CN1768577A - 一种培育抗枯萎病香蕉的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育抗枯萎病香蕉的方法。本发明所提供的培育抗枯萎病香蕉的方法是用含有人溶菌酶基因或葡萄糖氧化酶基因的表达载体转化香蕉，得到抗枯萎病香蕉。本发明采用苗期盆栽伤根淋菌与大田伤根浇菌的方法鉴定转基因香蕉的枯萎病抗性，盆栽接菌60d后，对照非转基因植株表现明显的枯萎病症状，叶片脱水、黄化、下垂、假茎纵切面有紫红色斑点，维管束部分明显受害，转HL基因香蕉有24株无任何病症，转GO基因植株有31株无任何病症，抗性明显；大田病圃营养生长期伤根浇菌后，经过全生育期观察，有2株转HL基因香蕉和2株转GO基因香蕉枯萎病抗性显著，并已挂果。Northern Blot分析表明抗病株中有HL或GO表达。

Description

一种培育抗枯萎病香蕉的方法

技术领域

本发明涉及一种培育抗枯萎病香蕉的方法。

背景技术

香蕉属芭蕉科(Musacea)芭蕉属(Musa)，学名Musa spp.，是一种倍受人们喜爱的热带水果。香蕉(含大蕉)世界年产量达977，712万吨(FAO，2001)，仅次于柑橘，位居水果产量的第二。

香蕉枯萎病(Banana vascular wilt)也称巴拿马病(Panama disease)，是一种土传维管束真菌病害，由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起，危害严重，曾在50年代毁灭了中、南美洲的大片蕉园，使口感最好的香蕉大密哈(Gros micheAAA)灭绝(Stove R H，et al，Fusarium wilt of banana：Some history and currentstatus of the disease.In：Ploetz R C(ed)Fusarium wilt of banana.APS Press，St Paul，Minn，1990)。近年出现的香蕉枯萎病菌4号小种危害性更大，可感染所有的香蕉、大蕉品种，包括对其它枯萎菌小种有抗性的Cavendish群香蕉(PloetzR C，et al.Fusarium wilt(Panama disease).In：Ganry J(ed)Breeding bananaand plantain for resistance to disease and pests.CIRAD：in collaborationwith INIBAP，Montpellier，France，1993)。香蕉枯萎病目前尚无理想的防治药剂，并且生产上大面积栽培的香蕉品种都不抗镰刀菌枯萎病，因此迫切需要培育抗枯萎病的香蕉品种，但由于食用栽培香蕉绝大多数为三倍体，具有不育、不结实等生理特点，难以通过有性杂交的方式改良品种，现有品种都是通过芽变的方法选育而成，因此香蕉遗传资源匮乏。

基因工程技术是作物改良的有效途之一，Sagi L、Ganapathi等(Sagi L，et al.Genetic engineering of banana for disease resistance-future possibilities.In：Jones DR(ed)Disease of banana，Abaca and Enset.CABI.Wallingford UK，pp 465-515；Ganapathi T R，et al.Agrobacterium-mediated transfomation ofembryogenic cell suspensions of the banana cultivar Rasthali(AAB).PlantCell Reports，2001，20：157)以香蕉悬浮细胞系为材料，用农杆菌法转化获得了转基因香蕉，Ganapathi T R，Sagi等(Ganapathi T R，et al，Genetictransformation of banana：In：Jaiwal PK，Singh RP(eds)Plant geneticengineering，Vol 6.Sci-Tech Pub.Co.，Houson，USA，pp83-109；Sagi L，et al.Genetic transformation of banana and plantain(Musa，spp.)via particlebombardment.Biotechnology，1995a，13：481)也用基因枪法获得了香蕉转基因植株。May等(May G D，et al.Generation of transgenic banana(Musa acuminata)plants via Agrobacterium-mediated transformation.Biotechnology，1995，13：486)以香蕉无菌苗的茎尖分生组织及假茎薄片为外植体，通过农杆菌转化成功。但由于香蕉是单子叶植物，不易被农杆菌侵染，又因在组织培养过程中褐化严重，因此目前尚未建立起成熟高效的农杆菌转化体系。

