CN110736654A - 一种腮腺炎病毒大鼠神经毒力评价模型 - Google Patents

一种腮腺炎病毒大鼠神经毒力评价模型 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种腮腺炎病毒大鼠神经毒力评价模型。具体地，本发明提供了一种用于评估腮腺炎病毒神经毒力的装置，包括：(I)病毒接种模块，用于向一大鼠的侧脑室进行待评估腮腺炎病毒的病毒接种；(II)处理模块，对固定的鼠脑进行振动切片；(III)成像模块，用于对获得的鼠脑切片进行扫描成像；(IV)分析模块，用于在所得成像中，鼠脑纵切面中因脑积水形成空洞的横截面积S1和鼠脑总横截面积S0，通过公式I计算神经毒力指数：神经毒力指数＝S1/S0×100 (公式I)。多次结果表明，本方法结果稳定、重复性好，能够区分野毒株及疫苗株，且相对于目前猴体神经毒力模型大幅降低动物成本及操作难度。

Description

一种腮腺炎病毒大鼠神经毒力评价模型
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，更具体地，涉及一种腮腺炎病毒大鼠神经毒力评价模型。
背景技术
腮腺炎病毒是一种RNA病毒，属副粘病毒科，能够通过飞沫传播并侵入儿童腮腺及其它腺体器官如睾丸、卵巢、胰腺、肾脏和中枢神经系统。患者临床表现为一侧或双侧腮腺肿大，伴发热、乏力、肌肉疼痛等，伴随一定几率的睾丸炎及脑炎并发症。目前市场上的腮腺炎疫苗株均由分离的野毒株经传代致弱得到的减毒株。
鉴于腮腺炎病毒存在神经毒性，对腮腺炎疫苗进行神经毒力评价是疫苗安全性的重要指标。目前，大多数国家规定使用的腮腺炎神经毒力评价方法是猴体神经毒力试验。但猴体神经毒力试验需要用到大量非人灵长类动物，操作困难且费用十分昂贵。更重要的是，近些年的研究表明，猴体神经毒力试验在检测腮腺炎毒株时，易受多种因素影响结果可能不稳定。国际上，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)、食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)及欧洲联盟(European Union，EU)等组织也对用猴子作为腮腺炎病毒体神经毒力评价模型的科学性表达了质疑，并在积极建立更加客观的动物模型。
鉴于以上问题，建立一种替代的动物模型迫在眉睫。STEVEN A.RUBIN等首次建立了大鼠神经毒力模型，具体方法为于1日Lewis大鼠乳鼠侧脑室接种腮腺炎病毒，第30天安乐死，取鼠脑做石蜡切片并进行苏木精-伊红(HE)染色，统计鼠脑纵切面中因脑积水形成空洞的横截面积占大脑(包括脑干)的平均百分比对腮腺炎神经毒力进行评价。多个实验室的多次重复试验表明，大鼠神经毒力模型能够区分减毒株和野毒株，且易于操作、成本低廉，未来有望逐步替代猴体神经毒力试验。
然而，上述的大鼠神经毒力模型中，对切片处理耗时较长、操作复杂，更重要的是HE染色多次脱水、透明、洗涤等过程改变脑切片的自然形态，导致脑横截面发生改变，以致对结果的统计分析产生人为干扰，目前的切片处理方法仍难以令人满意。
因此，本领域迫切需要开发一种结果稳定、操作方便，并且评价客观的腮腺炎病毒大鼠神经毒力评价模型。
发明内容
本发明的目的就是提供一种结果稳定、操作方便，并且评价客观的腮腺炎病毒大鼠神经毒力评价模型。
在本发明中，提供了一种用于评估腮腺炎病毒神经毒力的装置，包括：
(I)病毒接种模块，用于向一大鼠的侧脑室进行待评估腮腺炎病毒的病毒接种，在所述病毒接种后的第20至30天(较佳地第22-28天，更佳地第25天)的大鼠为样本i；
(II)处理模块，用于从所述样本i中取鼠脑并固定，对固定的鼠脑进行振动切片；
(III)成像模块，用于对所述生物组织切片模块中获得的鼠脑切片进行扫描成像；
