CN104232759B - 一种用于筛选抗枯萎病香蕉品种的基因标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于筛选抗枯萎病香蕉品种的基因标记物,包含标记基因MaDAHPS1、MaEPSPS1、MaICS、MaCAD1和MaC4H2中的一种或多种,MaDAHPS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,MaEPSPS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,MaICS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,MaCAD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,MaC4H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明采用水杨酸代谢途径关键基因MaDAHPS1、MaEPSPS1、MaICS、MaCAD1和MaC4H2中的一种或多种作为基因标记物,可以用于香蕉抗枯萎病早期筛选,为育种的早期鉴定提供了技术保障。

Description

一种用于筛选抗枯萎病香蕉品种的基因标记物
技术领域
本发明属于植物基因工程领域,尤其涉及一种用于筛选抗枯萎病香蕉品种的基因标记物。
背景技术
香蕉枯萎病,又称巴拿马病、黄叶病,是在世界范围内限制香蕉产量的主要原因(Getha and Vikineswary,2002;O’Donnell et al,1998;Ploetz and Pegg,2000)。该病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense,Foc)引起的毁灭性土传维管束病害,广泛分布于世界各大香蕉主产区(高乔婉,1996)。香蕉枯萎病菌是兼性寄生菌,其腐生能力很强,在土壤中可以存活8-10年。病原菌进入寄主以后,采用死体营养方式,先降解寄主组织,杀死寄主细胞,再吸收营养(王振中,2006)。香蕉枯萎病是一种典型的维管束病害,发病时在整株外表可见明显的萎焉和下部老叶变黄,在病害严重时期,受感染的植株大多数的叶片变黄或干枯,假茎可以直立1-2个月,之后整株倒地腐烂。在受感染的植株内部,根系和球茎的木质部组织中呈现出红褐色至栗色的变化。在球茎的横切面,有红棕色或黑色的斑点,这是被病原菌侵染后坏死的维管束(Pérez-Vicente,2004)。Foc也侵染香蕉周围萌发的吸牙(Pérez-Vicente,2004)。同时枯萎病扩散的途径还包括带病的种苗(Su etal,1986)和带有病原菌的农耕工具及种植者(Hwang et al,2004)等。
目前依据病菌在香蕉不同品系及不同属种的致病程度,将其划分为4个生理小种(Koenig et al,1997)。其中,1号小种(Race 1)呈世界性分布,侵染粉蕉、香蕉的栽培品种大蜜舍(Gros Michel,AAA)及龙牙蕉(Musa,AAB),不侵染矮香蕉(Dwarf Cavendish,AAA);香蕉栽培史上第一次枯萎病爆发就是1号生理小种造成的。2号小种(Race 2)仅侵染三倍体杂种棱香蕉(Bluggoe,AAB),不侵染大蜜舍,对香蕉栽培品种的危害较小。3号小种(Race 3)主要侵染野生揭尾蕉属(Heliconia spp.),对香蕉栽培品种基本不造成危害。4号小种(Race 4)几乎危害所有的香蕉和大蕉品种(Persley et al,1987;Koenig et al,1997;Ploetz et al,2000),如大蜜舍、矮香蕉、野蕉、棱指蕉。该小种分热带型(tropical)和亚热带型(subtropical)两种(Visser et al,2010),在香蕉整个生长时期均造成危害,当土壤中病原菌的浓度达到1×103CFU/g时,就能使香蕉表现出病害症状(何欣等,2010)。4号生理小种在4个生理小种中破坏性最大(Persley et al,1987;王振中,2006),目前占世界栽培香蕉种植面积的80%的品种受它侵染,这其中包括商品化种植程度很高的卡文迪什亚种(Cavendish subgroups)(Kungn and Jeffries,2001;Ploetz,2005)。
香蕉枯萎病的发生和发展机理十分复杂,在该研究领域一直存在长期的争论,其研究涉及到病理学、解剖学、生理学、生物化学和分子生物学等多个学科。有研究显示枯萎病的发生是由于病原菌通过根系侵入植株输导组织,病原体在木质部的导管中大量繁殖,这些繁殖体可以在蒸腾压力的作用下随导管运输(在梯状导管的基部收集到病原体),随着病原体的大量增殖,增殖的病原菌体可由一个导管运输到另一个导管,大量繁殖的病原菌在导管内形成凝胶体,受感染的宿主分泌酚类化合物使堵塞的导管木质化而死亡(Ploetzand Pegg,2000)。同样利用GFP标记的Foc TR4观察到在接种1天后病源菌便附着于根系表皮细胞,沿细胞间层生长,之后可在维管束中大量繁殖从而导致根系死亡(殷晓敏等,2011)。
