CN117264028A

CN117264028A - 一种重组vsv载体、重组vsv病毒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117264028A
Application number: CN202311258654.XA
Authority: CN
Inventors: 张�荣; 马艳龙; 马雪
Original assignee: Shanghai Institute Of Major Infectious Diseases And Biosafety
Current assignee: Shanghai Institute Of Major Infectious Diseases And Biosafety
Priority date: 2023-09-27
Filing date: 2023-09-27
Publication date: 2023-12-22

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组VSV载体、重组VSV病毒及其制备方法和应用。本发明将编码缺失53个氨基酸的CCHFV GPC序列的核酸片段和报告基因同时插入到VSV载体质粒中，拯救了获得同时表达CCHFV GPC和EGFP的重组病毒。该重组VSV病毒可复制到较高滴度，感染细胞后发生多轮的复制，灵敏度高，可高效快速地评价针对CCHFV包膜糖蛋白GPC的中和抗体效价、疫苗免疫效果、CCHFV入侵机制研究以及应用于CCHFV单轮感染假病毒颗粒的高效包装。由于包含报告基因，可以更灵敏、便捷、直观、高效的检测假病毒的感染情况，有利于开展高通量研究工作，大大降低了成本。

Description

一种重组VSV载体、重组VSV病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组VSV载体、重组VSV病毒及其制备方法和应用。

背景技术

克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)，又称新疆出血热病毒，属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)、内罗病毒科(Nairoviridae)、正内罗病毒属(Orthonairovirus)，是一种分节段有囊膜的负链RNA病毒。基因组分为3个节段分别为S、M和L，分别编码病毒核衣壳蛋白、包膜糖蛋白和RNA依赖的RNA聚合酶。CCHFV感染所引发的克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever,CCHF)是流行于中国、俄罗斯、欧洲、中东以及非洲的一种烈性、高致病性和高传播性的传染病，其临床症状为发热、多器官出血、坏死和功能衰竭，病死率极高，一般在30％-50％，最高可达80％。目前针对CCHFV尚没有特效药物和预防疫苗。

CCHFV属于生物安全三级的病毒，CCHFV所有活病毒的操作需要在三级的生物安全实验室完成，严重限制了对CCHFV的研究。因此，建立一种能够在生物安全二级实验室进出操作的病毒模型，用于高效快速的评价针对CCHFV的中和抗体、疫苗免疫效果以及入侵抑制剂和入侵相关机制的研究，具有重大意义。

假病毒系统在一定程度可以模拟真病毒的入侵过程。现有研究已经建立了能够在生物安全二级实验室进行操作的CCHFV假病毒模型系统，例如包装CCHFV包膜糖蛋白GPC的水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)单轮感染假病毒系统和可复制型假病毒系统。然而，目前还没有同时将CCHFV包膜糖蛋白GPC的序列和含有EGFP或者其他报告基因的序列同时插入到VSV病毒载体中成功拯救病毒的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种重组VSV载体、重组VSV病毒及其制备方法和应用。本发明制备得到的表达CCHFV GPC和报告基因的重组病毒可用于针对CCHFV的中和抗体效价、疫苗免疫效果的评价、CCHFV入侵机制的研究、作为预防CCHFV感染的候选疫苗，也可应用于包装高效的单轮感染CCHFV假病毒颗粒。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

CCHFV包膜糖蛋白GPC突变体，其在野生型CCHFV包膜糖蛋白GPC的序列中缺失C端末尾53个氨基酸，且包含R516K或L518V单点突变；

所述野生型CCHFV包膜糖蛋白GPC的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。

本发明还提供了编码CCHFV包膜糖蛋白GPC突变体的核酸片段，包括：

i)、编码权利要求1所述的CCHFV包膜糖蛋白GPC突变体的核酸片段；和/或

ii)、编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸片段。

本发明中编码CCHFV包膜糖蛋白GPC突变体的核酸片段经过密码子优化，其序列为：

I)、如SEQ ID NO:1所示的序列；或

II)、SEQ ID NO:1所示的序列中第1547位碱基由G突变为A获得的序列；

III)、SEQ ID NO:1所示的序列中第1552位碱基由C突变为G获得的序列；

IV)、在I)、II)或III)所示的核苷酸序列中取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且编码的蛋白功能相同或相似的核苷酸序列；或

V)、与I)～IV)任一项所述序列至少有90％同源性的序列。

其中，缺失C端末尾53个氨基酸的CCHFV包膜糖蛋白GPC突变体的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，其编码基因经密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

缺失C端末尾53个氨基酸，且包含R516K单点突变氨基酸序列的突变体，其编码基因的核酸序列经密码子优化，优化后的序列为SEQ ID NO:1(缺失C端末尾53个氨基酸的突变体)所示的序列中第1552位碱基由C突变为G获得的序列。

缺失C端末尾53个氨基酸，且包含L518V单点突变氨基酸序列的突变体，其编码基因的核酸序列优化后的序列为：在SEQ ID NO:1所示的序列中第1547位碱基由G突变为A获得的序列。

本发明还提供了重组VSV载体，包括：VSV载体质粒、本发明所述的编码CCHFV包膜糖蛋白GPC突变体的核酸片段和目的基因；

所述VSV载体质粒为包含VSV基因组序列且编码VSV包膜糖蛋白的G基因缺失的质粒。

一些实施方案中，所述目的基因为报告基因；所述报告基因为GFP、EGFP、mCherry、RFP、YFP、mNeonGreen、TurboGFP、mGreenLantern、ZsGreen、mKate2、NanoLuc luciferase、Firefly luciferase、Gaussia luciferase、Renilla luciferase等。

