CN101205558A

CN101205558A - 香蕉枯萎病菌分子检测基因及其检测方法

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Publication number: CN101205558A
Application number: CNA2006101353612A
Authority: CN
Inventors: 陈庆河; 翁启勇; 赵健; 李本金; 兰成忠; 邱荣洲; 吕新
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2008-06-25
Anticipated expiration: 2026-12-22
Also published as: CN101205558B

Abstract

本发明公开了一种香蕉枯萎病菌分子检测基因及其检测方法，专用于香蕉枯萎病高灵敏度快速分子检测。检测基因为香蕉枯萎病菌特异的404bp序列，在Genbank数据库未发现同源序列。设计了一对引物FOC－F/FOC－R，其在香蕉枯萎病菌纯DNA、带菌的发病组织及土壤上特异性地扩增出364bp的特异扩增产物。所发明的检测基因及引物可被用于生产实践中香蕉发病组织和土壤中香蕉枯萎病菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间香蕉枯萎病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

Description

香蕉枯萎病菌分子检测基因及其检测方法

所属技术领域：

本发明涉及一种香蕉枯萎病菌分子检测基因及其检测方法，专用于香蕉枯萎病菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间香蕉枯萎病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害防治和植物检疫技术的领域。

背景技术：

香蕉枯萎病由尖镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起，是我国的三类检疫性病害。1904年在美国夏威夷首次报道发现该病害，1910年在巴拿马因该病造成重大损失。目前该病害广泛分布世界产香蕉国家(Stover，R.H. 1962.Fusarial Wilt(PanamaDisease)of Bananas and Other Musa Species.CMI，Kew，Surrey，UK；Koening et al.Fusariumoxysporum f.sp.Cubense consists of a small number of divergent and globally distributed clonallineage.Phytopathology，1997，87：915-923)。我国大陆于1960年在广西的西贡蕉上首先发现该病，为我国进口检疫对象(高乔婉.香蕉枯萎病.中国农业百科全书植物病理学卷.北京：中国农业出版社，1996，p.482-483)。该病初侵染源来自病株及带菌土壤，病原菌的孢子在土壤中可存活8-10年。该病远距离传播主要通过种苗、带菌的土壤和流水。据报道该病菌1号小种和4号小种对生产造成严重危害。1号小种只发现为害粉蕉，在我国分布较广；4号小种能为害香蕉和粉蕉，分布于台湾和广东。香蕉枯萎病是香蕉的一种毁灭性病害，具有很强的传染性，一旦扩散蔓延则难以控制。据报道台湾香蕉因4号小种危害，不到10年时间几乎摧毁了台湾的香蕉产业(Su HJ et al. Fusarial wilt of Cavendish bananas in Taiwan.PlantDisease，1986，70：814-818)，虽经多年研究和治理，至今每年因枯萎病造成香蕉产量严重损失。广州市番禺地区、中山市也发生香蕉枯萎病，据统计发病面积5000多亩，该病菌与台湾香蕉研究所报道的是一致，鉴定12个菌株均属生理小种4号，近来在福建也发现香蕉枯萎病(林时迟等。福建省香蕉枯萎病鉴定。福建农业大学学报，2000，29(4)：465～469)。目前，香蕉枯萎病仍为害我国香蕉生产，并且有继续扩展蔓延的态势，香蕉枯萎病对我国香蕉产业已构成重大威胁。

目前，防治香蕉枯萎病的方法主要是综合治理：加强检疫，严防带病种苗进入无疫区；推广种植无病组培苗；定期检查蕉园，发现零星病株应及时清除销毁，并撒施石灰或尿素处理土壤；种植抗病和耐病的香蕉品种；重病区则应轮作其它作物如水稻、花生、甘蔗等经济作物。该病害的检疫检测技术是以往研究中的薄弱环节，因此，国内外目前仍无十分有效的办法控制香蕉枯萎病扩散蔓延为害，同时，无病种苗生产基地的建设对于无疫区农作物，尤其是果树等多年生作物香蕉枯萎病的防治至关重要，植物检疫措施不仅可及时堵截国外病原菌的传入，而且也是确保国内经济作物安全出口的必要手段。