(IV)分析模块，用于统计在所述成像模块所获得的成像中，鼠脑纵切面中因脑积水形成空洞的横截面积S1和不含小脑的鼠脑总横截面积S0，通过公式I计算大鼠神经毒力指数
神经毒力指数＝空洞的横截面积S1/脑总横截面积S0×100(公式I)
在另一优选例中，所述大鼠选自下组：Wistar大鼠或Lewis大鼠。
在另一优选例中，所述大鼠的日龄为1至3日龄，较佳地为1至2日龄，更佳地为1日龄。
在另一优选例中，所述病毒接种模块包括一注射器，所述注射器为20μL、规格为27G的微量注射器。
在另一优选例中，所述病毒接种模块中，所述的病毒接种的位置为大鼠脑部前卤点与人字点中间，矢状缝左侧1.5至2.5mm(优选1.9至2.1mm，更优选2mm)，深度1.5至2.5mm(优选1.9至2.1mm，更优选2mm)。
在另一优选例中，所述病毒接种模块中，所述的病毒接种中所注射病毒体积为5至20μL，较佳地为8至15μL，更佳地为10μL。
在另一优选例中，所述病毒接种模块中，所述的病毒接种量为102至104CCID50，较佳地为102至103CCID50，更佳地为102CCID50。
在另一优选例中，在所述处理模块中，包括以下元件：
(a)麻醉元件，用于通过向样本i注射麻醉剂来麻醉样本i，以获得样本ii；
(b)任选的心脏灌注元件，用于对样本ii进行心脏灌注，以获得样本iii；
(c)固定元件，用于将样本iii的鼠脑进行固定；
(d)包埋和切片元件。
在另一优选例中，所述麻醉元件中包括麻醉剂和麻醉剂注射器。
在另一优选例中，所述的麻醉剂选自下组：水合氯醛、戊巴比妥钠、乌拉坦，或其组合。
在另一优选例中，所述的麻醉剂为水合氯醛，所述水合氯醛的浓度为5％至15％，较佳地为10％。
在另一优选例中，所述麻醉剂的注射方式为腹腔注射或肌肉注射。
在另一优选例中，所述麻醉剂的注射量为0.2至3mL，较佳地0.5至1.5mL，更佳地1mL。
在另一优选例中，所述固定元件中包括固定液，所述固定液选自下组：多聚甲醛、丙酮、乙醇，或其组合。
在另一优选例中，所述固定液为多聚甲醛，所述多聚甲醛的浓度为3％至5％，较佳地为4％。
在另一优选例中，所述固定的时间为12至72小时，较佳地为20至28小时，更佳地为24小时。
在另一优选例中，所述包埋和切片元件中包括包埋材料。
在另一优选例中，所述包埋材料选自下组：琼脂糖、石蜡、明胶，或其组合。
在另一优选例中，所述包埋和切片元件中，可进行振动切片的操作。
在另一优选例中，所述分析模块中，统计的鼠脑纵切面包括位于大鼠左脑矢状缝左侧1至3mm的区域，较佳地1.5至2.5mm的区域。
在另一优选例中，所述分析模块中，包括照片分析软件。
在另一优选例中，所述照片分析软件选自下组：Image-pro plus或Image J。
本发明的目的是建立用于评价腮腺炎神经毒力的大鼠模型，替代目前的猴体神经毒力试验，腮腺炎疫苗安全性评价提供操作简单、成本低廉、结果稳定的方法。
为实现此目的，本发明建立的大鼠神经毒力模型方法包括如下：
(1)大鼠乳鼠侧脑室接种体积为10μL，病毒量为100CCID50腮腺炎病毒。
(2)第25天麻醉大鼠并进行心脏灌注，取鼠脑置于4％多聚甲醛固定24小时。
(3)固定后的鼠脑用琼脂糖包埋后进行振动切片，对鼠脑切片进行扫描成像。
(4)统计鼠脑纵切面中因脑积水形成空洞的横截面积占大脑总横截面积的平均百分比并指定为大鼠神经毒力指数。
在一种优选的实施方案中，本发明提供用于腮腺炎病毒神经毒力评价的大鼠模型的建立方法，其中所述的大鼠为Wistar大鼠。
在一种优选的实施方案中，本发明提供用于腮腺炎病毒神经毒力评价的大鼠模型的建立方法，其中步骤(1)中，所述乳鼠日龄为1日龄。
在一种优选的实施方案中，本发明提供用于腮腺炎病毒神经毒力评价的大鼠模型的建立方法，其中步骤(1)中侧脑室注射的具体位置为乳鼠左脑前卤点与人字点中间，矢状缝左侧2mm，深度2mm。
