CN107058616A

CN107058616A - 一种燕麦花叶病毒的rt‑pcr检测方法、引物和试剂盒

Info

Publication number: CN107058616A
Application number: CN201710056939.3A
Authority: CN
Inventors: 张卫东; 黄永辉; 权永兵; 廖力; 徐淼锋; 迟远丽
Original assignee: Inspection Technical Center Of Zhuhai Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection Technical Center Of Zhuhai Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2017-01-19
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明涉及生物物种分子诊断领域，公开了一种燕麦花叶病毒的RT‑PCR检测方法、引物和试剂盒。检测方法包括以下步骤：S1、取待测样品提取植物组织总RNA；S2、以总RNA为模板，引入下游引物OMV‑R2进行反转录模板cDNA的合成；S3、将上游引物OMV‑F2、下游引物OMV‑R2置于PCR仪中进行PCR扩增反应；S4、对扩增产物进行电泳分离，鉴定样品中是否含有燕麦花叶病毒。本发明针对检疫性有害生物燕麦花叶病毒，设计了特异性引物，建立了RT‑PCR快速检测OMV的方法，具有检测方法快速简单、特异性强、灵敏度高、稳定性强等优点，适用于我国各大检验检疫机构针对检疫性有害生物燕麦花叶病毒的鉴定。

Description

一种燕麦花叶病毒的RT-PCR检测方法、引物和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物物种分子诊断领域，具体地说，涉及一种燕麦花叶病毒的RT-PCR检测方法、引物和试剂盒。

背景技术

燕麦花叶病毒(Oat mosaic virus，OMV)为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)，为线状，常弯曲，无包膜，具有明显的形态长度，长约600～750nm，宽12～14nm。OMV主要侵染燕麦属植物，引起秋季播种的燕麦发病，可以引起39～60％的减产。OMV的传播主要依赖禾谷多粘菌以持久性方式传播，长距离扩散则随感病植株的无性繁殖材料传播。目前，OMV主要分布于美国、加拿大、新西兰、英国、法国、爱尔兰等国，在我国尚未见发生，2007年农业部862号公文《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》将其列为重要的对外检疫性有害生物。因此，建立该病毒的快速检疫鉴定技术及相关检测标准具有非常重要的经济价值和社会价值。

半个世纪来，现代病毒学研究水平不断提高，病毒的检测技术也在不断发展和改进。目前病毒的检测方法主要包括枯斑和指示植物检测法，酶标免疫吸附法(ELISA)，电镜负染检测法，免疫电镜检测法，电镜超薄切片法以及PCR检测方法。血清学方法是目前普遍运用的常规检测方法，可操作性强，检测结果相对可靠。但是该方法依赖于高质量的抗血清，成本较高，周期性长，且灵敏度有限，难以检测含量很少的病毒。同时，燕麦花叶病毒所在的大麦黄花叶病毒属各个成员在血清学上密切相关，因而难以采用ELISA方法来准确检测燕麦花叶病毒。

PCR技术也是目前国内外植物病毒检测中应用较成功的方法。专利CN 102102133A“棉花曲叶病毒检测用引物”公开了棉花曲叶病毒定性PCR检测方法。但是，迄今为止，缺乏一种针对燕麦花叶病毒的特异性强、灵敏度高的RT-PCR检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，针对OMV的外壳蛋白基因(CPgene)设计一对特异性检测燕麦花叶病毒的引物，并优化反应体系和反应程序，建立了RT-PCR快速检测OMV病毒的方法。该方法具有很强的特异性，可以从大麦黄花叶病毒属中特异性检出OMV病毒。该方法灵敏度高、特异性强、快速高效，检测结果准确可靠，非常适合在检验检疫口岸的推广应用。

为此，本发明所采用的技术方案是：

一种用于燕麦花叶病毒的RT-PCR检测的引物，包括上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2，其序列分别如下：

OMV-F2：5′-CCTCGGATGGTGCGTCAATA-3′；(SEQ ID No.1)

OMV-R2：5′-AACCCTGTGGTGGGTTGTTT-3′。(SEQ ID No.2)

