CN103789443B

CN103789443B - 香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法

Info

Publication number: CN103789443B
Application number: CN201410064946.4A
Authority: CN
Inventors: 林壁润; 张景欣; 沈会芳; 蒲小明; 潘群英
Original assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guangdong Yueke Plant Protection Agricultural Technology Co., Ltd
Priority date: 2014-02-25
Filing date: 2014-02-25
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2034-02-25
Also published as: CN103789443A

Abstract

本发明公开一种香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法。本发明提供一组特异引物，可在一次PCR扩增反应内同时检测香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种，以及细菌性软腐病菌；当PCR产物呈现636bp条带，即样本中含有FOC1；呈现796bp条带，即样本中含有FOC4；呈现218bp条带，即样本中含有细菌性软腐病原菌。该方法操作简单，耗时短，检测灵敏度高；检测香蕉枯萎病菌菌丝的灵敏度可达1μg，检测细菌性软腐病菌的灵敏度可达10³CFU/ml。该方法同时可应用于香蕉患病组织、直接分离的病原菌或土壤的检测，具有准确度高等优点，防止香蕉枯萎病和细菌性软腐病的扩散与蔓延，保障香蕉安全生产。

Description

香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法

技术领域

本发明属于农作物病害防治及植物检疫领域，特别涉及一种香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法。

背景技术

香蕉是仅次于水稻、小麦和玉米的全世界第四大粮食作物；据FAO统计，近10年全世界香蕉种植面积呈增长的趋势，2007年种植面积达6615.75万亩，产量达到8000多万吨，而中国的面积为450多万亩，居第五位，产量达到700多万吨，居第二位。但是，该产业的发展正受到病害的毁灭性威胁，特别是毁灭性病害香蕉枯萎病和细菌性软腐病等。香蕉枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense FOC）（Wang Z Z et al，2006），有4个生理小种；其中4号生理小种（FOC4）能感染几乎所有的香蕉品种，其危害性最大（Liu J M et al，2006）。目前，FOC4已严重危害澳大利亚、菲律宾和我国台湾等地的香蕉生产（漆艳香等，2008）；1996年，广东番禺也发现巴西香蕉感染枯萎病，并鉴定为FOC4。目前，以FOC4为主要病原菌的香蕉枯萎病在广东省主要香蕉种植基地迅速蔓延，对香蕉产业造成重大危害。此外，FOC1也是我国香蕉枯萎病的重要病原菌，如严重危害我国华南香蕉产区的粉蕉的枯萎病就是由1号生理小种FOC1侵染引起的（彭埃天等，2009）；该病原菌可感染香蕉栽培种“大蜜啥”（Gros Michel（AAA））、龙牙蕉（MusaAAB）和矮香蕉（Dwarf Cavendish（AAA））等，且该生理小种呈世界性分布。香蕉细菌性软腐病则于2009年7月广东广州首次发现，这是在中国大陆首次发现该毁灭性病害，田间发病率20%～30%，严重可达100%以上，并造成整株死亡；病原菌经鉴定为Dikeya sp.（Lin et al，2010）。但由于该病害报道时间较短，尚未有关于病害监测技术的系统报道。

该两种病害主要通过种苗传播，病害潜伏期长，一旦出现症状，香蕉已经面临死亡状态危害严重。但是，由于以下原因使得病情的判断不准确或者耗时较长，无法制定准确的防治措施或者延误最佳防治时机；第一，香蕉细菌性软腐病初期发病症状和香蕉枯萎病有些相似，根据病状较难判断，而传统的病原菌分离培养鉴定的方法耗时耗力，且同时依赖专业人员的扎实植物病理学背景；第二，香蕉枯萎病和细菌性软腐病经常可复合感染香蕉植株，造成严重危害。然而，目前国内外关于香蕉主要病害的检测技术均是单项技术，如“香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种检测引物和快速检测方法”（申请号：201010181211.1）和“香蕉细菌性软腐病害病原菌分子快速检测的方法与应用”（申请号：201110003516.8）。以上技术均只能单独检测香蕉枯萎病和细菌性软腐病菌。因此，在实际农业生产中，关于香蕉重要病害检测、监测及防治等，由于检测过程较为耗时、耗工和耗钱，容易错过农时，不符合生产实际要求。为防止香蕉枯萎病和细菌性软腐病的扩散与蔓延，确保香蕉的安全生产，建立一套稳定、简便、快速、灵敏的分子检测方法对种苗及种植区的土壤进行检疫检测是非常必要的。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法。

本发明根据香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种的基因组差异序列设计一对可同时检测出香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种的特异引物，仅使用一对引物可同时鉴定香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种；同时，根据Dickeya属的gyrB基因序列设计新引物，可特异检测该属病原菌。

该方法操作简便易行，可以以试剂盒的形式直接应用于生产实践，用于带菌的植物组织或土壤的高灵敏度快速检测，确保为生产提供健康无菌种苗、对病原菌分子预警具有十分重要的意义。

本发明的另一目的在于提供一种所述香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法的应用。

香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种及香蕉细菌性软腐病菌的多重分子快速检测的方法，即利用聚合酶链式反应（PCR）分子生物学技术对香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种及香蕉细菌性软腐病菌进行高灵敏度快速检测，可用于香蕉种苗检疫、土壤病原菌检测、田间香蕉病害的早期诊断以及病菌的鉴定和监测。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，包括以下步骤：

（1）提供两对检测引物，见表1所示：

表1香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种及细菌性软腐病菌检测特异引物

（2）对样本进行处理，抽提样本DNA；

（3）以样本DNA为模板，使用香蕉枯萎病菌上游、下游特异引物和细菌性软腐病菌上游、下游特异引物进行多重PCR扩增反应；

（4）将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测；当PCR产物呈现636bp条带时，即样本中含有香蕉枯萎病菌1号生理小种病原菌；当PCR产物呈现796bp条带时，即样本中含有香蕉枯萎病菌4号生理小种病原菌；当PCR产物呈现218bp条带时，即样本中含有细菌性软腐病原菌。

步骤（2）中所述的样本为香蕉病原菌时，所述处理的方式优选为利用FPCBsolution抽提培养过滤后的真菌菌丝的DNA；利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA；

所述的过滤优选为用擦镜纸等进行过滤，其余可过滤菌液且保留菌丝的耗材也可用于过滤，如滤纸等；

步骤（2）中所述的样本为土壤时，所述处理的方式优选为使用土壤基因组DNA快速提取试剂盒提取疑感染的土壤DNA；

步骤（3）所述的多重PCR扩增反应的反应条件优选为94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min；

步骤（3）所述的多重PCR扩增反应的体系（20μL）如下：

步骤（4）所述的用琼脂糖凝胶电泳检测优选用1.0%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测。

所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法在检测香蕉枯萎病菌和香蕉细菌性软腐病菌上的应用。

所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法可通过应用于香蕉患病组织DNA的检测，患病组织上直接分离的病原真菌或细菌的鉴定及检测，土壤中香蕉枯萎病菌不同生理小种、细菌性软腐病菌的检测，帮助香蕉种苗检疫、土壤病原菌检测、田间香蕉病害的早期诊断以及病菌的监测和鉴定。

本发明的机理是：

PCR检测方法则具有灵敏度高、精度高、取样量微小、检测时间短等优点。本发明首先基于NCBI公布的香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的全基因组序列设计香蕉枯萎病菌的特异引物；其次，基于Dickeya属的gyrB基因序列设计引物，可特异性地检测细菌性软腐病菌Dickeya sp.；进一步，整合以上的单项检测技术，建立多重一步检测香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种及香蕉细菌性软腐病菌的技术。

建立快速准确的多重检测技术，同时检测枯萎病菌1号生理小种、4号生理小种以及软腐病菌，可检测种苗，杜绝带病种苗传播，监测病害，早期发现病害，发出预警，及早采取相应措施，将有利于病害防治。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

（1）本发明基于NCBI公布的香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种全基因组序列设计香蕉枯萎病香蕉枯萎病菌的特异引物，该序列所属基因与香蕉枯萎病菌致病性相关，并在香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种间具有160bp左右的insert/deletion差异。针对该差异序列，设计一对引物可直接鉴定至香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种，鉴定水平达生理小种级别。

（2）本发明根据可引起香蕉细菌性软腐病的Dickeya属细菌的gyrB基因序列设计引物。gyrB基因是编码DNA解旋酶B亚单位的基因，其显著优点是基因进化率较快，碱基替换频率较高，在相似细菌的检测和鉴别方面比16SrRNA基因更具优越性。目前，gyrB基因在研究细菌的系统发育和鉴定细菌亲缘种方面得到了广泛的应用。

（3）本发明建立的多重PCR检测技术可以以香蕉患病组织、直接分离的病原菌或土壤的DNA为模板，一次PCR反应可直接同时检测香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种和香蕉细菌性软腐病菌Dickeya sp.；同时，检测分离到的香蕉枯萎病菌菌丝的灵敏度可达1μg，检测分离的香蕉细菌性软腐病菌的灵敏度可达10³CFU/mL。

附图说明

图1是香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物PCR扩增示意图；其中，泳道M为DNA Marker2000；泳道1为香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株FOC1；泳道2为香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株FOC4；泳道3～19依次为：新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum），奇异根串珠霉（Thielaviopsis paradoxa(deSeynes)V.Hohnel），弯孢菌（Curvularia lunata），胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides），鞘锈菌（Coleosporium plumeriae），链格孢（Alternariaalternata），奇异长喙壳菌（Ceratocystis paradoxa（Dade）Moreau），博宁刺盘孢（Colletotrichum boninense），烟草疫霉（Phytophthora nicotianae），芒果球座菌（Guignar diamangiferae），荔枝球腔菌（Mycosphaerella litchii），粉孢（Oidiumsp.），龙眼壳二胞（Ascochyta longan），广生茎点霉（Phomaomnivirens Aveskamp），掌状拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis palmarum），喙状凸脐蠕孢菌（Exserohilumrostratum），阿南德氏链霉菌（Streptomyces anandii）；泳道N为无菌水阴性对照。

图2是细菌性软腐病菌Dickeya sp.特异性引物PCR扩增示意图；其中，泳道M，DNA Marker2000；泳道1为香蕉细菌性软腐病菌（Dickeya sp.MS1）；泳道2为水稻细菌性软腐病菌（Dickeya sp.EC1）；泳道3为蝴蝶兰细菌性软腐病菌（Dickeya sp.PA1）；泳道4为孔雀草细菌性软腐病菌（Dickeya sp.TP1）；泳道5～19依次为：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacteriumcarotovorum subsp.Carotovorum）、野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）、大肠杆菌DH5a（Escherichia coli DH5a）、梨火疫病菌（Erwinia amylovora）、白叶枯病菌（Xanthomonas oryze pv.Oryze）、水稻细菌性条斑菌（Xanthomonasoryzae pv.Oryzicola）、玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii subsp.stewartii）、烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum race1）、恶臭假单孢杆菌（Pseudomonasputida）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、丁香假单胞菌（Pseudomonas syringaepv.syringae）、菜豆枯萎病菌（Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens）、霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）、嗜麦寡养食单胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）；泳道N为无菌水阴性对照。