在一种优选的实施方案中，本发明提供用于腮腺炎病毒神经毒力评价的大鼠模型的建立方法，其中步骤(1)中所注射病毒体积为10μL，病毒量为100CCID50，所用注射器为20μL微量注射器，规格为27G。
在一种优选的实施方案中，本发明提供用于腮腺炎病毒神经毒力评价的大鼠模型的建立方法，其中步骤(2)中所用麻醉剂为10％水合氯醛，麻醉剂注射方式为腹腔注射，体积为1mL。
在一种优选的实施方案中，本发明提供用于腮腺炎病毒神经毒力评价的大鼠模型的建立方法，其中步骤(3)中所用切片方法为振动切片，参数为刀片前进速度1.50mm/s，振幅0.75mm，鼠脑切片厚度80μm。
在一种优选的实施方案中，本发明提供用于腮腺炎病毒神经毒力评价的大鼠模型的建立方法，其中步骤(3)用于扫描分析的鼠脑切片，应位于左脑矢状缝左侧2mm的区域。
在一种优选的实施方案中，本发明提供用于腮腺炎病毒神经毒力评价的大鼠模型的建立方法，其中步骤(4)中脑切片照片分析软件为image pro plus，统计方式为脑切片脑室区域空洞面积/脑切片横截面总面积。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为实施例1中病毒接种位置示意图。
图2为实施例1中鼠脑空洞示意图。
图3为实施例1中鼠脑切片示意图。
图4为实施例1中统计方式示意图。
图5为实施例1中统计结果示意图。
图6为对比例中两种切片方式效果示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种结果稳定、操作方便，并且评价客观的腮腺炎病毒大鼠神经毒力评价模型。实验结果表明，在构建评价腮腺炎病毒神经毒力的大鼠模型中，使用振动切片的处理步骤来代替传统方法中的石蜡切片-HE染色的步骤，并在切片后直接分析，能够舍去HE染色的步骤，缩短了2到3天的处理时间，并显著降低了操作难度。此外，在本发明的模型中，用Wistar大鼠来代替Lewis大鼠，亦解决了Lewis大鼠种群稀少不以获取的难题。在此基础上完成了本发明。
本发明的主要优点包括：
1)重复性强。多次结果表明本神经毒力模型能够区分野毒株、部分减毒株及减毒株。
2)客观准确。排除了切片处理过程中人为操作对结果产生影响，客观反映脑切片空洞情况。
3)操作方便。对鼠脑切片后可直接统计分析，不需做其他处理。
4)成本低廉。用大鼠替代猴子，大幅降低动物成本及饲养成本。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：用于腮腺炎病毒神经毒力评价的大鼠模型的建立
1.1动物及病毒稀释
选取SPF级Wistar孕鼠4只，随机分成4组即A、B、C、D(每组乳鼠数量不低于10只)。其中A组为对照组接种DMEM培养基，B组接种疫苗株，C组接种经Vero细胞传代10次的腮腺炎野毒株，D组接种腮腺炎野毒株。B、C、D 3组用DMEM培养基稀释病毒滴度为4.0lg CCID50/mL。
1.2病毒接种
母鼠生产后，固定1日龄乳鼠，用灭菌后的20μL微量注射器(规格27G)吸取10μL病毒液，注射位置为乳鼠脑部前卤点与人字点中间，矢状缝左侧2mm，深度2mm。每种病毒各接种10只，空白对照以相同操作注射10μL DMEM培养基。
1.3大鼠麻醉及心脏灌注
病毒接种后第25天，吸取1mL 10％水合氯醛溶液对大鼠腹腔注射。2分钟后待大鼠麻醉将其仰卧固定，心脏灌注30mL PBS及30mL 4％多聚甲醛。
1.4取脑及固定
小心去除颅骨，将鼠脑取出，鼠脑尽可能完整，包含脑干。鼠脑浸置于4％多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱固定24小时。
1.5鼠脑包埋及切片
称取一定量琼脂糖并加热溶解于PBS，用于配制5％的琼脂糖凝胶。待琼脂糖溶液稍微冷却未凝固时，将其倒入6孔板，并将鼠脑水平放入。琼脂糖溶液凝固期间注意调整、维持鼠脑水平姿态。
2小时后将已被琼脂糖凝胶包埋好的鼠脑从6孔板中取出，用刀片沿鼠脑矢状缝垂直向下将鼠脑切为两半，将含左半脑的部分切成包含有完整左脑的长方体胶块，用胶水固定在切片机载物台上。待胶水凝固后，向载物槽中倒入PBS。直至漫过琼脂糖凝胶。
设置切片起始位置及其他参数，开始切片(刀片的前进速度设置为1.50mm/s，振幅设置为0.75mm，切片厚度设置为80μm)。选取距离鼠脑矢状缝2mL位置的完整切片，用毛笔将脑片从PBS中捞取出，并贴附于载玻片上。维持切片自然形态，将载玻片置于扫描仪内扫描拍照。
1.6统计分析
用软件image pro plus对各组切片照片进行分析，统计各组神经毒力指数。
A、B两组鼠脑固定完毕后，部分大鼠鼠脑切开后存在明显空洞，如附图2所示。振动切片后各组部分鼠脑切片情况如附图3所示，A组(DMEM组)及B组(疫苗株组)空洞不明显，C组(野毒株传代组)及D组(野毒株组)两组部分鼠脑可见明显空洞。最终神经毒力指数统计结果如附图5所示，A组的平均得分为0.15，B组平均得分为0.31，C组平均得分为1.63，D组平均得分为5.66。A、B 2组间没有显著性差异，B、C、D 3组间均有显著性差异(P<0.05)。
对比例：腮腺炎病毒神经毒力评价的大鼠模型的效果测试-脑组织处理方式对比
2.1动物及分组
SPF级Wistar孕鼠2只，分成E、F两组。E组为腮腺炎病毒野毒株组，其中一半数量的鼠鼠脑处理方式为振动切片，其余鼠脑处理方式为石蜡切片-HE染色。F组为DMEM对照组，取脑后处理方式与E组一致。
2.2病毒接种
稀释腮腺炎野毒株滴度为4.0lg CCID50/mL。固定1日龄乳鼠，用灭菌后的20μL微量注射器(规格27G)吸取10μL病毒液，对乳鼠左脑室接种，位置为乳鼠脑部前卤点与人字点中间，矢状缝左侧2mm，深度2mm。空白对照以相同操作注射10μL DMEM培养基。
2.3大鼠麻醉及心脏灌注
病毒接种后第25天，吸取1mL 10％水合氯醛溶液对大鼠腹腔注射。2分钟后待大鼠麻醉将其仰卧固定，心脏灌注30mL PBS及30mL 4％多聚甲醛。
2.4取脑及固定
小心去除颅骨，将鼠脑取出，鼠脑尽可能完整，并包含脑干。鼠脑浸置于4％多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱固定24小时。
2.5石蜡切片及苏木精-伊红(HE)染色
2.5.1脱水与透明。切取合适大小的脑组织块置于一次性塑料脱水包埋盒中，流水冲洗1小时。室温(25℃)下乙醇梯度脱水、二甲苯透明，具体为50％乙醇2小时→60％乙醇2小时→75％乙醇2小时→85％乙醇2小时→95％乙醇1小时→无水乙醇1小时→二甲苯20分钟。观察透明结果，吸净包埋盒周面液体，转入浸蜡。
2.5.2浸蜡与包埋。鼠脑组织块置于60℃石蜡液中浸渍2小时，而后向金属包埋模具内注入一定蜡液，保持切面向下放入脑组织，避免气泡产生。
2.5.3切片及烤片。将包埋好的组织块修理规整并固定，设置切片厚度8μm进行切片，用毛笔将切面完整的蜡片于42℃温水中展平，平铺到载玻片上。将蜡片置于60℃烤片2小时，依序置于切片盒内保存。
2.5.4苏木精-伊红(HE)染色。依次将切片放入二甲苯40分钟，无水乙醇10分钟，75％酒精5分钟，自来水洗。切片置入苏木素染液染3-5分钟，自来水洗。切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5分钟，入伊红染液中染色5分钟。切片依次放入无水乙醇15分钟，二甲苯10分钟透明，中性树胶封片。
2.6振动切片
2.6.1鼠脑包埋
称取一定量琼脂糖并加热溶解于PBS，用于配制5％的琼脂糖凝胶。待琼脂糖溶液稍微冷却未凝固时，将其倒入6孔板，并将鼠脑水平放入。琼脂糖溶液凝固期间注意调整、维持鼠脑姿态。
2.6.2切片