一些具体实施例中，所述目的基因为报道基因EGFP。本发明将编码缺失53个氨基酸的CCHFV GPC突变体的核酸片段和报告基因同时插入到VSV载体质粒中，拯救了获得同时表达CCHFV GPC和EGFP的重组病毒。该重组VSV病毒可复制到较高滴度，感染细胞后发生多轮的复制，灵敏度高，在BHK-21细胞和Vero E6细上的滴度最高分别达到10⁷PFU/mL、10⁶PFU/mL，可高效快速地评价针对CCHFV包膜糖蛋白GPC的中和抗体效果、疫苗免疫效果以及CCHFV入侵机制的研究。由于包含报告基因，有利于开展高通量研究工作，如筛选CCHFV感染相关的宿主因子、筛选入侵的抑制剂。

所述目的基因为抗原蛋白基因；所述抗原蛋白基因包括编码病毒抗原、肿瘤抗原或表达宿主与病原微生物抗原的基因。

本发明中，所述编码CCHFV包膜糖蛋白GPC的核酸片段为：

核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，或在SEQ ID NO.1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且编码的蛋白功能相同或相似的核酸片段，或与SEQ IDNO.1所示序列具有至少90％同源性且编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的GPC蛋白的核酸片段。

本发明中，编码C末端缺失53个氨基酸GPC的核酸片段的扩增引物包括：上游引物pC-CCHFV-GPC-F(序列如SEQ ID NO.3)下游引物pC-CCHFV-GPC-R(序列如SEQ ID NO.4)。

本发明中，所述VSV载体质粒为包含VSV基因组序列且编码VSV包膜糖蛋白的G基因缺失的质粒的载体质粒。一些实施方案中，所述VSV载体质粒的骨架为pBlueScript系列载体、pSMART系列载体或细菌人工染色体BAC系列载体等。

本发明中，所述报告基因为GFP、EGFP、mCherry、RFP、YFP、mNeonGreen、TurboGFP、mGreenLantern、ZsGreen、mKate2、NanoLuc luciferase、Firefly luciferase、Gaussialuciferase、Renilla luciferase等。一些具体实施例中，所述报告基因为EGFP。

本发明还提供一种水疱性口炎病毒VSV的可复制型假病毒系统，包括本发明所述的重组病毒质粒、包含VSV病毒N、P、L、G基因的辅助质粒以及包装细胞。

本发明中，所述包含VSV病毒N、P、L、G基因的辅助质粒包括辅助质粒1、辅助质粒2、辅助质粒3和辅助质粒4，分别表达N、P、L、G蛋白。一些实施方案中，所述重组病毒质粒和辅助质粒1、辅助质粒2、辅助质粒3和辅助质粒4的质量比为10:(2-8):(3-6.5):(1-3):(1-8)。一些具体实施例中，所述比例具体为10:3:3:3:3，10:5:4:2:1、10:5:3:1:2、10:2:6.5:1.25:2、10:2.5:6.5:1.25:2、10:8:4:1:8，优选为10:3:3:3:3。

本发明中，所述包装细胞为表达T7 RNA聚合酶的293T细胞。

本发明还提供一种重组VSV病毒，由本发明所述的重组病毒质粒经包装细胞包装而成。

一些实施方案中，所述包装细胞为表达T7 RNA聚合酶的293T细胞。

本发明还提供了所述的重组VSV病毒的制备方法，包括:

将本发明所述的重组VSV载体(命名为pBlue-VSV(ΔG)-CCHFV-GPCΔ53)、分别包含VSV病毒N基因、P基因、L基因、G基因的辅助质粒1、辅助质粒2、辅助质粒3和辅助质粒4共转染表达T7 RNA聚合酶的宿主细胞，收集上清，传代，获得重组VSV病毒。

所述重组病毒质粒和辅助质粒1、辅助质粒2、辅助质粒3和辅助质粒4的质量比为10:3:3:3:3。

一些实施方案中，辅助质粒1、辅助质粒2、辅助质粒3和辅助质粒4分别包含VSV病毒N、P、L、G基因的开放阅读框全长序列，引物序列如SEQ ID NO.5到SEQ ID NO.12所示。

所述宿主细胞为表达T7 RNA聚合酶的293T细胞；待宿主细胞培养至80％-90％汇合度进行所述共转染。

所述传代用的细胞系为BHK-21，传代次数为2～3次。

本发明中，在所述传代的同时还包括加入抗VSV G蛋白的中和抗体步骤，用于中和含G蛋白的VSV病毒。

进一步的，一些实施方案中，本发明提供的重组VSV重组病毒的构建过程具体包括如下步骤：

(1)pC-CCHFV-GPCΔ53质粒的构建

以密码子优化合成的GPC核苷酸序列为模版，设计引物pC-CCHFV-GPC-F和pC-CCHFV-GPC-R通过PCR扩增有C末端缺失53个氨基酸的GPC，然后与经限制性内切VSV基因组载体酶EcoR I和Xho I双酶切后的pCAGGS载体连接，构建获得C末端缺失53个氨基酸的GPC表达质粒pC-CCHFV-GPCΔ53；所述质粒的包膜糖蛋白GPC的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

(2)重组质粒pC-VSV-N、pC-VSV-P、pC-VSV-L和pC-VSV-G质粒的构建

以pBlue-VSV-GFP质粒为模版，设计引物pC-VSV-N-F、pC-VSV-N-R、pC-VSV-P-F、pC-VSV-P-R、pC-VSV-L-F、pC-VSV-L-R、pC-VSV-G-F、pC-VSV-G-R分别扩增VSV的N、P、L和G基因的开放阅读框，然后与经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切后的pCAGGS载体连接，构建获得VSV的N、P、L和G表达质粒pC-VSV-N、pC-VSV-P、pC-VSV-L和pC-VSV-G。

(3)重组质粒pBlue-VSV(ΔG)-CCHFV-GPCΔ53质粒的构建

以pC-CCHFV-GPCΔ53质粒为模版，设计引物pBlue-VSV-GPC-F和pBlue-VSV-GPC-R，扩增目的片段CCHFV-GPCΔ53片段，然后与经限制性内切酶Mlu I和Xho I双酶切后的pBlue-VSV-GFP质粒相连接，构建获得了缺失VSV G基因表达CCHFV-GPCΔ53片段的重组质粒pBlue-VSV(ΔG)-CCHFV-GPCΔ53；

(4)VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒的拯救

表达T7 RNA聚合酶的293T-T7细胞培养至80％-90％汇合度时，通过磷酸钙转染的方法，将重组质粒pBlue-VSV(ΔG)-CCHFV-GPCΔ53和辅助质粒pC-VSV-N、pC-VSV-P、pC-VSV-L和pC-VSV-G共同转染293T-T7细胞，转染48小时后收集上清，在BHK-21连续传代3次，传代同时加入抗VSV G蛋白的中和抗体，最终获得重组VSV病毒同时表达CCHFV GPC和报告基因EGFP的报告病毒，命名为VSV-CCHFV-GFP。

进一步的，步骤(1)中所述引物pC-CCHFV-GPC-F和pC-CCHFV-GPC-R基因序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

进一步的，步骤(2)中所述引物pC-VSV-N-F、pC-VSV-N-R、pC-VSV-P-F、pC-VSV-P-R、pC-VSV-L-F、pC-VSV-L-R、pC-VSV-G-F、pC-VSV-G-R的序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ IDNO.12所示。

进一步的，步骤(3)中所述引物pBlue-rVSV-GPC-F和pBlue-rVSV-GPC-R序列如SEQID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

本发明还提供了所述的重组VSV载体、所述的可复制型假病毒系统、所述的重组VSV病毒或本发明制备方法制得的重组VSV病毒在如下至少一方面中的应用：

I)、在CCHFV中和抗体效价评估中的应用；

II)、在CCHFV入侵机制的研究中的应用；

III)、在制备CCHFV疫苗中的应用，或CCHFV疫苗免疫效果评价中的应用；

IV)、在CCHFV单轮感染假病毒颗粒包装中的应用。

本发明还提供一种CCHFV疫苗，包括本发明所述的重组VSV病毒、本发明制备方法制得的重组VSV病毒或本发明所述的重组VSV载体。

本发明还提供了由上述方法制备得到的基于VSV载体同时表达CCHFV GPC蛋白和EGFP蛋白的报告病毒VSV-CCHFV-GFP。

本发明还提供了上述制备的重组VSV病毒(简称VSV-CCHFV-GFP)在CCHFV的中和抗体效价评估、入侵机制研究以及在CCHFV单轮感染假病毒颗粒包装中的应用。

本发明将编码CCHFV包膜糖蛋白GPC截短序列的核酸片段和报告基因同时插入到VSV载体质粒中，拯救了获得同时表达CCHFV包膜糖蛋白GPC和报告基因(EGFP)的重组病毒。与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、相比单轮感染假病毒系统，本发明可复制型假病毒，可以复制到较高滴度，感染细胞后发生多轮的复制，灵敏度高，毒种准备容易，成本低；

2、相比现有的可复制型假病毒，除了表达包膜糖蛋白基因GPC，本发明重组VSV载体、重组VSV病毒还插入了表达EGFP的报告基因。报告基因的插入，可以更灵敏、便捷、直观、高效的检测假病毒的感染情况，降低成本。构建同时表达较大片段的包膜糖蛋白GPC和报告基因，难度加大，这是本专利的优势和与之前专利的不同之处。因为含有EGFP报告基因，可以通过荧光显微镜、流式细胞仪，高内涵扫描等仪器直观、迅速得判断病毒的感染情况。

3、相比现有的可复制型假病毒，表达包膜糖蛋白GPC的序列长度和编码基因的序列均不同。现有GPC蛋白的胞内段缺失14个氨基酸。本发明在胞内段缺失了GPC蛋白C末端53个氨基酸，并且对核苷酸序列进行了优化，最终明显提高了病毒滴定和拯救效率。

4、相比现有的可复制型假病毒，拯救方式不同。现有技术已公开的是依赖表达T7聚合酶的痘病毒的辅助完成拯救，而本发明是直接转染真核表达质粒，拯救方式更便利，不用后期纯化病毒，减少了痘病毒的污染发生。

5、拯救获得的VSV-CCHFV-GPC重组病毒的GPC蛋白，除含有初始设计的C端末尾53个氨基酸缺失和R516K突变，关键的点突变R516K可显著地提高包装单轮感染CCHFV假病毒颗粒效率，显著高于现有GPC蛋白的胞内段缺失14个氨基酸或含有L518V点突变。

附图说明

图1为pBlue-VSV(ΔG)-CCHFV-GPCΔ53质粒的图谱；

图2为VSV-CCHFV-GFP重组病毒的鉴定：图2A为显示VSV-CCHFV-GFP测序突变位点R516K；图2B为VSV-CCHFV-GFP病毒和VSV-GFP病毒的噬斑形态；

图3为斑点形成实验(FFA)检测VSV-CCHFV-GFP病毒在BHK-21细胞和Vero E6细胞上的生长曲线；

图4为流式检测VSV-CCHFV-GFP病毒感染A549细胞后细胞表面Gc表达；

图5为用VSV-CCHFV-GFP感染测试不同来源细胞的敏感性：图5A为流式检测VSV-CCHFV-GFP感染不同来源细胞后的感染效率；图5B为荧光显微镜检测VSV-CCHFV-GFP感染不同来源细胞后的荧光图；

图6为不同抗体对VSV-CCHFV-GFP和VSV-GFP的中和效果评价：图6A为抗CCHFV-Gc和抗VSV-G中和抗体对VSV-CCHFV-GFP的中和曲线；图6B为抗CCHFV-Gc和抗VSV-G中和抗体对VSV-GFP的中和曲线；图6C为抗体对VSV-CCHFV-GFP和VSV-GFP的中和效价IC50值；图6D为VSV-CCHFV-GFP和VSV-GFP在有和无抗CCHFV-Gc和抗VSV-G中和抗体下的荧光图；

图7为VSV-CCHFV-GFP用于研究硫酸乙酰肝素对入胞的影响：图7A为流式检测敲除B3GAT3和B4GALT7后细胞表面的硫酸乙酰肝素的表达；图7B流式检测VSV-CCHFV-GFP和VSV-GFP感染野生型或敲除B3GAT3或B4GALT7的A549细胞上的感染效率。

图8为VSV-CCHFV-GFP重组病毒的GPC蛋白用于单轮感染假病毒颗粒的包装：图8A为荧光显微镜下观察不同缺失或突变的CCHFV GPC蛋白包装的假病毒感染BHK-21效率；图8B为流式细胞术检测不同缺失或突变的CCHFV GPC蛋白包装的假病毒感染BHK-21效率。

具体实施方式

本发明提供了一种重组VSV载体、重组VSV病毒及其制备方法和应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

本发明中，经人源密码子优化后的CCHFV包膜糖蛋白GPC的基因全长为5055bp，将该序列克隆至质粒载体pUC57。然后以pUC57-GPC质粒为模版，构建包含C末端缺失53个氨基酸的GPC编码序列的表达质粒pC-CCHFV-GPCΔ53，在此基础上将CCHFV GPC(Δ53)片段克隆至pBlue-VSV-GFP质粒中，构建成pBlue-VSV(ΔG)-CCHFV-GPCΔ53重组质粒。将该质粒与VSV辅助质粒pC-VSV-N、pC-VSV-P、pC-VSV-L和pC-VSV-G共同转染至稳定表达T7 RNA聚合酶的293T-T7细胞，拯救出同时表达CCHFV包膜糖蛋白GPC和报告基因EGFP的重组VSV病毒。该报告病毒可用于针对CCHFV包膜糖蛋白GPC的中和抗体效价和疫苗免疫效果的评价、CCHFV入侵机制的研究、作为预防CCHFV感染的候选疫苗，也可应用于包装高效的单轮感染CCHFV假病毒颗粒。

本发明采用的产品和材料来源如下：

大肠杆菌Stbl3感受态和磷酸钙转染试剂购自赛默飞世尔科技有限公司；pUC57-CCHFV-GPC质粒由南京金斯瑞公司合成；pCAGGS载体购自Addgene；pBlue-VSV-GFP质粒是以pBlueScript为骨架按照本领域常规技术手段插入VSV基因组全长序列和GFP序列获得；稳定表达T7 RNA聚合酶的293T-T7细胞由本课题组之前构建并保存；VSV-GFP病毒和VSV(ΔG)/G单轮感染病毒颗粒病毒由本课题组制备并保存，抗CCHFV-Gc和抗VSV-G中和抗体由本课题组制备并保存；抗体mouse-anti-HS monoclonal antibody购自USBio公司；抗体goat-anti-mouse IgM conjugated with Alexa Fluor 647和goat-anti-human IgGconjugated withAlexa Fluor 647购自赛默飞世尔科技有限公司；本发明使用的限制性内切酶和Next Ultra IIQ5高保真DNA聚合酶购自NEB生物技术有限公司；MUL组装克隆试剂盒购自上海朗晶生物技术公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1基于水疱性口炎病毒(VSV)载体的克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)荧光报告病毒的制备

(1)pC-CCHFV-GPCΔ53质粒的构建

本实验所使用的CCHFV包膜糖蛋白GPC为CCHFV IbAr10200毒株的包膜糖蛋白GPC(NP_950235)。经人源密码子优化后由南京金斯瑞公司进行合成，克隆进质粒pUC57，得到质粒pUC57-CCHFV-GPC。然后以质粒pUC57-CCHFV-GPC为模版，设计相应引物扩增有C末端缺失53个氨基酸的GPC，具体包括如下引物：

上游引物pC-CCHFV-GPC-F(序列如SEQ ID NO.3)下游引物pC-CCHFV-GPC-R(序列如SEQ ID NO.4)

SEQ ID NO.3：

GTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGCACATCTCCCT GATGTACGCCATC

SEQ ID NO.4：

AGGGAAAAAGATCTGCTAGCTCGAGTCAGCCTCTGGTCCGTCTGCA GCACTTGAAAC

利用Next Ultra IIQ5 DNA聚合酶扩增有C末端缺失53个氨基酸的GPC片段，PCR反应体系如下：模版(pUC57-CCHFV-GPC)10ng，上游引物pC-CCHFV-GPC-F和下游引物各2μL，酶25μL，加水至50μL，反应条件为：98℃ 30s，(98℃ 10s、58℃ 30s、72℃ 3min 30s)32个循环，72℃ 10min，4℃一直保存。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，通过胶回收试剂盒回收目的条带。

