CN1678346A - 用于牛呼吸系统和生殖系统的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗或预防动物中1型以及2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、1型牛疱疹病毒(BHV－1)、牛呼吸道5合胞病毒(BRSV)、副流感病毒(PI3)、胎儿弯曲杆菌、犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospira hardjo－prajitno、出血黄疽钩端螺旋体、Leptospira hardjo－bovis以及波摩那钩端螺旋体引起的疾病或病症的组合疫苗和方法，该方法通过给所述动物施用有效量的组合疫苗来实现。该组合疫苗可为失活的或经修饰的全细胞或细胞部分的活制剂。

Description

用于牛呼吸系统和生殖系统的疫苗
技术领域
本发明涉及治疗或预防动物中1型以及2型牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)(BVDV)、1型牛疱疹病毒(BovineHerpes Virus)(BHV-1)、牛呼吸道合胞病毒(Bovine RespiratorySyncytial Virus)(BRSV)、副流感病毒(Parainfluenza Virus)(PI3)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流感伤寒钩端螺旋体(Leptospiragrippotyphosa)、Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno、出血黄疽钩端螺旋体(Leptospira icterohaemmorrhagiae)、Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis以及Leptospirainterrogans pomona引起的疾病或病症的组合疫苗和方法，该方法通过给所述动物施用有效量的组合疫苗来实现。该组合疫苗可为失活的或经修饰的全细胞或细胞部分的活制剂。
发明背景
已知和牛呼吸性疾病(BRD)并发症相关的五种病毒因子是：1型牛疱疹病毒，也称为牛乳头炎病毒(IBR)；1型以及2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)；牛呼吸道合胞病毒(BRSV)；以及副流感病毒(PI3)，其可在全球范围内导致具有极大经济重要性的奶牛和牛奶业的呼吸系统以及生殖系统感染。BRD可引发广泛的临床症状，包括呼吸性疾病的急性发作及流产。BRD的呼吸形式其特征为发炎、肿胀、出血、及呼吸道粘膜坏死并可能伴随着高烧、厌食、沮丧、流鼻液、呼吸困难、以及口鼻发炎。IBR及BVDV病毒能在怀孕的所有三个三月期中诱发流产，但是多半是发生在妊娠的后半段，且经常没有其它临床症候出现(Ellis等人(1996) JAVMA 208：393-400；Ellsworth等人(1994)In：Proceedings，74th Conference of Research Workers inAnimal Disease：34)。
1型牛疱疹病毒(BHV-1)是α疱疹病毒科亚科的成员，且会在牛中产生各种形式的临床疾病，包括：呼吸以及生殖系统感染、结膜炎、脑炎、及流产。以往控制BHV-1感染病时利用了疫苗，该疫苗包含减毒的活病毒(Gerber，J.D.，等人，1978，Am.J.Vet.Res.39：753-760；Mitchell，D.，1974，Can.Vet.Jour.15：148-151)、失活病毒(Frerichs，G.N.，等人，1982，Vet.Rec.111：116-122)、以及病毒的亚单位，例如，在本领域中称为gI、gIII及gIV的三种主要BHV-1糖蛋白中的一种(Babiuk，L.A.，等人，1987，Virology 159：57-66；van Drunen，S.，等人，1993，Vaccine 11：25-35)。此外，已证明了BHV-1 gIV糖蛋白质的重组截短形式(在在本领域中称为BHV-1 tgIV)具有诱发粘膜免疫对抗BHV-1的能力(van Drunen，S.，等人，1994，Vaccine，12：1295-1302)。然而，此种BHV-1疫苗是禁用于血清阳性或血清阴性的妊娠牛，并也禁用于正在哺乳小牛的妊娠母牛。
1型以及2型BVDV已涉及各种临床症状。研究显示：此病毒可导致严重的原发性呼吸性疾病；持续感染的(PI)牛是易感小牛的主要感染来源；而且BVDV可感染白细胞库，造成免疫系统深远的以及广泛的缺陷。Ellis等人(1996)JAVMA 208：393-400；Baum等人(1993)The CompendiumCollection：Infectious Disease in Food Animal Practice.Trenton，NJVeterinary Learning Systems-113-121；Meyling等人(1987)AgricPestivirus Infect Rumin 225-231。当妊娠牛感染后(尤其是第一个三月期中)即可能造成流产或木乃伊化。Bolin等人(1989)Am J.Vet Res52：1033-1037。粘膜性疾病是牛病毒性腹泻(BVD)的另一种经常致死的表现形式，其是由于胎儿在早期感染非致细胞病变的BVDV生物型、对此病毒产生免疫耐受性、产下持续感染的(PI)小牛以及接着再度感染致细胞病变的BVDV生物型所导致的。Bolin等人(1989)Am J.Vet Res 52：1033-1037.2型BVDV，曾经确认为奶牛中的出血型BVDV分离物，已成为从美国多数区域中与BVD-相关的流产以及呼吸病例中分离出的主要菌株。Van Oirschot等人(1999)Vet Micro 64：169-183。
BVDV被分类成瘟病毒属(pestivirus genus)以及黄病毒科。其与在绵羊中造成的广泛疾病及猪瘟(classical swine fever)的病毒紧密相关。感染的牛只显示“粘膜疾病”，其特征在于升高的温度、腹泻、咳嗽以及消化道粘膜溃疡(Olafson，等人，Cornell Vet.36：205-213(1946)；Ramsey，等人，North Am.Vet.34：629-633(1953))。BVD病毒能穿过妊娠牛只的胎盘并可导致分娩PI小牛((Malmquist，J.Am.Vet.Med.Assoc.152：763-768(1968)；Ross，等人，J.Am.Vet.Med.Assoc.188：618-619(1986))。此类小牛对所述病毒具免疫耐受性且在其余生中于血液中持续带有病毒。他们是爆发粘膜疾病的来源(Liess，等人，Dtsch.Tieraerztl.Wschr.81：481-487(1974))且极易感染造成如肺炎或肠疾病之类疾病的微生物(Barber，等人，Vet.Rec.117：459-464(1985))。
依据培养细胞中BVDV病毒的生长研究，可分离出二种病毒生物型：在感染的细胞中诱发细胞病变效应(cp)的病毒以及不诱发细胞病变效应(ncp)的病毒(Lee等人，Am.J.Vet.Res.18：952-953；Gillespie等人，CornellVet.50：73-79，1960)。Cp变异体可以来自预感染ncp病毒的PI动物(Howard等人，Vet.Microbiol.13：361-369，1987；Corapi等人，J.Virol.62：2823-2827，1988)。基于BVD病毒的病毒颗粒表面糖蛋白质E2的5′非翻译区域(NTR)的遗传多样性以及抗原性的差异，一般将其分为二种主要基因型：I型以及II型。1型BVDV是古典或传统的病毒株系，通常在具有免疫能力的动物中只产生温和的腹泻，而2型BVDV是一种致病性高的新兴病毒，能产生血小板减少症、出血以及急性的致命疾病(Corapi等人，J.Virol，63：3934-3943；Bolin等人，Am.J.Vet.Res.53：2157-2163；Pellerin等人，Virology 203：260-268，1994；Ridpath等人，Virology205：66-74，1994；Carman等人，J.Vet.Diagn.Invest.10：27-35，1998)。使用一组单克隆抗体(Mabs)和使用动物产生的病毒特异性抗血清的交互中和反应测定了I型以及II型BVDV病毒具有不同的抗原性(Corapi等人，Am.J.Vet.Res.51：1388-1394，1990)。任一基因型的病毒可为二种生物型中的一种，即cp或ncp病毒。
研究BVD病毒感染的动物显示BVD病毒诱发动物的B细胞以及T-细胞反应(Donis等人，Virology 158：168-173，1987；Larsson等人，Vet.Microbiol.31：317-325，1992；Howard等人，Vet.Immunol.Immunopathol.32：303-314，1992；Lambot等人，J.Gen.Virol.78：1041-1047，1997；Beer等人，Vet.Microbiology.58：9-22，1997)。
目前使用化学失活的BVD病毒分离株已发展出许多BVDV疫苗(Fernelius等人，Am.J.Vet.Res.33：1421-1431，1972；Kolar等人，Am.J.Vet.Res.33：1415-1420，1972；McClurkin等人，Arch.Virol.58：119，1978)。失活病毒疫苗须使用多重剂量以达成初次免疫。一些失活BVDV疫苗只可提供保护对抗I型BVDV感染(Beer等人，Vet.Microbiology.77：195-208，2000)。由于失活BVDV疫苗只能提供短期免疫并且无法有效率的提供交叉型的保护，所以不能保护胎儿(Bolin，Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract.11：615-625，1995)。
另一方面，经修饰的活病毒(MLV)疫苗则提供较高层次的保护。目前，许可的BVDV MLV疫苗是使用在牛或猪细胞中重复传代培养得到的减毒病毒制成(Coggins等人，Cornell Vet.51：539，1961；Phillips等人，Am.J.Vet.Res.36：135-，1975)，或使用表现出温度敏感性表型的化学修饰的病毒制成(Lobmann等人，Am.J.Vet.Res.45：2498-，1984；47：557-561，1986)。单一剂量的MLV疫苗已足以进行免疫，被接种牛只的免疫持续期间可持续数年。然而，此类疫苗是使用I型BVDV病毒株系发展的，因此只能保护对抗I型病毒。此外，此类现有的BVDV疫苗不能应用于妊娠牛或正在哺乳小牛的妊娠母牛。
在PI3病毒单独作用下一般只会产生中等程度的疾病；然而此病毒会使呼吸道易于产生更具致病性的生物体(包括IBR病毒、BRSV、以及BVDV)导致的继发性感染，造成典型的运输发烧症状(shipping fever syndrome)。已知导致牛呼吸性疾病的各种病毒中，PI3病毒散布最广。Ellis等人(1996)JAVMA 208：393-400。
BRSV可优先感染下呼吸道，感染的严重性多半是由免疫系统对关键的病毒蛋白质的反应决定。Bolin等人(1990)Am J Vet Res 51：703。感染的牛只一般而言呈现非特异性的症候，包括鼻孔以及眼睛流出液体、温和的(经常是两阶段的)发烧、以及干咳。更严重感染的牛会发展出严重的咳嗽、用口的困难呼吸、以及口周围起泡的口水、及拒绝进食及饮水。Ellis等人(1996)JAVMA 208：393-400。
