MX2013013867A - Ensayo de union a elastasa unida a una fase solida para la medicion de la actividad de alfa-antitripsina. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiera a un método para la medición de un inhibidor de alfa-proteinasa activa (AIPI) en una muestra, que comprende los pasos de unir elastasa a un soporte sólido, dejar que el AlPl contenido en la muestra se una a la elastasa unida a la fase sólida, y detectar el AIPI unido a la fase sólida con un reactivo de detección.

Description

ENSAYO PE U NION A ELASTASA UNIDA A UNA FASE SOLIDA PARA LA MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE ALFA-ANTITRIPSINA Campo de la invención La presente invención se refiere a un método par a la medición de un inhibidor de alfa^proteinasa activo (A1 PI) en una muestra, comprendiendo los pasos de unir elastasa a un soporte sólido, dejando el A1 PI contenido en la muestra unirse a la elastasa unida a la fase sólida, y detectar A1 PI unida a fase sólida con un reactivo de detección.

Antecedentes de la invención El inhibidor de alfai-proteinasa humana (A1 PI ; también: alfa- 1 -antitripsina) circula en niveles de suero de 20 a 48 µ ?. La glicoproteína de 51 kDa consiste de 394 aminoácidos con tres N-glicanos tipo complejo unidos a asparaginas 46, 83 y 247. La ramificación y truncamiento de N-glicano diferentes del extremo N resultan en un patrón característico sobre focalización isoeléctrica. Además, una forma truncada C-terminal de A1 PI , la cual no tiene la lisina C-terminal después del corte por carboxipeptidasas básicas fue descrita recientemente. A1 PI es un miembro de la superfamilia de serpinas (serine pjoteinase inhibitors, (inhibidores de serina proteinasa) por sus siglas en inglés). Su actividad anti-proteasa requiere el sitio activo Met358-Ser359. Este sitio ocupa un lazo expuesto sobre la molécula y une fuertemente la región activa de neutrofilo elastasa de otras serina proteasas incluyendo tripsina, catepsina G, plasmina, trombina y calicreína de tej ido. A1 PI ejerce una función inactivadora preferencial para neutrófilo elastasa debido a que la constante de velocidad de asociación para el complejo de A1 Pl/neutrófilo elastasa es 25 veces mayor que aquéllas medidas para otras serina proteasas. A1 PI se difunde del plasma hacia el pulmón , donde es responsable de más de 90% de la protección anti-elastasa del tracto respiratorio inferior. La deficiencia de A1 PI , que conduce a concentraciones de plasma por debajo de 20 µ ? , deja el pulmón pobremente protegido y altamente vulnerable a destrucción de pulmón progresiva. La terapia es dirigida hacia el reemplazo o aumento de A1 PI de plasma.

La medición de actividad inhibidora de neutrófilo elastasa de A1 PI se hizo básicamente posible desde 1 974 cuando la síntesis del substrato cromogénico N-succinil-L-alanil-L-alanil-L-alanil-p-nitroanilida (Suc(Ala)3-pNA) fue descrita. Este substrato tiene una alta selectividad para elastasa. La tripsina y quimotripsina, por ejemplo, tienen velocidades de hidrólisis de 0.007 y 0.014, respectivamente, cuando se mide a la misma concentración que la elastasa y ajusfando la velocidad obtenida con elastasa a 100. A pH 8.0 y 25°C, el substrato Suc-(Ala)3-pNA tiene las constantes cinéticas Km y Kc at de 1 .1 5 mM y 18.6 s"1 para elastasa, respectivamente. Su selectividad y buena solubilidad en agua fueron la base para un ensayo de inhibición de elastasa de A1 PI como se describió primero en 1981 . Este ensayo se basó en la medición de actividad de elastasa residual de muestras de A1 PI , las cuales han sido incubadas con un exceso de elastasa. Brevemente, las muestras fueron incubadas con una cantidad definida de elastasa porcina durante un tiempo definido antes de que se agregue el substrato cromogénico. La liberación de pNA fue monitoreada fotométricamente y se permitió calcular la actividad residual de elastasa, la cual por sí misma es inversamente proporcional a la actividad de A1 PI de la muestra. Formatos de ensayo estándares usando esta aproximación cromogénica tienen un límite relativamente alto de cuantíficación de aproximadamente 3 pg/ml de A1 PI activo. Aunque la sensibilidad de tales formatos de ensayo puede incrementarse al usar substratos fluorogénicos para la medición de elastasa residual, todavía están limitados por el hecho de que uno de los compañeros de reacción en exceso, es decir, elastasa, y no el producto de reacción es medido.

Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de proporcionar un novedoso ensayo para la determinación de actividad de A1 PI en una muestra teniendo sensibilidad mejorada.

Esta necesidad es satisfecha al proporcionar las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones Breve descripción de la invención La presente invención describe el uso de elastasa unida a fase sólida para medir la actividad de inhibición anti-elastasa de A1 PI en una muestra. Las cantidades de complejo de elastasa-A1 Pl formadas son entonces medidas directamente al detectar A1 PI unida a placa, en complejo con elastasa, con un reactivo de detección en lugar de medir la actividad de elastasa residual. Este modo de detección aumenta ventajosamente la sensibilidad del ensayo por un factor de 1 ,000. La selectividad superior del ensayo depende de la especificidad de la formación de complejo elastasa-A1 Pl , la cual no cambia después de unir elastasa a un soporte sólido, y sobre la especificad del reactivo de detección usado.