2小时后将已被琼脂糖凝胶包埋好的鼠脑从6孔板中取出，用刀片沿鼠脑矢状缝垂直向下将鼠脑切为两半，将含左半脑的部分切成包含有完整左脑的长方体胶块，用胶水固定在切片机载物台上。待胶水凝固后，向载物槽中倒入PBS。直至漫过琼脂糖凝胶。
设置切片起始位置及其他参数，开始切片。(刀片的前进速度设置为1.50mm/s，振幅设置为0.75mm，切片厚度设置为80μm。)选取距离矢状缝2mm位置的完整切片，用毛笔将脑片从PBS中捞取出，并贴附于载玻片上。
2.7图像采集分析
对切片拍照后，对比分析E、F两组中振动切片结果及石蜡切片-HE染色结果。
如附图6所示，野毒株组经振动切片处理及石蜡切片-HE染色处理，均可见脑横截面空洞存在，DMEM组不存在空洞。两种处理方式最终统计结果没有明显差异，不过石蜡切片-HE染色处理周期长且操作复杂，易导致切片发生皱缩、折叠、变形，改变切片自然形态，脑横截面发生人为改变，对分析产生干扰。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于评估腮腺炎病毒神经毒力的装置，其特征在于，包括：
(I)病毒接种模块，用于向一大鼠的侧脑室进行待评估腮腺炎病毒的病毒接种，在所述病毒接种后的第20至30天(较佳地第22至28天，更佳地第25天)的大鼠为样本i；
(II)处理模块，用于从所述样本i中取鼠脑并固定，对固定的鼠脑进行振动切片；
(III)成像模块，用于对所述生物组织切片模块中获得的鼠脑切片进行扫描成像；
(IV)分析模块，用于统计在所述成像模块所获得的成像中，鼠脑纵切面中因脑积水形成空洞的横截面积S1和不含小脑的鼠脑总横截面积S0，通过公式I计算大鼠神经毒力指数
神经毒力指数＝空洞的横截面积S1/脑总横截面积S0×100(公式I)。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述大鼠选自下组：Wistar大鼠或Lewis大鼠。
3.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述大鼠的日龄为1至3日龄，较佳地为1至2日龄，更佳地为1日龄。
4.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述病毒接种模块中，所述的病毒接种的位置为大鼠脑部前卤点与人字点中间，矢状缝左侧1.5至2.5mm(优选1.9至2.1mm，更优选2mm)，深度1.5至2.5mm(优选1.9至2.1mm，更优选2mm)。
5.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述病毒接种模块中，所述的病毒接种量为102至104CCID50，较佳地为102至103CCID50，更佳地为102CCID50。
6.如权利要求1所述的装置，其特征在于，在所述处理模块中，包括以下元件：
(a)麻醉元件，用于通过向样本i注射麻醉剂来麻醉样本i，以获得样本ii；
(b)任选的心脏灌注元件，用于对样本ii进行心脏灌注，以获得样本iii；
(c)固定元件，用于将样本iii的鼠脑进行固定；
(d)包埋和切片元件。
7.如权利要求6所述的装置，其特征在于，所述麻醉元件中包括麻醉剂和麻醉剂注射器。
8.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述麻醉剂的注射方式为腹腔注射或肌肉注射。
9.如权利要求6所述的装置，其特征在于，所述固定元件中包括固定液，所述固定液选自下组：多聚甲醛、丙酮、乙醇，或其组合。
10.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述分析模块中，统计的鼠脑纵切面包括位于大鼠左脑矢状缝左侧1至2.5mm的区域，较佳地1.8至2.2mm的区域。
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