CN113234837B - 基于陆生环境dna检测棉铃虫的试剂盒及其应用 - Google Patents

基于陆生环境dna检测棉铃虫的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过环境DNA提取及定量PCR来检测样本中是否存在过棉铃虫的试剂盒及其应用方法，包括：聚碳酸酯蚀滤膜、碱性溶解液、定量PCR反应液、棉铃虫特异性引物对和Taqman荧光探针。使用时，先清洗待测果蔬样品，以滤膜富集洗液中的环境DNA并用碱性溶解液回收；环境DNA经过柱纯化后，作为模板加入定量PCR反应液中，并加入引物对和探针，与不加模板的对照组平行做定量PCR反应；通过比较待测样本与对照组在反应中Cq值的差异，判断样本中棉铃虫DNA的有无及相对含量。本发明可在尚未观察到棉铃虫虫体时即检测出果蔬中是否存在过该害虫，提升了检测能力和效率。

Description

基于陆生环境DNA检测棉铃虫的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种基于陆生环境DNA检测棉铃虫的试剂盒及其应用。
背景技术
目前对陆生害虫的检测技术多采用定性检测，需要获得虫体本身，且存在准确度不高，测定结果易受干扰等缺点，本发明中，我们通过定量检测害虫残留在环境中的DNA，进而可以获得更为准确的结果。由于每种生物的DNA中都会有各自存在的特异性序列，我们只需找到每种害虫独有的特异性序列，并按此序列制得荧光探针。令特异性荧光探针与我们所获得的环境DNA相结合并进行扩增，利用qPCR定量检测，便可根据具体荧光颜色不同和强弱差异初步判断害虫类别，再根据相应害虫的标准曲线进行计算，得出其环境DNA的含量，从而估计出害虫种类和危害规模。综上所述，定量检测不仅操作简单、灵敏度高，而且其结果还十分准确。
当前大多数相关发明都是基于害虫图像识别的自动检测技术，通过采集害虫标本建立物理特征性数据库（音频、图像等）、监控生境获取害虫物理特征，从而对害虫进行分析识别，最终获得害虫的种属和分布信息。如中国专利申请CN201820022929.8：一种害虫检测装置，发明人构建多种物理性传感器，使传感器的输出端与控制器的输入端相接，控制器再与网络通信模块相连，通过各部件的配合，能采集大量经过传感器的害虫的信息。此害虫检测装置可以采集大量现场的图像数据、害虫经过传感器的数量以及害虫检测附近的声音，便于研究人员通过图像数据、害虫经过传感器的数量分析害虫的种类和规模，因而表现出高效、灵敏的特点。但此项装置在害虫检测检疫的准确度方面，由于害虫所处复杂的背景、众多的干扰因素、装置的多重标准以及研究人员判断与分析的误差，使得检测的结果并不十分客观，因此准确度上还有待提高。此类物理检测装置和检测方法存在着相似的优点和不足——即灵敏度高，但特异性差。
近年来，兴起的基于昆虫遗留在环境中的DNA（eDNA）的定量检测技术实现了物种检测中的高特异性和高效性的统一。但由于各类昆虫eDNA的释放量和富集难易程度不一样，目前大多发明应用在水生生境中，例如：
CN201610662966.0中华鲟环境DNA检测PCR扩增引物及其检测方法和应用
CN201920125138.2一种收集海水中环境DNA的装置
CN201510005835.0用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法
CN201510640527.5基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法
等等，都是针对水生生境的环境DNA;
另有极少数专利与陆生生境的环境DNA相关，如:
CN200710066211.5一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法
CN201910525589.X一种检测环境微生物砷氧化基因物种组成的PCR引物及方法
但这些专利都无一例外地是以微生物为检测对象，鲜有基于环境DNA技术的害虫检测方面的发明。相比水体的环境DNA，陆生生物的环境DNA较难获取，陆生害虫的定量检测仅见Valetine等人2018年发表的关于茶翅椿的报道。陆生害虫的环境DNA不仅难获取，而且极易分解，是以基于环境DNA检测害虫的技术迟迟未发展。且之前所发展技术均是检测单一物种，因环境DNA难以提取和分离，而本发明则需克服并改进现有技术，实现多物种检测。
现有的陆生农业害虫检测技术多需要针对虫体本身进行判断，识别监测过程中难以排除外界诸多干扰因素的影响，使技术人员不能做出十分客观的判断。且单次检测对象单一、时效性差、耗时耗力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于陆生环境DNA检测棉铃虫的试剂盒及其应用。
本发明采用的技术方案：一种基于陆生环境DNA检测棉铃虫的试剂盒，包括根据目标害虫棉铃虫基因设计的引物对和Taqman荧光探针；
所述棉铃虫的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；
所述引物对包括MLC2-F和MLC2-R，所述MLC2-F的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述MLC2-R的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；
所述Taqman荧光探针的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
所述SEQ ID NO.1具体为
5-CCATTCCAACAGCGCTCATTCTCCTCAGCAGCGAAGTCAGGTTTGTCACACACTCGATCCGCTAGTCCAGCAAAGAGTTTCTTATTCGACGCTAGGGTGGCTGCAAATAG-3
所述SEQ ID NO.2具体为：CCATTCCAACAGCGCTCATT；
所述SEQ ID NO.3具体为：CTATTTGCAGCCACCCTAGC；
所述SEQ ID NO.4具体为：AGCGAAGTCAGGTTTGTCACACACTCGAT。
所述试剂盒还包括缓冲试剂。
一种所述的试剂盒在陆生环境中检测棉铃虫中的应用。
所述应用的方法为：
S1、取果蔬样本在去离子水中震荡漂洗得到漂洗液；
S2、用蠕动泵和聚碳酸酯蚀滤膜过滤所述漂洗液，使eDNA富集在所述聚碳酸酯蚀滤膜上；
S3、收集所述eDNA，用权利要求1或3中所述的试剂盒进行qPCR反应，根据具体荧光颜色定性判断是否环境中是否含有棉铃虫。
所述应用还包括定量检测方法，具体为：
S4、提取棉铃虫的基因组DNA，将所述基因组DNA进行梯度稀释；
S5、用权利要求1或3中所述的试剂盒进行qPCR反应，根据具体荧光颜色强弱与基因组DNA的浓度建立标准曲线；
