CN109030431B - 一种利用水溶性光吸收剂提升图像信噪比的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用水溶性光吸收剂提升图像信噪比的方法，包括：将生物组织进行预处理，并配制水溶性光吸收剂‑PBS混合溶液；将所述预处理后的组织在所述水溶性光吸收剂‑PBS溶液中进行渗透处理；将渗透后的组织在成像系统上成像。本发明提供一种基于水溶性光吸收剂抑制组织背景荧光，提升图像信噪比的方法，此方法使用过程中不需要对生物组织进行脱水处理，操作简洁，不会引起组织形变，且普适性好。

Description

一种利用水溶性光吸收剂提升图像信噪比的方法

技术领域

本发明涉及一种生物光学成像技术领域，尤其涉及一种利用水溶性光吸收剂提升图像信噪比的方法。

背景技术

生物光学成像(Optical Imaging)是指利用光学的探测手段结合光学探测分子对细胞或者组织甚至生物体进行成像，来获得其中的生物学信息的方法。如果把生物光学成像限定在可见光和近红外光范围，依据探测方式的不同生物光学成像可分为荧光成像、生物发光成像、光声成像、光学断层层析成像等。

生物光学成像可用来获取生物组织如脑、心脏、肝脏、肾脏、胰腺等结构信息。比如在神经科学领域，获取不同类型神经元的精细形态及其所处的准确位置，明确神经元类型，从而判断其结构异常以及与其密切相关的神经类疾病的发生。更进一步的，不仅要获取完整的神经元胞体、轴突、树突等整体结构信息，还希望获取到树突脊、突触小结及轴突末梢等精细结构信息。

传统的生物光学成像技术通常会受到样本背景荧光的干扰，以至于难以获取到高信噪比的图像。目前解决上述的背景荧光干扰问题主要分为样本深层的焦外信号和组织的自发荧光。针对厚组织块进行成像时，目前我们用到的抑制组织背景荧光提升图像信噪比的方法主要涉及以下两个方面：

(1)从成像方式上考虑有激光扫描共聚焦或结构照明抑制背景技术、TDI系统中的多重积分方法等，但是图像信噪比依然受限于样本本身背景荧光强弱，且成像速度慢。

(2)从样本自身考虑有将一定浓度的SBB溶解在酒精中，渗透生物组织，通过SBB结合生物组织中的脂褐质降低组织自身的自发荧光同时吸收深层信号的荧光来抑制背景荧光的方法。由于SBB为脂溶性染料，需溶解在酒精中，所以其渗透生物组织后会使组织产生一定程度的形变，不利于形态的保持。

综上所述，当前的抑制组织背景荧光提升图像信噪比的方法存在成像速度慢、背景荧光抑制不彻底或是组织形态保持不佳的问题。

发明内容

有鉴于此，我们提出了一种基于水溶性光吸收剂Keyamine^TMBlack SP-IJ Liquid抑制组织背景荧光，提升图像信噪比的方法。此方法使用过程中不需要对生物组织进行脱水处理，操作简洁，不会引起组织形变，且普适性好。

为解决以上技术问题，本发明的技术方案为采用一种利用水溶性光吸收剂提升图像信噪比的方法，包括：

预处理步骤，将组织进行预处理，并配制水溶性光吸收剂-PBS溶液；

渗透处理步骤，将所述预处理后的组织在所述水溶性光吸收剂-PBS溶液中进行渗透处理；

成像步骤，将渗透后的组织在成像系统上成像。

优选的，所述将组织进行预处理具体为：

提供活体组织；

将所述组织进行PFA后固定，PBS漂洗。

优选的，所述提供水溶性光吸收剂-PBS溶液具体为：

将水溶性光吸收剂与PBS溶液混合得到水溶性光吸收剂的质量浓度为0.1％-5％的水溶性光吸收剂-PBS溶液。

优选的，所述水溶性光吸收剂选自如下化合物中的一种或多种：Keyacid^TMBlackWA BR Conc、Keyamine^TMBlack SP-IJ Liquid、食用黑或C.I.直接黑19。

