CN113406050B - 基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法，包括以下步骤：将待检测的细菌与无菌浮萍于1/2SH培养液中共培养，获得接菌浮萍；对接菌浮萍进行清洗；采用绿色荧光核酸染料DMAO对浮萍进行染色。本发明的基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法是基于浮萍“水生模式植物”的功能研究体系，采用特别组分和浓度的化学溶液清洗浮萍叶片组织，再结合绿色荧光核酸染料DMAO进行染色，从而实现快速鉴定细菌侵染组织的类型，并能促进判断侵染细菌对宿主植物是否致病，以及微生物与植物是否建立共生关系，它们之间的相互作用如何等的相关研究。

Description

基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法
技术领域
本发明属于细菌功能研究技术领域，更具体地说，本发明涉及一种基于浮萍鉴定细菌侵染组织类型的方法。
背景技术
自然环境中的细菌进入植物体内后，由于生理适应等因素的作用，有些细菌可长期在植物体内生存，并可以随种子或无性繁殖材料在植物各世代之间传播，成为后代植物内生细菌的主要来源。而有些细菌则附着在植物组织表面，对植物的生长生理起到积极促进作用或者造成病害。
浮萍是一种小型的浮水植物，因浮萍基因组较小、结构简单、重复序列少、营养繁殖、遗传周期短(营养条件良好的情况下约30h繁殖一代)、易于采集与培养等优点，是植物模式系统的理想材料，便于研究植物与微生物互作。
植物与微生物的相互作用是近年来微生物学研究的新热点，通过了解细菌以附生菌或内生菌方式侵入植物进行相互作用，以及菌体所产生的多种生物学效应，能够有效的利用微生物的促生机制以及对植物病害的生物防治作用，对于提高农作物的产量和品质具有重要的实践意义。
目前，多数研究细菌侵染植物组织的方法，以绿色荧光蛋白GFP基因标记实验菌株，能够有效地区分接种的目标菌株和土壤及植物中存在的土著菌，并且有利于实时、原位地观测目标菌的存活状态。然而，检测结果会受到诸如质粒表达不稳定、异源蛋白在芽孢杆菌中表达不稳定等因素的影响，导致外源基因的表达效果经常不理想甚至不能表达。
细菌与植物发生互作之前，首先是侵染植物体表或体内，而研究细菌尤其是内生菌如何侵染植物，以及明确侵染植物的组织类型，仍缺少简便快捷的方法。目前研究细菌侵染植物组织类型的方法中，化学品试剂多，配制复杂，且灭菌植物组织时也至少需要20分钟以上，处理步骤较为繁琐，耗时，不够快捷，而且检测结果也不够灵敏。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种基于浮萍鉴定细菌侵染组织类型的方法，该鉴定方法方便快捷灵敏。
实现上述发明目的的具体技术方案如下：
一种基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法，包括以下步骤：
(1)、将待检测的细菌与无菌浮萍于1/2SH培养液中共培养，获得接菌浮萍；
(2)、对接菌浮萍进行清洗，所述清洗包括：无菌水清洗；以及无菌水清洗后，化学溶液清洗5～10min，再无菌水冲洗；
所述化学溶液包括以下组分：127～147mM NaCl、体积浓度30～45％的酒精、质量体积浓度3～5％的NaClO，pH7.0～7.8；
(3)、采用绿色荧光核酸染料DMAO分别对经清洗后的浮萍进行染色，荧光显微镜观察。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述无菌水清洗的次数为2～4次，每次0.5～1min。所述化学溶液包括以下组分：135～140mM NaCl、体积浓度35～40％的酒精、质量体积浓度4～5％的NaClO，pH7.4～7.8。依次经过无菌水和化学溶液清洗接菌浮萍，以剔除浮萍组织表面可能存在的附生菌，保证染色后观察到的目标菌为内生菌。
在其中一些实施例中，步骤(3)中绿色荧光核酸染料DMAO的用量为5～25μL，染色时间为2～5min。染料用量过多、染色时间过长，都会导致组织染色太深，不便于观察。
在其中一些实施例中，步骤(3)中绿色荧光核酸染料DMAO的用量为5～15μL，染色时间为2～4min。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述无菌浮萍是通过以下方法得到的：将浮萍用无菌水洗涤3～5次，加入5～10mL45～55％酒精洗涤5～10min，弃上清，再加入质量体积浓度5～7％的次氯酸盐洗涤1.5～3min，再用无菌水冲洗2-3次。
在其中一些实施例中，所述次氯酸盐的质量体积浓度为5～6％，洗涤时间为2～3min。
在其中一些实施例中，所述次氯酸盐为次氯酸钠。次氯酸钠溶液有强氧化性，同时是强碱性，虽可用来杀菌消毒，但对植物有破坏作用，因而消毒浓度和时间应当适宜。
在其中一些实施例中，步骤(1)中确定所述无菌浮萍是否灭菌彻底的方法为：将无菌浮萍置于LB细菌培养基上，25℃～32℃培养12h～24h，若浮萍周围无菌落产生，则浮萍灭菌彻底。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述待检测的细菌与无菌浮萍在共培养时的菌液OD600＝0.1～0.3。优选为OD600＝0.2。OD600是在紫外分光光度计下检测细菌的吸收值，其大小反应细菌的浓度，接菌的细菌浓度过浓或过稀，会导致定殖植物组织上过密或过稀，进而会影响组织上细菌群的观察，因此需要保证合适的细菌量。
本发明旨在提供一种基于无菌浮萍植物体系，通过分离自水体或土壤环境中的外源细菌，研究其侵染浮萍组织类型的方法。与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1、发明人通过反复实验摸索发现，当体积浓度为30～45％的酒精结合质量体积浓度为3～5％的NaClO时，可以达到植物组织表面彻底灭菌的作用，而当两者的浓度低于本发明所述浓度时，灭菌难以彻底；单独选择体积浓度为30～45％的酒精或是质量体积浓度为3～5％的NaClO清洗组织，也会有灭菌不彻底的问题，尤其是真菌，无法彻底清洗掉；在灭菌的同时，恰到好处地配合NaCl生理盐水在清洗过程中起到保护细胞结构的作用。本发明的化学溶液，仅包含一定浓度的盐、酒精和次氯酸，试剂使用少，配制简单，且本发明的化学溶液5～10min即可使得浮萍组织表面充分灭菌，处理简单、方便、省时，从而该化学溶液能用于灵敏地鉴定细菌侵染浮萍组织的类型；
2、本发明的基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法是基于浮萍“水生模式植物”的功能研究体系，采用特别组分和浓度的化学溶液清洗浮萍叶片组织，有效去除组织表面附生菌，对内生菌进行染色并观察，方便快捷，不受菌体自身影响；再结合绿色荧光核酸染料DMAO进行染色，该染料能够对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活细胞和死细胞进行染色，从而实现快速、灵敏地鉴定细菌侵染组织的类型，并能促进判断侵染细菌对宿主植物是否致病，以及微生物与植物是否建立共生关系，它们之间的相互作用如何等的相关研究。
附图说明
图1为本发明实施例1中使用本发明的方法清洗浮萍组织，细菌侵染浮萍组织的荧光显微成像结果图，其中W代表无菌水清洗浮萍组织；C代表无菌水清洗后，本发明的化学溶液清洗；白色箭头指向细菌。
图2为本发明实施例1中使用现有方法清洗浮萍组织，细菌侵染浮萍组织的荧光显微成像结果图，其中W代表无菌水清洗浮萍组织；SD代表无菌水和现有的化学溶液依次清洗无菌浮萍；B代表现有方法清洗无菌浮萍(无菌水和SD依次洗涤后，次氯酸钠再洗涤1min～2min)；白色箭头指向细菌。
图3为本发明实施例1中使用本发明的方法清洗浮萍组织，细菌侵染浮萍组织的PCR验证结果图谱，其中，No TC代表无DNA模板的PCR空白对照；+代表接种菌株的PCR对照；W代表无菌水清洗浮萍组织；C代表无菌水清洗后，本发明的化学溶液清洗。
图4为本发明实施例1中使用现有方法清洗浮萍组织，细菌侵染浮萍组织的PCR验证结果图谱，其中，No TC代表无DNA模板的PCR空白对照；+代表接种菌株的PCR对照；SD代表无菌水和现有的化学溶液依次清洗无菌浮萍；B代表现有方法清洗无菌浮萍(无菌水和SD依次洗涤后，次氯酸钠再洗涤1min～2min)。
