CN104561382A - 一种用于蓝舌病病毒16型荧光rt-pcr检测的特异性引物对及探针 - Google Patents

一种用于蓝舌病病毒16型荧光rt-pcr检测的特异性引物对及探针 Download PDF

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Abstract

本发明属于病毒检测领域，涉及蓝舌病病毒血清16型荧光RT-PCR检测用引物和探针序列。BTV-16型实时荧光RT-PCR检测方法是采用Taqman技术，设计一组仅在BTV-16型VP2基因间保守的特异引物对和一条特异性的荧光标记探针，应用荧光PCR仪对样品进行检测。采用该组引物和探针建立的荧光RT-PCR检测方法可特异性地检测到国内外BTV-16型病毒核酸，而检测不到其它血清型的BTV？核酸。该方法具有特异性强、灵敏度高，操作简单，耗时少和效率高等特点，并能避免检测过程中可能造成的环境污染。

Description

一种用于蓝舌病病毒16型荧光RT-PCR检测的特异性引物对及探针
技术领域
本发明涉及蓝舌病病毒16型（BTV-16）荧光RT-PCR检测用引物和探针序列。
背景技术
蓝舌病（Bluetongue, BT）是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒（Bluetongue Virus, BTV）引起，由吸血昆虫通过叮咬传播，感染反刍动物致其发病的非接触性传播的虫媒病毒病，本病以口腔、鼻腔和胃肠道黏膜发生溃疡性炎症变化为主要特征。蓝舌病病毒主要引起绵羊发病和死亡；牛和山羊动物常为隐性感染，偶有发病和死亡。世界动物卫生组织（OIE）2009年修订的《陆生动物卫生法典》将蓝舌病列为法定报告的多种动物共患疫病，我国2008年新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将其列为一类动物疫病。
蓝舌病病毒粒子呈二十面立体对称，直径为70～80nm，具有双层衣壳。病毒基因组大小约为19，200个碱基对，由10个节段的双链RNA组成，其中由第二片段编码的结构蛋白VP2为主要的血清型型特异性蛋白。 目前世上已知的BTV可分为26个血清型，不同血清型之间无交叉保护。我国于1979年在云南首次发现绵羊蓝舌病，随后相继在湖北、安徽、四川、重庆、山西等地出现蓝舌病疫情。病毒分离和血清学调查结果表明，我国至少存在11个血清型的蓝舌病病毒，即BTV-1、2、3、4、9、11、12、15、16、21和23型。从湖北和四川发病绵羊体内分离到了BTV-16型病毒。
针对蓝舌病的防控主要采用疫苗免疫和媒介昆虫控制相结合的办法。只有采用与疫源地流行的相同血清型BTV种毒制备的疫苗进行免疫，才能获得良好的免疫效果，因而，快速鉴定出BTV致病毒株的血清型已成防控蓝舌病的关键。常规的临床样品中BTV血清型的鉴定需先分离病毒，再经中和试验进行判定，操作较为繁琐，耗时长达1个月以上。
实时荧光PCR技术以其特异性好、灵敏度高、简便快速等优点在许多领域得到了广泛应用。欧洲国家应用该技术解决了对BTV-8型病毒的快速检测和鉴定的难题。筛选出针对不同BTV血清型的引物、探针，建立相应的荧光RT-PCR检测方法，对临床样品中的BTV血清型作出快速准确的诊断，将有助于制定相关防控策略。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蓝舌病病毒16型（BTV-16)荧光RT-PCR检测用引物和探针。
本发明采用以下技术方案：通过对我国BTV毒株进行全基因组序列测定，并将其与GenBank中公布的国内外BTV的VP2基因序列进行比对分析，选取在BTV-16型毒株间保守而与其它25个血清型BTV核酸差异较明显的区段进行引物和探针的设计与合成，合成多组引物和探针，通过用于对不同血清型BTV毒株的荧光RT-PCR检测，再从中筛选出只能扩增BTV-16样品的最优组合。
用于检测蓝舌病病毒16型核酸的荧光RT-PCR引物序列和探针序列组如下：
上游引物BTV16-L2-1585F：5’- GCTCCAATGTTTAATGCAAAAGTG -3’；
下游引物BTV16-L2-1705R：5’- TTAACAGATCGATACAATCCGCAC -3’；
特异性探针序列如下：
BTV16-L2-1622PB： 5’-FAM- TCGAGTTAGCGCAACGAAAGAATGAAGAC–BHQ1-3’，其中，FAM为荧光报告基因， BHQ1为荧光淬灭基团。
将按上述引物、探针与通用的商品化荧光RT-PCR扩增试剂盒组合后，建立检测蓝舌病病毒16型的实时荧光RT-PCR检测方法。
蓝舌病病毒16型实时荧光RT-PCR检测方法采用以下步骤：
（1）制备待测模板：可采用商品化RNA提取试剂盒或Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取各种来源样品中BTV基因组RNA， 将所提取的核酸样品需在配制反应液前经热变性使其变为单链RNA后备用；
（2）配制引物、探针液：选取上述的引物和探针，溶解配制多个工作浓度；
（3）建立反应体系：参照通用的商品化荧光RT-PCR扩增试剂盒的说明书配制，利用系列梯度方阵测定筛选法确定最佳的引物浓度和探针浓度；
（4）确定反应程序：筛选出最佳的扩增程序；
（5）选择仪器的检测通道；
（6）样品上机检测。
本发明的主要特点是：充分运用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，具有结果可靠和准确灵敏、操作简单、省时省力、提高检查效率等优点，特别适合大量样品的快速检测。
附图说明
图1为蓝舌病病毒16型实时荧光RT-PCR方法的特异性试验检测曲线图。只在BTV-16病毒培养液和含有BTV-16病毒的血液中获得阳性结果，Ct值分别为21和28；其它血清型的BTV无有效扩增。
图2为蓝舌病病毒16型实时荧光RT-PCR方法的灵敏度试验检测曲线图。BTV-16病毒培养液在稀释度为10-6时，仍能获得有效扩增，Ct值为38。
具体实施方式
反应体系的建立和优化：
利用BTV毒株和BTV阳性的反刍动物血液作为待检样品，利用商品化RNA提取试剂盒或Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分装后置-80℃保存备用。将待检的核酸样品 95 ℃变性 5分钟，速取出置冰上备用。
（1）引物浓度的优化  在反应体系中其他条件相同的情况下，将引物浓度分别从0.1 μmol/L倍比稀释至0.6 μmol/L，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物浓度终浓度为0.2 μmol/L；
（2）探针浓度的优化  在反应体系中其他条件相同的情况下，将探针浓度分别从0.02μmol/L倍比稀释至0.2μmol/L，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度终浓度为0.04 μmol/L。
采用 AB Life Technologies公司的AgPath-ID one-step RT-PCR Kit（Catalog Number：AM1005）来进行试验，通过对引物和探针浓度的优化，最后确定采用的实时荧光RT-PCR反应体系为25 ul，包括12.5 ul 2×real time PCR Buffer （包含有dNTP，Mg2+等），1 ul 25×enzyme mix，终浓度分别为0.2 μmol/L和0.04 μmol/L的引物和探针，5 ul模板，用水补足至25 ul。根据检测样品来源的不同，可适当调整模板用量。采用不同公司的荧光RT-PCR扩增试剂盒反应体系需作调整。
RT-PCR反应程序的建立：
运用Applied Biosystems 7500 fast荧光PCR 仪筛选出如下反应程序：45℃反转录10 min，95℃ 10 min终止反转录反应；95℃ 变性3 sec，在60℃退火和延伸30s，重复40个循环。根据使用的仪器不同，应将反应程序参数作适当调整。
仪器检测通道的选择：
进行RT-PCR设置反应荧光信号时，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。程序设置好后，点击运行，进行PCR反应，反应结束后保存文件，打开分析软件，分析实验结果，给出△Rn（第n个循环时的荧光增加值）与循环数图像。
实施例1