人溶菌酶(human lysozyme，简称HL)是一种双功能酶，它不但可水解细菌细胞壁的β-(1，4)糖苷键，而且可水解真菌细胞壁的几丁质。Nakajima等将按细菌偏爱密码子设计的人溶菌酶基因导入烟草，可能因密码子偏爱性及无信号肽等原因，溶菌酶的表达较低，但尽管如此，转基因烟草对病原真菌白粉菌(E.cichoracearum)及细菌烟草野火病菌(P.syringae pv.tabaci)的抗性均有较大的提高。

葡萄糖氧化酶(GO)是由Muller于1928年在黑曲霉提取物中发现的，它可以催化β-D-葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和H₂O₂，是近年来研究较多的一种与信号传导有关的活性氧类(AOS)分子，它不仅对病原微生物具有直接的抑杀作用，还可通过信号传导途径诱发细胞壁结构蛋白的氧化交联阻止病菌的侵入(Bradley D J，KjellbomP，Lamb C J，et al.El icitor-and wound-induced oxidative cross-linking ofa proline-rich plant cell wall protein：a novel，rapid defense response.Cell，1992，70：21～30)及激活水杨酸合成以诱导防卫基因的表达，使植物产生系统获得性抗性。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育抗枯萎病香蕉的方法。

本发明所提供的培育抗枯萎病香蕉的方法，是用含有人溶菌酶基因或葡萄糖氧化酶基因的表达载体转化香蕉，得到抗枯萎病香蕉。

用于构建所述含有人溶菌酶基因或葡萄糖氧化酶基因的表达载体的出发载体可为现有的质粒表达载体，如pUC19，pBI121，pCAMBIA1301。

为了提高转化效率，所述转化香蕉的方法为以香蕉组培苗假茎薄片为外植体，利用农杆菌侵染辅助基因枪轰击的遗传转化方法，将所述人溶菌酶基因或葡萄糖氧化酶基因转入香蕉。

所述农杆菌侵染辅助基因枪轰击的遗传转化方法可为以直径为1.0μm的不含目的基因的裸露金粉，80Psi轰击香蕉组培苗假茎薄片，然后恢复培养1-2天后，再用农杆菌侵染。

选用低代香蕉组培苗的假茎薄片为外植体，虽然转化率较以悬浮细胞为外植体低，仅为0.95％或1.05％，但转化周期相对较短，受香蕉基因型的依赖也较小，并且薄片仅1-2mm厚，在选择培养时可与培养基充分接触，侧芽在强的选择压下产生，避免了非转化细胞的再生，又经过2-3步的生芽与生根交替选择培养，可以避免嵌合体的出现，同时选用低代组培苗不仅芽生长点多，其周围的组织都具有潜在的芽分化能力，薄片利于农杆菌的吸附。

为了提高人溶菌酶基因在植物中的表达量，所述人溶菌酶基因优选为具有序列表中序列1的核苷酸序列。

序列表中的序列1是由植物偏爱密码子组成的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列不变。

为提高所述人溶菌酶基因表达蛋白的积累量和使其更有效发挥作用，所述人溶菌酶基因连接有大麦α-淀粉酶信号肽序列。该信号肽序列指导所述人溶菌酶基因表达产物分泌至细胞外，一方面避免HL蛋白被胞内蛋白酶降解，有利于提高它在组织中的积累量及在细胞间隙中的浓度，另一方面，因病菌的侵染和繁殖多始于细胞间隙，故HL在细胞间隙中的积累也有利于在病菌侵染初期起作用(Trudel J，Potvin C，Asselin A，1992，Expression of active hen egg white lysozyme in transgenictobacco.Plant Sci 87：55-67)。