图1～图4中，Lm4a代表待检测菌株；Aw4b代表待检测菌株；-代表无菌浮萍；Sp245代表内生菌阳性对照菌株；Sp7代表附生菌阳性对照菌株。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
在本发明中，所述待检测的细菌为采用常规方法分离自水体或土壤环境的细菌。同时设置空白对照和/或阳性对照；所述空白对照未加入菌液；所述阳性对照加入有已知功能的菌液。空白对照和阳性对照可根据本领域技术人员的常规技能进行选择与设置。
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1一种基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法
本实施例的一种基于浮萍鉴定细菌侵染的方法，包括以下步骤：
1、构建无菌浮萍体系
将采集的浮萍置于无菌水中洗涤3～5次，取5～10片浮萍于10mL无菌离心管中，加入5mL50％酒精洗涤10min，弃上清。加入5mL 5％次氯酸钠洗涤2min，再用无菌水冲洗2-3次。
将浮萍转移至植物培养基(1/2SH+0.5％蔗糖+0.1％头孢噻亏)，其中SH是Schenk&Hildebrandt Basal Salt Mixture植物培养基的缩写。待浮萍在培养基上生长7天后，将浮萍置于LB(牛肉膏蛋白胨)细菌培养基上，28℃培养箱过夜观察，若浮萍周围无菌落产生，则代表浮萍充分灭菌。此时，将一些无菌浮萍转移至1L灭菌的2×SH培养液中，再放置于恒温培养室中扩大培养2-3周左右，扩大浮萍生物量，构建稳定的无菌浮萍体系。
2、将细菌接种于无菌浮萍中
Day 1：将两种待检测菌株Lm4a(Enterobacter sp.)和Aw4b(Pantoea sp.)(待检测菌株为申请人实验室鉴定菌株，Lm4a的16S rDNA序列如SEQ ID No.3所示，Aw4b的16SrDNA序列如SEQ ID No.4所示)以及两株阳性对照菌株Sp7(已被鉴定为附生菌Azospirillum brasilense)和Sp245(已被鉴定为内生菌Azospirillum brasilense)(Jain&Patriquin 1984)分别接种在5mL LB培养液中，28℃恒温培养箱，250rpm摇床过夜培养；
Lm4a 16S rDNA序列(SEQ ID No.3)：
AACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGAGGTTAATAACCTCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAgAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGA
Aw4b 16S rDNA序列(SEQ ID No.4)：
ATCTGCCCGATAGAGGGGGATAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCACTATCGGATGAACCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGGGGTAATGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTGCGGTTAATAACCGTGCCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGA
Day 2：从Day1的细菌培养液中，取出500μL至50mL LB培养液扩大培养，培养条件同Day1；
