CN106023291B - 快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的成像装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的成像装置和方法，该装置包括：样本存放装置；用于驱动所述样本存放装置在三维空间内移动的三维移动台；用于对样本进行切片，使样本得到浅层部分的振动切片模块；以及用于对样本的浅层部分进行高通量层析成像的宽场光学显微成像模块。本发明解决了现有技术中样本制备流程复杂、影响样本形态和荧光信号、成像速度慢的缺点，能够快速获取并分析样本的三维结构信息，所获取数据具有自配准特性，并对感兴趣部位的样本切片进行分子表型染色，获得样本的分子表型信息，并可配准到所获取的三维结构信息中去。

Description

快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的成像装置和 方法

技术领域

本发明涉及显微成像，具体地指一种快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的成像装置和方法。

背景技术

大脑是自然界最复杂的系统之一，支配着人类的一切活动。对大脑的探索一直是人类的研究目标，但时至今日我们仍无法准确描述智力、思维和意识的产生机制。神经结构是实现脑高级功能的重要基础。复杂的脑功能需要多个脑区的共同参与，并由局部和长程神经环路共同协同作用。脑疾病往往伴随着功能相关的特定神经环路及其输入连接与输出投射关系的结构异常。为了破译脑功能与脑疾病的结构基础，需要在全脑尺度进行细胞分辨水平地结构解析。此外，认识脑功能与脑疾病还需要解析其分子基础，明确参与环路与功能的神经元细胞类型，以便找出疾病发生、发展的分子机制。然而，神经元功能分子种类繁多，目前仅鉴定确认的类别就数以百计，这直接导致神经元分子表型纷繁复杂。以往仅按单一分子表型来进行神经元分类，不够准确。因此，找出特征分子表型以确定环路中神经元类型，需要在全脑尺度进行大量的筛选与鉴定，工作量巨大。

借助荧光标记和免疫组化技术，人们已经能够对脑区之间的神经连接进行示踪，对特定神经环路中细胞类型进行可视化。在相关研究中，通常需要先对特定神经环路进行荧光标记，再以传统组织学的方式，将完整大脑切成数百张薄片，逐片手工贴片和成像。在逐片检查了所有脑片的成像结果后，才能确定目标脑区，之后选择相应的脑片进行特定分子表型的免疫组化染色，最终鉴定出环路内神经元的细胞类型。上述传统方法均为手工操作，费时费力，效率低下，难以完成为基于分子表型进行细胞分类采集海量数据的工作。繁复的手工操作还导致一定数量的脑片存在耗损，无法获得全脑水平连续的神经投射信息。由于无法对相邻脑片空间位置进行配准，所获取的数据集无法重建三维结构。因此，神经结构的分子表型研究急需发展自动化的全脑成像手段。

近年来，全脑免疫组化结合光片照明成像，提供了一种获取神经元分子表型的新工具，避免了大量的手工操作。利用透明后组织渗透性好的优点，已有光透明技术实现了全脑免疫组化染色，再通过光片照明成像技术对这些荧光标记的神经结构及其分子表型进行全脑成像。但受限于严重的技术缺陷，这些技术方案仅能提供全脑分布的简单参考，而难以展示神经环路纤维结构的分子表型。现有全脑免疫组化仅适用于小分子抗体，随着抗体分子量的增大，抗体的渗透深度与均匀性剧烈下降。全脑免疫组化的流程长且复杂，荧光信号易淬灭，样本存在变形，无法长期保存。抗体试剂使用量大，成本高。此外，目前光片照明技术成像分辨率较低，仅10μm左右，且在深部脑区进一步下降，无法在全脑范围获得一致的成像效果。成像所需超长工作距离物镜，设计难度高，价格昂贵。目前尚无可实现诸如全脑原位杂交等其他全脑分子表型染色的技术。

因此，要真正实现特定神经环路中神经元细胞类型的快速鉴定，亟待方法和技术上的突破。

发明内容

本发明目的在于克服上述现有技术的不足而提供一种快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的装置及方法，本发明解决了现有技术中样本制备流程复杂、影响样本形态和荧光信号、成像速度慢的缺点，能够快速获取并分析样本的三维结构信息，所获取数据具有自配准特性，并对感兴趣部位的样本切片进行分子表型染色，获得样本的分子表型信息，并可配准到所获取的三维结构信息中去。