一种燕麦花叶病毒的RT-PCR检测方法，包括使用上述引物进行PCR扩增的步骤。

进一步地，该检测方法包括以下步骤：

S1、取待测样品提取植物组织总RNA；

S2、以总RNA为模板，引入下游引物OMV-R2进行反转录模板cDNA的合成；

S3、将上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2置于PCR仪中进行PCR扩增反应；

S4、对扩增产物进行电泳分离，鉴定样品中是否含有燕麦花叶病毒。

进一步地，所述步骤S2中进行反转录模板cDNA的合成时，其反应体系为：

反应条件为：37℃保温60min，70℃15min灭活反转录酶。

进一步地，所述dNTP的浓度为10mmol/L，所述下游引物OMV-R2的浓度为10μmol/L。

进一步地，所述步骤S3中PCR反应体系为：

反应条件为：95℃5min；95℃1min，60℃50s，72℃60s，35个循环；72℃10min。

进一步地，所述上游引物OMV-F2和下游引物OMV-R2的浓度均为10μmol/L。

一种燕麦花叶病毒的RT-PCR检测试剂盒，包含以上所述的引物。

本发明的有益效果是：本发明针对检疫性有害生物燕麦花叶病毒，设计了特异性引物，建立了RT-PCR快速检测OMV的方法，具有检测快速简单、特异性好、灵敏度高、稳定性强等优点，检测时间也缩减到2小时之内，极大的提高了效率，适用于我国各大检验检疫机构针对检疫性有害生物燕麦花叶病毒的鉴定。

附图说明

图1是实施例RT-PCR检测OMV的特异性结果；

图2是实施例RT-PCR检测OMV的灵敏度结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例

一、选择供试验材料。采用的供试验的病毒样品见表1。

表1供试验病毒样品

中文名	英文名
		燕麦花叶病毒	Oat mosaic virus，OMV
大麦黄花叶病毒	Barley yellow mosaic virus，BYMV
		大麦和性花叶病毒	Barley mild mosaic virus，BaMMV
小麦黄花叶病毒	Wheat yellow mosaic virus，WYMV
		小麦梭条斑花叶病毒	Wheat spindle streak mosaic virus，WSSMV
水稻坏死花叶病毒	Rice necrosis mosaic virus，RNMV

本实施例使用到的主要试剂和仪器如下：PCR扩增试剂由珠海宝锐生物科技有限公司提供；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、引物由宝生物工程(大连)有限公司提供；其他试剂按普通分子生物学实验操作规定。

二、取待测样品提取植物组织总RNA。

采用液氮进行供试样品的前处理，植物总RNA提取按照试剂盒(TaKaRa Code:D9108A)方法，操作步骤如下：

1、于冰箱中取冷冻样品置于预冷的研钵中，加入液氮，迅速研磨至粉末状；

2、迅速将粉末状样品转移至2mL离心管中，加入1mL RNAiso Plus，剧烈振荡混匀，直至样品呈匀浆状，室温静置5min；

3、12000g，4℃离心5min；

4、小心吸取上清(1mL)，转移至新的2mL离心管中；

5、向上述溶液中加入1/5体积的氯仿(200μL)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，待溶液充分乳化后，室温静置5min；

6、12000g，4℃离心15min；

7、从离心机中小心取出离心管，此时溶液分三层，小心吸取上层清液(400μL)，转移至新的2mL离心管中；

8、向上述清液中加入等体积(400μL)的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温静置10min；

9、12000g，4℃离心10min，此时管底有白色沉淀；

10、小心地弃去上清，沿离心管管壁缓慢加入1mL预冷的75％乙醇，切勿碰触到沉淀，轻轻地上下颠倒离心管洗涤沉淀；

11、12000g，4℃离心5min，小心地弃去乙醇，保留沉淀；

12、室温状态下干燥10min左右；

13、待乙醇充分晾干之后，向离心管中加入60μL，RNase-free H₂O溶解沉淀；

14、溶解后的RNA保存于-20℃冰箱，备用。

三、根据GenBank中已登录的OMV的核苷酸序列，利用DNAStar软件包PrimerSelect设计引物。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，引物的相关信息如表2。

