CN104651507B - 用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物与方法 - Google Patents

用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物与方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104651507B
CN104651507B CN201510073931.9A CN201510073931A CN104651507B CN 104651507 B CN104651507 B CN 104651507B CN 201510073931 A CN201510073931 A CN 201510073931A CN 104651507 B CN104651507 B CN 104651507B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
pcr
bollworm
tobacco budworm
oriental tobacco
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510073931.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104651507A (zh
Inventor
崔金杰
李兆群
张帅
雒珺瑜
吕丽敏
王春义
李春花
朱香镇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201510073931.9A priority Critical patent/CN104651507B/zh
Publication of CN104651507A publication Critical patent/CN104651507A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104651507B publication Critical patent/CN104651507B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物与方法。所述特异性引物具体如下：Primer‑F：5’‑AACACCAATTAAAACTCCCACAATT‑3’；Primer‑R：5’‑TGTGAGCCAGGTTGGTTTCTAT‑3’。所述方法以待测样本的基因组DNA为模板，利用所述特异性引物进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，根据产物核苷酸序列的155bp‑158bp位置是否存在TTAT碱基序列，判断样本为棉铃虫或烟青虫。

Description

用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物与方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物与方法。
背景技术
棉铃虫与烟青虫是我国农作物上的重要害虫。他们同属于鳞翅目、夜蛾科、铃夜蛾属，亲缘关系极近。两者具有相似的形态和取食习性，它们之间有许多相同的寄主植物。例如它们均可以危害茄科植物。生产上极容易混淆，干扰农田害虫预测预报的准确性。
据研究发现，棉铃虫与烟青虫卵、幼虫及蛹的相似性达到人类肉眼几乎无法辨别的程度，只有在它们成虫期可以根据翅的颜色和花纹来区别。由于棉铃虫与烟青虫极近的亲缘关系，它们经常被科学家用于探究昆虫进化及物种形成的原因。然而如何去区分棉铃虫与烟青虫是一直困扰昆虫学家的难题。因此，开发一种快速准确棉铃虫与烟青虫的鉴定方法对生产和科研都有非常重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物与方法。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物，所述特异性引物具体如下：
Primer-F：5’-AACACCAATTAAAACTCCCACAATT-3’；
Primer-R：5’-TGTGAGCCAGGTTGGTTTCTAT-3’。
本发明还提供了区分棉铃虫和烟青虫的方法，所述方法以待测样本的基因组DNA为模板，利用所述特异性引物进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，根据产物核苷酸序列的155bp-158bp位置是否存在TTAT碱基序列，判断样本为棉铃虫或烟青虫。
进一步地，所述PCR反应体系为：
无菌水 28.75μL
10×PCR反应缓冲液 5μL
25mmol/L氯化镁 5μL
2.5mmol/L dNTP 4μL
10μmol/L Primer-F 2.5μL
10μmol/L Primer-R 2.5μL
5u/μL Taq酶 0.25μL
25mg/L DNA模板 2.0μL
总体积 50μL。
进一步地，所述PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸7min。
更进一步地，所述方法具体包括以下步骤：
1)合成特异性引物；
2)采用动物组织细胞提取待测样本的基因组DNA；
采用动物组织细胞提取基因组DNA的方法为本领域常规方法；
3)在PCR反应管中加入反应体系，混匀；
4)将PCR反应管放入台式离心机中离心10s后插入PCR仪中；
5)运行PCR反应；
6)反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测；
7)以无菌水作为空白对照PCR反应体系的模板；
8)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；
9)电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于胶成像仪上成像，根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小；
10)PCR产物交予生工生物工程(上海)股份有限公司公司测序；
11)根据产物核苷酸序列的155bp-158bp位置是否存在TTAT碱基序列，判断样本为棉铃虫或烟青虫。
其中，所述步骤8)具体为：按15g/L的浓度称取琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液；按每100mL琼脂糖溶液中加入5μL EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板；取5μL PCR产物与3μL加样缓冲液混合后加入点样孔中，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳。
本发明在保证PCR产物长度在一个测序反应内(即800bp)的情况下，共设计了9组引物(见表1)，通过按照上述实验方法，对棉铃虫和烟青虫的基因组DNA进行PCR验证和筛选，最后得到扩增效率较高，特异性较高的组合7引物(电泳结果见图1)。
表1设计引物组合
本发明还提供了含有前述特异性引物的试剂盒。
本发明的有益效果在于：
1.操作简单。本发明使用的DNA提取及PCR杂交技术是传统的分子生物学技术，技术成熟，检测灵敏度高。
2.应用广泛。可以用来鉴定任意时期和虫态的棉铃虫和烟青虫。
3.准确性高。根据DNA序列的不同来区分棉铃虫与烟青虫，可以达到100％的准确率。
附图说明
图1为本发明设计的9组引物对棉铃虫和烟青虫基因组DNA的扩增结果。
图2为本发明实施例1中测序结果比对图。
图3为本发明实施例2中测序结果比对图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1室内人工饲养的烟青虫与棉铃虫的鉴定。
1)合成以下引物：
Primer-F：5’-AACACCAATTAAAACTCCCACAATT-3’
Primer-R：5’-TGTGAGCCAGGTTGGTTTCTAT-3’
2)分别取来自不同家系的棉铃虫和烟青虫幼虫各15头。
3)采用天根的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(货号：DP-304-03)，根据试剂盒说明书提取受试虫的基因组DNA.
4)PCR扩增，反应体系如下：
反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸7min。
5)反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测。
6)以无菌水作为空白对照PCR反应体系的模板。
7)按15g/L的浓度称取琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。按每100mL琼脂糖溶液中加入5μL EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取5μL PCR产物与3μL加样缓冲液混合后加入点样孔中，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳。
8)PCR产物交予上海生工测序。
9)把测序结果与目的DNA序列(烟青虫序列：Seq ID No.1，棉铃虫序列：Seq ID No.2)进行比对。鉴定结果(图1)与已知的结果一致，说明此方法准确率达到100％。
实施例2田间采集的棉铃虫与烟青虫的
具体实验方法如下：
1)合成以下引物：
Primer-F：5’-AACACCAATTAAAACTCCCACAATT-3’
Primer-R：5’-TGTGAGCCAGGTTGGTTTCTAT-3’
2)分别在棉花及辣椒田中采集昆虫(未知是棉铃虫或烟青虫)15条。
3)采用天根的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(货号：DP-304-03)，根据试剂盒说明书提取试虫的基因组DNA.
4)PCR扩增，反应体系如下：
反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸7min。
5)反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测。
6)以无菌水作为空白对照PCR反应体系的模板。
7)按15g/L的浓度称取琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。按每100mL琼脂糖溶液中加入5μL EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取5μL PCR产物与3μL加样缓冲液混合后加入点样孔中，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳。
8)PCR产物交予上海生工测序。
9)把测序结果与目的DNA序列(烟青虫序列：Seq ID No.1，棉铃虫序列：Seq ID No.2)进行比对。结果显示(图2)，这30头昆虫中18头为棉铃虫，12头为烟青虫。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物如下所示：
Primer-F：5’-AACACCAATTAAAACTCCCACAATT-3’；
Primer-R：5’-TGTGAGCCAGGTTGGTTTCTAT-3’。
2.区分棉铃虫和烟青虫的方法，其特征在于，所述方法以待测样本的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述特异性引物进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，根据产物核苷酸序列的155bp-158bp位置是否存在TTAT碱基序列，判断样本为棉铃虫或烟青虫。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：
无菌水 28.75μL
10×PCR反应缓冲液 5μL
25mmol/L氯化镁 5μL
2.5mmol/L dNTP 4μL
10μmol/L Primer-F 2.5μL
10μmol/L Primer-R 2.5μL
5u/μL Taq酶 0.25μL
25mg/L DNA模板 2.0μL
总体积 50μL。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸7min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
1)合成特异性引物；
2)采用动物组织细胞提取待测样本的基因组DNA；
3)在PCR反应管中加入反应体系，混匀；
4)将PCR反应管放入台式离心机中离心10s后插入PCR仪中；
5)运行PCR反应；
6)反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测；
7)以无菌水作为空白对照PCR反应体系的模板；
8)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；
9)电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于胶成像仪上成像，根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小；
10)PCR产物测序；
11)根据产物核苷酸序列的155bp-158bp位置是否存在TTAT碱基序列，判断样本为棉铃虫或烟青虫。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤8)具体为按15g/L的浓度称取琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液；按每100mL琼脂糖溶液中加入5μL EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板；取5μL PCR产物与3μL加样缓冲液混合后加入点样孔中，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳。
7.含有权利要求1所述特异性引物的试剂盒。
CN201510073931.9A 2015-02-10 2015-02-10 用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物与方法 Expired - Fee Related CN104651507B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510073931.9A CN104651507B (zh) 2015-02-10 2015-02-10 用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物与方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510073931.9A CN104651507B (zh) 2015-02-10 2015-02-10 用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物与方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104651507A CN104651507A (zh) 2015-05-27
CN104651507B true CN104651507B (zh) 2016-08-24