所述含有人溶菌酶基因的植物表达载体优选为pCUbi-HL。

所述葡萄糖氧化酶基因来源于黑曲霉，具有序列表中序列2的核苷酸序列。

所述含有葡萄糖氧化酶基因的表达载体优选为pCUbi-GO。

上述含有人溶菌酶基因或葡萄糖氧化酶基因的表达载体均可按常规方法构建。

本发明将人溶菌酶基因或葡萄糖氧化酶基因转入香蕉栽培品种，PCR分析表明51株整合有人溶菌酶基因，61株整合有葡萄糖氧化酶基因。采用苗期盆栽伤根淋菌与大田伤根浇菌的方法鉴定转基因香蕉的枯萎病抗性，结果表明盆栽接菌60d后，对照非转基因植株表现明显的枯萎病症状，叶片脱水、黄化、下垂、假茎纵切面有紫红色斑点，维管束部分明显受害，转HL基因香蕉有24株无任何病症，转GO基因植株有31株无任何病症，抗性明显；大田病圃营养生长期伤根浇菌后，经过全生育期观察，有2株转HL基因香蕉和2株转GO基因香蕉枯萎病抗性显著，并已挂果。Northern Blot分析表明抗病株中有HL或GO表达。说明人溶菌酶基因和葡萄糖氧化酶基因在植物抗真菌病害基因工程中有着广阔的应用前景。

附图说明

图1为植物表达载体pCUbi-HL基因表达盒示意图。

图2为转HL基因香蕉植株的PCR检测结果。

图3为四株抗病性提高的转HL基因植株的Northern blot杂交结果。

图4为转HL基因香蕉盆栽枯萎病抗性鉴定照片。

图5为GO抑菌实验照片。

图6为植物表达载体pCUbi-GO基因表达盒示意图。

图7为转GO基因香蕉植株的PCR检测结果。

图8为转GO基因香蕉植株的Southern blot分析结果

图9为转GO基因香蕉植株的Northern blot分析结果

图10为转GO基因植株盆栽淋菌鉴定照片

图11为转GO基因植株盆栽淋菌鉴定实验中转GO基因香蕉和非转基因香蕉的维管束照片

具体实施方式

下述实例中所用实验方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、抑菌实验

香蕉枯萎菌4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense.4)由广东省农业科学院植物保护研究所从广东省信宜市发病香蕉园中分离。保存在PDA斜面培养基上，28±1℃培养5d后收集孢子，涡旋离心孢子悬浮液，收集沉淀，用无菌水洗沉淀两次以除去残留的培养基，孢子悬浮液稀释至1.5×10⁵个/ml，进行抑菌实验。

1、HL抑菌实验

吸菌液2μl分别滴于加有HL(0，25，50，75，100，150mg/L)(购自sigama Co.t)的PDA平板上，不同处理均重复3次。将平皿置于28±1℃，2d后观察病菌丝长度，比较同期对照的菌丝长度。结果如表1所示，体外抑菌试验表明HL的抑菌浓度为40mg/L。

表1.接种2天后病原菌Fusarium oxysporum f.sp.Cubense.4的体外抑菌实验

HL(mg/L)	菌丝长度(mm)	比率(％)
			0	6.5	100
25	6.5	100
			50	3.8	58.5
75	3.2	49.2
			100	2.8	43.1

2、GO抑菌实验

吸菌液2μL分别滴于加有GO(0.016，0.008，0.004，0.002μmol/L，购自Amresco公司，酶活性100U/mg)的PDA平板上，不同处理均重复3次。将平皿置于30±1℃，4-5d后观察病菌生长情况，病菌长势较对照(不加葡萄糖氧化酶的PDA培养基)减弱时的浓度为最低抑菌浓度，病菌完全不能生长的浓度为致死浓度。结果如图5所示，表明GO的最低抑菌浓度为0.004μmol/L，致死浓度为0.016μmol/L，GO对Fusarium oxysporum f.sp.Cubense 4的作用明显。图5中，1-4的GO浓度分别为0.016，0.008，0.004，0.002μmol/L。

实施例2、用含有人溶菌酶基因的表达载体pCUbi-HL转化香蕉培育抗枯萎病香蕉

一、pCUbi-HL的构建

1、HL基因与大麦α-淀粉酶分泌信号肽的连接

按照王冰山等的方法(王冰山，人溶菌酶基因的修饰、合成及其在烟草中的表达，2002，农业生物技术学报)利用BamHI和EcoRI将HL基因从pHL上切下，亚克隆于带有大麦α-淀粉酶分泌信号肽序列的质粒pSC的BamHI和EcoRI位点之间，得到重组质粒pSHL。