图3是多重PCR检测技术对香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种和细菌性软腐病菌Dickeya sp.DNA的PCR扩增示意图；其中，泳道M为DNA Marker2000；泳道1为FOC1；泳道2为FOC4；泳道3为Dickeya sp.MS1；泳道4为Dickeyasp.PA1；泳道5为FOC1+Dickeya sp.MS1；泳道6为FOC1+Dickeya sp.PA1；泳道7为FOC4+Dickeya sp.MS1；泳道8为FOC4+Dickeya sp.PA1；泳道N为无菌水阴性对照。

图4是多重PCR检测技术对患病香蕉植株DNA的PCR扩增示意图；其中，泳道M为DNA Marker2000；泳道1为FOC1；泳道2为FOC4；泳道3为Dickeyasp.MS1；泳道4为Dickeya sp.PA1；泳道5为惠州病株；泳道6为东莞病株；泳道7和8为惠州博罗病株；泳道9～13，阳江病株；泳道N为无菌水阴性对照。

图5是多重PCR检测技术对香蕉枯萎病菌的灵敏度检测示意图；其中，泳道M为DNA Marker2000；泳道编号10⁰～10⁹分别代表各个稀释倍数（前半部分中的泳道编号10⁰～10⁹分别代表FOC1的各个稀释倍数；后半部分中的泳道编号10⁰～10⁹分别代表FOC4的各个稀释倍数）；泳道N为无菌水阴性对照。

图6是多重PCR检测技术对香蕉细菌性软腐病菌的灵敏度检测示意图；其中，泳道M为DNA Marker2000；泳道编号10⁰～10⁹分别代表各个稀释倍数；泳道N为无菌水阴性对照。

图7是多重PCR检测技术对人工接种病原菌病土DNA的PCR扩增示意图；其中，泳道M为DNA Marker2000；泳道1为FOC1阳性对照；泳道2为FOC4阳性对照；泳道3为Dickeya sp.MS1阳性对照；泳道4为拌FOC1土壤；泳道5为拌FOC4土壤；泳道6为拌Dickeya sp.MS1土壤；泳道7为拌FOC1+Dickeyasp.MS1土壤；泳道8为拌FOC4+Dickeya sp.MS1土壤；泳道9为拌FOC1+FOC4；泳道10为灭菌土对照；泳道N为无菌水阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株FOC1和香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株FOC4均在文献“香蕉枯萎病镰刀菌ITS序列的PCR扩增及其分子检测.华南热带农业学报，2007,13（3）：1-5.”中公开；

新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum）在文献“First report of brown spotdisease caused by Neoscytalidium dimidiatum on Hylocereus undatus in Guangdong,Chinese mainland.Plant Disease.2012,96(11):1702-1702.”中公开；

奇异根串珠霉（Thielaviopsis paradoxa(de Seynes)V.Hohnel）在文献“Preliminary Investigation on the Main Fungal Diseases of Sugarcane in GuangxiProvince of China.Plant Diseases and Pests,2013，4(1):28-32.”中公开；

弯孢菌（Curvularia lunata）在文献“海南岛香蕉真菌病害调查及弯孢霉的生物学特性研究.华南热带农业大学，2007”中公开；

鞘锈菌（Coleosporium plumeriae）在文献“First report of plumeria rust diseasecaused by Coleosporium plumeriae in Taiwan.Plant Pathology，2006,55（2）：306.”中公开；

链格孢（Alternaria alternata）在文献“昆明美人蕉黑斑病菌——链格孢Alternaria alternata.菌物学报，2012,31(4):645-647.”中公开；

奇异长喙壳菌（Ceratocystis paradoxa（Dade）Moreau）文献“椰子茎泻血病菌生物学特性研究.热带作物学报，2011,32（6）:1122-1127.”中公开；

烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）在文献“First Report of Pineapple Heart RotCaused by Phytophthora nicotianae in Hainan Province,China.Plant Disease.2013,97(4):560-560.”公开；

博宁刺盘孢（Colletotrichum boninense）、芒果球座菌（Guignardiamangiferae）、荔枝球腔菌（Mycosphaerella litchii）、粉孢（Oidium sp.），龙眼壳二胞（Ascochyta longan）和广生茎点霉（Phomaomnivirens Aveskamp）均在文献“荔枝叶部真菌病害鉴定.中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会论文摘要集”中公开；

胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、掌状拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis palmarum）和喙状凸脐蠕孢菌（Exserohilum rostratum）均在文献“海南菠萝几种叶部真菌病害研究.西南农业学报，2012（5）：1703-1707.”中公开；

阿南德氏链霉菌（Streptomyces anandii）在文献“链霉菌4138杀虫成分及对甜菜夜蛾的毒力测定.中国生物防治，2008,24（2）：163-167.”中公开；

香蕉细菌性软腐病菌（Dickeya sp.MS1）在文献“First report of a soft rot ofbanana in mainland China caused by a Dickeya sp.(Pectobacterium chrysanthemi).Plant Disease，2010，94（5）：640.”中公开；

水稻细菌性软腐病菌（Dickeya sp.EC1）在文献“First Report of Bacterial FootRot of Rice Caused by a Dickeya zeae in China.Plant disease，2012,96（12）：1818.”中公开；

蝴蝶兰细菌性软腐病菌（Dickeya sp.PA1）在文献“First Report of a Soft Rotof Phalaenopsis aphrodita Caused by Dickeya dieffenbachiae in China.2012,96（5）：760.”中公开；

孔雀草细菌性软腐病菌（Dickeya sp.TP1）在文献“First Report of BacterialSoft Rot on Tagetes patula Caused by Dickeya dieffenbachiae in China.PlantDisease，2013,97(2):282.”中公开；

胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorum subsp.Carotovorum）在文献“First Report of Bacterial Soft Rot of Potato Caused byPectobacterium carotovorum subsp.carotovorum in Guangdong Province of China.Plant Disease,2012,96(12):1819.”中公开；

野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）在文献“野油菜黄单胞菌产胶基因GumD克隆与重组质粒的构建.食品科学，2006,27（11）：182-184.”中公开；

梨火疫病菌（Erwinia amylovora）、玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartiisubsp.stewartii）、白叶枯病菌（Xanthomonas oryze pv.Oryze）、烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum race1）、丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv.syringae）、菜豆枯萎病菌（Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens）在文献“香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光PCR检测方法的建立.华南热带农业大学学报，2005,11（1）：1-5.”中公开；

水稻细菌性条斑菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola）在文献“水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的实时荧光快速检测鉴定.微生物学报，2003,43（5）：626-637.”中公开；

恶臭假单孢杆菌（Pseudomonas putida）购自上海复祥生物科技有限公司；

霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）文献“高效纤维素降解细菌的分离鉴定及酶学特性.江苏农业科学，2013，41（3）：305-309.”中公开；

嗜麦寡养食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）文献“一株琼胶酶产生菌的筛选与鉴定.中国农学通报，2013,29(21):88-91.”中公开；

大肠杆菌DH5a（Escherichia coli DH5a）购自天根生化科技（北京）有限公司）；

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）均购自北京北纳创联生物技术研究院。

引物序列合成以及基因组序列测序均在生工生物工程（上海）股份有限公司进行。

实施例1：香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异引物的设计与筛选

根据NCBI公布的香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种全基因组序列，查找可能与香蕉枯萎病菌枯萎病菌致病相关，且在1号和4号生理小种间存在insert/deletion差异的基因序列。在Fusarium oxysporum f.sp.cubense race1contig438(AMGP01000438.1)和Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4contig195(AMGQ01000195.1)上搜寻得到可能与致病性相关的序列差异基因，具体序列见Seq1，Seq2。在FOC4（seq2）的1515～1678bp处，FOC4与FOC1相比具有160bp左右的插入片段；在该片段两侧延伸序列设计合适引物。也可通过以下方法获得等同的基因组差异序列：根据提供的序列设计合适的引物，PCR扩增FOC4、FOC1生理小种的菌株（在文献“香蕉枯萎病镰刀菌ITS序列的PCR扩增及其分子检测.华南热带农业学报，2007,13（3）：1-5.”中公开），获取相应的基因组序列。

根据上述序列，应用Oligo dT6.0软件设计PCR特异引物，并优先挑选符合合适GC含量（40～60%），最优Tm值为60℃等原则的引物，并交由上海生工合成。设计的多对PCR引物经以下常规PCR反应体系筛选，选择最优的PCR产物。PCR反应体系（20μL）：10×PCR buffer(Mg²⁺)2μL，Forward primer（正向引物）和Backward primer（反向引物）（10μM）各0.4μL，dNTP(2.5mM)1.6μL，Taq酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，DNase-Free water（无DNA酶水）补足20μL。PCR反应条件是:94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。最终获得Foc-F/Foc-R一对最适引物，分别为Seq3和Seq4。

实施例2：细菌性软腐病菌Dickeya sp.特异引物的设计与筛选

根据可引起细菌性软腐病的Dickeya属细菌和其余多个属细菌的gyrB基因序列设计引物，包括Dickeya sp.MS1(Genbank登录号：JQ284039)，Dickeyadadantii3937（Genbank登录号：NC_014500.1），Dickeya paradisiaca Ech703（Genbank登录号：CP001654.1)，Dickeya chrysanthemi NCPPB402(Genbank登录号：CM001974.1)，Dickeya dianthicola NCPPB3534(Genbank登录号：NZ_CM001840.1），胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum PC1，CP001657.1），果胶杆菌属细菌（Pectobacterium wasabiaeWPP163，CP001790.1），果腐果胶杆菌（Pectobacterium atrosepticum SCRI1043，NC_004547.2），大肠杆菌（Escherichia coli P12b，CP002291.1），灵杆菌（Serratiamarcescens WW4，CP003959.1），克氏柠檬酸杆菌（Citrobacter koseri ATCCBAA-895，CP000822.1），普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica AS9，CP002773.1），鼠柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium ICC168，NC_013716.1），宋内志贺菌（Shigella sonnei53G，NC_016822.1），阪崎肠杆菌（Cronobacter sakazakii ATCCBAA-894，CP000783.1），肠道沙门氏菌（Salmonella enterica subsp.enterica serovarHeidelberg str.B182，CP003416.1），肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae KCTC2242，CP002910.1），水生拉恩菌（Rahnella aquatilis CIP78.65，CP003244.1），志贺氏菌（Sodalis glossinidius str.'morsitans'，NC_007712.1），苏黎世克洛诺斯氏菌（Cronobacter turicensis z3032，NC_013282.2），阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae SCF1，CP002272.1）和蟑螂埃希菌（Escherichia blattae DSM4481）等（以上菌株的基因序列来源于NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）；其中香蕉细菌性软腐病菌gyrB基因序列见Seq5。使用Mega5.0进行多序列比对，在Dickeya属保守序列区域设计通用引物。也可通过以下方法获得等同的基因组差异序列：根据提供的序列设计合适的引物，PCR扩增Dickeya属的菌株[香蕉细菌性软腐病菌（Dickeya sp.MS1）（First report of a sort of banana in MainlandChina Caused by a Dickeya sp.(Pectobacterium chrysanthemi).Plant Disease.2010,94(5):640-640.），水稻细菌性软腐病菌（Dickeya sp.EC1）（First Report ofBacterial Foot Rot of Rice Caused by a Dickeya zeae in China.Plant disease，2012,96（12）：1818.），蝴蝶兰细菌性软腐病菌（Dickeya sp.PA1）（First Report ofa Soft Rot of Phalaenopsis aphrodita Caused by Dickeya dieffenbachiae in China.2012,96（5）：760.），孔雀草细菌性软腐病菌（Dickeya sp.TP1）（First Report ofBacterial Soft Rot on Tagetes patula Caused by Dickeya dieffenbachiae in China.Plant Disease,2013,97(2):282.）]，获取相应的基因组序列。