（1）待测模板的制备
方法一  采用商品化RNA提取试剂盒按照说明书方法进行。
方法二  用Trizol核酸抽提试剂的提取方法
a．取样品100ul加入1.5ml离心管中，再向其中加入300ul的Trizol组织抽提液，于振荡器上充分振荡。然后12000rpm离心15min，将上清移至1.5ml的离心管中；
b．向上清中加入400ul预冷的异丙醇，在振荡器上充分振荡后，12000 rpm离心10 min，以便获得RNA沉淀；
c．小心倒掉上清，加入600ul 75%乙醇，用手上下颠倒数次洗涤。（注意：不能剧烈振荡，防止RNA的断裂和RNA沉淀溶解后难以重新沉淀）；
d．12000rpm离心10min，缓慢吸弃上清，室温干燥约25min，待乙醇完全挥发后加25 ul DEPC水溶解，-20℃保存备用。
    将所提取的核酸样品 95 ℃变性 5分钟，速取出置冰上备用
（2）蓝舌病病毒16型实时荧光RT-PCR反应的扩增条件
根据已经优化的反应体系来加样，将加好样的PCR管放在荧光PCR仪中，设置相应荧光收集条件后进行扩增，反应程序如下：45℃ 10 min，95℃ 10 min；95℃ 3 sec，60℃ 30 sec，重复40个循环。
（3）蓝舌病病毒16型实时荧光RT-PCR检测结果
在25ul反应体系中，利用针对蓝舌病病毒16型的特异性引物和探针进行实时荧光RT-PCR，检测含有BTV-16型基因组RNA的阳性样品，结果可以得到特异性的荧光曲线。
以上试验结果表明，本发明设计的引物和探针特异性良好，并建立了蓝舌病病毒16型实时荧光RT-PCR检测方法。
实施例2
蓝舌病病毒16型实时荧光RT-PCR方法的特异性试验：
在25ul反应体系中，同时加入除16型外其他血清型的蓝舌病病毒和流行性出血热病毒（EHDV）毒株的核酸作为模板，运用本发明的特异性引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测，结果只有蓝舌病病毒16型有特异性扩增曲线，而其它样品均无扩增曲线，证实本发明针对BTV-16型的引物和探针具有良好的特异性（图1）。
实施例3
蓝舌病病毒16型实时荧光RT-PCR方法的灵敏度试验：
在25ul反应体系中，将蓝舌病病毒16型提取核酸测定浓度后，作8个10倍系列稀释，进行实时荧光RT-PCR检测，得到稀释梯度系列扩增曲线（图2），结果发现其可以检测的最低稀释度为10-6，相当于浓度为2.18pg/ul的RNA。
利用本发明进行检测，操作简便快速，一般可在3小时左右完成，而且可以在检测过程中实时检测结果，不需要进行扩增产物的电泳观察，避免了扩增产物对实验环境的污染以及电泳观察时EB对环境的污染。
<110>云南省畜牧兽医科学院
<120>蓝舌病病毒16型（BTV-16）荧光RT-PCR检测用引物和探针
<160>3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
GCTCCAATGTTTAATGCAAAAGTG
 
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
TTAACAGATCGATACAATCCGCAC
 
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
TCGAGTTAGCGCAACGAAAGAATGAAGAC

Claims (2)

1.一种用于蓝舌病病毒16型荧光RT-PCR检测的特异性引物对，其特征在于，所述引物对由上游引物BTV16-L2-1585F序列为 GCTCCAATGTTTAATGCAAAAGTG 和下游引物BTV16-L2-1705R序列为TTAACAGATCGATACAATCCGCAC 组成。
2.一种用于用于蓝舌病病毒16型荧光RT-PCR检测的探针序列，其特征在于，所述的探针BTV16-L2-1622PB序列为TCGAGTTAGCGCAACGAAAGAATGAAGAC。
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150429

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