CN1884545B - 利用基因工程技术培育托品烷类生物碱高产的颠茄及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用基因工程技术培育托品烷类生物碱高产的颠茄的方法。其过程是用高保真RT-PCR分离目的基因，构建携带目的基因的双元三价植物高效表达载体，采用转基因技术把目的基因导入颠茄高效表达；在特定的筛选和诱导条件下获得转基因的颠茄；并对转基因颠茄进行分子检测和化学检测，最终获得托品烷类生物碱含量大大提高的转基因颠茄。本发明不但提供了一种利用基因工程技术培育托品烷类生物碱高产的颠茄的新方法，而且可以为包括莨菪碱和东莨菪碱在内的托品烷类生物碱的生产提供一种新型优质药源。

Description

利用基因工程技术培育托品烷类生物碱高产的颠茄及方法

技术领域

本发明属于分子生物学、生理学、育种学以及基因工程等领域，为一种利用基因工程技术培育托品烷类生物碱高产的颠茄的方法，具体涉及目的基因的克隆、表达载体的构建、获得托品烷类生物碱高产的转基因颠茄的具体程序。本发明还提供利用基因工程获得的托品烷类生物碱高产的转基因颠茄及其培养的子代、再生植株、植物组织或种子。

背景技术

颠茄(Atropa bellandonna)是民间传统的药用植物，为茄科颠茄属植物，是产生托品烷类生物碱的资源植物。托品烷类生物碱的生物合成途径已经阐明，编码限速酶的基因已经克隆，其中氮甲基腐氨转运酶和莨菪碱-6-羟化酶是该途径上最重要的限速酶。已经有研究报道，在莨菪发根中过量表达来源与黑莨菪的氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因，使得东莨菪碱的含量比原始材料提高了9倍。

本方面采用基因工程方法在颠茄过量表达来源于颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因，从而达到打破颠茄中托品烷类生物碱生物途径上的限速反应，最终培育出托品烷类生物碱高产的颠茄。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种利用基因工程技术遗传改良颠茄的方法，该方法将转移颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因核苷酸的编码区到颠茄中高效表达，从而提高颠茄中托品烷类生物碱的合成能力。

在本发明的另一方面，还提供了一种植物表达载体，它包含上述颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因核苷酸的编码区。

在本发明的另一方面，还提供了一种用上述植物表达载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是颠茄。

本发明的技术方案如下：

本发明分离出的两条DNA分子：一条是颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因的编码区，用引物fabpmt：5’-ccggatccATGGAGGTCAACCACAACAATG-3’和rabpmt：5’-ccgagctcTCAAAACTCAACCAAATCCCTC-3’可以从颠茄中扩增出来；另一条是颠茄的莨菪碱-6-羟化酶基因的编码区，用引物fabh6h：5’-ccagatctATGGCTACTCTTGTCTCAAATTG-3’和rabh6h：5’-cccacgtg TTAGGCATTAATTTTATATGGC-3’可以从颠茄中扩增出来。

一种利用基因工程技术提高颠茄中托品烷类生物碱含量的方法，特征在于利用携带颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区的植物表达载体，采用任何转基因方法在颠茄细胞、组织、器官、植株中过量表达氮甲基腐氨转运酶和莨菪碱-6-羟化酶，从而提高颠茄中托品烷类生物碱生物合成能力。其步骤如下：

(1)采用基因克隆的方法获得颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区；

(2)把颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区可操作地连于表达调控序列，形成植物表达载体；

(3)获得颠茄的无菌外植体；

(4)采用任何转基因方法转移颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区到颠茄细胞、组织、器官、植株中；

(5)在特定的条件下筛选和鉴定颠茄转化子；

(6)在适合的条件下培养的转基因的颠茄，获得转基因后代。

本发明涉及的植物表达载体包含颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区的DNA。

用上述方法获得的生命体，它是转基因的颠茄的细胞、组织、器官、植株。其特征为：导入了在CaMV35S启动子驱动下的颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区，其氮甲基腐氨转运酶和莨菪碱-6-羟化酶表达水平得到大大提高，托品烷类生物碱合成能力得到大大提高，托品烷类生物碱含量液得到大大提高。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。在本发明中，术语“生命体”指颠茄的细胞、组织、器官、植株。

