CN106801109A - 一种猪非典型瘟病毒rt‑pcr检测特异性引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种猪非典型瘟病毒rt‑pcr检测特异性引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物病毒学及分子生物学技术领域，具体涉及一种猪非典型瘟病毒RT‑PCR检测特异性引物、试剂盒及检测方法。所述特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述试剂盒包括所述引物、Prime Script 1 step酶混合物、2×1 step缓冲液和无核酸酶水。本发明还公开了利用所述特异性引物或所述试剂盒检测猪非典型瘟病毒的方法。本发明引物特异性和灵敏度高，可以于各种临床样本中检测、鉴别出猪非典型瘟病毒，从而可以快捷及时地采取防治措施，减少经济损失。

Description

一种猪非典型瘟病毒RT-PCR检测特异性引物、试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明属于属于动物病毒学及分子生物学技术领域，具体涉及一种猪非典型瘟病毒RT-PCR检测特异性引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
瘟病毒属属于黄病毒科，是有囊膜高度变异的RNA病毒，其基因组长度约12.3kb。目前已确定的有4个种：牛病毒性腹泻1型病毒(BVDV-1)，牛病毒性腹泻2型病毒(BVDV-2)，猪瘟病毒(CSFV)和边界病毒(BDV)。另外还有几种未确定的非典型瘟病毒，包括长颈鹿瘟病毒，羚羊瘟病毒，HoBi样病毒和Bungowannah病毒。
2015年美国学者在对一份PRRSV阳性样本做宏基因组学分析时，发现其中有片段与瘟病毒CSFV、BVDV及菊头蝠瘟病毒(RaPV)预期值(E)从8e-6-1e-88，并具有68％-98％同一性(identity)。他们将这种病毒暂时命名为“Atypical porcine pestivirus，APPV”(BenM.Hause,Emily A.Colin,Lalitha Peddireddi et al,2015.Discovery of a novelputative atypical porcine pestivirus in pigs in the USA.Journal of GeneralVirology,96,2994-2998.)。
2016年，德国学者从先天性震颤的仔猪小脑以及外周神经检测到APPV核酸，而健康仔猪未检测到，从而提出新生仔猪先天性震颤可能与APPV存在一定关联。另一篇德国学者的研究表明，APPV在德国猪群中有较高的感染率，并且在一株特殊的PK-15细胞上可以检测到病毒复制(M.Beer,K.wernike,C.et al.2016.High Prevalence of HighlyVariable Atypical Porcine Pestiviruses Found in Germany.Transbound and EmergDiseases，doi:10.1111/tbed.12532.)。
这些发现可能有助于对仔猪先天性震颤发病原因的理解，国外多采用PCR方法对该病毒进行检测，但该病毒属于RNA病毒，基因序列变异快，不同毒株间基因序列差异大，NCBI目前登陆序列同源性也仅88.1％-90.9％，国外建立的PCR方法在国内适用性不强，且国内尚无针对该病毒的检测方法出现。
由此可见，现有技术还存在较大不足。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种猪非典型瘟病毒PCR检测特异性引物、试剂盒及检测方法，对猪非典型瘟病毒进行快速、准确地鉴别。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种猪非典型瘟病毒RT-PCR检测特异性引物，核苷酸序列如下：
上游引物F：ctcacyagtgatgggtggga(SEQ ID NO:1)，其中，y代表：c或者t；
下游引物R：cctatyttcttcatgaayaccatggc(SEQ ID NO:2)，
其中，y代表：c或者t。
一种猪非典型瘟病毒的检测试剂盒，，包括所述的猪非典型瘟病毒RT-PCR检测特异性引物。
进一步的，所述试剂盒还包括：一步法RT-PCR试剂(均来自市售)：PrimeScript1step酶混合物，2×1step缓冲液，无核酸酶水。
进一步的，所述引物或试剂盒应用于猪非典型瘟病毒的检测。
一种猪非典型瘟病毒的PCR检测方法，包括：
(1)待检样本RNA提取；
(2)利用所述的特异性引物，采用一步法RT-PCR扩增步骤(1)中所得的样本RNA；
(3)取步骤(2)中所得PCR反应产物进行电泳鉴定；
(4)结果判定。
进一步的，所述步骤(2)中一步法RT-PCR反应体系为：
进一步的，所述步骤(2)中一步法RT-PCR扩增条件为：
进一步的，所述步骤(1)中的样本可以是离体血清、肺脏样本和淋巴结样本等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一组PCR的引物，该引物特异性和灵敏度都较高，且能够检测出猪非典型瘟病毒，可以对各种临床样本进行检测、鉴别，从而可以快捷地对临床样本进行检测，操作简单、实用。
附图说明
图1为本发明对样本扩增的电泳图，其中泳道1为阳性样本，泳道2为阴性对照。
图2为本发明特异性检验结果。其中泳道1为阳性样本，泳道2-7分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒，8为阴性对照。
图3为本发明灵敏度结果，1、2、3、4、5、6代表的RNA浓度分别为1.22μg/μL、0.122μg/μL、0.0122/μLμg、1.22ng/μL、0.122ng/μL、0.0122ng/μL。
图4实施例1检测结果，泳道1为阳性血清样品，泳道2为病料样本1，泳道3为病料样本2，泳道4为DMEM。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
实施例1一种猪非典型瘟病毒PCR检测引物、检测试剂盒及检测方法
1、一种猪非典型瘟病毒PCR检测引物
根据NCBI登陆的猪非典型瘟病毒的毒株序列，登录号：KU194229、KX929062、LT594521、KU041638、KU041639、KU041637、KX929063、KX929069等提供的信息，运用DNAMAN6.0进行比对分析，设计了以下PCR的引物：
上游引物F：ctcacyagtgatgggtggga(SEQ ID NO:1)，其中，y代表：c或者t；
下游引物R：cctatyttcttcatgaayaccatggc(SEQ ID NO:2)，其中，y代表：c或者t；
使用上述引物进行PCR扩增，可以对猪非典型瘟病毒进行鉴别，快速、准确。
2、一种猪非典型瘟病毒PCR检测试剂盒
一种猪非典型瘟病毒检测试剂盒，包括以上所述的猪非典型瘟病毒PCR引物SEQID NO:1和SEQ ID NO:2；
还包括一步法RT-PCR试剂(来自市售)：PrimeScript 1step酶混合物，2×1step缓冲液，无核酸酶水；
3、一种猪非典型瘟病毒PCR检测方法
(1)待检样本RNA提取：临床阳性血清样本和2份病料(病料1为淋巴结样本，病料2为肝脏样本，来源于不同的猪只)样本各200μL作为待检样本、200μLDMEM细胞培养基样本作为阴性对照，分别进行以下操作：
病料样本加入1mL PBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清液200μL，用AXYGEN AxyPepTM Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep kit进行RNA抽提，抽提按照试剂盒说明书进行，最后加40μL的TE进行洗脱，洗脱后的RNA放于-80℃保存。
所述阳性血清样本测序结果为：
ctcactagtgatgggtgggaaatactaggccctggcaggatcccaaaaatcactaacgtagagtccgctaagatggacctactatctaaactaatgacattcctggggattgaaagttcgagggtccctagaaccccagtccactccactaggaaactactgaagatagtaagaggcatggaaactgggtgggggtacactcatgccggaggaattagtagtgcgaggcatgtcaccggtgagaagaacctaatgacacacatggagggcaggaagggcaagtatatcctgcagtctcaagaacatggtgctgatgaggtggaatatggggtgaagactgaccagaaagcacccgacaatgcattgtgctattgttttaatcctgaagctactaatataaagggagagacaggggccatggtattcatgaagaagatagg。
(2)将提取的RNA分别加入到一步法RT-PCR反应体系中于PCR管内进行PCR扩增。
其中，一步法RT-PCR反应体系为：
(3)将步骤(2)的PCR管置于PCR仪上进行扩增反应。
扩增条件为：
(4)分别取5μL PCR反应产物在1％(质量比)的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。
(5)结果判定：
如果扩增出的片段大小在439bp左右的为阳性，无条带或条带大小不符的为阴性。电泳图见图4，检测结果见表1。
表1待检样本检测结果
待检样本 扩增结果判定
血清样本 阳性
病料样本1 阳性
病料样本2 阴性
DMEM细胞培养基 阴性
实施例2特异性检验
以检测阳性的血清样本RNA作为阳性对照，以无菌蒸馏水为阴性阴性对照，分别按实施例1步骤(2)、(3)扩增，按步骤(4)方法做电泳鉴定，结果如图1所示。
以检测阳性的血清样本作为阳性对照，猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的培养液进行特异性检测，使用实施例1的方法与引物，结果除阳性对照外均没有扩增，阳性病料经过PCR扩增分别在439bp处有条带(见图2)。
实施例3灵敏度检验
用实施例1中血清样本提取得到的RNA用RNase Free H2O做10倍的梯度稀释，RNA含量分别为1.22μg/μL、0.122μg/μL、0.0122μg/μL、1.22ng/μL、0.122ng/μL、0.0122ng/μL作为模板，每个稀释度各取8μL作为模板，按实施例1方法进行检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量为0.976ng，即0.122ng/μL梯度。(见图3)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
<110> 广东温氏食品集团股份有限公司
<120> 一种猪非典型瘟病毒RT-PCR检测特异性引物、试剂盒及检测方法
<160> 2
<170> DNAMAN6.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctcacyagtg atgggtggga 20
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cctatyttct tcatgaayac catggc 26

Claims (8)

1.一种猪非典型瘟病毒RT-PCR检测特异性引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.一种猪非典型瘟病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的猪非典型瘟病毒RT-PCR检测特异性引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Prime Script1step酶混合物，2×1step缓冲液，无核酸酶水。
4.根据权利要求1所述的特异性引物或权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物或试剂盒应用于猪非典型瘟病毒的检测。
5.一种猪非典型瘟病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于，包括：
(1)待检样本RNA提取；
(2)利用权利要求1所述的特异性引物，采用一步法RT-PCR扩增步骤(1)中所得的样本RNA；
(3)取步骤(2)中所得PCR反应产物进行电泳鉴定；
(4)结果判定。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中一步法RT-PCR反应体系为：
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中一步法RT-PCR扩增条件为：
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的样本包括离体血清样本、肺脏样本和淋巴结样本。
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