Family

ID=53243146

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510073931.9A Expired - Fee Related CN104651507B (zh) 2015-02-10 2015-02-10 用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物与方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104651507B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234837B (zh) * 2021-06-16 2024-02-20 湖南科技大学 基于陆生环境dna检测棉铃虫的试剂盒及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6239077B1 (en) * 1998-05-01 2001-05-29 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Aminoacetonitrile derivative agricultural and horticultural insecticide containing the same and use thereof
CN102134599B (zh) * 2010-12-28 2013-04-03 红云红河烟草(集团)有限责任公司 一种快速鉴别棉铃虫和烟青虫的分子生物学方法
CN102373292A (zh) * 2011-12-19 2012-03-14 云南师范大学 一种快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104651507A (zh) 2015-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Spagnolo et al. Detection of Botryosphaeriaceae species within grapevine woody tissues by nested PCR, with particular emphasis on the Neofusicoccum parvum/N. ribis complex
CN104498599B (zh) 一组微孢子虫分子通用检测引物及其试剂盒
CN103060318A (zh) 基于谷子全基因组序列开发的ssr核心引物组及其应用
CN106048056B (zh) 一种小麦种子休眠持续性显著相关的snp标记及其caps标记和应用
CN104962643B (zh) 白背飞虱不同组织部位稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用
CN108220475A (zh) 基于rpa技术的樱桃灰霉病菌检测方法及检测专用引物
CN103409527A (zh) 利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法
CN104232785B (zh) 梨小食心虫荧光pcr检测方法与应用
CN107385108B (zh) 莲藕中一种新马铃薯y病毒科病毒的检测试剂盒及其检测方法
JP2010046038A (ja) イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー
CN107022615B (zh) 用于检测松材线虫的lamp引物组、试剂盒及检测方法
CN104651507B (zh) 用于区分棉铃虫和烟青虫的特异性引物与方法
CN113774065A (zh) 美国白蛾不同性别成虫荧光定量内参基因及其引物和应用
CN104988240B (zh) 利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状的方法
CN106978493A (zh) 一种快速鉴定茶尺蠖和灰茶尺蠖的引物及其鉴定方法
CN104498593B (zh) 鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及其试剂盒
CN103409528A (zh) 利用蜜蜂hex71基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法
CN106868147B (zh) 一种香蕉叶斑病菌分子检测引物及其快速检测方法
CN104946657B (zh) 白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用
CN110734985B (zh) 一种鉴别棉蚜茧蜂与豆柄瘤蚜茧蜂的方法
CN105063202B (zh) 利用SNP标记rs4208349鉴别蜂群王浆高产性状的方法
CN102605085B (zh) 美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法
CN105567827A (zh) 一种同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的pcr方法
CN104694627B (zh) 用于鉴别甘薯染色体的两个dna重复序列及fish鉴别方法
CN103421901B (zh) 利用蜜蜂SsRbeta基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160824

Termination date: 20170210

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee