CN1128538A - 串联的合成hiv-1肽类 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新的合成肽类，它是抗HIV-1的候选疫苗并可用于诊断。此肽类包含HIV-1gag蛋白的T细胞抗原决定簇的氨基酸序列，尤其是p24E，它与HIV-1分离物含有GPGR序列的V3环蛋白和/或含有ELKDWA序列的gp4 1的B细胞抗原决定簇之氨基酸序列直接相连接。本发明还提供了串联的合成肽类的多聚体形式。
Description
涉及的相关申请
本申请是1993年6月9日提交的美国专利申请No.08/073,378的部分继续申请。
发明领域
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及含有人免疫缺陷病毒蛋白质的T和B细胞抗原决定簇的合成肽类。
发明背景
AIDS病是人免疫缺陷病毒(HIV)感染的最终结果，目前尚无有效疫苗使人群免受HIV感染，因此迫切需要开发灵验的HIV-疫苗。以前曾将经化学处理完全灭活的HIV-1颗粒、编码HIV-1完整包膜蛋白(gp160)的疫苗载体以及经纯化的重组gp120评价为候选的HIV疫苗。尽管灭活的HIV-1病毒制品在人体中会引起T细胞介导的迟发型超敏(DTH)反应，痘苗/gp160和gp120重组疫苗候选者可诱导病毒中和性抗体，但这些免疫原中无一表现为有效的人HIV疫苗(参考文献1-本文所指的参考文献列于说明书的最后)。
本发明人对HIV疫苗学的兴趣在于开发合成的HIV-1肽类用以掺入疫苗中，并且认为用于与这些HIV-1肽疫苗结合的痘苗HIV-1重组亚单位可导致产生抗HIV-1的更有效免疫应答。为了设计合成
的HIV疫苗候选者，可将含有病毒分离物之间有高度保守性之序列的免疫原性病毒B细胞中和抗原决定簇(BE)与功能性的辅助性T细胞决定簇(THD)相连接以产生强烈而持久的交叉保护性抗体应答。另外，在合成的构成中还可包括HIV特异性的细胞毒T淋巴细胞(CTL)抗原决定簇以产生抗HIV感染的细胞介导的免疫。
对串联的抗原决定簇而言，在某些T和B细胞抗原决定簇之间存在特定的和优选的空间关系是必需的，以便能有效地加工从而提供免疫原性。因此，重要的是鉴定出HIV-1蛋白质中适当的T和B细胞抗原决定簇序列并以最适的构型装配它们，以使T和B细胞记忆都能有效产生并可生成所需特异性的抗体。已发现THD并非万能，仅当其与适当的II类主要组织相容性复合物(MHC)抗原相联合递呈时才具有免疫功能。T细胞抗原决定簇优势具有独特的等级，因而为了开发有效的AIDS合成疫苗，重要的是使用不同HIV-1 gp160、gag、pol和其它基因产物的最有效THD。最新研究表明gag基因产物在诱生抗HIV感染的免疫应答方面起到了至关重要的作用，因此，AIDS的临床进展与gag p24蛋白质循环抗体的减少相关，所产生的抗免疫决定簇gag p17肽的抗体可在体外抑制HIV-1感染(参考文献2、3)。
已公开的国际专利申请WO90/13564中描述了HIV-1核心蛋白p24E的T细胞抗原决定簇的鉴定和特征以及合成嵌合肽类的构建，此肽含有与HIV-1包膜或核心蛋白的B细胞抗原决定簇之氨基酸序列相连接的T细胞抗原决定簇的氨基酸序列。通过将B细胞抗原决定簇与T细胞抗原决定簇相连接可诱导针对B细胞抗原决定簇的免疫应答，而当细胞抗原决定簇不按此连接时则观察不到这种应答。此公开申请中提供了有关p24B细胞抗原决定簇、BE3抗原决定簇、ENV抗原决定簇和V3A抗原决定簇的数据，这些抗原决定簇都衍生于HIV-
1/LAV分离物，它们之间带有和不带有接头序列。
已公开的WO说明书中试验的具体构建体为：通过直接偶联使BE3与p24E的C-末端相连接，或者既可以通过两个脯氨酸残基也可以通过直接偶联使BE3与p24E的N-末端相连接，ENV在两种情况下都是通过两个脯氨酸残基与p24E的N-末端和C-末端相连接，而V3A是通过两个脯氨酸残基与p24的N-末端相连接。
在此公开中试验的来自HIV-1/LAV分离物中HIV-1 gp120可变环的V3A序列(残基308-327)通过使用脯氨酸-脯氨酸接头将此分子与p24E的N-末端相连接可使之具有免疫原性。
已知美国专利No.4,925,784(Crowl)通过重组方式提供了融合蛋白，它含有HIV-1 LAV分离物(HTLV-III)的gag蛋白氨基酸15-512以及env蛋白氨基酸44-140，即为含有1093个氨基酸的多肽或蛋白质，它比任何合成肽都要大很多，合成肽的长度不会超过150个氨基酸，通常其长度不超过50个氨基酸。据描述这种大分子融合蛋白对诊断应用和疫苗材料是有用的。
在独立分离物以及单一的感染个体的连续分离物之间人免疫缺陷病毒(HIV)的包膜糖蛋白(env)是高度可变的。env的氨基酸变异性集中于特定的可变区域(大多位于表面部分的gp120，它是通过原始的gp160基因产物的蛋白酶解成熟作用而产生的)，另外的区域变化较小。然而最可变区域经常含有中和性抗原决定簇以致于病毒部分逃避了宿主的免疫应答并建立起持续感染。这种可变性给根据特异性相互作用的诊断技术提出了难题，此技术通常使用分离或混合试剂检测HIV-1样品，这种可变性也给任何可能的疫苗或免疫治疗提出了难题，因为任何适当的试剂对于HIV-1的许多毒株都会产生反应。
因此，在宿主中对大量有免疫学差异的HIV分离物产生免疫应答尚存在两个难题。首先，远系繁殖种群中任何特殊宿主都会具有特殊的HLA单元型，因此对特殊的T细胞抗原决定簇的反应是有差别的。其次，抗体不能识别或中和许多有免疫学差异的HIV分离物，尤其是从病人体内最新收集的作为初发地域分离物的HIV分离物。
为了诊断、生产免疫试剂、治疗和抗HIV接种的目的，提供合成肽类是有利可图的，此肽含有许多宿主将与之反应的T细胞抗原决定簇以及来自包括初发地域分离物的不同HIV分离物蛋白质的B细胞抗原决定簇。
本发明的概述
本发明的目的在于提供合成肽类，特别是合成的HIV-1肽类，此肽类对于增强抗HIV感染的免疫应答或者检测HIV感染是有用的，其中合成的HIV-1肽类含有HIV-1核心蛋白的辅助性T细胞决定簇(T细胞抗原决定簇)，尤其是含有氨基酸序列为GPKEPFRDYVDRFYK(SEQ ID NO：2)的p24E，以及含有相应于HIV-1蛋白质、尤其是gp160、gag和pol蛋白的B细胞抗原决定簇的氨基酸序列，本发明还可提供至少含有一种此类合成HIV-1肽类的抗AIDS疫苗以及组合物，使用此合成HIV-1肽类检测HIV抗原的方法以及诊断试剂盒。
本文所用的术语“合成肽”是指使用例如下文实施例1中所述的肽合成方法，将含有T细胞抗原决定簇的氨基酸序列与含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列相连接以形成合成的T-B或B-T构建体。
在北美和西欧的AIDS群体中发现的流行HIV-1毒株属于HIV-1(MN)分离物，因此，能保护性地抗此血清型的合成HIV疫苗可含有如THD的p24E以及如B细胞抗原决定簇的HIV-1(MN)蛋白质的中和抗原决定簇。HIV-1(MN)包膜蛋白gp120的细胞外成分中的
两个区域或抗原决定簇已经显示出可诱生抗此病毒的中和抗体。这些区域中的一个为第三高可变(V3)环，它包括gp120(MN)的氨基酸残基301-335(参考文献4)。从受MN分离物感染的个体中分离到的株和群特异性单克隆抗体显示出可识别V3环冠区域的不同核心氨基酸序列(参考文献5)。
可产生中和抗体的其它gp120抗原决定簇是CD4结合位点，利用分离自受HIV-1感染的个体和黑猩猩的单克隆抗体进行的研究表明CD4结合位点中的中和抗原决定簇是由gp120的多个位点的非邻近氨基酸残基形成的。
另外，这两种类型中和抗体的结果表明，使用比抗CD4结合位点反应浓度低得多的V3特异性中和单克隆抗体即可达到体外中和所给剂量之HIV-1病毒的目的。
在本发明合成肽类的构建中，发明人用化学方法合成了一系列线形合成HIV-1(MN)肽类(下文表I所示，该表位于描述性正文的最后)，它们含有与V3(MN)环冠区域的高度保守序列(GPGR-SEQ ID NO：1)相邻的不同侧翼序列，此肽类与THD、p24E(GPKEPFRDYVDRFYK-SEQ ID NO：2)的氨基(N-)或羧基(C-)端相连接，另外，本发明人还合成了另外一系列线形合成肽类(如下文表VI、VII、IX、X和XI所示)。
另外已经制备并研究了图1所示的五个四聚肽，其中含有B细胞抗原决定簇的序列与p24E的C-末端相连接，这些肽是含有线形p24E-V3 MN序列的p24E-V3 MN(MAP)；含有线形CLTB-34序列的CLTB34(MAP)；含有线形CLTB-36序列的CLTB-36(MAP)；含有线形CLTB-91序列的CLTB-91(MAP)以及含有线形VP序列的VP-T-B(MAP)(见图1)；每个VP序列分别含有HIV-1(MN)
和HIV-1(BRU)分离物的残基307-316和315-325的杂合V3序列，并与p24E的C-末端相连接。
本发明的一个方面提供了合成肽，它包括至少一个含有人免疫缺陷病毒(HIV)分离物的gag蛋白的T细胞抗原决定簇的氨基酸序列，此序列在其N-末端或C-末端与至少一个含有HIV分离物的包膜蛋白V3环的B细胞抗原决定簇的氨基酸序列相连接，其中当位于所说N-末端时，含有B细胞抗原决定簇的序列与含有T细胞抗原决定簇的序列可以直接偶联。这种合成肽类是新的，在上述WO 90/13564中未公开。
本发明的另一方面提供了合成肽，它包括至少一个含有人免疫缺陷病毒(HIV)分离物的gag蛋白的T细胞抗原决定簇的氨基酸序列，此序列在其N-末端或C-末端与至少一个含有HIV分离物的gp41蛋白的B细胞抗原决定簇的氨基酸序列相连接，后者包括序列X1LKDWX2，其中X1是E、A、G或Q，X2是A或T，尤其是包括序列ELKDWA(参考文献10)或者能够诱生HIV特异性抗血清并能识别序列X1LKDWX2的序列。这种合成肽类是新的，在上述WO 90/13564中未公开。
本发明另一方面提供了合成的肽分子，它包括许多单个嵌合合成肽类，它们相互连接形成了多聚体分子，每个所说单个合成肽都含有包含人免疫缺陷病毒(HIV)分离物的gag或包膜蛋白的T细胞抗原决定簇的氨基酸序列，此序列与含有HIV分离物的gag或包膜蛋白B细胞抗原决定簇的氨基酸序列相连接。这种多聚体分子是新的，在上述WO90/13564中未公开。
本发明进一步包括本文提供的任何合成肽类的特异性抗体以及编码本文所提供合成肽的核酸序列，此核酸序列可被掺入表达载体。
本发明所涉及的HIV分离物通常为HIV-1分离物，包括含有T细胞和B细胞抗原决定簇序列之序列的合成肽类的氨基酸序列可以是多种HIV-1分离物的氨基酸序列，这些分离物包括LAV、BRU、MN、SF2、RF、PRI、1714、2054、HXB2、Z6、BX08、IIIB和SC，也可以使用不同分离物的共有序列。
在含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列来自V3环蛋白质的本发明实施方案中，此氨基酸序列优选包含序列GX1GX2，其中X1是P或Z，X2是R、K或Q，或者优选包含可产生HIV特异性抗血清并能识别序列GX1GX2、尤其是序列GPGR的序列。含有B细胞抗原决定簇的序列可包含至少来自两个不同HIV-1分离物的含有B细胞抗原决定簇的V3环序列，也可包含至少两个HIV-1初级分离物的V3环的共有序列。
在本发明不同的实施方案中，含有T细胞抗原决定簇的氨基酸序列优选包含p24蛋白的序列，例如p24E、p24N、p24L、p24M和p24H，尤其是p24E。在HIV-1分离物中高度保守的这些肽类的序列示于下表I和IX中。这类序列也包括保留了所选择序列T细胞特性的任何选择序列的一部分、其变异体或突变体。
含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列可与含有T细胞抗原决定簇的氨基酸序列的C-末端氨基酸直接偶联。
另外含有B细胞抗原决定簇的序列还可与含有HIV T细胞抗原决定簇的其它氨基酸序列相连接，它们可以是HIV gag或包膜蛋白的氨基酸序列。含有B细胞抗原决定簇的序列也可与含有HIV B细胞抗原决定簇的其它氨基酸序列相连接。gp41蛋白的B细胞抗原决定簇以及含有X1LKDWX2序列的B细胞抗原决定簇可以互相连接或者与含有V3环B细胞抗原决定簇的氨基酸序列相连接。
本文提供的多聚体分子可含有许多相同的单个嵌合合成肽，优选含有上文定义的合成肽类。
本发明进一步提供了免疫原性组合物，它含有免疫有效量的根据本发明提供的至少一种合成肽或者至少一种编码任何一种合成肽的核酸分子及其药学上可接受的载体。另外，本发明还提供了免疫宿主、优选人宿主的方法，它包括给宿主施用本文提供的免疫原性组合物。
免疫原性组合物可含有多种合成肽类，此肽经选择可为多种有免疫学差异的HIV-1分离物提供免疫应答，优选进一步被选择的合成肽可为许多对任何特定T细胞抗原决定簇有不同反应性的宿主提供免疫应答。
用于免疫原性组合物的肽类的特别有用的“合剂”(cocktail)包括下表中鉴定为CTLB-36、CTLB-91和BX08的肽类。这种组合物可进一步包含下表XI中被鉴定为MPK-2的肽类。
免疫原性组合物可配制成粘膜或非肠道给药制剂。免疫原性组合物可进一步包含至少一种其它免疫原性或免疫刺激性物，尤其是佐剂，如磷酸铝或氢氧化铝。
本发明还提供了用于检测试验样品中HIV特异性抗体的诊断试剂盒，此试剂盒包括：
(a)表面；
(b)至少一种如本文所提供的肽，它具有的氨基酸序列中的抗原决定簇对于固定于所述表面的HIV特异性抗体而言是特异性的；
(c)使抗体和至少一种固定肽接触以形成复合物的手段；和
(d)检测复合物的手段。
本发明另一方面提供了检测试验样品中HIV抗原的诊断试剂盒，此试剂盒包括：
(a)表面；
(b)抗体，其抗原决定簇对于固定于所述表面的HIV抗原之不同抗原决定簇而言是特异性的且无交叉反应性，此抗体是由本文所提供的肽类所产生的。
(c)使抗体与HIV抗原接触以形成复合物的手段；和
(d)检测复合物的手段。
附图的简要说明
图1所示为四聚体肽类的构建，此肽能在小鼠和/或豚鼠中诱生抗HIV-1的多克隆抗体应答。
图2包括豚鼠抗体应答的图示，此豚鼠先经非传染性、非复制性的HIV-1(IIIB)样颗粒免疫，再经如本文的一个实施方案中提供的HIV-1肽合剂加强免疫；和
图3图示说明豚鼠抗血清的反应性，此抗血清是先用非传染性、非复制性的HIV-(IIIB)样颗粒免疫豚鼠，再经如本文的一个实施方案中提供的HIV-1肽合剂加强免疫后产生的。
本发明的一般性描述
在本发明的一个实施方案中，所包含的肽类具有的相应于V3环抗原决定簇的氨基酸序列与HIV-1核心蛋白p24高度保守的T细胞抗原决定簇p24E的N-或C-末端相连接(如表I所示)。例如这些肽类可具有序列RIHIGPGRAFYTTKNGPKEPFRDYVDRFYK(V3MN-p24E-SEQ ID NO：10)和GPKEPFRDYVDRFYKRIHIGPGRAFYTTKN(p24E-V3MN-SEQ ID NO：9)，相应于以黑体印刷的V3(MN)环的氨基酸311-325(除非另有说明，本说明书全文中黑体的序列皆为含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列)分别与作为含有T细胞抗原决定簇的氨基酸序列的p24E(HIV-(MN)核心蛋白p24的氨基酸291
-305)的N-和C-末端相连接。例如这些肽类也可具有序列RKRIHIGPGRAFGPKEPFRDYVDRFYK(CLTB-32-SEQ ID NO：13)和GPKEPFRDYVDRFYKRKRIHIGPGRAF(CLTB-28-SEQ ID NO：12)相应于以黑体印刷的V3(MN)环的氨基酸309-320分别与p24E的N-和C-末端相连接。这些肽类也可具有序列RKRIHIGPGRAFYTTKNGPKEPFRDYVDRFYK(CLTB-35-SEQ ID NO：7)和GPKEPFRDYVDRFYKRKRIHIGPGRAFYTTXN(CLTB-34-SEQ IDNO：6)，相应于以黑体印刷的V3(MN)环的氨基酸309-325分别与p24E的N-和C-末端相连接。此肽类也可具有序列NKRKRGPGRAFYIIKNGPKEPFRDYVDRFYK(CLTB-37-SEQ ID NO：4)和GPKEPFRDYVDRFYKNKRKRIHIGPGRAFYTTKN(CLTB-36-SEQ ID NO：3)，相应于以黑体印刷的V3(MN)环的氨基酸307-325分别与p24E的N-和C-末端相连接。
这些肽类能在小鼠、豚鼠和猴中产生HIV特异性的多克隆抗体应答(表III和IV)。
本发明的另一个实施方案包含如四聚体肽类(如图1所公开的)的多聚体分子，它能在小鼠或豚鼠中诱生抗HIV-1的多克隆抗体应答(表XIII)。例如，这些多聚体分子可具有使用赖氨酸分支肽合成技术四聚体化的四个线性p24E-V3MN序列(SEQ ID NO：9)，因而被命名为p24E-V3MN(MAP-多抗原性肽)。例如，这些四聚体也可含有四个赖氨酸分支的CLTB-34序列(SEQ ID NO：6)，因此被命名为CLTB-34(MAP)。例如，这些四聚体也可含有四个赖氨酸分支的CLTB-36序列(SEQ ID NO：3)，因此被命名为CLTB-36(MAP)。例如，这些四聚体也可含有四个赖氨酸分支的CLTB-91序列(SEQ ID NO：20)，因此被命名为CLTB-91(MAP)。
例如，这些四聚体也可含有四个赖氨酸分支的VP-T-B线形序列GPKEPFRDYVDRFYKTRKSIRIQRGPGRAFYTTKN(SEQ ID NO：15)，它含有与p24E(SEQ ID NO：2)的C-末端相连接的杂合V3序列VP(NTRKSIRIQRGPGRAFYTTXN-SEQ ID NO：16)。杂合的V3序列VP自身包含以黑体印刷的V3(BRU)环氨基酸307-316(NTRKSIRIQR-SEQ ID NO：17)通过其C-末端与以黑体表示的V3(MN)环氨基酸序列315-325(GPGRAFYTTKN-SEQ ID NO：18)的N-末端相连接。
本发明新的免疫原性组合物所含的肽类含有HIV免疫原性T和B细胞抗原决定簇，被制备成与HIV-1细胞外包膜区域gp120、gp41以及核心蛋白p24的特异性抗原决定簇相连接的肽类。当施用给哺乳动物时这些组合物可用于免疫接种以产生HIV-特异性的体液免疫应答，这一点如下文实施例中的资料所示，在小鼠、豚鼠和猴中得到了证实。
肽类的合成
为了设计以合成肽为基础的HIV免疫原，可如实施例1中所述使用自动的ABI 430A固相肽合成仪来化学合成线形肽类，它包括与含有T细胞抗原决定簇肽类的N-或C-任一末端相连接的V3环和gp41序列。可在弗氏佐剂(FA)或磷酸铝(alum)中配制不同的组合物以比较它们诱导哺乳动物HIV特异性免疫应答的能力。
还制备了五个多聚体分子，它们被称为p24E-V3MN(MAP)、CLTB34(MAP)、CLTB-36(MAP)、CLTB-91(MAP)和T-B-VP(MAP)，它们是通过使用各自的线形串联抗原决定簇，也即p24E-V3MN、CLTB-34、CLTB-36、CLTB-91和VP-T-B的赖氨酸分支肽合成技术进行四聚体化而形成的。当将它们置于
alum或FA中施用给哺乳动物时，其产生HIV特异性免疫应答的能力也得到了研究。
线形HIV肽类在哺乳动物中的免疫原性
用在FA中乳化或吸收至alum中的各个肽类免疫小鼠、豚鼠或猴可检测线性HIV肽类在哺乳动物中诱发抗体应答的能力。以皮下途径每次100μg注射4次后，通过肽特异性的EIA和体外合胞体阻断测定法可测定IgG抗体应答(表II、III、IV、V、XII)。
四种不同的V3(MN)肽类也即V3MN、CLTB-29、CLTB-55和CLTB-56含有不同的V3(MN)环冠部分(GPGR)的侧翼序列，但是缺少p24E序列，不论它们是以存在于FA中还是磷酸铝(alum)中被注射，其免疫原性或者是没有或者是很弱(见下表III)。用含有T细胞抗原决定簇和B细胞抗原决定簇的各个合成HIV-1肽类进行研究显示出p24E之加强这些肽类免疫原性的载体功能。因此T-B方向的合成HIV-1肽类所产生的V3(MN)特异性抗体应答比各自游离的V3(MN)肽类或B-T对应物所产生的要强很多(表III)。因此，这些研究的结果表明有关p24E的V3(MN)肽的方向会影响到本发明合成HIV-1肽类的免疫原性。将各个合成HIV-1肽类置于FA或磷酸铝(alum)中施用给鼠和豚鼠，检测所产生抗血清中各个抗V3肽抗体的效价并加以比较，结果表明在豚鼠和小鼠中CLTB-36皆为最具免疫原性的肽(表III)。
当将CLTB-36于佐剂ISA51中配制时，可在灵长类动物中产生强烈的肽特异性抗体应答(表IV)，此抗体可中和病毒，此肽的这种能力可进一步证实其免疫原性。重要的是抗CLTB-34和CLTB-36而产生的鼠和豚鼠的抗血清能对各种HIV-1血清型的V3肽类产生交叉反应(下表V)。
通过对三种其它嵌合肽类，即p24E-SP10(A)、CLTB-91、CLTB-84和T1-SP10(A)-MN(表I)进行研究可进一步阐明p24E和V3序列用于构建免疫原性T-B肽类的新用途。下表III的结果表明具有序列GPKEPFRDDYVDRFYKCTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK(SEQ ID NO：19)，的p24E-SP10(A)当于FA或alum中被施用时能在豚鼠中诱导效价良好的CLTB-56特异性的抗体，所述序列含有与p24E的C-末端相连接的V3(MN)环N-末端(CTPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK-SEQ ID NO：20)。类似地，在alum中配制的p24E-SP10(A)在Balb/c(H-2d)中也可以产生高水平的抗-CLTB-56抗体应答。相反已发现具有序列KQIINMWQEVEKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK-SEQ ID NO：21)，的T1-SP10(A)-MN在豚鼠和Balb/c(H-2d)小鼠中免疫原性较差，其序列含有与文献(参考文献4)中报导的T细胞抗原决定簇T1(KQIINMWQEVEKAMYA-SEQ ID NO：22)的C-末端相连接的V3(MN)环相同的N-末端。这些资料表明对于V3(MN)环的N-末端序列而言，p24E与T1相比可成为更有效的载体。另外已发现T1可介导CLTB-56免疫原性的增强。使用存在于FA或alum中并包含与T细胞抗原决定簇T1相连接的CLTB-56且序列为KQIINMWQEVEKAMYANKRKRIHIGPGRAFYTTXN-SEQ ID NO：23)，的CLTB-91肽免疫豚鼠，并用于alum中的CLTB-91注射小鼠，检测其血清样品中高水平的CLTB-56特异性抗体的效价即可显示出上述结果。由于CLTB-91与T1-SP10(A)-MN的不同之处仅为与T1C-末端相连接的V3(MN)序列，这些资料表明用于T1-SP10(A)-MN时，CLTB-56与V3(MN)环的N-末端相比是更好的B细胞抗原决定簇。另外还发现当CLTB-84于alum中被施用
给豚鼠时免疫原性较强(表III)，CLTB-84含有与另一个T细胞抗原决定簇p24M的C-末端相连接的CLTB-56序列，p24M包含p24的序列GHKARVLAEMSQVT(SEQ ID NO：30)。
制备了五种其它系列的HIV-1合成肽类，在表VI所示的第一系列肽类(SEQ ID NOS：38-47)，中，两个不同的美国临床HIV分离物的V3序列1714(NTRKRIHMGPGRAFYATGDIIG-SEQ IDNO：48)和2054(NTRKGIHIGPGRAFYTGEIVGDIRQ-SEQ ID NO：49)分别被连接到p24E和T1的C-末端，形成了p24E-1714和T1-2054。另外，纽约和阿姆斯特丹分离物之相同的V3共有序列PRI(NTRKSIPIGPGRAFYTTG-SEQ ID NO：50)被连接到p24E、T1或p24M上，形成了CLTB-PRI、T1-PRI和p24M-PRI的各个T-B肽类。另外，通过将p24E与LAI(NTRKSIRIQRGPGRAFYTIG-SEQ ID NO：51)，RF(NTRKSITKGPGRVIYATGQIIG-SEQ ID NO：52)的V3序列以及MN和RF(NKRKRIHIGPGRVIYATGQIIG-SEQ ID NO：53)的杂合V3序列相连接，以分别形成CLTB-V3B、CLTB-V3RF和CLTB-HB构建体即可构建出三种其它的T-B肽类。
表VII所示为第二系列的构建体(SEQ ID NOS：54-68)。构建它们所用的特殊gp41序列具有参考文献6中所述的中和抗原决定簇ELDKWA(SEQ ID NO：69)表VIII所示的结果表明这些肽类中的每一种都可被人中和性单克隆抗体2F5识别(参考文献6)。
表IX所示为构建的第三系列肽类(SEQ ID NOS：70-84)。此构建包括使用CLTB-56序列以连接到gag的三个不同T细胞抗原决定簇的N-或C-末端从而分别形成B-T或T-B合成肽类，这三种抗原决定簇即为P24N(QMREPRGSDIAGTTSTL-SEQ ID NO：70)，P24L(EEMMTACQGVGGPGHK-SEQID NO：73)和P24M(GHKARVLAEAMSQVT-SEQ IDNO：76)。另外纽约和阿姆斯特丹分离物的共有序列PRI(NTRKSIPIGPGRAFYTTG-SEQ ID NO：80)也可与T细胞抗原决定簇P24H(PIVQNIQGQMVHQAI-SEQ ID NO：79)或T5(VKYKVVKIEPLGVAP-SEQ ID NO：82)的N-或C-末端相连接以分别形成B-T或T-B肽类。
表X所示为制备的第四系列肽类(SEQID NOS：85-92)。肽类CLTB-102和CLTB-105是含有gp41(ELLELDKWASLWNWF-SEQ ID NO：93)和分别连接于辅助性T细胞抗原决定簇p24E C-和N-末端的CLTB-56之杂合序列的构建体。CLTB-103和CLTB-107是含有CLTB-56和分别连接于p24E C-和N-末端的相同gp41序列的肽类。为了构建CLTB-160和CLTB-161，可将伦敦、印度和巴黎分离物共有的(LIP)V3序列、泰国HIV-1病毒的V3序列(THAI)以及在纽约、阿姆斯特丹最初发现的分离物的共有V3序列用来分别与T细胞抗原决定簇p24E和T1的C-末端相连接。
表XI所示为构建的第五系列肽类(SEQ ID NOS：94-97)。肽MPK-1含有gp41中和抗原决定簇(ELDKWAS-SEQ ID NO：98)的拷贝，它通过GPG接头序列分别在其N-和C-末端与T1和p24E T细胞抗原决定簇相连接。肽MPK-2的构建与MPK-1相同，但除了T1和p24E的方向相反。NPK-3和MPK-4的构建包括使用两拷贝gp41序列ELDKWAS以使MPK-1在其N-或C-末端分别与T-1和p24E和T1相连接。
HIV-1肽合剂的免疫原性
含有本发明五种肽类的合剂之免疫原性是在豚鼠中评价的(表II)。这些串联的肽类包括：CLTB-70，它含有与p24E C-末端相连接的HIV-1(SF2)分离物的V3序列；CLTB-72，它含有与p24E C-末端相连接的HIV-1(IIIB)的V3序列；CLTB-74，它含有与p24E C-末端相连接的HIV-1(RF)的V3序列；CLTB-76，它含有与p24E C-末端相连接的HIV-1(Z6)的V3序列以及p24E-GP41C，它含有与p24E C-末端相连接的HIV-1(BRU)的gp41序列。表II所示结果表明用在FA或alum中配制的合剂免疫动物，可使之产生抗五种串联肽类中每一种的高水平抗体应答。
因此，上述结果显示出当肽合剂吸附至alum时，其诱生抗四种不同HIV-1分离物(SF2、IIIB、RF和Z6)的V3环以及HIV-1(BRU)的gp41序列的强烈抗体应答的能力。
另外还研究了使用另一种HIV-1肽合剂的免疫接种计划，此合剂含有CLTB-36、CLTB-91、CLTB-84(如表I所示)和CLTB-70(如表II所示)以及HIV-1自身装配的、非复制性、非传染性的HIV样颗粒(如1991年5月2日公开的WO91/058564中所述)。图2所示的结果表明先经于不完全弗氏佐剂中乳化的HIV-样颗粒免疫接种，再用吸附至alum中的合剂加强免疫的豚鼠可产生抗CLTB-56肽的强烈抗体应答。用合剂第二次加强免疫注射后，抗血清抗MN分离物的病毒中和效价为1,091。至关重要的是图3所示结果进一步表明从用肽合剂第二次加强免疫后的动物中收集的抗血清表现出抗含有几种实验室培养病毒和初级临床分离物V3序列之肽类的强烈交叉反应性。
其它肽合剂可含有免疫有效量的任一种包括合成肽的公开肽类，所述合成肽包括至少一个含有人免疫缺陷病毒(HIV)分离物gag蛋白的T细胞抗原决定簇的氨基酸序列，此序列在其N-末端或C-末端与至少一个含有HIV分离物gp41蛋白的B细胞抗原决定簇的氨基酸序列相连接，后者包括序列X1LKDWX2，其中X1是E、A、G或Q，X2是A或T，或者也可包括能够产生HIV特异性的抗血清并可识别序列X1LKDWX2的序列。尤其是此肽可为MPK-2(SEQ ID NO：95，表XI)。
通过检测抗合成的HIV-1肽类而产生的抗血清抑制由同种HIV-1(MN)分离物诱导的合胞体形成的能力可研究此抗血清的功能活性。将四种含有仅含B细胞抗原决定簇序列的V3(MN)肽类，也即V3MN、CLTB-29、CLTB-55和CLTB-56置于FA或磷酸铝(alum)中施用，免疫接种鼠后其抗血清缺乏阻断合胞体的活性(见下表XII)。已发现豚鼠抗配制于FA中而不是磷酸铝(alum)中的CLTB-56产生的抗血清在稀释度为1∶10时显示出大于90％的合胞体抑制活性。已发现鼠和豚鼠抗于FA或alum中的B-T串联合成肽类，也即V3MN-p24E、CLTB-32和CLTB-35而产生的抗血清也缺乏阻断合胞体的活性，这些串联合成肽类抗各个含有B细胞抗原决定簇的肽类，也即V3MN、CLTB-29和CLTB-55反应的抗体效价不佳，然而已发现豚鼠抗于FA或磷酸铝(alum)中被施用的CLTB-37而产生的抗血清都具有1∶10的合胞体抑制效价，此抗血清所含的CLTB-56-特异性抗体效价分别为1∶1250和1∶450。用抗免疫原性的T-B合成肽类而产生的抗血清所进行的功能性研究结果表明：抗于FA或磷酸铝(alum)中的T-B合成肽CLTB-36而产生的鼠和豚鼠抗血清都能强烈抑制由同种(MN)病毒诱导的合胞体形成。另外还发现cynomolgus猴抗于ISA51中配制的CLTB-36而产生的抗血清具有良好的抗MN分离物的中和效价(在两只动物中为278和430)(见表IV)。已发现鼠和豚鼠抗于FA中的p24E-V3MN和CLTB-34而产生的抗血清与抗于alum中肽而产生的各个抗血清相比含有较高效价的V3MN和CLTB-55特异性抗体，此抗血清具有有效的合胞体阻断活性。还观察到用于免疫接种的动物种类会影响到V3(MN)特异性功能抗体的产生。这种影响可通过例如以下的事实来阐明，即尽管于FA中的T-B串联合成肽CLTB-28可在小鼠和豚鼠中诱导相同效价的抗CLTB-29抗体，但仅仅后者所产生的抗血清具有高效价的合胞体抑制活性。