优选的，所述水溶性光吸收剂具体选自Keyamine^TMBlack SP-IJ Liquid。

优选的，所述渗透处理的时间具体为组织片为0.1-10h，组织块为1～10天。

优选的，所述将渗透后的组织在成像设备上成像具体为：

将所述渗透处理后的组织封片，并置于荧光显微镜上成像。

优选的，所述将渗透后的组织在成像系统上成像获取三维连续数据集具体为：

将所述渗透处理后的组织用琼脂糖进行包埋处理；

将包埋处理的生物组织块，在振动切片上切削，显微镜成像。

优选的，所述组织为小鼠脑切片、全脑、肝脏、心脏、肾脏或胰腺。

本发明的首要改进之处为本发明提出了一种基于水溶性光吸收剂的抑制组织背景荧光，提升图像信噪比的方法。该方法通过将光吸收剂配置PBS溶液，并对组织进行渗透，使组织在成像时，根据物质对光的吸收规律，光强为1₀的光通过厚度为x的介质后，出射光强I(x)有如下关系式：

I(x)＝I₀e-μax

其中吸收系数μa表示组织体中每单位长度上的一个光子被吸收的概率。将光吸收剂渗透进入鼠脑后可增加组织体的吸收系数μa，使离焦荧光大部分被吸收，荧光成像时能透过的背景荧光就会减少。在这个过程中，焦面上的荧光信号强度可能也会有一定程度的降低。但是，根据吸收定律，更深层的背景荧光减少得更多，且在成像时可以通过增加曝光时间等方式进行改善，因此能够得到焦面上更高的信背比，提高成像质量。所以光吸收剂可用于抑制生物组织的背景荧光，方便快捷，对组织形态无损。

同时，该方法还可用于大体积生物组织如小鼠全脑的树脂包埋中抑制组织背景荧光，提升图像信噪，获取精细的荧光数据。

附图说明

图1、本发明实施例1提供的吸收光谱；

图2、本发明实施例1抑制thy1-GFP脑片背景荧光前荧光显微镜图；

图3、本发明实施例1抑制thy1-GFP脑片背景荧光后荧光显微镜图；

图4本发明实施例1提供的抑制hy1-GFP脑片背景荧光吸收光谱前后对比图；

图5本发明实施例2抑制绿色荧光素脑片背景荧光前荧光显微镜图；

图6本发明实施例2抑制绿色荧光素脑片背景荧光后荧光显微镜图；

图7本发明实施例2抑制绿色荧光素脑片背景荧光前后吸收光谱图；

图8本发明实施例3提供的染料标记小鼠肾脏样本抑制背景荧光前后的荧光显微镜图；

图9本发明实施例4提供的病毒标记样本系统三维成像图；

图10本发明实施例5提供的不同水溶性光吸收剂浓度下，生物成像和不添加水溶性光吸收剂生物成像对比图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

本发明采用一种利用水溶性光吸收剂提升图像信噪比的方法，包括：

预处理步骤，将组织进行预处理，并配制水溶性光吸收剂-PBS溶液；

渗透处理步骤，将所述预处理后的组织在所述水溶性光吸收剂-PBS溶液中进行渗透处理；

成像步骤，将渗透后的组织在成像设备上成像。

以下通过实施例来具体阐述。

实例1荧光蛋白标记小鼠脑组织样本

步骤一，在二月龄的Thy1-GFP雄性小鼠腹腔注射10％乌拉坦和2％水合氯醛混合物进行麻醉，灌流取脑，PFA后固定24h，PBS漂洗24h；

步骤二，将小鼠全脑于振动切片机上切片200-500um；

步骤三，将一定浓度的水溶性光吸收剂溶解于PBS中，将切好的脑片放入PBS-水溶性光吸收剂溶液中(水溶性光吸收剂质量浓度为0.1％-5％)渗透0.1-10h，水溶性光吸收剂选用Keyamine^TMBlack SP-IJ Liquid；

步骤四，将渗透好的脑片封片，于荧光显微镜上成像，可以采用宽场荧光显微镜；

通过图1～图4所示的内容可以看出，在使用光吸收剂-PBS溶液渗透组织后，神经元的位置及形貌更加清清晰，从荧光强度曲线可以看出，使用光吸收剂后的成像信噪比更高。

实例2染料标记小鼠脑组织样本

步骤一，在二月龄的C57雄性小鼠尾静脉注射DyLight 488，20min后腹腔注射10％乌拉坦和2％水合氯醛混合物进行麻醉，灌流取脑，PFA后固定24h，PBS漂洗24h；