2、与强启动子和Ω序列连接构建重组质粒pTSH

按照王冰山等的方法(王冰山，人溶菌酶基因的修饰、合成及其在烟草中的表达，2002，农业生物技术学报)构建重组质粒pTSH，具体方法如下：pSHL经EcoRI酶切后用Klenow酶补平。再以PstI酶切，将信号肽及HL基因片段亚克隆于pTΩ4A的PstI和HpaI位点间。使其与pTΩ4A上带有两个增强子的CaMV 35S启动子和翻译增强片段Ω序列及polyA序列和Nos终止子连接，得到重组质粒pTSH。

3、表达载体pCUbi-HL的构建

将带有启动子和终止子的HL基因表达盒，用HindIII和EcoRI酶切从pTSH上切下，克隆于植物表达载体pCAM1301(澳大利亚，CAMBIA公司)的HindIII和EcoRI位点之间，得到HL基因的植物表达载体pCUbi-HL(图1)，其主要元件包括带2个增强子的CaMV 35S启动子(780bp)，翻译增强片段Ω序列(80bp)，大麦α-淀粉酶信号肽sp序列(69bp)，HL结构基因(390bp)，poly A序列(240bp)，Nos终止子(250bp)，筛选标记hpt基因；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界。将鉴定正确的pCUbi-HL以冻融法导入农杆菌EHA105，得到农杆菌EHA105/pCUbi-HL。

二、香蕉的遗传转化

1.培养基

1)生芽培养基(BM1)：MS+5mg/L 6BA+0.1mg/L IBA+5mg/L腺嘌呤+3％蔗糖+0.8％琼脂粉，pH5.8

2)重悬菌液培养基(BM2)：1/2MS+100-200μmol/L  乙酰丁香酮+100g/L蔗糖，pH5.2

3)共培养培养基(BM3)：MS+5mg/L 6BA+100μmol/L乙酰丁香酮+0.8％琼脂粉+3％蔗糖，pH5.2

4)生芽选择培养基(BM4)：MS+0.1mg/L IBA+5mg/L 6BA+3％蔗糖+0.8％琼脂粉+6.25mg/L潮霉素(Hygromycin)+500mg/L羧苄青霉素(Carb)+3％蔗糖，pH5.8

5)生根选择培养基(BM5)：1/2MS+0.2mg/L IBA+7.5mg/L Hygromycin+500mg/L Carb+3％蔗糖+0.8％琼脂粉+1％活性炭，pH5.8

2、受体品种：田间取广东信宜主栽香蕉(Musa spp.)粉蕉(ABB)和泰蕉(AAA)吸芽，经过1‰升汞消毒处理，在超净工作台上剥取顶芽，接种于生芽培养基BM1，经过3-4代的生芽增殖培养，横切成1-2mm薄片用于转化。

3、农杆菌的预处理：农杆菌EHA105/pCUbi-HL菌液接种于YEB(含卡那霉素50-100mg/L)培养基中，28℃、150-200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.4-0.5，将培养好的菌液5000rpm离心10min后，菌体悬浮于培养基BM2。

4、基因枪轰击：选取1-2mm厚的香蕉假茎薄片，置于生芽培养基BM1上，每个培养皿放20个外植体，参照文献Murray EE，Lotzer J and Eberle M.Codon usagein plant genes.Nucleic Acids Research，1989，17(2)447-498的方法，以裸露的不含目的基因的金粉(直径1.0μm)轰击(80Psi)薄片，造成微创伤，基因枪型号为PDS-1000/He(BioRad)。

5、农杆菌侵染：轰击后的薄片在非选择性培养基BM1上28℃恢复培养1-2d，微创伤修复，然后农杆菌侵染20-30min，在BM3培养基上共培养2-3d。

6、选择培养：共培养后的薄片转入生芽选择培养基BM4，在28℃，16h光/8h暗，光照强度1500LX培养。待长出3-4cm高的芽后转入生根选择培养基BM 5，培养3-4周。