质粒pCAGGS用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切，酶切体系如下：pCAGGS 3μg，EcoR I 2μL和Xho I 2μL，10xBuffer 5μL，加水补至50μL，37℃酶切3h，酶切产物经经琼脂糖凝胶电泳后，通过胶回收试剂盒回收目的条带。

上述扩增回收的PCR片段和双酶切的载体通过同源重组的方式进行连接，连接体系为pCAGGS 50ng，PCR产物50ng，MUL enzyme 5μL，总体积为10μL；连接条件为50℃ 1h。

取5μL连接产物加入大肠杆菌Stbl3感受态，混匀后冰浴25min，42℃热应激60s，冰浴90s，加入无抗生素的LB培养基800μL，置于摇床上震荡培养45min，离心后取少量LB重悬菌体，均匀涂布在氨苄抗性的LB平板上，将平板倒置培养。待菌落形成后，挑取单克隆菌落，接种于含有氨苄抗性的LB培养基中进行过夜摇菌，小提质粒后进行Sanger测序验证，获得质粒pC-CCHFV-GPCΔ53。

(2)重组质粒pC-VSV-N、pC-VSV-P、pC-VSV-L和pC-VSV-G质粒的构建

以pBlue-VSV-GFP质粒为模版，设计引物pC-VSV-N-F、pC-VSV-N-R、pC-VSV-P-F、pC-VSV-P-R、pC-VSV-L-F、pC-VSV-L-R、pC-VSV-G-F、pC-VSV-G-R分别扩增VSV的N、P、L和G基因的开放阅读框，引物序列如SEQ ID NO.5到SEQ ID NO.12所示，具体的PCR反应体系及反应条件参考上述方法。

SEQ ID NO.5：

AGGGAAAAAGATCTGCTAGCTCGAGTCAGCCTCTGGTCCGTCT

GCAGCACTTGAAAC

SEQ ID NO.6：

AGGGAAAAAGATCTGCTAGCTCGAGTCATTTGTCAAATTCTG

ACTTAGCAT

SEQ ID NO.7：

GTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGGATAATCTCA

CAAAAGTTCGTG

SEQ ID NO.8：

GAGGGAAAAAGATCTGCTAGCTCGAGCTACAGAGAATATTT

GACTCTCGCC

SEQ ID NO.9：

GTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGGAAGTCCAC

GATTTTGAGACC

SEQ ID NO.10：

AGAGGGAAAAAGATCTGCTAGCTCGAGTTAATCTCTCCAAG

AGTTTTCCTCGTGTAGG

SEQ ID NO.11：

TTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAG

SEQ ID NO.12：

GATCTGCTAGCTCGAGTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTC。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的片段，回收后的目的片段与经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切后的pCAGGS载体连接，连接反应及后续的转化如前所述，经Sanger测序后获得VSV的N、P、L和G的表达质粒pC-VSV-N、pC-VSV-P、pC-VSV-L和pC-VSV-G。

(3)pBlue-VSV(ΔG)-CCHFV-GPCΔ53重组质粒的构建

以上述构建的pC-CCHFV-GPCΔ53质粒为模版，设计上游引物pBlue-VSV-GPC-F和下游引物pBlue-VSV-GPC-R，引物序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，扩增目的片段CCHFV-GPC_Δ53片段，经胶回收后与经限制性内切酶Mlu I和Xho I双酶切后的pBlue-VSV-GFP质粒相连接，连接反应及后续的转化如前所述，经Sanger测序后获得重组质粒pBlue-VSV(ΔG)-CCHFV-GPCΔ53(图1)；

SEQ ID NO.13：

TAACAGAGATCGATCTGTTTACGCGTCACTATGCACATCTCCCTGAT GTACGCCATCCTGTG

SEQ ID NO.14：

GCTAGCGCGCAATTGCCTCGAGCGTGATATCTGTTAGTTTTTTTCAT ACCTAGCAGGATTTGAGTCAGCCTCTGGTCCGTCTGCAGCAC

2.VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒的拯救

将293T-T7细胞接种于10cm Dish中，待细胞汇合度达到80％-90％时，通过磷酸钙转染的方式将pBlue-VSV(ΔG)-CCHFV-GPCΔ53质粒和辅助质粒pC-VSV-N、pC-VSV-P、pC-VSV-L和pC-VSV-G，按最优化的质量比为10:3:3:3:3。转染16h后换液为10％FBS的DMEM，48h后收集上清。将上清在BHK-21细胞上连续传代三次，同时加入抗VSV-G的中和抗体，最终获得VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒，收获的上清保存于-80℃。

3.VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒的鉴定与特征

(1)Sanger测序鉴定VSV-CCHFV-GFP病毒。病毒提取RNA基因组后，通过RT-PCR扩增VSV-CCHFV-GFP病毒全基因组并送Sanger测序全长。测序结果显示，在CCHFV的GPC蛋白第1547位碱基由“G”突变为“A”，氨基酸序列则由第516位的“R”变为“K”，如图2A所示。在其余位置并没有发现核苷酸改变。

(2)结晶紫染色检测VSV-CCHFV-GFP和VSV-GFP病毒(表达绿色荧光蛋白EGFP的VSV病毒，由本课题组制备并保存，后续应用中作对照使用)的噬斑形态。