用香蕉枯萎病菌细胞壁的激发子处理香蕉根系会诱发根系细胞壁的木质化,而且耐病品种中这些酶活均高于感病品种(cv.Williams),表明木质素引起细胞壁加厚是起到防卫尖孢镰刀菌4号生理小种的重要途径(Ana et al,2000)。研究发现利用激发子处理香蕉植株后,与对照相比较,水杨酸的水平提高21倍,防御酶活性也显著提高,同时多酚含量也提高,说明激发子能够诱导产生系统获得性抗性(Patel et al,2004),同样在抗病品种中的酚酸类物质上升高于感病品种(VandenBerg et al,2007),这些研究结果表明香蕉对枯萎病菌存在可诱导的抗病性,而且酚类物质代谢参与香蕉抗枯萎病的过程。
在基因水平,VandenBerg等(2007)利用SSH和微阵列技术研究耐病和感病品种的香蕉根系中发现细胞壁加固相关基因可能参与到香蕉抵抗枯病病菌的侵染,这与之前的生化研究结果相吻合。伴随着新一代测序技术的发展,RNA-seq(RNA-sequencing)和数字基因表达谱(Digital gene expression profiles,DGE)广泛应用到非模式植物尤其是农作物的转绿组和基因表达谱的研究(Varshney et al,2009;梁烨等,2011)。最近Li等(2012)利用这些技术研究香蕉与枯萎病互作的抗性机理,研究发现病原菌侵染香蕉激活了香蕉的病原菌相关分子模式触发的免疫反应(PTI),效应因子触发的免疫反应(ETI),离子流和茉莉酸的生物合成参与到香蕉抗枯萎病的过程,水杨酸不参与香蕉抗Foc TR4的过程,上述结果从转绿组角度阐释了香蕉抗枯萎病的分子机理。
由于香蕉是三倍体,不产生种子,常规育种很难进行(Robinson,1996)。在香蕉品种中,野生种的香蕉对枯萎病具有很好的抗性,这些材料是很好的抗病基因库(Ploetz andPegg,2000)。但对这些基因功能的研究还只处在初始阶段。而利用基因工程手段将抗病相关基因导入感病香蕉品种仅有少数成功的报道(Mahdavi et al,2012),但在香蕉中可靠有效的遗传转化方法还需要进一步的探索与研究(Becker et al,2000;Khanna et al,2004)。
DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映,而且具有标记量丰富、稳定、操作简便等优点。目前,DNA分子标记已广泛地应用于种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位和分子标记辅助选择等各方面(葛颂等,1994)。
香蕉品种创制是对香蕉品种经济性状的设计、重组、选择和固定。传统的育种方法主要是依靠香蕉的形态标记进行选择,同时香蕉的高度不育和多态性不但耗费大量的人力和物力,而且需要很长的时间。近年来,随着生物技术的发展,香蕉育种的方式有了很大的变化,各种遗传标记广泛应用于香蕉育种,尤其是DNA分子标记技术的应用,极大地缩短了育种的周期。
大量的DNA分子标记被运用于香蕉亲缘关系分析及分类的研究。Uma等采用RAPD标记技术分析印第安16个品种的野生蕉遗传多样性和种间相关性,将16个品种分为4类。我国学者对33个品种香蕉(Musa nana Lour,为M.acuminata与M.balbisian的自交及杂交后代)的遗传变异进行了研究,将这些品种划归4个群。Noyer等利用SSR和AFLP标记对30个香蕉品种遗传背景分析,发现遗传基础较为狭小,而用MSAP标记研究在CCGG位点胞核嘧啶甲基化程度,获得较高的遗传多样性数据。Nair等采用建立在香蕉的LTR序列基础之上的IRAP标记对36个香蕉品种基因组分类,结果表明,IRAP标记在鉴定B基因存在较为适用。Creste等利用微卫星标记技术对巴西的58个香蕉品种的基因型(49个二倍体和9个三倍体品种)进行分类,为种质资源的鉴定和评价奠定了基础。
近年来随着分子生物学研究手段的不断更新,基因组学和转录组学研究获得快速发展,建立在这些技术基础上的数量众多的基因表达信息被获得。因此,借助于这些信息分离用于鉴定某一性状的标记基因成为可能,为育种的早期鉴定提供了技术保障。
发明内容
本发明的目的在于现有技术的不足,提供一种基因标记物,可用于抗枯萎病香蕉品种的早期筛选。
本发明的第一个方面是提供一种于筛选抗枯萎病香蕉品种的基因标记物,所述基因标记物包含标记基因MaDAHPS1、MaEPSPS1、MaICS、MaCAD1和MaC4H2中的一种或多种,MaDAHPS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,MaEPSPS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,MaICS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,MaCAD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,MaC4H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地,,所述基因标记物包含标记基因MaDAHPS1、MaEPSPS1、MaICS、MaCAD1和MaC4H2。
本发明的第二个发明是提供一种筛选抗枯萎病香蕉品种的方法,包括以下步骤:将香蕉幼苗接种镰刀菌,然后确定本发明第一个方面所述的基因标记物的表达水平,筛选基因标记物的表达水平提高的香蕉幼苗。
优选地,在接种镰刀菌之前,先确定本发明第一个方面所述的基因标记物的表达水平。
本发明的第三个方面是提供一种本发明第一个方面所述的基因标记物在筛选抗枯萎病香蕉品种中的应用。
本发明的第四个方面是提供一种试剂盒,所述试剂盒包含用于检测本发明第一个方面1所述的基因标记物的表达的探针。
本发明采用水杨酸代谢途径关键基因MaDAHPS1、MaEPSPS1、MaICS、MaCAD1和MaC4H2中的一种或多种作为基因标记物,可以用于香蕉抗枯萎病早期筛选,为育种的早期鉴定提供了技术保障。
附图说明
图1为感病品种和抗病品种接种FocTR4后游离态水杨酸(SA)的含量检测结果;
图2为感病品种和抗病品种接种FocTR4后结合态SA的含量检测结果;
图3为感病品种和抗病品种中MaDAHPS1表达检测结果;
图4为感病品种和抗病品种中MaEPSPS1表达检测结果;
图5为感病品种和抗病品种中MaICS表达检测结果;
图6为感病品种和抗病品种中MaCAD1表达检测结果;
图7为感病品种和抗病品种中MaC4H2表达检测结果;
图8为不同浓度水杨酸处理对Foc TR4生长的影响的检测结果,其中,水杨酸处理浓度:1:0uM;2:50uM;3:100uM;4:200uM;5:300uM;6:400uM;7:500uM;8:600uM;
图9不同浓度的水杨酸对香蕉幼苗根系的影响结果图,其中b为a的局部放大图;
图10为水杨酸处理对诱导香蕉抗病性的效果图,其中,a为外部症状,b为内部症状;
图11为SA预处理后接种Foc TR4后香蕉根系SA含量影响的检测结果,其中,a为对游离态SA含量的影响,b为对结合态SA含量的影响;
图12为SA预处理后接种Foc TR4后对诱导水杨酸代谢途径关建酶基因的表达的影响。
具体实施方式
下面参照附图,结合具体的实施例对本发明作进一步的描述,以更好地理解本发明。
1.水杨酸代谢途径关键基因的获得(克隆)
以镰刀菌侵染后2天、4天和6天的香蕉根系提取总RNA,构建文库进行转录组分析,获得涉及水杨酸代谢途径差异表达cDNA片段14个,并用RACE技术在香蕉果实中克隆到了5个重要基因的全长序列,分别命名为3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶基因(3-dexy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase,MaDAHPS1)、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase,MaEPSPS1)、异分支酸合酶基因(Isochorismate synthase,MaICS)、肉桂醇脱氢酶基因(Cinnamylalcohol dehydrogenase,MaCAD1)、肉桂酸4-羟基裂解酶基因(Cinnamate-4-hydroxylase,MaC4H2)。
1.1 MaDAHPS1克隆
提取香蕉(Musa acuminate L.AAA group cv.Brazilian,中国热带农业科学院热带生物技术研究所澄迈香蕉种植园)根系的总RNA,反转录得到cDNA,按照如下体系进行PCR扩增:
以反转录cDNA为模板,以D1-3’以及D2-3’作为5’RACE反应的3’端引物和5’端接头引物ptr5’进行半嵌套PCR扩增,经过2轮PCR扩增获得883bp长PCR产物。以D3-5’和3’端接头引物ptr3’进行PCR扩增基因3’端序列,获得424bp长PCR产物。对转录组序列、5’端序列和3’端序列分析获得该基因的全长序列,以此全长序列设计引物DAH5’和DAH3’,以反转录cDNA为模板,按下列PCR反应体系和条件进行PCR扩增得产物。
PCR引物:
D1-3’:5’-CTGTTCGCTGTGCTCAGTGAAATCG-3’;
D2-3’:5’-TGGCAGTATGCCCGGATCATTTCTCTG-3’;
D3-5’:5’-ATTGCCAATCCTCTTGGGATCAAG-3’。
cDNA接头引物:
ptr5’:5’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’;
ptr3’:5’-TAATACGACTCACTCACTATAGGG-3’。
基因全长引物:
DAH-5’引物:5’-ATGGCCCTCGCCAGCGGCTC-3’;
DAH-3’引物:5’-TCATAAGTGGAAAAGGCATAG-3’。
PCR反应体系:
在0.2mL离心管中依次加入:
轻弹混匀,瞬时离心收集管壁上的液滴至管底。
PCR反应程序:
(扩增目的基因5’端片段的两轮PCR反应程序相同)
用TIANGEN的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1362bp的PCR产物,并将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度剂进行DNA浓度及纯度检测,结果为DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。
将回收的PCR产物与pMD20-T vector连接(参照TaKaRa说明书),得到连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中,得到转化子,提取转化子的质粒,以DHA-5’引物和DHA-3’为引物进行PCR鉴定,得到1362bp的PCR产物,为阳性质粒,将该阳性质粒送去测序,结果为该阳性质粒含有PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列,该PCR产物的基因命名为MaDAHPS1。
1.2 MaEPSPS1克隆
提取香蕉(Musa acuminate L.AAA group cv.Brazilian,中国热带农业科学院热带生物技术研究所澄迈香蕉种植园)根系的总RNA,反转录得到cDNA,按照如下体系进行PCR扩增:
以反转录cDNA为模板,以E1-3’以及E2-3’作为5’RACE反应的3’端引物和5’端接头引物ptr5’进行半嵌套PCR扩增,经过2轮PCR扩增获得1253bp长PCR产物。以E3-5’和3’端接头引物ptr3’进行PCR扩增基因3’端序列,获得528bp长PCR产物。对转录组序列、5’端序列和3’端序列分析获得该基因的全长序列,以此全长序列设计引物ESP-5’和ESP-3’,以反转录cDNA为模板,按下列PCR反应体系和条件进行PCR扩增得产物。
PCR引物:
E1-3’:5’-GTCATGGCAACGTCAGGCATC-3’;
E2-3’:5’-TGGTGGGCCAGTAACAGTCAC-3’;
E3-5’:5’-AAGTTGGGAGCAACAGTG-3’。
cDNA接头引物:
ptr5’:5’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’
ptr3’:5’-TAATACGACTCACTCACTATAGGG-3’。
基因全长引物:
EPS-5’引物:5’-ATGGCGCAGGCGACTGTGG-3’;
EPS-3’引物:5’-GCTCAGTTCTTTGTAAATG-3’。
PCR反应体系如下:
在0.2mL离心管中依次加入:
轻弹混匀,瞬时离心收集管壁上的液滴至管底。
PCR反应程序:
(扩增目的基因5’端片段的两轮PCR反应程序相同)
用TIANGEN的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1557bp的PCR产物,并将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度剂进行DNA浓度及纯度检测,结果为DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。
将回收的PCR产物与pMD20-T vector连接(参照TaKaRa说明书),得到连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中,得到转化子,提取转化子的质粒,以EPS-5’引物和EPS-3’为引物进行PCR鉴定,得到1557bp的PCR产物,为阳性质粒,将该阳性质粒送去测序,结果为该阳性质粒含有PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列,该PCR产物的基因命名为MaEPSPS1。
1.3 MaICS克隆
提取香蕉(Musa acuminate L.AAA group cv.Brazilian,中国热带农业科学院热带生物技术研究所澄迈香蕉种植园)根系的总RNA,反转录得到cDNA,按照如下体系进行PCR扩增:
以反转录cDNA为模板,以I1-3’以及I2-3’作为5’RACE反应的3’端引物和5’端接头引物ptr5’进行半嵌套PCR扩增,经过2轮PCR扩增获得789bp长PCR产物。以I3-5’和3’端接头引物ptr3’进行PCR扩增基因3’端序列,获得641bp长PCR产物。对转录组序列、5’端序列和3’端序列分析获得该基因的全长序列,以此全长序列设计引物ICS-5’和ICS-3’,以反转录cDNA为模板,按下列PCR反应体系和条件进行PCR扩增得产物。
PCR引物:
I1-3’:5’-AGGGTCCATCGTAGTATCGAT-3’;
I2-3’:5’-TGCTGAAAACTGATGATGGCTG-3’;
I3-5’:5’-TGGTCAAGATCTACTATTCAGC-3’。
cDNA接头引物:
ptr5’:5’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’;
ptr3’:5’-TAATACGACTCACTCACTATAGGG-3’。
基因全长引物:
ICS-5’引物:5’-ATGAACGGGTGTGGTGGGG-3’;
ICS-3’引物:5’-TTAGTTGGCAGTGCTGCTCG-3’。
PCR反应体系:
在0.2mL离心管中依次加入:
轻弹混匀,瞬时离心收集管壁上的液滴至管底。
PCR反应程序:
(扩增目的基因5’端片段的两轮PCR反应程序相同)
用TIANGEN的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1605bp的PCR产物,并将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度剂进行DNA浓度及纯度检测,结果为DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。
将回收的PCR产物与pMD20-T vector连接(参照TaKaRa说明书),得到连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中,得到转化子,提取转化子的质粒,以ICS-5’引物和ICS-3’为引物进行PCR鉴定,得到1605bp的PCR产物,为阳性质粒,将该阳性质粒送去测序,结果为该阳性质粒含有PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列,该PCR产物的基因命名为MaICS。
1.4 MaCAD1克隆
提取香蕉(Musa acuminate L.AAA group cv.Brazilian,中国热带农业科学院热带生物技术研究所澄迈香蕉种植园)根系的总RNA,反转录得到cDNA,按照如下体系进行PCR扩增:
以反转录cDNA为模板,以C1-3’以及C2-3’作为5’RACE反应的3’端引物和5’端接头引物ptr5’进行半嵌套PCR扩增,经过2轮PCR扩增获得571bp长PCR产物。以C3-5’和3’端接头引物ptr3’进行PCR扩增基因3’端序列,获得423bp长PCR产物。对转录组序列、5’端序列和3’端序列分析获得该基因的全长序列,以此全长序列设计引物CAD-5’和CAD-3’,以反转录cDNA为模板,按下列PCR反应体系和条件进行PCR扩增得产物。
PCR引物:
C1-3’:5’-CATTGTATACAACAGCAGCCAACG-3’
C2-3’:5’-AGCCTGAGGATCTGCAGCTGCAAAG-3’
C3-5’:5’-ATGTTCAAGACGTTGCCAAG-3’
cDNA接头引物:
ptr5’:5’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’
ptr3’:5’-TAATACGACTCACTCACTATAGGG-3’
基因全长引物:
CAD-5’引物:5’-ATGTTGTCAGCAGGGAC-3’
CAD-3’引物:5’-GC TCAAAAATTAACTTTG-3’
PCR反应体系:
在0.2mL离心管中依次加入:
轻弹混匀,瞬时离心收集管壁上的液滴至管底。
PCR反应程序:
(扩增目的基因5’端片段的两轮PCR反应程序相同)
用TIANGEN的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收957bp的PCR产物,并将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度剂进行DNA浓度及纯度检测,结果为DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。
将回收的PCR产物与pMD20-T vector连接(参照TaKaRa说明书),得到连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中,得到转化子,提取转化子的质粒,以CAD-5’引物和CAD-3’为引物进行PCR鉴定,得到957bp的PCR产物,为阳性质粒,将该阳性质粒送去测序,结果为该阳性质粒含有PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列,该PCR产物的基因命名为MaCAD1。
1.5 MaC4H2克隆
提取香蕉(Musa acuminate L.AAA group cv.Brazilian,中国热带农业科学院热带生物技术研究所澄迈香蕉种植园)根系的总RNA,反转录得到cDNA,按照如下体系进行PCR扩增:
以反转录cDNA为模板,以H1-3’和H2-3’作为5’RACE反应的3’端引物和5’端接头引物ptr5’进行半嵌套PCR扩增,经过2轮PCR扩增获得756bp长PCR产物。以H3-5’和3’端接头引物ptr3’进行PCR扩增基因3’端序列,获得387bp长PCR产物。对转录组序列、5’端序列和3’端序列分析获得该基因的全长序列,以此全长序列设计引物C4H-5’和C4H-3’,以反转录cDNA为模板,按下列PCR反应体系和条件进行PCR扩增得产物。
PCR引物:
H1-3’:5’-ACCCCCTTCTCTTTCGGCCATCAG-3’
H2-3’:5’-AGTCGGCTCCTCTCCGAGTTG-3’
H3-5’:5’-ACGCGTGGTGGCTGGGGAAC-3’
cDNA接头引物:
ptr5’:5’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’
ptr3’:5’-TAATACGACTCACTCACTATAGGG-3’
基因全长引物:
C4H-5’引物:5’-ATGCTCACCCTTGCGGCAG-3’
C4H-3’引物:5’-TCATGGTGCAATCGGATGG-3’
PCR反应体系:
在0.2mL离心管中依次加入:
轻弹混匀,瞬时离心收集管壁上的液滴至管底。
PCR反应程序:
(扩增目的基因5’端片段的两轮PCR反应程序相同)
用TIANGEN的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1557bp的PCR产物,并将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度剂进行DNA浓度及纯度检测,结果为DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。
将回收的PCR产物与pMD20-T vector连接(参照TaKaRa说明书),得到连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中,得到转化子,提取转化子的质粒,以C4H-5’引物和C4H-3’为引物进行PCR鉴定,得到1557bp的PCR产物,为阳性质粒,将该阳性质粒送去测序,结果为该阳性质粒含有PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
2.香蕉感病品种和抗病品种接种镰刀菌FOC4后内源水杨酸含量测定
实验用感病品种巴西蕉(Musa acuminata L.AAA group,cv.Brazilian)和抗病品种农科1号(Musa acuminata L.AAA group,cv.Nongke No.1)为实验材料,当香蕉苗生长至60天即有4-5片叶时,采用蘸根接菌法分别接种两个品种香蕉,接种浓度为1×106个/ml,在0天(接菌前)和接菌后2天、4天和6天相同时间点取样,每个样3株苗×3组重复共9株苗,经液氮速冻后置于-70℃保存。
水杨酸提取方法参考Zhang等(2003)的方法稍有改动。1.0g香蕉根系经充分研磨后,分别加入2mL 5%的三氯乙酸、去离子水8mL和15mL乙醚,充分震荡后浸提12h,于1000rpm下离心10min,取乙醚相。水相再经乙醚重复浸提2次,合并乙醚相。用旋转蒸发器将乙醚蒸干,加入1mL甲醇溶解沉淀,溶液经0.45um的微孔过滤器过滤后置于离心管中保存,即为游离态水杨酸。向剩余水相中加入2mL 18.5%的HCI,于80℃水浴中加热1小时,冷却后用乙醚提取3次,合并有机相,真空旋转蒸干后加入1mL甲醇溶解沉淀,溶液经0.45um的微孔过滤器过滤后置于离心管中保存,即为结合态水杨酸。香蕉根系中SA的总含量为游离态水杨酸与结合态水杨酸之和。
HPLC测定的色谱条件:流动相组分为甲醇和乙睛溶液(50:50),其中乙睛溶液为65%的乙睛和35%的超纯水配置(用乙酸调节pH 2.8),柱温25℃,波长280nm,流速1.0ml/min,进样量为20uL,样品检测时间为10min。
液相色谱测定了感病品种和抗病品种响应Foc TR4侵染后内源游离态水杨酸和结合态水杨酸含量,结果如图1和图2所示。在感病品种和耐病品种接种Foc TR4前,它们的游离态水杨酸含量没有显著差异。而接种Foc TR4 2天后,感病品种中游离态水杨酸含量极显著低于对照,减少了105.4ng/g;耐病品种中游离态水杨酸含量则极显著升高,含量增加69.6ng/g。在接种Foc TR4前感病品种和耐病品种根系中的结合态水杨酸(SAG)含量呈现极显著差异,即耐病品种含量远远高于感病品种。接种Foc TR4后2天感病品种和耐病品种保持各自接种前水平,没有显著变化。从总水杨酸含量(结合态水杨酸+游离态水杨酸)变化来看。耐病品种在接种Foc TR4后2天呈现增加现象,而感病品种则减少,说明香蕉接种FocTR4后根系中水杨酸含量与香蕉的抗病性正相关。
3.香蕉感病品种和抗病品中水杨酸信号途径相关基因的表达分析
3.1 MaDAHPS1表达分析
结果如图3所示,在感病品种中,MaDAHPS1在2天极显著下调(P<0.01)(本文中极显著下调的判断标准为P<0.01,未达到极显著P>0.01,下同),并在随后的4天和6天基本保持这个表达水平,而耐病品种MaDAHPS1在2天即表现出极显著上调表达,在4天达到最高值,6天表达水平快速下降,但还是显著高于感病品种中该基因的表达。
3.2 MaEPSPS1表达分析
结果如图4所示,EPSPS1在感病品种接种后2天显著下调,4天表达量有所上升但与6天均保持一个较低水平。耐病品种自接种后2天即表现出极显著的上调表达,6天表达量达到最大。该基因在抗病品种的表达数倍高于感病品种
3.3 MaICS表达分析
结果如图5所示,在感病品种中,ICS在2天和4天表达变化不显著,6天极显著下调。耐病品种中,ICS在所有点均上调,并在4天达到极显著。
3.4 MaCAD1表达分析
结果如图6所示,在感病品种中,CAD1在所有时间点极显著下调,而耐病品种中,CAD1的表达在所有时间点都为极显著上调,在6天表达量最大。表明在耐病品种响应FocTR4时激活了CAD基因,而在感病品种中该基因表达被抑制。
3.5 MaC4H2表达分析
结果如图7所示,在感病品种中C4H2在所有时间点下调,耐病品种C4H2在所有点极显著上调,显示耐病品种中激活了C4H基因的表达,而感病品种中C4H基因表达被抑制。
上述结果表明,在香蕉根系水杨酸合成过程的2条途径莽草酸途径相关基因和苯丙素合成途径相关基因表现出一致的表达结果,即在感病品种接种Foc TR4这些基因均表现出下调或基本维持原有表达水平不变,而抗病品种接种Foc TR4后这些基因均表现出极显著的上调表达,表明在耐病品种响应Foc TR4侵染过程中这两个途径均被激活。
根据上述基因在香蕉感病和抗病品种接种Foc TR4后的表达特性,我们认为可以将它们作为香蕉抗枯萎病育种早期筛选的标记基因。
4.外源水杨酸处理诱导香蕉抗病性增强
4.1水杨酸显著抑制Foc TR4生长
配置含不同浓度水杨酸(0-600uM)的PDA培养基,其中以不加水杨酸(0uM)的培养基为对照,每个处理重复3次。置于28度条件下培养5天,测定水杨酸对Foc TR4生长的影响。实验结果如图8所示,与0uM相比50uM、100uM和200uM SA的培养基中Foc TR4菌落生长状态和直径无明显变化。随着水杨酸浓度的增大,Foc TR4生长受到抑制,并且浓度越大抑制作用越明显,菌落直径在PDA培养基上呈下降趋势。表明这些浓度的水杨酸对Foc TR4的生长有明显的抑制作用。
4.2水杨酸对香蕉幼苗的生长特性的影响
因为高浓度的水杨酸对植物细胞产生毒性(蔡新忠和郑重,1998),因此我们用30天的香蕉幼苗进行预实验,用100uM和200uM浓度的水杨酸溶液浇灌香蕉幼苗,两天后观察其根部变化,结果如图9所示。在以100uM的水杨酸浓度处理的香蕉幼苗生长良好,根系未受到水杨酸的毒害;而在以200uM的水杨酸浓度处理的香蕉幼苗其根系受到一定的毒害,根系出现坏死。所以我们选择100uM浓度的水杨酸为可利用的处理香蕉幼苗浓度。
4.3水杨酸处理后接种Foc TR4提高香蕉抗病性
以100uM浓度的水杨酸预处理生长60天的感病香蕉幼苗两天,然后香蕉接种FocTR4,三周后观察发病情况,结果如图10所示。从图中可以看出,在接种三周后Foc TR4处理的香蕉已经明显表现出感病症状,如底部叶片变黄,上层叶片失绿,植株与对照相比偏小等(右)。而在水杨酸处理后接种的香蕉幼苗则没有任何外部病症出现,植株大小与对照没有明显的变化(左)。在内部症状方面,我们观察球茎横截面发现,Foc TR4处理的香蕉幼苗球茎已经褐变,而水杨酸处理后接种Foc TR4的香蕉幼苗球茎并未发现明显的褐变(图10b)。因此水杨酸处理能诱导香蕉的抗病性。
4.4水杨酸处理后接种Foc TR4提高感病香蕉内源水杨酸的含量
感病品种巴西蕉幼苗经外源水杨酸处理2天后接种Foc TR4,检测香蕉根系水杨酸的含量,结果如图11所示。香蕉根系游离态水杨酸含量比对照增加,与不用水杨酸处理直接接种Foc TR4处理对比,游离态水杨酸含量显著增加,说明水杨酸处理能增加香蕉根系中游离态水杨酸的生物合成。结合态水杨酸含量的变化与游离态基本一致,即经外源水杨酸处理2天后接种Foc TR4与不用水杨酸处理直接接种相比,结合态水杨酸整体呈现增加趋势。表明外源水杨酸处理能激活接种Foc TR4后香蕉根系内源水杨酸的生物合成。
4.5水杨酸处理后接种Foc TR4对诱导水杨酸代谢途径关建酶基因的表达
结果如图12所示,水杨酸处理后接种Foc TR4显著提高感病品种巴西蕉根系中水杨酸代谢途径关键基因MaDAHPS1、MaEPSPS1、MaICS、MaCAD1和MaC4H2表达,而这些基因的表达与处理后根系中水杨酸含量的变化是相一致的,说明通过调控水杨酸代谢途径基因的表达可以提高香蕉感病品种中内源水杨酸的含量,从而提高香蕉对枯萎病的抗性。
本研究中我们外施100uM的水杨酸能够很好地控制枯萎病病害的发生,同时在培养基中加入低于200uM的SA对病原菌的生长没有影响,证明水杨酸能增强香蕉对枯萎病菌的抗性是通过提高植物的抗病性来实验的,而不是抑制了病原菌的生长。
由于香蕉对水杨酸很敏感,高浓度的水杨酸处理会对香蕉根系造成一定的毒害,使根系变褐。本研究选择低浓度的水杨酸处理香蕉幼苗,虽然没有显著提高内源游离态水杨酸的含量,但水杨酸的预处理可以激活水杨酸生物合成相关的代谢途径,激活水杨酸的信号途径,使这些基因的表达提高,当香蕉遭受Foc TR4的侵染时,这些代谢途径便会发挥其抗病作用,导致接菌后内源总水杨酸含量有所上升,赋予了香蕉获得具有依耐与水杨酸介导的抗病途径。
在感病品种中进一步验证水杨酸生物合成和信号传导相关基因的表达,结果表明感病品种在外源水杨酸处理幼苗后能使其获得抗病性,而这个抗病性的获得是通过激活水杨酸生物合成和信号传导相关基因的表达,增加了内源水杨酸的生物合成,使内源水杨酸含量增加,致使香蕉获得系统抗性,对Foc TR4产生抗性,从而增强了感病品种的抗病性。
我们的研究和发现,不仅为今后香蕉抗枯萎病早期筛选提供了有用的标记基因,而且建立了一套通过提高香蕉体内水杨酸含量提高植株抗病能力的方法。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (5)

1.一组筛选抗枯萎病香蕉品种的基因标记物,其特征在于,所述基因标记物包含标记基因MaDAHPS1、MaEPSPS1、MaICS、MaCAD1和MaC4H2,MaDAHPS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,MaEPSPS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,MaICS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,MaCAD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,MaC4H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.一种筛选抗枯萎病香蕉品种的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将香蕉幼苗接种镰刀菌,然后确定权利要求1所述的基因标记物的表达水平,筛选基因标记物的表达水平提高的香蕉幼苗。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在接种镰刀菌之前,先确定香蕉幼苗中权利要求1所述的基因标记物的表达水平。
4.权利要求1所述的基因标记物在筛选抗枯萎病香蕉品种中的应用。
5.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含用于检测权利要求1所述的基因标记物的表达的探针。
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