CN1517009A - 用于制备各种生物制品的无病原体特异仓鼠的培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于生成SPF(特异性的不含病原体：SPF)仓鼠的方法，该仓鼠可以用来制备各种生物制品。特别是，本发明涉及一种用于生成SPF仓鼠的方法，用该仓鼠制备的各种生物制品未受到寄生虫、细菌、以及内源性、外源性病毒等可潜在引起疾病的微生物感染。因为根据本发明中的方法而生成的SPF仓鼠未携带任何污染物，如寄生虫、细菌、以及内源性或外源性病毒等，所以从该SPF仓鼠中提取的原始细胞、以及用该细胞制备的生物制品不会引起任何微生物污染物的机会感染，而在用于制备目前的生物制品(如疫苗等)的动物细胞中，有可能存在该微生物污染物。因此，可以安全地利用本发明中生成的SPF仓鼠制备各种生物制品，以备人体使用。

Description

用于制备各种生物制品的无病原体特异仓鼠的培育方法
技术领域
本发明涉及一种用于生成SPF(特异性的不含病原体：SPF)仓鼠的方法，该仓鼠可以用来制备各种生物制品。特别是，本发明涉及一种用于生成SPF仓鼠的方法，用该仓鼠制备的各种生物制品未受到寄生虫、细菌、以及内源性-、外源性病毒等可潜在引起疾病的微生物感染。
背景技术
疫苗免疫接种是一种可使人类宿主获得保护性和主动性免疫力、而不在宿主上产生任何疾病的方法，该方法中利用了与感染性疾病有关的抗原。例如，疾病相关病原体的抗原或病原体本身都可适当地引起很特异的免疫反应，该免疫反应由体液免疫调节B淋巴细胞或由细胞免疫调节T淋巴细胞介导，因此，可使保护抗体的滴度增加到相同或相近于宿主自然感染后康复阶段(或细胞毒素T淋巴细胞的持续记忆行为)的免疫状态。根据抗原的不同类型以及所采用的不同制备方法，疫苗可分为类毒素疫苗、灭活疫苗、减毒活疫苗以及重组DNA疫苗等。到目前为止，已研制的疫苗多数是灭活疫苗或减毒活疫苗，其制备过程包括下列步骤：将活病毒接种到某种类型的动物源细胞上、对其进行培养和提取、然后对其进行纯化和适当加工。因为病毒具有只能在活细胞中增殖的特性，所以必须使用动物源(包括人类)细胞作为制备病毒疫苗的细胞底物。用于制备疫苗的细胞系主要分为原始细胞系、二倍体细胞系以及连续细胞系。通过在某一特定阶段冷冻细胞系，可制备二倍体细胞系以及连续细胞系，然后可将其确立或控制为用于生产的母体或工作细胞库系统。当需要制备一种疫苗时，将所需数量的细胞解冻，然后在特定的阶段进行培养，即可作为制备疫苗的细胞系。
同样，原始细胞可用于制备脊髓灰质炎-、麻疹-、德国麻疹-、日本脑炎-、或黄热病活疫苗。对每一批疫苗制品而言，都可使用原始细胞生产疫苗制品，该原始细胞从鸡、狗、猴、或仓鼠等动物中直接分离，然后进行了培养。因此，与动物组(作为原料来源)自身安全性有关的质量管理非常重要。经过多年对PMK细胞(primary monkey kidney cell，猴原始肾细胞)安全性的研究，发现PMK细胞中存在20种不同类型的潜在病毒，其中一些可能在人体内引起致命性疾病，而从二十世纪50年代开始疫苗程序期间，用该PMK细胞制备的麻疹疫苗对麻痹性麻疹的根除发挥了巨大的作用。例如，在许多批麻疹灭活疫苗和麻疹活疫苗被接种到几百万儿童多年后，发现SV40病毒(猿病毒中一种)，可引起啮齿类动物的癌症。体外实验也发现，上述病毒可将人体正常细胞转化成癌细胞(Hayflick L.Science，276(5311)：337-341，1997)。上述发现不可避免地激起了对有关麻疹疫苗(以PMK细胞为基础)的可能致癌性的争论。同样，在麻疹-、腮腺炎-、或黄热病疫苗(以鸡胚细胞为细胞底物)广泛传播和使用之后，发现该鸡胚细胞受到了一种活家禽逆转录病毒(家禽造白细胞组织增生病毒)的污染。上述事件引起了很多关于疫苗对人体可能致癌性的关注。随后更多对疫苗安全性的争论，聚焦于细胞底物(用来制备疫苗)中的潜在微生物污染。因为上述原因，关于作为原料来源以制备生物制品(如疫苗)的动物，国际上建议使用已被确证为SPF(specific pathogen free，特异性不含病原体)的动物组。
对SPF动物的大致筛选基于几个实验，如尸体解剖、显微镜检查、培养实验、血清学实验和组织病理学实验等。但是，上述实验仅仅有助于检测寄生虫、细菌和一些主要病毒的感染，还没有建立用来筛选SPF动物的清晰标准。对SPF老鼠和SPF小鼠而言，已有检测其微生物污染的国际公认标准，与此相比，还没有如此一个用来筛选SPF仓鼠的国际确认标准。目前商业上使用的SPF仓鼠是一种VAF(viral antigen free，无病毒抗原)仓鼠，该VAF仓鼠未受几种病毒微生物污染。即使在被国际公认为SPF动物的主要供应源的Charles River实验室公司或Harlan Sprague Dawley公司，只通过对3-15种细菌、2-3种寄生虫和5或6种病毒的简单检测来筛选SPF动物。来自上述两家公司其中之一的VAF仓鼠经常被发现受到了病毒污染。而且，在某些情况下，由于无症状感染，根本无法长时间检测到病毒。因此，很可能生物制品(如疫苗等)是以商用VAF仓鼠为基础制备的，而该VAF仓鼠受到了可能对人体有害的微生物的污染。所以，上述生物制品的安全性至今没有得到保证。
用SPF仓鼠来制备疫苗的细胞系通常是PHK细胞(仓鼠原始肾细胞)。以PHK细胞为基础制备的生物制品包括下列例子：日本脑炎减毒活疫苗、日本脑炎灭活疫苗、狂犬病疫苗、登革热疫苗、肾病综合症出血热疫苗以及蜱源性脑脊髓炎疫苗。利用每个抗原病毒能够在PHK细胞中有效地、稳定地增殖的生物学特性，制备了上述疫苗。所以，建立作为原料来源的SPF仓鼠，以用来提取PHK细胞(作为不同疫苗制品的细胞底物)是更为重要的。
因此，在进行了许多研究以培育一种能够安全用于制备用于人体的生物制品的仓鼠后，本发明建立了SPF仓鼠组，该仓鼠组未受到许多可潜在引起疾病的寄生虫、细菌和内源性、外源性病毒的感染。进一步，通过证实取自所述SPF仓鼠的PHK细胞及用其制备的生物制品的安全性，完成了本发明。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种用于生成可以用来安全制备生物制品的SPF仓鼠的方法。
为了达到上述发明目的，本发明提供了一种用于生成用来制备生物制品的SPF仓鼠的方法，其步骤包括：
(a)首先，通过对寄生虫、细菌和仓鼠病毒的微生物污染实验，选取未受感染的仓鼠，并通过同窝交配繁殖上述选取的仓鼠，然后从所繁殖的仓鼠中，第二次选取未受到上述微生物感染的仓鼠；
(b)将所选取的仓鼠进行交配，在雌性仓鼠怀孕后的第12-14天取其子宫，将所取的子宫引入一个隔离室，通过剖腹产取其胚胎，然后在分组小于10000的屏蔽区内，利用代育母鼠来培育上述所取的胚胎，并
(c)通过同窝交配来繁殖上述步骤(b)中所培育的仓鼠，并对其进行寄生虫、细菌、仓鼠病毒、鼠病毒、内源性仓鼠逆转录病毒、仓鼠多瘤病毒(HPyV)、仓鼠淋巴瘤病毒和未知仓鼠病毒的微生物污染实验，然后从上述繁殖的仓鼠中，选取未受上述微生物感染的仓鼠。
本发明中，术语“生物制品”(或“生物品”)指通过活组织或其产物所制得的疫苗、培养物和其它制剂，其目的是用于对人体或动物的诊断、免疫接种或治疗，或用于相关研究。
下面将详细描述本发明。
本发明的特征在于，它提供了一种培育SPF仓鼠的方法，该仓鼠可用来安全地制备用于人体和动物的生物制品。另外，本发明的特征在于，为了稳定且持续地提供原始细胞，以用来制备上述生物制品，建立了一个无菌仓鼠组，该仓鼠组未受到寄生虫、细菌、以及内源性或外源性病毒等微生物的污染，并提供了用于确定上述仓鼠安全性的标准和方法。
本发明中的仓鼠包括可用于制备生物制品的各种仓鼠。优选金色叙利亚仓鼠。尽管中国成都生物制品研究所已使用了金色仓鼠，将其作为疫苗制品细胞底物的动物源，但本发明中特殊的是，所选择的金色仓鼠用于提供最初的胚胎，该胚胎被转移给纯种代育母鼠，由其进行培育。
在本发明的一个实施例中，对上述金色仓鼠组进行寄生虫、细菌及仓鼠病毒的微生物污染实验，从而初次筛选不受微生物污染的仓鼠组。在实验动物培育室中繁殖上述选取的仓鼠，并再次进行上述微生物实验。从而第二次筛选不受微生物污染的仓鼠组。对于上述微生物实验而言，有关技术中所公开的任何方法均可运用。特别是，利用参考例1中所描述的方法，本发明中所进行的微生物实验包括6种外源性和内源性寄生虫、11种细菌、以及7种仓鼠病毒(如下表1中所列)。
表1为选取怀孕母鼠而进行的微生物实验项目
  微生物名称
寄生虫   肝毛细线虫
  膜壳绦虫属
  家兔脑胞内原虫
  鼠贾第鞭毛虫(Girdia muris)
  鼠六鞭毛虫(Spironucleus muris)
  管状线虫属
  体外寄生虫
细菌   支气管败血性鲍特菌
  库氏棒状杆菌
  螺旋菌属
  肺炎支原体
  沙门氏菌属
  鼠伤寒沙门氏菌
  肺炎链球菌
  铜锈色假单胞菌
  亲肺炎巴斯德氏菌
  金黄色葡球菌
  毛状梭菌
病毒   SEND(仙台)
  PVM(鼠肺炎病毒)
