CN116694778A - 基于陆生环境dna检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用 - Google Patents
基于陆生环境dna检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116694778A CN116694778A CN202310693320.9A CN202310693320A CN116694778A CN 116694778 A CN116694778 A CN 116694778A CN 202310693320 A CN202310693320 A CN 202310693320A CN 116694778 A CN116694778 A CN 116694778A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- kit
- asian corn
- yzymm
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000346285 Ostrinia furnacalis Species 0.000 title claims abstract description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims abstract description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 15
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 10
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005530 etching Methods 0.000 claims description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000883303 Acipenser sinensis Species 0.000 description 1
- 241001391944 Commicarpus scandens Species 0.000 description 1
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒，包括根据目标害虫亚洲玉米螟基因组中特异性DNA设计的引物对和Taqman荧光探针；所述亚洲玉米螟基因组特异性DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物对包括YZYMM‑F和YZYMM‑R，所述YZYMM‑F的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述YZYMM‑R的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；所述Taqman荧光探针的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。所述试剂盒还包括聚碳酸酯蚀滤膜(Φ＝10μm)和缓冲试剂。本发明能快速、准确地检测出某种害虫，对于物种的特异性较高，且检测的结果比较精准，并在一次反应中同时定量检测多种害虫。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用。
背景技术
亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis属鳞翅目螟蛾科，是一种杂食性害虫，主要取食玉米，严重影响玉米的产量和质量。危害玉米植株地上的各个部位，使受害部分丧失功能，降低籽粒产量。在玉米心叶期，初孵幼虫大多爬入心叶内，群聚取食心叶叶肉，2、3龄幼虫大多爬入心叶内潜藏为害；此后，陆续蛀入茎秆继续为害，蛀孔口常堆有大量粪渣；雄穗被蛀，常易折断，影响授粉；苞叶、花丝被蛀食，会造成缺粒和秕粒；茎秆、穗柄、穗轴被蛀食后，形成隧道，破坏植株内水分、养分的输送，使茎秆倒折率增加，籽粒产量下降。初孵幼虫可吐丝下垂，随风漂移扩散到邻近植株上。对亚洲玉米螟的有无进行定性检测，并对其密度进行定量测定，对控制其虫害及防治具有一定的指导作用。通过对害虫生物残留物DNA的定量测定，可以得到更精确的分析结果。因为每个物种的DNA都具有特定的基因序列，所以我们只要根据这些特异性的基因序列，就可以制得此序列的荧光探针。将特定的荧光探针与我们得到的环境DNA进行融合并扩增，然后用qPCR技术进行定量分析，可以通过荧光颜色和荧光强度的差别来判断害虫的种类，然后通过对相应害虫曲线的进行分析，得到它们的环境DNA含量，以此来判断污染农作物的害虫种类和估算虫害破坏的规模。以此为依据来减少因害虫而带来的经济损失，为来年防治害虫提供了重要的参考。
然而当前大多数的发明都是围绕害虫图像自动检测识别的技术，通过采集害虫标本建立物理特征性数据库(音频、图像等)、监控生境获取害虫物理特征，从而对害虫进行分析识别，最终获得害虫的种属和分布信息。如中国专利申请CN201820022929.8：一种害虫检测装置，发明人构建多种物理性传感器，使传感器的输出端与控制器的输入端相接，控制器再与网络通信模块相连，通过各部件的配合，能采集大量经过传感器的害虫的信息。此害虫检测装置可以采集大量现场的图像数据、害虫经过传感器的数量以及害虫检测附近的声音，便于研究人员通过图像数据、害虫经过传感器的数量分析害虫的种类和规模，因而表现出高效、灵敏的特点。但此项装置在害虫检测检疫的准确度方面，由于害虫所处复杂的背景、众多的干扰因素、装置的多重标准以及研究人员判断与分析的误差，使得检测的结果并不十分客观，因此准确度上还有待提高。此类物理检测装置和检测方法存在着相似的优点和不足——即灵敏度高，但特异性差。
近年来，兴起的基于昆虫遗留在环境中的DNA(eDNA)的定量检测技术实现了物种检测中的高特异性和高效性的统一。但由于各类昆虫eDNA的释放量和富集难易程度不一样，目前大多发明应用在水生生境中，例如：N201610662966.0中华鲟环境DNA检测PCR扩增引物及其检测方法和应用；CN201920125138.2一种收集海水中环境DNA的装置；CN201510005835.0用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法；CN201510640527.5基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法等等，都是针对水生生境的环境DNA。
