CN103436605B - 一种快速区分稻曲病菌交配型的分子检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速区分稻曲病菌（Villosiclavavirens）交配型的分子检测方法，包括收集待检菌丝和组织样品，采用CTAB法提取所需检测样本的基因组DNA，用0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，PCR扩增，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用标记判断DNA片段的大小，涉及的检测样本为：稻曲病菌分生孢子单孢菌株或子囊孢子单孢菌株或菌核，所述的PCR扩增为多重PCR扩增，在多重PCR扩增体系中涉及的两对扩增引物是Vm1-F/Vm1-R和Vm2-F/Vm2-R，其中，Vm1-F为SEQIDNO.1，Vm1-R为SEQIDNO.2，Vm2-F为SEQIDNO.3，Vm2-R为SEQIDNO.4。
Description
技术领域
本发明涉及植物保护领域，是一种快速区别稻曲病菌（Villosiclava virens）交配型的分子检测方法。
技术背景
真菌的交配型是控制其交配亲和性和有性繁殖的遗传基础，同宗配合的子囊真菌通常具有一个交配型基因座；而大多数异宗配合的丝状子囊真菌有一对高度异源的交配型基因座。在异宗配合子囊真菌中，异源的交配型基因座分别为MAT1-1和MAT1-2，其中MAT1-1基因座至少含有一个具有α-结构域的交配型基因mat1-1-1，而MAT1-2交配型基因座则至少含有一个具有高泳动蛋白家族（HMG）结构域的交配型基因mat1-2-1，通过检测mat1-1-1和mat1-2-1交配型基因可确定异宗配合子囊真菌的交配型。
由稻曲病菌（有性态：Villosiclava virens；无性态：Ustilaginiodea virens）侵染引起的水稻稻曲病危害水稻穗部并产生毒素，严重影响稻米产量和品质。其在侵染后期可产生菌核，在田间越冬后于次年侵染适期可萌发进行有性繁殖产生子囊孢子，成为稻曲病的主要初侵染源。最新研究显示，稻曲病菌是异宗配合真菌，具有MAT1-1和MAT1-2两种交配型，含有MAT1-1和MAT1-2交配型稻曲病菌的菌核越冬后可萌发并产生子囊孢子；而仅含有MAT1-1交配型稻曲病菌的菌核不能萌发产生子座及子囊孢子。因此，田间可育菌核是稻曲病流行的关键因子之一，田间可育菌核数量的统计是建立病害流行预警体系的关键基础。
申请人在前期研究中根据Yokoyama等扩增到的稻曲病菌mat1-2-1 基因部分序列(Genbank 登录号:AB124632)和使用简并引物扩增到的稻曲病菌交配型基因mat1-1-1部分DNA序列（Genbank登录号：JQ844754），设计了两对特异性引物可用于检测稻曲病菌的交配型（植物病理学报，2012，42（6）：561-568），缩短了稻曲病菌交配型检测的周期，但该方法需要将一个稻曲病菌DNA样本进行两次PCR扩增和凝胶电泳，在检测大批量样本时操作较为繁琐。
通过多重PCR扩增体系对稻曲病菌DNA样本进行交配型检测，目前未见报道。该方法可快速检测稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和菌核的交配型，适用于稻曲病流行预测及植物病理学领域的科学研究。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前对稻曲病菌交配型检测方法中必须通过两次PCR扩增，检测步骤相对繁琐的缺陷，本发明提供一种更快速、且易于操作的检测稻曲病菌交配型的分子检测方法。
本发明的目的是这样实现的：一种快速区分稻曲病菌（Villosiclava virens）交配型的分子检测方法，包括收集待检菌丝和组织样品，采用CTAB法提取所需检测样本的基因组DNA，用0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，多重PCR扩增，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用标记判断DNA片段的大小，其特征在于，检测样本为：稻曲病菌分生孢子单孢菌株或子囊孢子单孢菌株或含有稻曲病菌的菌核，多重PCR扩增体系中涉及的两对扩增引物是Vm1-F/Vm1-R和Vm2-F/Vm2-R，其中，Vm1-F为SEQ ID NO.1，Vm1-R为SEQ ID NO.2，Vm2-F为SEQ ID NO.3，Vm2-R为SEQ ID NO.4。
在本发明中，多重PCR扩增体系为：取5uL不含Mg2+的10×PCR Buffer稀释10倍；浓度为25mM的MgCl2，3μL；dNTP Mixture(2.5mM each)，4 μL；取浓度为1-5ng/μL模板DNA 1μL；引物Vm1-F和Vm1-R 以及引物Vm2-F和Vm2-R各1 μL；Taq DNA聚合酶，0.25μL；PCR扩增程序为：94°C，5min；35×（94°C，30s；65.4°C，30s；72°C，30s）；72°C，5min；4°C保存。
在本发明中，MAT1-1交配型的稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和含有MAT1-1交配型菌丝的菌核的可得到180bp左右的DNA条带；而MAT1-2交配型的稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和含有MAT1-2交配型菌丝的菌核的可得到280bp左右的DNA条带；据此获得被测稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和菌核的交配型。MAT1-1和MAT1-2交配型稻曲病菌菌株可有性繁殖产生子囊孢子，同时含有MAT1-1和MAT1-2交配型菌丝的菌核可萌发产生子座及子囊孢子，仅含有MAT1-1交配型稻曲病菌菌核的分生孢子单孢菌株不能萌发产生子座及子囊孢子。
本发明的优点：使用多重PCR方法将MAT1-1和MAT1-2检测特异性引物置于同一个PCR反应体系中，使用一次PCR和凝胶电泳即可检测判断稻曲病菌样品的交配型，减少了检测步骤并节约检测成本，适用于大批量的稻曲病菌样本交配型的快速检测，为稻曲病菌可育菌核的检测以及植物保护领域研究中菌株交配型的测定提供了更便捷更快速的方法。
附图说明
图1 本发明对稻曲病菌分生孢子单孢菌株交配型的检测的电泳图。
图2 本发明对稻曲病菌子囊孢子单孢菌株交配型的检测的电泳图。
图3 本发明对稻曲病菌菌核的交配型检测的电泳图。
具体实施方式
实施例1
克隆获取mat1-2-1部分DNA序列：
根据Yokoyama等扩增到的稻曲病菌mat1-2-1 基因210bp DNA序列(Genbank 登录号:AB124632)，设计特异性巢式引物，它们是：
SEQ ID NO.5：
M2W1：5’-CAAAGAGGCGAATCCAGGA-3’
SEQ ID NO.6：
M2W2：5’-CTGGGCCGAGCATGGAACCTTGA-3’
SEQ ID NO.7:
M2W3：5’-ACAGGATCAAGCAGGCCCTCTT-3’
使用DNA Walking SpeedUp试剂盒（Seegene公司）步移法扩增该序列5’端DNA序列，测序，获得共526bp的mat1-2-1基因部分DNA序列
SEQ ID NO.8：
mat1-2-1基因部分DNA序列
ccgctgtcct tgttagcttc gggatccatt ggacagggtg ccgtcgatgc ctggacgggc 60
agacagccgt gtggtggtgc tgcgtaccgt ttgcatcccc agcttggcgt gttttatttt 120
tgcgtctttc ttcggcttcc cggccgcctc agtttgcgtc gtgggtgctg ggcggactgg 180
ctgtgagggg gattccgctt tcgggggacg agatggggaa gtcgtcggcg gtggatgaga 240
ctacaatctg cgcttgggtg ttccttcttg tccggcgttt cttttccgac ggctttcggg 300
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ctttgtactt ttgtcgaacc tctctggact caaggttcca tgctcggccc agaatttgtg 420
cttgaaaagt cagtctcaga acaaattcac aactgcattg aaacacttac aaatctcatt 480
atttgtgatt cctggattcg cctctttgac ggtattatgt cgctcc 526
实施例2
根据稻曲病菌交配型基因mat1-1-1部分DNA序列（Genbank登录号：JQ844754）设计引物对：
SEQ ID NO.1：
Vm1-F: 5’-GAAGTCGTATGCGTGCGAC-3’
SEQ ID NO.2：
Vm1-R: 5’-CTTGTTCCACAGGGTGGTCA-3’
根据实施例1获得的稻曲病菌交配型基因mat1-2-1部分DNA序列（SEQ ID NO.8）设计引物对：
