数变化可为如下几类：
i)细胞的大小、形状或位置显示变化的瞬时形态学变化，同时至少部分细胞占据了相同的空间，例如，当在细胞培养生长和分裂时；
ii)涉及细胞以随机的方式运动(细胞运动性)，或者细胞向着或离开化学或物理刺激运动(细胞迁移)的细胞位置变化，其中细胞位置发生变化，从而，整个细胞占据了与先前占据的位置不重叠的空间；和
iii)细胞大小和形状的永久性形态学变化，通常作为细胞分化的结果而发生，并导致细胞团和面积的显著增加。
根据类别i)，当所有的培养细胞显示了形态学变化时，某些特定的生物学过程可涉及类别ii)和iii)中的一种或两种。例如，采用细胞因子刺激的成纤维细胞显示了定向于化学吸引剂梯度的定向趋化性(Sasaki，等人，MediatorsInflamm.，(2000)，9(3-4)，155-60)。在这种情况下，细胞行为与上述类型ii)相应。在PC12细胞中，NGF诱导的分化引起细胞失去运动性，并导致神经突的长出(Green和Reid，Nature，(1977)，268，349)，当细胞长出的长度大于细胞体直径的两倍时可将其分类为神经突。在这种情况下，细胞行为与上述类型ii)相应。在肌管形成时，在单个肌细胞形成肌纤维的过程中，单个细胞优先向着细胞密度高的区域迁移，并随后与其它细胞融合形成线性纤维(Chazaud等人，J.Muscle Res.Cell Motil.，(1998)，19(8)，931-6)。在这种情况下，细胞表现出上述类型ii)和iii)两种行为。
根据本发明的第一方面的一个实施例，本发明提供了一种通过至少进一步检测标记细胞的亚群一次，来测定细胞形态学参数随时间变化的方法。该变化可由可检测标记物模式随时间扩展和/或扩散引起。这不需要单个细胞的鉴定或示踪就可实现。在该实施例中，该方法包括如下步骤c)：将所述细胞群的所述部分再暴露于所述第二波长光中N次，其中N≥1，并检测所述标记物质的分布模式，其中所述标记物质的分布模式用于建立指示所述细胞形态学参数变化的特征测验图。
在根据本发明第一方面的一个优选实施例中，提供了一种筛选测试试剂的方法，所述测试试剂对细胞形态学参数的影响尚待测定。该方法包括下列步骤：(a)在所述试剂存在和不存在的情况下，根据第一方面的方法进行上述操作；并且(b)在所述试剂存在和不存在的情况下，测定所述标记物质的分布模式的差别；其中在所述试剂存在和不存在的情况下，所述标记物质的分布模式的差别指示了所述试剂对细胞形态学参数的影响。作为替代，也可通过在测试试剂存在的情况下，采用上述方法进行测定，并将标记物质的分布模式与不存在试剂的情况下测得的对照分布模式相比较。对照模式可以很方便的以电子化储存于数据库或其它电子格式中。
合适地，根据本发明的标记细胞的标记物质，通过将其暴露于合适波长的光，可以从不可检测或基本上不可检测的状态转变为可检测状态。根据其特点和使用方法，合适的标记物质可分为两类。
在第一类中，标记物，这里定义为直接标记物，可直接被光作用转化为可检测状态。直接标记物可加载或附着于细胞群和亚群中的所有细胞，该细胞随后可通过限定几何形状的光照射进行标记。用作直接标记物的合适物质包括，隔离的(Caged)荧光分子、光致变色分子和光致变色蛋白。直接标记物还可包括能够影响报道分子的生物物理或荧光特征第二种部分。在这种情况下，报道分子在胞外介质中是非荧光的，在胞内或者当接着用光照射附着于细胞时是荧光的。该种类中用作直接标记物的合适物质包括：酶底物光致变色荧光染料、膜敏感的光致变色染料以及pH敏感的光致变色染料。
第二类标记物，这里定义为间接标记物，当受到光照射时不改变它们的检测特性，但可用于与其它光活性物质相结合。间接标记物可通过限定几何形状的光照射，加载或附着于全部细胞群的一个细胞亚群。用作间接标记物的合适物质包括，包含于光活性脂质体和光反应标记内的高浓度自猝灭荧光色素。
