CN109526985A - 土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的应用 - Google Patents

Abstract

土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的应用，涉及一种蛋白的生物防治剂的应用。本发明利土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂。本发明以土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂，稀释后可直接喷洒于植物表面。在盆栽实验和田间实验中，表面喷洒土地类芽胞杆菌蛋白EsxA的植物(水稻)对水稻稻瘟病均显示出明显的抗性，2h内便诱导植物开启免疫响应，且防效显著。本发明为增强植物的抗病性提供了新途径。

Description

土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白的生物防治剂的应用。

背景技术

水稻是中国最重要的粮食作物，然而随着水稻连作持续发生，病害问题日趋严重，造成产量和质量不断下降。其中，稻瘟病是全世界最具破坏性的水稻病害，目前已在85个国家检测到该病害，由稻瘟病造成的产量损失占水稻产量损失的50％。随着化学农药的持续使用，致使植物病原菌产生了严重的抗药性，病害防治效果越来越差，农药使用者被迫加大剂量，形成恶性循环。采用生物防治是解决上述问题的有效途径，然而，由于生物防治技术要求高，防治效果受易环境影响而不稳定等缺点，其应用受到严重限制。

发明内容

本发明利用土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂。

防治方法：将土地类芽胞杆菌蛋白EsxA喷洒于植物表面。

本发明以土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂，稀释后可直接喷洒于植物表面。在盆栽实验和田间实验中表面喷洒土地类芽胞杆菌蛋白EsxA的植物(水稻)对水稻稻瘟病均显示出明显的抗性，2h内便诱导植物开启免疫响应，且防效显著，达到67％以上。本发明为增强植物的抗病性提供了新途径。

附图说明

图1是土地类芽胞杆菌蛋白EsxA过敏反应结果照片，其中Tris-HCl为对照；

图2是实施例2盆栽实验病情指数柱形图；

图3是实施例2田间实验病情指数柱形图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的应用。

其中，所述的植物为水稻、小麦、谷子或高粱。

具体实施方式二：本实施方式土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的防治方法：将土地类芽胞杆菌蛋白EsxA喷洒于植物表面。

本实施方式中用自来水稀释土地类芽胞杆菌蛋白EsxA。

具体实施方式三：本实施方式土地类芽胞杆菌蛋白EsxA的获得：

步骤一、提取土地类芽胞杆菌(Paenibacillus terrae)NK3-4基因组DNA，然后进行引物扩增，正向引物为：5'-CCGGAAT TCATGGCAGGACGCATTTTAATTACC-3'，

反向引物为：5'-GCTCTAGACCCTTCGTTTGGTCAACAGTACGGAA-3'；

PCR扩增体系为：2×HifiMixI 25μl、ddH₂O 20μl、土地类芽胞杆菌NK3-4基因组DNA1μl、正向引物2μl和反向引物2μl；

PCR扩增条件为：95℃预变性5min，而后94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延长10min；

步骤二、转录和翻译，即获得土地类芽胞杆菌蛋白EsxA。

本实施方式土地类芽胞杆菌蛋白EsxA的源自于非致病菌株。本实施方式土地类芽胞杆菌蛋白EsxA的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本实施方式土地类芽胞杆菌蛋白EsxA含有91个氨基酸，分子质量10276.53，理论pI5.29，分子式为C₄₄₅H₇₁₁N₁₂₅O₁₄₆S₄，原子数目1431，消光系数(280nm)为5500，Abs 0.1％(＝1g/l)0.535，估计半衰期为30小时(哺乳动物的网状细胞，体外)，>20小时(酵母，体内)和>10小时(大肠杆菌，体内)。不稳定指数46.28，归为不稳定。脂肪族指数65.38，大致亲水性平均值-0.548。

本实施方式土地类芽胞杆菌蛋白EsxA为酸性、疏水蛋白质。

土地类芽孢杆菌(Paenibacillus terrae)NK3-4属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus Ash,Priest&Collin,1994)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年12月17日，保藏号为CGMCC No.7011。

