JPH0675518B2

JPH0675518B2 - 血漿中のプロカリクレインを光度測定する方法

Info

Publication number: JPH0675518B2
Application number: JP61024263A
Authority: JP
Inventors: クヌート・バルトル; ヘルムート・リル
Original assignee: ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date: 1985-02-08
Filing date: 1986-02-07
Publication date: 1994-09-28
Anticipated expiration: 2009-09-28
Also published as: EP0190766A3; DK62186D0; NO169022C; ES8701842A1; DK164512B; NO169022B; CA1267598A; EP0190766B1; DK62186A; NO860200L; EP0190766A2; ES551764A0; DK164512C; JPS61185199A; DE3663684D1; DE3504405A1; ATE43641T1; US4732860A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野：本発明は、血漿中のプロカリクレインを光度測定する方
法に関する。

従来技術：プロカリクレインを測定することから、血液凝固系に関
して報告することができる。プロカリクレインの不足
は、凝血時間が延長されることを表わす。凝血時間が延
長される場合、プロカリクレインを測定することは、こ
の延長が第VIII因子、第IX因子の不足によつて惹起され
るのか或いはプロカリクレインの不足によつて惹起され
るのかということに関して解明を与えることができる。
プロカリクレインの測定により第VIII因子又第IX因子の
不足の問題が明らかになつた場合には、このことは、重
大な疾病を暗示する。更に、例えばシヨツクのような特
定の他の疾病状態の場合にもプロカリクレイン量の変化
が確認される。

血漿中のプロカリクレインからのカリクレイン形成は、
次の反応図により進行する：プロカリクレインを測定する公知方法は、ベルクマイヤ
ー（H.U.Bergmeyer）著“メソツズ・オブ・エンザイマ
テイツク・アナリシス（Methods of Enzymatic Analysi
s）”、第３版、第Ｖ巻、第412/413頁に記載されてい
る。それによれば、凝固実験における常用の測定に対し
て除外される、若干の極めて複雑で時間的浪費である方
法とともに、第XII因子を硫酸デキストランで活性化し
た後に形成されるカリクレインを色原体基質により測定
することは、公知である。しかし、この方法は、例えば
α_１−抗トリプシン及びC₁−不活性体のような血漿阻止
剤の測定結果に対する影響を回避するために、０℃でプ
ロカリクレインをカリクレインに変換する恒温保持を実
施しなければならないという欠点を有する。更に、０℃
での恒温保持は、この方法を自動化する可能性を重大な
ことに排除する。

発明が解決しようとする問題点：本発明の課題は、前記欠点を示さず、殊に標準温度で実
施することができる、プロカリクレインを測定するため
の簡単で迅速な方法を得ることである。

問題点を解決するための手段：この課題は、本発明によれば、血漿を接触活性化剤と一
緒に20℃〜40℃で恒温保持し、得られる吸光度を測定
し、次に色原体トロンビン基質を添加し、吸光度をｔ＝
０の時点で測定し、次に基質から放出される光学測定可
能な基を短い時間間隔で又は連続的に測定し、かつ時間
を吸光度に対してプロツトした際に得られる曲線の直線
部分の上昇をプロカリクレイン含有量に対する尺度とし
て測定することを特徴とする、血漿中のプロカリクレイ
ンを光度測定する方法によつて解決される。

接触活性化剤は、有利にエラグ酸、スルフアチド（特に
脳物質から）及び例えばアエロジル（Aerosil）の商
標、デグツサ社（Degussa）、西ドイツ、で市販されて
いるような微粒状二酸化珪素から選択される。硫酸デキ
ストランは不適当である。特に好ましいのは、試験溶液
1ml当り0.08〜2.1μｇの濃度のエラグ酸である。最適な
結果は、1ml当りエラグ酸0.40〜0.45μｇの濃度で得ら
れる。本明細書中で前記の濃度の記載及び全ての以下の
濃度の記載は、試験における最終濃度に対するものであ
る。

意外なことに、本発明方法の場合、標準温度、有利30〜
70℃で恒温保持することができる。

色原体トロンビン基質としては、このために市販のペプ
チドを使用することができ、このペプチドは、酵素作用
下で基質から離脱され、次いで光学測定することができ
る色原体基、殊にパラニトロアニリン基又はその誘導体
を含有する。本発明の範囲内で使用するのに好ましい色
原体トロンビン基質は、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA、H-D-CHA
-Ala-Arg-pNA、H-D-CHG-Gly-Arg-pNA、H-D-CHG-Ala-Arg
-pNA、H-D-CHG-ブト‐Arg-pNA、Iso-Buco-Gly-Arg-pN
A、ナフチル‐SO₂‐Gly-Pro-Arg-pNA、H-D-Phe-Pip-Arg
-pNA及びBz-Pro-Phe-Arg-pNAである。

上記の記号ないし略号は、次の意味を有している： Gly＝グリシン Pro＝プロリン Arg＝アルギニン Ala＝アラニンブト＝α‐アミノブチリル Pip＝ピペコリン酸 Phe＝フェニルアラニン Tos＝p-トルエンスルホニル（＝トシル） CHA＝β‐シクロヘキシルアラニン CHG＝シクロヘキシルグリシン iso-Buco＝イソブチリルオキシカルボニルナフチル‐SO₂＝ナフチルスルホニル Bz＝ベンゾイル H-D＝Ｄ配置の場合に保護されていないアミノ酸色原体トロンビン基質の濃度は、有利にそれぞれの基質
のミハエリス定数に応じて0.01〜２ミリモル/lである。
基質としては、約0.2ミリモル/lの濃度でのTos-Gly-Pro
-Arg-p-ニトロアニリン及び0.7〜0.8ミリモル/lの濃度
でのBz-Pro-Phe-Arg-pNAが特に好ましい。

本発明方法の１つの特殊な実施態様によれば、この方法
は、プロカリクレインと、部分的トロンボプラスチン時
間（PTTないしはPTZ）とを同時に測定することができる
ように実施することができる。この場合には、PTT-測定
にも十分に敏感である基質、例えば前記Tos-Gly-Pro-Ar
g-p-ニトロアニリンを使用しなければならない。この種
の同時測定の場合、色原体トロンビン基質の濃度は減少
させることができ、この場合には、一般に約0.02〜0.04
ミリモル/lである。濃度を減少させることは、測定技術
的理由により、Ｓ字形曲線を検出する際に記録計器の振
れが大きくなりすぎないようにするために行なわれる。

本発明方法は、有利に動物性、植物性又は合成燐脂質の
存在で実施される。適当な燐脂質の例は、ケフアリン、
大豆‐燐脂質、ホスフアチジルエタノールアミン及びホ
スフアチジルコリンである。しかし、多数の他の燐脂質
も同様に適当であるが、その数が多すぎるために本明細
書中に詳細に記載することはできない。特に好ましいの
は、ケフアリンである。PTTを同時測定する場合には、
燐脂質を添加することが必要である。

更に、本発明方法は、カルシウムイオンの存在で実施す
るのが有利である。それというのも、カルシウムの添加
は、本方法の感度上昇を、単位時間当りの吸光度差の増
大によつて生ぜしめるからである。Ca²⁺‐イオン1ml当
り25〜40μモルの濃度が好ましい。PTTを同時測定する
場合には、カルシウムイオンを添加することが必要であ
る。Ca²⁺‐イオン及びホスホリピドを添加する場合に
は、Ｓ字形曲線が得られ、その基線、プロカリクレイン
測定のために使用される。

恒温保持時間は、本発明方法の場合、１〜10分間の間に
あり、この場合には、４〜６分間が好ましい。長すぎる
か又は短かすぎる恒温保持時間の場合には、低いプロカ
リクレイン値が得られる。

血漿としては、本発明の範囲内で、例えばクエン酸塩血
漿、蓚酸塩血漿又はEDTA-血漿が使用される。

本発明方法をカルシウムイオンの存在で実施する場合に
は、測定は、血漿を添加してから正確に30秒後に行なわ
れる。それというのも、引続き吸光度は急激に上昇する
からである。カルシウムイオンを添加しないと、この急
激な上昇は行なわれず、測定は、長い時間間隔で実施す
ることもできる。

色原体基質からの発色団の形成は、光度測定により追跡
される。このことは、動的に単位時間当りの吸光度の変
化を測定することによつてか又は２点運動学によつて行
なうこともできるし、最終点測定によつて行なうことも
できる。最終点測定の場合には、色形成反応を停止させ
なければならず、このことは、有利に酸を添加すること
によつて行なわれる。特に停止させるのに適当なのは、
例えば酢酸又はクエン酸である。酢酸の場合、これは、
有利に20〜100容量％の濃度で使用され、クエン酸の場
合には、５〜20容量％の濃度で使用される。

実施例：次に、本発明を実施例につき添付図面と関連させて詳説
する。

例１プロカリクレインの測定試薬1: 緩衝液：（トリス（Tris）/HCl） 100μモル/ml、pH7.6 エラグ酸 0.5μg/ml 家兎の脳からのケフアリン 0.04mg/ml メルチオラート 0.01重量％試薬2: Tos-Gly-Pro-Arg-p-NA 0.376μモル/ml 試薬1 2.0mlに試料0.2ml（クエン酸塩血漿）を添加し、
37℃で５分間恒温保持する。引続き、試薬2 0.2mlを添
加し、混合し、直ちに光度測定を37℃及び405nmで実施
する。血漿中のプロカリクレイン含有量が異なる場合、
第１図による測定値が結果として得られる。この場合、
血漿中の100％プロカリクレインは標準血漿留りのプロ
カリクレイン含有量を意味する。

例２ Ca²⁺‐イオンの添加試薬1 2.0ml（例１、±ケフアリン）に試料0.2ml（クエ
ン酸塩血漿）を添加し、37℃で５分間恒温保持する。引
続き、試薬0.2ml（Tos-Gly-Pro-Arg-pNA 0.376μモル/m
l、Ca²⁺を用いるか又はCa²⁺なし、40μモル/ml）を添加
する。

測定を例１の記載と同様にして実施する。

Ca²⁺、イオンを添加する場合には、ΔE/minは、最初の2
5秒間で測定しなければならない。

第Ｉ表は、試験の感度に対するCa²⁺‐イオンないしはケ
フアリンの影響を示す。

例３二酸化珪素の存在でのプロカリクレインの測定試薬１（例１）中にエラグ酸の代りにアエロジル（Aero
sil）200（1mg/ml）を添加する。Ca²⁺‐イオン40μモ
ル/mlの存在でΔE/min＝0.04が得られる。

例４プロカリクレインとPTTの同時測定試薬1:例１と同様試薬2:Tos-Gly-Pro-Arg-p-NA 0.376μモル/ml Ca²⁺‐イオン 40μモル/ml 試験の実施は、例１と同様に行なわれ、この場合には、
プロカリクレインを測定するためにΔE/minを25秒間で
測定する。その後にこの反応をさらに進行させ、“固定
吸光度‐測定”を実施する。この場合には、空試験値に
対する一定の吸光度差（ΔＥ＝0.2）が達成されるまで
の時間を測定する。この時間はPTT-時間である。第２図
は、記録計器で記録された吸光度曲線を示す。（PTT-時
間:46.3秒間：プロカリクレイン反応:0.042ΔE/min）。

純粋なカリクレイン基質は、第２図に記載したように反
応の線形部分のみを生じる。更に、引き続く曲線のＳ字
形部分は、トロンビンの形成に遡及することができる。
従って、この方法の場合には、カリクレインに対して明
らかな非特異性を有するトロンビン基質が使用される。
Bz-Pro-Phe-Arg-pNAは、良好なカリクレイン基質であ
り、このことは、トロンビンに対してなお受け入れ可能
な感度を有していることを意味する。

第３図は、例４によるPTT-測定と、これまでのPTT-試験
との相関関係を示す。（クロツテイング‐法（Clotting
-Methode）、アクテイン‐試験（Actin-Test）、メル
ツ（Merz）及びダーデ（Dade））。この場合、PTT-測定
は、プロカリクレイン試験によつて破壊されないことが
判明する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、血漿中のプロカリクレイン含有量が異なる場
合の単位時間当りの吸光度差を示す線図、第２図は、Ｓ
字形曲線を認めることができる、吸光度を反応時間に対
してプロツトした線図、かつ第３図は、本発明によるPT
T-試験法と、公知のPTT-試験法とを同時に試験した場合
のPTT-測定の相関関係を示す線図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭57−50923（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−29948（ＪＰ，Ａ) 特公昭57−2320（ＪＰ，Ｂ２) 金井泉原著、金井正光編著「臨床検査法提要（改訂第29版）」金原出版（昭和58− ６−30）Ｐ．332−335

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】血漿中のプロカリクレインを光度測定する
方法において、血漿を接触活性化剤と一緒に20℃〜40℃
で恒温保持し、得られる吸光度を測定し、次に色原体ト
ロンビン基質を添加し、吸光度をｔ＝０の時点で測定
し、次に基質から放出される光学測定可能な基を短い時
間間隔をもって又は連続的に測定し、時間を吸光度に対
してプロットした際に得られる曲線の直線部分の上昇を
プロカリクレイン含有量に対する尺度として測定するこ
とを特徴とする、結晶中のプロカリクレインを光度測定
する方法。
【請求項２】試験溶液にCa²⁺−イオンをも添加する、特
許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】Ca²⁺−イオン１〜100μモル/mlを添加す
る、特許請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】エラグ酸、スルファチド又は微粒状二酸化
珪素を接触活性化剤として使用する、特許請求の範囲第
１項から第３項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】試験溶液1ml当りエラグ酸0.08〜2.1μｇを
添加する、特許請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】燐脂質を添加する、特許請求の範囲第１項
から第５項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】ケファリン、大豆燐脂質、ホスファチジル
エタノールアミン又はホスファチジルコリンを燐脂質と
して添加する、特許請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項８】試験溶液1ml当りケファリン４〜200μｇを
添加する、特許請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項９】Tos-Gly-Pro-Arg-pNA、H-D-CHA-Ala-Arg-p
NA、H-D-CHG-Gly-Arg-pNA、H-D-CHG-Ala-Arg-pNA、H-D-
CHG-ブト‐Arg-pNA、Iso-Buco-Gly-Arg-pNA、ナフチル
‐SO₂‐Gly-Pro-Arg-pNA、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA及びBz-
Pro-Phe-Arg-pNAの群からの色原体トロンビン基質を使
用する、特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項１０】有利に30〜37℃で恒温保持する、特許請
求の範囲第１項から第９項までのいずれか１項に記載の
方法。
【請求項１１】１〜10分間恒温保持する、特許請求の範
囲第１項から第10項までのいずれか１項に記載の方法。