Day3：从Day2的细菌培养液中，取出25mL于灭菌的离心管中，4℃低温8,000rpm离心5min。弃上清后，加25mL无菌水混匀沉淀物，4℃低温8,000rpm离心5min，弃上清，重复此步骤。加入25mL 0.5×SH灭菌溶液混匀，用分光光度计读取细菌溶液在600nm处的吸光值，然后稀释菌液至OD600＝0.2/50mL。将50mL溶于0.5×SH的待检测菌株Lm4a(Enterobactersp.)和Aw4b(Pantoea sp.)倒入无菌瓶中，再将提前培养好的无菌浮萍转移至菌液瓶内，覆盖菌液表面即可得到实验组接菌浮萍；
另外，设置50mL 1/2SH灭菌溶液倒入无菌瓶中，加入同样数量的浮萍，做空白对照；同时，用1/2SH稀释菌液至OD600＝0.2/50mL的阳性对照菌株Sp7(附生菌Azospirillumbrasilense)和Sp245(内生菌Azospirillum brasilense)分别加入无菌浮萍，做阳性对照。
将实验组接菌浮萍、无菌浮萍空白对照组、阳性对照组接菌浮萍转移到光照培养室(16h光照/8h黑暗，光强1000Lx)中培养。
3、对接菌浮萍进行无菌水和化学溶液清洗处理
培养2～4天后，将各瓶中的0.5×SH溶液吸出，弃去，并剪取小部分浮萍叶片组织，分别进行如下处理：
a、无菌水清洗处理(标记为W)实验组、空白对照组、阳性对照组的浮萍组织叶片
无菌水清洗1min，重复清洗一次；
b、本发明的化学溶液清洗处理(标记为C)实验组、空白对照组、阳性对照组的浮萍组织叶片
选取经W处理后的浮萍样品转移到灭菌的化学溶液(130mM NaCl、体积浓度30％酒精、质量体积浓度3％的NaClO，pH7.4)中洗涤5min，再用无菌水冲洗两次，每次1min；
c、现有方法清洗处理(标记为SD、B)空白对照组、阳性对照组的浮萍组织叶片
①选取经W处理后的10个浮萍转移到灭菌的SD化学溶液(140mM NaCl，2.5mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.5mM MgSO4，1mM CaCl2，0.1％(v/v)Triton-X100，pH＝7.5)中，清洗20min；
②经过步骤①后，5％的次氯酸钠洗涤1min～2min，最后用Na2S2O3溶液冲洗2次，标记为B。
4、染色、鉴定细菌侵染类型
取出经步骤3处理的浮萍样品，分别置于载玻片上，滴加5～10μL左右绿色荧光核酸染料DMAO(Live&Dead Bacterial Staining Kit，#40274ES60)，染色3～5min，之后用吸水纸去除染液。
将载玻片放置在Olympus(FSX100)荧光显微镜下，观察浮萍组织中已被染色的细菌群落。并分别使用10x、20x和30x的放大倍数以及绿色滤镜来观察并拍照。
通过观察细菌侵染浮萍的染色结果，确定判断细菌是以附生菌或内生菌方式侵染浮萍组织。若细菌分布于叶片组织表面，则判断细菌是以附生菌方式侵染浮萍，组织侵染能力相对较弱；若细菌分布于叶片组织内部，则判断细菌是以内生菌方式侵染浮萍，组织侵染能力较强。
使用本发明的化学溶液(W/C)清洗浮萍组织，细菌侵染浮萍组织的荧光显微成像结果如图1所示。空白对照无菌浮萍经W和C清洗后，在叶片组织表面和内部均没有细菌分布；与阳性对照组Sp7相比，接菌株Lm4a的浮萍，经W清洗后，细菌分布在叶片组织表面，但经C清洗后，在叶片组织内部没有细菌分布，说明菌株Lm4a是以附生菌方式侵染浮萍，组织侵染能力相对较弱；与阳性对照组Sp245相比，接菌株Aw4b的浮萍，经W清洗后，细菌分布在叶片组织表面，经C清洗后，细菌分布在叶片组织内部，说明菌株Aw4b是以内生菌方式侵染浮萍，组织侵染能力较强。证明本发明的方法可以很好地鉴定细菌侵染组织的类型。
使用现有的化学溶液(SD/B)清洗浮萍组织，细菌侵染浮萍组织的荧光显微成像结果如图2所示。空白对照无菌浮萍经W、SD和B清洗后，在叶片组织表面和内部均没有细菌分布；阳性对照附生菌Sp7，经W、SD清洗后，在叶片组织表面和内部仍然有细菌分布，经B清洗后，在叶片组织表面和内部才没有细菌分布了；说明单独使用SD不足以清洗掉附生菌，而SD与B组合则可以达到清除附生菌的效果，因此植物组织采用W和/或SD处理后，可观察到附生菌；阳性对照内生菌Sp245经W清洗后，细菌分布在叶片组织表面，经SD和B清洗后，细菌分布在叶片组织内部，说明SD与B组合后可清洗掉附生菌，而清洗不掉内生菌，因此可观察到内生菌的分布。
5、基于PCR验证细菌侵染浮萍叶片组织
对步骤3中经W和C洗涤后的浮萍叶片，分别转移至预填充了1g氧化锆珠的2mL微量离心管内，加入2x CTAB和氯仿，经磁珠振荡器均质化所有组织，之后采用2x CTAB核酸提取法提取DNA。
对各处理组的DNA通过引物扩增细菌16S rDNA基因片段，其中，正向引物e9f：5’-GAGTTT GATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.1)，反向引物e926r：5’-CCGTCAATTCCTTT GAGTTT-3’(SEQ ID No.2)。
25μL的PCR反应体系包括：2.5μL 10x PCR buffer缓冲液、0.5mM MgCl2、0.2mMdNTPs、正反引物各0.8μM、0.5μL 5U/μL Taq聚合酶、100ng DNA模板，最后加无菌ddH2O至25μL。
PCR反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性1min、50℃退火30s、72℃延伸1min，25次循环；最后继续72℃延伸5min。
经嗅化乙锭染色后，PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳半小时左右，再经过凝胶成像仪检测PCR扩增结果并拍照。若W和C处理组均显示条带，则为内生菌侵染浮萍；若W组显示条带，而C处理组无条带，则为附生菌。
而采用现有方法的溶液(SD和B)清洗后，判断的依据为：采用无菌水清洗(W)后经PCR检测有指纹图谱，或SD清洗后也有微弱的指纹图谱，但B清洗后没有指纹图谱，则认为该待检测细菌为附生菌，侵染能力较弱。若经W、SD和B清洗后，经PCR检测都有明显的指纹图谱，则认为该待检测细菌为内生菌，侵染能力较强。
使用本发明方法清洗浮萍组织，细菌侵染浮萍组织的PCR验证结果图谱如图3。从图3可以看出，与阳性对照组Sp245相比，接种菌株Aw4b的浮萍组织，W和C处理组均显示条带，证明是内生菌侵染了浮萍组织，菌株Aw4b为内生菌；而与阳性对照组Sp7相比，接种菌株Lm4a的浮萍组织，W处理组显示了条带，而C处理组没有条带，证明是附生菌侵染了浮萍组织，菌株Lm4a为附生菌。说明PCR检测结果与荧光染色结果一致。
使用现有方法清洗浮萍组织，细菌侵染浮萍组织的PCR验证结果图谱如图4。从图4可以看出，内生菌阳性对照Sp245，W、SD、B处理组均显示条带，证明是内生菌侵染了浮萍组织；而附生菌阳性对照Sp7，W处理组显示了条带，SD也和W处理一样显示了条带，而B处理组没有条带，证明是附生菌侵染了浮萍组织。
综上，使用现有技术的化学溶液SD，以及SD溶液结合B溶液清洗浮萍组织，虽然也能够验证细菌在浮萍组织中的侵染类型，但步骤繁琐，耗时偏长，且不够灵敏。这体现在以下三方面：
1、SD溶液需要多种试剂，配制复杂耗时，且SD洗涤浮萍组织的时间至少保证在20min以上，才能确保组织表面附着菌清洗掉，然后再用B溶液去清洗；若是单独使用B试剂，又无法确保植物组织表面彻底灭菌；本发明化学溶液CM结合了酒精和次氯酸的灭菌作用，仅需要5～10min，就可以将组织表面附着菌清洗掉，洗涤时间大大减少；
2、在验证细菌侵染组织的类型是否为内生菌侵染时，仅凭SD溶液无法确保检测的准确性，需要结合B溶液一起洗涤组织后再提取植物DNA进行PCR检测，步骤繁琐；
3、当验证细菌侵染组织的类型是否为附生菌侵染时，无菌水W和SD洗涤后PCR检出结果一致，因而单独开展SD步骤结合PCR检测则显得多余。
实施例2一种基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法
本实施例的一种基于浮萍鉴定细菌侵染的方法，除了步骤3b中本发明的化学溶液(CM)各组分的浓度与实施例1不同外，其他都与实施例1相同；本实施例的化学溶液由以下组分组成：135mM NaCl，体积浓度40％酒精，5％(g/100ml)NaClO，pH7.6。本实施例的基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法，结果与实施例1一致。