另有极少数专利与陆生生境的环境DNA相关，如CN200710066211.5一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法；CN201910525589.X一种检测环境微生物砷氧化基因物种组成的PCR引物及方法。但这些专利都无一例外地是以微生物为检测对象，鲜有基于环境DNA技术的害虫检测方面的发明。陆生害虫的定量检测仅见极少数报道(如Valetine等人2018年发表的关于茶翅椿的研究)。与水体的环境DNA相比，陆生生物的环境DNA比较难获取。陆生害虫分布区域广泛且种类繁多，大多体积较小，尤其是亚洲玉米螟一般会分布在玉米心叶的位置，正常活动所遗留在环境中的DNA量甚微，不容易集中到滤膜上进行采样，检测的敏感性低。且环境DNA难以提取和分离，采集区域的DNA并不一定是研究区域的生物DNA，容易出现假阳性与假阴性，还易发生交叉污染，而本发明则需克服并改进现有技术，尽量提高检测的敏感性，达到早期预防虫害的目的。
现有的陆生农业害虫检测技术多需要针对虫体本身进行判断，识别监测过程中难以排除外界诸多干扰因素的影响，使技术人员不能做出十分客观的判断。且单次检测对象单一、时效性差、耗时耗力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用。
为达到以上目标，本发明所采用的技术方案是：一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒，包括根据目标害虫亚洲玉米螟基因组中特异性DNA设计的引物对和Taqman荧光探针；所述亚洲玉米螟基因组特异性DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物对包括YZYMM-F和YZYMM-R，所述YZYMM-F的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述YZYMM-R的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；所述Taqman荧光探针的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；所述试剂盒还包括聚碳酸酯蚀滤膜(Φ＝10μm)和缓冲试剂。
所述的陆生环境DNA检测试剂盒在陆生环境检测亚洲玉米螟的应用。
其应用方法如下：
S1、取玉米心叶样本在去离子水中震荡漂洗得到漂洗液；
S2、用卡默尔蠕动泵和直径47mm、孔径10um的Millipore聚碳酸酯蚀滤膜过滤所述漂洗液，使eDNA富集在所述聚碳酸酯蚀滤膜上；
S3、收集所述eDNA，用权利要求1或2中所述的试剂盒进行qPCR反应，根据扩增反应曲线中的Cq值来判断环境中是否含有亚洲玉米螟。当实验组Cq值大于NTC组Cq值，说明环境中含有亚洲玉米螟。
所述的陆生环境DNA检测试剂盒在陆生环境检测亚洲玉米螟的应用还包括定量检测方法，方法如下：
S4、提取亚洲玉米螟的基因组DNA，将所述基因组DNA进行梯度稀释；
S5、用权利要求1或2中所述的试剂盒进行qPCR反应，用权利要求1或2中所述的试剂盒进行qPCR反应，按基因组DNA浓度和DNA反应扩增曲线Cq值建立标准曲线；
S6、将待测eDNA的Cq值代入所述标准曲线中进行计算，获得eDNA含量。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明是一种利用陆地环境DNA来检测亚洲玉米螟的试剂盒，它能快速、准确地检测出某种害虫，对于物种的特异性较高，且检测的结果比较精准。相对于常规的形态学的检测方法，在分子生物学层面进行检测更具有可信度和通用性；而且该方法仅需采集样品进行eDNA富集，之后进行qPCR反应，比传统的检测方式节省了很多时间。该试剂盒在外出检测时方便携带，检测过程简便，因此操作方法也好学易懂，同时，由于操作人员本身的原因，以及缺乏形态学的经验，导致测量结果出现偏差的可能性非常小。
(2)本发明提供了一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒在检测陆生环境中亚洲玉米螟的应用，本申请基于eDNA的定量检测方法扩展应用于陆生农业害虫的检测中，并在一次反应中同时定量检测多种害虫。相较目前该项技术仅能普遍适用于水体环境，我们的发明能优化其检测方法，拓展该项技术的应用范围。此外，我们的发明还可辐射应用于生态学种群分析及入侵害虫的海关检验检疫等多个方面。此项发明将基于eDNA的定量检测方法应用在了陆生果蔬害虫中，扩展了应用范围，同时与目前的害虫检测发明相比，特异性更高。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为亚洲玉米螟DNA标准曲线拟合结果图。
图2为从玉米叶样品中提取环境eDNA并检测菜青虫虫害的过程示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒，包括根据目标害虫基因组DNA设计的引物对和Taqman荧光探针；
选取的亚洲玉米螟基因组DNA序列如SEQ ID NO.1所示。该序列是从亚洲玉米螟基因组中提取的一段DNA片段，此片段具有高度的物种特异性，具体序列为：GTGGACCAACGATCAGCCGGACTAGGATGCGCGCCGTGATATACTTTATCGACGTCAAAATGTATGGGCAAAATCGATAAAACGGCGTGATAACCGCTTATCGCGGCGCGCATCCTAGGCCCTCTGGTGTAGGCCGTACGAAGCATTTAGATGCAGGCAG
引物对包括YZYMM-F和YZYMM-R，
YZYMM-F的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
ACCAACGATCAGCCGGACTA。
YZYMM-R的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；具体为：