钩端螺旋体病是由钩端螺旋体属的螺旋体引起的疾病，为重要经济家畜的动物性感染。Leptospira borgpetersenii serovar hardjo(哈德焦钩端螺旋体)以及L.interrogans serovar pomona(波摩那钩端螺旋体)是最常见与世界各地牛钩端螺旋体病相关的二种血清变型。在美国的牛只调查中，29％在血清学上与哈德焦钩端螺旋体有反应，23％与波摩那钩端螺旋体有反应。钩端螺旋体经由粘膜或破裂皮肤侵入身体，经由血液散播。他们趋向于肾以及生殖道，较不常见于眼的玻璃体液以及中枢神经系统。最常见的感染方法是直接或间接和感染的尿液、乳汁、或胎盘液接触，但是亦可经性行为以及经卵巢感染。感染钩端螺旋体属的牛会出现急性的发烧、缺乳、流产、或早产以及产出虚弱的感染小牛，以及可导致繁殖失败以及低的受孕率。可用抗生素治疗感染，但是抗生素治疗对非泌乳的或非妊娠的牛只并不明显。该牛会形成肾脏急性的或慢性的感染，造成致病生物体从尿道排除，进而感染其它动物或管理牛的人。对钩端螺旋体属的免疫具有血清变型的特异性，虽然多年来已有疫苗，但绝大多只能诱发不良以及短暂的免疫。
因此需要发展一种组合疫苗以对抗多种抗原，该组合疫苗对妊娠以及哺乳母牛及其后代是安全的，并满足奶牛和肉牛市场的需要。因此本发明提供疫苗以治疗和预防动物例如母牛以及小牛中呼吸性以及繁殖性疾病的主要感染性因素。本发明进一步提供免疫源性组合物和方法以治疗或预防动物的疾病或病症。
发明概述
本发明提供治疗或预防感染以下至少一种致病因子导致的动物疾病或病症的方法：1型或2型BVDV、BHV-1、PI3、BRSV、胎儿弯曲杆菌、犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospira borgpeterseniihardjo-prajitno、出血黄疽钩端螺旋体、Leptospira borgpeterseniihardjo-bovis以及Leptospira interrogans pomona，该方法包含对所述动物施用有效量的组合疫苗。
本发明方法可保护动物，例如牛(特别是奶牛)免于呼吸感染和繁殖性疾病。本发明方法可保护动物例如妊娠母牛免于由IBR引起的流产以及1型和2型BVDV引起的持续性胎儿感染。本发明方法亦可保护动物例如泌乳母牛以及哺乳小牛的妊娠母牛免于由1型以及2型BVDV引起的持续性感染。因此，本发明方法可保护育龄动物、妊娠动物以及泌乳动物。
本发明方法使用的组合疫苗可为全细胞或部分细胞制剂(例如经修饰的活制剂)。依据本发明施用的组合疫苗可包括其它成份，例如佐剂，且可选择地在组合疫苗中使用第二种或多种抗原。第二抗原选自选自但不限于下列：1型牛孢疹病毒(BHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(1型或2型BVDV)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感病毒(PI3)、犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno、出血黄疽钩端螺旋体、Leptospira interrogans pomona、Leptospira borgpeterseniihardjo-bovis、布拉迪斯拉发钩端螺旋体(Leptospira bratislava)、胎儿弯曲杆菌、犬新孢子虫(Neospora caninum)、胎儿滴虫(Trichomonusfetus)、牛枝原体(Mycoplasma bovis)、睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)以及多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)。
发明详述
本发明提供治疗或预防由IBR、BVDV、PI3、BRSV、胎儿弯曲杆菌和/或钩端螺旋体属感染引起的动物疾病或病症的方法，包括对所述动物施用有效量的组合疫苗。
在某些具体实施方案中，本发明方法使用的疫苗包含经修饰的活疫苗以及药学上可接受的载体、或经修饰的活疫苗以及佐剂。
为了清楚说明本发明，而非限制本发明的方法，本发明的详细描述可分成以下几部分，以描述或说明本发明某些特色、实施方案或用途。
定义以及缩写
本文术语“治疗或预防”疾病或病症是指降低或排除致病性1型以及2型BVDV病毒、IBR、PI3、BRSV、弯曲杆菌和/或钩端螺旋体属抗原感染的风险，改善或缓和感染症状，或加速感染的康复。若能降低病毒或细菌负荷、降低肺部的感染、降低直肠温度、和/或增加食物摄入和/或生长，则该治疗方法可认为具有治疗效果的。若能降低钩端螺旋体属(例如Leptospiraserovars hardjo以及Leptospira serovars pomona)导致的胎儿感染和尿道排出，则该治疗方法亦可视同为具有治疗效果。
本发明方法例如可有效的预防或降低IBR引起的流产以及1型和2型BVDV引起的感染，以及降低直肠温度。因此本发明可保护胎儿对抗IBR以及1型和2型BVDV引起的感染以及保护胎儿对抗牛孢疹以及牛瘟病毒。本发明也可提供保护胎儿免于持续性感染，例如持续性BVDV感染。“持续性胎儿感染”意指发生在胎儿发育早期(例如，妊娠的45-125天)的感染，其导致初生动物对BVDV具有免疫耐受性以及在数月或数年内保持高比率的BVDV复制以及繁殖活性，成为牛群BVDV感染的永久来源。此类持续性感染的动物若再度感染致细胞病变的病毒生物型，也会有产生致死性粘膜疾病的危险。
本文术语“组合疫苗”意指两价的或多价的抗原组合，该抗原包括经修饰的活抗原和/或失活抗原。依据本发明的组合疫苗包含经修饰的活的感染性的IBR、PI3、BRSV以及失活的1型和2型BVDV、一种或多种抗原例如(但不限于)犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospira borgpeterseniihardio-prajitno、出血黄疽钩端螺旋体、Leptospira interrogansPomona)、Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、胎儿弯曲杆菌、犬新孢子虫、胎儿滴虫、牛枝原体、睡眠嗜血菌、溶血性曼氏杆菌以及多杀巴斯德氏菌、兽医学可接受的载体以及佐剂。优选的具体实施方案中，此经修饰的活的IBR成分是温度敏感性的IBR。另一优选具体实施方案中，2型BVDV成分是致细胞病变的菌株(cpBVD-2菌株53637-ATCC编号第PTA-4859号)，1型BVDV成分是致细胞病变的5960菌株(cpBDV-1菌株5960-National Animal Disease Center，United StatesDepartment of Agriculture，Ames，Iowa)。本发明亦包含非致细胞病变的1型以及2型BVDV株系。另一优选的具体实施例中，经修饰的活抗原是干燥、冷冻干燥的或玻璃化的抗原。
依据本发明的组合疫苗可以包含失活的1型以及2型BVDV、一种或多种抗原例如(但不限于)犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospiraborgpetersenii hardio-prajitno、黄疽出血型钩端螺旋体、Leptospirainterrogans pomona、Leptospira borgpetersenii hardio-bovis、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、胎儿弯曲杆菌、犬新孢子虫、胎儿滴虫、牛枝原体、睡眠嗜血菌、溶血性曼氏杆菌以及多杀巴斯德氏菌、兽医学可接受的载体以及佐剂。本文术语的“组合疫苗”意指多成分组合物，其中包含至少一种经修饰的活的抗原、至少一种第二抗原和佐剂，其可防止或降低感染风险和/或改善感染症状。在优选的具体实施例中第二抗原是失活抗原。在优选的具体实施例中，组合疫苗的来源是PregSure5(Pfizer，Inc.)、PregSure5-5L(Pfizer，Inc.)以及PregSure5-VL5(Pfizer，Inc.)。组合疫苗尤佳的来源是PregSure5-VL5。
组合疫苗组合物对抗病原体的保护效应通常是经过诱发患者免疫反应来实现的，该免疫反应是细胞调节的或体液免疫反应或两者的组合。一般而言，消除或降低BVDV、IBR、和/或PI3感染的发生率、改善症状、或从感染的对象中加速除去病毒可指示组合疫苗组合物的保护效应。本发明供应的疫苗组合物可保护对抗1型和/或2型BVD病毒引起的感染与BHV-1(IBR)引起的流产以及PI3及BRSV引起的呼吸感染。
通过施用组合疫苗来治疗或预防由IBR、BVDV、PI3、BRSV、胎儿弯曲杆菌和/或钩端螺旋体属感染引起的动物疾病或病症的本发明方法，在此亦称为疫苗接种方法。
可用于本发明方法的本文术语“组合疫苗”包括例如失活的全细胞或部分胎儿弯曲杆菌和/或钩端螺旋体属细胞制剂、失活的1型以及2型BVDV和/或一种或多种经修饰的活抗原例如BHV-1、PI3和/或BRSV。
在一个实施方案中，本发明疫苗组合物包含有效量的一种或多种上述的BVDV病毒，优选为cpBVD-2菌株53537(ATCC PTA-4859)；cpBVD-1菌株5960(cpBDV-1菌株5960-National Animal Disease Center，United StatesDepartment of Agriculture，Ames，Iowa)；IBR ts突变株RBL 106(NationalInstitute of Veterinary Research，Brussels，Belgium)；PI3 ts突变株RBL 103(RIT，Rixensart，Belgium)；BRSV菌株375(Veterinary MedicalResearch Institute，Ames，Iowa)。疫苗组合物中可直接利用纯化的BVDV病毒，或优选地，BVD病毒可经化学方法失活或连续在体外传代而加以进一步减毒。典型地，疫苗含有约1×103至约1×1010溶菌斑或菌落形成单位的病毒，和兽医学可接受的载体以及佐剂，体积介于0.5至5毫升之间以及优选为约2毫升。疫苗组合物中提供有效保护效应所需的病毒精确量可由熟练的兽医测定。适用于疫苗组合物的兽医学可接受的载体可为描述于下的任何载体。
典型的施用途径是肌肉内或皮下注射约0.1至约5毫升的疫苗。本发明的疫苗组合物也可包含额外的活性成分，例如对抗BVDV的其它疫苗组合物，例如描述于WO 9512682、WO 9955366、美国专利第6,060,457号、美国专利第6,015,795号、美国专利第6,001,613号、以及美国专利第5,593,873号中地疫苗组合物。
经由单次接种注射或经由多次接种注射可完成疫苗接种。视需要可从接种动物收集血清以及测试抗BVD病毒抗体的存在。
本发明另一具体实施例中，疫苗组合物是用于治疗BVDV感染。据此，本发明提供治疗1型或2型、或1型及2型BVD病毒导致的动物感染的方法，其包括对动物施用治疗有效量的本发明BVD病毒。另一具体实施例中本发明疫苗组合物可有效的增进畜群繁殖力，以及降低疾病从牛传播至人类的危险。
“动物对象”意指包含任何易受BVDV、BHV、PI3、BRSV或钩端螺旋体属感染的动物，例如：牛、绵羊及猪。
在实行本发明方法时，将本发明疫苗组合物施用给牛，优选经由肌肉内或皮下路径，虽然其它路径亦可利用，例如：经口的、鼻腔内的(例如气溶胶或其它不用针头的施用路径)、淋巴结内的、皮肤内的、腹膜内的、直肠的或阴道的施用路径、或上述路径的组合。亦可能需要加强免疫方案，可调整此剂量方案以提供最佳的免疫。