实施例3一种基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法
本实施例的一种基于浮萍鉴定细菌侵染的方法，除了步骤3b中本发明的化学溶液(CM)各组分的浓度与实施例1不同外，其他都与实施例1相同；本实施例的化学溶液由以下组分组成：140mM NaCl，体积浓度35％酒精，4％(g/100ml)NaClO，pH7.8。本实施例的基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法，结果与实施例1一致。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东省科学院生物工程研究所
<120> 基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagtttgatc ctggctcag 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgtcaattc ctttgagttt 20
<210> 3
<211> 620
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (6)

1.一种基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、将待检测的细菌与无菌浮萍于1/2 SH培养液中共培养，获得接菌浮萍；所述无菌浮萍是通过以下方法得到的：将浮萍用无菌水洗涤3~5次，加入5~10 mL45~55%酒精洗涤5~10min，弃上清，再加入质量体积浓度5~7%的次氯酸钠洗涤1.5~3min，再用无菌水冲洗2-3次；
(2)、对接菌浮萍进行清洗，所述清洗包括：无菌水清洗；以及无菌水清洗后，化学溶液清洗5~10min，再无菌水冲洗；所述无菌水清洗的次数为2~4次，每次0.5~1min；
所述化学溶液包括以下组分：130~140mM NaCl、体积浓度30~40%的酒精、质量体积浓度3~5%的NaClO，pH7.4~7.8；
(3)、采用绿色荧光核酸染料DMAO分别对清洗后的浮萍进行染色；
(4)、染色后观察浮萍；
经无菌水清洗后，观察到待检测的细菌分布在叶片组织表面，但经无菌水清洗后，化学溶液清洗5~10min，再无菌水冲洗后，观察到叶片组织内部没有待检测的细菌分布，则待检测的细菌是以附生菌方式侵染浮萍；
经无菌水清洗后，观察到待检测的细菌分布在叶片组织表面，但经无菌水清洗后，化学溶液清洗5~10min，再无菌水冲洗后，观察到待检测的细菌分布在叶片组织内部，则待检测的细菌是以内生菌方式侵染浮萍。
2.根据权利要求1所述的基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法，步骤(3)中绿色荧光核酸染料DMAO的用量为5~25 μL，染色时间为2~5min。
3.根据权利要求2所述的基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法，步骤(3)中绿色荧光核酸染料DMAO的用量为5~15 μL，染色时间为2~4min。
4.根据权利要求1所述的基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法，所述次氯酸钠的质量体积浓度为5~6%，洗涤时间为2~3min。
5.根据权利要求1所述的基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法，步骤(1)中确定所述无菌浮萍是否灭菌彻底的方法为：将无菌浮萍置于LB细菌培养基上，25ºC~32ºC培养12h~24h，若浮萍周围无菌落产生，则浮萍灭菌彻底。
6.根据权利要求1所述的基于浮萍鉴定细菌侵染类型的方法，步骤(1)中所述待检测的细菌与无菌浮萍在共培养时的菌液OD600 =0.1~0.3。
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