实现本发明目的采用的技术方案是一种快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的成像装置，该装置包括：

样本存放装置；

三维平移台，用于驱动所述样本存放装置在三维空间内移动；

振动切片模块，用于对样本进行切片，得到样本的浅层部分；以及

宽场光学显微成像模块，用于对样本的浅层部分进行高通量层析成像。

此外，本发明还提供一种通过上述装置实现快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的方法，该方法包括：

步骤S101：利用荧光标记对生物组织样本进行标记；

步骤S102：使用琼脂糖包埋样本，得到包埋后的样本块；

步骤S103：将包埋后的样本块固定在水槽中，并加入缓冲液；

步骤S104：根据成像要求，在计算机中设置Z向采样间距、切片厚度、成像区间和Z向成像范围；

步骤S105：通过计算机控制三维平移台移动，使样本移至成像区域，并控制宽场光学显微成像模块对样本浅层整个断面进行高通量层析成像，并存储所得到的图像；

步骤S106：计算机控制三维平移台移动，使样本移至切片区域，并控制振动切片模块对样本已成像部分进行快速切片；

步骤S107：计算机控制切片收集模块将切片收集至容器中；

步骤S108：确认是否已完成样本整个Z向的成像，若没有完成则执行下一步骤；

步骤S109：计算机控制三维平移台沿Z向抬升样本，然后返回到步骤S105；若完成则执行下一步骤；

步骤S110：所获取的图像之间具有自配准性，可快速重建出样本三维结构信息成像数据并浏览，选取感兴趣部位的样本切片；

步骤S111：对选取的样本切片进行分子表型染色并成像，获取对应部位的分子表型信息，并配准至已有的三维结构信息成像数据。

本发明较现有技术具有以下优点：

(1)将振动切片与光学显微成像相结合，通过成像过程和切片过程的交替循环，克服了光学成像深度的限制，能够快速获取大样本的三维结构信息。与传统研究方法相比，提升了数据获取的效率且所获取的数据具有三维自配准特性，加速神经环路细胞分类的相关研究。

(2)在自动化的收集成像过程中产生的样本切片，能够根据样本三维结构信息的成像结果选择感兴趣的目标切片进行分子表型染色，获取样本的分子表型信息。避免了全脑免疫组化技术只能使用小分子抗体的局限性，可适用于现有任意免疫组化抗体、原位杂交抗体等常用分子表型染色的试剂。

(3)采用琼脂糖包埋样本，流程简单，不会造成样本形变，不影响样本的荧光信号和抗原特性。

附图说明

图1为本发明快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息成像装置的结构示意图。

图2为本发明中计算机的控制连接框图。

图3为本发明快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息成像方法的流程图。

图4为本发明实现快速获取大样本三维结构信息的示意图。

图5为本发明中获取的鼠脑样本的三维结构数据图，图5a为全脑结构数据的三维重建结果，图5b为单个冠状面图。

图6为本发明中获取的样本切片的免疫组化数据图，图6a为抗-小清蛋白的免疫组化图；图6b为抗-钙结合蛋白的免疫组化图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

本实施例快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息成像装置的结构如图1所示，该装置包括精密三维平移台9、水槽7、宽场光学显微成像模块、振动切片模块、切片收集模块和计算机15。水槽7设于精密三维平移台9上，水槽7内装有缓冲液，样本5置于缓冲液中。精密三维平移台9与计算机15连接，计算机15控制精密三维平移台9在三维方向移动。

本实施例所用宽场光学显微成像模块为结构光照明显微镜，用于对样本的浅层部分进行高通量层析成像，它包括光源1、空间光调制器2、物镜3和相机4，空间光调制器2用于调制所述光源发出的光，物镜3用于对空间光调制器调制后的光形成结构光调制条纹，即由光源1出射的光经空间光调制器2调制后在物镜3的焦面上形成结构光调制条纹。相机4用于获取不同相位的图像后传输至计算机15。将三幅不同相位的图像经过结构光照明成像重建算法计算后即可得到样本的层析图像。

本实施例中所用振动切片模块8用于将样本的已成像部分切除，振动切片模块8为现有常用设备，此处不再赘述。振动切片模块8的刀片6位于水槽7内缓冲液面以下。

本实施例中所用切片收集模块用于收集切除得到的切片，它包括容器12、管路10和水泵11，管路的一端对着刀片6处(切片被切除的部位)，另一端通向容器12；水泵11设于管路10中，用于将水槽7内的缓冲液抽入到容器12内。

如图2所示，本实施例中计算机15分别与空间光调制器2、相机4、振动切片模块8、精密三维平移台9和水泵11连接。计算机15对上述各部件的控制分别为：计算机15通过控制空间光调制器2和相机4实现结构光显微成像，获取样本的层析图像并存储在计算机15中；计算机15通过控制振动切片模块8和精密三维平移台9实现对样本5的快速切片；计算机15通过控制水泵11实现将水槽7中的缓冲液抽入到容器12内，被切除的切片随缓冲液也被抽入到容器12内。

本实施例中所用各部件的参数具体为：光源1采用Lumen Dynamics公司生产的X-cite exact金属卤化物光源；空间光调制器2采用规格为0.7XGA的数字微镜阵列；成像用的物镜3为日本Olympus公司生产的NA值为1.0的20×消色差物镜；成像相机4为日本Hamamatsu公司生产的sCMOS相机，像素规格为2048×2048；水槽7为金属加工件；采用基于弹簧钢片结构和电磁力驱动的振动切片模块8，刀片6采用美国Electron MicroscopySciences公司的氧化锆刀片；精密三维平移台9采用美国Aerotech公司的产品，固定于大理石平台上，定位精度为亚微米水平，能满足切片和成像的精度要求；切片收集模块中的水泵11为高流量隔膜泵。

通过本实施例快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的方法流程如图3所示，具体包括以下步骤：

步骤S101：利用荧光标记技术对生物组织样本的特定结构进行标记；

步骤S102：使用琼脂糖包埋样本，得到包埋后的样本块。本实施例将新鲜的样本组织经过固定后，采用3％～5％的琼脂糖包埋，包埋过程仅需1～2个小时。

步骤S103：将包埋后的样本固定在水槽中7，并加入硼酸钠缓冲液。

步骤S104：根据成像要求，在计算机15上设置Z向采样间距、切片厚度、成像区间和Z向成像范围；

步骤S105：计算机控制精密三维平移台9将样本移至成像区域，并控制结构光照明显微镜对样本5的浅层部分13进行高通量层析成像，相机4获取不同相位的图像后由计算机通过重建算法计算得到样本的层析图像；并存储所得到的图像；

步骤S106：计算机控制精密三维平移台9将样本移至切片区域，并控制振动切片模块对样本浅层已成像部分13进行快速切片；

步骤S107：计算机控制切片收集模块将切片收集至指定容器12中；

步骤S108：确认是否已完成样本整个Z向的成像，若没有完成则执行下一步骤；

步骤S109：Z向抬升样本，返回到步骤S105，继续对暴露出的样本浅层部分14进行成像和切片；若完成则执行下一步骤；

步骤S110：所获取的图像之间具有自配准性，可快速重建出样本三维结构信息成像数据并浏览，选取感兴趣部位的样本切片；

步骤S111：对选取的样本切片进行分子表型染色并成像，获取对应部位的分子表型信息，并配准至已有的三维结构信息成像数据。

如图4所示，通过上述方法实现快速获取大样本三维结构信息的过程为：宽场光学显微成像模块通过物镜3对样本5的浅层部分13进行高通量层析成像，成像完成后振动切片模块8将样本已成像部分13切除，切片收集模块收集切片，随后计算机15控制精密三维平移台9沿Z向抬升样本，继续对样本浅层部分14进行成像，成像完成后将浅层部分14切除，切片、收集和成像过程循环即可获取整个样本的间隔采样层析图像和切片。

图5为采用上述快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的成像方法获取的鼠脑样本的三维结构数据图。利用转基因荧光标记技术对该鼠脑进行标记，该鼠脑中含有促肾上腺皮质激素释放激素基因的细胞均表达荧光蛋白，其中，图5a为全脑结构数据的三维重建结果图，图5b为单个冠状面图片。整套数据包含300层图像，每层图像之间间隔50μm。图像的分辨率达到了0.32μm×0.32μm，能够清晰的分辨胞体和纤维等细节信息。图像之间具备自配准特性，能够方便的得到三维重建结果，并辨别含有促肾上腺皮质激素释放激素基因的细胞在全脑范围内的分布和聚集情况。整个全脑结构数据的采集时间仅需12小时。

图6为采用上述快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的成像方法获取的鼠脑样本皮层部位切片的免疫组化数据图，其中，图6a为抗-小清蛋白的免疫组化图片，图6b为抗-钙结合蛋白的免疫组化图片。根据已有的三维结构数据结果可知皮层部位有较多的含有促肾上腺皮质激素释放激素基因的细胞，故选着含皮层的样本切片进行免疫组化染色。染色操作为常规的操作步骤，简单、快速，可适用于现有任意免疫组化抗体、原位杂交抗体等常用分子表型染色的试剂。图中免疫组化数据显示了鼠脑皮层部位包含小清蛋白和钙结合蛋白的细胞分布情况。

尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上可以对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的成像装置，其特征在于，包括：

样本存放装置；

三维平移台，用于驱动所述样本存放装置在三维空间内移动；

振动切片模块，用于对样本进行切片，得到样本的浅层部分；

宽场光学显微成像模块，用于对样本的浅层部分进行高通量层析成像；

切片收集模块，用于收集切除得到的切片；

所述切片收集模块包括：

容器；

管路，其一端对着切片被切除的部位，另一端通向所述容器；以及

水泵，设于管路中，用于将被切除的切片随缓冲液从管路中抽入到所述容器内。

2.根据权利要求1所述快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的成像装置，其特征在于，还包括：

计算机，分别与所述三维平移台、宽场光学显微成像模块、振动切片模块和切片收集模块连接，用于控制所述三维平移台、宽场光学显微成像模块、振动切片模块和切片收集模块实现各自的工作。

3.根据权利要求1或2任一项所述快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的成像装置，其特征在于：所述样本存放装置内装有缓冲液，样本置于缓冲液中。

4.根据权利要求3所述快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的成像装置，其特征在于：所述宽场光学显微成像模块为结构光照明显微镜或其他能实现高通量层析成像的光学仪器。

5.一种通过权利要求1所述装置实现快速获取大样本三维结构信息和分子表型信息的方法，其特征在于，包括：

步骤S101：利用荧光标记对生物组织样本进行标记；

步骤S102：使用琼脂糖包埋样本，得到包埋后的样本块；

步骤S103：将包埋后的样本块固定在水槽中，并加入缓冲液；

步骤S104：根据成像要求，在计算机中设置Z向采样间距、切片厚度、成像区间和Z向成像范围；

步骤S105：通过计算机控制三维平移台移动，使样本移至成像区域，并控制宽场光学显微成像模块对样本浅层整个断面进行高通量层析成像，并存储所得到的图像；

步骤S106：计算机控制三维平移台移动，使样本移至切片区域，并控制振动切片模块对样本已成像部分进行快速切片；

步骤S107：计算机控制切片收集模块将切片收集至容器中；

步骤S108：确认是否已完成样本整个Z向的成像，若没有完成则执行下一步骤；

步骤S109：计算机控制三维平移台沿Z向抬升样本，然后返回到步骤S105；若完成则执行下一步骤；

步骤S110：所获取的图像之间具有自配准性，快速重建出样本三维结构信息成像数据并浏览，选取感兴趣部位的样本切片；

步骤S111：对选取的样本切片进行分子表型染色并成像，获取对应部位的分子表型信息，并配准至已有的三维结构信息成像数据。