  MVM(鼠微小病毒)
  KRV(鼠Kilham病毒)
  Reo-3(3型呼吸道肠道病毒)
  LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒)
  H-1(Toolans H-1病毒)
在本发明的另一实施例中，为选取怀孕母鼠(怀孕的雌性仓鼠，后来将其胚胎转移给代育母鼠)，将两只雌仓鼠(至少曾具有一次分娩经历)与一只雄鼠(具有交配经历)一起放在同一笼子中。然后，选取出现了阴道栓的仓鼠，对其进行处理，直至怀孕第一天，并继续饲养。另外，取来自Charles River实验公司的VAF仓鼠，对其进行上述微生物污染实验。确保该VAF仓鼠未受污染后，将其用作代育母鼠(雌性仓鼠，其接受了怀孕母鼠的胚胎，并照看幼鼠直至断奶)。
图1示出了本发明中SPF仓鼠的培育简图。在母鼠怀孕后第12-14天，通过剖腹产取其子宫，通过浸泡浴器(充满了无菌溶液)，将所取子宫送入隔离室内。根据怀孕母鼠腹部的膨隆程度、阴道口的充血程度和松弛程度，来决定进行剖腹产的合适时机。对上述无菌溶液而言，可以使用过氧乙酸溶液、2％Mikro-quat溶液、或碘酒熔液。优选过氧乙酸溶液。另外，所述过氧乙酸溶液的浓度优选0-1-0.2％之间。
从子宫中取其胚胎后，由代育母鼠进行培育。该培育过程优选在分组小于10000的SPF屏障区内进行，培育过程遵照动物实验指南(由韩国医学科学院编制)进行。特别是，本发明人在SPF屏障区进行的培育过程由韩国Yonsei大学医学院医学研究中心的实验动物医学部提供，该培育过程被调节为在下列条件下进行：温度22-26℃、相对湿度45-55％、通风频率8-12次/小时、光强度大于25勒克斯、分组小于10000。通过同窝交配来繁殖动物。
在本发明的另一实施例中，为从上述繁殖的动物中选取一个SPF仓鼠组，进行了对各种寄生虫、细菌和病毒(如表2、表3、表4所示)的微生物污染实验。在下列表2、表3及表4中，比较了本发明在挑选SPF仓鼠时进行的微生物污染实验项目和目前VAF仓鼠(取自Charles River实验公司或HarlanSprague Dawley公司)的实验项目。
表2本发明中为选取一个SPF仓鼠组而进行的微生物实验项目：细菌
  序号 细菌 本发明   Chatles River实验公司   Harlan SpragueDawley公司
  1   支气管败血性鲍特菌     ●     ●     ●
  2   库氏棒状杆菌     ●     ●
  3   螺旋菌属     ●     ●
  4   肺炎支原体     ●     ●
  5   沙门氏菌属     ●     ●     ●
  6   鼠伤寒沙门氏菌     ●
  7   肺炎链球菌     ●     ●     ●
  8   假单胞菌属     ●     ●
  9   铜锈色假单胞菌     ●     ●     ●
  10   巴斯德氏菌属     ●     ●
  11   亲肺炎巴斯德氏菌     ●     ●
  12   金黄色葡球菌     ●     ●
  13   毛状梭菌     ●     ●
  14   催产克雷伯杆菌     ●     ●
  15   多杀巴斯德菌     ●     ●
  16   肺炎克雷伯杆菌     ●     ●
  17   B组β-链球     ●     ●     ●
  18   G组β-链球     ●     ●
  19   β-链球菌属     ●     ●
表3本发明中为选取一个SPF仓鼠组而进行的微生物实验项目：寄生虫
寄生虫 本发明   Charles River实验公司 Harlan SpragueDawley公司
    体内寄生虫     ●     ●     ●
    肝毛细线虫     ●     ●     ●
    膜壳绦虫属     ●     ●     ●
    家兔脑胞内原虫     ●     ●     ●
    鼠贾第鞭毛虫(Girdia muris) ● ● ●
    鼠六鞭毛虫(Spironucleus muris) ● ● ●
    管状线虫属     ●     ●     ●
    体外寄生虫     ●     ●     ●
表4本发明中为选取一个SPF仓鼠组而进行的微生物实验项目：病毒
病毒 病毒组 本发明 Charles River实验公司 Harlan SpragueDawley公司
仓鼠特异性病毒(10种)
SEND(仙台)     类流感病毒     ●     ●     ●
PVM(鼠肺炎病毒)     副粘病毒     ●     ●     ●
MVM(鼠微小病毒)     短小病毒     ●
KRV(鼠Kilham病毒)     短小病毒     ●
Reo-3(3型呼吸道肠道病毒)   呼吸道肠道病毒 ● ● ●
LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒) 沙粒病毒     ●
H-1(Toolans H-1病毒)     短小病毒     ●     ●     ●
GD-7(泰勒鼠脑脊髓炎病毒)   小核糖核酸病毒 ●
SV5(猿病毒5)   类流感病毒     ●
HANT(汉滩病毒)   本雅病毒     ●
鼠特异性病毒(16种)
LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒)   沙粒病毒     ●
MHV(鼠肝炎病毒)   冠状病毒     ●     ●
PVM(鼠肺炎病毒)   副粘病毒     ●
MVM(鼠微小病毒)   短小病毒     ●
SEND(仙台)   副粘病毒     ●
ECTRO(缺肢畸型)   痘病毒     ●
EDIM(幼鼠兽疫腹泻)   轮状病毒     ●
REO-3(3型呼吸道肠道病毒)   呼吸道肠道病毒 ●
GDV II(鼠脑脊髓炎)   小核糖核酸病毒 ●
MAD(鼠腺病毒)   腺病毒     ●
POLY(多瘤病毒)   乳多空病毒     ●
HANT(汉滩病毒)   本雅病毒     ●
MTV(鼠胸腺病毒)   疱疹病毒     ●
MCMV(鼠巨细胞病毒)   疱疹病毒     ●
K(鼠肺炎病毒)   乳多空病毒     ●
LDV(乳酸盐脱氢酶-促病毒) 披膜病毒 ●
内源性仓鼠逆转录病毒   逆转录病毒     ●
仓鼠多瘤病毒   乳多空病毒     ●
未知仓鼠淋巴瘤病毒   -     ●
未知仓鼠病毒   -     ●
首先，本发明进行了对细菌(表2所列)、寄生虫(表3所列)、10种仓鼠特异性病毒和16种鼠特异性病毒(表4所列)的微生物污染实验。结果，选出了一个被证实不受微生物污染的SPF仓鼠组(见表5-表9)。关于细菌和寄生虫的微生物污染实验，应韩国Yonsei大学医学院医学研究中心实验动物医学部的要求，关于仓鼠特异性病毒和鼠特异性病毒的微生物污染实验，应英国格拉斯哥Q-one Biotech有限责任公司的要求。
关于对所述仓鼠病毒的实验以及血清学实验，借助从仓鼠中分离的PHK细胞，进行了对10种特异性外源病毒(如表4所列)的仓鼠抗体生成试验(HAP试验)。
所述HAP试验在鼠抗体生成试验(MAP试验)的基础上进行了修改，最先由Rowe及其同事开展(Rowe WP et al，J.Exp.Med.，109：379-391，1959；andRowe WP et al.，Virology 11：645-649，1960)。它是一种敏感的、特异性的和综合性的方法，用于检测能够感染仓鼠组织的病毒。该实验将病毒接种在高敏仓鼠宿主(未受到10种特异性外源病毒的感染)上，然后进行敏感的、特异性的血清学测定来检测病毒抗体。
为确定任意外来病毒感染实验动物的最大机会，使用了3种接种路线。口内接种物带来了能够进入消化道的肠病毒。鼻内接种物带来了能够进入呼吸系统的呼吸道病毒。腹膜内接种物带来的病毒可能穿过消化道粘液膜进入体内器官。
关于对所述鼠病毒的实验，进行了对16种特异性病毒(如表4所列)的鼠抗体生成试验(MAP试验)。(Rowe WP.，et al，J.Exp.Med.，109：379-391，1959；Rowe WP.，et al.，In，The Problems of Laboratory Animal Disease.pp 132-141.ed.RC Harris.Academic Press Inc.，New York，1962；Smith AL.，In，Viral andMycoplasmal Infections of Laboratory Rodents.pp 731-750 eds PN Bhatt，ROJacoby，MC Morse and AE New.Academic Press Inc.，New York，1986)