En particular, la presente invención se refiere a un método para la medición de un inhibidor de alfa!-proteinasa activo (A1 PI) en una muestra, comprendiendo los pasos de unir elastasa a una fase sólida, incubar la fase sólida con la m uestra, incubar la fase sólida con un reactivo de detección que se une específicamente a A1 PI , determinar la cantidad de reactivo de detección unido a la fase sólida, y determinar la cantidad de A1 PI activo en la muestra.

Descripción detallada de la invención En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para la medición de inhibidor de alfaTproteinasa activo (A1 PI) en una muestra, comprendiendo los pasos de (a) unir elastasa a una fase sólida; (b) incubar la fase sólida con la muestra; (c) incubar la fase sólida con una unión de reactivo de detección a A1 PI ; (d) determinar la cantidad de reactivo de detección unida a la fase sólida; y (e) determinar la cantidad de A1 PI activo en la muestra.

En este contexto, "medición de A1 PI activo en una muestra" como se usa en la presente se refiere a la determinación de la cantidad y/o la concentración de A1 PI activo que está contenido en na muestra. Además, "A1 PI activo" como se usa en la presente, se refiere a A1 PI que es capaz de ejercer su función natural, es decir, unir e inactivar elastasa y otras serina proteasas.

La elastasa usada en el método de la presente invención no está particularmente limitada y puede ser, por ejemplo, elastasa humana o porcina. Medios para unir elastasa a una fase sólida son conocidos en la técnica y no son particularmente limitados. Incluyen, por ejemplo, la incubación del soporte sólido con elastasa en un amortiguador adecuado, por ejem plo, solución salina amortiguada con fosfato (PBS), durante un lapso apropiado, por ejemplo, durante la noche, a una temperatura apropiada, por ejemplo, +4°C. Amortiguadores adecuados adicionales y parámetros de incubación son conocidos en la técnica.

La fase sólida sobre la cual el método de la presente invención es realizado no está particularmente limitada. Más aún, las fases sólidas adecuadas son conocidas en la técnica. En una modalidad preferida, la fase sólida es una microplaca, por ejemplo, una microplaca teniendo una superficie absorbente, tal como por ejemplo, una placa NUNCMR Maxisorp.

En el contexto de la presente invención, la elastasa puede ser unida a la fase sólida mediante adsorción, donde es retenida mediante fuerzas hidrofóbicas . De manera alternativa, la superficie de la fase sólida puede ser activada mediante procesos químicos que provocan enlace covalente de la elastasa al soporte.

Si la fase sólida es silicio o vidrio, la superficie debe ser activada generalmente antes de unir la elastasa. Los compuestos de silano activados, tales como trietoxi amino propil silano, trietoxi vinil silano, y (3-mercapto-propil)-trimetoxi silano pueden usarse para introducir grupos reactivos, tales como grupos amino, vinilo y tiol, respectivamente. Tales superficies activadas pueden ser usadas para enlazar la elastasa directamente (en los casos de amino o tiol), o la superficie activada puede hacerse reaccionar adicionalmente con enlazadores tales como glutaraldeh ído, bis(succinimidil)suberato, SPPD (succinimidil 3-[2-piridilditio]propionato), SMCC (succinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1 -carboxilato) , SLAB ([4-yodoacetiljaminobenzoato de succinimidilo), y SMPB (4-[1 -maleimidofenil]butirato de succinimidilo) para separar la elastasa de la superficie. Grupos vinilo pueden ser oxidados para proporcionar un medio para unión covalente. Los grupos vinilo también pueden ser usados como u n ancla para la polimerización de varios polímeros, tal como ácido poli-acrílico, el cual puede proporcionar múltiples puntos de unión para elastasa . Grupos amino pueden hacerse reaccionar con dextranos oxidados de varios pesos moleculares para proporcionar enlazadores hidrofílicos de diferente tamaño y capacidad. Ejemplos de dextranos oxidables incluyen Dextran T-40 (peso molecular 40,000 daltones), Dextran T-1 10 (peso molecular 1 10, 000 daltones), Dextran T-500 (peso molecular 500,000 daltones), Dexran T-2M (peso molecular 2,000,000 daltones), o Ficoll (peso molecular 70, 000 daltones). Adicionalmente, pueden usarse interacciones de polielectrolito para inmovilizar elastasa sobre la fase sólida .

La fase sólida puede ser cualquier material adecuado con suficiente afinidad de superficie para unir elastasa. Soportes sólidos útiles incluyen: carbohidratos poliméricos naturales y sus derivados sintéticamente modificados, reticulados o substituidos, tales como agar, agarosa, ácido algínico reticulado, gomas guar substituidas y reticuladas, ésteres de celulosa, especialmente con ácido nítrico y ácidos carboxilicos, ésteres de celulosa mezclados y éteres de celulosa; polímeros naturales conteniendo nitrógeno, tales como proteínas y derivados, incluyendo gelatinas reticuladas o modificadas; polímeros de hidrocarburo naturales, tales como proteínas y derivados, incluyendo gelatinas reticuladas o modificadas; polímeros de hidrocarburos naturales, tales como látex y hule; polímeros sintéticos, tales como polímeros de vinilo, incluyendo polietileno, polipropileno, poliestireno, polivinilcloruro, polivinilacetato y sus derivados parcialmente hidrolizados, poliacrilamidas, polimetacrilatos, copolímeros y terpolímeros de los policondensados anteriores, tales como poliésteres, poliamidas y otros polímeros, tales como poliuretanos o poliepóxidos; materiales inorgánicos, tales como sulfatos o carbonatos de metales alcalino térreos y magnesio, incluyendo sulfato de bario, sulfato de calcio, carbonato de calcio, silicatos de metales alcalinos y alcalino-térreos, aluminio y magnesio; y óxidos o hidratos de aluminio o silicio, tales como arcillas, alúmina , talco, caolín , zeolita, gel de sílice o vidrio (estos materiales pueden ser usados como filtros con los materiales poliméricos anteriores); y mezclas o copol ímeros de las clases anteriores, tales como copol ímeros de injerto obtenidos al inicializar la polimerización de polímeros sintéticos en un polímero natural preexistente. La nitrocelulosa y nylon también pueden ser usados. Todos estos materiales pueden ser usados en formas adecuadas, tales como películas, láminas, tubos, particulados o placas, o pueden ser recubiertos sobre, unidos, o laminados a portadores inertes apropiados, tales como papel, vidrio, películas plásticas, géneros o similares.

De manera alternativa, la fase sólida puede constituir micropartículas. Las micropartículas apropiadas pueden ser seleccionadas por alguien experto en la técnica a partir de cualquier tipo adecuado de material particulado e incluyen aquéllos compuestos de poliestireno, polimetacrilato, polipropileno, látex, politetrafluoroetileno, poliacrilonitrilo, policarbonato o materiales similares. Además, las micropartículas pueden ser micropartículas magnéticas o paramagnéticas, con el fin de facilitar la manipulación de la micropartícula dentro de un campo magnético.

Las micropartículas pueden ser suspendidas en la mezcla de reactivos y muestra o pueden ser retenidas e inmovilizadas por un material de soporte. En el último caso, las micropartículas sobre o en el material de soporte no son capaces de movimiento substancial a posiciones en otra parte dentro del material de soporte. De manera alternativa, las micropartículas pueden ser separadas de la suspensión en la mezcla de reactivos y muestra mediante sedimentación o centrifugación. Cuando las micropartículas son magnéticas o paramagnéticas , las micropartículas pueden ser separadas de suspensión en la mezcla de reactivos y muestra mediante un campo magnético.

La incubación de la fase sólida con la muestra de acuerdo con la presente invención, puede ser realizada a temperaturas adecuadas durante un lapso adecuado, por ejemplo, durante 60 minutos a temperatura ambiente. Además, combinaciones de tiempo/temperatura adecuadas son conocidas para una persona experta en la técnica.

En una modalidad preferida, la fase sólida es bloqueada antes de incubar la fase sólida con la muestra en el paso (b) , con el fin de disminuir la adsorción no específica de A1 PI u otros componentes de muestra a la fase sólida. Agentes de bloqueo adecuados son conocidos en la técnica y no están particularmente limitados. Incluyen, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA), BSA metilada, albúmina de suero humano , caseína, caseína hidrolizada, lecha deshidratada descremada, gelatina o leche en polvo en amortiguadores adecuados. Un amortiguador de bloque adecuado es por ejemplo, PBS conteniendo 0.05% de polisorbato 20 y 1 0 mg/ml de BSA. El bloqueo puede ser realizado a temperaturas adecuadas durante un lapso adecuado, por ejemplo, durante 60 minutos a temperatura ambiente. Además, combinaciones de tiempo/temperatura adecuadas son conocidas para una persona experta en la técnica.

En otra modalidad preferida, la muestra es diluida antes de la incubación con la fase sólida en el paso (b). Las proporciones de dilución adecuadas dependen de la concentración de A1 PI esperada en la muestra y son conocidas para una persona experta en la técnica. Además, amortiguadores de dilución adecuados son conocidos en la técnica y no están particularmente limitados. Incluyen, por ejemplo, PBS.

Los reactivos de detección adecuados que pueden ser usados en el método de la presente invención son conocidos en la técnica y no están particularmente limitados. Incluyen, por ejemplo, compuestos, como posiciones o moléculas capaces de unirse de manera específica o substancialmente específica (es decir, con reactividad cruzada limitada) a un epitope de A1 PI . Estos agentes (o ligandos) son normalmente anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, o derivados o análagos de los mismos, pero también incluyen, sin limitación: fragmentos Fv; fragmentos Fv de cadena simple (scFv); fragmentos Fab'; fragmentos F(ab')2; anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpos; anticuerpos camelizados y fragmentos de anticuerpos; anticuerpos quiméricos; y versiones multivalentes de los anteriores: los agentes de captura multivalentes también pueden ser usados, según sea apropiado, incluyendo, sin limitación; anticuerpos monoespecíficos o biespecíficos; tales como fragmentos Fv estabi lizados de disulfuro. Estos agentes también incluyen , sin limitación, aptámeros, péptidos sintéticos, moléculas de unión, ácidos nucleicos, etc. y son como se conoce en la técnica. Etiquetas adecuadas para los reactivos de detección a ser usados en el método de la presente invención, no son particularmente limitadas y son conocidas en la técnica. I ncluyen, por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina, biotina y moléculas fluorescentes. En una modalidad preferida, el reactivo de detección es un anticuerpo A1 PI anti-humano conjugado con peroxidasa.

La incubación de la fase sólida con un reactivo de detección puede realizarse a temperaturas adecuadas durante un lapso adecuado, por ejemplo, durante 60 minutos a temperatura ambiente. Combinaciones de tiempo/temperatura adecuadas adicionales son conocidas para una persona experta en la técnica. Además, las proporciones de dilución adecuadas y amortiguadores para diluir el reactivo de detección antes de la incubación , son conocidos en la técnica y pueden ser determinados fácilmente.

