DK164512B - Fremgangsmaade til simultan bestemmelse af prokallikrein og den partielle thromboplastintid - Google Patents

Description

i

DK 164512 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til simultan bestemmelse af proka11 ikrein og den partielle thrombopla-stintid (PTT). Ud fra bestemmelsen af prokallikrein kan der uddrages oplysninger vedrørende blodkoaguleringssytemet. Man-5 gel på proka11ikrein ytrer sig i en forlænget koaguleringstid.

Ved forlængede koaguleringstider, kan prokal1ikreinbestemmel-sen give oplysning, om denne forlængelse er forårsaget af mangel af faktor VIII, IX eller af en prokal1ikreinmangel. Viser prokal1ikreinbestemmelsen, at det drejer sig om en mangel på faktor VIII eller IX, tyder dette på alvorlige sygdomme. Des-uden fastslås der også ved bestemte andre sygdomstilstande, som f.eks. chok, en forandring af prokal1ikreinmængden.

Kai 1ikreindannelsen ud fra prokallikrein i plasma forløber efter følgende reaktionsskema: 15 faktor XII dextransul f at.» faktor Xlla prokallikrein faktor XII^ kallikrein.

20

De kendte metoder til bestemmelse af prokallikrein er beskrevet i H. U. Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, 3. udgave, bind V, side 412/413. Ved siden af nogle meget komplicerede og tidsrøvende metoder, der ikke kan komme i betragtning som en rutinebestemmelse i koaguleringslaboratorium, er det 25 herfra kendt at bestemme det efter aktivering af faktor XII med dextransulfat dannede kallikrein via et kromogent substrat. Denne fremgangsmåde har imidlertid den ulempe, at der må gennemføres inkubering til overvågning af prokallikrein til kallikrein ved 0°C for at forhindre indflydelse af plasmainhi-30 bitorer, som f.eks. a^-antitrypsin og C^-inaktivator, på måleresultatet. Inkuberingen ved 0°C forhindrer igen på tungtvejende måde denne fremgangsmådes automat iserbarhed.

Det er således formålet med den foreliggende opfindelse at 3 5 tilvejebringe en enkel og hurtig fremgangsmåde til simultan bestemmelse af prokallikrein og PTT, som ikke har de nævnte ulemper, og som især kan gennemføres ved normal temperatur.

2

DK 164512 B

Denne opgave løses ifølge opfindelsen ved hjælp af en fremgangsmåde til simultan fotometrisk bestemmelse af prokallikre-in og PTT i plasma, der er ejendommelig ved, at man inkuberer plasma med en overf 1adeaktivator valgt blandt ellagsyre, sul-5 fatider og findelt si 1 iciumdioxid, derefter tilsætter et kro-mogent thrombi nsubstrat, måler den vundne ekstinktion, og dernæst måler den derfra frigjorte optiske bestemmelige gruppe i korte tidsintervaller eller kontinuerligt og som mål for pro-kal1ikreinindholdet bestemmer stigningen af den lineære del af den kurve, der opnås ved opstilling af tiden i forhold til ekstinktionen og som mål for PTT bestemmer tiden indtil en forud fastlagt ekstinktion.

Overfladeaktivatoren vælges blandt ellagsyre, sulfatider (fortrinsvis fra hjernemateriale) og findelt si 1iciumdioxid, som X 5 det f.eks. er tilgængeligt i handelen under betegnelsen "Aerosi1"®, Degussa, Tyskland. Dextransu1fat er ikke egnet. Særligt foretrækkes ellagsyre i en koncentration fra 0,08 til 2,1 pg/ml prøveopløsning. De bedste resultater opnås med en koncentration fra 0,40 til 0,45 pg ellagsyre pr. ml. Disse og 20 alle de følgende koncentrationsangivelser i nærværende beskrivelse er beregnet på slutkoncentrationerne ved prøven.

Det er på overraskende måde ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen muligt at inkubere ved normale temperaturer, navnlig 25 ved 20 til 40° C og fortrinsvis ved 30 til 37*0.