作为检测细胞和/或肿瘤系内的外来鼠科病毒的主要方法，MAP试验已经广泛使用了20年以上。该实验通过将存于实验材料中的任何鼠科病毒接种到老鼠体内，再检测被接种老鼠体内的抗体产物而进行。
为确定任意外来病毒感染实验动物的最大可能性，使用了4种接种路线。口内接种物带来了能够进入消化道的肠病毒(MHV&GDV II)。鼻内接种物带来了能够进入呼吸系统的呼吸道病毒(PVM&SEND)。腹膜内接种物带来的病毒可能穿过消化道粘液膜进入体内器官。穿刺部位也充当了一种进入通道，可引起缺肢畸形。大脑内接种物带来了能够直接进入大脑脑膜的LCMV病毒。
在LCM激发实验中，用一种已知的病毒致命株来激发老鼠，观察每个工作日直至12天时的发病率和死亡率。如果在实验项目中存在LCMV的无毒株，将会使上述老鼠的免疫力得到激发，老鼠将会存活下去。如果实验项目中不含所述无毒株，老鼠将会在4-12天时死于激发量。
实验动物是否受到了感染，以及实验材料中是否含有病毒，对不同可能的细菌，通过不同的技术来确定。本发明中使用的血清学技术包括直接荧光抗体(IFA)、酶联免疫测定(ELISA)、补体结合(CFA)、免疫电子显微镜(IEM)、以及血凝抑制反应(HAI)。
然后，为了检测所选出的SPF仓鼠组中是否存在可能引起机会感染的潜伏病毒，进行了仓鼠多瘤病毒(下文中，指‘HPyV’)的感染试验。叙利亚仓鼠对HPyV病毒引起的感染非常敏感，该病毒可导致其毛囊上皮癌。病毒基因组包括大约为5.3kb大小的双链DNA，其开放阅读框架的构成呈典型的多瘤病毒状(Delmas V，et al.，EMBO Journal，4：1279-1286，1985)。
使用PCR实时检测对核苷酸靶分子的拷贝数进行定量测定。PCR实时检测利用Taq聚合酶的5’-核苷酸外切酶活性，来水解一种标记了荧光指示剂的Taq Man内探针，并冷却染色(Lee LG，et al.，Nucleic Acids Research21：3761-3766，1993)。在ABI 7700序列测定系统中，对拷贝数的计算基于何时最先检测到靶分子的扩增。7700系统检测出的是阈值循环数(CT)，该循环数是荧光能在固定的阈值基线之上穿过的少数循环数。通过将未知样本与标准曲线进行比较，可以确定其绝对数量，该标准曲线由已知数量的靶分子生成(PE Applied Biosystems，1997，Relative quantitation of gene expression，UserBulletin #2.ABI PRISM 7700 Sequence detection system)。通过实验样本CT数与已知数量重组质粒分子CT数的对比，可以确定实验样本中存在的HPyV基因组DNA的数量，所述重组质粒分子中包含HPyV DNA，以用于生成一个标准曲线。在常规测定条件下，测定100个pHPyV的基因组。
结果在本发明中SPF仓鼠的任何组织中，都未检测到HPyV-特异性病毒(见表10)。
用于制备生物制品的细胞系可以在广泛的宿主范围内产生逆转录病毒。所以，应检测本发明中SPF仓鼠是否受到了内源性仓鼠逆转录病毒(内源性仓鼠白血病病毒)的感染。如果证实了SPF仓鼠受到了感染，还应检测人体细胞是否受到了SPF仓鼠逆转录病毒的感染。实验项目细胞系中是否存在逆转录病毒(能够感染人类或原始细胞)，可用下面的探测细胞系进行测定：人类二倍体细胞系MRC-5、Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji、非洲青猴肾细胞系Vero、幼仓鼠肾细胞系BHK等。MRC-5和Raji细胞用于检测是否存在能感染人体细胞的逆转录病毒。MRC-5中可复制C-型逆转录病毒，而Raji中还可复制D-型逆转录病毒(包括松鼠猴逆转录病毒)。与Vero细胞的共同培养结果显示，该细胞中可复制能感染灵长类的逆转录病毒，而BHK细胞代表了仓鼠细胞系中的一种细胞系。使用如此多种探测细胞的原因在于，通过实验项目细胞与不同宿主细胞的共同培养，未知病毒(可能潜伏于实验项目细胞中)的表达机会可能会增加。
进行上述实验时，将实验项目细胞与探测细胞共同培养，并且在传代1阶段，除去实验项目细胞。为了扩增感染水平较低的病毒，至少对探测细胞进行5次传代。5次传代后(如果合适，或者进行更多的传代)，从培养物中收集上清液，并通过产物—促进性逆转录酶(PERT)测定法，来检测是否存在逆转录病毒。对逆转录酶(HA)活性的测定而言，PERT测定是一种非常敏感的测定方法，有报道说，该方法的敏感性是一般RT测定法的106倍以上(Silver J，et al，Nucleic Acids Research，21：3593-3594，1993；and Pyra H，et al.，PNAS，U.S.A.，91：1544-1548，1994)。BHK细胞中存在内源性逆转录病毒，结果在进行PERT测定时出现了阳性结果，基于上述事实，使用RT测定法来检测上清液中(取自BHK培养物)是否存在逆转录病毒。
特别是，在本发明中，将PHK细胞(从本发明的SPF仓鼠中分离)分别与MRC-5和Raji细胞共同培养。结果，在与所述PHK细胞共同培养的人体细胞系中，未发现逆转录酶(RT)的活性，该逆转录酶的活性是逆转录酶病毒活性的指示物(见表11和表12)。
在第三个实验中，检测了本发明的SPF仓鼠是否受到了未知病毒污染物的感染。进行该实验时，将探测细胞与PHK细胞(从本发明的SPF仓鼠中分离)共同培养，并在整个培养期内，用显微镜观察该探测细胞中是否出现了CPE。另外，利用来自不同动物如几尼亚猪、鸡和人体等的红细胞(rbcs)，使上述探测细胞进行红细胞吸附作用。特别是，将PHK细胞(从本发明的SPF仓鼠中分离)分别与MRC-5、Raji细胞和Vero细胞共同培养。利用几尼亚猪红细胞、鸡红细胞和人体‘O’型红细胞的混合物，同样使上述探测细胞进行红细胞吸附作用。结果，在上述与本发明中的PHK细胞共同培养的各种检测细胞中，未观察到细胞病变反应(CPE)或红细胞吸附作用。
最后一个实验中，利用一种免疫抑制药物—环孢霉素，检测了本发明的SPF仓鼠中是否存在未知的致淋巴瘤病毒的感染。在抑制了仓鼠的免疫功能后的100天时间内，本发明中的SPF仓鼠未发生肿瘤或其它类似肿瘤的症状。
如上所述，可以证明在本发明中的SPF仓鼠中，以及在从该SPF仓鼠中提取的PHK细胞中，没有感染细菌、寄生虫、10种特异性仓鼠病毒、16种特异性鼠病毒、仓鼠多瘤病毒、内源性逆转录病毒(仓鼠白血病病毒)、未知仓鼠淋巴瘤病毒(可潜在引起恶性淋巴瘤)、以及其它未知的仓鼠病原体。而且，在由Charles River实验公司或Harlan Sprague Dawley公司培育的VAF系列仓鼠中，仅仅检测了是否存在几种细菌、寄生虫和4-5种特异性仓鼠病毒，没有如本发明一样，进行一个广泛的安全性确认(见表2、表3和表4)。因此，在安全性上，本发明中的SPF仓鼠优于目前的VAF或其它SPF仓鼠。所以很明显，从本发明的SPF仓鼠中提取原始细胞(优选PHK细胞)，并将其作为细胞底物以用于制备生物制品是十分有利的。
上述生物制品包括所有的病毒疫苗，该病毒指所有能够将原始细胞(从SPF仓鼠中分离)作为宿主细胞(细胞底物)，从而在其中增殖的病毒。特定的例子包括：在发明中制备的日本脑炎减毒活疫苗(Tsai et al.，Japaneseencephalitis vaccine.3rd ed.Vaccines，ed.S.A.Plotkin and W.Orenstein.，1999，Philadelphia：WB Saunders，672-710)、日本脑炎灭活疫苗(Lu et al.，Japaneseencephalitis vaccine.1st ed.Medical Biological Products.1995，Beijing：Peoples Medical Publishing House，528)、狂犬病疫苗(Plotkin SA，et al.，Rabiesvaccine，In Plotkin SA，Orenstein WA，eds.(1999)Vaccines(3rd ed.)，Philadelphia，PA：WB Saunders company，743-766；Lu et al.，Rabies vaccine.1st ed.Medical Biological Products.1995，Beij ing：Peoples Medical Publishing House，552)、登革热疫苗、肾病综合征出血热疫苗(Lu et al.，Hemorrhagic fever vaccine.1st ed.Medical Biological Products.1995，Beijing：Peoples Medical PublishingHouse，652)、以及蜱源性脑脊髓炎疫苗(Lu et al.，Tick-borne encephalitis vaccine.1st ed.Medical Biological Products.1995，Beijing：Peoples Medical PublishingHouse，540)等。
附图简述
图1例示了本发明中产生一个SPF仓鼠的过程简图。
本发明的优选实施例
下面将借助不同例子对本发明进一步详述。但应注意，本发明不仅仅局限于这些例子或受这些例子的限制。
<参考例1>
微生物污染实验
1-1)对寄生虫的检测
用胶带取标本后，用光显微镜检查是否存在任何外源性寄生虫。同时，为检查是否存在任何内源性寄生虫，将实验动物处死，并进行解剖，然后准备好胃、小肠、大肠组织标本。将所取标本用苏木精和伊红染色，然后在光显微镜下检查。
1-2)对细菌的检测
以下列三种方法为基础，检查是否存在细菌。
a.培养法—对除螺旋菌属、肺炎支原体、毛状梭菌外的所有细菌。
用消毒棉签取气管、鼻窦和肠道材料，并将其在培养板上铺展开，以备进行细菌检测。然后，遵照SOP(Standard Operating Procedure，标准操作程序)进行处理。
b.PCR法—对螺旋菌属
以SEQ ID NO.1为前引物，以SEQ ID NO.2为逆引物进行PCR(J.Clin.Microbiol.，35(6)：1620-1623，1997；J.Clin.Microbiol.，39(11)：3920-3926，2001)。PCR反应在下列操作条件下进行：变性(94C，30秒)；退火(55℃，30秒)；延伸(72℃，2分钟)，共进行30个循环的扩增，最后一步在72℃下进行5分钟。通过1.5％NuSieve琼脂糖凝胶电泳，鉴别上述所得的PCR产物(FMC BioProducts，Rockland，Maine)。
c.ELISA法—对肺炎支原体和毛状梭菌
遵照厂商操作手册的要求，利用Monilisa试剂盒(ICLAS，实验动物总研究中心，日本)和Murin抗原试剂盒(Intracel，美国)进行检测。
1-3)对病毒的检测
以ELISA法为基础进行病毒检测。遵照厂商操作手册的要求，利用Monilisa试剂盒(ICLAS，实验动物总研究中心，日本)和Murin抗原试剂盒(Intracel，美国)进行ELISA。特别是，对上述表1中所列的7种仓鼠病毒的检测，遵照Smith法(Smith AL.(1986)Serologic tests for detection of antibody torodent viruses.In，Viral and Mycoplasmal Infections of Laboratory Rodents.pp731-750.eds.PN Bhatt，RO Jacoby，MC Morse and AE New.Academic Press Inc.，Orlando)和Lewis法(Lewis AM，Rowe WP，Turner HC and Heubner RJ.(1965)Lymphocytic choriomeningitis virus in hamster tumor：spread to hamsters andhumans.Science，150，363-364)等进行。除仓鼠病毒之外，对其它病毒的检测，在相应例子中进行了详细的说明。
<参考例2>
手术隔离室的准备
将一个手术隔离室(Daehan Biolink Co.Ltd.，Korea)的内部用酒精和葡糖酸氯己定溶液消毒，然后用活动气流保持其正压。将一个浸泡浴器内充满0.2％过氧乙酸溶液。把操作工具和其他必需品放进该隔离室内，以备外科手术用，另外准备一个血琼脂平板(SIGMA)，以备立即检测可能存在于标本(刚刚取自胚胎)中的微生物污染。
<例1>
筛选用于生产SPF仓鼠的仓鼠
1-1)仓鼠组的初次筛选
遵照参考例1中所述的方法，将取自中国成都生物制品研究所的金色叙利亚仓鼠进行微生物污染实验(如表1)。结果，初次筛选出了未受微生物污染的仓鼠组。
1-2)繁殖首次筛选出的仓鼠组，并进行第二次筛选
在实验动物培育室里，通过同窝交配，将上述例1-1)中选出的仓鼠组进行3代以上的繁殖。再次进行上述例1-1)中的微生物污染实验，从而第二次筛选出未受污染的动物。然后，将选出的动物分配到新的小组中，接着进行繁殖。
<例2>
SPF仓鼠的产生和繁殖
2-1)怀孕母鼠和代育母鼠的筛选
为挑选可通过剖腹产提供胚胎的怀孕母鼠，从例1-2)筛选出的仓鼠组中，选取两只具有一次以上分娩经历的雌鼠，并将其与一只具有交配经历的雄鼠放在同一笼中。第二天，选出生成了阴道栓的雌鼠，对其进行处理，直至怀孕第一天，并继续饲养。另外，将来自Charles River实验公司的VAF金色叙利亚仓鼠(Harlan，USA)进行上述微生物污染实验(如上述例1-1)所述)，并使用与上述同样的方法，将确保未受污染的仓鼠进行交配，以获取怀孕母鼠。由此获得了代育母鼠。代育母鼠比怀孕母鼠早交配一天。选出在怀孕母鼠预产期前一天生产的动物，并将其作为代育母鼠，以用来培育所述怀孕母鼠的胚胎。
2-2)通过剖腹产获取胚胎
以怀孕母鼠腹部的膨隆程度、阴道口的充血程度和松弛程度为基础，确定剖腹产的合适时机。在怀孕后的第13.5天，进行剖腹产。首先，注射CO2以处死怀孕的母鼠，然后用消毒皂(手用碘皂，美国QUIP实验公司)清洗尸体外表，并用酒精纱布进行消毒。再用碘酒溶液进一步消毒。进行消毒时，怀孕母鼠的阴道开放区和生殖区需格外注意，应彻底清洗。打开死亡动物的腹部，取出子宫。用钳子结扎每个卵巢两侧的区域，并用手术剪剪开。再用钳子结扎子宫颈区，并用手术剪剪开。用碘酒溶液对切口处进行消毒，并使子宫角朝下，将子宫穿过隔离室的浸泡浴器，从而引入隔离室的内部(见图1)，所述隔离室在上述参考例2中已经备好。然后，用消毒纱布和棉球尽可能快的除去子宫表面的消毒液，接着切开子宫以取出胚胎。将上述获取的胚胎移至手术台上，该手术台已提前备好并进行了保暖。注意不要让胚胎接触化学溶液如消毒液等。大约半小时后，检查完胚胎状况，选出能自主呼吸的胚胎。然后，将代育母鼠的排泄物涂到胚胎上，并分配给每个代育母鼠8个胚胎。利用在手术中分离的胎盘等，对胚胎进行微生物污染实验。
<例3>
在无菌环境中饲养和繁殖胚胎
在SPF屏障区里，饲养上述例2中获取的胚胎，所述SPF屏障区由韩国Yonsei大学医学院医学研究中心的实验动物医学部提供。将所述屏障区调节到下列条件：温度22-26℃、相对湿度45-55％、通风频率8-12次/小时、光强度大于25勒克斯、分组小于10000。关于饮用水，供给氯化物浓度低于2％的离子水。关于饲养原料，供给经过射线照射消毒的啮齿类动物普通食物(LabDiet Co.，USA)。关于仓鼠后代的组成，将饲养的仓鼠进行分组，从而使每一代中有8个以上的繁殖组。为了进行近亲繁殖，采用同窝交配法，在该方法中，交配在同一窝中进行。
<例4>
SPF仓鼠的筛选
4-1)细菌和寄生虫污染实验。
将从例3的繁殖组里选出的每一只仓鼠，进行细菌和寄生虫(如表2、表3所列)的微生物污染实验。实验根据上述参考例1中所述的方法进行。如下表5所示，结果证实了在上述选出的仓鼠组中，未检测到寄生虫和细菌。
表5细菌和寄生虫污染实验结果
  微生物     检测结果
细菌   支气管败血性鲍特菌     *-
  库氏棒状杆菌       -
  螺旋菌属       -
  肺炎支原体       -
  沙门氏菌属       -
  鼠伤寒沙门氏菌       -
  肺炎链球菌       -
  假单胞菌属       -
  铜锈色假单胞菌       -
  巴斯德氏菌属       -
  亲肺炎巴斯德氏菌       -
  金黄色葡球菌       -
  毛状梭菌       -
  催产克雷伯杆菌       -
  多杀巴斯德菌       -
  肺炎克雷伯杆菌       -
  B组β-链球       -
  G组β-链球       -
  β-链球菌属       -
  寄生虫   肝毛细线虫       -
  膜壳绦虫属       -
  家兔脑胞内原虫       -
  鼠贾第鞭毛虫(Girdia muris)       -
鼠六鞭毛虫(Spironucleus muris) -
管状线虫属 -
体外寄生虫 -
*-：未检测到
4-2)病毒污染实验
将从例4-1)中选出的仓鼠进行不同种类病毒的微生物污染实验。所有的病毒实验应英国格拉斯哥Q-One Biotech公司所要求。
4-2-1)对10种仓鼠特异性病毒的实验
a.血清学实验
从每个例4-1)里筛选出的实验组中，取5只实验动物的血清进行ELISA分析(Smith AL.，Viral and Mycoplasmal Infections of Laboratory Rodents.731-750，1986；Lewis AM et al.，Science，150：363-364，1965；Baum SG et al.，N.Eng.Med.，274：934-936，1966)。首先，将表4中10种特异性仓鼠病毒的抗体预覆于微量滴定平板上。将备好的血清标本加到每个孔中，并将平板在室温下温育1小时。以VAF LVG叙利亚仓鼠的血清为阴性对照，该VAF LVG叙利亚仓鼠的年龄为3-4周，雌性，在屏蔽区内饲养。以曾暴露于每一种病毒抗原的仓鼠的血清为阳性对照。然后用PBS/0.05％吐温20，将平板清洗3遍，并将结合了过氧化物酶的异种lgG加到平板的每个孔中。再将平板在室温下温育1小时，然后将其用PBS/0.05％吐温20清洗3遍。其后，将邻苯二胺和尿素/H2O2底物加到平板的每个孔中。然后在室温避光条件下，将平板温育20分钟。温育之后，读出在490nm下的吸光率，从而检测是否存在特异性仓鼠病毒。结果，筛选出了完全未受到任何仓鼠病毒感染的仓鼠组。下表6中概括了上述筛选出的仓鼠的实验结果。
表6仓鼠病毒血清学实验结果
   样本                                 仓鼠病毒
SEND  PVM  KRV  MVM  REO-3  GD-7  LCMV  SV5  H-1  HANT
    1  *-   -   -   -    -   -   -   -   -   -
    2    -   -   -   -    -   -   -   -   -   -
    3    -   -   -   -    -   -   -   -   -   -
    4    -   -   -   -    -   -   -   -   -   -
    5    -   -   -   -    -   -   -   -   -   -
 *NC    -   -   -   -    -   -   -   -   -   -
 *PC  *+   +   +   +    +   +   +   +   +   +
*NC：阴性对照
*PC：阳性对照
*-：未检测到
*+：检测到
b.仓鼠抗体生成试验(HAP试验)
为了更精确地检测上述10种特异性病毒(已知感染了仓鼠组织)是否已存在于仓鼠组(已在上述步骤a中筛选出)中，进行了HAP试验。本发明所用的HAP试验在MAP试验的基础上作了轻微修改，该MAP最先由Rowe及其同事开展(Rowe WP et al，J.Exp.Med.，109：379-391，1959；and Rowe WP etal.，Virology 11：645-649，1960)。从仓鼠(已在上述步骤a中筛选出)中分离出PHK细胞，并将其接种在雌性VAF LVG叙利亚金色仓鼠中，该金色叙利亚仓鼠为雌性，年龄3-4周。实验期间，将已被接种的仓鼠置于高压灭菌的微隔离单元内，该隔离单元内有草垫、水和食物，从而避免PHK细胞的污染病毒之外的病毒感染。在接种后的第二十八天，从所有动物中取血清样本。利用血清学测定法，在所有血清样本中测定10种不同的病毒抗体。依照Hartley等方法(Hartley JW et al.，Virology，11：645-649，1960)，用IFA法(直接免疫萤光测定)确定HANT抗体。用ELISA测定法确定其余9种病毒抗体。如下表7中所示，证实了没有产生任何对受试仓鼠病毒的抗体。该结果与上述步骤a中的结果一致。
表7 HAP试验结果
仓鼠病毒 检测方法 PHK细胞接种   MEM培养基接种(对照)
    SEND     ELISA    *-        -
    SV-5     ELISA      -        -
    PVM     ELISA      -        -
    MVM     ELISA      -        -
    KRV     ELISA      -        -
    H-1     ELISA      -        -
    GD-7     ELISA      -        -
    REO-3     ELISA      -        -
    LCMV     ELISA      -        -
    HANT     IFA      -        -
*-：未检测到
4-2-2)对16种特异性鼠病毒的检测
为了证实仓鼠组(已在上述例4-2-1中筛选出)是否已经感染了鼠病毒，利用从所述仓鼠中分离出的PHK细胞，进行了MAP试验(Rowe WP.，et al，J.Exp.Med.，109：379-391，1959；Rowe WP.，et al.，In，The Problems of LaboratoryAnimal Disease.pp 132-141.ed.RC Harris.Academic Press Inc.，New York，1962；Smith AL.，In，Viral and Mycoplasmal Infections of Laboratory Rodents.pp731-750 eds PN Bhatt，RO Jacoby，MC Morse and AE New.Academic Press Inc.，New York，1986)。
首先，在20只VAF老鼠(CD 1株，取自Harlan UK公司)上接种PHK细胞，所述PHK细胞取自上述步骤a中的仓鼠。在接种后的第4天，处死4只老鼠，分离出其血浆。利用分光光度计测定法，检测LDH(乳酸脱氢酶)的活性水平，从而确定是否存在LDV(乳酸脱氢酶—激发病毒)。结果证实，在接种了本发明里PHK细胞的老鼠中，其LDH活性与阴性对照的LDH活性相同(见下表8)。上述结果表明，上述4-2-1)中筛选出的仓鼠未受LDV感染。
表8 LDV感染实验结果
    接种物   LDH活性(单位)
    DMEM培养基(阴性对照)     ＜160
    本发明中的PHK细胞     ＜160
    LDV(Riley株)系(阳性对照)     2560
在接种后的第23天，用一种已知的LCMV致死株(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，Armstrong株)来激发4只老鼠，并观察每一个工作日直至12天时的发病率和死亡率。如果上述PHK细胞没有感染LCMV，动物将会在4-12天内死亡。在接种LCMV后的12天内，接种了本发明里仓鼠PHK细胞的4只老鼠全部死亡。该结果表明，本发明中生产的仓鼠没有感染LCMV。
在接种后的第31天，从剩余的老鼠中提取血清标本，并通过血清学实验，来测定是否存在老鼠病毒的抗体。如下面表9中所述，在接种了本发明里PHK细胞的老鼠的血清中，未检测到15种不同类型的鼠病毒。
表9 MAP试验结果
老鼠病毒 检测方法 PHK细胞接种   MEM培养基接种(对照)
    LCMV     ELISA     *-       -
    MHV     ELISA       -       -
    PVM     ELISA       -       -
    MVM     ELISA       -       -
    SEND     ELISA       -       -
    ECTRO     ELISA       -       -
    EDIM     ELISA       -       -
    REO3     ELISA       -       -
    GDVII     ELISA       -       -
    MAD     ELISA       -       -
    POLY     ELISA       -       -
    HANT     IFA       -       -
    MTV     IFA       -       -
    MCMV     ELISA       -       -
    K     ELISA       -       -
*-：未检测到
根据上述实验，证实了本发明中所建立的SPF仓鼠组未感染任何微生物，包括19种细菌、6种寄生虫、以及10种仓鼠病毒和16种鼠病毒。
<例5>
检测不同类型病毒感染的附加实验
本发明中，对例4中筛选出的SPF仓鼠进行了进一步的实验，以检测是否存在内源性或外源性的病毒感染。
5-1)对仓鼠多瘤病毒(HPyV)感染的检测
从例4中筛选出的SPF仓鼠中取一只实验动物，根据已知方法，分离其肝、脾、淋巴结、肺和肾组织。然后，利用ABI 7700序列检测系统(PE AppliedBiosystems，1997，Relative quantitation of gene expression，User Bulletin #2)，检测上述分离出的组织中是否存在HPyV-特异性序列。在96孔反应平板的单个孔中进行PCR反应。以从上述组织中分离出的DNA为模板。将TaqMan PCR反应混合物(包含TaqMan缓冲液A、Mg2+、dNTPs、AmpErase LNG、AmpliTaqGold DNA聚合酶、TaqMan HPyV-特异性引物以及荧光探针)加入反应中。将反应平板放进ABI 7700反应器中，在该反应器中进行AmpErase和AmpliTaq的活化和扩增反应。在50℃下进行所述AmpErase反应2分钟。然后在95℃下进行AmpliTaq Gold活化反应10分钟。另外，设定PCR反应条件为：共进行40个循环，包括在95℃下变性15秒，在60℃下退火/延伸1分钟。对对照组而言，在阴性对照组中，不使用模板进行PCR；而在阳性对照组中，以含HPyV靶基因的重组phaPV为模板进行PCR。结果如下表10中所示。所以，证实了在本发明中SPF仓鼠的所有组织内，未检测到HPyV—特异性序列。