在本发明中，术语“托品烷类生物碱”包括莨菪碱和东莨菪碱。

在本发明中，术语“任何转基因方法”包括根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化、发根农杆菌Ri质粒介导基因转化、植物病毒载体介导基因转化、如PEG介导基因转化、脂质体介导基因转化、电击法介导基因转化、超声波介导基因转化、显微注射介导基因转化、激光微束介导基因转化、基因枪法介导基因转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。

在本发明中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定颠茄转化子”是指用在离体培养的条件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)选择出有抗生素抗性的颠茄的转化子；可以使用PCR、Southern杂交、Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定颠茄的转化子。

在本发明中，术语“在适合的条件下培养的转基因的颠茄，获得转基因后代”是指对经过鉴定的转化子离体培养，并检测氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因的表达水平，筛选托品烷类生物碱高产的优良转化子进行培养，获得转基因后代。

在本发明中，我们从颠茄中克隆氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因的编码区，并构建了植物高效反义表达载体，并遗传转化颠茄，打破颠茄中托品烷类生物碱生物合成途径中的限速反应，推动代谢流往目标产物方向流动，提高颠茄中托品烷类生物碱的合成能力，从而提高颠茄中托品烷类生物碱的产量，然后筛选获得托品烷类生物碱高产的转基因颠茄进行培养，并获得转基因后代。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

颠茄氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区的克隆

根据颠茄氮甲基腐氨转运酶基因(GenBank登录号：AB018570)和莨菪碱-6-羟化酶基因(GenBank登录号：AB017153)的全长序列，并根据植物双元载体pCAMBIA1304和pBI121的多克隆酶切位点，设计携带相应酶切位点的基因特异性引物分别扩增目的基因的编码区，用于构建植物表达载体。

克隆颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区的引物为：fabpmt：5’-ccggatccATGGAGGTCAACCACAACAATG-3’(作为上游引物，携带Bam HI酶切位点和5’末端的两个保护碱基cc)；rabpmt：5’-ccgagctcTCAAAACTCAACCAAATCCCTC-3’(作为下游引物，携带SacI酶切位点和5’末端的两个保护碱基cc)。

克隆颠茄莨菪碱-6-羟化酶基因的引物为：fabh6h：5’-ccagatctATGGCTACTCTTGTCTCAAATTG-3’(作为上游引物，携带BglII酶切位点和5’末端的两个保护碱基cc)；rabh6h：5’-cccacgtg TTAGGCATTAATTTTATATGGC-3’(作为下游引物，携带Pml I酶切位点和5’末端的两个保护碱基cc)。

从颠茄叶片中提总RNA(上海华舜生物工程有限公司的RNA提取试剂盒)，反转录成cDNA(TaKaRa RNA PCR Kit)，然后进行PCR扩增，PCR反应体系为50ul，包含去离子水，10×PCR buffer5ul，dNTP1ul，MgCl₂3ul，引物各1ul，cDNA摸板1ul，Taq酶0.5ul。PCR条件为94℃3分钟，随之以94℃45秒、58℃45秒、和72℃2分钟进行29个循环，最后以72℃延伸8分钟。1％琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，获得扩增目的基因。

电泳分离后，回收(赛百胜PCR产物回收试剂盒)PCR产物，取适量回收产物与PMD18-T easy Vector载体连接(TaKaRa PMD18-T Vector试剂盒)后转入DH5α，LB+氨苄青霉素(100mg/l)固体培养基上抗性筛选阳性克隆，PCR鉴定后送测序(赛百胜公司完成)。

实施例2

构建携带颠茄氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区的植物表达载 体

选用pBI121和pCAMBIA1304为基本元件，构建双元三价植物表达载体pCAMBIA1304⁺(p1304⁺)。构建流程如下：1)Hind III和EcoR I双酶切pBI121和pCAMBIA1304；回收pBI121表达盒，回收pCAMBIA1304大片段；连接这两个回收产物，转化DH5α，在卡那霉素LB平板上筛选得到单克隆，摇菌扩大培养，抽提质粒，HindIII和EcoRI双酶切验证；即构建好p1304⁺。

将经过测序正确后的携带目的基因的DH5α(已经转入颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区或莨菪碱-6-羟化酶基因编码区)分别摇菌，扩大培养，分别提取质粒；用Bam HI及sac I双酶切携带颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区的PMD18-T easy Vector载体，1％琼脂糖电泳后回收小片段；1％琼脂糖电泳后回收小片段。

将构建好p1304⁺用Bam HI及sac I双酶切后回收大片断，并与从PMD18-T easyVector载体上用Bam HI及sac I双酶切切下的颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区用T4连接酶连接后，转化DH5α感受态细胞，LB+Kan(100mg/l)固体培养基上筛选抗性克隆，PCR和双酶切鉴定。获得携带颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区的重组质粒并命名为p1304⁺-abpmt。