Som kromogene thrombi nsubstrater kan der hertil anvendes i handelen almindeligt tilgængelige peptider, som indeholder en kromogen gruppe, navnlig en paranitroani1 i ngruppe eller et de-30 rivat deraf, som spaltes fra substratet under enzymindvirkning, og da kan bestemmes optisk. Foretrukne kromogene thrombi nsubstrater til anvendelse inden for den foreliggende opfindelses rammer er Tos-Gly-Pro-Arg-pNA, H-D-CHA-Ala-Arg-pNA, H- D-CHG-Gly-Arg-pNA, H-D-CHG-Ala-Arg-pNA, H-D-CHG-but-Arg-pNA, iso-Buco-Gly-Arg-pNA, naphthyl-S02-Gly-Pro-Arg-pNA, H-D-Phe-Pip-Arg-pNA og Bz-Pro-Phe-Arg-pNA.

35

DK 164512B

3

Koncentrationen af det kromogene thrombi nsubstrat udgør hensigtsmæssigt 0,01 til 2 mmol/liter i afhængighed af det pågældende substrats Michael is-konstant. Særligt foretrækkes som substrat Tos-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilin i en koncentration på 5' ca. 0,2 mmol/liter og Bz-Pro-Phe-Arg-pNA i en koncentration på 0,7 til 0,8 mmol/liter.

Fortrinsvis gennemføres fremgangsmåden ifølge opfindelsen i nærværelse af animalske, vegetabilske eller syntetiske phos-pholipider. Eksempler på egnede phospholipider er cephalin, sojabønne-phospholipid, phosphati dy1 ethano 1 am in og phosphati-dylcholin. Talrige andre phospholipider er imidlertid ligeledes egnede, men kan på grund af deres store antal ikke angives specielt her. Særligt foretrækkes cephalin. Dets mængde ligger hensigtsmæssigt mellem 4 og 200 Mg/ml. I tilfælde af en simul-15 tanbestemme1 se af PTT er en tilsætning af et phospholipid nødvendig.

Det er endvidere hensigtsmæssigt at gennemføre fremgangsmåden ifølge opfindelsen i nærværelse af ca1ciumioner, da calciumtilsætning bevirker en følsomhedsstigning for fremgangsmåden ved forøgelse af ekstinktionsdifferensen pr. tidsenhed. Der foretrækkes en koncentration fra 25 til 40 pmol/ml Ca++-ioner.

I tilfælde af simultanbestemmelse af PTT er calciumiontiIsætningen nødvendig. Ved tilsætning af Ca++-ioner og phospholipid 2 5 opnås en S-formet kurve, hvis grundlinie anvendes til prokal-1 ikrei nbestemmeIsen.

Inkuberingstiden ligger ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen mellem 1 og 10 minutter, idet 4 til 6 minutter foretrækkes.

30

Ved for lang eller for kort inkuberingstid fås lavere prokal-1 ikrei nværdi.

Som plasma anvendes inden for den foreliggende opfindelses 3 5 rammer f.eks. citratplasma, oxalatplasma eller EDTA-plasma.

4

DK 164512 B

Når fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres i nærværelse af calciumioner, sker målingen i de første knap 30 sekunder efter tilsætningen af plasma, da ekstinktionen derefter stiger stejlt. Uden calciumiontiIsætning sker denne stejle stigning 5 ikke, og målingen kan også gennemføres i længere tidsinterval ler.

Dannelsen af kromofor ud fra det kromogene substrat følges fotometrisk. Dette kan ske både kinetisk ved bestemmelse af eks-^ tinktionsændringer pr. tidsenhed eller ved topunktskinetik og også ved slutpunktsmåling. I tilfælde af en slutpunktsmåling må farvedannelsesreaktionen afbrydes, hvilket fortrinsvis sker ved syretilsætning. Særligt egnet til afbrydelse er f.eks. eddikesyre eller citronsyre. I tilfælde af eddikesyre anvendes denne fortrinsvis i en koncentration fra 20 til 100 rumfangs-15 procent, i tilfælde af citronsyre i en koncentration fra 5 til 20 rumfangsprocent.

Følgende eksempel belyser opfindelsen nærmere i forbindelse med tegningen. På denne viser: 20 fig. 1 en grafisk afbilding af ekstinktionsdifferensen pr.

tidsenhed ved forskellige prokallikreinindhold i plasma , 25 fig. 2 en grafisk afbildning af ekstinktionen i forhold til reaktionstiden, hvor man kan se det S-formede kurveforløb, og fig. 3 en grafisk afbildning, der viser korrelationen for PTT-30 bestemmelsen ved en simultanbestemmelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse og en kendt PTT-prøve-metode.