多聚体分子在哺乳动物中的免疫原性
通过用于FA或alum中乳化的多聚体分子CLTB-36(MAP)、CLTB-91(MAP)、CLTB-34(MAP)、p24E-V3 MN(MAP)和VP-TB(MAP)(它们各自的构型示于图1)免疫小鼠和豚鼠可检测它们在哺乳动物中产生抗体应答的能力。四次100μg的剂量之后，通过肽特异性的ELISA和体外合胞体阻断测定法可测定IgG抗体应答。
下表XIII所示为在小鼠和/或豚鼠中用多聚体分子进行的免疫原性研究的结果。使用于FA或alum中的四聚体CLTB-36(MAP)免疫小鼠和豚鼠都可产生高效价的CLTB-56特异性肽抗体。类似地，在这些动物中于FA或alum中配制的CLTB-91(MAP)也可诱导高效价的CLTB-56特异性抗体。将四聚体的T-B串联合成肽CLTB-34(MAP)、p24E-V3MN(MAP)或VPTB(MAP)置于FA中施用给豚鼠，它也可产生高效价的分别为CLTB-55、V3MN和VP特异性的抗体。抗于FA或alum中的CLTB-36(MAP)而产生的鼠和豚鼠抗血清可强烈抑制由HIV-1(MN)病毒诱导的合胞体的形成(下表XIV)。类似地，抗于FA中的分支肽类CLTB-34(MAP)和VP-T-B(MAP)而产生的豚鼠抗血清显示出有效的阻断合胞体的活性。
本发明的种种实施方案在HIV感染的接种、诊断、治疗以及免疫试剂的生产领域有很多用途，这一点对于本技术熟练人员来说是很显而易见的。这种用途的进一步非限制性的讨论将在下文作进一步描述。
疫苗的制备和使用
已表明本发明的肽可诱发免疫应答，因此此分子的一个可能的用途是可作为抗AIDS和AIDS相关疾病的有效疫苗的基础，因此本发明另一方面提供了抗AIDS和AIDS相关疾病的疫苗，它含有根据本发明的分子。
适于用作疫苗的免疫原性组合物可由本文公开的免疫原性肽类制备得到。免疫原性组合物可诱发免疫应答，此应答可产生起调理素作用或抗病毒作用的抗体。如接种过的受治疗者受到HIV攻击，抗体与病毒结合而使之失活。
如美国专利4,601,903、4,599,231、4,599,230和4,596,792所举例说明，含有肽类的疫苗通常在本技术领域中是熟知的。可将疫苗制成可注射的、液体溶液或乳剂，可将肽类同与其相容的药学上可接受的赋形剂相混合。赋形剂可包括水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇及其混合物。疫苗可进一步包含如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂或加强疫苗效力的佐剂之辅助性物质。使疫苗得到佐剂效果的方法包括使用如氢氧化铝或磷酸铝(alum)的试剂，普遍使用的是于磷酸缓冲盐水中的0.05-0.1％溶液。疫苗可经皮下或肌内注射的非肠道途径施用。另外包括栓剂和口服制剂的其它施用方式也是适用的。对于栓剂而言，可包括结合剂和载体，例如polyalkalene二醇或甘油三酯。口服制剂可包括通常使用的赋形剂，如药用级糖精、纤维素和碳酸镁。这些组合物的形式可为溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末，它们含有10-95％的肽类。
此疫苗可以以治疗有效的、保护性的和免疫原性的量，以与剂型相容的方式被施用。施用的量依据受治疗的试验者而定，包括例如个体的免疫系统合成抗体以及产生细胞介导的免疫应答的能力，所需施用的活性成分的精确量依据医生的判断而定，然而本技术领域熟练人员可容易地确定适当的剂量范围，此肽类可以是微克级。最初施用和加强免疫剂量的适当给药方案也是不同的，但可包括最初的施用及紧随其后的相继施用，例如将如WO91/058564所述的自身装配的、非传染性、非复制性的HIV样颗粒与至少一种前肽一起免疫接种分配至接受者，接着再以本文提供的肽类至少一次地再次免疫接种。疫苗的剂量也依据施用的途径而定，根据宿主的大小而变化。
通过直接施用核酸分子，例如通过注射、或者通过首先构建活载体，如沙门氏菌属(Salmonella)、BCG、腺病毒、痘病毒、疫苗或脊髓灰质炎病毒，再施用此载体，也可将编码本发明肽类的核酸分子直接用于免疫接种。对于已被用于为免疫系统携带异源抗原的一些活载体的讨论例如参见O′Hagan 1992(参考文献10)。将DNA直接注射给受试者以进行遗传免疫接种的方法描述于例如Ulmer等人，1993(参考文献11)。
由于本文所提供的肽类自身不具备足够长的血清和/或组织半衰期，因而在体内使用此肽类需要对它们进行修饰。为此，可任选地将本发明的分子与载体分子相连接，这可通过保守序列氨基酸的化学基团，或者通过在C-或N-末端增加额外的氨基酸来实现。已知很多适当的连键，例如使用Tyr残基的侧链。适当的载体包括例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)、卵清蛋白、非蛋白质载体和其它许多种载体。
另外，为了对肽类加以构型限制，对其进行修饰将会是有利的。例如为了完善所诱发的效应器之免疫应答，模仿天然蛋白质中此肽的自然存在的构型可能有用。经修饰的肽类本文指的是“类似物”肽类。术语“类似物”可扩展为有关本发明实际操作中由其增加的体内或体外稳定性和/或效力为特征的任何功能和/或结构等同的肽。本文所用的术语“类似物”也可扩展为本文所述肽类的任何氨基酸衍生物。
本文所考虑到的肽类类似物包括但不局限于侧链的修饰，以及非天然氨基酸和/或其衍生物、非氨基酸单体和交联接头的掺入。也考虑了对肽类或其类似物施加构型限制的其它方法。
很明显本发明的肽能以不会明显影响其功能上重要的免疫原性行为的多种不同方法加以修饰。对肽序列的可能的修饰可包括如下所述：
一个或多个单独的氨基酸可被具有可比性的或类似特性的氨基酸取代，因此：
V可被I取代；
T可被S取代；
K可被R取代；和
L可被I、V或M取代。
本发明肽类的一个或多个氨基酸可被“逆-反”氨基酸所置换，即如WO91/13909中所讨论的具有相应于氨基酸的功能性基团的双功能胺。
一个或多个氨基酸可以被缺失。
模仿此肽三维结构的结构类似物可被用来取代此肽本身。
本发明所考虑到的侧链修饰的例子包括例如通过先和乙醛反应再经NaBH4还原的还原烷基化作用所进行的氨基基团的修饰；亚氨逐乙酸甲酯的脒化作用(amidination)；乙酸酐的酰化作用；氰酸盐对氨基基团的甲氨酰化作用；2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基基团的三硝基苄基化作用；琥珀酐和四氢化邻苯二甲酸酐对氨基基团的酰化作用；吡哆醛-5′-磷酸盐对赖氨酸的Pyridoxylation，随后再经NaBH4的还原作用。
通过使用如2，3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛试剂形成杂环缩合产物可对精氨酸残基的胍基基团进行修饰。
先通过形成O-acylisourea的碳化二亚胺活化作用，随后再经衍生作用衍生成例如相应的酰胺则可对羧基基团进行修饰。
巯基基团的修饰可使用下述方法，例如碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化作用；生成磺基丙氨酸的过甲酸氧化作用；与其它的巯基化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酐或其它经取代的马来酰亚胺反应；使用4-对氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞基-4-硝基苯酚以及其它汞化合物以形成汞的衍生物；和在碱性pH下氰酸盐的甲氨酰化作用。
色氨酸残基的修饰可通过例如N-溴琥珀酰亚胺的氧化作用或者2-羟基-5-硝基苄基溴或硫苯基卤化物对吲哚环的烷基化作用。另一方面，酪氨酸残基可通过四硝基甲烷的硝化作用形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变。
组氨酸残基咪唑环的修饰可通过碘乙酸衍生物的烷基化作用或者焦碳酸二乙酯的N-乙酯基化作用来实现。
在肽合成过程中，掺入非天然氨基酸及其衍生物的例子包括但不局限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D型异构体。
例如，可使用交联接头使三维构型稳定，即可使用同-双重功能的交联接头，如带有(CH2)n间隔基团(其中n＝1至n＝6)的双重功能的亚氨酸酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，也可使用异双重功能的试剂，它通常含有如N-羟基琥珀酰亚胺的氨基活性部分以及另一个如马来酰亚胺或联硫基(对SH而言)或者碳化二亚胺(对COOH而言)的基团特异性的活性部分。另外，还可对肽类进行构型限制，例如可通过掺入α-甲基氨基酸，在氨基酸的相邻C原子之间引入双键，如在N和C末端之间，两个侧链之间或侧链与N或C末端之间形成酰胺键以引入共价键从而形成环状肽类或类似物。
本发明的肽类或其类似物可以单个长度或多个串联或非串联重复片段存在。单一类型的肽或类似物可形成重复片段，或者重复片段可由包括适当载体分子的不同分子组成。
将本发明的肽类偶联到脂肪酸部分以产生脂质化肽类即可调节其免疫原性，便利的脂肪酸部分包括糖脂类似物，N-棕榈基-S-(2RS)-2，3-双(棕榈酰氧基)丙基-半胱氨酰-丝氨酸PAM3-Cys-Ser)、N-棕榈基-S-[2，3-双(棕榈酰氧基)(2RS)-丙基-[R]-半胱氨酸(TPC)或2-棕榈基-赖氨酸部分。
还可将本发明的肽类与脂质化的氨基酸偶联，如芳香族氨基酸(如酪氨酸)的十八烷基酯，包括十八烷基-酪氨酸(OTH)。
还可进一步发现根据本发明的分子在治疗(预防或治疗)AIDS以及相关疾病中的用途，它是通过取代HIV病毒吸附到人或动物细胞上或者通过扰乱病毒的三维结构而起作用的。
因此本发明的另一方面提供了预防或治疗AIDS或相关疾病的方法，包括施用有效量的根据本发明的肽。
免疫测定法
在免疫测定法中，本发明的肽类可用作免疫原，即抗原。免疫测定法包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、RIA和其它非酶联抗体结合测定法，或者本技术领域中已知的用于检测抗HIV抗体的方法。在ELISA测定法中，肽类被固定在经选择的表面，例如能结合肽类的表面，如聚苯乙烯微量滴定板的孔。洗涤以除去未完全吸附的肽类后，可将已知为与检测样品相关的中性抗原的非特异性蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)或酪蛋白溶液结合到经选择的表面上，这可以封闭固定化表面上非特异性的吸附位点，因此可降低由表面抗血清的非特异性结合而导致的本底。
在需要鉴别可识别多种HIV分离物的抗体的一个诊断性实施方案中，本发明的多种肽类被固定在经选择的表面上。另外，当本发明肽的B细胞抗原决定簇在多种HIV分离物中高度保守时(例如gag或gP41的B细胞抗原决定簇)，可固定单个或有限数目的肽类。在需要特异性地鉴别可识别单个HIV分离物(如BRU、MN或SF2)的抗体的另一个诊断性实施方案中，可固定单个本发明的肽。在需严格确定负责抗体生成的特定HIV分离物的药物、临床试验、法律和法庭科学领域中，所述的后一个诊断性实施方案具有特殊的用途。
正常情况下，肽类的大小范围为约12个残基直至约达14至40个残基。应理解肽类的混合物可用作如疫苗中的免疫原或用作诊断试剂。来自保守区和/或非保守区的肽类混合物被用于提供交叉分离物保护和/或诊断的情况也可存在。在这种情况下，肽免疫原混合物通常是指用作免疫原性组合物或诊断试剂的“合剂”制品。
然后以有助于免疫复合物(抗原/抗体)形成的方式使样品，如待检的临床或生物材料与固定化表面接触。这包括用如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸缓冲盐水(PBS)/吐温溶液的稀释剂稀释样品，然后在约25℃-37℃的温度下将样品温育约2-4小时，温育后洗涤与样品接触的表面以除去非免疫复合性的物质。洗涤步骤可包括使用如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液的溶液洗涤。
在测试样品和结合肽类之间特异性免疫复合物形成以及随后的洗涤之后，可通过使免疫复合物与第一抗体特异性的第二抗体接触来测定免疫复合物形成的出现乃至数量。如果测试样品来源于人，则第二抗体是对人免疫球蛋白有特异性的抗体，通常为IgG。为了提供检测方法，第二抗体可具有相关活性，如与适当的产色底物一起温育时可显现颜色的酶活性。通过使用例如可见光分光光度计测量产色的水平即可定量。
其它用途
与本发明所根据的保守序列结合的分子、尤其是抗体、抗体相关分子及其结构类似物也可用作治疗和诊断AIDS和相关疾病的试剂。
本发明的范围中还包括抗体的变异体(包括抗原结合位点)，如嵌合抗体、人源化抗体、虚饰(veneered)抗体和工程抗体，它们可与本发明的肽类结合。
与本发明肽类结合的抗体和其它分子可以多种不同的方式用于治疗(预防和治疗)和诊断的目的，它包括下列方式：
为了适当施用抗体的被动免疫接种，可将人源化抗体施用给HIV病人。
通过使用能行使所需功能的适当亚类或同种型的抗体(可以通过适当的抗体工程而得到)可激活、补充或介导抗体依赖性细胞介导的细脆毒性(ADCC)。
为了有目标地释放毒素或其它试剂，例如可通过使用含有抗体和细胞毒性部分偶联物的免疫毒素，使之直接或间接结合到例如gp120或gp41的靶保守序列上来实现。
将高免疫原性物质有目标地释放至受HIV感染细胞的表面，导致通过宿主的体液或细胞免疫系统使这种细胞有可能被除去。
为了检测HIV，例如可使用多种免疫测定技术。
在另一个诊断性实施方案中，本发明的肽(单独地，或作为包括合剂制品的混合物)可用来产生HIV抗原特异性抗体(包括单克隆抗体)，此抗体可用来检测HIV或抗原，或可用于中和包括生物样品在内的样品中的HIV。
在另一个诊断性实施方案中，本发明的肽类可用来特异性刺激来自例如受HIV感染个体的生物样品中HIV特异性的T细胞。
上述公开对本发明进行了一般性描述，参考以下具体的实施例可得到对本发明更完整的理解。描述这些实施例的目的仅为阐明本发明，而无意于限制本发明的范围。当情况需要或允许变通时，还可考虑形式的变化和等同物的替代。尽管本文使用了特定的术语，但这些术语只用于描述为目的，而不用于限制本发明。
实施例
本公开未详细描述由Dr.Thomas Matthew′s小组在杜克大学(NC.USA)使用的肽合成法、酶免疫测定法(EIA)和体外合胞体阻断测定法(参考文献7)，但它们已在科学文献中得到充分报导，并且属于本技术熟练人员所熟知的范围之内。
实施例I
本实施例阐明了线形肽类的合成。
根据使用ABI(Applied Biosystems Inc)430A肽合成仪和如制造商所述的最优化t-BOC化学鉴定出的不同HIV-1分离物所报导的氨基酸序列，即可合成下表I、II、VI、VII、IX、X和XI所示的肽类。用氢氟酸(HF)处理从树脂上除去粗肽类，使用Vydac C4半制备性柱(1×30cm)，通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化此粗肽类，上述制备柱使用的是流速为2ml/min，在40分钟内产生的于0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)中的15-55％乙腈梯度。用于免疫检测和免疫接种研究的所有合成肽类(下表I)经分析性HPLC鉴定，其纯度＞95％。在Waters Pico-Tag系统中进行的氨基酸组分分析与理论上的组分相当一致。
实施例II
本实施例阐明了支化肽类的合成。
使用ABI 430A肽合成仪以及根据先前由Tam所描述的合成方法(参考文献8)可制备如图1所示的合成分支HIV-1肽类(MAP)，通过如实施例I线性肽类所述的RP-HPLC纯化NAP肽类。
实施例III
本实施例描述了用于检测HIV-1嵌合肽类的免疫原性的方法。
五只6-12周龄Balb/c(H-2d)小鼠或三只6-8周龄雌性Duncan Hartley豚鼠分别购自Charles River动物饲养场(Montreal，Canada)和Hazleton动物饲养场(Denver，Co.，USA)，用100μg如下给出的游离肽免疫接种各个动物，通过皮下途径将于弗氏完全佐剂(CFA)中乳化或吸收至3mg磷酸铝(alum)中的所给剂量的肽施用给动物；三周后再用于弗氏不完全佐剂(IFA)中乳化或吸收至3mg磷酸铝(alum)中的相同剂量的相同肽加强免疫。以三周为间隔期用制备于各个佐剂中的相同量的相同肽进一步加强免疫小鼠两次。在加强免疫后的第9天和第14天分别收集实验小鼠和豚鼠的血清，使用一般的酶联免疫吸附测定法(EIA)测定血清中肽特异性的IgG抗体，并测定其合胞体阻断活性。
实施例IV
本实施例阐明了使用酶免疫测定法(EIA)的抗肽抗体的检测。
根据参考文献9中所述方法，通过用如下表I和图1中所示的含有BE的各个V3肽类以每孔1μg的量涂EIA培养板(Covalink，Nunc.Denmark)即可进行可与不同构建体的V3肽反应之抗体的EIA检测。在4℃下温育30分钟后，用洗涤缓冲液(含有0.025％的吐温20(Bio-rad实验室，Richmond，CA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.0)洗涤培养板三次以除去未结合的肽类，然后在含有0.05％脱脂牛奶的PBS中以1∶50起始对每个实验血清样品进行三倍稀释，再将100μl经稀释的血清加入每个经肽涂的小孔中。血清样品每个稀释度的测定完全相同。通过将培养板在室温下温育1小时可使V3肽特异性抗体结合到固定化的肽上，用洗涤缓冲液将培养板洗涤三次即可除去未结合的抗体，再将制造商推荐的以1∶5000稀释于洗涤缓冲液中的100μl羊抗鼠IgG抗体与辣根过氧化物酶的偶联物(Jackson lab.，)加入每个测试孔以检测抗V3肽的抗体对靶肽的特异性结合。在室温下温育1小时后，用洗涤缓冲液将培养板洗涤四次以除去未结合的抗体-偶联物。通过加入100μl四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢的混合物(制造商推荐：1份TMB，9份过氧化氢，ADIDiagnostics Inc.，Willowdale，Canada)可测定所结合偶联物的量。在室温下黑暗中显色10-15分钟，并通过加入100μl 1N硫酸以中止反应，在450nm下用Titertek Multi Skan分光光度计(MCC/340型)读出酶反应的光密度，结果示于表III，它表示的是相应反应效价的平均值。不论是否单倍体型，正常鼠血清的相应效价总小于50。
本公开的概述
本公开可概括为本发明提供了能产生抗HIV-1感染的免疫应答的某些合成肽类及其四聚体形式，此肽类含有包含HIV-1gag蛋白T细胞抗原决定簇的氨基酸序列以及相应于包括GPGR序列的包膜蛋白和/或包括ELKDWA序列的gp41蛋白的V3环的氨基酸序列，本发明还提供了含有这种串联的合成肽类的疫苗组合物。还可在本发明的范围之内进行修饰。
表I
本公开说明书中描述的HIV-1嵌合肽类
肽 序列* SEQ ID NO：