根据上述序列，应用Oligo dT6.0软件设计PCR特异引物，并优先挑选符合合适GC含量（40～60%），最优Tm值为60℃等原则的引物，并交由上海生工合成。设计的多对PCR引物经以下常规PCR反应体系筛选，选择最优的PCR产物。PCR反应体系（20μL）：10×PCR buffer(Mg²⁺)2μL，Forward primer（正向引物）和Backward primer（反向引物）（10μM）各0.4μL，dNTP(2.5mM)1.6μL，Taq酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，DNase-Free water（无DNA酶水）补足20μL。PCR反应条件是:94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。最终获得GyrB-F/GyrB-R一对最适引物，分别为Seq6和Seq7。

实施例3：香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种菌株DNA提取及特异引物鉴定

香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种菌株的菌种以孢子悬浮液-80℃保存在25%甘油中。孢子悬浮液接种至PDA试管斜面（马铃薯葡萄糖琼脂培养基），25℃培养7天，然后用5mL无菌水冲洗培养菌表面，得到孢子悬浮液，然后吸取1mL孢子悬浮液加入装有150mL PDA液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，150rpm培养3天后，3层擦镜纸过滤菌丝。

真菌DNA的提取步骤如下：

a.取菌丝，液氮研磨成细粉；

b.取数个2mL的离心管，各加0.5mL体积的粉末，然后加入800μL的FPCB solution（购自生工生物工程（上海）股份有限公司）和8μLβ-巯基乙醇，加完后立即涡旋，混匀，55℃温浴30min，其中每10min摇晃一次；

c.加氯仿800μL，摇匀，4℃12000r/min离心10min；

d.取上清液，加入等量氯仿（800μL），摇匀，4℃12000r/min离心10min；

e.取上清于1.5mL离心管中，加60%体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10min（室温），然后4℃12000r/min离心10min；

f.倒掉上清，加1mL预冷的70%（v/v）乙醇水溶液清洗，混匀，然后4℃12000r/min离心2min；

g.倒掉乙醇，4℃12000r/min再离心2min，将离心管壁上的乙醇甩掉后，用移液器将乙醇吸出，放入通风橱中风干大约5min。

h.加20μL dd H₂O，溶解DNA，-20℃保存。

以香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种菌株及其余17个对照菌株的基因组DNA为模板，以无菌水为阴性对照。PCR反应体系和扩增步骤同实施例1；扩增产物使用1.0%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测，结果见附图1。M，DL2000；1，香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株FOC1；2，香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株FOC4；其余依次为：新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum）(First report of brown spotdisease caused by Neoscytalidium dimidiatum on Hylocereus undatus in Guangdong,Chinese mainland.Plant Disease.2012,96(11):1702-1702.)，奇异根串珠霉（Thielaviopsis paradoxa(de Seynes)V.Hohnel）(Preliminary Investigation on theMain Fungal Diseases of Sugarcane in Guangxi Province of China.Plant Diseasesand Pests,2013，4(1):28-32.)，弯孢菌（Curvularia lunata）（海南岛香蕉真菌病害调查及弯孢霉的生物学特性研究.华南热带农业大学，2007），胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）（胶孢炭疽菌的种内遗传多样性研究.菌物系统，2003，22（1）：50-55），鞘锈菌（Coleosporium plumeriae）（First report ofplumeria rust disease caused by Coleosporium plumeriae in Taiwan.PlantPathology，2006,55（2）：306.），链格孢（Alternaria alternata）（昆明美人蕉黑斑病菌——链格孢Alternaria alternata.菌物学报，2012,31(4):645-647.），奇异长喙壳菌（Ceratocystis paradoxa（Dade）Moreau）（椰子茎泻血病菌生物学特性研究.热带作物学报，2011,32（6）:1122-1127.），博宁刺盘孢（Colletotrichumboninense）（荔枝叶部真菌病害鉴定.中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会论文摘要集），烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）(First Report ofPineapple Heart Rot Caused by Phytophthora nicotianae in Hainan Province,China.Plant Disease.2013,97(4):560-560.)，芒果球座菌（Guignar diamangiferae），荔枝球腔菌（Mycosphaerella litchii），粉孢（Oidium sp.），龙眼壳二胞（Ascochytalongan），广生茎点霉（Phomaomnivirens Aveskamp）（荔枝叶部真菌病害鉴定.中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会论文摘要集），掌状拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis palmarum），喙状凸脐蠕孢菌（Exserohilum rostratum）（海南菠萝几种叶部真菌病害研究.西南农业学报，2012（5）：1703-1707.），阿南德氏链霉菌（Streptomyces anandii）（链霉菌4138杀虫成分及对甜菜夜蛾的毒力测定.中国生物防治，2008,24（2）：163-167.）；N，无菌水阴性对照。由图1可见，香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株和香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株分别可扩增636bp和796bp特异条带，但其余菌株和阴性对照则无扩增，表明所筛选的引物具有高度特异性，可用于香蕉枯萎病菌不同生理1号、4号生理小种的鉴定。

实施例4：细菌性软腐病菌DNA提取及特异引物鉴定

取甘油冻存（-80℃)的细菌菌株Dickeya sp.MS1（First report of a sort ofbanana in Mainland China Caused by a Dickeya sp.(Pectobacterium chrysanthemi).Plant Disease.2010,94(5):640-640.）分别接种到LB（酵母浸出粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1000mL）平板上，划线培养；挑取单菌落于液体LB培养基中培养，180rpm，30℃（大肠杆菌E.coli DH5a于37℃；大肠杆菌E.coli DH5a购自天根生化科技（北京）有限公司）培养16h。细菌基因组DNA提取使用TIANamp细菌基因组提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司），按照试剂盒提供的步骤提取DNA。

以香蕉细菌性软腐病菌，水稻细菌性软腐病菌，蝴蝶兰细菌性软腐病菌、孔雀草细菌性软腐病菌和对照的其他属的细菌菌株DNA为模板，以无菌水为阴性对照，进行引物特异性检测。PCR反应体系和扩增步骤同实施例2；取PCR扩增产物5μL，与2μL6×Loading Buffer混匀后，加样于1.0%（w/v）琼脂糖凝胶上样孔中，用1×TAE缓冲液在100V电压条件下电泳30min，于凝胶成像系统下拍照观察，结果见附图2。M，DL2000；1，香蕉细菌性软腐病菌（Dickeyasp.MS1）；2，水稻细菌性软腐病菌（Dickeya sp.EC1）；3，蝴蝶兰细菌性软腐病菌（Dickeya sp.PA1）；4，孔雀草细菌性软腐病菌（Dickeya sp.TP1）；其余依次为：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorum subsp.Carotovorum）（First Report of Bacterial Soft Rot of Potato Caused byPectobacterium carotovorum subsp.carotovorum in Guangdong Province of China.Plant Disease,2012,96(12):1819.)、野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）(野油菜黄单胞菌产胶基因GumD克隆与重组质粒的构建.食品科学，2006,27（11）：182-184.)，大肠杆菌DH5a（Escherichia coli DH5a）（购自天根生化科技（北京）有限公司），梨火疫病菌（Erwinia amylovora），白叶枯病菌（Xanthomonasoryze pv.oryze）(香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光PCR检测方法的建立.华南热带农业大学学报，2005,11（1）：1-5)，水稻细菌性条斑菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）（水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的实时荧光快速检测鉴定.微生物学报，2003,43（5）：626-637.），玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartiisubsp.stewartii），烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum race1）(香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光PCR检测方法的建立.华南热带农业大学学报，2005,11（1）：1-5.)，恶臭假单孢杆菌（Pseudomonas putida）（荧光假单胞杆菌对板栗疫病的控制效果.惠州学院学报(自然科学版)，2009，29（3）：17-23.），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（购自北京北纳创联生物技术研究院），丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv.syringae），菜豆枯萎病菌（Curtobacteriumflaccumfaciens pv.flaccumfaciens）（香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光PCR检测方法的建立.华南热带农业大学学报，2005,11（1）：1-5），霍氏肠杆菌（Enterobacterhormaechei）（高效纤维素降解细菌的分离鉴定及酶学特性，江苏农业科学，2013，41（3）：305-309.），嗜麦寡养食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）（一株琼胶酶产生菌的筛选与鉴定.中国农学通报，2013,29(21):88-91.）和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）（购自北京北纳创联生物技术研究院）；N，无菌水阴性对照。结果表明只有细菌性软腐病菌（Dickeya sp.）能扩展出大小为218bp的条带，说明设计的检测引物GyrB-F/GyrB-R具有良好的特异性。

实施例5：香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种及细菌性软腐病菌多重检测体系对病原菌的检测

以分离得到的香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种菌株、香蕉细菌性软腐病菌和蝴蝶兰细菌性软腐病菌为模板，使用香蕉枯萎病菌上游特异引物Foc-F（5'-TTCGGCGATAACTTCAATGTCA-3'），下游特异引物Foc-R（5'-TGGGTTGCGGATTCGCTATT-3'），细菌性软腐病菌上游特异引物GyrB-F（5'-AATACGACATTCTGGCTAAGCG-3'）和下游特异引物GyrB-R（5'-GATTTCCACGCCGATATTGTCT-3'），进行多重PCR扩增反应；以无菌水为阴性对照。多重PCR扩增反应体系（20μL）：DNA模板1μL，10×PCR buffer(Mg²⁺)2μL，dNTP(2.5mM)1.6μL，4个引物(10μM)各0.3μL，Taq酶（5U/μL）0.2μL，ddH₂O补足至20μL；反应条件为94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。使用1.0%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果见附图3；图中，M，DL2000；1，FOC1；2，FOC4；3，Dickeya sp.MS1；4，Dickeya sp.PA1；5，FOC1+Dickeya sp.MS1；6，FOC1+Dickeya sp.PA1；7，FOC4+Dickeya sp.MS1；8，FOC4+Dickeya sp.PA1；N，阴性对照。结果表明，1号PCR产物呈现636bp条带时，即样本为香蕉枯萎病菌1号生理小种病原菌；2号PCR产物呈现796bp条带时，即样本为香蕉枯萎病菌4号生理小种病原菌；3号和4号PCR产物呈现218bp条带时，即样本为细菌性软腐病原菌；5号和6号PCR产物呈现636bp和218bp复合条带；7号和8号PCR产物呈现796bp和218bp复合条带；阴性对照则无扩增。

实施例6：多重检测体系对香蕉枯萎病、细菌性软腐病和复合感染的患病组织的检测

在2012年8月至2013年12月，在广东省香蕉种植区进行调查，如广州市番禺区、东莞市麻涌镇、惠州市博罗县、阳江市等，采集疑似病株样本。

用自来水把染病茎部组织上的杂质冲洗干净，选取病健交界组织，切成约小块，并用70％酒精消毒30s。DNA提取参照CTAB法，具体如下：取适量上述近地面假茎组织，在研钵中加入液氮充分研磨至粉状，加2×CTAB800μL，加热至65℃，30min；加入800μL的氯仿：异戊醇（体积比：24:1），充分混匀，12000rpm离心10min；小心吸取上清；重复加入等体积（800μL）氯仿：异戊醇（体积比：24:1），充分混匀，12000rpm离心10min；取上清液，加入等体积（800μL）的无水乙醇，立刻轻柔混匀，-20℃放置20min；12000rpm离心10min，得到沉淀；70%（v/v）乙醇水溶液清洗沉淀两遍；室温晾干，加入无菌水溶解，置于-20℃保存备用，用于下一步检测。健康香蕉植株基因组DNA按同样的方法（CTAB法）制备与保存。

以上述地点的香蕉病株组织DNA为模板，香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种菌株、香蕉细菌性软腐病菌作为阳性对照，无菌水作为阴性对照，采用多重检测体系进行检测鉴定。PCR反应体系同实施例5。PCR反应结束后，取4μL PCR产物用1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图4。M，DL2000；1，FOC1；2，FOC4；3，Dickeya sp.MS1；4，Dickeya sp.PA1；5，惠州病株；6，东莞病株；7，8，惠州博罗病株；9-13，阳江病株；N，阴性对照。结果表明，4个阳性对照均呈现相应的特异条带，阴性对照无扩增；5号惠州病株扩增出FOC1对应的特异条带（636bp），6号东莞病株扩增出FOC1对应的特异条带（796bp），7号和8号博罗样品则扩增出Dickeya sp.MS1相应的特异条带（218bp）；9号至13号阳江病株则扩增出636bp和218bp的复合条带，表明该地区的病株受到香蕉枯萎病菌1号生理小种和细菌性软腐病菌复合侵染。

利用本发明得到的检测结果与香蕉枯萎病、细菌性软腐的病害调查结果基本一致，这表明本发明所述方法具有较高的可行性。同时，将以上的病株进行病原菌分离，选取香蕉假茎的病健交界处进行病原菌分离，采用传统的组织分离法。将分离得到的病原菌按照相应方法进行培养后，提取病原菌DNA。以该DNA为模板，使用真菌ITS保守引物ITS4和ITS5，细菌16S rDNA特异引物27f和1492r，扩增相应的保守基因序列，测序并进行BLAST比对。序列分析结果表明，所有引起植株发病的病原菌均与PCR检测的阳性结果一致。

实施例7：多重检测体系灵敏度鉴定

取28℃，150rpm培养3天后的香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种菌株的菌丝0.1g，分别提取基因组DNA，溶解于100μL无菌水中，即每1μL DNA模板代表1mg真菌菌丝；DNA提取办法参照实施例3。提取的DNA依次10倍浓度稀释，共稀释9个浓度，即10¹×，10²×，10³×，10⁴×、10⁵×、10⁶×、10⁷×、10⁸×、10⁹×。以上述10个不同浓度的DNA为模板，PCR反应体系同实施例5。PCR反应结束后，取4μL PCR产物用1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图5。结果表明显示香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种菌株DNA的检测灵敏度一致，其10⁰～10³4个稀释浓度的DNA模板均有相应的扩增带，10⁴～10⁹倍浓度稀释的模板及阴性对照等均没有扩增，即该多重检测体系的检测范围为1mg到1μg的菌丝，表明该多重检测体系可检测到的含量下限为lμg，也说明该检测引物对香蕉枯萎病菌病原菌具有比较高的检测灵敏度。

取32℃摇床培养的香蕉细菌性软腐病病原菌菌悬液（10⁸CFU/mL)，取1mL菌液提取基因组DNA，步骤同实施例4。提取的DNA依次稀释10倍，稀释9个浓度，即10¹×，10²×，10³×，10⁴×、10⁵×、10⁶×、10⁷×、10⁸×、10⁹×。以上述10个不同浓度的DNA为模板，PCR反应体系同实施例5。PCR反应结束后，取4μLPCR产物用1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图6。结果表明显示10⁰～10⁵6个稀释浓度的DNA模板均有相应的扩增带，10⁶～10⁹倍浓度稀释的模板及阴性对照等均没有扩增，表明该多重检测体系可检测到的细菌含量下限为10³CFU/mL，也说明该检测引物对香蕉细菌性软腐病菌病原菌具有比较高的检测灵敏度。

实施例8多重检测体系对含菌土壤的检测

在28℃，150rpm条件下培养香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种菌株3天，32℃，150rpm条件下培养香蕉细菌性软腐病病原菌菌悬液至浓度为10⁸CFU/mL。称取7份3.0g灭菌土，分别加入0.1g香蕉枯萎病菌1号生理小种菌丝，0.1g香蕉枯萎病菌4号生理小种菌丝，0.1mL香蕉细菌性软腐病病原菌菌悬液（10⁸CFU/mL），0.1g香蕉枯萎病菌1号生理小种菌丝+0.1mL香蕉细菌性软腐病病原菌菌悬液，0.1g香蕉枯萎病菌4号生理小种菌丝+0.1mL香蕉细菌性软腐病病原菌菌悬液，0.1g香蕉枯萎病菌1号生理小种菌丝+0.1g香蕉枯萎病菌4号生理小种菌丝，0.1mL无菌水，各自混匀。准确称量0.3～0.5g的新鲜土到干净的离心管中，并使用土壤基因组DNA快速提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司，离心柱型，DP4001）。具体提取步骤如下：

a.加入1mL的抽提液，加入10μL的蛋白酶K和50μL的溶菌酶，涡旋1～2分钟，充分混匀后37℃水浴15分钟（每隔2～3分钟剧烈震荡混匀）。

b.加入100μL溶液B，涡旋1～2分钟，充分混匀后65℃水浴10分钟（每隔2～3分钟剧烈震荡混匀）。

c.10,000rpm离心10分钟取上清至新的1.5mL离心管。

d.加入1/3体积的蛋白沉淀液，充分颠倒混匀。

e.冰浴8分钟，13,000rpm离心10分钟取上清。

f.纯化柱的处理：在纯化柱中间加入500μL的溶液C，静置1分钟，10,000rpm离心过滤30s，弃滤液。此步是为了增加柱子过滤杂质及腐殖酸的能力。

g.将步骤e得到的上清液加入到处理过的纯化柱中，低速离心（4000rpm）过滤，收集下滤液（下滤液含有DNA）至新的1.5mL离心管中。

h.准确估计下滤液的体积，加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，13,000rpm离心10分钟，小心倒掉上层悬液；用70%（v/v）乙醇水溶液洗涤沉淀两次，倒扣离心管晾干，最后用100μL洗脱缓冲液EB溶解沉淀即可。

以土壤分离得到的DNA为模板，使用香蕉枯萎病菌上游特异引物Foc-F，下游特异引物Foc-R，细菌性软腐病菌上游特异引物GyrB-F和下游特异引物GyrB-R，进行多重PCR扩增反应；设无菌水为阴性对照。多重PCR扩增反应体系及扩增程序参照实施例5。使用1.0%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果见附图7；图中，M，DL2000；1，FOC1阳性对照；2，FOC4阳性对照；3，Dickeya sp.MS1阳性对照；4，拌FOC1土壤；5，拌FOC4土壤；6，拌Dickeyasp.MS1土壤；7，拌FOC1+Dickeya sp.MS1土壤；8，拌FOC4+Dickeya sp.MS1土壤；9，拌FOC1+FOC4；10，灭菌土对照；N，无菌水阴性对照。结果表明，阳性对照中，1号PCR产物呈现636bp条带时，符合香蕉枯萎病菌1号生理小种病原菌目的条带；2号PCR产物呈现796bp条带时，符合香蕉枯萎病菌4号生理小种病原菌目的条带；3号PCR产物呈现218bp条带时，符合细菌性软腐病原菌目的条带。在拌菌土壤检测中，4号至6号PCR产物分别呈现636bp，796bp和218bp条带，均符合相应的菌株的目的条带；7号至9号PCR产物则分别呈现636bp和218bp复合条带，796bp和218bp复合条带，636bp和796bp复合条带，同样符合土壤所拌菌株的目的条带；1号和11号则无扩增产物，表明灭菌土和阴性对照无效扩增。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提供两对检测引物，如下所示：

香蕉枯萎病菌上游特异引物Foc-F：5'-TTCGGCGATAACTTCAATGTCA-3'；

香蕉枯萎病菌下游特异引物Foc-R：5'-TGGGTTGCGGATTCGCTATT-3'；

细菌性软腐病菌上游特异引物GyrB-F：5'-AATACGACATTCTGGCTAAGCG-3'；

细菌性软腐病菌下游特异引物GyrB-R：5'-GATTTCCACGCCGATATTGTCT-3'；

(2)对样本进行处理，抽提样本DNA；

(3)以样本DNA为模板，使用香蕉枯萎病菌上游、下游特异引物和细菌性软腐病菌上游、下游特异引物进行多重PCR扩增反应；

(4)将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测；当PCR产物呈现636bp条带时，即样本中含有香蕉枯萎病菌1号生理小种病原菌；当PCR产物呈现796bp条带时，即样本中含有香蕉枯萎病菌4号生理小种病原菌；当PCR产物呈现218bp条带时，即样本中含有细菌性软腐病原菌。

2.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的样本为香蕉病原菌时，所述处理的方式为利用FPCB solution抽提培养过滤后的真菌菌丝的DNA；利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA。

3.根据权利要求2所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：所述的过滤为用擦镜纸或滤纸进行过滤。

4.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的样本为香蕉植株组织时，所述处理的方式为利用CTAB法抽提香蕉植株组织中的DNA。

5.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的样本为土壤时，所述处理的方式为使用土壤基因组DNA快速提取试剂盒提取疑感染的土壤DNA。

6.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：步骤(3)所述的多重PCR扩增反应的反应条件为94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。

7.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：

步骤(3)所述的多重PCR扩增反应的体系20μL如下：DNA模板1μL，含Mg²⁺的10×PCR buffer 2μL，2.5mM的dNTP 1.6μL，10μM的Foc-F 0.3μL，10μM的Foc-R 0.3μL，10μM的GyrB-F 0.3μL，10μM的GyrB-R 0.3μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，ddH₂O 14μL，共20μL。

8.权利要求1～7任一项所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法在检测香蕉枯萎病菌和香蕉细菌性软腐病菌上的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法应用于香蕉种苗检疫、土壤病原菌检测、田间香蕉病害的早期诊断以及病菌的监测和鉴定。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法应用于香蕉患病组织的检测，患病组织上直接分离的病原真菌或细菌的鉴定及检测，土壤中香蕉枯萎病菌不同生理小种、细菌性软腐病菌的检测。