VSV-CCHFV-GFP和VSV-GFP病毒分别以10倍的梯度稀释感染Vero E6细胞，感染2h后加入1％的甲基纤维素，感染48h后用4％PFA固定细胞，PBS洗3次后用1％的结晶紫染色15min，再次洗掉结晶紫，观察病毒的噬斑形态，结果如图2B所示，VSV-CCHFV-GFP形成较小的针状噬斑形态，VSV-GFP形成大而圆的噬斑形态。

(3)测定VSV-CCHFV-GFP在BHK-21和Vero E6细胞上的生长曲线

VSV-CCHFV-GFP以MOI为0.01感染BHK-21和Vero E6细胞，分别在2h、6h、12h、24h、48h、60h和72h收集细胞上清，保存于-80℃。将Vero E6细胞接种于96孔板中，待细胞汇合度接近100％时，将上述收集的上清分别以10倍梯度稀释并感染Vero E6细胞，每个稀释度3个复孔，在37℃中感染2h,感染2h后加入1％的甲基纤维素，继续培养，48h后加入4％PFA固定细胞，PBS洗3次后用1％的结晶紫染色15min，再次洗掉结晶紫，记录96孔中的斑点数，计算病毒的每毫升中病毒的噬斑形成单位(Plaque-forming unitper milliliter,PFU/mL)。结果如图3所示，VSV-CCHFV-GFP在BHK-21细胞上的滴度最高可以达到10⁷PFU/mL，在Vero E6细胞上的滴度最高可以达到10⁶PFU/mL。

(4)检测VSV-CCHFV-GFP感染后细胞表面Gc的表达

VSV-CCHFV-GFP以MOI为0.01感染A549细胞，感染24h后用TrypLE消化细胞，用冰预冷的PBS洗细胞两次，用anti-CCHFV-Gc抗体作为一抗，用human IgG1 isotype Control抗体作为同型对照抗体，冰上孵育30min，孵育结束后预冷的PBS洗涤1次，加入goat-anti-human IgG conjugated withAlexa Fluor 647二抗，冰上继续孵育30min。孵育结束后预冷的PBS洗涤1次，加入2％PFA固定细胞10min，固定结束后用PBS继续洗涤细胞2次，使用1％FBS的PBS重悬细胞，通过流式检测Gc蛋白的表达。结果如图4所示，VSV-CCHFV-GFP感染的A549细胞表面可以表达正确构象的Gc蛋白。

4.VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒在筛查CCHFV易感细胞系中的应用

VSV-CCHFV-GFP以MOI为0.01分别感染A549细胞、Hela细胞、Huh7细胞、SW13细胞、293T细胞、Vero E6细胞、BHK-21细胞和MDCK细胞。感染20h后，荧光显微镜下观察GFP荧光，随后消化细胞，用2％PFA固定细胞10min，PBS洗涤细胞1次后，使用1％FBS的PBS重悬细胞，通过流式检测病毒感染效率。结果如图5所示，BHK-21细胞、Huh7细胞为CCHFV的高度易感细胞系；A549细胞、293T细胞和Vero E6细胞为CCHFV的中度易感细胞系，Hela细胞和MDCK细胞为CCHFV的低易感细胞系。

5.VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒在评估CCHFV中和抗体效价中的应用

将anti-CCHFV-Gc抗体和anti-VSV-G抗体以5倍的倍比稀释，然后分别和VSV-CCHFV-GFP和VSV-GFP病毒在37℃孵育1h，孵育结束后将孵育混合物加入到长满的A549细胞的96孔板中，在37℃中继续培养16h，16h后用荧光显微镜下观察GFP荧光，同时收集细胞，用2％PFA固定细胞10min，PBS洗涤细胞1次后，使用1％FBS的PBS重悬细胞，通过流式检测病毒感染效率，通过GraphPad Prism软件中的非线性回归计算抗体的IC₅₀值。结果如图6所示，anti-CCHFV-Gc可以很好的中和VSV-CCHFV-GFP病毒而不能中和VSV-GFP病毒，而anti-VSV-G可以很好的中和VSV-GFP病毒而不能中和VSV-CCHFV-GFP病毒。

6.VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒在研究CCHFV入侵机制中的应用

用于研究基因BAGAT3或B4GALT7在硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)生成通路中发挥重要的调控作用。

利用CRISPR/Cas9技术，设计靶向BAGAT3和B4GALT7的sgRNA，构建敲除BAGAT3和B4GALT7的A549细胞。sgRNA序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

SEQ ID NO.15：CCAGAGCCCATACCTGGCAT；

SEQ ID NO.16：CACTACAAGACCTATGTCGG。

sgRNA分别克隆到慢病毒载体lentiCRISPRv2(Addgene#52961)，同慢病毒包装质粒psPAX2和pMD2G共转293T细胞，用包装好的慢病毒转导A549细胞，使用puromycin筛选7天获得敲除BAGAT3和B4GALT7的A549细胞。

将野生型、敲除BAGAT3或B4GALT7的A549细胞用TrypLE消化，随后用冰预冷的PBS洗细胞两次，用mouse-anti-HS monoclonal antibody抗体作为一抗，用mouse IgMisotype Control抗体作为同型对照抗体，冰上孵育30min，孵育结束后预冷的PBS洗涤1次，加入goat-anti-mouse IgM conjugated withAlexa Fluor 647二抗，冰上继续孵育30min。孵育结束后预冷的PBS洗涤2次，用1％FBS的PBS重悬细胞，通过流式检测细胞表面的HS表达。结果如图7A所示，敲除BAGAT3和B4GALT7的A549细胞表面的HS表达明显减少。