p24E GPKEPFRDYVDRFYK 2CLTB-36(T-B) GPKEPFRDYVDRFYKNKRKRIHIGPGRAFYTTKN 3CLTB-37(B-T) NKRKRIHIGPGRAFYTTKNGPKEPFRDYVDRFYK 4CLTB-56(B) NKRKRIHIGPGRAFYTTKN 5CLTB-34(T-B) GPKEPFRDYVDRFYFRKRIHIGPGRAFYTTKN 6CLTB-35(B-T) RKRIHIGPGRAFYTTKNGPKEPFRDYVDRFYK 7CLTB-55(B) RKRIHIGPGRAFYTTKN 8D24E-V3MN(T-B) GPKEPFRDYVDRFYKRIHIGPGRAFYTTKN 9V3MN-p24E(B-T) RIHIGPGRAFTTTKNGPKEPFRDYVDRFYK 10V3MN(B) RIHIGPGRAFYTTKN 11CLTB-28(T-B) GPKEPFRDYVDRFYKRKRIHIGPGRAF 12CLTB-32(B-T) RKRIHIGPGRAFGPKEPFRDTVDRFYK 13CLTB-29(B) RKRIHIGPGRAF 14p24E-SP10(A) GPKEPFRDYVDRFYKCTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK 19CLTB-91 KQIINMWQEVEKAMYANKRKRIHIGPGRAFYTTKN 23T1-SP10(A)MN KQIINMWQEVEKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK 21CLTB-84(T-B) GHKAVLAEMSVTNKRKRIHIGPGRAFYTKN 29
*以黑体印刷的是用以构建方向为T-B或B-T的每个串联抗原决定簇的V3(MN)序列。
表II
HIV-1肽合剂在豚鼠中的免疫原性肽合剂 序列 抗肽*IgG效价 SEQ ID
弗氏 Alum NO：
CLTB-70+ GPKBPFRDYVDRFYKNTRKSIYIGPGKAFHTTGR 312,500 25,000 24CLTB-72+ GPKBPFRDYVDRFYKNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGK 312,500 25,000 25CLTB-74+ GPKEPFRDYVDRFYKNTRKSITKGPGKVIYATGQ 625,000 62,500 26CLTB-76+ GPKEPFRDYVDRFYKNTRQSTPIGLGQALYTTRG 625,000 12,500 27p24B-GP41C GPKEPFRDYVDRFYKSLISXSQNQQKKNHOKLLKLDKNAB 625,000 12,500 26
*用配制于FA或alum中的合剂启动和加强免疫豚鼠四次，测定抗用于制备此合剂的各个
个T-B串联抗原决定簇而产生的抗血清。所示结果为被配制于弗氏佐剂或alum中的五个不同
HIV-1串联抗原决定簇的合剂免疫接种的三只豚鼠之平均效价。此合剂含有：
CLTB-70(SEQ ID NO：24)，它含有与p24E C-末端相连接的SF2的V3序列，CLTB-72
(SEQ ID NO：25)它含有与p24E C-末端相连接的IIIB的V3序列：CLTB-74(SEQ ID NO：
26)，它含有与p24E C-末端相连接的RF的V3序列：CLTB-76(SEQ ID NO：27)，它含有
与p24E C-末端相连接的Z6的V3序列以及p24E-GP41C(SEQ ID NO：28)，它含有与
p24E C-末端相连接的HIV-1(BRU)的gp41序列。
表III
HIV-1肽类的免疫原性
相应的V3(MN)肽特异性抗体效价*免疫接种的肽 鼠 豚鼠
弗氏 Alum 弗氏 AlumCLTB-36(T-B) 328,050 109,350 109,350 12,150CLTB-37(B-T) 12,150 1,250 12,150 450CLTB-56(B) 450 150 1,250 450CLTB-34(T-B) 109,350 12,150 109,350 12,150CLTB-35(B-T) 450 450 1,250 900CLTB-55(B) 50 50 450 150p24E-V3MN(T-B) 36,450 1,250 36,450 2,700V3MN-p24E(B-T) 450 450 1,250 900
V3MN(B) ＜50 ＜50 150 150CLTB-28 (T-B) 36,450 4,050 36,450 1,250CLTB-32 (B-T) 150 150 12,150 450CLTB-29 (B) ＜50 ＜50 50 50p24E-SP10(A) NC 24,300 2,700 2,700CLTB-91 NC 145,800 58,600 8,100CLTB-84 108,000 48,600T1SP10(A)-MN 300 100 900 300
*所示结果为抗经配制于所示佐剂中的各个肽免疫接种的5只Balb/c(H-2d)和3只
Duncan Hartly豚鼠血清中含有包膜BE的各个V3(MN)肽反应所得相应抗体效价的平均值。NC＝未完成
表IV
CLTB-36在Cynomolgus猴中的免疫原性*猴编号 剂量(μg) 佐剂 CLTB-36特异性效价 中和效价(MN)14039 200 ISA51 25,600 27814040 200 ISA51 12,800 430*在第0、28和84天，用200μg乳化于Montanide ISA51(Seppic)中的CLTB-36将猴肌内注射免疫，测定第二次加强免疫(即第84天的免疫接种)后两周所收集的血清。
表V
抗V3肽类的抗CLTB-34和抗CLTB-36抗血清的EIA反应性V3肽序列 SEQ 分离物 效价
ID 抗CLTB-34* 抗CLTB-36*
NO： 鼠 豚鼠 鼠 豚鼠RKRIHIGPGRAF 31 MN 4,050 4,050 4,050 4,050TRSIHIGPGRAF 32 SC 1,350 4,050 4,050 4,050RRRIHIGPGRAF 33 JH3 4,050 4,050 4,050 4,050RKSIYIGPGRAF 34 SF2 1,350 450 1,350 450KSIRIQRGPGRAFVTIG 35 IAI 450 4,050 450 4,050RKRIRIQRGPGRAF 36 HXB2 150 1,350 150 1,350RKSITKGPGRVIYAT 37 RF 50 50 50 50
*给Balb/c小鼠和豚鼠皮下注射100μg吸附至1.5mg磷酸铝(alum)中的CLTB
-34或CLTB-36即可产生抗血清。所示结果为第四次注射后四只鼠和三只豚鼠
血清样品的平均值。
表VI
肽 序列* V3序列的分离物来源 SEQ
ID NO：CLTB-V3B GPKEPFRDYVDRFYKNTRKSIRIQRGPGRAFYTIG LAI 38CLTB-V3RF GPKEPFRDYVDRFYKNTRKSITKGPGRVIYATGQIIG RF 39
---- MN -----CLTB-HB GPKEPFRDYVDRFYKNKRKRIHIGPGRVIYATGQIIG MN/RF杂合体 40
--- RF ---CLTB-PRI GPKEPFRDYVDRFYKNTRKSIPIGPGRAFYTTG 纽约和阿姆斯 41
特丹的共有序列P24E-1714 GPKEPFRDYVDRFYKNTRKRIHMGPGRAFYATGDIIG 美国临床分离物 42P24E-FRE GPKEPFRDYVDRFYKNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGC 法国的共有序列 43CLTB-BX08 GPKEPFRDYVDRFYKNTRKSIHIGPGRAFYATGEIIG 法国初级分离物 44T1-PRI KQIINMWQEVEKAMYANTRKSIPIGPGRAFYTTG 纽约和阿姆斯 45
特丹的共有序列T1-2054 KQIINMWQEVEKAMYANTRKGIHIGPGRAFYTGEIVGDIRQ美国临床分离物 46
表VI(续)
P24M-PRI GHKARVLAEMSQVTNTKRSIPIGPGRAFYTG 纽约和阿姆斯特 47
丹的共有序列*黑体所示为用以构建各个串联抗原决定簇肽的V3序列，而非黑体字母所示为那些T细胞抗原决定簇，即p24E(GPKEPFRDYVDRFYK-SEQ ID NO：2)、T1(KQIINMWQEVEKAMYA-SEQ ID NO：22)和p24M(GHKARVLAEAMSQVT-SEQ ID NO：77)。
表VII
肽 序列* SEQ ID NO：CLTB-92 GPKEPFRDYVDRFYKEQELLELDKWASLWNWFDIT 54CLTB-92A EQKLLELDKWASLWNWFDIT 55CLTB-93 GPKEPFRDYVDRFYKELLELDKWASLWNWFDIT 56CLTB-94 ELLELDKWASLNWFDIT 57CLTB-95 GPKEPFRDYVDRFYKELDKWASLWNWFDIT 58CLTB-96 ELDKWASLWNWFDIT 59CLTB-97 GPKEPFRDYVDRFYKEQELLELDKWASLWNWF 60CLTB-97A EQELLELDKWASLWNWF 61LTB-98 GPKEPFRDYVDRFYKELLELDKWASLWNWF 62CLTB-99 GPKEPFRDYVDRFYKELDKWAHLWNWF 63CLTB-100 GPKEPFRDYVDRFYKEQELLELDKWA 64CLTB-101 GPKEPFRDYVDRFYKELLELDKWA 65T1-KAT1 KQIINMWQEVBKAMYAEQELLELDKWASLWNWF 66
表VII(续)
T1-KAT2 KQIINMWQEVEKAMYAELDXWAS 67T1-KAT3 KQIINMWQEVEKAMYAGPGELLELPKWASL 68*黑体所示为用以构建各个串联抗原决定簇肽的含有Katinger氏中和抗原决定簇(ELDKWA-SEQ ID NO：69)的gp41序列，而非黑体字母所示为T细胞抗原决定簇、p24E(GPKEPFRDYVDRFYK-SEQ ID NO：2)和T1(KQIINMWQEVEKAMYA-SEQID NO：22)。
表VIII
抗含有gp41中和抗原决定簇的HIV-1肽类的人单克隆抗体2F5的反应性肽* 吸光度(450nm)#CLTB-106(阴性对照) 0.07CLTB-92 0.63CLTB-92A 0.22CLTB-93 0.51CLTB-94 0.34CLTB-95 0.25CLTB-96 0.14CLTB-97 0.54CLTB-98 0.58CLTB-99 0.32CLTB-100 0.61CLTB-101 0.48CLTB-102 0.65CLTB-103 0.71CLTB-105 0.65CLTB-107 0.55MPK-1 0.77MPK-2 0.72MPK-3 0.76T1-KAT 1. 0.54T1-KAT 2 0.62T1-KAT 3 0.77*肽类的序列示于表IV、VI、和VIII。每种单独的肽以1μg/孔的量被涂在ELISA培养板上。人的中和单克隆抗体2F5在本公开所述ELISA法中所使用的量为40ng/孔。#阴性对照(0.07)两倍以上的吸光度读数被认为阳性结果。
表IX
肽 序列* V3序列的分离物来源 SEQ
ID NO：(P24N) QMREPRGSDIAGTTSTL 70
----- CLTB-56 -----CLTB-82 QMREPRGSD1AGTTSTLNKRKRIHIGPGRAFYTTKN MN 71CLTB-85 NKRKRIHIGPGRAFYTTKNQMREPRGSDIAGTTSTL MN 72(P24L) EEMMTACQGVGGPGHK 73CLTB-83 EEMMTACQGVGGPGHKNKRKRIHIGPGRAFYTTKN MN 74CLTB-87 NKRKRIHIGPGRAFYTTKNEEMMTACQGVGGPGHK MN 75(P24M) GHKARVLAEAMSQVT 76CLTB-84 GHKARVLAEAMSQVTNKRKRIHIGPGRAFYTTKN MN 77CLTB-89 NKRKRIHIGPGRAFYTTKNGHKARVLAEAMSQVT MN 78P24H PIVQNIQGQMVHQAI 79
------ PRI -------CLTB-156 PIVQNIQGQMVHQAINTRKSIPIGPGRAFYTTG 纽约和阿姆斯特丹的共有序列 80CLTB-157 NTRKSIPIGPGRAFYTTGPIVQNIQGQMVHQAI 纽约和阿姆斯特丹的共有序列 81T5 YKYKVVKIEPLGVAP 82
表IX(续)
CLTB-158 YKYKVVKIEPLGVAPNTRKSIPIGPGRAFYTTG 纽约和阿姆斯特丹的共有序列 83CLTB-159 NTRKSIPIGPGRAFYTTGYKYKVVKIEPLGVAP 纽约和阿姆斯特丹的共有序列 84*黑体所示为用以构建各个串联抗原决定簇肽的V3序列，而非黑体字母所示为T细胞抗原决定簇。
表X
肽 序列* SEQ ID NO：
---- gp41 -----CLTB-102 GPKEPFRDYVDRFYKELLELDKWASLWNWFNKRKRIHIGPGRAFYTTKN 85
----- CLTB-56 -----
--- CLTB-56 ------CLTB-103 GPKEPFRDYVDRFYKNKRKRIHIGPGRAFYTTKNELLELDKWASLWNWF 86
---- gp41 -----
----- gp41 ----CLTB-105 ELLELDKWASLWNWFNKRKRIHIGPGRAFYTTKNGPKEPFRDYVDRFYK 87
---- CLTB-56 ------
----- CLT8-56 -----CLTB-107 NKRKRIHIGPGRAFYTTKNELLELDKWASLWNWFGPKEPFRDYVDRFYK 88
----- gp41 ----
---- MN-1 -----T1-KAT4 KQIINMWQEVEKAMYAKRIHIGPGRAFYTTKGPGELLELDKWASL 89
--- gp41 --
---- MN-1 ----P24E-KAT4 GPKEPPRDYVDRFYKRIHIGPGRAFYTTKGPGLLELDKWASL 90
--- gp41 --CLTB-160 ----- LIP ---- --- THAI --- ----- NYA ------GPKEPFRDYVDRFYKKSIHIGPGKTLYATGPGSITIGPGQVFYRGPGRKSIPIGPGRAFYTTG 91
表X(续)
CLTB-161 ----- LIP ---- --- THAI --- ----- NYA -----
KQIINMWQEVEKAMYAKSIHIGPGKTLYATGPGSITIGPGQVFYRGPGRKSIPIGPGRAFYTTG 92*黑体所示为掺入各个构建体的不同V3序列，也显示了V3序列的分离物来源。对于构建体CLTB-160和CLTB-161，LIP表示伦敦、印度和巴黎分离物的共有序列，THAI表示泰国HIV-1病毒的V3，NYA表示在纽约和阿姆斯特丹发现的初级分离物的共有序列。非黑体字母所示为T细胞抗原决定簇p24E和T1。
表XI
肽 序列* SEQ ID NO：MPK- 1 KQIINMWQEVEKAMYAGPGELDKWASGPGGPKEPFRDYVDRFYK 94
------ T1 ------ ---- p24E -----MPK- 2 GPKEPFRDYVDRFYKGPGELDKWASGPGKQIINMWQEVEKAMYA 95MPK- 3 KQIINMWQEVEKAMYAGPGELDKWASGPGELDKWASGPGGPKEPFRDYVDRFYK 96MPK- 4 GPKEPFRDYVDRFYKGPGELDKWASGPGELDKWASGPGKQIINMWQEVEKAMYA 97*黑体所示为用以构建各个肽的gp41序列，而非黑体字母所示为T细胞抗原决定簇p24E和T1，以斜体字母表示的是接头序列GPG。
表XII
鼠和豚鼠抗HIV-1(MN)肽类产生的抗血清的功能活性相应的合胞体阻断效价a)抗血清 鼠 豚鼠
弗氏 Alum 弗氏 AlumCLTB-36 10 60 90 40CLTB-37 ＜10 ＜10 10 10CLTB-56 ＜10 ＜10 10 ＜10CLTB-34 10 ＜10 20 40CLTB-35 ＜10 ＜10 10 ＜10CLTB-55 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10p24E-V3MN 80 ＜10 90 ＜10V3MN-p24E ＜10 ＜10 ＜10 ＜10V3MN ＜10 ＜10 ＜10 ＜10CLTB-28 ＜10 ＜10 90 ＜10CLTB-32 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10CLTB-29 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10a)效价所根据的是对经同种HIV-(MN)病毒诱导的合胞体形成＞90％的抑制作用
表XIII
分支的HIV-1肽类的免疫原性a) 相应的V3(MN)肽特异性抗体效价免疫接种 鼠 豚鼠的肽
弗氏 Alum 弗氏 AlumCLTB-36(MAP) 12,150 12,150 24,300 12,150CLTB-34(MAP) NC NC 12,150 12,150CLTB-91(MAP) NC NC 24,300 8,100p24E-V3MN(MAP) NC NC 24,300 NCVP-TB(MAP) NC NC 2,700 2,700a)所示结果为抗各个含BE肽(如图1所示)的相应反应效价的平均值。每次测定使用三只豚鼠和五只小鼠。NC：未完成
表XIV
抗分支肽类产生的抗血清的功能活性
相应的合胞体阻断效价a)免疫接种的肽 鼠 豚鼠
弗氏 Alum 弗氏 AlumCLTB-36(MAP) ＞10 ＞10 10 35CLTB-34(MAP) NC NC 20 40VP-TB(MAP) NC NC 10 10a)效价所根据的是对经MN分离物诱导的合胞体形成＞90％的抑制作用。NC：未完成。
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Claims (56)
1.合成肽，含有至少一个含有人免疫缺陷病毒(HIV)分离物gag蛋白的T细胞抗原决定簇的氨基酸序列，此序列在其N-末端或C-末端与至少一个含有HIV分离物包膜蛋白V3环的B细胞抗原决定簇的氨基酸序列相连接，其中当位于所说N-末端时，所说含有B细胞抗原决定簇的序列与所说含有T细胞抗原决定簇的序列直接偶联。
2.权利要求1的合成肽，其中所说HIV分离物是HIV-1分离物。
3.权利要求2的合成肽，其中所说V 3环是选自LAV、BRU、MN、SF2、RF、PRI、1714、2054、HXB2、Z6、BX08、IIIB和SC中的HIV-1分离物的V3环。
4.权利要求3的合成肽，其中所说含有T细胞抗原决定簇的氨基酸序列含有选自具有表I和IX所示氨基酸序列的p24E、p24N、p24L、p24M和p24H中的一种，或者含有保留了所说经选择序列的T细胞特性的任何选择序列的部分、变异体或突变体。
5.权利要求4的合成肽，其中所说含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列含有序列GX1GX2，其中X1是P或L，X2是R、K或Q，或含有能产生HIV特异性抗血清并能识别序列GX1GX2的序列。
6.权利要求5的合成肽，其中所说含有T细胞抗原决定簇的氨基酸序列含有p24E或其保留了此序列T细胞特性的部分、变异体或突变体，所说含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列含有序列GPGR或者含有能产生HIV特异性抗血清并能识别序列GPGR的序列。
7.权利要求6的合成肽，其中所说含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列与所说含有T细胞的氨基酸序列的C-末端直接偶联。
8.权利要求6的合成肽，其中所说含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列包含序列NKRKRIHIGPGRAFYTTKN(CTLB-56)或其保留了此序列B细胞特性的部分、变异体或突变体。
9.如权利要求5的合成肽，其中所说含有B细胞的氨基酸序列选自序列NKRKRIHIGPGRAFYTTKN(CTLB-56)，RIHIGPGRAFYTTKN(V3MN)，RKRIHIGPGRAF(CTLB-29)，RKRIHIGPGRAFYTTKN(CTLB-55)，NTRKSIYIGPGRAFHTTGR(SF2)，NTRKRIRIQRGPGRAFVTIGK(LAI)，NTRKSIRIQRGPGRAFYTIG(IIIB)，NTRKSITKGPGRVIYATGQ(RF)，NTRKSITKGPGRVIYATGQIIG(RF)，NTRQSTPIGLGQALYTTRG(Z6)，NTRKGIHIGPGRAFYTGEIVGDIRQ(2054)，NTRKRIHMGPGRAFYATGDIIG(1714)，NTRKSIHIGPGRAFYATGEIIG(BX08)，或其保留了所述序列B细胞特性的部分、变异体或突变体。
10.权利要求3的合成肽，其中所说含有B细胞抗原决定簇的序列包含来自至少两个不同HIV-1分离物的含有B细胞抗原决定簇的V3环序列。
11.权利要求10的合成肽，其中所说含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列包含序列NTRKSIRIQRGPGRAFYTTKN(VP)或NKRKRIHIGPGRVIYATGQIIG(HB)，或其保留了所述序列B细胞特性的部分、变异体或突变体。
12.权利要求3的合成肽，其中所说含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列包含至少两个HIV-1初级分离物V3环的共有序列。
13.权利要求12的合成肽，其中所说B细胞抗原决定簇的氨基酸序列包含序列NTRKSIPIGPGRAFYTTG(PRI)，NTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGC(FRE)或其保留了所述序列B细胞特性的部分、变异体或突变体。
14.权利要求8至13中任何一项的合成肽，它与所说含有T细胞的氨基酸序列的C-末端相连接。
15.权利要求4的合成肽，其中含有B细胞抗原决定簇的序列另外还与含有HIV gag蛋白或包膜蛋白的T细胞抗原决定簇的另一个氨基酸序列相连接。
16.合成肽，它含有至少一种包含人免疫缺陷病毒(HIV)分离物gag蛋白的T细胞抗原决定簇的氨基酸序列，此序列在其N-末端或C-末端与至少一种包含HIV分离物gp 41蛋白的B细胞抗原决定簇的氨基酸序列相连接，后者包含序列X1LKDWX2，其中X1是E、A、G或Q，X2是A或T，或者包含能产生HIV特异性抗血清并能识别序列X1LKDWX2的序列。
17.权利要求16的合成肽，其中所说HIV分离物是HIV-1分离物。
18.权利要求17的合成肽，其中所说gp41蛋白是选自LAV、BRU、MN、SF2、RF、PRI、1714、2054、HXB2、Z6、BX08、IIIB和SC中的HIV-1分离物的gp41蛋白。
19.权利要求18的合成肽，其中所说含有T细胞抗原决定簇的氨基酸序列包含选自具有表I和IX所示氨基酸序列的p24E、p24N、p24L、p24M和p24H中的一种，或保留了所说经选择序列T细胞特性的任何选择序列的部分、变异体或突变体。
20.权利要求16的合成肽，其中所说含有T细胞抗原决定簇的氨基酸序列包含p24E或其保留了此序列T细胞特性的部分、变异体或突变体，所说含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列包含序列ELKDWA或包含能产生HIV特异性抗血清并能识别序列ELKDWA的序列。
21.权利要求20的合成肽，其中所说含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列与所说含有T细胞的氨基酸序列的C-末端直接偶联。
22.权利要求20的合成肽，其中所说含有B细胞抗原决定簇的氨基酸序列选自序列EQELLELDKWASLWNWFDTT(CLTB-92A)，ELLELDKWASLWNWFDIT(CLTB-94)，ELDKWASLWNWFDIT(CLTB-96)，EQELLELDKWASLWNWF(CLTB-97A)，ELLELDKWASLWNWF，ELDKWASLWNWF，EQELLELDKWA，ELLELDKWA，ELDKWAS和GPGELLELDKWASL或者其保留了所述序列B细胞特性的部分、变异体或突变体。
23.权利要求16的合成肽，其中所说含有B细胞抗原决定簇的序列另外还与含有至少一个HIV分离物包膜蛋白V3环的B细胞抗原决定簇的氨基酸序列相连接。
24.权利要求23的合成肽，其中所说B细胞抗原决定簇是表X所示序列中的一种，或其保留了所述序列B细胞特性的部分、变异体或突变体。
25.权利要求19的合成肽，其中所说含有B细胞抗原决定簇的序列另外还与含有HIV gag蛋白或包膜蛋白的T细胞抗原决定簇的另一个氨基酸序列相连接。
26.权利要求25的合成肽，其中所说另一个含有B细胞抗原决定簇的序列另外还与含有HIV分离物的gp41或V3环包膜蛋白的B细胞抗原决定簇的至少一个其它氨基酸序列相连接。
27.权利要求25的合成肽，它包含表XI所示氨基酸序列中的一种，或其保留了所述序列B细胞特性的部分、变异体或突变体。
28.合成的肽分子，含有连接成多聚体分子的多种单个合成肽类，每种所说单个合成肽类含有包含人免疫缺陷病毒(HIV)分离物gag或包膜蛋白的T细胞抗原决定簇的氨基酸序列，此序列与含有HIV分离物gag或包膜蛋白的B细胞抗原决定簇的氨基酸序列相连接。
29.权利要求28的合成肽分子，其中所说多聚体分子中的每种合成肽是相同的。
30.权利要求28的合成肽分子，其中所说单个合成肽类选自权利要求1和权利要求17所要求的合成肽类。
31.权利要求28的合成肽分子，其中所说多聚体分子含有氨基酸序列：
[GPKEPFRDYVDRFYKNKRKRIHIGPGRAFYTTKN]4或其保留了此序列T和B细胞特性的部分、变异体或突变体。
32.权利要求28的合成肽分子，其中所说多聚体分子含有氨基酸序列：
[GPKEPFRDYVDRFYKRKRIHIGPGRAFYTTKN]4或其保留了此序列T和B细胞特性的部分、变异体或突变体。
33.权利要求28的合成肽分子，其中所说多聚体分子含有氨基酸序列：
[GPKEPFRDYVDRFYKNTRKSIRIQRGPGRAFYTTKN]4或其保留了此序列T和B细胞特性的部分、变异体或突变体。
34.权利要求28的合成肽分子，其中所说多聚体分子含有氨基酸序列：
[KQIINWQEVEKAMYANKRKRIHIGPGRAFYTTKN]4或其保留了此序列T和B细胞特性的部分、变异体或突变体。
35.权利要求28的合成肽分子，其中所说多聚体分子含有氨基酸序列：
[GPKEPFRDYVDRFYKRIHIGPGRAFYTTKN]4或其保留了此序列T和B细胞特性的部分、变异体或突变体。
36.免疫原性组合物，含有免疫有效量的至少一种如权利要求1、16和28中任一项所要求的合成肽或者至少一种编码任一所说合成肽类的核酸分子以及药学上可接受的载体。
37.权利要求36的免疫原性组合物，含有多种经选择可为多种有免疫学差异的HIV-1分离物提供免疫应答的所说合成肽类。
38.权利要求37的免疫原性组合物，其中所说多种合成肽类可进一步选择成能为多种对T细胞抗原决定簇有不同反应性的宿主提供所说免疫应答。
39.权利要求38的免疫原性组合物，其中所说多种合成肽类包含：
GPKEPFRDYVDRFYKNKRKRIHIGPGRAFYTTKN(CTLB-36)
KQIINMWQEVEKAMYANKRKRIHIGPGRAFYTTKN(CTLB-91)
GPKEPFRDYVDRFYKNTRKSIHIGPGRAFYATGEIIG(BX08)。
40.权利要求39的免疫原性组合物，其中所说多种合成肽类进一步包含：
GPKEPFRDYVDRFYKGPGELDKWASGP6KQIINMWQEVEKAMYA(MPK-2)。
41.权利要求36的免疫原性组合物，配制用于粘膜或非肠道给药。
42.权利要求41的免疫原性组合物，进一步包含至少一种其它免疫原性或免疫刺激性物质。
43.权利要求42的组合物，其中所述的至少一种其它物质是佐剂。
44.权利要求43的组合物，其中佐剂是磷酸铝或氢氧化铝。
45.权利要求36的组合物，配制成供人使用的疫苗。
46.免疫宿主的方法，包括给宿主施用免疫有效量的权利要求36的免疫原性组合物。
47.权利要求46的方法，其中免疫原性组合物配制用于粘膜或非肠道给药。
48.权利要求47的方法，其中免疫原性组合物进一步包含至少一种其它免疫原性或免疫刺激性物质。
49.权利要求48的方法，其中所述的至少一种其它物质是佐剂。
50.权利要求49的方法，其中佐剂是磷酸铝或氢氧化铝。
51.权利要求49的方法，其中的宿主是人。
52.权利要求46的方法，其中通过至少一种使用自我装配的、非传染性、非复制性HIV样颗粒的前肽免疫接种启动宿主，然后施用所说免疫原性组合物作为所述宿主的至少一次再次免疫。
53.用于检测试样中HIV特异性抗体的诊断试剂盒，此试剂盒包括：
(a)表面；
(b)至少一种如权利要求1、16和28中任一项所要求的肽，
它具有的氨基酸序列中抗原决定簇对于固定于表面的HIV特异性抗体而言是特异性的；
(c)使抗体和至少一种固定肽接触以形成复合物的手段；和
(d)检测复合物的手段。
54.用于检测试样中HIV抗原的诊断试剂盒，此试剂盒包括：
(a)表面；
(b)抗体，其抗原决定簇对于固定于表面的HIV抗原之不同抗原决定簇而言是特异性的且无交叉反应性，此抗体是由如
权利要求1、16和28中任一项所要求的所说肽产生的；
(c)使抗体与HIV抗原接触以形成复合物的手段；和
(d)检测复合物的手段。
55.编码如权利要求1、16和28中任一项所要求的合成肽的核酸序列。
58.如权利要求1、16和28中任一项所要求的任一合成肽的特异性抗体。
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