香蕉枯萎病是一种毁灭性病害，一旦进入无发病的地区则无法根除，而其抗病育种又极其困难，所以为了防止香蕉枯萎病从疫区传入非疫区，建立一套稳定、可靠、简便、快速、灵敏的分子检测方法对香蕉苗及种植地区土壤进行检疫、监测是非常必要的。在以往的有害病菌检测方面，我国科研人员主要采取传统的植物病原检测技术，传统的检测方法是依据症状、形态，在培养基上直接分离培养，然后在室内通过形态学和生理学性状特征鉴定，再结合致病性测定(Sun E J et al.ldentification of Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4 from soil orhost tissue by cultural characters.Phytopathology.1978，68：1672-1673)，这种检测方法耗时较长，且必须拥有病原菌详细的分类资料，鉴定时还受到其他因子的干扰，如种内不同菌株间生物学性状变异较大，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，满足不了病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求。现在部分病原菌免疫血清学鉴定方法已经建立，但是特异性较差，常常受到相似种的干扰，也受到抗血清质量的影响，血清学检测结果的准确性取决于抗血清的质量。单克隆抗体的专化性太强，主要用于流行学中检测菌系，通常将多种单克隆抗体混合使用，以消除过度专化的问题(Linfield.A rapid serological test fDr detecting Fusarium oxysporumf.sp.narcissi in Narcissus.Annals ofApplied Biology.1993，123，685-93)。目前认为在检测应用方面，多克隆抗体要优于单抗，而多克隆抗体又易与亲缘关系相近的细菌发生交叉反应。因此，常规的血清学方法的应用受到了一定的限制。另一种检测方法是种内特异性寡核苷酸探针检测法，尽管一些非放射性探针可取代放射性探针，但是杂交检测法耗时较长且比较昂贵。

近年来国内外在植物病原菌快速分子检测方面进行了较为深入的研究，取得了一定的进展，尤其是多聚酶链式反应(PCR)技术，在植物病原检测中的应用日臻完善，专化性引物PCR技术甚至不需要纯培养，可直接从样品浸提液中对靶标病原物进行特异性扩增(Zhang ZGet al.Molecular detection of Fusanum oxysporum f.sp.niveum and Mycospherella melonis in infectedplant tissues and soil.FEMS Microbiology Letters.2005，249：39-47；Henson，JM.and French R.Thepolymerase chain reaction and plant disease diagnose.1993，Ann.Rev.Phytopathol.31：81-109.)。植物病原生物的分子检测技术(以PCR技术为平台)是当前该领域的发展方向，许多重要病原生物都已经建立了分子检测技术，越来越多的分子检测试剂盒已经或正在被研制。我国虽然在植物病原生物分子检测技术方面起步较晚，但目前也研制出了许多用于植物病原生物检测的技术，尤其是一些拥有自主知识产权的检测方法，并将之投入到商业生产和应用中。但在香蕉枯萎病菌检测方面我国至今还未见有分子检测技术的系统研究，更没有相关检测试剂盒的研制和推广。

鉴于以上原因，我们通过大量分析香蕉枯萎病菌及其它镰刀菌的指纹图谱多态性，针对香蕉枯萎病菌的特异基因设计出了一对特异性引物，可用于带香蕉枯萎病菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，对于确保我国香蕉无病种苗生产基地的建设、安全出口，同时及时堵截国外危险性带枯萎病香蕉传入我国具有十分重要的意义。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术中香蕉枯萎病菌的生物学检测方法所需周期长、特异性差，灵敏度低的问题，提供一种香蕉枯萎病菌的特异分子检测基因以及结果可靠、易于操作、灵敏度高的香蕉枯萎病菌的快速检测诊断的方法。该方法可以试剂盒的形式直接应用于生产实践，可用于带菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，对于确保我国香蕉无病种苗生产基地的建设、安全出口，同时及时堵截国外危险性带枯萎病香蕉传入我国具有十分重要的意义。