将VSV-CCHFV-GFP和VSV-GFP病毒分别以MOI为1感染野生型和敲除BAGAT3和B4GALT7的A549细胞，感染12h后收集细胞，用2％PFA固定细胞10min，PBS洗涤细胞1次后，使用1％FBS的PBS重悬细胞，通过流式检测病毒感染效率。结果如图7B所示，敲除BAGAT3和B4GALT7的A549细胞的VSV-CCHFV-GFP报告病毒的感染效率明显下降，而VSV-GFP病毒的感染效率没有变化，表明HS在CCHFV病毒入侵细胞过程中发挥重要作用，而VSV-CCHFV-GFP报告病毒可以方便快捷的应用于病毒入侵机制研究。

7.VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒的GPC蛋白在包装单轮感染病毒颗粒中的应用

获得的VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒GPC蛋白除了含有设计的C端末尾53个氨基酸缺失外，还存在第516位的“R”变为“K”突变。利用该特点，将GPC蛋白应用于包装出更高效的CCHFV单轮感染假病毒颗粒。

(1)CCHFV单轮感染假病毒颗粒质粒的构建(pC-CCHFV-GPCΔ14、pC-CCHFV-GPCΔ53-L518V、pC-CCHFV-GPCΔ53-R516K)

以质粒pUC57-CCHFV-GPC为模版，设计相应引物扩增有C末端缺失14个氨基酸的GPC，用以构建质粒pC-CCHFV-GPCΔ14。具体包括如下引物：

上游引物pC-CCHFV-GPCΔ14-F(序列如SEQ ID NO.17)下游引物pC-CCHFV-GPCΔ14-R(序列如SEQ ID NO.18)

SEQ ID NO.17：

GTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGCACATCTCCCTGA TGTACGCCATC。

SEQ ID NO.18：

AGGGAAAAAGATCTGCTAGCTCGAGTCAGTCGGCCAGTCTCTCCCC GTCCAGC。

以质粒pUC57-CCHFV-GPCΔ53为模版，设计相应突变引物构建含有L518V突变位点的质粒pC-CCHFV-GPCΔ53-L518V。具体包括如下引物：

上游引物pC-CCHFV-GPC-F(序列如SEQ ID NO.3)和下游引物pC-CCHFV-GPCΔ53-L518V-R(序列如SEQ ID NO.19)

SEQ ID NO.19：CAGACAGCACCCTTCTAGAGCCGGTGGAGGCCTTG。

上游引物pC-CCHFV-GPCΔ53-L518V-F(序列如SEQ ID NO.20)和下游引物pC-CCHFV-GPC-R(序列如SEQ ID NO.4)。

SEQ ID NO.20：CTCTAGAAGGGTGCTGTCTGAGGAACCCAGCGACG。

以质粒pUC57-CCHFV-GPCΔ53为模版，设计相应引物构建含有R516K突变位点的质粒pC-CCHFV-GPCΔ53-R516K。具体包括如下引物：

上游引物pC-CCHFV-GPC-F(序列如SEQ ID NO.3)和下游引物pC-CCHFV-GPCΔ53-R516K-R(序列如SEQ ID NO.21)。

SEQ ID NO.21：

CAGCAGCCTTTTAGAGCCGGTGGAGGCCTTGCCGAT。

上游引物pC-CCHFV-GPCΔ53-R516K-F(序列如SEQ ID NO.22)和下游引物pC-CCHFV-GPC-R(序列如SEQ ID NO.4)。

SEQ ID NO.22：

CACCGGCTCTAAAAGGCTGCTGTCTGAGGAACCCAG。

利用Next Ultra IIQ5 DNA聚合酶扩增GPC片段，PCR反应体系如下：模版10ng，上游引物和下游引物各2μL，酶25μL，加水至50μL，反应条件为：98℃ 30s，(98℃ 10s、58℃30s、72℃ 3min 30s)32个循环，72℃ 10min，4℃一直保存。

取5μL连接产物加入大肠杆菌Stbl3感受态，混匀后冰浴25min，42℃热应激60s，冰浴90s，加入无抗生素的LB培养基800μL，置于摇床上震荡培养45min，离心后取少量LB重悬菌体，均匀涂布在氨苄抗性的LB平板上，将平板倒置培养。待菌落形成后，挑取单克隆菌落，接种于含有氨苄抗性的LB培养基中进行过夜摇菌，小提质粒后进行Sanger测序验证，获得质粒pC-CCHFV-GPCΔ14、pC-CCHFV-GPCΔ53-L518V及pC-CCHFV-GPCΔ53-R516K。

(2)CCHFV单轮感染假病毒颗粒的包装

将293T细胞接种于12孔细胞培养板中，待细胞汇合度达到80％-90％时，使用3μLFugene HD转染试剂对应1μg质粒分别转染pC-CCHFV-GPCΔ14、pC-CCHFV-GPCΔ53、pC-CCHFV-GPCΔ53-L518V及pC-CCHFV-GPCΔ53-R516K。转染24h后换液为10％FBS的DMEM。以MOI＝3剂量感染G蛋白反式包装的VSV(ΔG)/G单轮感染病毒颗粒。感染2h后更换为含抗VSV-G的中和抗体的10％FBS的DMEM。24h后收取的上清保存于-80℃。