实施例1

土地类芽胞杆菌蛋白EsxA的制备方法：

一、提取土地类芽胞杆菌(Paenibacillus terrae)NK3-4基因组DNA，然后进行引物扩增，正向引物为：5'-CCGGAAT TCATGGCAGGACGCATTTTAATTACC-3'，

反向引物为：5'-GCTCTAGACCCTTCGTTTGGTCAACAGTACGGAA-3'；

PCR扩增体系为：2×HifiMixI 25μl、ddH₂O 20μl、土地类芽胞杆菌NK3-4基因组DNA1μl、正向引物2μl和反向引物2μl；

PCR扩增条件为：95℃预变性5min，而后94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延长10min，PCR扩增产物经纯化即获得EsxA基因；

二、转录和翻译按以下步骤进行：

2.1PCR产物纯化

2.2载体构建

用EcoR1/Xba1分别双酶切纯化的PCR产物与pPICZαA质粒；酶切体系为50μl：PCR产物或pPICZαA 15μl，以及EcoR1 1μl、Xba1 1μl、Buffer 5μl、ddH₂O 28μl；37℃酶切2h，得带有粘端的EsxA基因及pPICZαA。然后用T4连接酶连接双酶切后的pPICZαA质粒与PCR产物，连接体系为10μl：酶切pPICZαA 2μl、酶切PCR产物4μl、连接10×ligase buffer 1μl、T4连接酶0.2μl、ddH₂O 2.8μl，25℃反应10min，得到质粒pPICZαA-EsxA，与未来插入EsxA基因的pPICZαA比较，分子量明显变大，表明载体构建成功，经DNA测序表明插入EsxA正确无误。

2.3质粒线性化

用PmaI酶切质粒pPICZαA-EsxA，酶切体系为50μl：PmaI 2μl、Custmart 5μl、pPICZαA-EsxA43μl，37℃反应2.5h，得到线性化pPICZαA-EsxA；

2.4感受态细胞制备：

(1)取甘油保存的毕赤酵母KM71H 10μl接种于装有10ml YPD培养基的100ml三角瓶中，170rpm，37℃培养过夜，然后取100μl接种于装有500ml YPD培养基的2000ml三角瓶中，170rpm，37℃培养过夜，至OD值1.3～1.5停止培养；

(2)取50ml步骤(1)获得培养液于1500g、4℃条件下离心5min，弃上清，收集细胞；

(3)用50ml冰预冷的无菌水重悬细胞，1500g、4℃条件下离心5min，弃上清；

(4)于细胞中加入25ml冰预冷的无菌水重悬细胞，1500g、4℃条件下离心5min，弃上清，将沉淀转移到2ml离心管中；

(5)用2ml冰预冷的1M山梨醇重悬细胞，1500g、4℃条件下离心5min；

(6)用100μl冰预冷的1M山梨醇重悬细胞；即得到感受态细胞毕赤酵母KM71H。

2.5转化感受态细胞：

取步骤2.4获得80μl重悬的酵母受态细胞，转移到冰预冷的电转杯中，将100μl线性化的质粒载体加入感受态细胞中，在1.5kw、25μF、200Ω条件下电转，电击时间为4ms；电击后立即向电转杯中加入1ml、浓度为1M的山梨醇，28℃静置2h。

2.6克隆筛选：取步骤2.5获得的转化后的感受态细胞500μl涂布于含有500μg/ml博莱霉素的YPDS平板上，28℃培养5d，然后挑取阳性克隆，进一步PCR检测。

2.7诱导表达：

取检测结果阳性的克隆进行扩繁，再接种于BMGY培养基中，于28℃、250rpm条件下培养至OD＝2～6(16～18h)，室温下1500g、离心5min，倒掉上清，用原培养液1/10体积的BMGY培养基重悬细胞并于28℃、250rpm条件下培养，每24h后添加浓度为100％的甲醇至培养液中甲醇浓度为0.5％，并于第1次加甲醇后的72～96h取培养液在1500g、室温下离心5min，将上清转移到新的离心管中-80℃保存，即得到包含本发明土地类芽胞杆菌蛋白EsxA的粗蛋白。