根据本发明，采用的优选标记物质具有许多预期特征，如下所述：
a)它们应能够自由溶解于液体介质和缓冲液中；
b)它们应能够自由透过或进入细胞膜，但保留于细胞内部或者与细胞结合；并且
c)在自由溶液及细胞中，在不存在适合于活化的波长的光时，它们应当是不可检测的或者基本上是不可检测的。
根据本发明，特别优选采用的标记物质具有许多另外的特征：
a)在暴露于适合活化的波长的光中之后在自由溶液中不可检测或基本上不可检测；并且
b)在暴露于适合活化的波长的光中之后在细胞内是可检测的。
具有这些特征的报道分子可允许细胞群暴露于不可检测或基本上不可检测标记物质的溶液中，允许所有细胞加载标记物，并允许其在细胞亚群中转变为可检测标记物，而不会将自由溶液中的大量标记物转化从而引起分析干扰。
隔离的荧光分子是其荧光特性可从非活化形式(非荧光)通过光解转换成活化形式(荧光)来控制的一种分子。存在许多隔离的基团，并且其中一些用于产生隔离荧光团，即不发荧光、用紫外光照射直到“非隔离”化才能产生荧光的基团(Adams和Tsien，Ann.Rev.Physiol.，(1993)，55，755-784；Handbookof Fluorescent Probes and Research Products，(2001)，Molecular Probes)。
合适用于按照本发明方法的隔离荧光分子例子包括N-(DMNB-隔离荧光素)-1，2-双十六酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和5-羧基荧光素-双-(5-羧甲氧基-2-硝基苄基)醚-丙氨酸-羧酰胺，琥珀酰亚胺酯(Molecular Probes lnc.)。这些隔离荧光色素可通过短暂的波长为300-600nm的紫外光照射而变得“非隔离”。原则上任何可附着或整合于活体细胞中的隔离荧光分子都可用于本发明的方法。
在替代方式中，标记物可以是表现为可开关控制荧光的光致变色材料。合适的光致变色材料包括可用488nm波长的光照射来活化的氧化银纳米束粒子，从而随后用520-550nm波长的光照射引起粒子发荧光(Peyser，等人，Science，(2001)，291，103-106)，而当粒子未受到488nm波长的光照射时，用520-550nm波长的光照射不能激发荧光。其它的基于光致变色开关的荧光描述如下，例如俘精酸酐衍生物(Inada，T.，等人，Chem.Lett.，(1997)，321；Inada，T.，等人，Chem.Lett.，(1997)，961；Walz，J.，等人，Chem.Phys.Lett.，(1993)，213，321-324)；以及二氢甘菊环衍生物(Daub，J.，等人，Mol.Cryst.Liq.Cryst.，(1992)，217，177-185)。
用于根据本发明方法的可供选择的光致变色材料包括光致变色分子，例如在美国专利US5268862及US5847141中描述的螺环苯并吡喃和并四苯醌类(naphthacenequinones)。当处于基态时，在受到紫外光、可见光和红外光照射时，这些材料的颜色发生变化。然后分子经过光化学转变成为亚稳态，亚稳态吸收不同波长的光成为基态。