(3)CCHFV单轮感染假病毒颗粒的感染

将BHK-21细胞接种于96孔细胞培养板中,待细胞汇合度达到80％-90％时，弃掉培养基，加入75μL 2％FBS的DMEM和25μL包装的单轮感染假病毒混合液。感染12h后，荧光显微镜下拍照。随后消化细胞，用2％PFA固定细胞10min，PBS洗涤细胞1次后，使用1％FBS的PBS重悬细胞，通过流式检测病毒感染效率。结果如图8所示，GPC蛋白缺失C端末尾14个氨基酸或53个氨基酸的包装效率较低；在缺失53个氨基酸的基础上突变L518V，感染效率提升约15倍；若在缺失53个氨基酸的基础上突变R516K，感染效率提升约76倍。

实施例2VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒的拯救

按照实施例1的方法进行VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒的拯救，与实施例1的区别在于，将pBlue-VSV(ΔG)-CCHFV-GPCΔ53质粒和辅助质粒pC-VSV-N、pC-VSV-P、pC-VSV-L和pC-VSV-G分别按照10:5:4:2:1、10:5:3:1:2、10:2:6.5:1.25:2、10:2.5:6.5:1.25:2、10:8:4:1:8的比例进行转染，结果只有少量GFP荧光产生。结果表明，这些转染比例虽然能成功拯救VSV-CCHFV-GFP重组报告病毒，但拯救效率低。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.CCHFV包膜糖蛋白GPC突变体，其特征在于，其在野生型CCHFV包膜糖蛋白GPC的序列中缺失C端末尾53个氨基酸，且包含R516K或L518V单点突变；

2.编码CCHFV包膜糖蛋白GPC突变体的核酸片段，其特征在于，包括：

ii)、编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸片段。

3.根据权利要求2所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的序列为：

I)、如SEQ ID NO:1所示的序列；或

V)、与I)～IV)任一项所述序列至少有90％同源性的序列。

4.重组VSV载体，其特征在于，包括：VSV载体质粒、权利要求2或3所述的核酸片段和目的基因；

5.根据权利要求1所述的重组VSV载体，其特征在于，所述目的基因为报告基因；所述报告基因为GFP、EGFP、mCherry、RFP、YFP、mNeonGreen、TurboGFP、mGreenLantern、ZsGreen、mKate2、NanoLuc luciferase、Firefly luciferase、Gaussia luciferase或Renillaluciferase。

6.根据权利要求1所述的重组VSV载体，其特征在于，所述目的基因为抗原蛋白基因；所述抗原蛋白基因包括编码病毒抗原、肿瘤抗原或表达宿主与病原微生物抗原的基因。

7.根据权利要求1所述的重组VSV载体，其特征在于，VSV载体质粒的骨架包括pBlueScript系列载体、pSMART系列载体或细菌人工染色体BAC系列载体。

8.一种水疱性口炎病毒VSV的可复制型假病毒系统，其特征在于，包括权利要求4～7任一项所述的重组VSV载体、含VSV病毒N基因、P基因、L基因和/或G基因的辅助质粒以及包装细胞。

9.根据权利要求8所述的水疱性口炎病毒VSV的可复制型假病毒系统，其特征在于，包含VSV病毒N、P、L、G基因的辅助质粒包括辅助质粒1、辅助质粒2、辅助质粒3和辅助质粒4，分别表达N、P、L、G蛋白。

10.根据权利要求9所述的可复制型假病毒系统，其特征在于，所述重组病毒质和辅助质粒1、辅助质粒2、辅助质粒3和辅助质粒4的质量比为10:(2-8):(3-6.5):(1-3):(1-8)，优选为10:3:3:3:3。

11.根据权利要求8所述的可复制型假病毒系统，其特征在于，所述包装细胞为表达T7RNA聚合酶的293T细胞。

12.一种重组VSV病毒，其特征在于，由权利要求4～7任一项所述的重组VSV载体经包装细胞包装而成。

13.根据权利要求12所述的重组VSV病毒，其特征在于，所述包装细胞为表达T7 RNA聚合酶的293T细胞。

14.权利要求12或13所述的重组VSV病毒的制备方法，其特征在于，包括:

将权利要求1～5任一项所述的重组VSV载体和辅助质粒共转染表达T7RNA聚合酶的宿主细胞，收集上清，传代，获得重组VSV病毒；

所述辅助质粒包括：分别含VSV病毒的N基因、P基因、L基因、G基因的辅助质粒1、辅助质粒2、辅助质粒3、辅助质粒4。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述重组VSV载体、辅助质粒1、辅助质粒2、辅助质粒3和辅助质粒4的质量比为10:3:3:3:3。

16.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为表达T7 RNA聚合酶的293T细胞；待宿主细胞培养至80％-90％汇合度进行所述共转染。

17.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述传代用的细胞系为BHK-21，传代次数为2～3次。

18.根据权利要求14～17任一项所述的制备方法，其特征在于，所述传代的同时还包括加入抗VSV G蛋白的中和抗体步骤。

19.权利要求1所述的CCHFV包膜糖蛋白GPC突变体、权利要求2或3所述的核酸片段、权利要求4～7任一项所述的重组VSV载体、权利要求8～11任一项所述的可复制型假病毒系统、权利要求12或13所述的重组VSV病毒或权利要求14～18任一项制备方法制得的重组VSV病毒在如下至少一方面中的应用：

1)、在CCHFV中和抗体效价评估中的应用；

2)、在CCHFV入侵机制的研究中的应用；

3)、在制备CCHFV疫苗中的应用，或CCHFV疫苗免疫效果评价中的应用；

4)、在CCHFV单轮感染假病毒颗粒包装中的应用。

20.一种CCHFV疫苗，包括权利要求12或13所述的重组VSV病毒或权利要求14～18任一项制备方法制得的重组VSV病毒。