“免疫原性”意指BVD病毒使动物产生免疫反应对抗1型或2型BVD病毒、或对抗1型和2型BVD病毒二者的能力。该免疫反应可为主要由毒性T-细胞介导的细胞免疫反应，或主要由辅助T-细胞活化介导的体液免疫，该体液免疫反应接着激活B细胞，导致抗体生产。
依据本发明，在用于免疫原性组合物之前，病毒优选是经由化学失活或在细胞培养体系中连续传代而加以减毒。此减毒方法是熟悉本领域的专业人士所熟知的方法。
本发明免疫原性组合物中所要包括的优选病毒为BVDV cp53637(ATCCNo.PTA-4859)。本发明免疫原性组合物所要包括的另一优选病毒为BVDV5960。本发明免疫原性组合物所要包括的更优选的病毒是IBR株ts突变株RBL 106。本发明免疫原性组合物所要包括的另一优选病毒为PI3 ts突变株RBL 103。本发明免疫原性组合物所要包括的另一优选病毒为BRSV株系375。
本发明的免疫原性组合物也可包含额外的活性成分，例如对抗BVDV的其它免疫原性组合物，例如描述于共同未决申请案系列号08/107,908、WO9512682、WO 9955366、美国专利第6,060,457号、美国专利第6,015,795号、美国专利第6,001,613号、及美国专利第5,593,873号中的那些。
此外，本发明免疫原性以及疫苗组合物能包含一种或多种兽医学可接受的载体。本文的“兽医学可接受的载体”包括任何以及所有的溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌及抗真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂等。稀释剂可以包括水、生理盐水、葡聚糖、乙醇、甘油等。等渗剂可以包括氯化钠、葡聚糖、甘露糖醇、山梨糖醇、及乳糖等。稳定剂可以包括白蛋白等。佐剂包括(但不限于)：RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、明矾、氢氧化铝凝胶、胆固醇、水包油乳状液、油包水乳状液，例如：弗氏完全以及不完全佐剂、Block co-polymer(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、AMPHIGEN佐剂、皂苷、Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)或其它皂苷组分、单磷脂酰脂质A、阿夫立定脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的热不稳定的肠毒素(重组型或非重组型)、霍乱毒素、或胞壁酰二肽，等等。免疫原性组合物能进一步包含一种或多种其它免疫调节剂，例如：白介素、干扰素、或其它细胞因子。免疫原性组合物亦能包含庆大霉素以及硫柳汞。尽管本发明中佐剂以及添加剂的用量及浓度能容易地由熟悉本领域的专业人士确定，本发明组合物预期包含约50微克至约2000微克的佐剂以及疫苗组合物，优选包含约500微克/2毫升疫苗组合物的剂量。另一优选的具体实施例中，本发明疫苗组合物预期包含约1微克/毫升至约60微克/毫升的抗生素，更优选少于约30微克/毫升的抗生素。
取决于施用途径，本发明免疫原性组合物可以制成各种不同的形式。例如，免疫原性组合物可以制成适用于注射的无菌水溶液或分散液的形式，或使用冷冻干燥技艺制成冷冻干燥的形式。冷冻干燥的免疫原性组合物一般是维持在约4℃，以及可重新调配于稳定溶液中，例如盐水或和HEPES，含或不含佐剂。
本发明免疫原性组合物可施用于动物对象以诱发免疫反应对抗1型或2型BVD病毒，或对抗1型以及2型BVD病毒。据此，本发明另一具体实施例提供刺激免疫反应对抗1型或2型BVD病毒、或对抗1型以及2型BVD病毒组合的方法，包括对动物施用有效量的上述本发明免疫原性组合物。“动物对象”意指包含任何易受BVDV感染的动物，例如：牛、绵羊及猪。
依据本发明方法，用于施用给动物对象的优选免疫原性组合物包括BVDV cp53637病毒和/或BVDV cp5960病毒。将含有BVDV病毒(优选经化学失活或在培养体系中连续传代而减毒)的免疫原性组合物施用给牛，优选经由肌肉内的或皮下路径施用，虽然其它施用路径亦可利用，例如：经口的、鼻腔内的、淋巴结内的、皮肤内的、腹膜内的、直肠的或阴道的施用路径，或组合的路径。
免疫方案可使用本领域已知的方法最佳化。可对动物施用单一剂量，或进行两次或多次免疫接种，间隔为二至十周。取决于动物年龄，可再次施用免疫原性或疫苗组合物。例如，本发明预期对健康的牛在年龄六个月之前进行疫苗接种，以及在年龄六个月时进行疫苗再接种。另一实施例中，本发明打算对生育前的牛在生育前约5周进行疫苗接种以及在生育前约2周再一次进行疫苗接种，以保护胎儿对抗1型以及2型BVDV引起的感染。也预期用单一剂量的组合疫苗进行半年再接种以预防胎儿感染BVDV。
牛中诱导的免疫反应的程度以及性质可用各种技术评估。例如可从接种动物收集血清以及测试抗BVDV病毒的特异性抗体是否存在，例如用传统的病毒中和反应分析。
本文术语的“牛”意指牛科动物，包括(但非限于)：菜牛、公牛、母牛、及小牛。此处所用的牛意指妊娠以及泌乳的牛。优选地，本发明方法应用于非人类的哺乳动物；优选是泌乳的或妊娠母牛以及其胎儿。
本文术语“治疗有效量”或“有效量”意指足以在所施用的动物中引发免疫反应的组合疫苗的量。免疫反应可包含(但不限于)：诱发细胞和/或体液免疫。疫苗的治疗有效量取决于所用的特定病毒、牛的状况和/或感染的程度而变化，以及可由兽医确定。
失活(部分或全细胞)及经修饰的活疫苗
本发明方法使用的失活或经修饰的活疫苗能使用各种本领域已知的方法制备。
例如，可使用已知技术直接从已感染的母牛子宫得到BVDV分离株。
BVDV的分离株可使用各种已知方法失活，例如用双元亚乙基亚胺(BEI)处理菌株，其描述于美国专利第5,565,205号，或用福尔马林、戊二醛、加热、放射、BPL、或本领域已知的其它失活剂失活。
除了失活的病毒分离株之外，疫苗产品亦可包括适量的一种或多种常用的佐剂。适当的佐剂包括(但不限于)：无机凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，例如溶血卵磷脂；糖苷，例如皂苷衍生物例如Quil A或GPI-0100；多聚醇(pluronic polyol)；聚阴离子；非离子性嵌段聚合物，例如PluronicF-127(B.A.S.F.，USA)；肽类；矿物油，例如Montanide ISA-50(Seppic，Paris，France)、卡波姆、Amphigen、Amphigen Mark II(Hydronics，USA)、Alhydrogel、油状乳液，例如矿物油乳化物，例如BayolF/Arlacel A以及水的乳化物，或植物油、水以及乳化剂例如卵磷脂的乳化物；明矾；牛细胞因子；胆固醇；以及佐剂组合物。优选的具体实施例中，含有皂苷的水包油乳化物是用传统方法微型流体化的。
应用于本发明疫苗以及方法中的1型BVDV特别优选的来源是PregSure(PFIZER INC.)，其含有BVDV株系5960(得自National AnimalDisease Center(NADC)，USDA，Ames，IA)。应用于本发明疫苗以及方法中的2型BVDV的特别优选的来源是PregSure(PFIZER INC.)，其含有BVDV株系53637(ATCC PTA-4859)，得自University of Guelph，Guelph，Ontario。
优选地，株系5960以及53637是用BEI失活并用市售的佐剂，优选QuilA-胆固醇-Amphigen(Hydronics，USA)进行佐剂化。本发明免疫原性以及疫苗组合物优选的剂量约2.0毫升。本发明方法以及组合物中可包含防腐剂。本发明考虑包含的防腐剂可为庆大霉素以及硫柳汞。亦可添加载体，优选为PBS。制备经修饰的活疫苗，例如经培养体系传代培养以使菌株毒性减若的方法是本领域已知的。
失活BVDV分离株也能组合下列的细菌及病毒，包括(但不限于)1型牛疱疹病毒(BHV-1)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感病毒(PI3)、胎儿弯曲杆菌、犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospiraborgpetersenii hardjo-prajitno、黄疽出血型钩端螺旋体、Leptospiraborgpetersenii hardjo-bovis以及Leptospira interrogans pomona。
剂量及给药模式
依据本发明，对牛(包括妊娠母牛以及哺乳小牛的妊娠母牛)施用有效量的组合疫苗提供了有效的免疫以对抗与牛病毒性腹泻病毒(1型以及2型)相关的疾病和胎儿感染。在一个具体实施例中，对小牛施用二个剂量的组合疫苗，时间间隔为大约3至4周。例如，在动物年龄为约1至约3个月时进行第一次施用。在第一次施用组合疫苗后约1至约4周进行第二次施用。
优选的具体实施例中，在动物育种前约5周进行第一次施用。在动物育种前约2周进行第二次施用。后续疫苗剂量的施用优选以年为基础进行。另一优选的具体实施例中，动物在年龄约6个月前接种，在年龄6个月后再接种。后续疫苗剂量的施用优选以年为基础进行。
组合疫苗的有效量取决于疫苗的成分以及施用方案。典型地，当疫苗中使用失活的牛病毒性腹泻病毒制剂时，每剂量的BVDV疫苗(1型以及2型)内含约103至约1010菌落形成单位，优选每剂量的BVDV(1型以及2型)疫苗含约105至约108菌落形成单位，在约3至4周期间施用至动物两次的情况下是有效的。优选地，在约3至4周期间施用至动物两次的情况下，提供有效免疫的组合疫苗中每剂量的BVDV(1型以及2型)含有约105至108菌落形成单位以及更佳者每剂量约106菌落形成单位。在动物育种前约5周进行第一次施用。在动物育种前约2周进行第二次施用。后续疫苗剂量的施用优选以年为基础进行。动物在年龄约6个月前接种，在年龄6个月后再接种。后续疫苗剂量的施用优选以年为基础进行。
依据本发明，当施用优选的产品即PregSure5(Pfizer，Inc.)时，优选施用PregSure5两次，每次的用量约0.5毫升至约5.0毫升，优选约1.5毫升至约2.5毫升，以及更佳者约2毫升。当施用优选的产品即PregSure5-L5或PregSure5-VL5时，优选施用PregSure5-L5或PregSure5-VL5两次，每次的用量约0.5毫升至约10.0毫升，优选约3毫升至约7毫升，以及更佳者约5毫升。在动物育种前约5周进行第一次施用。在动物育种前约2周进行第二次施用。后续疫苗剂量的施用优选以年为基础进行。若动物在年龄约6个月前接种，则在年龄6个月后再接种。后续疫苗剂量的施用优选以年为基础进行。
依据本发明，给药可经已知的路径进行，包括：口服、鼻腔内、局部、经皮、以及非经肠(例如：静脉内、腹膜内、皮肤内、皮下或肌肉内)路径。优选给药路径是皮下或肌肉内给药。
本发明也预期进行单一剂量初次给药，接着于一周牛进行再接种，所以就不需要为了产生和/或维持对抗感染的免疫力而对小牛在一周年前再接种额外的剂量。
依据本发明施用的组合疫苗能包含额外的成份，例如佐剂(例如无机凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，例如胆固醇、溶血卵磷脂；糖苷，例如皂苷衍生物，例如Quil A、QS-21或GPI-0100；多聚醇；聚阴离子；非离子性嵌段聚合物，例如Pluronic F-127；肽类；矿物油，例如MontanideISA-50、卡波姆、Amphigen、Alhydrogel、油状乳液，例如矿物油如BayolF/Arlacel A和水的乳化物、或植物油、水和乳化剂例如卵磷脂的乳化物；明矾；牛细胞因子；以及佐剂组合)。