光致变色蛋白是具有两个或更多不同激发或发射光谱稳态的荧光蛋白，可通过合适波长的光照射进行状态之间的转换。美国专利US6046925描述了具有光致变色荧光蛋白的光学存储装置。在一个实施例中，光致变色蛋白是带有一个T203氨基酸替代的变异的Aequorea绿色荧光蛋白(GFP)，例如T203F，T203Y，T203S，S65G/S72A/T203F，S65G/S72A/T203Y或T203S/S205T。在(Patterson，G.H.and Lippincott-Schwartz，J.，Science，(2002)，297，1873-7)描述了另一种GFP的变体，在用413nm的光强烈照射后，当用488nm的光激发时其荧光会增加100倍，并在有氧条件下可稳定保持数天。GFP的表达广泛用作活细胞的荧光探针和标记(Misteli，T.和Spector，D.L.，Nat.Biotechnol.，(1997)，15(10)，961-4)。采用本领域技术人员公知的方法(例如，参见Maniatis，等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.，(1989)中描述的技术)，对光致变色变异GFP或其它光致变色荧光蛋白工程化使之在活细胞中组成型表达，为本发明的方法提供了另外的标记细胞的方法。
其它的可用于与光致变色材料结合的直接标记的例子包括那些与细胞内成分反应后才产生荧光的材料，例如Bimane衍生物，如monobromobimane。当被动扩散进入细胞内并与胞内含有谷胱甘肽和硫醇的蛋白质反应后，形成蓝色荧光加合物。
可通过适合于设计标记物质的方法学来完成由根据本发明的标记物质对细胞的标记。例如，可利用正在研究的细胞质标记方法，或者作为替代，可用标记物标记细胞表面。标记方法的选择依赖所采用标记物的类型，这对本领域技术人员来说是公知的。例如，可允许采用本发明的方法中的光致变色材料进行细胞表面标记。作为替代，标记物质可通过微注射或者公认的大量加载方法来加载入细胞，如Molecular Probes提供的InfluxTM。
适用于本发明的将不可检测标记物活化为可检测形式的又一方法是，以不可检测的形式分隔标记。例如，在可通过用自身的猝灭引起荧光消失的高浓度标记小泡中将荧光部分分隔，或者通过将pH敏感的荧光部分在不发出荧光的pH环境下被囊化，来荧光分子不可检测。引入被囊化的荧光部分随后通过暴露于照射模式下被释放，允许荧光分子以空间控制的方式从不可检测形式转换成可检测形式。在药物送递应用中已描述了通过紫外光解法光激活，从光敏感脂质体将化合物释放到活细胞内(Bisby，R.H.等人，Photochem.Photobiol.，(2000)，72(1)，57-61；Morgan，C.G.等人，Photochem.Photobiol.，(1995)，62(1)，24-9)。根据本发明，将合适的荧光标记被囊化入带有光致变色脂类的脂质体，该脂类如(1，2-(4’-正丁基苯基)偶氮-4’-(γ-苯基丁酰基))-甘油基-3-胆碱磷酸(Morgan，C.G.等人，Biochim.Biophys.Acta，(1987)，903(3)，504-9)，该荧光标记在受到近紫外光照射时异构化，从而导致膜对溶质透性的变化，随后与细胞膜光定向融合，从而提供一种将荧光标记传送到细胞中的工具，可对细胞进行标记。
适用于该标记方法的荧光分子包括那些例如当在局部高浓度被分隔时，由于其自身猝灭而不发荧光(Shi，L.B.和Verkman，its.，J.Gen.Physiol.，(1989)，94(6)，1101-15)，但当稀释后，例如通过将脂质体与细胞膜光定向融合而释放到细胞中，又发出荧光的荧光素。作为替代，也可采用pH敏感的荧光分子如2’，7’-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素(Molecular Probes)。例如，可在酸性pH溶液中，将pH敏感的荧光色素被囊化于光敏脂质体，在该条件下分子显示较弱的荧光，但当通过脂质体光解将其释放到细胞中，并暴露于较高的pH条件下时，该分子的荧光强度增加。其他用于本发明的pH敏感的荧光分子是如在WO00/75237中描述的pH敏感的花菁染料。
适用于本发明方法的其他标记基团，是带有荧光色素或其它可检测部分与能被合适波长的光照射活化、并因而与邻近的部分形成共价结合的反应基团连接的光反应或光亲和标记。光反应标记的例子包括，ethidium monoazide(Molecular Probes)，芳基叠氮化物(Bronk，K.S.和Walt，D.R.，Anal.Chem.，(1994)，66(20)，3519-20)，叠氮罗丹明(Daoud，R.等人，Biochemistry，(2000)，39(50)，15344-52)以及羰花青叠氮硝基苯(Hahn，K.M.等人，J.Histochem.Cytochem.，(1993)，41(4)，631-4)。在本发明的方法中采用这些标记，可通过在能够引起活化及标记的合适波长光照射模式下，将细胞暴露于光反应分子，接着洗涤除去未结合的光反应分子来完成，从而产生标记细胞模式。
为了阐明本发明的原理及作用，现参考下列附图及图解，其中：
图1是细胞的光活化模式及随后细胞分布分析示意图；
图2显示的是细胞迁移之后的细胞分布分析图；
图3是加载了隔离的荧光标记并使用紫外光模式的HeLa细胞电子图像显示；
图4(A及B)是加载了隔离的荧光色素并使用紫外光模式的HeLa细胞电子图像显示；
图5(A及B及C)显示了加载了隔离的荧光色素并使用紫外光模式的HeLa细胞；
图6(A及B及C)显示了加载了隔离的荧光色素并使用紫外光模式的HeLa细胞，以及在0小时及24小时时的荧光分布分析。
参考图1及2对本发明的下列方面进行描述。在表面上生长的细胞(图1A中显示为黑色正方形)用不可检测的标记物质标记。接着，用第一波长光照射细胞的一个亚群，下文中记为λ1，λ1选定为，通过引起标记物从不可检测状态转化为可检测状态的适合于活化标记的波长，且细胞亚群为照射区域(在图1A中显示为灰色的带)限定的模式。接着，用第二波长光λ2照射同一区域的细胞(图1B中显示为黑色正方形)，λ2的波长长于λ1，显示由λ1照射模式引起的可检测标记的模式(图1B中白色的带)。接着，可在一个或更多预定的时间间隔，通过用波长为λ2的光照射同一细胞区域(图1C中显示为黑色的正方形)对细胞再次进行检测。如果细胞位置发生了变化，这将产生不同的可检测标记模式(如图1C中较宽阴影带所显示的)。因此，最初暴露于波长为λ1的光的细胞，与用波长为λ1的光最初照射细胞亚群的模式相比，显示了从其最初位置有移动，如由扩散或者另外改变的可检测标记模式所证实的。照射光的波长λ2，选定为适合于测定标记物质，并仅仅显示标记物质受到第一波长为λ1的光照射的那些细胞。
通过比较标记分布的适当特征来比较带有可检测标记细胞的分布模式，可以很容易地测定细胞运动和/或细胞形状变化的程度。例如，如图2所示，在细胞迁移检测开始时，沿着照射模式的线性横断面(图1B中表示为X-Y线)测定标记的分布，并在以后的时间重复这种测定(图1C中表示为X2-Y2线)，可得出如图2中所示的模式分布图的清楚的差别，其中细胞运动导致扩散并加宽了照射模式的强度特征。
原则上，任何模式或模式成分的数目均可用于采用波长为λ1的光照射的步骤。通过照射点在一维或二维方向持续或者间断地侧向移动，可得到点、线或其它几何形状。通过相对于样品移动照射点或者相反，或者这些运动的结合，可通过横过表面扫描调好焦的照射点来获得照射的模式。
扫描共焦显微镜，例如Zeiss LSM400，扫描横过标本的光的较小的调好焦的点。通过控制照射点的运动，或者通过限制照射点的运动并移动标本载物合，可引起照射点照射一个限定模式。作为替代，非扫描荧光显微镜，例如采用固定光源的Nikon Diaphot，通过结合高倍物镜及部分关闭光圈来在标本上产生小的光斑，也可用于在标本上产生照射模式。事实上标本载物合的一维或二维运动可用于建立任何需要的照射模式。通过这种方法活化HeLa细胞中分隔的荧光染料标记如图3所示。
