CN1307310C - 香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆 - Google Patents

香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因,本发明还公开了一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因克隆,根据已测的PGC1蛋白N末端编码序列设计引物,以香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株总RNA为模板,采用RT-PCR方法,合成cDNA的第一条链,5’RACE和3’RACE的方法克隆PGC1cDNA的全长序列,推测出PGC1的氨基酸序列。本发明获得的PGC1基因cDNA序列,可以作为区分FOC1号和4号小种的依据;将PGC1基因转化到真核微生物中,所表达的PGC1可以作为免疫蛋白抗原制作动物血清,作病原菌检测使用;真核微生物表达产物可以代替病原菌作耙标物,广泛筛选对PGC1有效的抗病基因,供香蕉抗枯萎病转基因育种使用。

Description

香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆
技术领域
本发明属于植物保护和生物技术领域,特别涉及一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆。
背景技术
香蕉镰刀菌枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病,是由镰刀菌侵染引起维管束坏死的土传性病害,病原菌为尖镰孢霉古巴专化型[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hansen](FOC).病原菌从受伤的根茎侵入,通过寄主维管束向茎上发展,并进一步向假叶部蔓延。当植株枯死后,病原菌随残体遗留在土壤中,随着水流或带菌的农具在蕉园内再进行自然传播,其厚垣孢子可在土壤中存活8~10年。由于该菌存活期长,传播迅速,尚未有防止该病的特效药物,因此一旦在香蕉产地发病,很可能大面积爆发将造成重大损失。
尖镰刀菌古巴专化型有4个生理小种,1号小种(race1)感染香蕉的栽培种“大蜜哈”[Grosmichel(AAA)]及龙牙蕉(MusaAAB),矮蕉[Dwarfcavendish(AAA)]较抗病,该小种呈世界分布,在中国大陆已有记录;2号小种(race2)在中美洲,仅感染三倍体杂种梭香蕉[Bluggoe(AAB)],不侵染“大蜜哈”;3号小种(race3)感染野生的羯尾蕉属(Heliconia);4号小种(race4)能感染几乎所有的香蕉种类,如Cevendish、“大蜜哈”、矮香蕉、野蕉(BB)和梭指蕉,毁灭性最大,在全世界范围内尚末找到有效的抵抗4号小种的香蕉品种。
香蕉枯萎病侵染时间长,没有有效的农药和防治措施,品种抗病性成为一个重要的控病方法。但是,由于对病害的侵染过程缺乏深入的研究,目前未见有关香蕉枯萎病的致病性研究报道,对病菌的致病因子没有足够的认识,抗病品种的选取很难取得理想的进展。植物病原菌可产生一系列的果胶酶,许多研究发现内切多聚半乳糖醛酸酶与病原菌的毒力和致病性高度相关。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点,提供一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶PGC1基因及其克隆。从香蕉枯萎病菌的致病性内切半乳糖醛酸酶是作为病菌的检疫检测的新指标,以及用于筛选和培育新的香蕉抗病品种。
一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因,其核苷酸序列,PGC1cDNA的全长序列如下:
cttcaacaac tctttgcatc ctcttgtctt tgtctcacac gaatatcaca atg gtt         56
cga aac atc gct att gcg gct ttg ctg cca gct gcc ttt gct tca acg        104
ctg cct cga gat ccc tgc agc gtg act gac tac tcc ggc ctc gcc acc        152
gcc gtc tca tct tgc aca aac att gtg ctc aac ggt ttc caa gtc ccc        200
act ggc aag gct ctt gat cta tcc aag ctc aag gac ggc gca acc gtt        248
acc ttc aag ggc aag acc acg ttt gcc act act gcc gat aac gac ttt        296
gat cct atc gtc att agc gga aat ggc atc act ata act ggt gca tct        344
ggc cat gtc att gat ggt aac ggc ccg gcg tac tgg gat ggc gaa ggt        392
tct aac aac aag aaa aac cca aag ccc gac cat ttc atc gtt gtc aag        440
aag act acc ggc aac tca aag atc aca aac ctg aac atc cag aac tgg        488
ccc gtt cac tgc ttc gac atc aca ggc agt tca caa ttg acc atc tca        536
ggg ctc att ctt gat aac aga ctt ggc gac aag ccc aat gcc aag agc        584
ggt agc ttg ccc gct gcg cac aac agc gac ggt ttc gac atc ccg tcc        632
agt gac cac gtt act ctg gat aac att cat gtt tat aac cag gat gac        680
tgt gtt gct gtc act tcg ggt aca aac atc atc gtc tcc aac atg tac        728
tgc tcc ggt ggt cat ggt ctt agc att gga tct gtt ggc ggc aag agc        776
aac aat gtc gtc aat ggt gtt cag ttc ttg gat tcg cag att gtt aac        824
agt gag aat gga tgc cgc atc aag tcc aac tct ggc aca act ggc acg        872
att gag aac gcc acg tac caa aac att gcc ctt acc aac atc agc aaa        920
tat ggt gtc gat gtc cag cag gac tat ctc aac ggt ggc cct act gga        968
aag ccc acc aac gga gtc aag atc agc ggt atc aag ttc atc aag gtc       1016
act ggt aca gtg gct agc tct gct caa gat tgg tat att ctg tgt ggc       1064
gat ggt agc tgc tct gga ttc act ttc tct gga aac gcc atc act ggt       1112
ggt ggc aag act agc agc tgc aac tat cct acc aac act tgc cct agc       1160
aag gtc aaa gcg gga cga tca cca ctc cat gtt cac aaa gct aga acc       1208
cag tca aag agt ggt ctt acg gtt gtt gcg tgg aat tgc tgc ggc gga       1256
cag ttg tgagcttggg tctatagtag tatttgtccg atagtcacta ggcttatctt        1312
agcaatacac tttatttatc gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1372
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa           1426
推测的PGC1的氨基酸序列如下:
Met Val Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala
1               5                   10                  15
Ser Thr Leu Pro Arg
Figure C20051003329600081
Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu
             20             25                      30
Ala Thr AlaVal Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val Leu Asn Gly Phe Gln
        35                 40                  45
Val Pro Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys Asp Gly Ala
    50                  55                   60