AAATGCTTCGTACGGCCTACAC。
Taqman荧光探针的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
CGCCGTGATATACTTTATCGACGTCAAAATG。
实施例2
一种实施例1的试剂盒在检测陆生环境中亚洲玉米螟含量的方法，具体为：
1.建立亚洲玉米螟的标准曲线：
1.1、用TSINGKE动物基因组DNA试剂盒提取玉米螟2龄幼虫的基因组DNA，50μL，通过紫外分光光度计测量其浓度为199.7ng/μL。
1.2、利用去离子水将玉米螟的基因组DNA按照2倍梯度稀释成2-1、2-2、2-3、2-4倍液。将原液与上述稀释液作为标准样品模版进行Real-time qPCR反应。具体体系与程序如下，进行两组生物学重复。
反应体系：
反应程序：
1.3、在两组生物学重复组中得到了各标样组Cq值接近的两条标准曲线。将每组标样对应RFU值取算术平均后拟合出亚洲玉米螟DNA标准曲线(见附图)。标准曲线方程为：Cq＝-0.839×LSQ+31.766，其中LSQ为稀释浓度相对对数值(为一个对数值，没有单位)，Cq值为循环阈值其含义为每个反应管中达到设定最佳阈值时的扩增轮数。拟合优度(R2)＝0.8339。
2.在培养箱中将亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)与玉米叶混合培养，模拟自然环境，培养空间密度为每只/192cm3。将培养时间72h的玉米摘下，在去离子水中震荡漂洗1～3h得到漂洗液。
3.提取eDNA：
3.1、将漂洗液用蠕动泵与滤器组合进行过滤。蠕动泵流速调整在10-500ml/min)，滤器中装有聚碳酸酯蚀滤膜(Φ＝10μm)，反复过滤2～3次，将eDNA富集在滤膜上。
3.2、将滤膜剪碎于EP管中，加入50μL碱性溶解试剂(NaOH 25mM、EDTA 0.2mM、pH＝12.0)中，95℃恒温水浴锅放置一小时。
3.3、吸取全部上清液转移至新的EP管中(记录体积)，用DNA凝胶回收试剂盒(北京擎科生物有限公司，或其他公司类似产品)对eDNA进行纯化处理得到纯化的eDNA。
(4)收集所述eDNA，用实施例1的试剂盒进行qPCR反应，根据实验组Cq值与NTC组Cq值的大小关系判断环境中是否含有亚洲玉米螟。当实验组Cq值大于NTC组Cq值，说明环境中含有亚洲玉米螟。
(5)根据扩增曲线Cq值判定亚洲玉米螟的含量：读取到待测eDNA的Cq值分别为Cq1＝30；Cq2＝31。将其代入标准曲线Cq＝-0.839×LSQ+31.766，可得：C1＝1.571ng/μL；C2＝24.455ng/μL。
这说明在上述培养条件下，从上述步骤2中所述玉米螟密度的培养环境中可有效提取到亚洲玉米螟残留DNA，获取量比从虫体直接提取DNA(从2只虫体直接提取的DNA,浓度为199.7ng/μL)降低约两个数量级，仍可被特异性地定量检测。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (5)
1.一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒，其特征在于，包括根据目标害虫亚洲玉米螟基因组中特异性DNA设计的引物对和Taqman荧光探针；所述亚洲玉米螟基因组特异性DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物对包括YZYMM-F 和 YZYMM-R，所述YZYMM -F的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述YZYMM-R的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；所述Taqman荧光探针的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括聚碳酸酯蚀滤膜(Φ=10µm)和缓冲试剂。
3.根据权利要求1所述的试剂盒在陆生环境检测亚洲玉米螟的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其应用方法如下：
S1、取玉米心叶样本在去离子水中震荡漂洗得到漂洗液；
S2、用卡默尔蠕动泵和直径47mm、孔径10um的Millipore聚碳酸酯蚀滤膜过滤所述漂洗液，使eDNA富集在所述聚碳酸酯蚀滤膜上；
S3、收集所述eDNA，用权利要求1或2中所述的试剂盒进行qPCR反应，
根据扩增反应曲线中的Cq值来判断环境中是否含有亚洲玉米螟。当实验组Cq值大于NTC组Cq值，说明环境中含有亚洲玉米螟。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，还包括定量检测方法，方法如下：
S4、提取亚洲玉米螟的基因组DNA，将所述基因组DNA进行梯度稀释；
S5、用权利要求1或2中所述的试剂盒进行qPCR反应，用权利要求1或2中所述的试剂盒进行qPCR反应，按基因组 DNA浓度和 DNA反应扩增曲线Cq值建立标准曲线；
S6、将待测eDNA的Cq值代入所述标准曲线中进行计算，获得eDNA含量。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310693320.9A CN116694778A (zh) | 2023-06-13 | 2023-06-13 | 基于陆生环境dna检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310693320.9A CN116694778A (zh) | 2023-06-13 | 2023-06-13 | 基于陆生环境dna检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116694778A true CN116694778A (zh) | 2023-09-05 |
Family
ID=87836985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310693320.9A Pending CN116694778A (zh) | 2023-06-13 | 2023-06-13 | 基于陆生环境dna检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116694778A (zh) |