依据本发明，对年龄大约3个月大的牛施用有效量的组合疫苗可提供有效的免疫以对抗呼吸感染以及繁殖性疾病、以及降低流产。
本发明也提供免疫牛(包括但不限于母牛、小牛、以及育种前的小母牛)以对抗BVDV(1型以及2型)引起的感染以及归因于IBR、BVDV(1型以及2型)、PI3、BRSV、弯杆菌病以及钩端螺旋体病的呼吸性疾病的方法，该方法包含对动物施用至少一个剂量，以及优选二个剂量的组合疫苗，以对动物进行免疫对抗BVD(1以及2型)、IBR、PI3、BRSV、犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno、黄疽出血型钩端螺旋体、Leptospira interrogans pomona、Leptospiraborgpetersenii hardjobovis、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、及胎儿弯曲杆菌引起的感染。
优选的具体实施例中，于皮下施用疫苗。另一优选的具体实施例中，于肌肉内施用疫苗。此外，优选疫苗剂量包含约2毫升至约7毫升，以及优选约5毫升，每毫升内含约103至约1010菌落形成单位/每剂量病毒。另一优选的具体实施例中，疫苗包含约2毫升，每毫升内含约103至约1010菌落形成单位/每剂量病毒。组合疫苗最好施用至动物两次；一次在约年龄1010至约3个月，一次则在约1至4周后。本发明也考虑以单一剂量疫苗于半年内再接种以及在生育前再接种疫苗。
本发明也提供保护牛胎儿免于胎儿感染和持续性的胎儿感染的方法，其包含对动物施用至少一个剂量，以及优选二个剂量的组合疫苗以免疫胎儿对抗BVD(1型以及2型)、IBR、PI3、BRSV、犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno、黄疽出血型钩端螺旋体、Leptospira interrogans pomona、Leptospira borgpeterseniihardjo-bovis、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、及胎儿弯曲杆菌引起的感染。组合疫苗优选对动物施用两次，一次在生育前约五周，而另一次则在生育前约二周。
本发明也涉及对动物(优选牛)施用有效量的组合疫苗以治疗或预防该动物中的疾病，包括持续性的胎儿感染以及繁殖性病症，例如流产。
本发明用下列实施例进一步说明(但非限制)。
                         实施例1
                       材料以及方法
动物——五十六只适于生育的BVDV血清阴性(即其具有的血清中和反应[SN]效价＜1∶2)母牛得自多种来源，在研究期间维持于研究的分开设备中。每只动物用两个耳标签加以确认，每耳一个标签。若动物遗失耳标签，则重新装上新的标签。在研究前，将测验动物接种用于钩端螺旋体病、弯杆菌病(弧菌病)以及梭状芽胞杆菌感染的商品疫苗。测验动物维持在兽医的监视下，该兽医每天临床监测测验动物。
测试疫苗——测试疫苗是多价的、经修饰的活的传染性牛鼻气管炎(IBR)一副流感病毒3(PI3)-呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，为干燥形式，用失活的混合有佐剂的液体BVDV疫苗再水化(Pfizer Inc，New York，NY.)。BVDV成分含有最小量的BVDV-1和-2免疫剂量，并与无菌佐剂混合。计算用于疫苗制剂的整体流体的8重复滴定的几何平均值效价(GMT)，从而确定BVDV免疫抗原的效能。再水化后，用肌肉内注射(IM)或皮下(SC)注射施用2毫升剂量的IBR-PI3-BRSV-BVDV疫苗。用灭菌水重构的干燥IBR-PI3-RSV疫苗用作安慰剂，并进行IM注射。
病毒攻击——使用非致细胞病变的2型BVDV野外分离株(株系94B-5359，得自Dr.Hana Van Campen，Wyoming State VeterinaryLaboratory，University of Wyoming)作为攻击剂。病毒特性是用SN分析以及反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)证实。2型BVDV的p125蛋白质和5端非翻译区域的核苷酸序列的RT-PCR分析呈阳性，而1型BVDV的gp53和p80保守序列呈阴性。在攻击前后立刻进行2重复滴定，确定攻击病毒效能的GMT为103.2TCID50/毫升。鼻内进行4毫升分剂量的攻击接种(2毫升/鼻孔)。
血清测定——1型以及2型BVDV的血清中和反应效价是用固定病毒、降低血清分析在牛细胞培养中测定。将系列稀释的血清与50-300 TCID50的致细胞病变1型BVDV菌株5960，或相似量的致细胞病变2型BVDV株系125c混合。
病毒分离——攻击后(PC)分离来自母牛外周血、羊水、胎儿血、及胎儿组织的牛细胞培养中的BVDV。使用山羊抗-BVDV多克隆抗体以间接免疫萤光测定BVDV阳性的细胞培养物。使用前述的免疫组织化学方法从胎儿组织试图分离BVDV。(Haines DM，Clark EG，和Dubovi EJ.Vet Pathol1992；29：27-32)。从母牛颈静脉放出5-10毫升全血样品并置于内含肝素的试管以制备用于病毒分离的棕黄层细胞。在局部的麻醉下以左边-邻接的剖腹手术收集羊水以及从子宫抽吸3-5毫升样本。
剖腹生产或自然流产后，无菌条件下从胎儿收集眼、脾、胸腺、以及3个脑切片(脑干/中脑、大脑、及小脑)。均质化胎儿组织的上清液用于细胞培养分离病毒。为了进行免疫组织化学评估，将胎儿组织包埋在石蜡中以及使用内含抗-BVDV单克隆抗体的1∶800以及1∶600腹水稀释液进行了双重复测试。
生物统计数据分析——为了证明攻击后的保护作用，在接种组(T2以及T3)相对于安慰剂对照组(T1)中，应证明母亲及胎儿2型BVDV感染发生率在统计上显著减少，。
使用Fisher氏精确测试比较(1)攻击后前14天母牛病毒血症的发生率、(2)分离自羊水的BVDV、(3)自然流产或剖腹生产后从胎儿组织和胎儿血分离的BVDV、以及(4)BVDV阳性胎儿组织的免疫组织化学。使用混合的线性模型和重复计量分析血清中和反应效价。使用变方分析的最小均方根，计算几何平均效价(GMT)，其排除了未受攻击母牛的SN数据。使用概率值P≤0.05来测定统计显著性。
胎儿保护研究——56只待测母牛随机分配到三个测验组，即IM安慰剂组(T1)、IM疫苗接种组(T2)、及SC疫苗接种组(T3)，如表1所示。母牛在研究的0天以及21天接种疫苗或安慰剂。所有的案例中，第0天的防疫注射是施用在颈部左边，以及第21天的防疫注射是施用在颈部右边。
第1天，母牛被给予覆盖有醋酸美仑孕酮的食物为期14天。第32天，对所有的母牛进行IM前列腺素注射(Lutalyse，Pharmacia &Upjohn，Kalamazoo，MI)以使动情期同步化。对显示动情期的母牛用BVDV-阴性精液进行人工授精。在第100天，大约是受孕65天，用直肠触诊测定母牛怀孕的情况。第105天，各测验组随机选出23只证实怀孕的母牛(对照组7只、IM接种组8只、以及SC接种组8只)，重新安置于附近的隔离设施，(Midwest Veterinary Services，Oaklank，NE)以及混和群居。第119天，将这23只待测母牛从鼻腔内注射致病的BVDV。注射当天以及在8个PC间隔收集血液样本，即在第119、121、123、125、127、129、133、140、及147天(PC日0、2、4、6、8、10、14、21、及28)，以分离BVDV并进行血清分析。
第147天(攻击后28天)，从每只母牛左侧进行剖腹术，并从每只母牛抽取羊水。第297天，大约分娩前7-14天，待测母牛被运送至Universityof Nebraska，Department of Veterinary and Biomedical Services进行剖腹生产。外科手术前，从每只母牛收集血液样本进行SN分析。剖腹生产后(第300-301天)，从每只胎儿收集血液样本。将胎儿安乐死并无菌收集组织以分离BVDV。
当发生自然流产时，在流产时以及在二周后从牛栏采取血液样本。将配对的血液样本进行血清测试(University of Nebraska VeterinaryDiagnositic Center，Lincoln，NE)，对流产胎儿进行BVDV分离评估(PfizerCentral Research，Lincoln，NE)以及胎儿组织的组织病理学评估(Saskatoon Veterinary Biodiagnostics，Saskatoon，SK，Canada)。
                       结果
观察到施用2个疫苗剂量期间或紧接之后并无副作用。
所有的母牛在疫苗接种前(第0天)呈1型以及2型BVDV血清阴性，证实测验动物在研究开始时对BVDV是免疫学上幼稚的。1型BVDV的GMT值展示于表2。16只接种动物中有十五只在施用2个疫苗剂量后呈血清转换现象。编号61的母牛(T3组)中1型BVDV的SN效价在第0天＜1∶2、在第21天为1∶19，以及在第33及119天＜1∶2。2型BVDV的GMT值展示于表3。所有接种的动物(包括61号母牛)，在第二剂量后发生血清转换。(61号母牛中2型BVDV的SN效价在第0天＜2，在第21天为1∶19，在第33天为1∶2，048，以及在第119天为1∶431)。繁殖时(第32-41天)，接种的母牛(61号母牛除外)中1型BVDV的SN效价介于1∶64至1∶13,777。接种的母牛在繁殖时2型BVDV的效价介于1∶64至1∶6,889。疫苗接种后，IM(T2)相对于SC(T3)组的GMT值差异在攻击前给药间隔或攻击后均不具统计显著性。至攻击时(第119天)，所有的安慰剂组母牛(T1)均保持1型以及2型BVDV血清阴性，显示本研究没有被偶发的暴露所破坏。所有安慰剂组的母牛在攻击后发生血清反应，证实每只动物均遭受到有效攻击。安慰剂组中1型BVDV的PC-GMT显著低于任一疫苗组所获得的免疫记忆反应(anemnesticresponse)(表2，第147天)。相比于任一疫苗组，安慰剂组母牛中2型BVDV的PC-GMT也较低，但是这差异只对IM(T2)接种动物具有统计显著性。
将3个测验组的二十三只母牛证实了妊娠，进行免疫攻击，并进行羊膜腔穿刺术(表1)。在羊膜腔穿刺术(第147天)以及剖腹生产(第300-301天)之间，有7只母牛流产，4只是T2组以及3只是T3组。此外，3只繁殖母牛(T1安慰剂组1只母牛以及T3组2只母牛)在剖腹生产时发现并未怀孕。此3只母牛是在第100天(大约繁殖后第65天)经直肠触诊证实怀孕，这表明后来发生了未侦测到的流产或胎儿再吸收。因为无法拿到这3只母牛的胎儿组织进行评估，所以从研究中移除这些动物。第259天，T1安慰剂组编号67的母牛死亡，所以移除它的胎儿不进行BVDV分离。因此，在研究的最后中，23只被攻击的母牛只有12只母牛进行剖腹生产。对这12只源自剖腹生产的胎儿加上7只流产胎儿以及死亡母牛的胎儿(共20只)进行BVDV分离评估。
第156天，T2组的38号母牛流产了它的胎儿(怀孕第123天，以及攻击后第37天)。并未评估配对的血清样品，但是攻击后第38号母牛的外周血以及羊水中BVDV分离呈现阴性。胎儿严重地自体溶解。胎儿经组织病理学以及细菌学的评估揭露绒毛膜以及绒毛膜下结缔组织的化脓炎症。从肺、肝、及胸腔的流体分离出猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)。BVDV分离以及免疫组织化学得到阴性结果，显示胎儿没有因攻击而感染。
三只T3母牛(编号21、27、及40)在第158天或在第159天流产(怀孕第125-127天，以及攻击后第39或40天)。因为没有观察到流产，所以不知道胎儿是属于那一只母牛的。它们被称为未知胎儿1、2或3。未知胎儿1是木乃尹化的，具有组织学上典型的新孢虫症(neosporosis)的损害。未知胎儿2是自体溶解的，具有多病灶的化脓的以及坏死性胎盘炎以及大量细菌球菌与发炎性渗出液的混合物。从肺、肾、肝、胃内含物以及胎盘组织分离出猪葡萄球菌。未知胎儿3是软化的及自体溶解的。从肺、肝、肾、及胃内含物分离出葡萄球菌。从这3只未知胎儿的所有组织得到BVDV分离以及免疫组织化学阴性结果。攻击后所有3只母牛外周血显示BVDV分离阴性。类似地，分离自21号以及40号母牛的羊水同样是BVDV阴性，但是27号母牛的羊水样本是BVDV阳性。未评估所述母牛的配对血清样品。
第160天，T2组45号母牛的胎儿流产(怀孕第128天，以及攻击后第41天)。研究结果清楚地显示广泛的胎儿自溶现象。从肺、肝、肾、胃内含物、及胎盘分离出葡萄球菌。呈现具有多病灶血栓形成的胎盘炎以及化脓性脉管炎。胸腔流体血清测定是IBR、牛病毒性腹泻(BVD)、及钩端螺旋体病阴性。所有的胎儿组织得到BVDV分离及免疫组织化学阴性结果。
第195天，T2组66号母牛的胎儿流产(怀孕第160天，以及攻击后第76天)。从胎儿表面延伸到胎盘固有层观察到明显的化脓性炎症。从胃内含物以及胎盘培养出大肠杆菌以及普通变形菌(Proteus vulgaris)。配对的血清样品以及胸腔的流体血清检验结果显示病原学不是IBR、BVD、或钩端螺旋体病。所有的胎儿组织得到BVDV分离及免疫组织化学阴性结果。
第295天，T2组的31号母牛流产了它的胎儿(怀孕第262天，以及攻击后第176天)。组织病理学的检查揭露扩散性坏死化脓的胎盘炎、绒毛膜上皮坏死、以及强烈的嗜中性白血球炎症。从这发炎性的病灶培养出革兰氏阴性的球杆菌和杆菌。配对的血清学检验结果显示病原学不是IBR、BVD、或钩端螺旋体病。所有的胎儿组织得到BVDV分离及免疫组织化学阴性结果。
得自研究结束前即死亡的T1安慰剂组67号母牛的PC外周血样品以及羊水呈BVDV分离阳性。此母牛的所有胎儿组织呈BVDV分离以及免疫组织化学阳性。
从12只剖腹胎儿收集的血液样本测定1型以及2型BVDV的SN效价。5只安慰剂组母牛或7只接种组母牛的剖腹胎儿中，没有一只呈现1型或2型BVDV血清阳性。
攻击后病毒分离的结果展示于表4。所有的7只T1安慰剂组母牛均有BVDV病毒血症，证实了表明各非接种的动物发生有效攻击的血清结果。所有16只T2以及T3接种组(各8个攻击后样品)的血液样本呈BVDV病毒血症阴性。T2及T3接种组PC病毒血症比率相对于对照的差异是有统计显著性的(P≤0.0001)。
16只接种组中有2只(12.5％)的羊水是BVDV阳性，而7只安慰剂组母牛中有7只(100％)具有阳性结果，它们具有显著的统计差异(P≤0.0001)。T3接种组中编号27以及60的羊水样品是阳性。病毒分离以及免疫组织化学方法显示27号母牛的胎儿分析呈BVDV-阴性。
14只接种动物中有1只(即T3中60号母牛)的胎儿组织(7.1％)是呈BVDV分离阳性。相对于6只T1安慰剂组母牛胎儿中有6只(100％)分离出BVDV，具有统计上显著的差异(P≤0.0001)。评估各胎儿组织中分离BVDV的结果为全阳性或全阴性。
14只T2以及T3接种组动物中有1只(T3组60号母牛)(7.1％)胎儿组织免疫组织化学结果呈BVDV阳性。6只T1安慰剂组母牛中有6只(100％)的胎儿组织呈BVDV-免疫组织化学阳性，显著地高于接种组的发生率(P≤0.0001)。各胎儿组织BVDV免疫组织化学评估的结果为全阳性或全阴性。
表5显示了病毒分离来源以及2只具有BVDV分离结果阳性的接种母牛的攻击前SN效价。血清数据显示T3接种组的27以及60号对疫苗接种有免疫反应。27号母牛的2型BVDV的SN效价在攻击时低于T3组的GMT，但是此差异不显著。
肌肉内疫苗接种以及SC疫苗接种总共提供92.9％的功效以对抗胎儿BVDV-2感染，14只接种的母牛中有13只的胎儿组织呈BVDV分离结果阴性(表4)。此相当于早期相同疫苗对抗胎儿BVDV-1攻击(参见实施例2)的88.9％的保护(18只接种动物中有16只是BVDV-分离阴性)。此二个研究中，100％的胎儿感染发生于非接种的安慰剂组母牛中，证实接种动物暴露于严重的免疫攻击。
从2只接种母牛即27以及60号的羊水中分离出攻击病毒(表5)。因此，此二只母牛被认定是BVDV感染阳性，尽管他们在8个PC给药间隔中的每一个均呈病毒血症阴性。病毒分离以及高特异性和敏感性的免疫组织化学方法均未侦测到27号母牛流产胎儿中有BVDV，因此有必要将其列为BVDV-阴性。胎儿流产可能是由于母牛的BVDV感染过程所造成。
为了确认结果，使用二种方法评估母牛(病毒血症以及从羊水分离病毒)及其胎儿(免疫组织化学以及从组织培养分离病毒)的保护。使用最保守的结果确定保护比率。因此，接种母牛的保护比率为87.5％(16只中有14只)，其为母牛羊水病毒分离为阴性的百分比，而不是100％(病毒血症-阴性母牛的百分比)。目前尚未有这样的BVDV攻击-免疫研究结果，即在能使未免疫接种对照产生100％胎儿感染的攻击下，接种动物中产生100％的胎儿保护。在一个研究中，即使是经修饰的活病毒(MLV)疫苗(不常用于评估妊娠母牛)也只能提供不超过83％的保护以对抗胎儿BVDV-1感染(Cortese VS，Grooms，DL，Ellis J，等人(1998)Am J VetRes.59：1409-1413.)。
表1  在2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)胎儿攻击研究下测验组及最终母牛的怀孕状况
组别 处理 母牛接种的数目(第0、21天) 母牛攻击的数目(第119天)                                  终止怀孕
(1)母牛死亡a (2)流产b (3)怀孕失败c (4)剖腹生产   BVDV分离所评估的胎儿数目(1+2+4)
T1T2T3     安慰剂组(IM)疫苗组(IM)疫苗组(SC) 181820 788 100 043 102 543 686
IM＝肌肉内的疫苗接种；SC＝皮下疫苗接种
aT1中67号母牛发生母亲死亡(第259天)。
bT2组中母牛38号(第156天)、45号(第160天)、66号(第195天)、31号(第295天)以及T3组中母牛21号、27号、以及40号(第158或159天)发生流产。
c所有怀孕失败的母牛均证实于第100天，即大约繁殖后65天怀孕。
表2  2型BVDV攻击的母牛对1型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清反应
处理组T1(n＝7)T2(n＝8)T3(n＝8)T2&T3(n＝16) 剖腹生产生育当天血清阳性的母牛数目a0/78/87/8(87.5％)15/16(93.8％)                     在选择的测验给药间隔1型BVDV血清中和(SN)几何平均效价的倒数
    疫苗接种(第0天)＜2＜2＜2＜2     疫苗接种(第21天)＜213.7b18.2c15.8c   繁殖(第32-41天)＜22,383.1c1,116.6c1,631.3c     攻击(第119天)＜2480.7c570.4c523.6c     羊膜腔穿刺术(第147天)65.71,919.2c1,448.3c1,667.2c 剖腹生产(第300-301天)833.6(n＝6)d762.7(n＝4)e691.7(n＝5)f726.3(n＝9)
aSN效价倒数≥8。
b统计显著的差异vs.安慰剂组(T1)，P≤0.0002。
c统计显著的差异vs.安慰剂组(T1)，P≤0.0001。
d67号母牛死于第259天。
e发生流产的母牛：38号(第156天)、45号(第160天)、66号(第195天)、以及31号(第295天)；此类母牛在第300-301天并未采血。
f母牛21、27、以及40号在第158及159天发生流产；此类母牛在第300-301天并未采血。
表3  2型BVDV攻击的母牛对2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清反应
处理组(数目)T1(n＝7)T2(n＝8)T3(n＝8)T2&T3(n＝16) 繁殖当天血清阳性的母牛数目a0/78/88/816/16                 在选择的测验给药间隔2型BVDV血清中和(SN)几何平均效价的倒数
    疫苗接种(第0天)＜2＜2＜2＜2     疫苗接种(第21天)＜27.0b12.8c9.5c     繁殖(第32-41天)＜21,217.7d1,837.6d1,495.9d     攻击(第119天)＜2285.2d261.7d273.2d     羊膜腔穿刺术(第147天)402.62,598.6e1,217.51,778.7f 剖腹生产(第300-301天)2,823.8(n＝6)g922.2b(n＝4)h621.3(n＝5)I756.9b(n＝9)
aSN效价倒数≥8。
b统计显著的差异vs.安慰剂组(T1)，P≤0.0064。
c统计显著的差异vs.安慰剂组(T1)，P≤0.0005。
d统计显著的差异vs.安慰剂组(T1)，P≤0.0001。
e统计显著的差异vs.安慰剂组(T1)，P＝0.0128。
f统计显著的差异vs.安慰剂组(T1)，P＝0.0023。
g67号母牛死于第259天。
h发生流产的母牛：38号(第156天)、45号(第160天)、66号(第195天)、以及31号(第295天)；此类母牛在第300-301天并未采血。
I母牛21、27、以及40号在第158及159天发生流产；此类母牛在第300-301天并未采血。
表4  攻击后母牛以及胎牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分离结果的总结
处理组T1安慰剂(IM)T2疫苗(IM)T3疫苗(SC)T2&T  3                                      攻击后病毒分离方法以及发生率
  病毒血症的母牛a7/7(100％)0/8(0％)d0/8(0％)d0/16(0％)d     羊水病毒分离7/7(100％)0/8(0％)d2/8(25％)d2/16(12.5％)d     胎儿组织病毒分离b6/6(100％)c0/8(0％)d1/6(16.7％)c，d1/14(7.1％)d    胎儿组织免疫组织化学分析b
   6/6(100％)c0/8(0％)d1/6(16.7％)c，d1/14(7.1％)d
a从第119天(攻击)至第147天(羊膜腔穿刺术)的9个给药间隔收集样品，制作棕黄层细胞进行病毒分离。若任何血液样本是BVDV阳性，则为病毒血症的母牛。
b流产或剖腹生产后收集胎儿组织。若任何组织是阳性，则胎儿为BVDV阳性。
c一只T1母牛，以及二只T3母牛自研究中排除，因为在剖腹生产时发现其并未怀孕，并且没有观察到流产。
d统计显著的差异vs.安慰剂组(T1)，P≤0.0001。
表5  在从接种的母牛或其胎儿分离出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的案例中母亲的血清中和反应(SN)效价以及进行攻击的
                                    结果
    测验组     母牛编号     病毒分离的来源      攻击时BVDV血清型和SN效价倒数
    怀孕终止     BVDV1     BVDV2
    T3T3T3     2760组GMT     AFAF，FT，IHCN/A     流产剖腹生产N/A     512181570     91152262
 AF＝羊水；FT＝胎儿组织；IHC＝胎儿组织的免疫组织化学；GMT＝几何平均效价；NA＝不适用
                         实施例2
                       材料以及方法
动物——五十九只BVDV血清阴性(即其具有的血清中和反应[SN]效价＜1∶2)育龄期的健康母牛得自多种来源，在研究期间在Nebraska维持于隔离的研究设备。每只动物用两个耳标签加以确认，每耳一个标签。若动物遗失耳标签则重新装上新的标签。在研究前，将测验动物接种用于钩端螺旋体病、弯杆菌病(弧菌病)、以及梭状芽胞杆菌感染的商品疫苗。测验动物处在兽医的监视下，该兽医每天临床监测这些测验动物。
测试疫苗——测试疫苗是多价的、经修饰的活的传染性牛鼻气管炎(IBR)-副流感病毒3(PI3)-呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其为干燥形式，用失活的液体BVDV疫苗再水合(CattleMaster/PregaSure5，Pfizer Inc，New York，NY)。将BVDV成分与无菌的佐剂混合。计算用于疫苗制剂的整体流体的8个重复滴定的几何平均效价，确定BVDV免疫抗原的效能。再水化后，用肌肉内的(IM)或皮下(SC)注射施用2毫升剂量的IBR-PI3-BRSV-BVDV疫苗。使用灭菌水重构的干燥IBR-PI3-RSV疫苗作为安慰剂。
攻击病毒——使用非致细胞病变的1型BVDV野外分离株(株系816317，得自Dr.E.J.Dubovi，New York State College of VeterinaryMedicine，Cornell University)作为攻击剂。病毒特性是用SN分析以及反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)证实。1型BVDV的gp53及p80蛋白质和5端非翻译区域的核苷酸序列的RT-PCR分析呈阳性，而2型BVDV的p125序列呈阴性。在攻击前后立刻进行2个重复滴定，从而确定攻击病毒效能的GMT为104.3TCID50/毫升。鼻内给予4毫升分剂量的攻击接种物(2毫升/鼻孔)。
血清测定——1型以及2型BVDV血清中和反应效价是在牛细胞培养中用固定病毒、降低血清分析法进行测定。将系列稀释的血清与50-300 TCID50的致细胞病变1型BVDV株系5960，或相似量的致细胞病变的2型BVDV株系125c混合。
病毒分离——从母牛外周血液、羊水、及胎儿组织进行牛细胞培养中的攻击后BVDV分离。使用山羊抗-BVDV多克隆抗体以间接免疫萤光法测定BVDV阳性的细胞培养物。使用前述免疫组织化学方法也尝试了从胎儿组织中分离BVDV。Haines DM，Dlark EG，和Dubovi EJ.VetPathol 1992；29：27-32。从母牛颈静脉放出5-10毫升全血样品并置于内含肝素的试管以制备进行病毒分离的棕黄层细胞。在局部麻醉下以左侧剖腹手术收集羊水以及从子宫抽吸3-5毫升样本。剖腹生产或自然流产后，在无菌状况下从每个胎儿收集眼、3个脑切片、脾、以及胸腺。均质化胎儿组织的上清液被尝试用于细胞培养中的病毒分离。为了进行免疫组织化学评估，将胎儿组织包埋在石蜡中以及使用内含抗-BVDV单克隆抗体的1∶800以及1∶600腹水稀释液进行双重复测试。
生物统计数据分析——接种组(T2以及T3)相对于安慰剂对照组(T1)中，母亲及胎儿感染发生率在统计上显著减少，显示攻击后的保护作用。使用Fisher′s精确测验比较母牛病毒血症的发生率以及从羊水、胎儿组织分离BVDV，以及胎儿组织的免疫组织化学。使用混合的线性模型和重复计量分析血清中和反应效价。使用变方分析的最小均方根，计算几何平均效价(GMT)，其中排除未受攻击母牛的SN数据。
胎儿保护研究——59只测验动物随机分配到三个测验组之一，即IM安慰剂组(T1)、IM疫苗接种组(T2)、及SC疫苗接种组(T3)，如表6所示。母牛在研究的第0天以及21天接种疫苗或安慰剂。所有的案例中，第0天的防疫注射是施用在颈部左边，以及第21天的防疫注射是施用的颈部右边。
第32天，对所有的母牛进行IM前列腺素注射(Lutalyse，Pharmacia & Upjohn，Kalamazoo，MI)以使动情期同步化。对显示动情期的母牛用BVDV-阴性精液进行人工授精。在第96天，大约是受孕60天，以直肠触诊法测定母牛怀孕的情况。第103天，将随机选自每个测验组的证实怀孕的10只母牛，重新安置于附近的隔离设施(Midwest Veterinary Services，Oakland，NE)。第117天，将这30只母牛从鼻腔内注射致病的BVDV。在攻击当天以及在8个攻击后间隔收集血液样本，即在第119、121、123、125、127、131、138、及145天收集血液样品以进行BVDV分离。
于第145天(攻击后28天)，进行左侧剖腹术，并从每只母牛抽取羊水。于第295天，大约预期分娩前7-14天，待测母牛被运送至University of Nebraska，Department of Veterinary and BiomedicalServices进行剖腹生产。外科手术前，从每只母牛收集血液样本进行SN分析。剖腹生产后(第298-300天)，从每只胎儿收集血液样本。将胎儿安乐死并无菌收集组织以进行BVDV分离。
若发生自然流产，则在流产时以及在二周后从母牛采取血液样本。配对的血液样本以及流产胎儿进行血液样本的血清测试(Universityof Nebraska Veterinary Diagnositic Center，Lincoln，NE)，从胎儿组织分离病毒，(Pfizer Central Research，Lincoln，NE)以及评估胎儿组织的组织病理学。(Saskatoon VeterinaryBiodiagnostics，Saskatoon，SK，Canada)。
                         结果
用于胎儿保护测验的30只母牛的个别SN值在第0天时是1型以及2型BVDV阴性，证实这些测验动物在研究开始时对BVDV攻击是免疫学上幼稚的。GMT值(表7以及8)表明施用两个剂量后IM(T2组)以及SC(T3组)疫苗接种均引起血清反应。所有T2以及T3组的母牛在施用第二个疫苗剂量后血清转换(SN效价≥1∶8)至1型BVDV以及2型BVDV。繁殖时(第34-37天)，1型BVDV的SN效价范围为1∶27至1∶2,900，2型BVDV的效价范围为1∶609至1∶13,777。疫苗接种后，于各攻击前间隔，SC组的GMT值相对于IM组呈小幅上扬，但是差异不具统计学显著性。攻击后二十八天(第145天)，SC接种组(T3组)相对于IM(T2)组，1型BVDV的GMT值(表7)显示统计显著的差异。
至攻击时(第117天)，所有安慰剂组母牛(T1)均保持1型以及2型BVDV血清阴性，显示本研究没有因为偶发的暴露而受到损害。安慰剂组母牛可对攻击产生血清反应，但是第145天它们对1型以及2型BVDV的GMT反应显著低于任一疫苗组的免疫记忆反应(表7以及8)。
在羊膜腔穿刺术(第145天)以及剖腹生产(第298-300天)之间，有2只母牛流产，1只是T1组以及另一只是T3组。此外，4只繁殖的母牛(T1安慰剂组2只母牛以及T2及T3组各1只母牛)在剖腹生产时发现并未怀孕。此4只母牛是在第96天(大约繁殖后第60天)经直肠触诊证实怀孕，显示发生了未侦测到的流产或胎儿再吸收。因为无法拿到这4只怀孕失败母牛的胎儿组织进行评估，所以从研究中移除这些动物。因此，在研究最后，30只遭受攻击的母牛中有24只母牛进行剖腹生产，以及总共26只剖腹生产或流产的胎儿进行BVDV分离的评估(表6)。
T1组的1317号母牛的胎儿在第238天流产(怀孕第201天，以及攻击后第121天)。胎儿组织病理学以及细菌学评估揭露具有肺炎、绒毛膜上皮的坏死、以及从胃以及胎盘分离出棒杆菌属物种。来自所述母牛的配对血清样品不支持IBR、BVD、或钩端螺旋体病是流产的病原学。在攻击后6、8、及10天收集的母牛外周血；羊水；以及胎儿脑、眼、及胸腺，但不是脾中，其细胞培养物中BVDV分离呈阳性。胎儿脑、眼、胸腺、以及脾的BVDV免疫组织化学呈阳性。在此案例中的病毒分离以及血清证据显示攻击后经历病毒血症的母牛流产了感染BVDV的胎儿。
T3疫苗组的1331号母牛的胎儿在第249天流产(怀孕第212天，以及攻击后第132天)。胎儿的组织病理学以及细菌学评估揭露具有扩散性化脓的肺炎。由胃内含物以及肺脏培养显示有大肠杆菌类细菌大量生长。这些母牛的配对血清样品不支持IBR、BVD、或钩端螺旋体病是流产的病原学。攻击后9个间隔收集的母牛外周血、羊水、以及胎儿脑、眼、脾以及胸腺于细胞培养后BVDV分离呈阴性。胎儿组织的免疫组织化学结果呈阴性。然而，集中的胎儿组织细胞培养中BVDV分离呈阳性。这种矛盾结果暗示胎儿组织可能因与含有BVD攻击病毒的牧场的接触而污染或在之前分离BVDV的尸体剖检设备受到媒介物的污染。母牛中攻击后病毒血症的缺乏、其阳性血清转变状况、及特定胎儿器官的阴性BVDV分离结果支持胎儿不是因为攻击而感染BVDV的结论。测定各剖腹胎儿收集的血液样本中1型以及2型BVDV的SN效价。源自T1安慰剂组母牛剖腹生产的7只胎儿中，没有一只呈1型或2型BVDV血清阳性。17只源自T2以及T3接种组母牛剖腹生产的胎儿中有五只呈1型BVDV血清阳性。四只胎儿的1型SN效价是1∶2或1∶4，T2母牛1421号的胎儿的1型SN效价是1∶181，2型SN效价是1∶512。
攻击后病毒分离的结果展示于表9。10只T1安慰剂组母牛中有九只经历BVDV病毒血症，显示发生了有效的攻击。20只T2以及T3接种动物中有19只其8个攻击后样品的每个血液样本呈BVDV病毒血症阴性。第123天(攻击后6天)，T2接种组1421号呈BVDV阳性，以及产下的胎儿呈如上所述的血清阳性，但是病毒-分离呈阴性。T2以及T3接种组中5％的攻击后BVDV病毒血症发生率显著少于对照的90％发生率(P≤0.0001)。
18只接种动物中有2只(即T2母牛1301号及1335号)的胎儿组织(11.1％)呈BVDV分离阳性。相对于8只T1安慰剂组母牛胎儿中有8只(100％)分离出BVDV，这具有统计上显著的差异(P≤0.0001)。所有评估的胎儿组织的BVDV分离结果呈BVDV-阳性或-阴性，只有T1母牛1317号例外，其4个胎儿组织样品中有3个呈阳性。
20只接种动物中有2只(10％)的羊水是BVDV阳性，相对于10只安慰剂组母牛中有10只(100％)具有阳性结果，这具有显著的统计差异(P≤0.0001)。T2接种动物中编号1301以及1335的羊水样品是阳性。
18只接种动物中有2只(即T2母牛1301号及1335号)的胎儿组织(11.1％)呈BVDV免疫组织化学阳性。这些接种的母牛的所有胎儿组织评估均呈阳性。此结果与此二只相同的母牛从羊水以及胎儿组织使用细胞培养方法分离BVDV的结果相呼应。8只T1安慰剂组母牛中有8只(100％)的胎儿组织呈BVDV阳性，显著高于接种组的发生率(P≤0.0001)。
具有阳性BVDV分离结果的这三只接种母牛的攻击前血清状况展示于表10。产下BVDV-阳性胎儿的母牛1301号以及1335号，以及有病毒血症的母牛1421号，均对疫苗接种有免疫反应。
接种母牛的18只胎儿中有十六只(88.9％)对能在未免疫接种对照中产生100％胎儿的攻击具有抗性。鼻腔内的攻击不仅摹仿天然的感染路径，且剂量比预期的野外暴露大很多。攻击效能也超过先前研究发现可一致性地达成实验性1型BVDV病毒血症以及胎儿感染的程度。参见Ficken M，Jeevaraerathnam S，Wan Welch SK，等人：BVDV fetalinfections with selected isolates.In：Proceedings of theInternational Symposium on Bovine Viral Diarrhea Virus，aFifty-Year Review.Ithaca，NY，1996；110-112。采用非致细胞病变的攻击株系，因为这个生物型与持续性的感染以及免疫耐受的胎儿感染相关。参见Cortese VS：Bovine virus diarrhea virus and mucosaldisease.In：Current Veterinary Therapy 4，Food AnimalPractice.Philadelphia，PA：WB Saunders，1999；286-291。
血清数据确认IM以及SC路径施用下疫苗的抗原性。所有接种的母牛血清转换至此二种BVDV类型，攻击后明显发生记忆反应(表7以及8)，其GMT效价持续到研究结束(6个月以后)。与阳性病毒分离相关的三只接种母牛在疫苗接种后也发生血清转换(表10)。源自血清阳性母牛1301以及1335号的剖腹生产的小牛是BVDV阳性。血清阳性的母牛或其胎儿中的病毒分离结果暗示体液抗体与保护有关联，但不是其唯一的决定因子。细胞的或粘膜的机制亦可能参与其中。
表6  在1型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)胎儿攻击研究下测验组及母牛的最终怀孕状况
组别 处理 接种母牛的数目(第0、21天) 母牛攻击的数目(第119天)                                 终止怀孕
(1)母牛死亡a (2)流产b (3)怀孕失败c (4)剖腹生产   BVDV分离所评估的胎儿数目(1+2+4)
T1T2T3     安慰剂组(IM)疫苗组(IM)疫苗组(SC) 181820 788 100 043 102 543 686
IM＝肌肉内的疫苗接种；SC＝皮下疫苗接种
a流产发生在第238天(T1母牛)以及第249天(T3母牛)。
b所有怀孕失败的母牛均证实在第96天，大约繁殖后60天是怀孕的。
表7  1型BVDV攻击的母牛对1型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清反应
处理组T1(n＝10)T2(n＝10)T3(n＝10)T2&T3(n＝20) 繁殖当天血清阳性的母牛数目a0/1010/1010/1020/20                        在选择的测验间隔1型BVDV血清中和(SN)几何平均效价的倒数
    疫苗接种(第0天)＜2＜2＜2＜2     疫苗接种(第21天)＜25.5b7.3b6.3b    繁殖(第34-37天)＜2414.1b630.2b510.8b     攻击(第117天)＜2177.4b281.2b223.3b     羊膜腔穿刺术(第145天)118.010,380.1b20,169.2b，c14,469.2b   剖腹生产(第298-300天)808.2(n＝9)d2,233.2b(n＝10)3,804.6b(n＝9)e2,914.9b(n＝19)
aSN效价倒数≥8。
b统计显著的差异vs.安慰剂组(T1)，P≤0.0003。
c统计显著的差异vs.IM疫苗组(T2)，P＝0.0446。
d一只母牛在第238天流产。
e一只母牛在第249天流产。
表8  1型BVDV攻击的母牛对2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清反应
                          在选择的测验间隔2型BVDV血清中和(SN)几何平均效价的倒数
处理组     繁殖当天血清阳性的母牛数目a     疫苗接种(第0天)     疫苗接种(第21天)   繁殖(第34-37天)     攻击(第117天)     羊膜腔穿刺术(第145天)    剖腹生产(第298-300天)
T1(n＝10)     0/10     ＜1.4     ＜1.4   ＜1.4     ＜1.4     48.5    604.9(n＝9)d
T2(n＝10)     10/10     ＜1.4     7.6b   1,782.9b     174.8b     3,756.0b    1,634.9b(n＝10)
T3(n＝10)     10/10     ＜1.4     17.7b，c   2,749.6b     309.7b     4,240.4b    1,879.9b(n＝9)e
T2&T3(n＝20) 20/20 ＜1.4 11.6b c 2,214.1b 232.7b 3,990.9b 1,753.1b(n＝19)
aSN效价倒数≥8。
b统计显著的差异vs.安慰剂组(T1)，P≤0.02。
c统计显著的差异vs.IM疫苗组组(T2)，P＝0.0415。
d一只母牛在第238天流产。
e一只母牛在第249天流产。
表9  攻击后母牛以及胎牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分离结果的总结
处理组T1安慰剂(IM)T2疫苗(IM)T3疫苗(SC)T2&T3                                 攻击后病毒分离方法以及发生率
    病毒血症的母牛a9/10(90％)1/10(10％)d0/10(0％)d1/20(5％)d 羊水病毒分离10/10(100％)2/10(20％)d0/10(0％)d2/20(10％)d     胎儿组织病毒分离b8/8(100％)c2/9(22.2％)c，d0/9(0％)d2/18(11.1％)d    胎儿组织免疫组织化学分析b
   8/8(100％)c2/9(22.2％)c，d0/9(0％)c，d2/18(11.1％)d
a从第117天(攻击)至第145天，于9个间隔收集样品制作棕黄层细胞，并进行病毒分离。若任何血液样本是BVDV阳性，则为病毒血症的母牛。
b流产或剖腹生产后收集胎儿组织。若任何组织是阳性，则胎儿为BVDV阳性。
c2只T1母牛，1只T2母牛，以及1只T3母牛自研究中排除，因为在剖腹生产时发现其没有怀孕，且没有观察到流产。
d统计显著的差异vs.安慰剂组(T1)，P≤0.008。
表10  当从接种的母牛或其胎儿分离出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)时，攻击前母牛的血清中和反应(SN)效价
  攻击时BVDV血清型和SN效价倒数
    测验组     母牛编号     病毒分离来源     BVDV1     BVDV2
    T2     1301     FT，AF，IHC     128     181
    T2     1335     FT，AF，IHC     109     91
    T2     1421     CV     64a     27a
    T2     GMT组     N/A     177.4     174.8
FT＝胎儿组织；AF＝羊水；IHC＝胎儿组织免疫组织化学；CV＝母牛病毒血症；NA＝不适用；GMT＝几何平均效价
                          实施例3
二组共16只牛皮下接种两次2毫升的L.hardjo/波摩那钩端螺旋体组合疫苗，时间间隔为3周，所述组合疫苗制备自二种佐剂配剂：1)2.5％Amphigen，具有QuilA/胆固醇各250mcg/mL，以及2)Amphigen/Al-凝胶。疫苗由移除培养液的死钩端螺旋体组成，所以游离内毒素含量很低。两次注射后纪录体温，注射部位反应，以及总体健康状况。没有观察到全身影响，只有轻微的局部反应，在临床上是可接受的。对十六只额外的牛注射盐水作为对照组。疫苗接种后四周，连续3天在眼以及阴道滴注5×106钩端螺旋体以攻击牛只。每一处理组的一半用血清变体hardjo攻击，另一半用波摩那钩端螺旋体进行攻击。由于不相关的原因，从研究中除去两个波摩那对照组，使该组只剩下6只动物。每周一次收集尿液、以及尸体剖检时(攻击后8周)收集肾脏样品，以培养、PCR、以及萤光抗体显微镜检查(FA)评估这些样品。
L.hardjo攻击后，从100％未施行过预防接种的对照组(8/8)检测到尿和/或肾培养物中具有活生物体，任何接种的动物均无法得到阳性培养(0/16)。波摩那钩端螺旋体攻击后，67％(4/6)的未施行过预防接种的对照组在尿/肾培养时显示出感染，但是接种动物中没有一只是肾或尿培养呈阳性的(0/16)。
由于钩端螺旋体病可经由污染的尿传播，因此预防或减低尿道排出的能力疫苗功效的有用度量。相对于对照组，两个疫苗配剂均可以统计学显著的量降低钩端螺旋体从尿道的排出。此数据显示用含任一佐剂的两价L.hardjo/波摩那钩端螺旋体疫苗接种具有显著的效果；证明用福尔马林-杀死的组合菌苗接种可以保护牛免于钩端螺旋体的感染。
                         实施例4
材料以及方法
动物——36只BVDV以及钩端螺旋体血清阴性(即其具有的血清中和反应[SN]效价＜1∶2，钩端螺旋体血清变体型Hardjo以及波摩那钩端螺旋体的[MAT]效价＜1∶20)的大约7个月大的小牛得自多种来源，在研究期间在Nebra ska维持于隔离的研究设备。每只动物用两个耳标签加以确认，每耳一个标签。若动物遗失耳标签则重新装上新的标签。在研究前，将测验动物接种以对抗梭状芽胞杆菌属疾病以及牛呼吸性疾病因子(除了BVD病毒)。测验动物维持在兽医监视下，该兽医每天临床监测所述测验动物。
测试疫苗——实验的测试疫苗是液体疫苗，内含福尔马林失活的L.hardjo-bovis或波摩那钩端螺旋体，或两者，以及失活的1型以及2型BVD病毒。将BVDV成分与无菌的佐剂混合。计算用于疫苗制剂的大流体的8个重复滴定的几何平均效价(GMT)，从而确定BVDV免疫抗原的效能。依据仓鼠致死性模型方案，确定钩端螺旋体免疫抗原的效能。实验测试疫苗的佐剂包含：2.5％Amphigen(v/v)和各为100mcg/mL的Quil A/胆固醇/，含或不含2％(v/v)氢氧化铝；或2.5％Amphigen(v/v)和各为100mcg/mL的Quil A/二甲基二-十八碳烷基溴化铵(DDA)，含或不含2％(v/v)氢氧化铝。实验的测试疫苗通过皮下(SC)注射施用5毫升剂量。根据制造者的说明，使用一价的L.hardjo-bovis菌苗作为阳性对照。使用内含生理盐水的安慰剂组疫苗作为负对照组。
攻击细菌——使用Leptospira borgpetersenii serovar hardjo型hardjo-bovis菌株203(National Animal DiseaseCenter，Ames，Iowa)作为攻击剂。L.hardjo-bovis攻击材料被制备成第一次传代生物，其分离自感染L.hardjo-bovis的实验牛的尿液。攻击材料每日施用一次，连续三天。在各攻击日，将内含大约2.5×106L.hardjo-bovis生物体/毫升的总计二毫升的攻击材料施用至三个分开的解剖位点。攻击路线是滴注到各眼的结膜囊(各1/2毫升)以及阴道(1毫升)。
血清测定——1型以及2型BVDV血清中和反应效价是用固定病毒、降低血清分析在牛细胞培养中测定。将系列稀释的血清与50-300TCID50的致细胞病变1型BVDV菌株5960，或相似量的致细胞病变的2型BVDV菌株125c混合。使用标准测验在合格的兽医临床检验中心(Cornell University College of Veterinary Medicine DiagnosticLaboratory)测试L.hardjo-bovis以及波摩那钩端螺旋体血清显微凝集反应效价(MAT)。