Thr Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe Ala ThrThr Ala Asp Asn
65                  70                  75                 80
Asp Phe Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly Asn Gly IleThr Ile Thr Gly
                85                  90                 95
Ala Ser Gly His Val  Ile Asp Gly Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly
            100                  105                 110
Glu Gly Ser Asn Asn Lys Lys Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val
        115                 120                 125
Val Lys Lys Thr Thr Gly Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln
    130                 135                 140
Asn Trp Pro Val His Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ile Ser Gly Leu Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala
                165                 170                 175
Lys Ser Gly Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln
        195                 200                 205
Asp Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn
    210                 215                 220
Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly
225                 230                 235                 240
Lys Ser Asn Asn Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser Gln Ile
                245                 250                 255
Val Asn Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser Gly Thr Thr
        260                     265                  270
Gly Thr Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Ile
        275                 280                 285
Ser Lys Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr Leu Asn Gly Gly Pro
    290                 295                 300
Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile Ser Gly Ile Lys Phe lle
305                 310                 315                 320
Lys Val Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu
                325                 330                 335
Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile
            340                 345                 350
Thr Gly Gly Gly Lys Thr Ser Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys
        355                 360                 365
Pro Ser Lys Val Lys Ala Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala
    370                 375                 380
Arg Thr Gln Ser Lys Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys
385                 390                 395                 400
Gly Gly Gln Leu
其中 Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val为已知PGCl蛋白N端测序部分,Asp为PGC1成熟蛋白N端编码氨基酸。
本发明的香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因克隆,根据已测的PGC1蛋白N末端编码序列设计引物,以香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株总RNA为模板,采用RT-PCR方法,合成cDNA的第一条链,5’RACE和3’RACE的方法克隆PGC1 cDNA的全长序列,推测出PGC1的氨基酸序列。
本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果:本发明纯化的多聚半乳糖醛酸酶PGC1是香蕉枯萎病菌4号生理小种的关键致病因子之一,获得的PGC1基因cDNA序列,可以作为区分FOC1号和4号小种的依据。将PGC1基因转化到真核微生物中,所表达的PGC1可以作为免疫蛋白抗原制作动物血清,作病原菌检测使用。同时,真核微生物表达产物可以代替病原菌作耙标物,广泛筛选对PGC1有效的抗病基因,供香蕉抗枯萎病转基因育种使用。
附图说明
图1为Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析图。
图2为Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析收集各管的PG活性变化曲线。
图3为Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换柱层析图。
图4为Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换柱层析收集各管的PG活性变化曲线。
图5为Sepharose CM弱阳离子交换柱层析图。
图6为Sepharose CM弱阳离子交换柱层析收集各管的PG活性变化曲线。
图7为纯化PGC1的IEF-PAGE电泳图谱。
其中71为粗酶液PG同工酶染色;72为经Sepharose CM Hitrap收集的PGC1酶染色;73为经Sepharose CM Hitrap收集的PGC1酶蛋白银染;74为标准等电点(pI3.5-9.5)。
图8为各纯化PGC1步骤的SDS-PAGE电泳银染图谱。
其中81为Sepharose SP XL 16/10收集酶液;82为Sephacryl S-100 16/10收集酶液;83为粗酶液;84为Sepharose CM Hitrap收集酶液;85为低分子量蛋白标准。
图9为3’端racePCR产物电泳。
91为第一轮RT-PCR产物;92为第二轮nest-PCR产物
图10为5’端racePCR产物电泳。
1为第一轮RT-PCR产物;2为第二轮nest-PCR产物
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
根据PGC1酶蛋白的N-端的22个氨基酸设计简并引物PGA1,PGA2。以香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株总RNA为模板,采用RT-PCR方法,退火温度47.9℃,与反向锚定引物Oligo(T)20进行PCR扩增,RT-PCR扩增产物,用PGA2和Oligo(T)20进行巢式PCR扩增,在54℃退火温度得到了特异性很强的1200bp单一条带RPGC1。将该片段送上海联合基因公司克隆、测序后,发现RPGC1全长1222bp,序列分析后发现包含PGC1蛋白质N-端的部分序列SGLAYAVSSCYNI。在PGC1片断中还包括一个终止密码子TGA。在终止密码子下游还包含一个长69bp的3’端非编码区,其中包括聚腺苷酸化的信号-TTTATTT-,以及一个含72个腺苷酸的poly(A)。由此证实得到的片段为PGC1基因的3’端的片段。
为了得到PGC1的全长DNA基因片段,根据RPGC1的序列设计引物,采用TaKaRa的5’Full RACE core set试剂盒进行5’片段的扩增。以PGB3为引物反转录总RNA,通过PGA3和PGLS1进行扩增得到一条800bp的条带,用PGLS2与PGA3进行巢式PCR扩增,在退火温度内得到了特异性很强的750bp单一条带LPGC1。目的片段克隆、测序后发现它全长758nt。序列分析后发现,除掉它与RPGC1重叠片段后,还包含120nt序列,LPGC1中包含N-端全部已测出的22个氨基酸序列和1个起始密码子AUG。起始密码子前有50nt的5’端非编码区。从序列分析结果可以证实,片段为PGC1基因的5’末端片段。
PGA1:5’TGCWSCGTSACTGACTACTCYGGC3’
PGA2:5’CTCGCYACCGCYGTCTCATCYTG3’
PGB2:5’CCAGAGTTGGACTTGATG3’
PGA3:5’GTTACCTTCAAGGGCAAGACC3’
PGLS1:5’ACAATGTTTGTGCAAGATGAGAC3’
PGLS2:5’GGCCGGAGTAGTCAGTCACTGAG3’
可获全长cDNA序列并推测氨基酸序列。
本发明中液体培养基:NH4HNO31.0g、KCl0.2g、FeSO40.01g、KH2PO40.2g ZnSO40.01g蒸馏水1000mL。Sigma公司产柑桔果胶5g,羧甲基纤维素钠5g,液体培养基pH值5.0后,于121℃、15磅下灭菌20min。
PG酶活性的测定:用pH5.0的0.05mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液配制0.5%的果胶酸溶液,取1mL果胶酸溶液与0.5mL稀释100倍的酶液混合,于45℃水浴锅中反应30min,立即加入DNS试剂0.5mL中止反应,再加入蒸馏水至5mL。在Bakeman分光光度计520nm波长处测定反应混合物的O.D值。测定后,取样品的O.D值平均值在标准曲线查出相应的糖量。对照除加入的PG酶液沸煮10min的失活酶液外,其余操作同上。多聚半乳糖醛酸酶的酶活单位为45℃下每mg酶每分钟催化低物释放1μmolD-半乳糖醛酸量(μmol/mg·min)。
酶蛋白浓度测定按Bradforf方法,用考马斯亮兰G250显色,在595nm下比色测定,用牛血蛋白清作标准曲线。
根据已测的PGC1蛋白N末端编码序列设计引物,克隆PGC1 cDNA的全长序列,推测出PGC1的氨基酸的序列。具体操作过程如下:
首先,提取纯化香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶,其工艺步骤是:
-20℃低温保藏的香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株(由广东省农业科学院提供)活化,接种在加有香石竹叶片的PDA平板上,25℃培养7天,用0.7cm打孔器在菌落边缘打下菌片,每个250mL三角瓶盛诱导果胶酶液体培养基100mL,加4个菌片,25℃下,110rpm振荡培养10天。在4℃,16000g下离心20min,取上清液。然后用Millipore公司的Amicon 8400超滤浓缩系统,内含10kDa超滤膜,浓缩约200倍,测多聚半乳糖醛酸酶活性和蛋白含量,保存于-20℃冰箱中备用。
采用Amersham Biosciences的全自动蛋白层析系统AKTA purify HPLC,预先用内含0.15mol/L NaCl,pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液,平衡120mL的Sephacry S-100 16/10凝胶柱,上述粗酶液上样量为2mL,用凝胶柱平衡缓冲液洗脱1.5倍柱体积,流速2.5mL/min,收集4mL/管。检测洗脱液在OD280的吸光值,可见两个蛋白峰A和B,如图1所示。测各管收集液的PG活性表明,15-48收集管中存在PG活性,如图2所示。合并每次层析收集的酶活性大于粗酶液活性25%洗脱液,用Millipore公司的10kDa超滤离心管浓缩脱盐,获得组分BI,测浓缩液酶活性及蛋白含量。
BI每次上样2mL于20mL的Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换层析柱中,预先用pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液平衡柱,用pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液配置的0.75mol/L NaCl溶液进行线性梯度洗脱30倍体积,流速4mL/min,收集梯度洗脱部分,4mL/管。经过Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换柱层析后,可见一明显的蛋白洗脱峰C,如图3所示。PG活性检测表明,从60-74收集管存在PG活性,如图4所示。合并每次层析收集的酶活性大于BI活性25%洗脱液,经10kDa超滤离心管浓缩脱盐,获得组分CI,测浓缩液酶活性及蛋白含量。
CI每次上样0.5mL于1mL的Sepharose FF CM弱阳离子交换层析柱,用pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液配置的0.75mol/L NaCl溶液进行线性梯度洗脱30倍柱体积,流速1mL/min,收集0.5mL/管,OD280检测为一对称的蛋白洗脱峰D,如图5所示,39-54收集管的有PG活性,如图6所示,收集梯度洗脱峰,合并数次层析的收集洗脱液,经10kDa超滤离心管浓缩脱盐,获得组分DI,进行IEF-PAGE同工酶电泳染色只检测到PGC1,如图7所示,SDS-PAGE电泳显示DI为一条蛋白带,如图8所示,即为达电泳纯的多聚半乳糖醛酸酶PGC1。
各纯化步骤组分析表明,纯化的PGC1酶活性为260.52 Units mg-1.min-1,与培养液相比较纯化了51.59倍,见表1。
   表1  PGC1纯化表
纯化步骤 总蛋白(mg) 总活性(U) 回收率(%) 比活性(Unitsmg-1.min-1) 纯化倍数
16000g离心上清 268.1 13539.05 100 5.05 0
PM-10膜浓缩液 38.88 297.04 0.022 7.46 1.48
Sephacryl S-100 16/10(BI) 4.10 98.81 0.0072 24.51 4.85
Sepharose SP XL 16/10(CI) 0.32 49.34 0.0036 154.2 30.53
Sepharose CM Hitrap(DI) 0.16 41.68 0.0031 260.52 51.59
超薄层IEF-PAGE电泳后,以标准等电点电泳迁移率作标准曲线的,从曲线中查出PGC1的等电点约为7.85,如图7所示。
用SDS-PAGE电泳,以标准分子量对数为纵坐标,迁移率为横坐标作直线回归图,以回归方程y=3.1554x2-38.239x+131.33(R=0.997)计算出PGC1的相对分子量为42.3kDa,如图8所示。
由中国科学技术大学生命科学院协助测定的PGC1酶蛋白N-末端序列为Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr ArgIle Val。
香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株,低温保存菌株接种在加有香石竹叶片的PDA平板培养基上,25~28℃培养3~4天,过滤除去菌丝,提取病菌总RNA,于-70℃保存。
低温保藏的病菌菌株经活化在液体培养基:NH4HNO3 1.0g、KCl 0.2g、FeSO4 0.01g、KH2PO4 0.2g、ZnSO4 0.01g、蒸馏水1000mL。Sigma公司产柑桔果胶5g,羧甲基纤维素钠5g,培养4天,用2层普通滤纸以布氏漏斗滤出菌丝,经双蒸水(ddH2O)充分洗涤,真空泵抽干水分。改进OMEGA公司的真菌RNA抽提纯化试剂盒E.Z.NA FungaL RNA Kit方法提取总RNA。其过程为:首先将抽滤收获的菌体放入研钵中,加液氮速冻后研磨成粉末,取约10-20mg粉末转移到用液氮预冷的1.5mL离心管中,向离心管中加入600μLRNA裂解液RFL和12μL β-巯基乙醇快速混匀,振荡10秒,使菌丝粉末完全溶解。然后加入140μL RNA抽提液SP,颠倒混合数秒钟,冰浴15分钟,室温离心10000g,10min,吸取上清,再加入140μL RNA抽提液SP,重复抽提一次,以完全除去除菌丝体中的蛋白质和多糖。接着吸取上清,加入等体积异丙醇,室温离心10000g,10min,弃上清,离心管倒置于干净滤纸上,流干其中的液体。加350μL 65℃预热RB缓冲液,350μL溶解RNA沉淀,加入350μL75%的无水乙醇,剧烈振荡混匀。再将混匀的样品移入HiBind RNAspin吸附柱中,放入2mL离心管中,室温离心10000g,30sec,取出吸附柱,倒掉离心管中的滤液。吸附柱中加入750μL洗脱缓冲液I,室温离心10000g,30sec,取出吸附柱,倒掉离心管中的滤液。吸附柱中加入500μL洗脱缓冲液II,室温离心10000g,30sec,取出吸附柱,倒掉离心管中的滤液,重复一次。最后加入30μL去离子甲酰胺溶液,放入新的1.5mL离心管中,室温离心10000g,1min,所获洗脱液即为提取的RNA。
测得的PGC1酶蛋白N-末端序列,在GenBank中查找同源序列,根据同源序列的氨基酸密码子的偏好性,同时也考虑香蕉枯萎病菌密码子本身的偏好性,利用Omiga2.0软件设计两条上游简并引物PGA1和PGA2,进行3’RACE(RNA3’端快速扩增)。
PGA1:5’TGCWSCGTSACTGACTACTCYGGC3’
PGA2:5’CTCGCYACCGCYGTCTCATCYTG3’
首先合成cDNA的第一链,在200μL PCR管中配制下列反应液:1μL总RNA,4μL 5×反转录缓冲液,10mM的dNTPs(脱氧核苷三磷酸)2μL,40units/μL的RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)0.5μL,20μm的Oligo(dT)20 Primer2.5μL,5μ/μL的AMV反转达录酶2μL,加DEPC(焦碳酸二乙酯)处理ddH2O至总体积20μL。混合均匀后在室温放置10min后移于42℃恒温槽中。42℃保温1h,在冰水中冷却2min。然后以PGA1和Oligo(dT)20进行第一轮RT-PCR,在冰上准备下列反应物:1μL cDNA模板,5units/μL的Pfu Taq 0.25μL,含Mg2+的10×Pfu缓冲液2.5μL,25mM的dNTPs4μL,20μm的上游引物PGA10.5μL,20μm的下游引物Oligo(dT)200.5μL,加入灭菌ddH2O至总体积25μL。混匀后在Hybraid express梯度PCR仪上,进行扩增:94℃,3min预变性;94℃,45sec变性;47.9℃,40sec退火;72℃,1:30min延伸;35个重复循环,最后72℃,延伸10min。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
然后将第一轮PCR产物稀释100倍用于第二轮巢式PCR扩增。巢式PCR的反应体系为:1μL第一轮扩增DNA,5units/μL的Ex Taq 0.25μL,含Mg2+的10×Pfu缓冲液2.5μL,25mM的dNTPs4μL,20μm的上游引物PGA20.5μL,20μm的下游引物Oligo(dT)200.5μL,加入灭菌ddH2O至总体积25μL。混匀后在Hybraid express梯度PCR仪上,进行扩增:94℃,3min预变性;94℃,45sec变性;54℃,45sec退火;72℃,1:30min延伸;35个重复循环,最后72℃,延伸10min。反应结束后在1%琼脂糖凝胶电泳检测到一条1200bp的特异DNA条带RPGC1(图9),用上海申能博彩生物有限公司的凝胶回收试剂盒回收,送上海联合基因公司测序。将该片段克隆、测序后,发现RPGC1全长1222bp(表1),序列分析后发现,包含PGC1蛋白质N-端的部分序列。在PGC1片断中还包括一个终止密码子TGA。在终止密码子下游还包含一个长69bp的3非编码区,其中包括聚腺苷酸化的信号-TTTATTT-,以及一个含72个腺苷酸的poly(A)。由此证实得到的片段为PGC1基因的3’端的片段。
PGB2以已知RPGC1序列设计5’端磷酸化引物PGB2起始cDNA链的合成,进行5’端RACE。将单链cDNA环化,设计两对序列特异性引物扩增环化的单链cDNA,PGA3和PGAL1为第一轮扩增引物,PGA3和PGLS2为第二轮扩增引物。首先配制反转录反应液:1μL总RNA,4μL 5×反转录缓冲液,10mM的dNTPs2μL,40units/μL的RNase Inhibitor 0.5μL,20μm的PGB2Primer(引物)2.5μL,5μ/μL的AMV反转达录酶2μL,加DEPC处理ddH2O至总体积45μL。混合均匀后在室温放置10min后移于42℃恒温槽中。42℃保温1h,在冰水中冷却2min。
然后将PGB2反转录的15μL的cDNA加入的5×Hybrid RNA Degeneration缓冲液(5倍RNA连接缓冲液)5μL,加水至75μL,再加入1μLRNase H,30℃反应1小时。反应结束后加入100μL的灭菌蒸馏水,500μL的100%乙醇均匀混合后在-20℃放置30分钟,进行乙醇沉淀。用的70%乙醇,清洗沉淀两次后将沉淀干燥处理。
在乙醇沉淀的单链cDNA中加入5×RNA Ligation buffe 8μL,40%PEG(聚乙二醇)#6000 20μL,T4 RNA Ligase 1μL,溶解乙醇沉淀的DNA,加灭菌ddH2O至反应总体积45μL,16℃,过夜(反应15~18h)。取反应液为RT-PCR的模板进行反应,按如下准备反应混合液:
1μL cDNA模板,5units/μL的Pfu Taq 0.25μL,含Mg2+的10×Pfu缓冲液2.5μL,25mM的dNTPs 4μL,20μm的上游引物PGLS1 0.5μL,20μm的下游引PGA3 0.5 μL,加入灭菌ddH2O至总体积25μL。混匀后在Hybraid express梯度PCR仪上,进行扩增:94℃,3min预变性;94℃,45sec变性;56℃,45sec退火;72℃,1min延伸;35个重复循环,最后72℃,延伸10min。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测。取1μL第一轮扩增DNA,5units/μL的Ex Taq0.25μL,含Mg2+的10×Pfu缓冲液2.5μL,25mM的dNTPs 4μL,20μm的上游引物PGLS2 0.5μL,20μm的下游引物PGA3 0.5μL,加入灭菌ddH2O至总体积25μL。混匀后在Hybraid express梯度PCR仪上,进行扩增:94℃,3min预变性;94℃,45sec变性;56℃,45sec退火;72℃,1min延伸;35个重复循环,最后72℃,延伸10min。
PGB2:5’CCAGAGTTGGACTTGATG3’
PGA3:5’GTTACCTTCAAGGGCAAGACC3’
PGLS1:5’ACAATGTTTGTGCAAGATGAGAC3’
PGLS2:5’GGCCGGAGTAGTCAGTCACTGAG3’
通过PGA3和PGLS1进行扩增得到一条800bp的条带,用PGLS2与PGA3进行巢式PCR扩增,在退火温度内得到了特异性很强的750bp单一条带LPGC1(图10)。目的片段克隆、测序后发现它全长758nt。序列分析后发现,除掉它与RPGC1重叠片段后,还包含120nt序列(表1),LPGC1中包含N-端全部已测出的22个氨基酸序列(表1下划线部分)和1个起始密码子AUG。起始密码子前有50nt的5’端非编码区。从序列分析结果可以证实,片段为PGC1基因的5’末端片段。将LPGC1和RPGC1从起始密码子到终止密码子的部分合并,得到PGC1 cDNA序列。
利用将所获的PGC1 cDNA片段推测的氨基酸的序列,PGC1 cDNA的全长序列为1215个核苷酸组成,编码产物N端21个氨基酸残基构成信号肽序列和383个氨基酸的PGC1的成熟蛋白,使用DNA Star软件推测PGC1成熟蛋白的分子量和等电点,推测的成熟蛋白分子量是39.8kDa,等电点7.74。与通过SDS-PAGE和等电聚焦测定的分子量和等电点相吻合。确定该cDNA序列是PGC1蛋白的编码基因。
                     表1  PGC1蛋白的编码基因
cDNA                                                  1       CT    2
3    TCA ACA ACT CTT TGC ATC CTC TTG TCT TTG TCT CAC ACG AAT ATC    47
48   ACA ATG GTT CGA AAC ATC GCT ATT GCG GCT TTG CTG CCA GCT GCC    92
AAl      Met Val Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala    14
93   TTT GCT TCA ACG CTG CCT CGA GAT CCC TGC AGC GTG ACT GAC TAC    137
15   Phe Ala Ser Thr Leu Pro Arg Pro  Cys Ser Val Thr Asp Tyr  29
138  TCC GGC CTC GCC ACC GCC GTC TCA TCT TGC ACA AAC ATT GTG CTC    182
30    Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val Leu    44
183  AAC GGT TTC CAA GTC CCC ACT GGC AAG GCT CTT GAT CTA TCC AAG    227
45   Asn Gly Phe Gln Val Pro Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys    59
228  CTC AAG GAC GGC GCA ACC GTT ACC TTC AAG GGC AAG ACC ACG TTT    272
60   Leu Lys Asp Gly Ala Thr Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe    74
273  GCC ACT ACT GCC GAT AAC GAC TTT GAT CCT ATC GTC ATT AGC GGA    317
75   Ala Thr Thr Ala Asp Asn Asp Phe Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly    89
318  AAT GGC ATC ACT ATA ACT GGT GCA TCT GGC CAT GTC ATT GAT GGT    362
90   Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly Ala Ser Gly His Val Ile Asp Gly    104
363  AAC GGC CCG GCG TAC TGG GAT GGC GAA GGT TCT AAC AAC AAG AAA    407
105  Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly Glu Gly Ser Asn Asn Lys Lys    119
408  AAC CCA AAG CCC GAC CAT TTC ATC GTT GTC AAG AAG ACT ACC GGC    452
120  Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val Val Lys Lys Thr Thr Gly    134
453  AAC TCA AAG ATC ACA AAC CTG AAC ATC CAG AAC TGG CCC GTT CAC    497
135  Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln Asn Trp Pro Val His    149
498  TGC TTC GAC ATC ACA GGC AGT TCA CAA TTG ACC ATC TCA GGG CTC    542
150  Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr Ile Ser Gly Leu    164
543  ATT CTT GAT AAC AGA CTT GGC GAC AAG CCC AAT GCC AAG AGC GGT    587
165  Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala Lys Ser Gly    179
588  AGC TTG CCC GCT GCG CAC AAC AGC GAC GGT TTC GAC ATC CCG TCC    632
180  Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile Pro Ser    194
633  AGT GAC CAC GTT ACT CTG GAT AAC ATT CAT GTT TAT AAC CAG GAT    677
195  Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln Asp    209
678  GAC TGT GTT GCT GTC ACT TCG GGT ACA AAC ATC ATC GTC TCC AAC    722
210  Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn    224
723  ATG TAC TGC TCC GGT GGT CAT GGT CTT AGC ATT GGA TCT GTT GGC    767
225  Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly    239
768  GGC AAG AGC AAC AAT GTC GTC AAT GGT GTT CAG TTC TTG GAT TCG    812
240  Gly Lys Ser Asn Asn Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser    254
813  CAG ATT GTT AAC AGT GAG AAT GGA TGC CGC ATC AAG TCC AAC TCT    857
255  Gln Ile Val Asn Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser    269
858  GGC ACA ACT GGC ACG ATT GAG AAC GCC ACG TAC CAA AAC ATT GCC    902
270  Gly Thr Thr Gly Thr Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala    284
903  CTT ACC AAC ATC AGC AAA TAT GGT GTC GAT GTC CAG CAG GAC TAT    947
285  Leu Thr Asn Ile Ser Lys Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr    299
948  CTC AAC GGT GGC CCT ACT GGA AAG CCC ACC AAC GGA GTC AAG ATC    992
300  Leu Asn Gly Gly Pro Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile    313
993  AGC GGT ATC AAG TTC ATC AAG GTC ACT GGT ACA GTG GCT AGC TCT    1037
315  Ser Gly Ile Lys Phe Ile Lys Val Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser    329
1038 GCT CAA GAT TGG TAT ATT CTG TGT GGC GAT GGT AGC TGC TCT GGA    1082
330  Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Gly    344
1083 TTC ACT TTC TCT GGA AAC GCC ATC ACT GGT GGT GGC AAG ACT AGC    1127
345  Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile Thr Gly Gly Gly Lys Thr Ser    359
1128 AGC TGC AAC TAT CCT ACC AAC ACT TGC CCT AGC AAG GTC AAA GCG    1172
360  Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys Pro Ser Lys Val Lys Ala    374
1173  GGA CGA TCA CCA CTC CAT GTT CAC AAA GCT AGA ACC CAG TCA AAG   1217
375   Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala Arg Thr Gln Ser Lys   389
1218  AGT GGT CTT ACG GTT GTT GCG TGG AAT TGC TGC GGC GGA CAG TTG   1262
390   ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys Gly Gly Gln Leu
1263  TGA GCT TGG GTC TAT AGT AGT ATT TGT CCG ATA GTC ACT AGG CTT   1307
                   ★
1308  ATC TTA GCA ATA CAC TTT ATT TAT CGC AAA AAAAAAAAAAAAAAA       1352
1353  AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA   1397
1398  AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA                        1426
注:斜体部分为推测的氨基酸序列,____为已知PGC1蛋白N端测序部分,
Figure C20051003329600181
为PGC1成熟蛋白N端编码氨基酸。
香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>华南农业大学
<120>香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆
<130>1
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1426
<212>DNA
<213>Fusarium oxysporum f.sp.cubense
<220>
<221>CDS
<222>(51)..(1262)
<400>1
cttcaacaac tctttgcatc ctcttgtctt tgtctcacac gaatatcaca atg gtt    56
                                                       Met Val
                                                       1
cga aac atc gct att gcg gct ttg ctg cca gct gcc ttt gct tca acg   104
Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala Ser Thr
      5                      10                 15
ctg cct cga gat ccc tgc agc gtg act gac tac tcc ggc ctc gcc acc   152
Leu Pro Arg Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr
    20                  25                   30
gcc gtc tca tct tgc aca aac att gtg ctc aac ggt ttc caa gtc ccc   200
Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val Leu Asn Gly Phe Gln Val Pro
35                  40                  45                   50
act ggc aag gct ctt gat cta tcc aag ctc aag gac ggc gca acc gtt   248
Thr Gly LysAla Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys Asp Gly Ala Thr Val
               55                  60                  65
acc ttc aag ggc aag acc acg ttt gcc act act gcc gat aac gac ttt    296
Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe Ala Thr Thr Ala Asp Asn Asp Phe