En una modalidad preferida, la fase sólida es lavada antes de y después de incubar la fase sólida con el reactivo de detección en el paso (c). Amortiguadores de lavado adecuados son conocidos en la técnica y no son particularmente limitados. Incluyen, por ejemplo, PBS conteniendo 0.05% de polisorbato 20.

Medios para determinar la cantidad de reactivo de detección unida a la fase sólida son conocidos en la técnica y no son particularmente limitados. En el caso de conjugados de anticuerpo etiquetados con peroxidasa, incluyen , por ejemplo, la incubación de la fase sólida con un substrato de peroxidasa cromogénico adecuado, por ejemplo, el reactivo de trimetilbencidina peroxidasa listo para usarse SureBlue (KPL), a una temperatura adecuada, por ejemplo, a temperatura ambiente, durante una cantidad suficiente de tiempo para permitir la formación de color. Subsecuentemente, la formación de color puede detenerse, por ejemplo, mediante adición de ácido sulfúrico 1 .5 M , y la cantidad de color formado determinada, por ejemplo, en un lector ELISA a 450 nm. Substratos cromogénicos adecuados adicionales, tiempos y temperaturas de incubación, y medios para medir la cantidad de color formado son conocidos para una persona experta en la técnica. El sistema de amplificación comúnmente usado en la técnica, incluyendo el sistema de biotina-avidina, también puede ser em pleado en el contexto de la presente invención.

Finalmente, medios para determinar la cantidad de A1 PI activo en la muestra son conocidos en la técnica y no son particularmente limitados. Incluyen, por ejemplo, la correlación de datos de muestra a una curva de calibración adecuada, que es establecida, por ejemplo, usando concentraciones de A1 PI conocidas.

Las figuras muestran: La Figura 1 muestra una curva de calibración de 6 puntos representativa obtenida como el promedio de tres curvas preparadas en un día.

La Figura 2 muestra las curvas de dosis-respuesta para dos preparaciones A1 PI con diferente pureza.

La Figura 3 muestra una electroforesis de gel de poliacrilamida de una preparación de A1 PI agregada.

La Figura 4 muestra una cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento de una preparación de A1 PI agregada.

La Figura 5 muestra la correlación entre los niveles de monómero de A1 PI , determinada con HP-SEC, y los resultados de dos ensayos de actividad diferentes medidos para las muestras con diferentes concentraciones de agregados de A1 PI .

La Figura 6 muestra la curva de regresión obtenido al graficar los resultados de dos ensayos de actividad diferentes.

La Figura 7 muestra las curvas de concentración-respuesta obtenidas con el ensayo de actividad de A1 PI de elastasa unida a fase sólida para un concentrado de A1 PI purificado, una preparación de plasma de referencia humana y una preparación de A1 PI oxidado.

La Figura 8 muestra formación de complejo de elastasa con inhibidores de proteína de plasma. La inserción da las intensidades de señal relativas determinadas para los diferentes inhibidores en las cuatro diluciones dadas como porcentaje de aquélla medida para A1 PI .

La presente invención será ilustrada adicionalmente en los siguientes ejemplos sin alguna limitación a los mismos.

Ejemplos Ejemplo 1 : Preparación y características de una curva de calibración de ensayo de 6 puntos La curva de calibración de ensayo que consiste de seis diluciones seriales 1 + 1 de una preparación estándar de trabajo cubrió un rango de concentración de actividad de A1 PI desde 1 1 0 ng7ml hasta 3.5 ng/ml. La curva fue obtenida como sigue: Elastasa porcina (Roche, 1 1 027905001 ; 50 mg/ml) se diluyó a 50 g/ml con solución salina amortiguada con fosfato (PBS; 8 g/l NaCI; 0.2 g/l KCI; 0.2 g/l KH2P04; 1 .26 g7L Na2H P04 x 2 H20; pH natural) y se incubó con las cavidades de una placa NUNC axisorp F96 a 4°C durante la noche (1 00 µ?/cavidad). La placa fue lavada entonces con PBS conteniendo 0.05% Polisorbato 20 (amortiguador de lavado; WB) y se inactivo mediante incubación con 200 µ?/cavidad de amortiguador de lavado conteniendo 10 mg/ml de albúmina de suero bovino (amortiguador de dilución; DB) a 37°C durante 60 min. 1 00 µ?/cavidad de amortiguador de dilución se adicionaron a las cavidades y el estándar pre-diluido, control o muestras fueron cargados y diluidos seriaimente directamente en la placa. Las cavidades B 1 1 y B 12 contenían solo amortiguador de dilución y sirvieron como blancos. La placa fue incubada entonces a temperatura ambiente (RT; 20 a 25°C) durante 60 min y se lavaron posteriormente. Entonces, se aplicó peroxidasa de A1 PI anti-humana de borrego (El sitio de unión), diluida 1 /1 ,000 en DB, a las cavidades a 100 µ?/cavidad, se incubó a RT durante 60 min y se removió mediante un paso de lavado. La placa lavada fue entonces incubada con el reactivo de trimetilbencidina peroxidasa listo para usarse SureBlue (KPL; 100 µ?/cavidad) y se incubó a RT hasta el desarrollo de color apropiado. La reacción se detuvo entonces con 1 00 µ?/cavidad de ácido sulfúrico 1 .5 m. Dentro de 60 min, la placa fue medida entonces en un lector ELISA a 450 nm con una medición de referencia a 620 nm.