将包含土地类芽胞杆菌蛋白EsxA的粗蛋白过0.45μm膜后，用His Trap HP柱在柱层析系统(AKTA Explorer-100)上按以下步骤进一步纯化蛋白：

(A)将柱子平衡至基线后，将粗蛋白溶液用含有50mM Tris-HCl和0.5M NaCl(pH7.5)上样缓冲液稀释3倍后上样，流速为3ml/min，上样结束后，换上述缓冲液进样，清洗柱子5min，至基线；

(B)用50mM Tris-HCl、0.5M NaCl、500mM咪唑(pH 7.5)洗脱液脱目的蛋白，收集洗脱峰；

(C)将上述蛋白液以50mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液超滤离心除盐，超滤离心管截留分子量为10000Da，即得到土地类芽胞杆菌蛋白EsxA。土地类芽胞杆菌蛋白EsxA测序，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，载体(质粒pPICZαA-EsxA)构建之前对pPICZαA质粒进行扩繁：用pPICZαA转化大肠杆菌感受态Trans1-T1，用博来霉素筛选阳性转化子，然后用含博来霉素(500μg/ml)的LB培养基扩繁，再用质粒提取试剂盒提取pPICZαA质粒。

真核表达载体pPICZαA由中国农业科学院院植物保护研究所植物病虫害国家重点实验室提供。

毕赤酵母KM71H菌株由中国农业科学院院植物保护研究所植物病虫害国家重点实验室提供。

土地类芽胞杆菌蛋白EsxA抗菌活性检测：

将土地类芽胞杆菌蛋白EsxA溶解在50ml 50mM Tris-HCl(pH 7.5)中，质量浓度调整为0.1％。基于改良版的牛津杯法测定土地类芽胞杆菌蛋白EsxA的抗菌活性，以稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)Guy11作为供试病原菌，测定土地类芽胞杆菌蛋白EsxA是否对稻瘟病菌生长具有抑制作用。

改良版的牛津杯法步骤为：将稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)Guy11接种于PDA平板上，28℃培养7d，让菌丝覆盖培养基表面。用打孔器打取长满菌丝的琼脂块，接种于新的PDA平板中央，而后将3个牛津杯摆放于琼脂块周围，使牛津杯之间及牛津杯与琼脂块的距离相等。将100μl质量浓度为0.1％的土地类芽胞杆菌蛋白EsxA液添加到每个PDA平板上的牛津杯中，在28℃培养7d，未观察到抑菌带。平板拮抗试验表明土地类芽胞杆菌蛋白EsxA对稻瘟病菌的生长没有拮抗作用，不具有抗菌活性。

土地类芽胞杆菌蛋白EsxA过敏反应(HR)检测：

用50mM Tris-HCl(pH 7.5)溶解土地类芽胞杆菌蛋白EsxA，将土地类芽胞杆菌蛋白EsxA质量浓度调到0.1％，进行过敏反应(Hypersensitive response,HR)测试：在生长4周的烟草叶片上分别注射20μl土地类芽胞杆菌蛋白EsxA液和20μl浓度为50mM的Tris-HCl(pH 7.5)，烟草注射土地类芽胞杆菌蛋白EsxA液2h后叶片即出现坏死斑，烟草在室温下(25℃)放置过夜后如图1所示，注射土地类芽胞杆菌蛋白EsxA的烟草叶片出现局部坏死现象，表明土地类芽胞杆菌蛋白EsxA能够激发植物诱导抗性。

实施例2土地类芽胞杆菌蛋白EsxA植物防效实验

A、盆栽实验

供试水稻品种：极易感稻瘟病的水稻品种，丽江新团黑谷。

稻瘟菌孢子悬液制备：用无菌水将用高粱培养的稻瘟病菌Magnaporthe oryzae(Guy11)孢子洗下制成1×10⁶孢子/ml的孢子悬液。

秧苗处理：水稻幼苗用稻瘟病菌(M.oryzae)孢子喷雾接种。

将易感稻瘟病的丽江新团黑谷水稻种苗在盆栽钵中(15cm×10cm×4.0cm，每盆140株苗)中生长10天，长至2叶1心期，先将纯化的免疫活性因子和Guy11孢子悬浮液稀释500倍；将本发明土地类芽胞杆菌蛋白EsxA稀释500倍后均匀地喷洒植物，直至液滴布满叶面，间隔24h后，再用相同方法将Guy11菌株孢子悬浮液喷雾至水稻叶片上，直至液滴布满叶面，此为实验组；以只喷Guy11孢子的处理为对阳性照；以只喷土地类芽胞杆菌蛋白EsxA稀释液的为阴性对照；以不喷任何物质的处理为空白对照。每个实验处理6盆钵。