7、再生苗多代选择培养：为避免嵌合体，切取生根健壮苗的假茎薄片，置于选择培养基上生芽，生芽后再次在生根选择培养基上培养。

实验结果表明，泰蕉对潮霉素的反应敏感，抑制泰蕉(AAA)薄片生芽和生根的浓度分别为6.25mg/L和7.5mg/L。2-3mm厚度的假茎薄片通常在生芽培养基上生3-4个芽，经过农杆菌侵染的薄片在含潮霉素的选择培养基上每个切片一般只生一个芽，而且大多数生长抑制或白化，每次继代中的薄片生芽率为30-40％，每瓶8个薄片平均生一个抗性芽，其余均白化、不出芽或生长抑制，也有出现叶片白绿嵌合的情况。在一次实验中共侵染假茎薄片2000个，经过2-3代生芽与生根的交替选择培养，共获得19株转基因香蕉，以起始侵染的薄片数计算，转化率为0.95％。经多次转化实验，共获得72株潮霉素抗性植株。

三、转基因香蕉的分子检测

1、PCR检测

按照HL基因设计引物PHL1：5’ccg，ctc，gag，tta，cac，tcc，gca，acc 3’，PHL2：5’ac，tct，aga，tac，tgg，tgc，aac，gac，gga，aag 3’，以72株潮霉素抗性植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。其中PCR扩增体系：10×扩增缓冲液5ul，4种dNTP混合物各100umol，引物各10～50pmol，模板DNA 0.1ug，TaqDNA聚合酶1u，加双蒸水至50ul；PCR扩增条件：95℃，5min；95℃，1min，53℃30’，72℃，1min，35个循环；72℃10min。PCR结果表明经检测的72株潮霉素抗性香蕉植株中有51株携带有HL基因，阳性率70.8％，证明外源基因已经整合到香蕉基因组中。图2显示了部分转基因潮霉素抗性植株的PCR检测结果，图2中，泳道1为阳性对照(pCUbi-HL)，泳道2为非转基因植株，泳道3-9为转基因潮霉素抗性植株。

2、Northern blot杂交检测

为了进一步验证HL基因在香蕉叶片中的表达，按常规方法提取四株抗病性提高的转基因植株67，109，26和57号植株的总RNA，将40μg总RNA用毛细管法转移到HybondTM N+膜上，用Prime-α-Gene Labeling System(Promega)制备探针，用[α-³²P]-dCTP标记步骤1中PCR扩增的HL基因，68℃杂交12h，洗膜后X光片-70℃曝光24h，以非转基因植株为阴性对照。结果如图3所示，表明这四株转基因植株的叶片中均有HL基因的表达。图3中，CK为非转基因植株。

四、转基因香蕉枯萎病抗性鉴定

参照蒲金基等(蒲金基，刘晓妹，曾会才.香蕉抗枯萎病育种研究进展.中国南方果树，2003，(32)1：31-3)的方法采用苗期盆栽伤根淋菌结合大田伤根浇菌鉴定枯萎病抗性，包子悬液的孢子浓度为1.5×10⁵个/ml。

1、转基因香蕉盆栽淋菌枯萎病抗性鉴定

对PCR检测阳性的转基因香蕉苗进行盆栽伤根淋菌，选用正常生长的非转基因香蕉苗为对照，具体方法如下：为便于土壤接种，在10kg砂土与玉米糠(19∶1)中加入1L孢子悬浮液，当香蕉苗长至6-7片叶时微切根部，在菌液中浸泡3-5min后移入带菌土中，置于28-30℃的光照培养间培养，60d后观察发病情况。结果非转基因香蕉苗出现明显的枯萎病症状，叶片脱水、黄化、下垂(图4中1，2)，根和假茎的维管束显紫红色，而转基因香蕉植株H-1，H-2，H-3，H-4，H-5抗病(图4中3，4，5，6，7)，其叶片、根和假茎的纵剖面表现正常。在51株转基因香蕉中，24株无任何病症出现，抗性显著，27株表现枯萎病病症。

2、转基因香蕉大田病圃枯萎病抗性鉴定

大田病圃设在广东省信宜市农科所西江温泉试验基地，北纬22°11’，东经111°32’，年平均气温22.4℃，极端最高气温39.2℃，香蕉生育期间积温为8300℃，年平均日照时数3285h，年降雨量1800-2000mm。

苗期盆栽鉴定表现抗病的24株移栽到大田病圃，香蕉苗移栽行距2.5m，株距2.5m，每畦移栽香蕉苗10株，移栽同期生长的非转基因香蕉对照1畦10株，施农家肥3次，化肥1次，喷施氧化乐果和敌力脱各1次。在营养生长期，微切根部，每株浇菌液1L，60d后观察发病情况，在每个生长发育阶段调查发病情况。根据不同时期香蕉的青叶张数，假茎爆裂时期等来确定香蕉的发病程度。结果表明在营养生长期浇菌液，所有对照在浇菌60d后开始出现病症，叶鞘变软，病叶叶鞘下部和假茎维管束出现暗红色病斑，叶片黄化，根系变黑坏死，中心维管束红色。转基因植植中有2株抗性明显，9株轻微发病，13株严重发病。

实施例3、用含有GO基因的表达载体pCUbi-GO转化香蕉培育抗枯萎病香蕉

一、单子叶植物表达载体pCUbi-GO的构建

用PstI/XhoI部分双酶切GO基因载体pGO(王志兴，刘昱辉，孙敬三，等.葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在转基因烟草中的表达.自然科学进展，2003，(13)3：248～254)，电泳回收GO基因片段，与Ubiquitin启动子连接并克隆到pCAMBIA1301(购自澳大利亚CAMBIA公司)的多克隆位点，获得单子叶植物表达载体pCUbi-GO(图6)。

将鉴定正确的pCUbi-GO以冻融法导入农杆菌EHA105，得到农杆菌EHA105/pCUbi-GO。图6中，hpt，潮霉素基因；35S，花椰菜花叶病毒35S蛋白基因启动子；Ubiquitin，玉米泛素基因启动子；GO，葡萄糖氧化酶基因；nos，花椰菜花叶病毒35S蛋白基因终止子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界。

二、香蕉的遗传转化

1、培养基；2、受体品种；4、基因枪轰击；5、农杆菌侵染；6、选择培养；7、再生苗多代选择培养均与实施例2的步骤二中的相同；3、农杆菌的预处理中，除菌种为农杆菌EHA105/pCUbi-HL外，其它方法与实施例2的步骤二的3相同。

实验结果表明，粉蕉和泰蕉对潮霉素的反应敏感，抑制粉蕉(AAB)薄片生芽和生根的浓度分别为5mg/L和6.25mg/L；抑制泰蕉(AAA)薄片生芽和生根的浓度分别为6.25mg/L和7.5mg/L。1-2mm厚度的假茎薄片在生芽培养基上生3-4个芽，经过农杆菌侵染的薄片在含潮霉素的选择培养基上每个切片一般只生1个芽，而且大多数芽的生长受到抑制或白化，每次继代的薄片生芽率为30％-40％，每瓶8个薄片平均生一个抗性芽，其余均白化、不出芽或生长抑制，也有出现叶片白绿嵌合的情况。在一次实验中，利用基因枪轰击并侵染假茎薄片2000个，经过2-3代生芽与生根的交替选择培养，共获得21株转基因香蕉，以起始侵染的薄片数计算，转化效率为1.05％。香蕉假茎薄片不经过基因枪轰击，直接进行农杆菌侵染，经过对9000个外植体的侵染转化，获得了40株转基因香蕉，转化效率为0.44％。经多次转化实验，共获得76株潮霉素抗性植株。

三、转基因香蕉的分子检测

参考Paul等(Paul S，Colin B，Simon P et al.Molecular cloning andcharacterization of banana fruit polyphenol oxidase，Planta，2001，213：748-757)的方法，提取香蕉叶片基因组DNA和总RNA。

1、PCR检测

以提取的76株潮霉素抗性植株叶片基因组DNA为模板，在引物-1：5’ATC ATCGCT GGT GGA GGT CTG 3’；和引物-2：5’CAG AAG GTC CCA CAC ATC GAA G 3’的引导下进行PCR反应。其中，PCR反应体系为：10×扩增缓冲液5ul，4种dNTP混合物各100umol，引物各10～50pmol，模板DNAO.1ug，Taq DNA聚合酶1u，加双蒸水至50ul；PCR扩增条件为94℃1min、53℃1min、72℃1min，循环35次。结果表明，其中的61株为阳性，阳性率80.3％，图7显示部分植株的PCR结果，除对非转基因植株照外，转基因植株和质粒pCUbi-GO的扩增产物均有一个1.4kb的阳性特征带。图7中，1，DNA分子量标准(Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker：21kb，5.14kb，2.027kb，1.548kb，1.375kb，0.94kb)；2，阳性对照质粒pCUbi-GO；3，非转基因植株对照；4-8，转基因植株。