La preparación estándar usada para la calibración de ensayo fue una preparación de A1 PI purificada, calibrada con un ensayo de inhibición de elastasa cromogénica validado contra el estándar WHO real para A 1 PI . Así la concentración asignada a este estándar de trabajo fue 22.1 mg de A1 PI activo por mi. La serie de dilución final, preparada por duplicado, consistió de las seis diluciones 1 /200,000 a 1 /6,400,000, resultando en un rango de actividad de A1 PI desde 1 10 ng/ml hasta 3.5 ng/ml. La curva de calibración fue obtenida finalmente al usar un ajuste log-log de las densidades ópticas corregidas con blanco (ODs) medidas y las concentraciones de actividad de A1 PI de los calibradores de ensayo.

La Figura 1 muestra un curva de calibración de 6 puntos representativa obtenida como el promedio de tres curvas preparadas en el día uno. Las características de curva de calibración, inclinación, intersección en eje Y y coeficiente de correlación, fueron muy similares para las tres curvas promediadas. Esto también fue cierto para la exactitud y precisión de las curvas. Las curvas de calibración cumplieron los requerimientos aceptados para exactitud, precisión y linealidad y fueron consideradas así como apropiadas para extrapolar muestras. El rango de relación lineal entre la señal y concentración de actividad de A1 PI bajó a 3.5 ng/ml. De esta manera, el ensayo fue 1000 veces más sensible que el ensayo de inhibición de elastasa estándar cromogénico que se basa en la medición de la actividad de elastasa residual.

Ejemplo 2: Medición de la actividad de A1 PI de plasma humano El plasma contiene otros diversos inhibidores de proteinasa además de A1 PI , los cuales podrían interactuar teóricamente con elastasa. La constante de asociación para el complejo de A1 PI-elastasa, sin embargo, ha sido reportada como aproximadamente 25 veces más que aquéllos medidos para otros inhibidores de proteinasa. Así, A1 PI ejerce un efecto inhibidor preferencial para elastasa.

No obstante, las curvas de dosis-respuesta para una preparación de A1 PI purificada, usadas como un estándar de ensayo, y una preparación de plasma de referencia humano fueron comparadas. La última preparación fue medida en una serie de diluciones comprendiendo las seis diluciones seriales 1 + 1 1/20,000 hasta 1 /640,000. La Figura 2 muestra las curvas de dosis-respuesta para las dos preparaciones con diferente pureza. Las dos curvas de dosis-respuesta fueron muy similares como se muestra por sus inclinaciones, las cuales difirieron por menos de 0.5%. Este hallazgo demuestra que inmovilizar elastasa al soporte sólido no cambió su selectividad para unir A1 PI .

Ejemplo 3: Medición de muestras conteniendo A1 PI agregado Una preparación de A1 PI agregado fue obtenida al calentar una solución de A1 PI purificado con una concentración de 20 mg/ml a 60°C durante 15 min. Esta solución fue mezclada entonces con A1 PI natural en diferentes proporciones. Varias mezclas conteniendo 10 a 90% de A1 PI agregado con calor en A1 PI natural se prepararon y analizaron juntas con el A1 PI natural y el agregado con calor mediante electroforesis de gel de poliacrilamida natural (PAGE; cf. Figura 3) y mediante cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (HP-SEC; cf. Figura 4).

Los números en la parte superior del gel mostrados en la Figura 3 que indican las diferentes muestras, dan los niveles relativos de A1 PI agregado con calor en las mezclas como un porcentaje, mientras que la estrella marca la banda correspondiente al monómero A1 PI . Las muestras, cargadas a la misma concentración de proteína y manchadas con Coomassie, difieren obviamente en la intensidad de la banda de monómero A1 PI, lo cual es inversamente proporcional a los niveles relativos de A1 PI agregado con calor en las muestras. Por otra parte, los compuestos de muestra de alto peso molecular aumentan con los niveles relativos de A1 PI agregados con calor en las mezclas. Así, PAGE natural confirma claramente la agregación inducida por calor de A1 PI . Este hallazgo también fue confirmado por los datos de los análisis de HP-SEC, donde mayores niveles relativos de A1 PI agregado con calor en las mezclas se correlacionaron con mayores áreas pico relativas del pico de agregado y menores áreas pico relativas del monómero de A 1 PI .

La Figura 5 muestra la correlación entre los niveles de monómero de A1 PI , determinados con HP-SEC, y los resultados de los dos ensayos de actividad medidos para las muestras con diferentes concentraciones de agregados de A1 PI . La actividad de A1 PI de estas muestras fue medida usando el ensayo de inhibición de elastasa cromogénica y el ensayo de actividad de A1 PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención. La actividad de A1 PI, medida con el ensayo de inhibición de elastasa cromogénica, claramente se correlacionó con los niveles relativos de monómeros de A1 PI como se muestra por el coeficiente de correlación cuadrado de R2=0.9932 encontrado para la curva de regresión. Esto podría esperarse debido a que la formación de agregados de A1 PI involucra el sitio activo de A1 PI , absolutamente obligatorio para su actividad inhibidora. La misma buena correlación fue encontrada cuando el ensayo de actividad de A1PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención, fue usada para medir la actividad de A1PI de las muestras. Además, ambas curvas de regresión mostraron inclinaciones similares, las cuales difirieron solo por 1%.

Estos datos confirmaron que el ensayo de A1PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención, midieron la actividad de inhibición de elastasa de A1PI. Adicionalmente demostraron que incluso altas concentraciones de A1PI agregado, inactivo, no interfirieron con el ensayo de actividad de A1PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención. Claramente, estos datos muestran que el ensayo de actividad de A1PI de elastasa unido a placa solo medie A1PI activo, es decir A1PI que es capaz de inhibir elastasa.