水稻幼苗首先在30℃和高湿度(90％)下在黑暗中温育培养24h，然后在自然光下的温室中在25～30℃培养。处理后5天观察叶瘟的严重程度。标准的发病分级标准适用于评估第3片叶稻瘟病症状的严重程度，因此根据国际水稻研究所的抗稻瘟病评估分级标准进行分级。并根据公式(A-1)计算第三片叶片的病情指数，根据方程式(A-2)计算防效。每盆分析14株幼苗。

病情指数％＝(0×n0+1×n1+2×n2+3×n3+······+9×n9)/(N×9)×100(A-1)

A-1式中N＝n1+n2+n3+······+n9，n代表相应病害级别的叶片数量；0,1,2,······,9代表病害级别。

防效％＝(阴性对照植物病情指数-处理植物病情指数)/(阴性对照植物病情指数)×100(A-2)

结果表明，空白对照及阴性对照均无稻瘟病发生，阳性对照稻瘟病发生最为严重，病情指数达到82.2％，实验组病情指数为18.3％，防效达到77.7％(如图2所示)。

B、田间试验

在田间种植感病品种蒙古稻，该试验区历年均有稻瘟病发生。在齐穗期，观察到稻瘟病发生(叶瘟病情指数为10％)。将土地类芽胞杆菌蛋白EsxA稀释500倍，喷洒在水稻叶片表面(处理组)。对照组植物用自来水处理。对照和处理的植株分别在3个20m²的地块上生长。这6块地块随机分布在稻田里。在喷洒后14天记录顶部3片叶的稻瘟病发病等级。根据方程式(A-1)计算病情指数，根据方程式(A-2)计算防效。

结果表明，喷施后第14d对照组水稻叶瘟的病情指数达到70.8％，而处理组叶瘟病情指数为22.8％，防效达到67.8％(如图3所示)。

序列表

<110> 黑龙江省农垦科学院

<120> 土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 91

<212> PRT

<213> 土地类芽孢杆菌(Paenibacillus terrae)

<400> 1

Met Ala Gly Arg Ile Leu Ile Thr Pro Glu Gln Val Asp Gln Val Ala

1 5 10 15

Asn Gln Phe Lys Gln Ser Gly Glu Gln Ser Gln Gln Ile Val Ser Ser

20 25 30

Leu Thr Gln Ser Ile Ser Gly Met Glu Gly Gln Trp Glu Gly Met Thr

35 40 45

Lys Gln Arg Phe Phe Gln Glu Phe Gln Glu Ala Ser Lys Gln Met Gln

50 55 60

Ala Phe Val Thr Thr Leu Asn Ser Ile Ser Gln Glu Leu Thr Ala Ile

65 70 75 80

Ala Asn Lys Phe Arg Thr Val Asp Gln Thr Lys

85 90

Claims (6)

1.土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的应用。

2.根据权利要求1所述的土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的应用，其特征在于将土地类芽胞杆菌蛋白EsxA喷洒于植物表面。

3.根据权利要求2所述的土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的应用，其特征在于所述的植物为水稻、小麦、谷子或高粱。

4.根据权利要求2所述的土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的应用，其特征在于将土地类芽胞杆菌蛋白EsxA稀释500倍后喷洒于植物表面。

5.根据权利要求1所述的土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的应用，其特征在于所述土地类芽胞杆菌蛋白EsxA的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

6.根据权利要求4所述的土地类芽胞杆菌蛋白EsxA作为水稻稻瘟病生物防治剂的应用，其特征在于喷洒土地类芽胞杆菌蛋白EsxA稀释液直至液滴布满叶面。