-
2023
- 2023-06-13 CN CN202310693320.9A patent/CN116694778A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tsuji et al. | The detection of aquatic macroorganisms using environmental DNA analysis—A review of methods for collection, extraction, and detection | |
| Beng et al. | Applications of environmental DNA (eDNA) in ecology and conservation: opportunities, challenges and prospects | |
| Chen et al. | Molecular identification of forensically important blow fly species (Diptera: Calliphoridae) in Taiwan | |
| Di Muri et al. | Read counts from environmental DNA (eDNA) metabarcoding reflect fish abundance and biomass in drained ponds | |
| Schabacker et al. | Increased eDNA detection sensitivity using a novel high‐volume water sampling method | |
| Ficetola et al. | Species detection using environmental DNA from water samples | |
| Eble et al. | Marine environmental DNA: Approaches, applications, and opportunities | |
| CN107760795B (zh) | 一种快速检测茶树炭疽病菌的lamp引物及检测方法 | |
| Kestel et al. | Applications of environmental DNA (eDNA) in agricultural systems: Current uses, limitations and future prospects | |
| Rishan et al. | Applications of environmental DNA (eDNA) to detect subterranean and aquatic invasive species: a critical review on the challenges and limitations of eDNA metabarcoding | |
| Tran et al. | Determination of the Pacific oyster Magallana gigas (Crassostrea gigas) diet composition in two aquaculture farms by fecal DNA metabarcoding | |
| Le Port et al. | A Valuable Tool for Ecological Inference and Management of Sharks and Their Relatives | |
| Ito et al. | Use of environmental DNA to survey the distribution of the invasive mussel Limnoperna fortunei in farm ponds | |
| CN116694778A (zh) | 基于陆生环境dna检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用 | |
| de Carvalho et al. | Technical and economic efficiency of methods for extracting genomic DNA from Meloidogyne javanica | |
| CN113234837B (zh) | 基于陆生环境dna检测棉铃虫的试剂盒及其应用 | |
| CN116694777A (zh) | 基于陆生环境dna检测菜青虫的试剂盒及其应用 | |
| CN114277166B (zh) | 一种瓜类细菌性果斑病菌的rpa检测引物、探针及检测方法 | |
| CN113005209B (zh) | 基于陆生环境dna检测橘小实蝇的试剂盒及其应用 | |
| Zhang et al. | Environmental DNA metabarcoding serves as a promising method for aquatic species monitoring and management: A review focused on its workflow, applications, challenges and prospects | |
| CN113151511B (zh) | 基于陆生环境dna检测斑翅果蝇的试剂盒及其应用 | |
| CN104099413A (zh) | 美国白蛾恒温核酸检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN114703313B (zh) | 一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用 | |
| AU2021100290A4 (en) | A new method for monitoring Fenneropenaeus chinensis | |
| CN105861637B (zh) | 用于快速检测食用向日葵杂交种sh338真实性的试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |