JP2000333677A - 植物の青枯病防除方法 - Google Patents
植物の青枯病防除方法Info
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- JP2000333677A JP2000333677A JP2000076645A JP2000076645A JP2000333677A JP 2000333677 A JP2000333677 A JP 2000333677A JP 2000076645 A JP2000076645 A JP 2000076645A JP 2000076645 A JP2000076645 A JP 2000076645A JP 2000333677 A JP2000333677 A JP 2000333677A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 植物の青枯病防除に対する３−（３−インド
リル）酪酸の効果を持続させるための方法及び同方法に
用いる植物を提供する。 【解決手段】 ３−（３−インドリル）酪酸の配糖体を
３−（３−インドリル）酪酸に加水分解する反応を触媒
するグルコース遊離酵素をコードする遺伝子を導入され
た植物に、３−（３−インドリル）酪酸又はその塩を施
用することにより、青枯病を防除する。
リル）酪酸の効果を持続させるための方法及び同方法に
用いる植物を提供する。 【解決手段】 ３−（３−インドリル）酪酸の配糖体を
３−（３−インドリル）酪酸に加水分解する反応を触媒
するグルコース遊離酵素をコードする遺伝子を導入され
た植物に、３−（３−インドリル）酪酸又はその塩を施
用することにより、青枯病を防除する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、青枯病の防除方法
に関し、詳しくは、３−（３−インドリル）酪酸の青枯
病防除効果が持続する植物を用いて青枯病を防除する方
法に関する。
に関し、詳しくは、３−（３−インドリル）酪酸の青枯
病防除効果が持続する植物を用いて青枯病を防除する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】トマト、ナス、ピーマン、タバコ、ダイ
コン、イチゴ、バナナ等の植物に発生する土壌病害の一
つである青枯病（立枯病）は、ラルストニア・ソラナセ
アラム（Ralstonia solanacearum）（以前は、シュード
モナスソラナセアラム(Pseudomonas solanacearum)に分
類されていた）により引き起こされる細菌病である。
コン、イチゴ、バナナ等の植物に発生する土壌病害の一
つである青枯病（立枯病）は、ラルストニア・ソラナセ
アラム（Ralstonia solanacearum）（以前は、シュード
モナスソラナセアラム(Pseudomonas solanacearum)に分
類されていた）により引き起こされる細菌病である。
【０００３】青枯病を防除する手段としては、クロルピ
クリン剤などの薬剤による土壌消毒がー般的に行なわれ
ているが、これらの薬剤は青枯病の防除以外に植物や土
壌、更には作業者ヘの悪影響が問題となっている。近
年、青枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstoni
a solanacearum）に対する特異的な抗菌性を有する物質
として、３−（３−インドリル）酪酸（以下、「3-IB
A」ともいう。）が提案された（特開平7-228502号参
照）。本物質は、土壌や養液栽培における養液に混入す
ることにより、青枯病菌の増殖を抑制させることができ
る。また、本物質は植物体への毒性が全く認められない
ため、予め根等から吸収させておくことができ、その後
侵入してきたラルストニア・ソラナセアラムの増殖を完
全に抑制することもできる。
クリン剤などの薬剤による土壌消毒がー般的に行なわれ
ているが、これらの薬剤は青枯病の防除以外に植物や土
壌、更には作業者ヘの悪影響が問題となっている。近
年、青枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstoni
a solanacearum）に対する特異的な抗菌性を有する物質
として、３−（３−インドリル）酪酸（以下、「3-IB
A」ともいう。）が提案された（特開平7-228502号参
照）。本物質は、土壌や養液栽培における養液に混入す
ることにより、青枯病菌の増殖を抑制させることができ
る。また、本物質は植物体への毒性が全く認められない
ため、予め根等から吸収させておくことができ、その後
侵入してきたラルストニア・ソラナセアラムの増殖を完
全に抑制することもできる。
【０００４】3-IBAのマウスにおける経口急性毒性、魚
毒性もまったく確認されておらず、安全性の非常に高い
効果的な薬剤であるが、3-IBAの青枯病菌抑制効果は、
施用後数日しか持続せず、効果を持続させるためには定
期的に新たな3-IBAを植物体に吸収させる必要があっ
た。
毒性もまったく確認されておらず、安全性の非常に高い
効果的な薬剤であるが、3-IBAの青枯病菌抑制効果は、
施用後数日しか持続せず、効果を持続させるためには定
期的に新たな3-IBAを植物体に吸収させる必要があっ
た。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のように3-IBA
は、施用後の青枯病の防除効果の持続性が短く、薬剤の
コスト増大、あるいは労カ増大という問題が生じてい
た。
は、施用後の青枯病の防除効果の持続性が短く、薬剤の
コスト増大、あるいは労カ増大という問題が生じてい
た。
【０００６】本発明は、上記現状に鑑みてなされたもの
であり、3-IBAの効果を持続させるための方法及び同方
法に用いる植物を提供することを課題とする。
であり、3-IBAの効果を持続させるための方法及び同方
法に用いる植物を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、3-IBAの植物への施用後の青枯病防
除効果の持続性が短い理由を解析した結果、植物体内に
吸収された3-IBAは速やか3-IBAグルコシド（3-IBAグル
コース配糖体）に変換されており、3-IBAグルコシドは
青枯病菌（ラルストニア・ソラナセアラム）に対する抗
菌性を失うことが明らかとなった。しかし、変換された
3-IBAグルコシドは、主に植物の根に蓄積されることも
明らかとなった。この知見に基づいて、蓄積された3-IB
Aグルコシドを、加水分解して再度3-IBAに戻すことがで
きれぱ、効率的な青枯病防除システムの構築が可能であ
ると考えた。そして、植物にグルコース遊離酵素遺伝子
を導入し、発現させたところ、形質転換植物における3-
IBAの青枯病に対する防除効果が持続することを見出
し、本発明を完成するに至った。
を解決するために、3-IBAの植物への施用後の青枯病防
除効果の持続性が短い理由を解析した結果、植物体内に
吸収された3-IBAは速やか3-IBAグルコシド（3-IBAグル
コース配糖体）に変換されており、3-IBAグルコシドは
青枯病菌（ラルストニア・ソラナセアラム）に対する抗
菌性を失うことが明らかとなった。しかし、変換された
3-IBAグルコシドは、主に植物の根に蓄積されることも
明らかとなった。この知見に基づいて、蓄積された3-IB
Aグルコシドを、加水分解して再度3-IBAに戻すことがで
きれぱ、効率的な青枯病防除システムの構築が可能であ
ると考えた。そして、植物にグルコース遊離酵素遺伝子
を導入し、発現させたところ、形質転換植物における3-
IBAの青枯病に対する防除効果が持続することを見出
し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、以下のとおりである。 （１）植物に３−（３−インドリル）酪酸又はその塩を
施用することにより青枯病を防除する方法において、前
記植物は、３−（３−インドリル）酪酸の配糖体を３−
（３−インドリル）酪酸に加水分解する反応を触媒する
グルコース遊離酵素をコードする遺伝子を導入されたも
のであることを特徴とする方法である。 （２）前記グルコース遊離酵素遺伝子が、前記植物の細
胞内で構成的に発現するプロモーターの制御下にある
（１）の方法。 （３）前記プロモーターが、ＭＡＳプロモーター、Ｃａ
ＭＶ １９Ｓプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモー
ター、ＮＯＳプロモーター、ＯＣＳプロモーターから選
ばれる（２）の方法。
施用することにより青枯病を防除する方法において、前
記植物は、３−（３−インドリル）酪酸の配糖体を３−
（３−インドリル）酪酸に加水分解する反応を触媒する
グルコース遊離酵素をコードする遺伝子を導入されたも
のであることを特徴とする方法である。 （２）前記グルコース遊離酵素遺伝子が、前記植物の細
胞内で構成的に発現するプロモーターの制御下にある
（１）の方法。 （３）前記プロモーターが、ＭＡＳプロモーター、Ｃａ
ＭＶ １９Ｓプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモー
ター、ＮＯＳプロモーター、ＯＣＳプロモーターから選
ばれる（２）の方法。
【０００９】（４）前記プロモーターが、青枯病菌の感
染特異的に発現するものである（１）の方法。 （５）前記プロモーターが、ｒｄ２９Ａプロモーター又
はＰＲ１ａプロモーターである（４）の方法。 （６）グルコース遊離酵素がβ−グルコシダーゼである
（１）〜（５）のいずれかの方法。 （７）グルコース遊離酵素がアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンスのβ−グルコシダーゼである（６）の方
法。
染特異的に発現するものである（１）の方法。 （５）前記プロモーターが、ｒｄ２９Ａプロモーター又
はＰＲ１ａプロモーターである（４）の方法。 （６）グルコース遊離酵素がβ−グルコシダーゼである
（１）〜（５）のいずれかの方法。 （７）グルコース遊離酵素がアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンスのβ−グルコシダーゼである（６）の方
法。
【００１０】以下、本明細書において特記しない限り、
3-IBAというときは、3-IBA又はその塩を含む。
3-IBAというときは、3-IBA又はその塩を含む。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の青枯病の防除方法は、グルコース遊離酵素遺伝
子が導入された植物を用いる。グルコース遊離酵素を発
現する植物を用いることにより、3-IBA又はその塩によ
る青枯病防除効果を持続させることができる。
本発明の青枯病の防除方法は、グルコース遊離酵素遺伝
子が導入された植物を用いる。グルコース遊離酵素を発
現する植物を用いることにより、3-IBA又はその塩によ
る青枯病防除効果を持続させることができる。
【００１２】グルコース遊離酵素としては、3-IBAグル
コシドを3-IBAに加水分解することができる酵素であれ
ば特に制限されないが、例えば、β−グルコシダーゼ等
が挙げられる。これらの酵素をコードする遺伝子の採取
源も、これらの酵素を産生する生物であれば特に制限さ
れず、大腸菌（エシェリヒア・コリ(E. coli)）、アグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tu
mefaciens）、バシルス・サブティリス（Bacillus subt
ilis）等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）等の酵母等の微生物が挙げられ
る。また、植物由来の遺伝子を用いてもよい。これらの
中ではアグロバクテリウム・ツメファシエンスが好まし
い。β−グルコシダーゼ遺伝子は、例えば、大腸菌のβ
−グルコシダーゼ遺伝子（Science (1997) Vol.277 No.