            70                  75                   80
gat cct atc gtc att agc gga aat ggc atc act ata act ggt gca tct    344
Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly Ala Ser
        85                  90                   95
ggc cat gtc att gat ggt aac ggc ccg gcg tac tgg gat ggc gaa ggt    392
Gly His Val Ile Asp Gly Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly Glu Gly
    100                 105                 110
tct aac aac aag aaa aac cca aag ccc gac cat ttc atc gtt gtc aag    440
Ser Asn Asn Lys Lys Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile ValVal Lys
115                 120                 125                130
aag act acc ggc aac tca aag atc aca aac ctg aac atc cag aac tgg    488
Lys Thr Thr Gly Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln Asn Trp
                135                 140                     145
ccc gtt cac tgc ttc gac atc aca ggc agt tca caa ttg acc atc tca    536
Pro Val His Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr Ile Ser
             150                155                 160
ggg ctc att ctt gat aac aga ctt ggc gac aag ccc aat gcc aag agc    584
Gly Leu Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala Lys Ser
        165                 170                 175
ggt agc ttg ccc gct gcg cac aac agc gac ggt ttc gac atc ccg tcc    632
Gly Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile Pro Ser
    180                 185                 190
agt gac cac gtt act ctg gat aac att cat gtt tat aac cag gat gac    680
Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln Asp Asp
195                 200                 205                 210
tgt gtt gct gtc act tcg ggt aca aac atc atc gtc tcc aac atg tac    728
Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn Met Tyr
                215                 220              225
tgc tcc ggt ggt cat ggt ctt agc att gga tct gtt ggc ggc aag agc    776
Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly Lys Ser
            230                 235                  240
aac aat gtc gtc aat ggt gtt cag ttc ttg gat tcg cag att gtt aac    824
Asn Asn Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser Gln Ile Val Asn
        245                 250                 255
agt gag aat gga tgc cgc atc aag tcc aac tct ggc aca act ggc acg    872
Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser Gly Thr Thr Gly Thr
    260                 265                 270
att gag aac gcc acg tac caa aac att gcc ctt acc aac atc agc aaa    920
Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Ile Ser Lys
275                 280                 285                 290
tat ggt gtc gat gtc cag cag gac  tat ctc aac ggt ggc cct act gga   968
Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr Leu Asn Gly Gly Pro Thr Gly
                295                 300                 305
aag ccc acc aac gga gtc aag atc agc ggt atc aag ttc atc aag gtc    1016
Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile Ser Gly Ile Lys Phe Ile Lys Val
            310                 315                 320
act ggt aca gtg gct agc tct gct caa gat tgg tat att ctg tgt ggc    1064
Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu Cys Gly
        325                 330                 335
gat ggt agc tgc tct gga ttc act ttc tct gga aac gcc atc act ggt    1112
Asp Gly Ser Cys Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile Thr Gly
    340                 345                 350
ggt ggc aag act agc agc tgc aac tat cct acc aac act tgc cct agc    1160
Gly Gly Lys Thr Ser Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys Pro Ser
355                 360                 365                 370
aag gtc aaa gcg gga cga tca cca ctc cat gtt cac aaa gct aga acc    1208
Lys Val Lys Ala Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala Arg Thr
                375                 380                 385
cag tca aag agt ggt ctt acg gtt gtt gcg tgg aat tgc tgc ggc gga    1256
Gln Ser Lys Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys Gly Gly
            390                 395                 400
cag ttg tgagcttggg tctatagtag tatttgtccg atagtcacta ggcttatctt     1312
Gln Leu
agcaatacac tttatttatc gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  1372
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa        1426
<210>2
<211>404
<212>PRT
<213>Fusarium oxysporum f.sp.cubense
<400>2
Met Val Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala
1               5                   10                  15
Ser Thr Leu Pro Arg Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu
            20                  25                   30
Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val Leu Asn Gly Phe Gln
        35                   40                  45
Val Pro Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys Asp Gly Ala
    50                  55                  60
Thr Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe Ala Thr Thr Ala Asp Asn
65                  70                  75                  80
Asp Phe Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly
                85                  90                  95
Ala Ser Gly His Val Ile Asp Gly Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly
            100                 105                 110
Glu Gly Ser Asn Asn Lys Lys Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val
        115                 120                 125
Val Lys Lys Thr Thr Gly Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln
    130                 135                 140
Asn Trp Pro Val His Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ile Ser Gly Leu Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala
                165                 170                 175
Lys Ser Gly Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln
        195                 200                 205
Asp Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn
    210                 215                     220
Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly
225                 230                 235                 240
Lys Ser Asn Asn Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser Gln Ile
                245                  250                 255
Val Asn Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser Gly Thr Thr
            260                 265                  270
Gly Thr Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Ile
        275                 280                     285
Ser Lys Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr Leu Asn Gly Gly Pro
    290                 295                 300
Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile Ser Gly Ile Lys Phe Ile
305                 310                 315                 320
Lys Val Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu
                325                 330                 335
Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile
            340                 345                 350
Thr Gly Gly Gly Lys Thr Ser Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys
        355                 360                 365
Pro Ser Lys Val Lys Ala Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala
    370                 375                 380
Arg Thr Gln Ser Lys Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys
385                 390                 395                 400
Gly Gly Gln Leu

Claims (2)

1、一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因,其核苷酸序列,PGC1cDNA的全长序列如下:
cttcaacaac tctttgcatc ctcttgtctt tgtctcacac gaatatcaca atg gtt       56
cga aac atc gct att gcg gct ttg ctg cca gct gcc ttt gct tca acg     104
ctg cct cga gat ccc tgc agc gtg act gac tac tcc ggc ctc gcc acc     152
gcc gtc tca tct tgc aca aac att gtg ctc aac ggt ttc caa gtc ccc     200
act ggc aag gct ctt gat cta tcc aag ctc aag gac ggc gca acc gtt     248
acc ttc aag ggc aag acc acg ttt gcc act act gcc gat aac gac ttt     296
gat cct atc gtc att agc gga aat ggc atc act ata act ggt gca tct     344
ggc cat gtc att gat ggt aac ggc ccg gcg tac tgg gat ggc gaa ggt     392
tct aac aac aag aaa aac cca aag ccc gac cat ttc atc gtt gtc aag     440
aag act acc ggc aac tca aag atc aca aac ctg aac atc cag aac tgg     488
ccc gtt cac tgc ttc gac atc aca ggc agt tca caa ttg acc atc tca     536
ggg ctc att ctt gat aac aga ctt ggc gac aag ccc aat gcc aag agc     584
ggt agc ttg ccc gct gcg cac aac agc gac ggt ttc gac atc ccg tcc     632
agt gac cac gtt act ctg gat aac att cat gtt tat aac cag gat gac     680
tgt gtt gct gtc act tcg ggt aca aac atc atc gtc tcc aac atg tac     728
tgc tcc ggt ggt cat ggt ctt agc att gga tct gtt ggc ggc aag agc     776
aac aat gtc gtc aat ggt gtt cag ttc ttg gat tcg cag att gtt aac     824
agt gag aat gga tgc cgc atc aag tcc aac tct ggc aca act ggc acg     872
att gag aac gcc acg tac caa aac att gcc ctt acc aac atc agc aaa     920
tat ggt gtc gat gtc cag cag gac tat ctc aac ggt ggc cct act gga     968
aag ccc acc aac gga gtc aag atc agc ggt atc aag ttc atc aag gtc    1016
act ggt aca gtg gct agc tct gct caa gat tgg tat att ctg tgt ggc    1064
gat ggt agc tgc tct gga ttc act ttc tct gga aac gcc atc act ggt    1112
ggt ggc aag act agc agc tgc aac tat cct acc aac act tgc cct agc    1160
aag gtc aaa gcg gga cga tca cca ctc cat gtt cac aaa gct aga acc    1208
cag tca aag agt ggt ctt acg gtt gtt gcg tgg aat tgc tgc ggc gga    1256
cag ttg tgagcttggg tctatagtag tatttgtccg atagtcacta ggcttatctt     1312
agcaatacac tttatttatc gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1372
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa          l426
其PGC1的氨基酸序列如下:
Met Val Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala
1               5                   10                  15
Ser Thr Leu Pro Arg
Figure C2005100332960003C1
Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu
            20                25                  30
Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val Leu Asn Gly Phe Gln
        35                  40                  45
Val Pro Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Set Lys Leu Lys Asp Gly Ala
    50                  55                  60
Thr Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe Ala Thr Thr Ala Asp Asn
65                  70                  75                  80
Asp Phe Asp Pro Ile Val Ile Set Gly Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly
                85                  90                  95
Ala Ser Gly His Val Ile Asp Gly Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly
            100                 105                 110
Glu Gly Ser Asn Asn Lys Lys Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val
        115                 120                 125
Val Lys Lys Thr Thr Gly Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln
    130                 135                 140
Asn Trp Pro Val His Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ile Ser Gly Leu Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala
                165                 170                 175
Lys Ser Gly Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln
        195                 200                 205
Asp Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn IIe Ile Val Ser Asn
    210                 215                 220
Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly
225                 230                 235                 240
Lys Ser Asn Ash Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser Gln Ile
                245                 250                 255
Val Asn Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser Gly Thr Thr
            260                 265                 270
Gly Thr Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Ile
        275                 280                 285
Ser Lys Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr Leu Asn Gly Gly Pro
    290                 295                 300
Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile Ser Gly Ile Lys Phe Ile
305                 310                 315                 320
Lys Val Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu
                325                 330                 335
Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile
            340                 345                 350
Thr Gly Gly Gly Lys Thr Ser Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys
        355                 360                 365
Pro Ser Lys Val Lys Ala Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala
    370                 375                 380
Arg Thr Gln Ser Lys Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys
385                 390                 395                 400
Gly Gly Gln Leu
其中 Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val为已知PGC1蛋白N端测序部分, 为PGC1成熟蛋白N端编码氨基酸。
2、一种克隆权利要求1所述的香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因的方法,其特征在于,根据已测的PGC1蛋白N末端编码序列设计引物,以香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株总RNA为模板,采用RT-PCR方法,合成cDNA的第一条链,5’RACE和3’RACE的方法克隆PGC1 cDNA的全长序列,推测出PGC1的氨基酸序列。
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dbj 2217912,GenBank,gi,Vol.124 No.1 2002 *
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