在根据本发明的每个实施例中，当样品和/或照射点移动时，通过封闭或断开光照从而实现多个或重复模式成分，可得到不连续区域的照射。
其它形式的扫描显微镜仪器，例如Amersham Biosciences IN Cell Analysis系统，采用限定波长的线性光照射标本。这些线性扫描系统可用于本发明的方法，通过扫描间断地调整横过标本的线性光，在标本上产生平行线模式。
作为选择，通过用穿过部分不透明模式屏蔽的光照射样品，屏蔽模式聚焦于样品上，可得到预定的照射模式。该屏蔽通常用于在表面上模式化有机或无机材料的光刻蚀法，例如，用于制造半导体装置。美国专利US5744305描述了制造并将这种屏蔽物用于光刻蚀法及光定向的空间寻址平行化学合成。
在本发明的另一方面，光致变色材料可用于标记培养细胞的离散模式，用于研究导致不依赖于细胞从一个不连续的位置迁移到其它位置的可检测标记分布变化的时间依赖过程，但该模式是细胞形态学变化的结果，导致了部分细胞延伸和迁移到细胞最初占据的区域之外。
为将本发明的方法用于神经突长出的检测，将培养的神经元细胞，例如PC-12细胞(Koike，T.，BrainRes.，(1983)，289(1-2)，293-303)，采用适当的光致变色标记物质标记，接着以限定模式将细胞亚群暴露于合适波长的光以使标记物质变得可检测。然后在不同时间间隔，用适合于检测标记物质的波长的光照射细胞重复检测标本，通过检测未受到模式化照射的标本区域出现的可检测标记，可揭示是否存在神经突长出，该标记的出现由神经突从细胞体长出引起。
实施例
实施例1
HeLa细胞在12孔多孔皿上在DMEM+10％血清中生长。细胞用PBS洗涤，细胞表面蛋白用CMNB分隔的0.025mg/ml的羧基-荧光素琥珀酰亚胺酯(Molecular Probes)室温下标记1小时。用PBS洗涤细胞三次，然后用照明光圈尽可能关闭到最大程度的Nikon Diaphot 300显微镜上的20倍物镜暴露于水银灯产生的330-380nm的光。用显微镜载物台的侧向运动来在横过细胞培养物的线上解除羧基荧光素的分隔。然后将激发波长变为450-490nm，并打开照明光圈，显示了一行标记细胞，其中隔离的标记转变为可检测形式，即相对于内源细胞荧光背景而言清晰可见的明亮的荧光细胞(图3)。
实施例2
HeLa细胞在12孔多孔皿上在DMEM+10％血清中生长。根据供应商的说明，采用Influx Pinocytic细胞加载试剂(Molecular Probes)，用0.1mg/ml的CMNB分隔的羧基-荧光素(Molecular Probes)对细胞进行加载。然后用照明光圈尽可能关闭到最大程度的Nikon Diaphot 300显微镜上的10倍物镜将细胞暴露于水银灯产生的330-380nm的光以照射环形区域(图4A的圆，相差图像)。然后将激发波长变为450-490nm，并打开照明光圈，显示了一组标记细胞，其中隔离的标记转变为可检测形式，即清晰可见的明亮的荧光细胞(图4B，荧光图象)。
实施例3
HeLa细胞在24孔皿上在DMEM+10％血清中生长。根据供应商的说明，采用Influx Pinocytic细胞加载试剂(Molecular Probes)，用1mg/ml的CMNB分隔的羧基-荧光素(Molecular Probes)对细胞进行加载，并将其转移到荧光较弱的Hams F-12培养基中。然后用照明光圈部分关闭的Nikon Diaphot 300显微镜上的10倍物镜将细胞暴露于水银灯产生的330-380nm的光以照射环形区域。然后将激发波长变为450-490nm，并打开照明光圈，显示了一组标记细胞，其中隔离的标记转变为可检测形式，即在10倍物镜下清晰可见的明亮的荧光细胞(图5B)和在4倍物镜的较低放大率下明显区别于仅仅通过相差检测才可见的全部细胞群的荧光细胞岛(图5C)。