将构建好p1304⁺-abpmt用Bgl II及Pml I双酶切后回收大片断，并与从PMD18-Teasy Vector载体上用Bgl II及Pml I双酶切切下的颠茄菪莨菪碱-6-羟化酶基因编码区用T4连接酶连接后，转化DH5α感受态细胞，LB+Kan(100mg/l)固体培养基上筛选抗性克隆，PCR和双酶切鉴定。获得携带颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区和菪莨菪碱-6-羟化酶基因编码区的的重组质粒并命名为p1304⁺-abpmt-abh6h。该质粒可以导入农杆菌LBA4404或者EHA105，获得工程菌，命名为LBA4404-abpmt-abh6h或EHA105--abpmt-abh6h，可用于对颠茄的转化。

实施例3

颠茄无菌外植体的获得

方法一：利用外植体建立颠茄无菌外植体

采取颠茄幼芽和幼茎，流水冲洗1小时；然后用2％(M/V)NaClO溶液浸泡10分钟，用无菌水冲洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl₂)溶液浸泡15分钟，用无菌水冲洗6次；然后接种在添加无菌丛生芽诱导培养基中(培养基盛于150ml的三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为：MS基本培养基，添加植物生长调节物1.25mg/L BA(苄基腺嘌呤)，30g/L蔗糖和0.6g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)调节培养基pH值为5.8，再添加5％琼脂粉。在光照培养箱中培养颠茄的幼芽，培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为55μmol.m^-2.s^-1。40天后，即可获得无菌的颠茄无菌外植体，等到叶片长到3cm×3cm大小时可用于遗传转化。

方法二：利用颠茄种子在无菌条件下萌发获得无菌外植体

采取颠茄成熟的种子，用2％(M/V)NaClO溶液浸泡20分钟，用无菌水冲洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl₂)溶液浸泡30分钟，用无菌水冲洗6次；在无菌条件下去除其种皮；将颠茄胚接种在种子萌发培养基上(培养基盛于150ml的三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为：MS基本培养基，添加30g/L蔗糖，调节培养基pH值为5.8，再添加5％琼脂粉。在光照培养箱中培养颠茄的幼芽，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养。待种子萌动后，改变培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为25μmol.m^-2.s^-1。等到叶片长到3cm×3cm大小时可用于遗传转化。

实施例4

根癌农杆菌遗传转化颠茄获得转基因颠茄

1、根癌农杆菌LBA4404-abpmt-abh6h、EHA105-abpmt-abh6h。使用前自冰箱取出，接种于50ml YEB液体培养(添加卡那霉素达到终浓度为100mg/L)，28℃，200rpm振荡培养两次；

2、第二次活化OD₆₀₀达0.3时，加100μmol/mL乙酰丁香酮，继续28℃，200rpm振荡培养，OD₆₀₀达0.6时，室温下4000rpm离心10分钟；

3、弃上清，菌体用MS液体培养基(100μmol/mL乙酰丁香酮)悬浮，稀释到原体积的5倍，在28℃，200rpm振荡培养，使菌液浓度达到的OD₆₀₀＝0.3左右；称转化液；可用于颠茄的遗传转化；1、2、3个步骤称为活化根癌农杆菌；

4、取无菌颠茄顶芽、侧芽、茎等植物不同部位，将茎切成1cm小段，或将叶片切成2cm²左右，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化液中，侵染10分钟后取出，用无菌卫生纸吸干，接入添加100μmol/mL乙酰丁香酮的MS固体培养基中共培养2天，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养。

5、共培养结束后转移至添加1.25mg/L BA的MS固体培养基(添加250mg/L头孢菌素以达到除菌的目的；添加50mg/L潮霉素作为筛选压获得转基因颠茄丛生芽)中培养，培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为55μmol.m^-2.s^-1。40天后，获得新生的颠茄丛生芽。

6、待从颠茄转化外植体上诱导出的丛生芽长到1cm左右是，分别切下单个的丛生芽，接种在无植物生长调节物的MS固体培养基上(添加250mg/L头孢菌素以达到除菌的目的；添加50mg/L潮霉素作为筛选压获得转基因颠茄丛生芽)继代培养；在该培养基上生长正常的颠茄丛生芽即为转基因颠茄。以后每25天继代培养一次，继代5次后，农杆菌可以去除干净。然后仅在添加0.25mg/L NAA的MS固体培养基上生根即可。转基因颠茄炼苗1周后，即可移栽。

实施例5

转基因颠茄的分子检测

1、颠茄基因组DNA的提取，方法如下：

1)取少量颠茄，放入1.5ml的Eppendorf管中，加500微升抽提buffer。

2)用小玻棒充分研磨后放于60℃水浴50min，其间经常颠倒混匀；

3)12000rpm，室温离心10分钟；

4)取上清液，加500ul饱和酚[Tris-HCl(pH8.0)饱和，吸取下层]，轻轻混匀，4℃静置5分钟至分层；

5)12000rpm，室温离心10min；

6)吸上清(约250微升)，加2倍体积的无水乙醇(-20℃储存)，充分混匀，室温静置至DNA析出；

7)8000rpm，4℃离心5分钟；

8)用75％的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置，使乙醇挥发完全。

9)加50ul TE(100ug/ml RNaseA，50mM Tris.Cl，10mM EDTA，pH8.0)，溶解DNA。37℃水浴1小时。

10)加40ul氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻混匀，静置5分钟至分层。

11)12000rpm，室温离心10分钟。

12)吸取上清(约35ul)到新Eppendorf管中，-20℃保存，用于PCR检测。

抽提缓冲液配方如下：

100mM            Tris-HCl(pH8.0)

2.5％(v/v)       巯基乙醇

500mM            NaCl

20mM             EDTA

1.5％(w/v)       SDS

2、转基因颠茄的PCR检测，方法如下：

由于所用的目的基因莨菪氮甲基腐氨转运酶基因和菪莨菪碱-6-羟化酶基因都源于颠茄自身，不可能用PCR直接检测。由于这两个基因在p1304⁺上是和潮霉素抗性基因在同一个边界内，因而可以在转基因颠茄中DNA中检测潮霉素抗性基因以确认转化子。潮霉素抗性基因(812bp)的检测使用引物fhygr(5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’)和rhygr(5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG’-3)。PCR程序为：94℃变性5min→30个循环(94℃50sec→58℃50sec→72℃1min)→72℃6min。

阳性对照为p1304⁺-abpmt-abh6h作为模板扩增，阴性对照为颠茄的天然叶片DNA作为模板扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。

实施例6

野生型颠茄和转基因颠茄中莨菪碱和东莨菪碱的含量比较

莨菪碱和东莨菪碱含量测定参照Hashimoto等人建立的方法(1993年)。结果为：莨菪碱在野生型颠茄主根、叶和茎中的含量分别为：8.1mg/g(干重)、1.4mg/g(干重)、0.3mg/g(干重)；莨菪碱在转基因颠茄主根、叶和茎中的含量分别为：14.2mg/g(干重)、3.6mg/g(干重)、1.2mg/g(干重)；东莨菪碱在野生型颠茄主根、叶和茎中的含量分别为：0.6mg/g(干重)、02mg/g(干重)、0.03mg/g(干重)；东莨菪碱在转基因颠茄主根、叶和茎中的含量分别为：4.6mg/g(干重)、3.8mg/g(干重)、0.4mg/g(干重)。

Claims (2)

1.一种利用基因工程技术提高颠茄中托品烷类生物碱含量的方法，特征在于首先构建植物高效表达载体，再采用转基因方法在颠茄细胞、组织、器官、植株中过量表达氮甲基腐氨转运酶和莨菪碱-6-羟化酶，其步骤如下：

(1)采用基因克隆方法获得来源于颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因核苷酸的编码区；

(2)把来源于颠茄的氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因核苷酸的编码区连于表达调控序列，构建携带颠茄氮甲基腐氨转运酶基因和莨菪碱-6-羟化酶基因编码区的植物表达载体：

选用pBI121和pCAMBIA1304为基本元件，构建双元三价植物表达载体pCAMBIA1304⁺(p1304⁺)，构建流程如下：1)Hind III和EcoR I双酶切pBI121和pCAMBIA1304；回收pBI121表达盒，回收pCAMBIA1304大片段；连接这两个回收产物，转化DH5α，在卡那霉素LB平板上筛选得到单克隆，摇菌扩大培养，抽提质粒，HindIII和EcoRI双酶切验证；即构建好p1304⁺；

将经过测序正确后的携带目的基因的DH5α分别摇菌，扩大培养，分别提取质粒；用Bam HI及sac I双酶切携带颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区的PMD 18-T easyVector载体，1％琼脂糖电泳后回收小片段；