S6、将待测eDNA的Cq值代入所述标准曲线中进行计算，获得eDNA含量。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）本发明提供了一种基于陆生环境DNA检测棉铃虫的试剂盒，该试剂盒内含棉铃虫的培养体系、特异性荧光探针等成分，从果蔬中提取环境DNA后可直接用该试剂盒中配置成检测环境DNA的所需体系。这种试剂盒已经将棉铃虫的特异性DNA片段截取并制成探针，可以更快更准确地检测出所提取的环境DNA中有无棉铃虫的DNA以及DNA含量，进而确定果蔬所在区域的棉铃虫的种群密度。
（2）本发明提供了一种基于陆生环境DNA检测棉铃虫的试剂盒在检测陆生环境中棉铃虫的应用，本申请基于eDNA的定量检测方法扩展应用于陆生农业害虫的检测中，并在一次反应中同时定量检测多种害虫。相较目前该项技术仅能普遍适用于水体环境，我们的发明能优化其检测方法，拓展该项技术的应用范围。此外，我们的发明还可辐射应用于生态学种群分析及入侵害虫的海关检验检疫等多个方面。此项发明将基于eDNA的定量检测方法应用在了陆生果蔬害虫中，扩展了应用范围，同时与目前的害虫检测发明相比，特异性更高。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1 棉铃虫DNA标准曲线拟合结果图。
图2从果蔬样品中提取环境eDNA并检测棉铃虫虫害的过程示意图。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
一种基于陆生环境DNA检测棉铃虫的试剂盒，包括根据目标害虫棉铃虫基因组特异性区段设计的引物对和Taqman荧光探针；
特异性DNA序列如SEQ ID NO.1所示，具体为5-CCATTCCAACAGCGCTCATTCTCCTCAGCAGCGAAGTCAGGTTTGTCACACACTCGATCCGCTAGTCCAGCAAAGAGTTTCTTATTCGACGCTAGGGTGGCTGCAAATAG-3
引物对包括MLC2-F和MLC2-R。
MLC2-F的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：CCATTCCAACAGCGCTCATT。
MLC2-R的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；具体为：CTATTTGCAGCCACCCTAGC。
Taqman荧光探针的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：AGCGAAGTCAGGTTTGTCACACACTCGAT。
实施例2
一种实施例1的试剂盒在检测陆生环境中棉铃虫含量的方法，具体为：
（1）建立棉铃虫的标准曲线：
1.1、用TSINGKE动物基因组DNA试剂盒提取羽化两天后的棉铃虫成虫的基因组DNA，50μL，检测起始浓度为426.6 ng/μL。
1.2、利用去离子水将棉铃虫的基因组DNA按照10倍梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4倍液。将原液与上述稀释液作为标准样品模版进行Real-time qPCR反应。进行两组生物学重复。反应体系和反应程序：反应液总体积为20微升，其中Fast qPCR Mix反应液10微升、上下游引物各0.8微升、Taqman荧光探针0.5微升、DNA模板1.0微升以及去离子水7.9微升。以上成分混合，使用离心机使其混合均匀，在95摄氏度或96摄氏度时聚合酶激活，需要时长300s或600s，循环次数为1次。变性温度在96摄氏度，需要时长为10.0s，循环次数为40到60次之间。退火时温度为60摄氏度，时长为60s左右，循环次数同变性。
1.3、在两组生物学重复组中得到了各标样组Cq值接近的两条标准曲线。将每组标样对应RFU值取算术平均后拟合出棉铃虫DNA标准曲线（见图1）。
标准曲线方程为：Cq=-3.2125LSQ +32.034，其中LSQ为稀释浓度相对对数值，无单位，Cq值为循环阈值其含义为每个反应管中达到设定最佳阈值时的扩增轮数。拟合优度（R2）=0.9963。
（2）在培养箱中将棉铃虫（Helicoverpa armigera）与玉米混合培养，模拟自然环境。将培养时长24-48 h的玉米摘下，在去离子水中震荡漂洗1~3h得到漂洗液。
（3）提取eDNA (如图2所示)：
3.1、用蠕动泵(流量参数为500ml/h)和聚碳酸酯蚀滤膜（Φ=10µm, 滤膜安装在蠕动泵的泵头上）的组合来过滤漂洗所得液，反复过滤2~3次，将eDNA富集在滤膜上。
3.2、将滤膜剪碎于EP管中，加入50μL碱性溶解试剂（NaOH 25mM、EDTA 0.2mM、pH=12.0）中，95℃恒温水浴锅放置一小时。。
3.3、吸取全部上清液转移至新的EP管中（记录体积），用DNA凝胶回收试剂盒(北京擎科生物有限公司，或其他公司类似产品)对eDNA进行纯化处理得到纯化的eDNA。
（4）收集所述eDNA，用实施例1的试剂盒进行qPCR反应，以不加模板的反应体系为对照。根据定量PCR仪检测得到的样本与对照组扩增曲线Cq值差异判断是否环境中是否含有棉铃虫，若对照组扩增曲线Cq值-eDNA样本扩增曲线Cq值>1，则判断环境中存在棉铃虫。
（5）根据荧光强度判定棉铃虫的含量：读取到待测eDNA的Cq值分别为Cq1=27；Cq2=29。将其代入标准曲线Cq=-3.2125LSQ +32.034，可得：C1=2.51ng/μL；C2=1.48ng/μL；C3=0.76ng/μL。
这说明在上述培养条件下，从果蔬环境中可有效提取到棉铃虫残留DNA，一只棉铃虫所产生的eDNA总量相当于0.02只棉铃虫成虫的基因组DNA量，表明该方法可有效检测棉铃虫在玉米表面活动过程中残留的微量DNA信息。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南科技大学
<120> 基于陆生环境DNA检测的棉铃虫的试剂盒及其应用
<141> 2021-06-16
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 110
<212> DNA
<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)
<400> 2
ccattccaac agcgctcatt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)
<400> 3
ctatttgcag ccaccctagc 20
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)
<400> 4
agcgaagtca ggtttgtcac acactcgat 29