表10仓鼠多瘤病毒实验结果
实验分组     HPyV-特异性序列
阴性对照    *-
本发明中仓鼠的肝组织      -
本发明中仓鼠的脾组织      -
本发明中仓鼠的淋巴结组织      -
本发明中仓鼠的肺组织      -
本发明中仓鼠的肾组织      -
阳性对照 *+
*-：未检测到
*+：检测到
5-2)对逆转录病毒感染的检测
从例4筛选出的SPF仓鼠中分离PHK细胞，并将该PHK细胞分别与人类二倍体细胞系MRC-5、人类Burkitts淋巴瘤细胞系Raji共同培养，然后检测逆转录病毒的生成。首先，将PHK细胞(从本发明中的SPF仓鼠上分离)与探测细胞(MRC-5或Raji细胞)共同培养4-5天。所述探测细胞系来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。在传代1阶段，除去所述PHK细胞，并将探测细胞培养5代以上。为了使错误的阳性信号最小化，加入了CTNEAT(小牛胸腺活化DNA)，所述错误阳性信号由DNA聚合酶的类-逆转录酶(RT)活性引起，而该CTNEAT可干扰DNA聚合酶的类-RT活性。在阳性对照中，加入了类微粒病毒(VLPs)。然后，收集探测细胞5代培养后的上清液。根据公开已知的方法，利用PERT测定法(产物增强性逆转录酶测定)来检测是否存在逆转录病毒(Lugert R，et al.，Biotechniques，20(2)：210-217，1996；Pyra H，etal.，PNAS.U.S.A.，91：1544-1548，1994)。将探测细胞接种在复式反孔平板的底部。结果，在接种了PHK细胞的培养物中未检测到RT活性(相关内容见表11、表12)。上述结果表明，本发明中SPF仓鼠的PHK细胞未受到逆转录病毒(有可能感染人)的污染。
表11逆转录病毒：MRC-5细胞系的实验结果
标本       *CT值 结果
        均值
经CT NEAT处理过的细胞 40   40   *-
经1/10稀释CT NEAT处理过的细胞 40   40     -
未经CT NEAT处理的细胞 37.3   39.3     -
未经1/10稀释CT NEAT处理的细胞 39.8   39.9     -
经105VLPs(1/10)峰化的细胞 20.8 23.0 *+
经103VLPs(1/10)峰化的细胞 28.6   26.2     +
*CT：阈值循环
*+：阳性
*-：阴性
表12逆转录病毒：Raji细胞系的实验结果
标本     *CT值 结果
       均值
经CT NEAT处理过的细胞 40     39.7   *-
经1/10稀释CT NEAT处理过的细胞 40     40     -
未经CT NEAT处理的细胞 30.8     31.6     -
未经1/10稀释CT NEAT处理的细胞 32.9     36.4     -
经105VLPs(1/10)峰化的细胞 24.7 21.7 *+
经103VLPs(1/10)峰化的细胞 31.6     30.6     +
*CT：阈值循环
*+：阳性
*-：阴性
5-3)对未知仓鼠病毒感染的检测
在本发明的SPF仓鼠中，还检测了是否可能存在未知的仓鼠病毒污染，该病毒有可能会造成对各种探测细胞的机会感染。关于探测细胞，采用了人类二倍体细胞系MRC-5、人类Burkitt淋巴瘤细胞系Raji、非洲青猴肾细胞系Vero，所有的探测细胞来自ATCC。将探测细胞(MRC-5、Raji或Vero细胞)与PHK细胞(从本发明的SPF仓鼠中分离)共同培养4-5天。在传代1阶段，除去PHK细胞，将探测细胞培养5代以上。然后，在整个培养期内，用显微镜观察探测细胞中是否出现CPE。结果，整个培养期内，在接种的培养物中未观察到CPF。
另外，利用几内亚猪红细胞、鸡红细胞和人类‘O’型血红细胞的混合物，检验了探测细胞对其的红细胞吸附能力。在4℃下，使PHK细胞(取自本发明的SPF仓鼠中)对几内亚猪红细胞、鸡红细胞和人类‘O’型血红细胞的混合物进行红细胞吸附作用，至少进行30分钟。以接种了培养基的探测细胞为阴性对照组，以接种了甲型流感病毒的MRC-5细胞为阳性对照组。结果，在阴性对照组和接种了PHK细胞的培养物(5次传代后)中，未观察到对人类‘O’型血红细胞、鸡红细胞和几内亚猪红细胞的红细胞吸附作用。
因为在将PHK细胞与各种探测细胞共同培养了很长时间后，在所述PHK细胞中仍未观察到CPF和红细胞吸附作用，所以可以说，在本发明SPF仓鼠的PHK细胞中，不存在来自仓鼠的未知病毒感染。
5-4)对未知仓鼠淋巴瘤病毒感染的检测
取20只新生的SPF幼仓鼠，对其施用免疫抑制药物—环孢菌素，以抑制其免疫活性。在确保降低了其免疫活性后，以所述动物为实验组。将实验组仓鼠饲养100天以上，每周监测是否发生了恶性淋巴瘤或其他肿瘤。在阳性对照组中，准备20只接种了HeLa肿瘤细胞(ATCC)的仓鼠。在阴性对照组中，准备10只未施用上述免疫抑制药物的健康仓鼠。100天后，将确定未发生恶性淋巴瘤或其它肿瘤的实验动物处死，并进行尸检。在每一个已被处死的动物中，检测淋巴结、脾、胰腺、肾、肺和肝等中的肿瘤痕迹。同时检测其它异常。结果显示，在抑制其免疫力后的100天时间内，本发明的SPF仓鼠中未发现肿瘤或其它类似肿瘤的损害。上述结果表明，在本发明的SPF仓鼠中，没有潜伏未知的仓鼠病毒。
通过上述结果，可以证明本发明在例4中所筛选出的SPF仓鼠中，没有感染任何不同类型的寄生虫、细菌、病毒、仓鼠病毒、鼠病毒以及其它已知/未知的病原体。而且，还可以证明，从本发明的SPF仓鼠中提取的PHK细胞适用于制备生物制品(如疫苗等)。
<例6>
从本发明的SPF仓鼠中分离PHK细胞，并用该PHF细胞制备日本肝炎减毒 活疫苗
将本发明中的SPF仓鼠(年龄为10-14天)用CO2气体处死。消毒后，将其移至一个实验动物室中，分组小于10000。无菌状态下取所述动物的肾。将所收集到的幼仓鼠的肾用EMEM介质清洗，然后加入胰蛋白酶溶液。将浸泡在该胰蛋白酶溶液中的肾在37℃下温育1-3小时。温育后，将胰蛋白酶作用后的肾悬浮液用介质(含血清)清洗，并借助玻璃珠获取单一的细胞悬浮液。用含有血清的介质将上述细胞悬浮液直接稀释到适当的体积，并将其转移到T-烧瓶中。通过繁殖获取要求数量的细胞后，用不含血清的介质清洗该细胞，并在EMEM介质中将上述细胞培育大约1小时，该EMEM介质中含日本肝炎病毒减毒株SA14-14-2(KCTC 0316 BP)。除去含病毒的培养基后，再将上述细胞培育3-4天，从而繁殖所述病毒。观察到75％或更多的CPE后，收集含病毒的悬浮液，净化和无菌过滤后，在2-8℃下贮存，以备QC检测。然后，进行最后的配方(加入稳定剂)、填充和真空冷冻干燥。
<实验例1>
对本发明中日本肝炎减毒活疫苗的安全测试
为证实日本肝炎减毒活疫苗对人体的安全性，进行了安全测试，所述日本肝炎减毒活疫苗用本发明中SPF仓鼠(例5)的PHK细胞配制。
1-1)对HPyV的检测
为检测在本发明的日本肝炎减毒活疫苗中是否存在HPyV，利用ABI 7700序列探测系统，确定了是否存在HPyV特异性序列，方法如例5-1)所述。结果概括于下表13中。
表13对仓鼠多瘤病毒的检测结果
实验组     HPyV-特异性序列
阴性对照组    *-
本发明的日本肝炎减毒活疫苗      -
阳性对照组    *+
*-：未检测到
*+：检测到
1-2)HAP试验
为检测在本发明的日本肝炎减毒活疫苗中是否存在仓鼠病毒，利用例4-2-1)步骤b中所描述的方法，进行了HAP试验。结果概括于下表14中，非常明显，在本发明的日本肝炎减毒活疫苗中，未检测到任何一种仓鼠病毒。
表14 HAP试验结果
病毒 检测方法 本发明的日本肝炎减毒活疫苗     MEM培养基接种(对照)
  SEND   ELISA       *-         -
  SV-5   ELISA         -         -
  PVM   ELISA         -         -
  MVM   ELISA         -         -
  KRV   ELISA         -         -
  H-1   ELISA         -         -
  GD-7   ELISA         -         -
  REO-3   ELISA         -         -
  LCMV   ELISA         -         -
  HANT   IFA         -         -
*-：未检测到
1-3)用LCM激发的MAP试验
为检测在本发明的日本肝炎减毒活疫苗中是否存在鼠病毒，利用例4-2-2)中所描述的方法，进行了MAP试验。将例6中的日本肝炎减毒活疫苗再悬浮在1-5ml/瓶的DMEM介质中。用DMEM介质将中和抗血清以1∶10的比例稀释。然后，将所述疫苗与上述稀释的中和抗血清以1∶1的比例混合，并在37℃下培育1小时，从而生成了实验样本。在20只SPF老鼠(CD1株，Harlan UK公司)上接种该样本。在接种后的第13天，处死4只老鼠，通过分光光度计测定法，测定死亡老鼠的血浆中的LDH活性水平。如下表15中所述，在接种了本发明中PHK细胞的老鼠上，其LDH活性微低于阴性对照组的LDH活性。
表15 LDV感染实验结果
接种物   LDH活性(单位)
DMEM介质(阴性对照)     449
本发明的日本肝炎减毒活疫苗     419
LDV(Riley株)系(阳性对照1)     1005
在接种后的第14天，用LCM病毒(Amstrong株)激发4只老鼠，观察每个工作日直至12天时的发病率和死亡率。7天后，所有的老鼠死亡。上述结果可以证实，在用本发明PHK细胞制备的日本肝炎减毒活疫苗中，未携带LCM病毒。
另外，在接种后的第34天，从剩余的老鼠中取血，并对其血清进行血清学实验。如下表16中所示，未检测到15种鼠病毒中的任何一种。
表16 MAP试验结果
鼠病毒 检测方法 本发明的日本肝炎减毒活疫苗   MEM培养基(对照)
    LCM   ELISA        *-       -
    MHV   ELISA          -       -
    PVM   ELISA - -
    MVM   ELISA - -
    SEND   ELISA - -
    ECTRO   ELISA - -
    EDIM   ELISA - -
    RE03   ELISA - -
    GDVII   ELISA - -
    MAD   ELISA - -
    POLY   ELISA - -
    HANT   IFA - -
    MTV   IFA - -
    MCMV   ELISA - -
    K   ELISA - -
*-：未检测到
1-4)PERT测定
在本发明的日本肝炎减毒活疫苗中，对是否存在逆转录病毒进行了检测。本发明进行了PERT测定，所述PERT测定法用于检测具有酶活性的逆转录酶微粒，该法具有很高的灵敏度。首先，取例6中制备的活疫苗3ml，以大约11000g的转速离心10分钟，从而对其进行净化，接着使其经过0.45μm的消毒过滤器，从而除去残余的碎片。然后，将上述处理后的疫苗以100000g的转速超离心60分钟，使其呈丸状。将每个小丸再悬浮在100μl裂解缓冲液中，以释放RT的活性。然后利用Pyra等公布的方法(Pyra H，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.，91：1544-1548，1994)进行PERT测定。结果证实：在本发明的日本肝炎减毒活疫苗中，RT活性为阴性。上述结果表明，在本发明的日本肝炎减毒活疫苗中不存在逆转录病毒。
1-5)对未知病毒污染的体外测定
通过将本发明中的日本肝炎减毒活疫苗与探测细胞系共同培养，本发明确定了该疫苗中是否有病毒感染。以人体近—三倍体细胞系H9(ATCC)为探测细胞。首先，将本发明日本肝炎减毒活疫苗的接种株与H9细胞系共同培养。在传代1阶段，除去接种株。将探测细胞继续传代5次以上。在整个培养期，用显微镜观察探测细胞中是否出现CPE。在上述H9培养物中未观测到CPE。
5次传代后，从H9培养物中收集上清液，并通过PERT测定法来检测是否存在逆转录病毒(Pyra H，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9：1544-1548，1994)。在接种了疫苗接种株的H9培养物中，未检测到RT活性。
另外，在4℃下，借助几尼亚猪红细胞、鸡红细胞和人类‘O’型红细胞的混合物，使H9细胞(接种了本发明的日本肝炎减毒活疫苗)进行红细胞吸附作用，至少进行30分钟。结果，在该H9细胞中未观察到红细胞吸附作用。因为在H9细胞(接种了本发明的日本肝炎减毒活疫苗)中未检测到CPF、RT活性和红细胞吸附作用，所以可以说，本发明的日本肝炎减毒活疫苗未携带病毒污染。
1-6)对未知病毒污染的体内测定
根据CPMP和FDA的要求(Committee for Proprietary Medicinal Products：AdHoc Working Party on Biotechnology/Pharmacy.J.Biol.Stand.，17：213-222，1989；and Points to consider in characterization of cell lines used to producebiologicals，1993.Center for Biologics Evaluation and Research.Food and DrugAdministration，Gethesda MD 20205，USA)，为检测本发明的日本肝炎减毒活疫苗中是否存在外来病毒因子，通过对胚胎、哺乳期小鼠、成年鼠和几尼亚猪的接种，本发明进行了下列体内测定。
(1)样本配制
将本发明中的日本肝炎减毒活疫苗(已经在例6中制备)再悬浮在1.5ml/瓶的DMEM中。用DMEM介质将中和抗血清以1∶10的比例稀释，将上述疫苗与该稀释的中和抗血清以1∶1的比例混合，并在37℃下培育1小时。
(2)动物实验
a. 对哺乳期小鼠的实验
首先，确定本发明中制备的疫苗对哺乳期小鼠的安全性。通过肌肉内(0.01ml)、腹膜内(0.1ml)、大脑内(0.01ml)注射路径，将上述步骤(1)中制备的样本接种到哺乳期小鼠上(第一次接种)，该哺乳期小鼠至少20只，来自2窝或2窝以上。通过同样的路径，将DMEM介质接种到另外一组哺乳期小鼠上，并作为阴性对照组。观察小鼠是否出现如虚弱、震颤、瘫痪或死亡等任何疾病反应，持续观察14天。14天后，处死小鼠。分离出小鼠的器官，溶解并搅匀。用与第一次接种同样的方法，将该器官悬浮液接种在另外一组新的哺乳期小鼠上(第二次接种)。同样观察该组小鼠14天。第一次接种中，在接种的24小时后，20只小鼠中存活了19只(存活率为95％)。对死亡的哺乳期小鼠进行尸检后，未观察到病毒感染。第二次接种中，在接种的24小时后，所有的小鼠存活(存活率为100％)。
b. 对成年鼠的实验
通过肌肉内(0.1ml)、腹膜内(0.5ml)、大脑内(0.031ml)注射路径，将上述样本接种到10只成年鼠上(SPF，CD 1株)。以同样的路径，将DMEM介质接种到阴性对照组老鼠上。然后，观察小鼠是否出现任何疾病反应，持续观察28天。结果，在接种的24小时后，所有的老鼠存活(存活率为100％)。
c. 对几内亚猪的实验
最后一个实验中，通过肌肉内(0.1ml)注射路径，将上述样本接种到5只成年几内亚猪(SPF，Duncan Hartley株)上。在阴性对照组中，以同样的路径将DMEM介质接种到5只几内亚猪上。观察上述几内亚猪是否出现任何疾病反应，持续观察28天。结果发现，在接种的24小时后，所有的几内亚猪存活(存活率为100％)。
(3)胚胎实验
a.羊膜内注射
进行羊膜内注射时，选取10个10-11天大的SPF胚胎，将0.1ml上述样本接种到其羊膜腔内。另外选取10个10-11天大的SPF胚胎，将0.1mlDMEM介质接种到其羊膜腔内，并作为阴性对照组。选取第三组10个10-11天大的SPF胚胎，将0.1ml甲型流感病毒接种到其羊膜腔内，并作为阳性对照组。接种后，将胚胎在35-36℃下培育5天。收集羊水并混合。对混合后的羊水进行血细胞凝集反应(HA)活性测定。通过对羊水的连续2倍稀释，在微量滴定平板上进行HA测定。清洗鸡和几内亚猪后，取其红细胞，将该红细胞中分别以0.5％悬浮液的形式加入上述平板中，并分别在2-8℃下培育1-2小时、在17-20℃下培育1-2小时，然后观察该复式平板上的HA活性。结果显示，在受试胚胎的羊水中，其HA活性与阴性对照组相近。另外，根据接种后24小时的生存测试，9个受试胚胎中，有8个存活(存活率为89％)。
b.尿囊内注射
进行尿囊内注射时，选取10个10-11天大的SPF胚胎，将0.1ml上述样本接种到其尿囊腔内(第一次传代)。另外选取10个10-11天大的SPF胚胎，将0.1mlDMEM介质接种到其尿囊腔内，并作为阴性对照组。选取第三组10个10-11天大的SPF胚胎，将0.1ml甲型流感病毒(ATCC VR-547)接种到其尿囊腔内，并作为阳性对照组。接种后，将胚胎在35-36℃下培育3天。收集其尿囊液并混合。取混合后尿囊液中的一份，冷冻并在-70℃时或-70℃以下储存，直至对其进行HA活性测定、或将其继代接种到新的一组胚胎中为止。
从最初通过尿囊接种了上述样本的胚胎中，取其0.2ml混合后的尿囊液，将其一一接种到7个10-11天大的胚胎上，从而将该尿囊液进行了传代(第二次传代)。从最初接种了DMEM介质的胚胎中取其尿囊液，并通过同样的途径，将该尿囊液传代到新的一组7个10-11天大的胚胎上。从最初接种了甲型流感病毒的胚胎中取其尿囊液，并通过同样的途径，将该尿囊液传代到新的一组7个10-11天大的胚胎上。3天后，收集尿囊液，混合并测定其HA活性。利用与上述羊膜内试验同样的方法，进行HA测定。
测定结果显示，在受试胚胎的尿囊液中，其HA活性与阴性对照组相近。另外，根据接种后24小时的生存测试，在第一次传代中，所有的胚胎保持存活(存活率为100％)，在第二次传代中，7个胚胎中有5个保持存活(存活率为71％)。
c.卵黄囊内注射
进行卵黄囊内注射时，选取10个6-7天大的SPF胚胎，将0.1ml上述样本接种到其卵黄囊腔内(第一次传代)。另外选取10个6-7天大的SPF胚胎，将0.1mlDMEM介质接种到其卵黄囊内，并作为阴性对照组。将上述胚胎在35-36℃下培育9天。然后，检测该胚胎的存活率。收集上述卵黄囊，清洗并混合。然后将其制备成10％的悬浮液，并继代接种到新的一组7个6-7天大的胚胎上(第二次传代)。从注射了DMEM的胚胎中取其卵黄囊，同样制备成10％的悬浮液，并将其继代接种到新的一组7个6-7天大的胚胎上，以作为阴性对照组。9天后，检测所有胚胎的生存能力。
上述结果显示，第一次传代中，在接种后的24小时内，10只受试胚胎都保持存活(存活率为100％)，第二次传代中，7只受试动物都保持存活(存活率为100％)。
综合上述实验结果，证实在用本发明SPF仓鼠的PHK细胞制备的日本肝炎减毒活疫苗中，未受到任何病毒感染。
工业应用
如上所述，根据本发明中的方法而生成的SPF仓鼠未携带任何寄生虫、细菌、或其它各种内源性或外源性病毒污染物。因此，从该SPF仓鼠中提取的原始细胞、以及用该细胞制备的生物制品不会引起微生物污染物的机会感染，而在用于制备目前的生物制品(如疫苗等)的动物细胞中，有可能存在该微生物污染物。所以，在本发明的SPF仓鼠中，所提取的仓鼠组织及其培养物的上清液可以安全用于制备各种生物制品，以备人体使用。

Claims (12)

1.一种用于生成SPF(特异性的不含病原体)仓鼠，从而用来制备生物制品的方法，其步骤包括：
(a)首先，通过对寄生虫、细菌和仓鼠病毒的微生物污染实验，选取未受感染的仓鼠，并通过同窝交配繁殖上述选取的仓鼠，然后从所繁殖的仓鼠中，第二次选取未受到上述微生物感染的仓鼠；
(b)将所选取的仓鼠进行交配，在雌性仓鼠怀孕后的第12-14天取其子宫，将所取的子宫引入一个隔离室，通过剖腹产取其胚胎，然后在分组小于10000的屏蔽区内，利用代育母鼠来培育上述所取的胚胎，并
(c)通过同窝交配来繁殖上述步骤(b)中所培育的仓鼠，并对其进行寄生虫、细菌、仓鼠病毒、鼠病毒、内源性仓鼠逆转录病毒、仓鼠多瘤病毒(HPyV)、仓鼠淋巴瘤病毒和未知仓鼠病毒的微生物污染实验，然后从上述繁殖的仓鼠中，选取未受上述微生物感染的仓鼠。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述用于制备生物制品的SPF仓鼠是用于提取仓鼠原始肾细胞(PHK细胞)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中上述步骤(a)中的仓鼠是金色叙利亚仓鼠。
4.根据权利要求1所述的方法，其中上述步骤(a)或(c)中的寄生虫包括体内寄生虫和体外寄生虫。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述体内寄生虫包括肝毛细线虫、膜壳绦虫属、家兔脑胞内原虫、鼠贾第鞭毛虫(Girdia muris)、鼠六鞭毛虫(Spironucleus muris)和管状线虫属。
6.根据权利要求1所述的方法，其中上述步骤(a)中的细菌包括支气管败血性鲍特菌、库氏棒状杆菌、螺旋菌属、肺炎支原体、沙门氏菌属、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎链球菌、铜锈色假单胞菌、亲肺炎巴斯德氏菌、金黄色葡球菌和毛状梭菌。
7.根据权利要求1所述的方法，其中上述步骤(a)中的仓属病毒包括仙台(SEND)、鼠肺炎病毒(PVM)、鼠微小病毒(MVM)、鼠Kilham病毒(KRV)、3型呼吸道肠道病毒(Reo-3)、淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒(LCMV)、Toolans H-1病毒(H-1)。
8.根据权利要求1所述的方法，其中上述步骤(b)中的代育母鼠是一种不含病毒抗原(VAF)的仓鼠。
9.根据权利要求1所述的方法，其中上述步骤(c)中的细菌还包括假单胞菌属、巴斯德氏菌属、催产克雷伯杆菌、多杀巴斯德菌、肺炎克雷伯杆菌、B组β-链球、G组β-链球、β-链球菌属，以及上述步骤(a)中的细菌。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中的仓鼠病毒还包括泰勒鼠脑脊髓炎病毒(GD-7)、猿病毒5(SV5)、汉滩病毒(HANT)，以及上述步骤(a)中的仓鼠病毒。
11.根据权利要求1所述的方法，其中上述步骤(c)中的鼠病毒包括淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒(LCMV)、鼠肝炎病毒(MHV)、鼠肺炎病毒(PVM)、鼠微小病毒(MVM)、仙台(SEND)、缺肢畸型病毒(ECTRO)、幼鼠兽疫腹泻病毒(EDIM)、3型呼吸道肠道病毒(REO-3)、鼠脑脊髓炎病毒(GDVII)、鼠腺病毒(MAD)、多瘤病毒(POLY)、汉滩病毒(HANT)、鼠胸腺病毒(MTV)、鼠巨细胞病毒(MCMV)、鼠肺炎病毒(K)、乳酸盐脱氢酶-促病毒(LDV)。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物制品选自一组疫苗，其中包括：日本脑炎减毒活疫苗、日本脑炎灭活疫苗、狂犬病疫苗、登革热疫苗、肾病综合征出血热疫苗、以及蜱源性脑脊髓炎疫苗。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1935102B (zh) * 2006-10-13 2010-06-16 中国药品生物制品检定所 一种实验动物分组的方法
CN101971788A (zh) * 2010-11-18 2011-02-16 青岛康大食品有限公司 Spf实验种兔人工繁殖技术
CN110122415A (zh) * 2019-05-28 2019-08-16 上海市农业科学院 高度近交实验用小型猪封闭群的繁育方法
CN110736654A (zh) * 2019-11-04 2020-01-31 上海青赛生物科技有限公司 一种腮腺炎病毒大鼠神经毒力评价模型
CN116769946A (zh) * 2022-12-22 2023-09-19 斯贝福（北京）生物技术有限公司 一种用于鼠六丝鞭毛虫检测的引物探针组合物及应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115804362A (zh) * 2023-02-08 2023-03-17 中国医学科学院医学生物学研究所 一种IFN-α/βR-/-小鼠抗体依赖性增强感染的注射液及其制备方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1935102B (zh) * 2006-10-13 2010-06-16 中国药品生物制品检定所 一种实验动物分组的方法
CN101971788A (zh) * 2010-11-18 2011-02-16 青岛康大食品有限公司 Spf实验种兔人工繁殖技术
CN110122415A (zh) * 2019-05-28 2019-08-16 上海市农业科学院 高度近交实验用小型猪封闭群的繁育方法
CN110122415B (zh) * 2019-05-28 2021-06-08 上海市农业科学院 高度近交实验用小型猪封闭群的繁育方法
CN110736654A (zh) * 2019-11-04 2020-01-31 上海青赛生物科技有限公司 一种腮腺炎病毒大鼠神经毒力评价模型
CN116769946A (zh) * 2022-12-22 2023-09-19 斯贝福（北京）生物技术有限公司 一种用于鼠六丝鞭毛虫检测的引物探针组合物及应用

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