步骤二，将小鼠全脑于莱卡商业振动切片机上切片200-500μm；

步骤三，将一定浓度的水溶性光吸收剂溶解于PBS中，将切好的脑片放入PBS-水溶性光吸收剂溶液中(水溶性光吸收剂质量浓度为0.1％-5％)渗透0.1-10h，水溶性光吸收剂选自Keyamine^TMBlack SP-IJ Liquid；

步骤四，将渗透好的脑片封片，于荧光显微镜上成像；

通过图5～图7所示的内容可以看出，在使用光吸收剂前后，血管的位置及形貌更加清晰，从荧光强度曲线可以看出，使用光吸收剂后的成像信噪比更高。

实例3染料标记小鼠肾脏样本

步骤一，在二月龄的C57雄性小鼠尾静脉注射DyLight 488，20min后腹腔注射10％乌拉坦和2％水合氯醛混合物进行麻醉，灌流取肾脏，PFA后固定24h，PBS漂洗24h；

步骤二，将小鼠肾脏琼脂糖包埋后于莱卡商业振动切片机上切片200-500μm；

步骤三，将一定浓度的水溶性光吸收剂溶解于PBS中，将切好的肾脏组织放入PBS-水溶性光吸收剂溶液中(水溶性光吸收剂质量浓度为0.1％-5％)渗透0.1-10h，水溶性光吸收剂选自Keyamine^TMBlack SP-IJ Liquid；

步骤四，将渗透好的肾脏组织封片，于荧光显微镜上成像；

通过图8所示的内容可以看出，在使用光吸收剂前后，肾小球的形态更加清晰，成像信噪比更高。

实例4病毒标记鼠脑组织琼脂糖包埋振动切片三维成像

步骤一，在二月龄的Thy1-GFP雄性小鼠腹腔注射10％乌拉坦和2％水合氯醛混合物进行麻醉，灌流取脑，PFA后固定24h，PBS漂洗24h；

步骤二，将一定浓度的水溶性光吸收剂溶解于蒸馏水中，将小鼠全脑放入蒸馏水-水溶性光吸收剂溶液中(水溶性光吸收剂质量浓度为0.1％-5％)渗透1-10d，水溶性光吸收剂选自Keyamine^TMBlack SP-IJ Liquid；

步骤三，将渗透处理后的小鼠全脑琼脂糖包埋固定；

步骤四，将琼脂糖包埋好的鼠脑样本粘在振动切片切削，并在显微镜上成像，获取数据。

通过图9所示的内容可以看出，在使用光吸收剂后，神经纤维清晰可见。

实施例5

按照实施例1的方法进行生物成像，不同的是，使用不同光吸收剂浓度，生物成像的结果如图10所示，可以看出，在不同的浓度下对应的效果，均能有效增加图像信噪比，但浓度太低，信噪比提升不足，浓度太高自身信号也会被大幅度吸收，将导致需要更高的曝光时间，因此这里存在一个平衡，但均比不添加水溶性光吸收剂的效果要好。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种利用水溶性光吸收剂提升图像信噪比的方法，其特征在于，包括：

预处理步骤，将生物组织进行预处理，并配制水溶性光吸收剂-PBS混合溶液；

渗透处理步骤，将所述预处理后的组织在所述水溶性光吸收剂-PBS溶液中进行渗透处理；

成像步骤，将渗透后的组织在成像系统上成像；

所述配制水溶性光吸收剂-PBS混合溶液具体步骤为：将水溶性光吸收剂与PBS溶液混合得到水溶性光吸收剂的质量浓度为0.1%-5%的水溶性光吸收剂-PBS溶液；

所述水溶性光吸收剂为化合物Keyamine™ Black SP-IJ Liquid。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将生物组织进行预处理具体步骤为：

提供活体组织；

将所述组织进行PFA后固定，PBS漂洗。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述渗透处理的时间具体为组织片为0.1-10h，组织块为1~10天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将渗透后的组织在成像系统上成像具体步骤为：

将所述渗透处理后的组织封片，并置于荧光显微镜上成像。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将渗透后的组织在成像系统上成像，获取三维连续数据集，具体步骤为：

将所述渗透处理后的组织用琼脂糖进行包埋处理；

将包埋处理的生物组织块，在振动切片上切削，显微镜成像。

6.根据权利要求1~5任意一项 权利要求所述的方法，其特征在于，所述组织为小鼠脑切片、全脑、肝脏、心脏、肾脏或胰腺。

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