实施例4
HeLa细胞在Wellco玻璃底盘上在Hams F-12+10％血清中生长。根据供应商的说明，采用Influx Pinocytic细胞加载试剂(Molecular Probes)，用1mg/ml的CMNB分隔的羧基荧光素(Molecular Probes)对细胞进行加载。然后用照明光圈部分关闭的Nikon Diaphot 300显微镜上的20倍物镜将细胞暴露于水银灯产生的330-380nm的光以照射环形区域。立即记录一个图象(6A)，并在37℃下温育24小时后，再记录同一培养区域的另一个图象(图6B)。沿着X-Y线，采用Metamorph图象分析软件测定横过该区域的荧光强度(6C)，显示峰值强度的显著下降，以及与细胞由于24小时内随机的细胞迁移而离开标记区域的运动相一致的升高的总荧光，从而区分图象。

Claims (10)

1.一种测定细胞形态学参数变化的方法，其包括：
a)将细胞群中的细胞亚群暴露于第一波长光，其中所述的细胞群采用当暴露于第一波长光时，能够从基本上不可检测状态转变为可检测状态的标记物质标记；
b)在第一时间将所述细胞群的至少部分暴露于第二波长光，并检测所述标记物质的第一分布模式；和
c)在第二时间将所述细胞群的所述部分暴露于第二波长光，并检测所述标记物质的第二分布模式；
其中所述标记物质的所述第一与第二分布模式的差别，指示所述细胞形态学参数的变化。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的形态学参数选为细胞大小、细胞位置和/或细胞形状。
3.根据权利要求2的方法，其中细胞形状的变化指示神经突的长出。
4.根据权利要求1至3的方法，其进一步包括如下步骤c)：将所述细胞群的所述部分再暴露于所述第二波长光N次，其中N≥1，并检测所述标记物质的分布模式，其中所述标记物质的分布模式用于建立指示所述细胞形态学参数变化的分布图。
5.一种筛选测试试剂的方法，所述测试试剂对细胞形态学参数的影响尚待测定，该方法包括下列步骤：
(a)在所述试剂存在和不存在的情况下，进行根据权利要求1-4中任一项的方法；和
(b)测定在所述试剂存在和不存在的情况下所述标记物质分布模式的差别；
其中，在所述测试试剂存在和不存在的情况下，所述标记物质分布模式的差别指示所述试剂对细胞形态学参数的影响。
6.一种筛选测试试剂的方法，所述测试试剂对细胞形态学参数的影响尚待测定，该方法包括下列步骤：
(a)在所述试剂存在和不存在的情况下，进行根据权利要求1-4中任一项的方法；和
(b)将标记物质的分布模式与不存在测试试剂的情况下测得的对照分布模式相比较。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述的标记物质选自隔离的荧光分子和光致变色化合物。
8.根据权利要求7的方法，其中所述隔离的荧光分子选自N-(DMNB-隔离的荧光素)-1，2-双十六酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和5-羧基荧光素-双-(5-羧甲氧基-2-硝基苄基)醚-丙氨酸-羧酰胺、琥珀酰亚胺酯。
9.根据权利要求7的方法，其中所述的光致变色材料选自氧化银纳米束粒子，螺环苯并吡喃和并四苯醌类。
10.选自隔离的荧光分子及光致变色化合物的标记物质在权利要求1-5中任一项的测定细胞形态学参数变化的方法中的应用。
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