本发明的目的是这样实现的，(1)本发明所述的香蕉枯萎病菌的检测基因，其特征在于在Genbank数据库中未发现同源序列，为香蕉枯萎病菌的特异基因，序列如下：

10 20 30 40 50

| | | | |

1 TGCCGAGCTG AGTATAAAGA CTTTACTGAT GTACATATGA ATGACTCGTG

51 GCACGGTACT TGCTGTGCGG GGATCATCCA GGGGATGTAT GAGGAGGCTA

101 GGCTATACAT CGCAAGGGTC TTTGAACGGG ACCACGCGGA TGAGATTGAA

151 GGACCTCTTC GAATGGCAAG AGTCTGTTTC CGATACCTGT GAAGTCGCAG

201 TTTATACTGA ATGTTCAATT AGGCTATTCA CTGGGCTATT GAGCCACCGC

251 GCTCCGTCGA CATCATCAGC ATCTCCGCTG GCTTCCGAAA CTACTCCAAG

301 GAACTAGACG ACGCTGTCAC AAGAGCCAAA GCTTCTGGTG TTCTTGTCAT

351 AGCTGCAGCG TCAAACTGGC AGAACAAAAA TACCGTCGCA TTCCCAGCTC

401 GGCA

(2)本发明所述的香蕉枯萎病菌的检测基因，又叫高效特异扩增序列，其序列特异扩增区域的PCR引物，即分子检测引物的序列为：

FOC-F：5’-ATA TGA ATG ACT CGT GGC ACG-3’

FOC-R：5’-GCT GGG AAT GCG ACG GTA T-3’

(3)本发明所述的香蕉枯萎病菌的检测方法，包括如下：

1)从被所述香蕉枯萎病菌感染的香蕉植株组织中或存在香蕉枯萎病菌的土壤样品中分离DNA；

2)以该DNA为模板用上述(2)中所述的一对引物FOC-F/FOC-R通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出上述(1)所述的香蕉枯萎病菌的特异基因产物；

3)然后取适量步骤2)的PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出364bp产物时，即可判断所述的香蕉植株组织或土壤样品中存在香蕉枯萎病菌；否则所述的香蕉植株组织或土壤样品中未存在香蕉枯萎病菌。

①当用于检测香蕉植株组织中存在香蕉枯萎病菌时，采用CTAB法提取香蕉枯萎病菌的DNA，按如下的PCR反应体系和反应条件用所设计的引物FOC-F/FOC-R进行PCR扩增，PCR反应体系具体可用如下：

PCR反应体系25μl，包括1倍PCR反应缓冲液，1.5mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，1.5UTaq DNA聚合酶，引物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec共30个循环；72℃延伸10min。

然后将8μl PCR产物用1.5％琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。

②当在土壤样品中存在香蕉枯萎病菌条件下，采用土壤DNA提取法(步骤见具体实施例3)提取土壤中香蕉枯萎病菌的DNA，按如下的PCR反应体系和反应条件用所设计的引物进行PCR扩增，

(4)本发明的香蕉枯萎病菌分子检测基因的制备方法，包括：1)采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA；2)CTAB法提取各种供试菌株基因组DNA后，应用随机引物进行RAPD分析筛选，筛选得到一条RAPD随机引物，序列为：5’TGCCGAGCTG-3’，使用筛选出的随机引物5’-TGCCGAGCTG-3’再次对供试菌株基因DNA进行RAPD分析，得到1条香蕉枯萎病菌特异的RAPD片段；3)使用切胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收香蕉枯萎病菌特异的RAPD片段，连接到载体上，通过适宜温度热击后，转化到感受态细胞中，待细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因后，在加有含有氨苄青霉素Amp、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷的LB平板上筛选阳性白斑；4)挑取转化子白斑的阳性克隆，采用质粒抽提试剂盒提取质粒DNA，用内切酶EcoRI和HindIII双酶切检测证实所克隆片段确实为香蕉枯萎病菌特异性的DNA片段；5)进行DNA的测序，得到香蕉枯萎病菌特异基因序列。

本发明的香蕉枯萎病菌分子检测基因的制备方法具体如下：

本发明的关键性技术是香蕉枯萎病菌的高效特异扩增的序列(检测基因)及其序列特异扩增区域(sequence characterized amplified region，SCAR)的PCR引物。为了发现香蕉枯萎病菌的特异基因和设计这些SCAR引物，本发明以我国3省(福建、广东和海南，此3省为我国香蕉枯萎病分布区)14株香蕉枯萎病菌和多种尖孢镰刀菌不同专化型、多种不同的镰刀菌种以及香蕉植株上常见的几种病原真菌为供试材料(具体菌株见表1)，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，所述的菌丝粉选自表1中的任一种菌株制成的菌丝粉，加入900μl 2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(提取液的配方为：2％CTAB；100mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，PH 8.0；20mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，pH8.0；1.4mol/L NaCl)和90μl 10％SDS(十二烷基苯磺酸钠)后混匀，于55～60℃水浴1.5h，每10min振荡混匀一次，水浴1.5h后离心(12,000rpm)15min，取上清液加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1)，离心(12,000rpm)5min，取上清液(水相)，加入与上清液等体积的氯仿抽提一次(12,000rpm)离心5min，吸上清(350μl)，加0.1体积(35μl)的3mol/L NaAC溶液和2体积(700μl)的冰无水乙醇，-20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液，加入700μl冰70％乙醇进行洗涤(稍离心，倾掉上清)，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE(10mmol/L Tris-HCL，0.1mmol/L EDTA，pH8.0)溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用。