Ejemplo 4: Correlación entre el ensayo de inhibición de elastasa cromogénica y el ensayo de actividad de A1PI de elastasa unida a fase sólida Muestras de A1PI que contienen niveles crecientes, definidos, de A1PI agregados con calor fueron medidos con el ensayo de inhibición de elastasa cromogénica, el cual se basa en incubar las muestras de A1PI con un exceso de elastasa porcina y medir la actividad de elastasa residual con el substrato cromogénico Suc-{Ala}3-pNA. La elastasa divide el substrato cromogénico y libera pNA, el cual es medido fotométricamente. La densidad óptica es directamente proporcional a la concentración de elastasa, la cual por sí misma es inversamente proporcional a la actividad de A1PI dentro de rangos definidos.

Además, estas muestras fueron medidas con el ensayo de actividad de A1PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención. La Figura 6 muestra la curva de regresión obtenida al graficar los resultados de los dos ensayos de actividad.

Las concentraciones de actividad de A1PI medidas con los dos ensayos se correlacionaron bien sobre el rango de actividad investigado, a saber 2 a 20 mg de A1PI activo/ml como es demostrado por el coeficiente de correlación cuadrado de R2=0.98. Estos datos demostraron la equivalencia de la actividad de A1PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención con el ensayo de inhibición de elastasa cromogénica debido a las diferencias en concentraciones de A 11 medidas para las muestras investigadas, reflejaron varianza provocada de manera aleatoria analítica en lugar de una sistemática. Ambos ensayos mostraron medir específicamente A1PI activo. En particular, se mostraron que concentraciones 10 veces mayores de A1PI inactivo no interfirieron con ambos ensayos.

Ejemplo 5: Medición de A1PI oxidado La actividad inhibidora de proteinasa de A1PI requiere absolutamente el sitio activo Met358-Ser359. Este sitio ocupa un lazo expuesto en la molécula y une fuertemente la región activa de neutrófilo elastasa. Met358 es sensible a oxidación resultando en una inactivación de A1PI, que resulta en una pérdida de su actividad inhibidora de elastasa.

La especificidad del ensayo de actividad de A1PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención fue mostrada al medir A1 PI oxidado, el cual fue obtenido mediante el siguiente procedimiento. Brevemente, 1 .5 mi de una preparación de A1 PI completamente activo, purificada, con una concentración de A1 PI de 20 mg/ml, fueron diluidos con 13.5 mi de amortiguador KH2P04 50 mM, pH 5.0, conteniendo KCI 1 00 mM y MgCI2 1 mM. 5. 1 mi de H202 fueron adicionados para provocar oxidación. Esta mezcla de reacción se incubó a RT durante 2 h y entonces se dializó contra solución salina amortiguada con fosfato a 4°C durante la noche. Las al ícuotas fueron preparadas y almacenadas congeladas a -20°C. La Tabla 1 da los resultados de los análisis hechos. En particular, la proteína de A1 PI fue medida con un ELISA. Adicionalmente, la actividad de A1 PI fue medida con un ensayo de inhibición de elastasa cromogénica y el ensayo de actividad de A1 PI de elastasa unido a placa de la presente invención.

Tabla 1 : Análisis de la preparación de A1 PI oxidado La medición de proteína de A1 PI con un ELISA resultó en una concentración de proteína de A1 PI de 1 .55 mg/ml, la cual concordó bien con lo esperado cuando la dilución provocada por el procedimiento fue considerada. En contraste, el ensayo de inhibición de elastasa cromogénico no detectó A1 PI activo y una concentración por debajo de 0.009 mg/ml se midió para el A1 PI oxidado. Esto correspondió a menos de 0.6% de la actividad inicial . Estos datos estuvieron en línea con los resultados de ensayo de elastasa unida a fase sólida de la presente invención, donde solo 0.2% de la actividad inicial fue encontrada para esta preparación. En conjunto, estos datos demostraron adicionalmente que la especificidad del ensayo de actividad de A1 PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención fue similar a aquélla del ensayo de inhibición de elastasa cromogénica. A1 PI oxidado, el cual permaneció completamente inmuno-reactivo como se muestra mediante los datos del ELISA, no mostró actividad considerable independiente de si se medía con el ensayo de elastasa cromogénica o el ensayo de elastasa unida a fase sólida. La Figura 7 muestra las curvas de concentración-respuesta, obtenidas con el ensayo de actividad de A1 PI de elastasa unida a fase sólida, para un concentrado de A1 PI purificado, una preparación de plasma de referencia humana y la preparación de A1 PI oxidada. Las curvas de concentración-respuesta evidencian claramente que el ensayo de actividad de A1 PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención solo mide A1 PI activo debido a que el A1 PI oxidado dio solo señales muy bajas, las cuales podrían indicar la presencia de bajos niveles de A1 PI todavía natural.

Ejemplo 6: Medición de complejos de elastasa-A1 Pl La inhibición de elastasa por A1 PI resulta en la formación de un complejo de A1 Pl-elastasa estable y A1 PI pierde su actividad inhibidora después de estar unido a elastasa. Consecuentemente, los complejos de A1 Pl-elastasa no deberían ser detectados o interferir con un ensayo de actividad de A1 PI . Por lo tanto, una preparación de A1 PI purificada fue incubada con diferentes cantidades de una preparación de elastasa humana purificada para obtener muestras conteniendo diferentes niveles de complejos de A1 Pl-elastasa.