SEQ ID NO.3：
Vm2-F: 5’-CAATCTGCGCTTGGGTGTTC-3’
SEQ ID NO.4：
Vm2-R: 5’- GGAGCGACATAATACCGTCA -3’。
实施例3
利用多重PCR检测方法判断稻曲病菌交配型：
收集待检菌丝和组织样品。包括分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株或田间采集的菌核。
采用CTAB发提取所需检测样本的基因组DNA，用0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。
利用多重PCR扩增体系检测稻曲病菌交配型。扩增引物对分别为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.1；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
多重PCR扩增体系为：10×PCR Buffer(Mg2+ Free)，5uL；MgCl2(25mM)，3uL；dNTP Mixture(2.5mM each)，4 uL；模板DNA(1-5ng/uL)，1uL；引物Vm1-F、Vm1-R和、Vm2-F和Vm2-R，各1 uL；Taq DNA聚合酶，0.25uL。PCR扩增程序为：94°C，5min；35×(94°C，30s；65.4°C，30s；72°C，30s)；72°C，5min；4°C保存。
取5uL PCR扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳，电压为10V/cm，电泳30min后将凝胶置于溴化乙锭溶液中浸泡5min，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用DNA marker判断DNA片段的大小。
当检查结果可以扩增到180bp左右的条带，即表明被测样品存在MAT1-1交配型交配型基因座，分生孢子单孢菌株或子囊孢子单孢菌株为MAT1-1交配型，田间采集的菌核样品含有MAT1-1交配型菌丝。
当检查结果可以扩增到280bp左右的条带，即表明被测样品存在MAT1-2交配型交配型基因座，分生孢子单孢菌株或子囊孢子单孢菌株为MAT1-2交配型，田间采集的菌核样品含有MAT1-2交配型菌丝。
实施例4
利用实施例3的多重PCR体系检测稻曲病菌分生孢子单孢菌株的交配型
利用多重PCR体系检测24个稻曲病菌分生孢子单孢菌株的交配型。24个稻曲病菌分生孢子单孢菌株分别是：UV10-12、UV10-16、UV10-23、UV10-42、UV10-45、UV10-56、UV10-63、UV10-67、UV10-75、UV10-79、UV10-87、UV11-3、UV11-9、UV11-13、UV11-19、UV11-23、UV11-33、UV11-39、UV11-45、UV11-58、UV11-68、UV11-77、UV11-89和UV11-97。
采用实施例3设计的多重PCR扩增体系扩增，结果如图1。
由图1可见：UV10-12、UV10-16、UV10-23、UV10-45、UV10-56、UV10-67、UV10-79、UV10-87、UV11-9、UV11-19、UV11-39、UV11-45、UV11-58、UV11-77和UV11-97为MAT1-1交配型分生孢子单孢菌株，UV10-42、UV10-63、UV10-75、UV11-3、UV11-13、UV11-23、UV11-33、UV11-68和UV11-89为MAT1-2交配型分生孢子单孢菌株。
实施例5
利用实施例3的多重PCR体系检测稻曲病菌子囊孢子单孢菌株的交配型
利用多重PCR体系检测16个稻曲病菌子囊孢子单孢菌株的交配型。16个稻曲病菌子囊孢子单孢菌株分别是：UVas1、UVas2、UVas3、UVas4、UVas5、UVas6、UVas7、UVas8、UVas9、UVas10、UVas11、UVas12、UVas13、UVas14、UVas15和UVas16。
采用实施例3设计的多重PCR扩增体系扩增，结果如图2。
由图2可见：UVas2、UVas5、UVas7、UVas11、UVas12、UVas15和UVas16为MAT1-1交配型子囊孢子单孢菌株，UVas1、UVas3、UVas4、UVas6、UVas8、UVas9、UVas10、UVas13和UVas14为MAT1-2交配型子囊孢子单孢菌株。
实施例6
利用实施例3的多重PCR体系检测稻曲病菌菌核的交配型