经上述方法提取表1中各种供试菌株基因组DNA后，应用随机引物进行RAPD分析筛选，筛选得到一条RAPD随机引物(序列为：5’-TGCCGAGCTG-3’)，使用筛选出的随机引物5’-TGCCGAGCTG-3’再次对供试菌株基因DNA进行RAPD分析，得到1条香蕉枯萎病菌特异的RAPD片段，使用UNIQ-10柱式切胶回收试剂盒(上海Sangon公司出品)从琼脂糖凝胶中回收香蕉枯萎病菌特异的RAPD片段(具体切胶回收方法参照UNIQ-10柱式切胶回收试剂盒说明书)，连接到pMD18-T vector载体(日本KAKARA公司，具体连接方法参照pMD18-T vector载体说明书)上，通过42℃热击90Sec，转化到E.coli DH5a(大肠杆菌)的感受态细胞中(感受态细胞购于日本TAKARA公司)，待细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp+)后，在加有Amp/IPTG/X-gal(Amp：氨苄青霉素；IPTG：异丙基硫代-β-D-半乳糖苷；X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)的LB(LB培养基的配方：酵母膏5.0g；蛋白胨10.0g；氯化钠10.0g；蒸馏水1000ml；琼脂20.0g；pH7.0)平板上筛选阳性白班，挑取转化子白斑的阳性克隆，采用H1-1-3质粒抽提试剂盒(上海Sangon公司出品)提取质粒DNA，用内切酶EcoRI和HindIII双酶切检测证实所克隆片段确实为香蕉枯萎病菌特异性的DNA片段，并委托TaKaRa公司进行DNA的测序，得到香蕉枯萎病菌特异基因序列。在香蕉枯萎病菌特异DNA片段序列的基础上应用Primer premier 5.0软件设计SCAR引物，经对供试菌株和福建、海南、广东等3个中国发生香蕉枯萎病地区50株香蕉枯萎病菌的特异性进行PCR验证(具体的反应体系是PCR反应体系25μl，包括1倍PCR反应缓冲液，1.5mMMgCl₂，0.2mM dNTPs，1.5U Taq DNA聚合酶，引物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec共30个循环；72℃延伸10min)，最后确定了1对高效扩增的序列特异扩增区域SCAR引物，此序列特异扩增区域引物在香蕉枯萎病菌上特异性地扩增出364bp的产物。这说明该引物可被用于生产实践中发病植物组织和土样中香蕉枯萎病菌快速可靠的检测和鉴定。

表1供试菌株

Table 1 Tested strains

注：序号1-14为香蕉枯萎病病原菌：CGMCC为中国普通微生物菌种保藏中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)。

本发明有益效果：本发明方法适用于土样和植物组织中香蕉枯萎病菌的快速可靠的检测和鉴定(具体检测结果见表2)，对于农业生产和植物检疫领域中香蕉枯萎病的防治和检疫措施的有效实施具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1)结果可靠：本发明方法已经对源于中国发生香蕉枯萎病的福建、海南、广东等地的香蕉枯萎病菌和带香蕉枯萎病菌的土样、植物组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；

2)实用性好：本发明所设计出的一对特异性引物，可用于带香蕉枯萎病菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，同时也可用于我国香蕉无病种苗生产基地的建设、安全出口，还可用于海关检疫口岸对香蕉枯萎病菌的检测，及时堵截国外危险性带枯萎病菌香蕉传入我国；

3)操作简便快速：应用本发明方法，对带香蕉枯萎病菌的土样和植物组织进行病菌DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程可在12小时内完成；

4)检测灵敏度高：应用本发明所设计的SCAR引物的扩增灵敏度达到10fg，因此本方法的实用性强，可满足对带菌土壤和发病植物组织中存在的香蕉枯萎病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要。

表2验证引物对香蕉枯萎病菌特异性所用菌株、样本及PCR检测结果

Table2 Specificity of primers in detecting Fusarium oxysporumf.sp.cubense fromdifferent strains and samples by PCR

注：序号1-14为香蕉枯萎病病原菌；CGMCC为中国普通微生物菌种保藏中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)；+表示能特异性地扩增出序列为364bp的DNA片段；-表示未能特异性地扩增出序列为364bp的DNA片段；S表示具有特异性；NS表示无特异性。

附图说明：

图1为本发明所要检测的香蕉枯萎病菌的特异PCR扩增图。

图中：M为100bp ladder分子量marker，1泳道为阴性对照，2-10泳道为尖镰孢古巴专化型(香蕉枯萎病菌)，11泳道为尖镰孢黄瓜专化型，12泳道为尖镰孢茄专化型，13泳道为豌豆腐皮镰孢，14泳道为稻瘟病菌，15泳道为致病疫霉菌。

图2为本发明香蕉枯萎病菌的灵敏性检测及巢式PCR扩增结果图。

图中：M为100bp ladder分子量marker，1泳道为1μg，2泳道为500ng，3泳道为100ng，4泳道为10ng，5泳道为1ng，6泳道为100pg，7泳道为10pg，8泳道为1pg，9泳道为100fg，10泳道为10fg，11泳道为阴性对照。

图3为本发明香蕉发病组织和带菌土壤的检测结果图。

图中：M为100bp ladder分子量marker，1泳道为阳性对照，2泳道为阴性对照，3泳道为发病的香蕉组织，4泳道为发病土壤，5泳道为健康香蕉组织，6泳道为健康香蕉组织用真核通用引物ITS1和ITS4扩增。

具体实施方式：

本发明的技术内容包括香蕉枯萎病菌的特异检测基因和特异检测引物，所设计的引物及其序列为：FOC-F：5’-ATA TGA ATG ACT CGT GGC ACG-3’，FOC-R：5’-GCT GGGAAT GCG ACG GTA T-3’。利用该引物可从香蕉枯萎菌株上特异扩增出364bp的产物。

实施例1

香蕉枯萎病菌的特异引物FOC-F/FOC-R的PCR扩增。

香蕉枯萎病菌检测基因的检测试剂盒，包括以下成分：

其特异引物及其序列为：

FOC-F：5’-ATA TGA ATG ACT CGT GGC ACG-3’

FOC-R：5’-GCT GGG AAT GCG ACG GTA T-3’

其试剂盒PCR反应体系25μl，包括1倍PCR反应缓冲液，1.5mM MgCl₂，0.2mMdNTPs，1.5U Taq DNA聚合酶，引物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec共30个循环；72℃延伸10min。

检测的特异性：除了来自我国枯萎病发生地海南、广东和福建等省份的香蕉枯萎菌株可特异地扩增出364bp的产物外，检测了Fusarium oxysporum的非古巴专化型、其它镰刀菌Fusarium spp及其它的真菌和细菌等菌株，均未能扩增出任何产物。

检测的灵敏性：用不同浓度的香蕉枯萎病菌DNA进行灵敏性检测，最低的检测率为10fg的纯DNA。灵敏性检测巢式PCR，其特征在于引物及其序列为：

FOC-NF：5’-GAT GAG ATT GAA GGA CCT CTT CG-3’

FOC-NR：5’-TCT AGT TCC TTG GAG TAG TTT CGG-3’

实施例2

发病植物组织中香蕉枯萎病菌的检测。

分别取香蕉枯萎病的发病组织和人工接种发病的香蕉组织采用CTAB法提取DNA，取1μl DNA按上述试剂盒实施的方法进行PCR扩增，其试剂盒PCR反应体系25μl，包括1倍PCR反应缓冲液，1.5mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，1.5U Taq DNA聚合酶，引物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec共30个循环；72℃延伸10min。电泳检测扩增产物，结果见图3，见到一条清晰的分子量为364bp的特异条带，因而判断香蕉枯萎病的发病组织和人工接种发病的香蕉组织均感染香蕉枯萎病菌。

实施例3

发病土壤样品中香蕉枯萎病菌的检测。

1)从发病土壤样品中提取DNA：

取过筛的土壤冷冻抽干24-48h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500μl 0.4％脱脂奶粉溶液，涡旋混匀。12000rpm离心15min。取上清加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为10μg/ml蛋白酶K，55℃水浴1-3h。水浴结束后，加入1/2体积的7.5M NH₄AC溶液，上下颠倒混匀。12000rpm离心15min。吸上清加2倍体积无水乙醇-20℃沉淀(沉淀时间1.5h)。沉淀结束后，12000rpm离心15min。用70％乙醇洗涤沉淀后倾去，室温晾干。每份样品所提DNA用10μl TE(或无菌超纯水)溶解，-20℃保存备用。

2)香蕉枯萎病菌的PCR检测

取1μl DNA按试剂盒实施的方法进行PCR扩增，其试剂盒PCR反应体系25μl，包括1倍PCR反应缓冲液，1.5mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，1.5U Taq DNA聚合酶，引物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec共30个循环；72℃延伸10min。电泳检测扩增产物，结果见图3，见到一条清晰的分子量为364bp的特异条带，判断发病土壤样品侵染香蕉枯萎病菌。

实施例4

本发明对无感染香蕉枯萎病菌的香蕉植物组织和土壤样品进行同实施例2和3的实验，未发现分子量为364bp的特异性扩增条带。

从以上结果可知，对所供试的香蕉植株组织或土壤样品进行总DNA提取，使用香蕉枯萎病菌的DNA序列特异扩增区域的SCAR引物FOC-F/FOC-R进行PCR扩增，如果能特异性地扩增出364bp的产物，即可判断香蕉植株组织感染了香蕉枯萎病菌或土壤中存在了香蕉枯萎病菌。

序列表

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>香蕉枯萎病菌分子检测基因及其检测方法

<130>DNA

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>404

<212>DNA

<213>香蕉枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.)

<400>1

tgccgagctg agtataaaga ctttactgat gtacatatga atgactcgtg gcacggtact 60

tgctgtgcgg ggatcatcca ggggatgtat gaggaggcta ggctatacat cgcaagggtc 120

tttgaacggg accacgcgga tgagattgaa ggacctcttc gaatggcaag agtctgtttc 180

cgatacctgt gaagtcgcag tttatactga atgttcaatt aggctattca ctgggctatt 240

gagccaccgc gctccgtcga catcatcagc atctccgctg gcttccgaaa ctactccaag 300

gaactagacg acgctgtcac aagagccaaa gcttctggtg ttcttgtcat agctgcagcg 360

tcaaactggc agaacaaaaa taccgtcgca ttcccagctc ggca 404

Claims

1.一种香蕉枯萎病菌分子检测基因，其特征在于具有如下所述的基因序列的香蕉枯萎病菌的特异检测基因。

10 20 30 40 50

| | | | |

1 TGCCGAGCTG AGTATAAAGA CTTTACTGAT GTACATATGA ATGACTCGTG

51 GCACGGTACT TGCTGTGCGG GGATCATCCA GGGGATGTAT GAGGAGGCTA

101 GGCTATACAT CGCAAGGGTC TTTGAACGGG ACCACGCGGA TGAGATTGAA

151 GGACCTCTTC GAATGGCAAG AGTCTGTTTC CGATACCTGT GAAGTCGCAG

201 TTTATACTGA ATGTTCAATT AGGCTATTCA CTGGGCTATT GAGCCACCGC

251 GCTCCGTCGA CATCATCAGC ATCTCCGCTG GCTTCCGAAA CTACTCCAAG

301 GAACTAGACG ACGCTGTCAC AAGAGCCAAA GCTTCTGGTG TTCTTGTCAT

351 AGCTGCAGCG TCAAACTGGC AGAACAAAAA TACCGTCGCA TTCCCAGCTC

401 GGCA

2.一种香蕉枯萎病菌的检测基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为：

FOC-F：5’-ATA TGA ATG ACT CGT GGC ACG-3’；

FOC-R：5’-GCT GGG AAT GCG ACG GTA T-3’。

3.一种香蕉枯萎病菌分子检测基因的检测方法，包括：

1)从被所述的香蕉枯萎病菌、被香蕉枯萎病菌感染的香蕉组织和存在香蕉枯萎病菌的土壤中提取DNA；

2)以该DNA为模板用一对引物FOC-F/FOC-R通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出香蕉枯萎病菌的特异基因产物；

3)然后取适量步骤2)的PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出364bp的产物，即可判断所述的香蕉植株组织或土壤样品中存在了香蕉枯萎病菌。

4.根据权利要求2所述的香蕉枯萎病菌的检测基因的PCR引物，其特征在于其灵敏性检测巢式PCR的引物及其序列为：

FOC-NF：5’-GAT GAG ATT GAA GGA CCT CTT CG-3’；

FOC-NR：5’-TCT AGT TCC TTG GAG TAG TTT CGG-3’。