Brevemente, una preparación de A1 PI purificada fue diluida con 20 mM Tris-HCI, pH 8.2, conteniendo 10 mg/ml de albúmina de suero humano, a una concentración de 400 Mg/ml e incubada con una preparación de neutrófilo elastasa humana (ICN, 1 91337; 500 Mg/ml) a diferentes proporciones molares a RT durante 45 min. En particular, las muestras con proporciones molares entre A1 PI y elastasa de 1 : 0.26, 1 0.52, 1 1 .02 y 1 2.55 fueron preparadas y analizadas adicionalmente. La Tabla 2 muestra los resultados de la medición de la actividad de A1 PI con el ensayo de actividad de A1 PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención.

Tabla 2: Ensayo de actividad de A1 PI de elastasa unida a fase sólida de muestras conteniendo complejo de A1 Pl-elastasa Incubar la preparación de A1 PI purificada con concentraciones crecientes de neutrófilo elastasa redujo la actividad de A1 PI medida con el ensayo de actividad de A1 PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención . La mezcla conteniendo una concentración equimolar de A1 PI y elastasa no mostró actividad medible. En contraste, las muestras con proporciones molares entre A1 PI y elastasa de 1 : 0.51 y 1 : 0.26, todavía tuvieron actividad de A1 PI con concentraciones correspondientes a 53.2% y 76.6% de aquélla media para la muestra antes de la formación de complejo. Esto igualó cercanamente la pérdida de actividad que se esperaba fuera inducida por los niveles de elastasa adicionados. Estos hallazgos también demostraron la capacidad del ensayo de actividad de A1 PI de elastasa unida a fase sólida de la presente invención para medir la actividad de inhibición de elastasa de A1 PI .

Ejemplo 7: Actividad amidolítica de elastasa unida a placa El método de la presente invención depende de la formación de complejo entre elastasa unida a placa y A1 PI . Por lo tanto, es obligatorio que la elastasa unida a placa retenga su actividad, debido a que solo enzima activa atacará el lazo de centro reactivo de A1 PI que resulta en formación de complejo. El substrato cromogénico Suc-(Ala)3-pNA se usó para medir la solución de elastasa después del procedimiento de recubrimiento y para verificar la presencia de elastasa activa sobre las cavidades recubiertas de la microplaca. Así, una actividad de elastasa de 1 8.8 pg/ml se midió par la solución recubierta después del procedimiento de recubrimiento. La diferencia para la concentración antes del recubrimiento (20 Mg/ml) implicó que 120 ng de elastasa unida por cavidad, lo cual iguala a una densidad de 1 .3 ng de elastasa por mm2. Un estimado razonable para la adsorción de superficie de IgG es 0.4 ng por mm2. Cuando un substrato cromogénico fue adicionado a las cavidades recubiertas y lavadas, se encontró que todas las cavidades mostraron actividad de elastasa resultando en la hidrólisis del substrato cromogénico. Estos datos confirmaron que la formación de complejo vista después de la incubación con A1 PI realmente se basó en el ataque proteolítico de elastasa. Cuando entonces las ODs de blanco-corregido fueron extrapoladas en una curva de calibración obtenida al medir elastasa libre, se encontró una actividad de elastasa de 82.3 ng por cavidad. Esto significó que más de 50% de la elastasa permaneció activa después del procedimiento de recubrimiento.

Ejemplo 8: Formación de complejo con otros inhibidores El plasma humano contiene varias proteínas las cuales son capaces de formar complejos con elastasa. Aunque la constante de velocidad para la formación de complejo entre A1 PI y elastasa es 25 veces mayor que aquéllas medias para otras serina proteasas, no obstante se investigó si la presencia de estos otros inhibidores afectó o no la medición de A1 PI . Las curvas de dosis-respuesta obtenidas para plasma y preparaciones de A1 PI purificadas, sin embargo, no indicaron algún efecto de estos inhibidores ya que sus inclinaciones fueron similares. En particular, c -antiquimotripsina (ACh) , a2-antiplasmina (AP), antitrombina (AT), a2-macroglobulina (AM), inhibidor C 1 (C1 -inh) e inhibidor inter-ct-tripsina (ITI) fueron verificadas por su capacidad para formar cantidades substanciales de complejos con la elastasa unida a placa y así afectar la medición de A1 PI . Como un control negativo adicional, el nivel de unión no específica a las cavidades fue determinado con elastasa unida a placa usando IgG como una proteína marcadora no específica, mientras que la unión de A1 PI se usó como una referencia positiva. La tabla 3 da las ODs promedio blanco-corregidas medidas para las series de diluciones de la preparación de plasma de referencia humana 1 R31003. Estas series de diluciones, comprendiendo doce diluciones que varían desde 1 /100 hasta 1 /204,800, fueron incubadas con la elastasa unida a placa. Complejos potencilamente formados fueron entonces detectados al usar conjugados de peroxidasa de anticuerpo específicos para el inhibidor respectivo. Estos datos también son mostrados en la Figura 8, donde las curvas de dilución versus OD son comparadas directamente.