2、Southern blot杂交

提取经盆栽淋菌鉴定与大田浇菌鉴定的枯萎病抗性提高的转基因香蕉22，23，77，14，19号和1株同期生长的非转基因植株叶片的基因组DNA，经EcoRI酶切后进行Southern杂交，以用PstI/XhoI部分双酶切GO基因载体获得的GO基因的PstI/XhoI酶切片段为探针。因GO基因中及靠近5′端处各有一个EcoRI位点，预期的杂交带为1.4kb。结果如图8所示，表明该五株抗病株均出现1.4kb的预期杂交带。证明外源基因已经整合到香蕉基因组中。图8中，CK+，阳性对照质粒pCUbi-GO；CK^-1，非转基因植株对照；22，23，77，14，19为转基因植株。

3、Northern blot杂交分析

提取抗枯萎病4号小种植株19，77，14，22，23号的叶片总RNA，将40μg RNA用毛细管法转移到HybondTM N+膜上，用Prime-α-Gene Labeling System(Promega)制备探针，用[α-32P]-dCTP标记探针(用PstI/XhoI部分双酶切GO基因载体获得的GO基因的PstI/XhoI酶切片段)，68℃杂交12h，洗膜后X光片-70℃曝光24h，以非转基因植株(CK)为阴性对照。结果如图9所示，表明抗病株在转录水平表达，其中以77号信号较强，14号次之，23号，19号，22号较弱。

四、转基因香蕉枯萎病抗性鉴定

该鉴定方法与实施例2的步骤四相同。

对PCR检测结果阳性的香蕉苗盆栽伤根淋菌，在淋菌60d后，非转基因香蕉苗出现明显的枯萎病症状，叶片脱水、黄化、下垂(图10中1)，根和假茎的维管束显紫红色(图11中2)，而转基因香蕉植株的叶片、根和假茎的纵剖面表现正常(图10中2，图11中1)。在61株转基因香蕉中，31株无任何病症，30株表现枯萎病病症，在苗期淘汰。

苗期盆栽鉴定表现抗病的31株移栽到病圃，在营养生长期伤根浇菌，所有对照在浇菌60d后开始出现病症，叶鞘变软，病叶叶鞘下部和假茎维管束出现暗红色病斑，叶片黄化，最后假茎爆裂、根系变黑坏死。转基因植株中的2株泰蕉77号和泰蕉14号对枯萎病抗性显著，现已挂果。11株在抽蕾后发病，其中粉蕉14号、22号和23号在断蕾时仍各有青叶10，11，13张，但在断蕾后出现枯萎病症状。18株在抽蕾前就已发病。