表2特异性引物

四、以总RNA为模板，引入所述下游引物OMV-R2进行反转录模板cDNA的合成。

以总RNA为模板，以下游引物OMV-R2作引物反转录合成cDNA，0.2mL PCR管中加入：

反应条件为：37℃保温60min，70℃15min灭活反转录酶，反应结束后cDNA于-20℃冰箱保存备用。

五、将上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2置于PCR仪中进行PCR扩增反应。其反应体系为：

用OMV作阳性对照，用ddH₂O作空白对照，6种供试验病毒作阴性对照，重复两次。

六、琼脂糖电泳

RT-PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，每个样品取5μL扩增产物与1μL的6×加样缓冲液混合均匀点样，用DNA Marker作分子标记，在1×TAE中以5V/cm的电压电泳50min，溴化乙锭溶液(0.5μg/mL)染色10min，在凝胶成像系统上观察并记录结果。

七、结果判断

如图1所示，其中M为Marker，1是阳性对照，2为待测样品，3是大麦黄花叶病毒，4是小麦黄花叶病毒，5是大麦和性花叶病毒，6是小麦梭条斑花叶病毒，7是水稻坏死花叶病毒，8是空白对照。阳性对照在406bp处有扩增片段，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，判定为阳性，其他近缘种类(阴性对照)和空白对照无特异性扩增，表明该体系具有良好的特异性。

将反转录的OMV阳性样品产物cDNA，加入到PCR反应体系中，进行灵敏度检测，结果如图2所示，其中，M为Marker，1为100ng/μL，2为10ng/μL，3为1ng/μL，4为0.1ng/μL，5为0.01ng/μL，6为0.001ng/μL。可知模板浓度在1～100ng/μL时，均能扩增出强烈的检测信号；对于0.1～0.01ng/μL的DNA模板，检测扩增产物明显降低，检测信号较弱；当DNA模板浓度为0.001ng/μL时，由于无扩增产物或检测信号太弱而无法检出。表明该方法的检测限度为0.1ng/μL，最适检测浓度为1～100ng/μL。

本发明针对OMV的外壳蛋白基因设计一对特异性检测燕麦花叶病毒的引物，并优化反应体系和反应程序，建立了RT-PCR检测OMV病毒的方法。特异性测试结果表明该方法具有很强的特异性，可以从大麦黄花叶病毒属中特异性检出OMV病毒，而且准确灵敏，成本较低，检测范围广，非常适合在检验检疫口岸的推广应用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种燕麦花叶病毒的RT-PCR检测方法、引物和试剂盒

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctcggatgg tgcgtcaata 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaccctgtgg tgggttgttt 20

Claims

1.一种用于燕麦花叶病毒的RT-PCR检测的引物，包括上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2，其序列分别如下：

OMV-F2：5′-CCTCGGATGGTGCGTCAATA-3′；

OMV-R2：5′-AACCCTGTGGTGGGTTGTTT-3′。

2.一种燕麦花叶病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述引物进行PCR扩增的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取待测样品提取植物组织总RNA；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中进行反转录模板cDNA的合成时，其反应体系为：

总RNA 1μL

5×PCR缓冲液 2.5μL

dNTP 0.5μL

下游引物OMV-R2 2μL

反转录酶 0.5μL

加ddH₂O至总体系 12.5μL；

反应条件为：37℃保温60min，70℃ 15 min灭活反转录酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述dNTP的浓度为10mmol/L，所述下游引物OMV-R2的浓度为10μmol/L。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中PCR反应体系为：

10×PCR缓冲液 2.5μL

MgCl₂ 2.5μL

上游引物OMV-F2 1μL

下游引物OMV-R2 1μL

模板cDNA 1μL

Taq酶 0.5μL

加ddH₂O补足到 25μL；

反应条件为：95℃ 5min；95℃ 1min，60℃ 50s，72℃ 60s，35个循环；72℃ 10min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述上游引物OMV-F2和下游引物OMV-R2的浓度均为10μmol/L。

8.一种燕麦花叶病毒的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物。