Tabla 3: Formación de complejo de elastasa con inhibidores de proteína de plasma Los datos evidenciaron claramente que A1 PI forma un complejo con elastasa más fácilmente que cualquiera de los demás inhibidores investigados. Sin embargo, la formación de complejo moderada fue detectada para dos de los seis inhibidores probados: Solo los inhibidores de a2-macroglobulina y ch-antiquimotripsina mostraron formación medible de un complejo de elastasa con señales promedio que ascendieron a 6.0% y 3.9% de aquélla media para la formación de complejo con A1 PI. En particular, el promedio para las diluciones 1 /12,800 a 171 02,400 fue calculado para evaluar mejor las señales obtenidas para los diferentes inhibidores. Estos datos sugirieron que más de 90% de la elastasa unida a placa fueron encontrados en complejo con A1 PI sobre la suposición de que una comparación directa era posible usando la aproximación seguida aqu í. Solo cantidades menores de los otros inhibidores de proteinasa de plasma fueron capaces de competir con A1 PI para la unión a la elastasa unida a placa. Estos datos están en línea con las curvas de dilución-respuesta determinadas para muestras de plasma y preparaciones de A1 PI purificadas. Estas curvas fueron paralelas y no difirieron de manera obvia en sus inclinaciones. En contraste, la competencia efectiva para la elastasa unida a placa provocada por inhibidores diferentes de A1 PI se supondría que reduciría la concentración de elastasa disponible para la reacción con A1 PI . En consecuencia, esto debería conducir a diferentes inclinaciones para las curvas de concentración-respuesta dependientes de la pureza de la preparación investigada. En una segunda aproximación, la influencia de Am fue investigada con más detalle. Así, las mezclas de A1 PI purificado y Am fueron preparadas conteniendo la concentración de A1 PI constante de 192 ng/ml y concentraciones crecientes de AM variando desde 0 hasta 2000 ng/ml. El método de la presente invención fue corrido entonces con estas muestras y las curvas de concentración-respuesta obtenidas fueron comparadas. La tabla 4 da las ODs blanco-corregidas de las series de diluciones, las cuales fueron usadas para calcular las curvas de regresión log-log . Estas curvas son descritas adicionalmente por sus inclinaciones, intersecciones de eje Y y coeficientes de correlación. Las inclinaciones también están dadas como un porcentaje de la medida para la muestra que no contiene AM.

Tabla 4: Análisis de mezclas de A1 PI purificada y AM Las curvas de concentración-respuesta fueron afectadas solo ligeramente por la concentración de AM incrementada de las mezclas, debido a que sus inclinaciones difirieron por menos de 7% de la inclinación encontrada para la muestra conteniendo cero AM. Sin embargo, la formación de complejo entre Am y elastasa ocurrió, pero la cantidad de complejo formado pareció no interferir con la medición de A1 PI . El exceso de 10 veces en masa de AM sobre A1 PI resultó en concentraciones aproximadamente equimolares pero para un estimado correcto de las proporciones molares, tiene que ser considerado que AM contiene cuatro sitios activos inhibidores y que es posible que más de un sitio pudiera estar involucrado en unión a la elastasa inmovilizada en placa. Tal interacción también puede ocurrir durante el ensayo cromogénico, donde la elastasa unida a Am estará todavía activa cuando se mide con un substrato cromogénico, contribuyendo así a una subestimación de la actividad de A1 PI medida para una muestra dada. En ese caso, la inactivación de AM con metilamina podría mejorar la situación. Los datos obtenidos para el método de la presente invención , sin embargo, demostraron que la pureza de las muestras no desvía la medición de A1 PI funcionalmente activo, incluso cuando AM estuvo presente en una concentración equimolar.

Ejemplo 9: Exactitud y precisión del método de la presente invención La exactitud y precisión del método de la presente invención fueron determinadas en dos matrices de muestra. Primero, muestras que imitan soluciones de lavado bronquioalveolar (BAL) con una concentración de proteína total baja de no más de 50 g/ml fueron preparadas con concentraciones de A1 PI funcionalmente activas variando desde 0.0002 hasta 0.01 mg/ml. Las muestras similares a plasma con concentraciones de A1 PI que varían desde 0.01 hasta 0.8 mg/ml fueron obtenidas al diluir una preparación de plasma de referencia de plasma humano con albúmina de suero humano, mientras que la muestra con la concentración de 3 mg/ml fue obtenida al adicionar A1 PI purificado. Finalmente, el 1 er estándar WHO actual para A1 PI , codificado 057162, también fue incluido . La exactitud fue expresada como la recuperación de la concentración de A1 PI nominal dada como un porcentaje, la precisión como la desviación estándar relativa del promedio de seis mediciones, hecha en un d ía (intra-ensayo) o en seis d ías (inter-ensayo). Los resultados son mostrados en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5: Precisión y exactitud del método de la presente invención sobre un rango de 0.0002 hasta 12.4 mg/ml de A1 PI funcionalmente activo n.d. : no realizado; BAL: lavado bronquioalveolar

Claims (7)

REIVI NDICACIONES

1 . Un método para la medición de inhibidor de alfaTproteinasa activo (A1 PI) en una muestra, que comprende los pasos de (a) unir elastasa a una fase sólida; (b) incubar la fase sólida con la muestra; (c) incubar la fase sólida con una unión de reactivo de detección a A1 PI ; (d) determinar la cantidad de reactivo de detección unida a la fase sólida; y (e) determinar la cantidad de A1 PI activo en la muestra.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , que comprende además el paso de bloquear la fase sólida con albúmina de suero bovino antes del paso (b).

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , que comprende además el paso de diluir la muestra antes de la incubación con la fase sólida en el paso (b).

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , que comprende además los pasos de lavar la fase sólida antes de y después del paso (c).

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la elastasa es elastasa porcina.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la fase sólida es una microplaca.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el reactivo de detección es un anticuerpo de A1 PI anti-humano conjugado con peroxidasa.