钩端螺旋体属的分离——检查尿液品以及肾组织均质物(集中左边和右边的肾脏)中是否有钩端螺旋体属的存在。使用标准程序每周检查尿以及肾培养中的钩端螺旋体一次，进行8周。使用标准测验在合格的兽医临床检验中心(Cornell University College ofVeterinary Medicine Diagnostic Laboratory)进行钩端螺旋体萤光抗体(FA)技术。
生物统计数据分析——接种组(表11)(T02、T03、T04以及T05)相对于安慰剂对照组(T1)，钩端螺旋体属感染发生率在统计上显著减少，显示攻击后的保护作用。通过处理和时间点总结了肾菌群化和尿排出的数据。比较各个处理之间肾脏中检测到钩端螺旋体的动物百分比。比较各个处理之间尿液中检测到钩端螺旋体的动物百分比。使用Fisher’s精确测试作上述分析。使用普通的线性混合模型比较钩端螺旋体从尿液排出的时间。使用概率值P≤0.05测定统计显著性。
钩端螺旋体保护研究——将36只测试动物随机分配入六个测验组之一，如表11所示。第0及第21天，T01-T05的每只动物得到5毫升SC剂量的适当的实验测试疫苗或安慰剂疫苗。第0天及第28天，每只T06的动物得到2毫升SC剂量的正对照疫苗。第57-59天，所有的动物均用以上的L.hardjo-bovis菌株203攻击。
第0、21、35、56、84、及111天，收集每只动物的血液样本以测定1型以及2型BVDV效价。
第1、56、70、77、84、91、98以及105天，收集每只动物的尿液样本(大约45毫升)以进行如上所述的钩端螺旋体分离。
第112以及113天将动物安乐死，并评估肾脏是否有上述钩端螺旋体属的存在。
                          结果
GMT值(表12)显示接受BVDV-钩端螺旋体组合疫苗(T02、T03、T04以及T05)的所有动物在施用二个疫苗剂量后均有血清反应。T02、T03、T04以及T05组的所有动物在施用第二个疫苗剂量后血清转换为1型BVDV(SN效价≥1∶8)。T02、T04以及T05组所有的动物在施用第二个疫苗剂量后血清转换为2型BVDV(SN效价≥1∶8)。安慰剂组(T01)或得到一价L.hardjo-bovis疫苗的实验组中所有的母牛均保持1型以及2型BVDV血清阴性，显示此研究不曾因偶发的暴露而受到损害。总体来说，BVDV血清学数据第一次显示：配制于四种不同佐剂中的包含失活的1型和2型BVDV以及失活的L.hardjobovis和波摩那钩端螺旋体的组合疫苗能诱发保护反应以对抗牛BVDV疾病，这是因为本领域已知母牛的BVDV SN效价≥1∶8表明表示产生了对抗BVDV疾病的保护作用。
尿以及肾的钩端螺旋体结果(表13)表明接受BVDV-钩端螺旋体组合疫苗的所有动物(T02、T03、T04以及T05)在所有的八个测试时间点都是尿液培养(CX)阴性(表13，第2栏)以及在尸体剖检时(第112或113天)是肾培养阴性(表13、第8栏)。得到钩端螺旋体一价疫苗(T06，正对照组)的母牛同样是得到了保护以对抗钩端螺旋体感染。相反的，得到安慰剂疫苗(T01，负对照组)的母牛基于尿液(表13，第2栏)以及肾培养(表13，第8栏)显示是受到感染的，表明该疫苗攻击研究是有效的。总体来说，L.hardjobovis分离数据第一次显示：配制于四种不同佐剂中的包含失活的1型和2型BVDV以及失活的L.hardjobovis和波摩那钩端螺旋体的组合疫苗能诱发对抗牛钩端螺旋体属疾病的保护反应。
表11——BVDV-钩端螺旋体组合疫苗研究中的小牛测验组
处理 疫苗   动物数目  剂量体积     施用路径    剂量数/动物  剂量间隔
T01 盐水安慰剂   6  5毫升     SC    2  3周
T02 L.hardjobovis-波摩那钩端螺旋体-BVDV-1-BVDV-2，溶于QAC 6 5毫升 SC 2 3周
T03 L.hardjobovis-波摩那钩端螺旋体-BVDV-1-BVDV-2，溶于QAC/AIOH 6 5毫升 SC 2 3周
T04 L.hardjobovis-波摩那钩端螺旋体-BVDV-1-BVDV-2，溶于DDA 6 5毫升 SC 2 3周
T05 L.hardjobovis-波摩那钩端螺旋体-BVDV-1-BVDV-2，溶于DDA/AIOH 6 5毫升 SC 2 3周
T06 单价L.hardjobovis   6  2毫升     SC    2  4周
表12——第35天1型和2型BVDV血清中和反应倒数几何平均效
                      价以及范围(#-#)
处理         第35天血清病毒中和反应倒数几何平均效价以及范围(#-#)
    1型BVD病毒     2型BVD病毒
    T01     ＜2(＜2-＜2)     ＜2(＜2-＜2)
    T02     1084.9(609-2435)     20.8(16-54)
    T03     148.0(＜2-1218)     5.8(＜2-19)
    T04     1877.9(1024-2896)     34.0(19-91)
    T05     1084.6(152-3444)     36.1(10-91)
    T06     ＜2(＜2-＜2)     ＜2(＜2-＜2)
表13——BVDV-钩端螺旋体组合疫苗对抗Leptospira
        hardjo-bovis攻击的功效结果
         尿液曾经是钩端螺旋体阳性的小牛的百分比         钩端螺旋体阳性尿液天数的最小均方根百分比           肾脏曾经是钩端螺旋阳性的小牛的百分比
处理     CX     FA     PCR     CX    FA     PCR     CX     FA     PCR
T01n＝6     100a     83.3a     83.3a     50.9a    29.1a     37.1a     83.3a     0a     16.7a
T02n＝6     0b     0b     0b     0b    0b     0b     0b     0a     0a
T03n＝6     0b     0b     0b     0b    0b     0b     0b     50.0a     0a
T04n＝6     0b     0b     0b     0b    0b     0b     0b     0a     0a
T05n＝6     0b     16.7ab     16.7ab     0b    0.3b     0.4b     0b     16.7a     0a
T06n＝6     0b     0b     33.3ab     0b    0b     1.6b     0b     0a     0a
在栏内没有共同上标的数值是有显著差异的(P＜0.05)。

Claims (13)

1.一种免疫原性组合物，其包含：
经修饰的活的牛疱疹病毒(BHV-1)；
经修饰的活的3型副流感病毒(PI3)；
经修饰的活的牛呼吸道合胞病毒(BRSV)；
佐剂；
至少一种抗原；和
兽医学上可接受的载体。
2.如权利要求1的免疫原性组合物，其中该抗原是失活的。
3.如权利要求1的免疫原性组合物，其中该佐剂包含：皂苷；包含皂苷的水包油乳剂；和/或Quil A、Amphigen以及胆固醇。
4.如权利要求1的免疫原性组合物，其中该抗原包含至少一种选自下列的抗原：牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV-2)、犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospiraborgpetersenii hardio-prajitno、黄疽出血型钩端螺旋体、Leptospira interrogans pomona、Leptospira borgpeterseniihardjo-bovis以及胎儿弯曲杆菌。
5.如权利要求4的免疫原性组合物，其中该牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)是致细胞病变的或非致细胞病变的；而该牛病毒性腹泻病毒(BVDV-2)是致细胞病变的或非致细胞病变的。
6.在动物对象中诱导针对至少下列之一的免疫反应的方法：
(a)1型牛疱疹病毒；
(b)1型牛病毒性腹泻病毒；
(c)2型牛病毒性腹泻病毒；
(d)3型副流感病毒(PI3)；
(e)牛呼吸道合胞病毒(BRSV)；
(f)胎儿弯曲杆菌；或
(g)抗原，其选自：犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno、黄疽出血型钩端螺旋体、Leptospira interrogans pomona、Leptospira borgpeterseniihardjo-bovis、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬新孢子虫、胎儿滴虫、牛枝原体、睡眠嗜血菌、溶血性曼氏杆菌及多杀巴斯德氏菌，
所述方法包括施用免疫有效量的权利要求1的组合物和兽医学上可接受的载体。
7.一种疫苗组合物，其包含：
经修饰的活的牛疱疹病毒(BHV-1)；
经修饰的活的3型副流感病毒(PI3)；
经修饰的活的牛呼吸道合胞病毒(BRSV)；
佐剂；
至少一种抗原；和
兽医学上可接受的载体。
8.用于在动物中预防选自动物BHV-1病毒所导致的流产的方法，包括给所述动物施用治疗有效量的权利要求7的疫苗组合物。
9.如权利要求8的方法，其中该动物为母牛、小牛、小母牛、菜牛或公牛。
10.在动物中治疗或预防由选自1型或2型BVDV、BHV-1、PI3或BRSV的病毒感染所导致的疾病或病症的方法，包括给所述动物施用治疗有效量的权利要求7的疫苗组合物。
11.在动物中治疗或预防由选自下列的抗原感染所导致的疾病或病症的方法：犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospiraborgpetersenii hardio-prajitno、黄疽出血型钩端螺旋体、Leptospira interrogans pomona、Leptospira borgpeterseniihardjo-bovis、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、胎儿弯曲杆菌、犬新孢子虫、胎儿滴虫、牛枝原体、睡眠嗜血菌、溶血性曼氏杆菌以及多杀巴斯德氏菌，所述方法包括给所述动物施用治疗有效量的权利要求7的疫苗组合物。
12.在动物对象中预防持续性胎儿感染的方法，包括给所述动物施用治疗有效量的权利要求7的疫苗组合物。
13.一种疫苗组合物，其包含：
经修饰的活的牛疱疹病毒(BHV-1)；
经修饰的活的3型副流感病毒(PI3)；
经修饰的活的牛呼吸道合胞病毒(BRSV)；
致细胞病变的BVD-2。
BVD-1；
佐剂；
至少一种抗原，选自：犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、Leptospira borgpeltersenii hardio-prajitno、黄疽出血型钩端螺旋体、以及Leptospira interrogans pomona、Leptospiraborgpetersenii hardjo-bovis、布拉迪斯拉发钩端螺旋体以及胎儿弯曲杆菌；和
兽医学上可接受的载体。
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