35

DK 164512B

5

Eksempel

Simultanbestemmelse af prokal1 ikrein og PTT.

5 Reagens 1: puffer (Tris/HCl) 100 μιηοΐ/ml, pH 7,6 ellagsyre 0,5 Mg/ml cephalin fra kaninhjerne 0,04 mg/ml merthiolat 0,01 vægt%.

10

Reagens 2:

Tos-Gly-Pro-Arg-p-NA 0,376 pmol/ml

Ca++-ioner 40 μιηοΐ/ml.

15

Til 2,0 ml reagens 1 sættes 0,2 ml prøve {citratplasma), og der inkuberes ved 37eC i 5 minutter. Derefter tilsættes 0,2 ml reagens 2, der blandes og gennemføres straks fotometrisk bestemmelse ved 37°C og 405 nm, idet ΔΕ/min bestemmes inden for 20 25 sekunder til bestemmelse af prokal1ikrein. Derefter lader man reaktionen forløbe videre og gennemfører en "fixed absor-bance-måling". Herved måles tiden indtil opnåelse af en bestemt ekstinktionsdifferens i forhold til blindværdien (ΔΕ = 0. 2) . Denne tid er PTT-tiden. Ved forskellige prokal1 ikrein- 2 5 indhold i plasma opnås som resultater måleværdier ifølge fig.

1. Her betyder 100% prokallikrein i plasma prokallikrei nindholdet for et normal piasmaforråd.

3Q Fig. 2 viser det med en skriver aftegnede ekstinktionsforløb. (PTT-tid: 46,3 sekunder; prokallikrei n-reakt i on: 0,042 ΔΕ/min).

Fig. 3 viser korrelationen mellem PTT-bestemmelsen ifølge eksemplet og en konventionel PTT-prøve. (Clotting-metode, "Ac- 3 5 tin-Test"®, Merz und Dade). Herved ses det, at PTT-bestemmel-sen ikke forstyrres af prokal1ikreinprøven.

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til simultan fotometrisk bestemmelse af pro-5 kallikrein og den partielle thromboplastintid (PTT) i plasma, kendetegnet ved, at man inkuberer plasma med en overfladeaktivator valgt blandt ellagsyre, sulfatider og findelt siliciumoxid, derefter tilsætter et kromogent thrombin-substrat, måler den vundne ekstinktion, og dernæst måler den derfra frigjorte optisk bestemmelige gruppe i korte tidsinter-valler eller kontinuerligt og som mål for prokallikreinindholdet bestemmer stigningen af den lineære del af den kurve, der opnås ved opstilling af tiden i forhold til ekstinktionen og som mål for PTT bestemmer tiden indtil en forud fastlagt ekstinktion. 15

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man til prøveopløsningen også sætter Ca++-ioner.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at 20 man tilsætter 1 til 100 pmol pr. ml Ca++-ioner.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man tilsætter 0,08 til 2,1 pg ellagsyre pr. ml prøveopløsning.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at man tilsætter et phospholipid.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at 30 man som phospholipid tilsætter cephalin, sojabønnephospho1 i- pid, phosphatidylethanolamin eller phophatidylcholin.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at man tilsætter 4 til 200 pg cephalin pr. ml prøveopløsning. 35

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at man anvender et kromogent 7 DK 164512 B thrombinsubstrat fra gruppen Tos-Gly-pro"Ar9-PNA' H-D-CHA-Ala-Arg-pNA, H-D-CHG-G1y-Arg-pNA, h-D-CHG-AIa-Arg-pNA, H-D-CHG-but-Arg-pNA, i so-Bueo-GIy-Arg-pNA, naphthyl-SO2-Gly-Pro-Arg-pNA, H-D-Phe-Pip-Arg-pNA og Bz-Pro-Phe-Arg-pNA. 5

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at man inkuberer ved 20 til 400C, navnlig 30 til 37°C. 1Q

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at man inkuberer i 1 til 10 minutter. 15 20 25 30 35