序列表

<160>2

<210>1

<211>390

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

aaggtgttcg agagatgcga gttggctagg acccttaaga gattgggaat ggacggttac      60

aggggtatct ctctcgccaa ctggatgtgc ttggctaagt gggagagcgg atacaacacc     120

agagctacta actacaacgc tggagatagg agcactgact acggtatctt ccagatcaac     180

tctagatact ggtgcaacga cggaaagacc ccaggagctg ttaacgcttg ccatctctcc     240

tgctcggctt tgcttcaaga taacattgct gatgctgttg cttgcgctaa gagggtggtt     300

agagatccac aaggtatcag cgcttgggtt gcctggagaa acaggtgcca aaacagagac     360

gttaggcagt acgtgcaagg ttgcggagtg                                      390

<210>2

<211>1752

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>2

agcaatggca ttgaagccag cctcctgact gatcccaacg atgtctccgg ccgcacggtc      60

gactacatca tcgctggtgg aggtctgact ggactcacca ccgctgctcg tctgacggag     120

aaccccaaca tcagtgtgct cgtcatcgaa agtggctcct acgagtcgga cagaggtcct     180

atcattgagg acctgaacgc ctacggcgac atctttggca gcagtgtaga ccacgcctac     240

gagaccgttg agctcgctac caacaatcaa accgcgctga tccgctccgg aaatggtctc     300

ggtggctcta ctctagtgaa tggtggcacc tggactcgcc cccacaaggc acaggttgac     360

tcttgggaga ctgtctttgg aaatgagggc tggaactggg acaatgtggc cgcctactcc     420

ctccaggctg agcgtgctcg cgcaccaaat gccaaacaga tcgctgctgg ccattacttc     480

aacgcatcct gtcatggtac caatggtact gtccatgccg gaccccgtga caccggcgat     540

gactattccc ccatcgtcaa ggctctcatg agcgctgtcg aagaccgagg cgttcccacc     600

cagaaggact tcggatgcgg tgaccctcat ggtgtgtcca tgttccccaa caccttgcac     660

gaagaccaag ttcgctccga tgccgctcgc gaatggctcc ttcccaacta ccaacgtccc     720

aacctgcaag tcctgaccgg acaatatgtt ggtaaggtgc tccttagcca gaacggcacc     780

acccctcgtg ccgtcggcgt ggaattcggc acccacaagg gcaacaccca caacgtttac     840

gctaagcacg aggtcctcct ggccgcgggc tccgctgtct ctcccacaat cctcgaatat     900

tccggtatcg gaatgaagtc catcctggag ccccttggta tcgacaccgt cgttgacctg     960

cccgtcggcc tgaacctgca ggaccagacc accgctaccg tccgcagccg catcacctct    1020

gctggtgccg gacagggaca ggccgcttgg ttcgccacct tcaacgagac ctttggtgac    1080

tattccgaaa aggcacacga gctgctcaac accaagctgg agcagtgggc cgaagaagcc    1140

gtcgcccgtg gcggattcca caacactacc gccttgctca tccagtacga gaactaccgc    1200

gactggattg tcaaccacaa cgtcgcgtac tcggaactct tcctcgacac tgccggagta    1260

accagcttcg atgtgtggga ccttctgccc ttcacccgag gatacgttca catcctcgac    1320

aaggacccct accttcacca cttcgcctac gaccttcagt acttcctcaa cgagctggac    1380

ctgctcggtc aggctgccgc tactcaactg gcccgcaaca tctccaactc cggtgccatg    1440

cagacctact tcgctgggga gactatcccc ggtgataacc tcgcgtatga tgccgatttg    1500

agcgcctgga ctgagtacat cccgtaccac ttccgtccta actaccatgg cgtgggtact    1560

tgctccatga tgccgaagga gatgggcggt gttgttgata atgctgcccg tgtgtatggt    1620

gtgcagggac tgcgtgtcat tgatggttct attcctccta cgcaaatgtc gtcccatgtc    1680

atgacggtgt tctatgccat ggcgctaaaa atttcggatg ctatcttgga agattatgct    1740

tccatgcagt ga                                                        1752

Claims (9)

1、一种培育抗枯萎病香蕉的方法，是用含有人溶菌酶基因或葡萄糖氧化酶基因的表达载体转化香蕉，得到抗枯萎病香蕉。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用于构建所述含有人溶菌酶基因或葡萄糖氧化酶基因的表达载体的出发载体为pUC19，pBI121，pCAMBIA1301。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述转化香蕉的方法为以香蕉组培苗假茎薄片为外植体，利用农杆菌侵染辅助基因枪轰击的遗传转化方法，将所述人溶菌酶基因或葡萄糖氧化酶基因转入香蕉。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述农杆菌侵染辅助基因枪轰击的遗传转化方法为以直径为1.0μm的不含目的基因的裸露金粉，80Psi轰击香蕉组培苗假茎薄片，然后恢复培养1-2天后，再用农杆菌侵染。

5、根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于：所述人溶菌酶基因为具有序列表中序列1的核苷酸序列。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述人溶菌酶基因连接有大麦α-淀粉酶信号肽序列接。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述含有人溶菌酶基因的植物表达载体为pCUbi-HL。

8、根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶基因来源于黑曲霉，具有序列表中序列2的核苷酸序列。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述含有葡萄糖氧化酶基因的表达载体为pCUbi-GO。

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