Claims (3)

1.一种根据目标害虫棉铃虫基因设计的引物对和Taqman荧光探针在制备基于陆生环境DNA检测棉铃虫的试剂盒中的应用，其特征在于，
所述棉铃虫的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；
所述引物对的DNA序列如SEQ ID NO.2-3所示；
所述Taqman荧光探针的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；
所述SEQ ID NO.1具体为5-CCATTCCAACAGCGCTCATTCTCCTCAGCAGCGAAGTCAGGTTTGTCACACACTCGATCCGCTAGTCCAGCAAAGAGTTTCTTATTCGACGCTAGGGTGGCTGCAAATAG-3
所述SEQ ID NO.2具体为：CCATTCCAACAGCGCTCATT；
所述SEQ ID NO.3具体为：CTATTTGCAGCCACCCTAGC；
所述SEQ ID NO.4具体为：AGCGAAGTCAGGTTTGTCACACACTCGAT。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲试剂。
3.权利要求1所述的试剂盒在陆生环境中检测棉铃虫的应用，其特征在于，所述应用的方法为：
S1、取果蔬样本在去离子水中震荡漂洗得到漂洗液；
S2、用蠕动泵和聚碳酸酯蚀滤膜过滤所述漂洗液，使eDNA富集在所述聚碳酸酯蚀滤膜上；
S3、收集所述eDNA，用所述的试剂盒进行qPCR反应，根据定量PCR仪检测得到的样本与对照组扩增曲线Cq值差异判断环境中是否含有棉铃虫，若对照组扩增曲线Cq值-eDNA样本扩增曲线Cq值>1，则判断环境中存在棉铃虫。
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棉铃虫性染色体两种分子标记的克隆及序列分析;牛宝龙;翁宏飚;何丽华;沈卫锋;孟智启;;昆虫学报;第50卷(第07期);第649-654页 *

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