将构建好的p1304⁺用Bam HI及sac I双酶切后回收大片断，并与从PMD 18-T easyVector载体上用Bam HI及sac I双酶切切下的颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区用T4连接酶连接后，转化DH5α感受态细胞，用100mg/l LB+Kan固体培养基筛选抗性克隆，PCR和双酶切鉴定，获得携带颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区的重组质粒并命名为p1304⁺-abpmt；

将构建好的p1304⁺-abpmt用Bgl II及Pml I双酶切后回收大片断，并与从PMD 18-Teasy Vector载体上用Bgl II及Pml I双酶切切下的颠茄菪莨菪碱-6-羟化酶基因编码区用T4连接酶连接后，转化DH5α感受态细胞，用100mg/l LB+Kan固体培养基上筛选抗性克隆，PCR和双酶切鉴定，获得携带颠茄氮甲基腐氨转运酶基因编码区和菪莨菪碱-6-羟化酶基因编码区的的重组质粒并命名为p1304⁺-abpmt-abh6h，将该质粒导入农杆菌LBA4404或者EHA105，获得工程菌，命名为LBA4404-abpmt-abh6h或EHA105--abpmt-abh6h，用于对颠茄的转化；

(3)获得颠茄无菌外植体；

方法一：利用外植体建立颠茄无菌外植体

其使用的为无菌丛生芽诱导培养基，该培养基配方为：MS基本培养基，添加植物生长调节物1.25mg/L BA，30g/L蔗糖和0.6g/L PVP，调节培养基pH值为5.8，再添加5％琼脂粉；

在光照培养箱中培养颠茄的幼芽，培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为55μmol.m^-2.s^-1，40天后，即可获得无菌的颠茄无菌外植体，等到叶片长到3cm×3cm大小时可用于遗传转化；

或方法二：利用颠茄种子在无菌条件下萌发获得无菌外植体

所使用的培养基配方为：MS基本培养基，添加30g/L蔗糖，调节培养基pH值为5.8，再添加5％琼脂粉；

在光照培养箱中培养颠茄的幼芽，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养；待种子萌动后，改变培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为25μmol.m^-2.s^-1，等到叶片长到3cm×3cm大小时可用于遗传转化；

(4)根癌农杆菌遗传转化颠茄获得转基因颠茄；

(5)转基因颠茄中托品烷类生物碱的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)包括以下步骤：

(1)根癌农杆菌LBA4404-abpmt-abh6h或EHA105-abpmt-abh6h，接种于50ml YEB液体培养，添加卡那霉素达到终浓度为100mg/L，28℃，200rpm振荡培养两次；

(2)第二次活化OD₆₀₀达0.3时，加100μmol/mL乙酰丁香酮，继续28℃，200rpm振荡培养，OD₆₀₀达0.6时，室温下4000rpm离心10分钟；

(3)弃上清，菌体用MS液体培养基添加100μmol/mL乙酰丁香酮悬浮，稀释到原体积的5倍，在28℃，200rpm振荡培养，使菌液浓度达到的OD₆₀₀＝0.3，该液称为转化液，用于颠茄的遗传转化；

(4)取无菌颠茄顶芽、侧芽、茎等植物不同部位，将茎切成1cm小段，或将叶片切成2cm²左右，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化液中，浸染10分钟后取出，用无菌卫生纸吸干，接入添加100μmol/mL乙酰丁香酮的MS固体培养基中共培养2天，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养；

(5)共培养结束后转移至添加1.25mg/L BA的MS固体培养基中培养，其中添加250mg/L头孢菌素以达到除菌的目的，添加50mg/L潮霉素作为筛选压获得转基因颠茄丛生芽，培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为55μmol.m^-2.s^-1，40天后，获得新生的颠茄丛生芽；

(6)待从颠茄转化外植体上诱导出的丛生芽长到1cm左右时，分别切下单个的丛生芽，接种在无植物生长调节物的MS固体培养基上继代培养，同样，添加250mg/L头孢菌素以达到除菌的目的，添加50mg/L潮霉素作为筛选压获得转基因颠茄丛生芽；在该培养基上生长正常的颠茄丛生芽即为转基因颠茄；

以后每25天继代培养一次，继代5次后，农杆菌去除干净，然后仅在添加0.25mg/LNAA的MS固体培养基上生根即可，转基因颠茄炼苗1周后，移栽。