利用多重PCR体系检测24个稻曲病菌菌核的交配型，24个随机挑选的稻曲病菌菌核分别是：UVS-1、UVS-2、UVS-3、UVS-4、UVS-5、UVS-6、UVS-7、UVS-8、UVS-9、UVS-10、UVS-11、UVS-12、UVS-13、UVS-14、UVS-15、UVS-16、UVS-17、UVS-18、UVS-19、UVS-20、UVS-21、UVS-22、UVS-23和UVS-24。采用实施例3设计的多重PCR扩增体系扩增，结果如图3
由图3可见：UVS-1、UVS-2、UVS-4、UVS-5、UVS-7、UVS-8、UVS-9、UVS-10、UVS-11、UVS-13、UVS-14、UVS-15、UVS-17、UVS-18、UVS-20、UVS-21、UVS-22、UVS-23和UVS-24菌核同时含有MAT1-1和MAT1-2交配型菌丝，为可育菌核；而UVS-3、UVS-6、UVS-12、UVS-16和UVS-19菌核仅含有MAT1-1交配型菌丝，为不可育菌核。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农科院
<120> 一种快速区分稻曲病菌交配型的分子检测方法
<130> 2
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaagtcgtat gcgtgcgac 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<400> 2
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<400> 3
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
<211> 526
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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Claims (2)
1.一种快速区分稻曲病菌（Villosiclavavirens）交配型的分子检测方法，包括收集待检菌丝和组织样品，采用CTAB法提取所需检测样本的基因组DNA，用0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，PCR扩增，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用标记判断DNA片段的大小，其特征在于，检测样本为：稻曲病菌分生孢子单孢菌株或子囊孢子单孢菌株或菌核，所述的PCR扩增为多重PCR扩增，在多重PCR扩增体系中涉及的两对扩增引物是Vm1-F/Vm1-R和Vm2-F/Vm2-R，其中，Vm1-F为SEQ ID NO.1，Vm1-R为SEQ ID NO.2，Vm2-F为SEQ ID NO.3 ，Vm2-R为SEQ ID NO.4；
MAT1-1交配型稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和含有MAT1-1交配型菌丝的菌核可得到180bp左右的DNA条带，MAT1-2交配型稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和含有MAT1-2交配型菌丝的菌核可得到280bp左右的DNA条带，据此获得被测稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株或菌核的交配型；
稻曲病菌MAT1-1和MAT1-2交配型单孢菌株可配合进行有性繁殖；同时含有MAT1-1和MAT1-2交配型菌丝的稻曲病菌菌核可萌发形成子座并产生子囊孢子，为可育菌核；仅含有MAT1-1交配型菌丝的菌核不能萌发产生子座，为不可育菌核。
2.根据权利要求1所述的一种快速区分稻曲病菌交配型的分子检测方法，其特征在于，多重PCR扩增体系为：不含Mg2+的10×PCR Buffer，5uL；浓度为25mM的MgCl2，3μL；dNTP Mixture，2.5mM each，4 μL；浓度为1-5ng/μL的模板DNA，1μL；浓度为10mM的引物Vm1-F和Vm1-R 以及引物Vm2-F和Vm2-R，各1 μL；TaqDNA聚合酶，0.25μL；ddH2O补足至50μL；PCR扩增程序为：94°C，5min；然后依序循环进行94°C，30s；65.4°C，30s；72°C，30s，循环次数为35次；再72°C，5min；4°C保存。
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