5331: 1453-1474）、及びアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスのβ−グルコシダーゼ遺伝子（Journal of B
acteriology (1988)Vol.170, No.1: 301-307）は公知で
あり、その塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオ
チドをプライマーとし、大腸菌又はアグロバクテリウム
・ツメファシエンスの染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）によって、
取得することができる。このようなプライマーとして
は、大腸菌のβ−グルコシダーゼ遺伝子では配列番号１
及び２に示すオリゴヌクレオチドが、アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンスのβ−グルコシダーゼ遺伝子では
配列番号３及び４に示すオリゴヌクレオチドが挙げられ
る。
コシドを3-IBAに加水分解することができる酵素であれ
ば特に制限されないが、例えば、β−グルコシダーゼ等
が挙げられる。これらの酵素をコードする遺伝子の採取
源も、これらの酵素を産生する生物であれば特に制限さ
れず、大腸菌（エシェリヒア・コリ(E. coli)）、アグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tu
mefaciens）、バシルス・サブティリス（Bacillus subt
ilis）等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）等の酵母等の微生物が挙げられ
る。また、植物由来の遺伝子を用いてもよい。これらの
中ではアグロバクテリウム・ツメファシエンスが好まし
い。β−グルコシダーゼ遺伝子は、例えば、大腸菌のβ
−グルコシダーゼ遺伝子（Science (1997) Vol.277 No.
5331: 1453-1474）、及びアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスのβ−グルコシダーゼ遺伝子（Journal of B
acteriology (1988)Vol.170, No.1: 301-307）は公知で
あり、その塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオ
チドをプライマーとし、大腸菌又はアグロバクテリウム
・ツメファシエンスの染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）によって、
取得することができる。このようなプライマーとして
は、大腸菌のβ−グルコシダーゼ遺伝子では配列番号１
及び２に示すオリゴヌクレオチドが、アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンスのβ−グルコシダーゼ遺伝子では
配列番号３及び４に示すオリゴヌクレオチドが挙げられ
る。
【００１３】植物にグルコース遊離酵素遺伝子を導入す
るには、その植物に適した形質転換法を採用すればよ
い。具体的には、エレクトロポレーション法、パーティ
クルガン法、アグロバクテリウム法等が挙げられる。こ
れらの方法の一般的な手順は、例えば「ラボマニュアル
植物遺伝子の機能解析」岩淵 雅樹ら編、丸善株式会社
（１９９２）に記載されている。
るには、その植物に適した形質転換法を採用すればよ
い。具体的には、エレクトロポレーション法、パーティ
クルガン法、アグロバクテリウム法等が挙げられる。こ
れらの方法の一般的な手順は、例えば「ラボマニュアル
植物遺伝子の機能解析」岩淵 雅樹ら編、丸善株式会社
（１９９２）に記載されている。
【００１４】植物に導入するグルコース遊離酵素遺伝子
は、その植物細胞で機能するプロモーターを有していな
い場合は、コード領域の上流に植物細胞で機能する適当
なプロモーターを連結しておく。そのようなプロモータ
ーとしては、構成的（constitutive）に発現するプロモ
ーター、及び青枯病菌の感染特異的に発現するプロモー
ターが挙げられる。植物細胞でグルコース遊離酵素が構
成的に発現すれば、青枯病菌の細胞内への侵入、感染を
予防することができる。また、グルコース遊離酵素が、
青枯病菌が感染したときに発現すれば、青枯病菌が感染
してもその増殖を防止することができる。植物体に蓄積
された3-IBAグルコシドを効率的に利用することを考慮
すると、青枯病菌の感染特異的に発現するプロモーター
を用いることが好ましい。
は、その植物細胞で機能するプロモーターを有していな
い場合は、コード領域の上流に植物細胞で機能する適当
なプロモーターを連結しておく。そのようなプロモータ
ーとしては、構成的（constitutive）に発現するプロモ
ーター、及び青枯病菌の感染特異的に発現するプロモー
ターが挙げられる。植物細胞でグルコース遊離酵素が構
成的に発現すれば、青枯病菌の細胞内への侵入、感染を
予防することができる。また、グルコース遊離酵素が、
青枯病菌が感染したときに発現すれば、青枯病菌が感染
してもその増殖を防止することができる。植物体に蓄積
された3-IBAグルコシドを効率的に利用することを考慮
すると、青枯病菌の感染特異的に発現するプロモーター
を用いることが好ましい。
【００１５】構成的に発現するプロモーターとしては、
ＭＡＳプロモーター（Plant Mol. Biol. (1992) Vol.2
0, No.2, 219-233）、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター（J. M
ol. Appl. Genet. (1982) Vol.1, No.6, 561-573）、Ｏ
ＣＳプロモーター（J. Mol. Appl. Genet. (1982) Vol.
1, No.6, 499-511）等が挙げられる。また、青枯病菌の
感染特異的に発現するプロモーターとしては、ｒｄ２９
Ａプロモーター（Mol. Gen. Genet. (1993) Vol.236, 3
31-340）又はＰＲ１ａプロモーター（タバコ由来：FEBS
Lett. (1987)Vol.255, 243-246、トマト由来：Plant M
ol. Biol. (1992) Vol.20, No.3, 513-527）等が挙げら
れる。
ＭＡＳプロモーター（Plant Mol. Biol. (1992) Vol.2
0, No.2, 219-233）、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター（J. M
ol. Appl. Genet. (1982) Vol.1, No.6, 561-573）、Ｏ
ＣＳプロモーター（J. Mol. Appl. Genet. (1982) Vol.
1, No.6, 499-511）等が挙げられる。また、青枯病菌の
感染特異的に発現するプロモーターとしては、ｒｄ２９
Ａプロモーター（Mol. Gen. Genet. (1993) Vol.236, 3
31-340）又はＰＲ１ａプロモーター（タバコ由来：FEBS
Lett. (1987)Vol.255, 243-246、トマト由来：Plant M
ol. Biol. (1992) Vol.20, No.3, 513-527）等が挙げら
れる。
【００１６】グルコース遊離酵素遺伝子のクローニン
グ、同遺伝子をコードするＤＮＡ断片とアグロバクテリ
ウム法に用いるベクターとの連結等の操作は、当業者に
知られている通常の方法を採用することができる。これ
らの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Sa
mbrookら、"Molecular Cloning A Laboratory Manual,S
econd Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s (1989)）等に記載されている。
グ、同遺伝子をコードするＤＮＡ断片とアグロバクテリ
ウム法に用いるベクターとの連結等の操作は、当業者に
知られている通常の方法を採用することができる。これ
らの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Sa
mbrookら、"Molecular Cloning A Laboratory Manual,S
econd Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s (1989)）等に記載されている。
【００１７】本発明を適用することができる植物として
は、青枯病菌が感染し、青枯病にかかる植物であれば特
に制限されないが、例えばトマト、ナス、ピーマン、タ
バコ、ダイコン、イチゴ、バナナ等が挙げられる。例え
ば、トマトのアグロバクテリウム法による形質転換は、
Journal of Experimantal Botany, 44(269), 1837-1845
(1993)、Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 24,
115-121 (1991)、Plant Cell Report, 5, 81-84 (198
6)等に詳述されている。また、現在形質転換体が得られ
ていない植物であっても、形質転換が可能になれば、本
発明を適用することができる。
は、青枯病菌が感染し、青枯病にかかる植物であれば特
に制限されないが、例えばトマト、ナス、ピーマン、タ
バコ、ダイコン、イチゴ、バナナ等が挙げられる。例え
ば、トマトのアグロバクテリウム法による形質転換は、
Journal of Experimantal Botany, 44(269), 1837-1845
(1993)、Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 24,
115-121 (1991)、Plant Cell Report, 5, 81-84 (198
6)等に詳述されている。また、現在形質転換体が得られ
ていない植物であっても、形質転換が可能になれば、本
発明を適用することができる。
【００１８】本発明においては、上記のようにしてグル
コース遊離酵素を導入された植物に、3-IBA又はその塩
を施用することにより、青枯病を防除する。3-IBAは、
例えば、以下のようにして化学合成することにより得る
ことができる（特開平7-228502号参照）。先ず３−アセ
チルインドールを出発物質として、これを水素化ナトリ
ウム存在下、１，２−ジメトキシエタン中でジエチルシ
アノメチルホスホネートと反応させ、３−アセチルイン
ドールのカルボニル基をシアノメチレン基に変換する。
次にこれをパラジウム−炭素存在下、メチルアルコール
中で水素添加する。そして水素添加したものを水酸化ナ
トリウム水溶液とエチルアルコールとの混合溶液中で加
水分解し、3-IBAを得る。
コース遊離酵素を導入された植物に、3-IBA又はその塩
を施用することにより、青枯病を防除する。3-IBAは、
例えば、以下のようにして化学合成することにより得る
ことができる（特開平7-228502号参照）。先ず３−アセ
チルインドールを出発物質として、これを水素化ナトリ
ウム存在下、１，２−ジメトキシエタン中でジエチルシ
アノメチルホスホネートと反応させ、３−アセチルイン
ドールのカルボニル基をシアノメチレン基に変換する。
次にこれをパラジウム−炭素存在下、メチルアルコール
中で水素添加する。そして水素添加したものを水酸化ナ
トリウム水溶液とエチルアルコールとの混合溶液中で加
水分解し、3-IBAを得る。
【００１９】3-IBAの塩としては、カリウムやナトリウ
ム等のアルカリ金属塩、カルシウムやマグネシウム等の
アルカリ土類金属塩が挙げられる。植物に3-IBAを施用
する方法としては、3-IBAの溶液又は3-IBAを添加した肥
料の土壌への散布、植物体への散水・散布、養液への添
加等の方法が挙げられる。通常、 土壌へは５〜１００
ｐｐｍの濃度で散布、植物体へは５〜１００ｐｐｍの濃
度で１週間から１カ月に１度、散水・散布、養液栽培の
場合には５〜１００ｐｐｍの濃度となるように養液に混
合するのが適当であるが、植物あるいは土壌、養液にお
ける青枯病菌の存在状態等によって左右されるので、防
除効果が低い場合は施用量又は回数を適宜増やせばよ
い。
ム等のアルカリ金属塩、カルシウムやマグネシウム等の
アルカリ土類金属塩が挙げられる。植物に3-IBAを施用
する方法としては、3-IBAの溶液又は3-IBAを添加した肥
料の土壌への散布、植物体への散水・散布、養液への添
加等の方法が挙げられる。通常、 土壌へは５〜１００
ｐｐｍの濃度で散布、植物体へは５〜１００ｐｐｍの濃
度で１週間から１カ月に１度、散水・散布、養液栽培の
場合には５〜１００ｐｐｍの濃度となるように養液に混
合するのが適当であるが、植物あるいは土壌、養液にお
ける青枯病菌の存在状態等によって左右されるので、防
除効果が低い場合は施用量又は回数を適宜増やせばよ
い。
【００２０】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００２１】
【実施例１】＜１＞大腸菌（E. coli）由来のβ−グル
コシダーゼ遺伝子の調製 大腸菌K-12株より、β−グルコシダーゼ遺伝子を調製し
た。大腸菌K-12株の染色体ＤＮＡを常法により調製し、
これを鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによ
り、β−グルコシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅
した。
コシダーゼ遺伝子の調製 大腸菌K-12株より、β−グルコシダーゼ遺伝子を調製し
た。大腸菌K-12株の染色体ＤＮＡを常法により調製し、
これを鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによ
り、β−グルコシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅
した。
【００２２】＜２＞β−グルコシダーゼ遺伝子導入べク
ターの構築 上記のようにして得られたβ−グルコシダーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を、T-DNAベクターpBI121（クローンテ
ック社）に導入した。pBI121は、選抜遺伝子としてカナ
マイシン（Km）抵抗性遺伝子（nptII）を含有し、ま
た、レポーター遺伝子としてβ−グルクロニダーゼ遺伝
子（GUS遺伝子）を有する。従って、遺伝子導入のモニ
タリングは、Km抵抗性による安定形質転換体（stable t
ransformant）の選抜により行うことができる。
ターの構築 上記のようにして得られたβ−グルコシダーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を、T-DNAベクターpBI121（クローンテ
ック社）に導入した。pBI121は、選抜遺伝子としてカナ
マイシン（Km）抵抗性遺伝子（nptII）を含有し、ま
た、レポーター遺伝子としてβ−グルクロニダーゼ遺伝
子（GUS遺伝子）を有する。従って、遺伝子導入のモニ
タリングは、Km抵抗性による安定形質転換体（stable t
ransformant）の選抜により行うことができる。
【００２３】pBI121のGUS遺伝子の部分に、前記大腸菌
由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子を挿入し、β−グルコ
シダーゼ遺伝子導入べクターを構築した（ベクター
Ａ）。具体的には、pBI121及びＰＣＲにより得られたβ
−グルコシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素Ba
mHI及びSacIで切断し、これらを連結した。
由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子を挿入し、β−グルコ
シダーゼ遺伝子導入べクターを構築した（ベクター
Ａ）。具体的には、pBI121及びＰＣＲにより得られたβ
−グルコシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素Ba
mHI及びSacIで切断し、これらを連結した。
【００２４】＜３＞アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスを用いたトマトへのβ−グルクロニダーゼ遺伝子の
導入 ベクターＡを、接合機能を有するヘルパープラスミドpR
K2013の仲介により、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンスLBA4404に三親接合を用いて導入した。具体的に
は、以下に示すようにして行った。ベクターＡを含む大
腸菌、pRK2013を含む大腸菌、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンスLBA4404を、それぞれ培養して集菌し、
ＬＢ培地（Bacto-Tryptone 0.1%、Yeast Extract 0.05
%、NaCl 0.05%）で洗浄した後、1mlのＬＢ培地に懸濁し
た。抗生物質を含まないＬＢ寒天培地に３者を100μlず
つ混合してまき、28℃で24時間培養した。その後、形成
されたコロニーをカナマイシン25μg/ml、ストレプトマ
イシン300μg/ml、リファンピシン100μg/mlを含む寒天
培地上で培養し、ベクターＡが導入されたアグロバクテ
リウム・ツメファシエンスLBA4404を選抜した。
ンスを用いたトマトへのβ−グルクロニダーゼ遺伝子の
導入 ベクターＡを、接合機能を有するヘルパープラスミドpR
K2013の仲介により、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンスLBA4404に三親接合を用いて導入した。具体的に
は、以下に示すようにして行った。ベクターＡを含む大
腸菌、pRK2013を含む大腸菌、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンスLBA4404を、それぞれ培養して集菌し、
ＬＢ培地（Bacto-Tryptone 0.1%、Yeast Extract 0.05
%、NaCl 0.05%）で洗浄した後、1mlのＬＢ培地に懸濁し
た。抗生物質を含まないＬＢ寒天培地に３者を100μlず
つ混合してまき、28℃で24時間培養した。その後、形成
されたコロニーをカナマイシン25μg/ml、ストレプトマ
イシン300μg/ml、リファンピシン100μg/mlを含む寒天
培地上で培養し、ベクターＡが導入されたアグロバクテ
リウム・ツメファシエンスLBA4404を選抜した。
【００２５】上記のようにして得たべクターＡを含むア
グロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404を、カナ
マイシン25μg/ml、ストレプトマイシン300μg/mlを含
むLB固体培地（Bacto-Tryptone 0.1%、Yeast Extract
0.05%、NaCl 0.05%、寒天1.5%）で28℃、２日間静置培
養した後、ＬＢ培地で28℃で24時間振とう培養を行なっ
た。
グロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404を、カナ
マイシン25μg/ml、ストレプトマイシン300μg/mlを含
むLB固体培地（Bacto-Tryptone 0.1%、Yeast Extract
0.05%、NaCl 0.05%、寒天1.5%）で28℃、２日間静置培
養した後、ＬＢ培地で28℃で24時間振とう培養を行なっ
た。
【００２６】アグロバクテリウム・ツメファシエンスを
振とう培養後、菌体を回収し、1/10MS無機塩（MS無機
塩：(NH4)2SO4 1650mg/l、KNO3 1900mg/l、CaCl2 440mg
/l、MgSO4・7H2O 370mg/l、NaH2PO4・H2O 170mg/l、MnSO4
・4H2O 22.3mg/l、ZnSO4・7H2O8.6mg/l、CuSO4・5H2O 0.
025mg/l、CoSO4・7H2O 0.025mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO3
6.2mg/l、Na2MoO4・2H2O 0.25mg/l、FeSO4・7H2O 27.8mg/
l、Na2-EDTA 37.3mg/l）、IAA（インドール酢酸）0.1μ
g/ml、zeatin riboside 1.0μg/ml、ショ糖3%、グルコ
ース10mMを含む液体培地（pH5.8)で洗浄後、20倍に希釈
して懸濁した。この懸濁液に無菌的に用意したトマト幼
芽の子葉、胚軸を10分問浸漬させて接種した。
振とう培養後、菌体を回収し、1/10MS無機塩（MS無機
塩：(NH4)2SO4 1650mg/l、KNO3 1900mg/l、CaCl2 440mg
/l、MgSO4・7H2O 370mg/l、NaH2PO4・H2O 170mg/l、MnSO4
・4H2O 22.3mg/l、ZnSO4・7H2O8.6mg/l、CuSO4・5H2O 0.
025mg/l、CoSO4・7H2O 0.025mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO3
6.2mg/l、Na2MoO4・2H2O 0.25mg/l、FeSO4・7H2O 27.8mg/
l、Na2-EDTA 37.3mg/l）、IAA（インドール酢酸）0.1μ
g/ml、zeatin riboside 1.0μg/ml、ショ糖3%、グルコ
ース10mMを含む液体培地（pH5.8)で洗浄後、20倍に希釈
して懸濁した。この懸濁液に無菌的に用意したトマト幼
芽の子葉、胚軸を10分問浸漬させて接種した。
【００２７】続いて、余分な菌体懸濁液を除去して、MS
無機塩（(NH4)2SO4 1650mg/l、KNO3 1900mg/l、CaCl2 44
0mg/l、MgSO4・7H2O 370mg/l、NaH2PO4・H2O 170mg/l、Mn
SO4・4H2O 22.3mg/l、ZnSO4・7H2O 8.6mg/l、CuSO4・5H2O
0.025mg/l、CoSO4・7H2O 0.025mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO
3 6.2mg/l、Na2MoO4・2H2O 0.25mg/l、FeSO4・7H2O 27.8m
g/l、Na2-EDTA 37.3mg/l）、IAA（インドール酢酸）0.1
μg/ml、zeatin riboside 1.0μg/ml、ショ糖3%、グル
コース10mM、寒天0.75%を含む液体培地（pH5.8)で３日
間共存培養を行なった。その後、子葉、胚軸を300μg/m
l濃度のカルベニシリン、0.1μg/ml濃度のIAA（インド
ール酢酸）、1.0μg/ml濃度のzeatin ribosideを含むMS
固体培地（MS無機塩（(NH4)2SO4 1650mg/l、KNO3 1900m
g/l、CaCl2 440mg/l、MgSO4・7H2O 370mg/l、NaH2PO4・H2
O 170mg/l、MnSO4・4H2O 22.3mg/l、ZnSO4・7H2O 8.6mg/
l、CuSO4・5H2O 0.025mg/l、CoSO4・7H2O 0.025mg/l、KI
0.83mg/l、H3BO3 6.2mg/l、Na2MoO 4・2H2O 0.25mg/l、Fe
SO4・7H2O 27.8mg/l、Na2-EDTA 37.3mg/l）、ショ糖 3
%、寒天 0.75%、pH5.8）に置床し、明条件で16時間、暗
条件で８時間、25℃で培養して、アグロバクテリウム・
ツメファシェンスの殺菌を行なった。
無機塩（(NH4)2SO4 1650mg/l、KNO3 1900mg/l、CaCl2 44
0mg/l、MgSO4・7H2O 370mg/l、NaH2PO4・H2O 170mg/l、Mn
SO4・4H2O 22.3mg/l、ZnSO4・7H2O 8.6mg/l、CuSO4・5H2O
0.025mg/l、CoSO4・7H2O 0.025mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO
3 6.2mg/l、Na2MoO4・2H2O 0.25mg/l、FeSO4・7H2O 27.8m
g/l、Na2-EDTA 37.3mg/l）、IAA（インドール酢酸）0.1
μg/ml、zeatin riboside 1.0μg/ml、ショ糖3%、グル
コース10mM、寒天0.75%を含む液体培地（pH5.8)で３日
間共存培養を行なった。その後、子葉、胚軸を300μg/m
l濃度のカルベニシリン、0.1μg/ml濃度のIAA（インド
ール酢酸）、1.0μg/ml濃度のzeatin ribosideを含むMS
固体培地（MS無機塩（(NH4)2SO4 1650mg/l、KNO3 1900m
g/l、CaCl2 440mg/l、MgSO4・7H2O 370mg/l、NaH2PO4・H2
O 170mg/l、MnSO4・4H2O 22.3mg/l、ZnSO4・7H2O 8.6mg/
l、CuSO4・5H2O 0.025mg/l、CoSO4・7H2O 0.025mg/l、KI
0.83mg/l、H3BO3 6.2mg/l、Na2MoO 4・2H2O 0.25mg/l、Fe
SO4・7H2O 27.8mg/l、Na2-EDTA 37.3mg/l）、ショ糖 3
%、寒天 0.75%、pH5.8）に置床し、明条件で16時間、暗
条件で８時間、25℃で培養して、アグロバクテリウム・
ツメファシェンスの殺菌を行なった。
【００２８】さらに１週間後に、50μg/ml濃度のカナマ
イシン、300μg/ml濃度のカルべニシリン、0.1μg/ml濃
度のIAA（インドール酢酸）、1.0μg/ml濃度のzeatin r
ibosideを含むMS固体培地に移植し、安定形質転換体の
選抜を行なった。得られた形質転換体は、100μg/ml濃
度のカナマイシンを含み、IAA（インドール酢酸）及びz
eatin ribosideを含まないホルモンフリーのMS固体培地
に移植して発根を促し、馴化した後、鉢上げして育成し
た。
イシン、300μg/ml濃度のカルべニシリン、0.1μg/ml濃
度のIAA（インドール酢酸）、1.0μg/ml濃度のzeatin r
ibosideを含むMS固体培地に移植し、安定形質転換体の
選抜を行なった。得られた形質転換体は、100μg/ml濃
度のカナマイシンを含み、IAA（インドール酢酸）及びz
eatin ribosideを含まないホルモンフリーのMS固体培地
に移植して発根を促し、馴化した後、鉢上げして育成し
た。
【００２９】形貿転換当代の個体から自殖種子を獲得
し、β−グルコシダーゼ遺伝子を同型接合体に保有する
個体をサザン解析により選抜して、β−グルコシダーゼ
遺伝子導入トマトの作出を完了した。
し、β−グルコシダーゼ遺伝子を同型接合体に保有する
個体をサザン解析により選抜して、β−グルコシダーゼ
遺伝子導入トマトの作出を完了した。
【００３０】＜４＞β−グルコシダーゼ遺伝子導入トマ
トの3-IBAによる青枯病菌に対する防除効果の確認 上記のようにして得られたβ−グルコシダーゼ遺伝子導
入トマトの苗を、常法に従って育成し、定植前に5〜100
ppmの3-IBA溶液を散水等の処理により苗に吸収させ、そ
の後ラルストニア・ソラナセアラムを接種した。その結
果、非組換えトマトの場合と比較してラルストニア・ソ
ラナセアラムの増殖抑制効果がより長く持続することが
明らかとなった。
トの3-IBAによる青枯病菌に対する防除効果の確認 上記のようにして得られたβ−グルコシダーゼ遺伝子導
入トマトの苗を、常法に従って育成し、定植前に5〜100
ppmの3-IBA溶液を散水等の処理により苗に吸収させ、そ
の後ラルストニア・ソラナセアラムを接種した。その結
果、非組換えトマトの場合と比較してラルストニア・ソ
ラナセアラムの増殖抑制効果がより長く持続することが
明らかとなった。
【００３１】植物体内で含成されたβ−グルコシダーゼ
により、3-IBAグルコシドが再度3-IBAに加水分解され
て、抗菌性を示したものと考えられる。
により、3-IBAグルコシドが再度3-IBAに加水分解され
て、抗菌性を示したものと考えられる。
【００３２】
【実施例２】＜１＞アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子の調製 アグロバクテリウム・ツメファシエンスATCC21400株よ
り、β−グルコシダーゼ遺伝子を調製した。アグロバク
テリウム・ツメファシエンスATCC21400株の染色体ＤＮ
Ａを常法により調製し、これを鋳型とし、配列番号３及
び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとするＰＣＲにより、β−グルコシダーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片を増幅した。
ンス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子の調製 アグロバクテリウム・ツメファシエンスATCC21400株よ
り、β−グルコシダーゼ遺伝子を調製した。アグロバク
テリウム・ツメファシエンスATCC21400株の染色体ＤＮ
Ａを常法により調製し、これを鋳型とし、配列番号３及
び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとするＰＣＲにより、β−グルコシダーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【００３３】pBI121のGUS遺伝子の部分に、前記アグロ
バクテリウム・ツメファシエンス由来のβ−グルコシダ
ーゼ遺伝子を挿入し、β−グルコシダーゼ遺伝子導入べ
クターを構築した（ベクターＢ）。具体的には、pBI121
及びＰＣＲにより得られたβ−グルコシダーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を制限酵素BamHI及びSacIで切断し、こ
れらを連結した。
バクテリウム・ツメファシエンス由来のβ−グルコシダ
ーゼ遺伝子を挿入し、β−グルコシダーゼ遺伝子導入べ
クターを構築した（ベクターＢ）。具体的には、pBI121
及びＰＣＲにより得られたβ−グルコシダーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を制限酵素BamHI及びSacIで切断し、こ
れらを連結した。
【００３４】ベクターＡの代わりにベクターＢを用いた
以外は実施例１と同様にして、β−グルコシダーゼ遺伝
子をトマトに導入し、得られたβ−グルコシダーゼ遺伝
子導入トマトの3-IBAによる青枯病菌に対する防除効果
を調べた。その結果、β−グルコシダーゼ遺伝子導入ト
マトは、非組換えトマトの場合と比較して、3-IBAによ
るラルストニア・ソラナセアラムの増殖抑制効果がより
長く持続した。
以外は実施例１と同様にして、β−グルコシダーゼ遺伝
子をトマトに導入し、得られたβ−グルコシダーゼ遺伝
子導入トマトの3-IBAによる青枯病菌に対する防除効果
を調べた。その結果、β−グルコシダーゼ遺伝子導入ト
マトは、非組換えトマトの場合と比較して、3-IBAによ
るラルストニア・ソラナセアラムの増殖抑制効果がより
長く持続した。
【００３５】
【発明の効果】本発明にしたがって、グルコース遊離酵
素遺伝子を導入した植物を用いることにより、3-IBAの
青枯病防除効果を持続させることができる。
素遺伝子を導入した植物を用いることにより、3-IBAの
青枯病防除効果を持続させることができる。
【００３６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> カゴメ株式会社 <120> 植物の青枯病防除方法 <130> P-7273 <141> 2000-03-17 <150> JP 11-77519 <151> 1999-03-23 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００３７】 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 gaggatccaa gatgccgttt cgcagc 26
【００３８】 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 gcgagctctt attgttttat taatagc 27
【００３９】 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 cgggatccaa tgaccgatcc caacacgc 28
【００４０】 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 cggagctctc accccttggc aacc 24
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (7)
- 【請求項１】 植物に３−（３−インドリル）酪酸又は
その塩を施用することにより青枯病を防除する方法にお
いて、前記植物は、３−（３−インドリル）酪酸の配糖
体を３−（３−インドリル）酪酸に加水分解する反応を
触媒するグルコース遊離酵素をコードする遺伝子を導入
されたものであることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記グルコース遊離酵素遺伝子が、前記
植物の細胞内で構成的に発現するプロモーターの制御下
にある請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記プロモーターが、ＭＡＳプロモータ
ー、ＣａＭＶ １９Ｓプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓ
プロモーター、ＮＯＳプロモーター、ＯＣＳプロモータ
ーから選ばれる請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 前記プロモーターが、青枯病菌の感染特
異的に発現するものである請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 前記プロモーターが、ｒｄ２９Ａプロモ
ーター又はＰＲ１ａプロモーターである請求項４記載の
方法。 - 【請求項６】 グルコース遊離酵素がβ−グルコシダー
ゼである請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 グルコース遊離酵素がアグロバクテリウ
ム・ツメファシエンスのβ−グルコシダーゼである請求
項６記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000076645A JP4574787B2 (ja) | 1999-03-23 | 2000-03-17 | 植物の青枯病防除方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7751999 | 1999-03-23 | ||
| JP11-77519 | 1999-03-23 | ||
| JP2000076645A JP4574787B2 (ja) | 1999-03-23 | 2000-03-17 | 植物の青枯病防除方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000333677A true JP2000333677A (ja) | 2000-12-05 |
| JP4574787B2 JP4574787B2 (ja) | 2010-11-04 |
Family
ID=26418597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000076645A Expired - Fee Related JP4574787B2 (ja) | 1999-03-23 | 2000-03-17 | 植物の青枯病防除方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4574787B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1166631A1 (en) * | 2000-06-27 | 2002-01-02 | Kagome Kabushiki Kaisha | Growth inhibitors against algae and moss |
| JP2002355091A (ja) * | 2001-05-31 | 2002-12-10 | Nissui Pharm Co Ltd | 腸炎ビブリオ検出用培地 |
| CN1307310C (zh) * | 2005-02-28 | 2007-03-28 | 华南农业大学 | 香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆 |
| CN115024118A (zh) * | 2022-07-11 | 2022-09-09 | 佛山市农业科学研究所(佛山市农业技术推广中心) | 一种预防和治疗杂交兰茎腐病的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07228502A (ja) * | 1994-02-16 | 1995-08-29 | Kagome Co Ltd | 青枯れ病菌拮抗剤 |
| JPH11228310A (ja) * | 1998-02-05 | 1999-08-24 | Kagome Co Ltd | 青枯れ病菌拮抗剤 |
-
2000
- 2000-03-17 JP JP2000076645A patent/JP4574787B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07228502A (ja) * | 1994-02-16 | 1995-08-29 | Kagome Co Ltd | 青枯れ病菌拮抗剤 |
| JPH11228310A (ja) * | 1998-02-05 | 1999-08-24 | Kagome Co Ltd | 青枯れ病菌拮抗剤 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6010022011, 日本植物病理学会報（１９９７）第６３巻第５号第４０６−４０８頁 * |
| JPN6010022014, 第１５回日本植物細胞分子生物学会講演要旨集（１９９７）第３９頁１Ａ−０５ * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1166631A1 (en) * | 2000-06-27 | 2002-01-02 | Kagome Kabushiki Kaisha | Growth inhibitors against algae and moss |
| JP2002355091A (ja) * | 2001-05-31 | 2002-12-10 | Nissui Pharm Co Ltd | 腸炎ビブリオ検出用培地 |
| CN1307310C (zh) * | 2005-02-28 | 2007-03-28 | 华南农业大学 | 香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆 |
| CN115024118A (zh) * | 2022-07-11 | 2022-09-09 | 佛山市农业科学研究所(佛山市农业技术推广中心) | 一种预防和治疗杂交兰茎腐病的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4574787B2 (ja) | 2010-11-04 |
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