CN106666204A - 一种提高免疫功能的72‑100周龄蛋鸡饲料及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于饲料组合物技术领域，具体涉及一种提高免疫功能的72‑100周龄蛋鸡饲料，并涉及该饲料的制备方法。所述蛋鸡饲料主要由以下重量份数的原料制成：谷物53‑60份，豆粕5‑20份，玉米蛋白粉1‑5份，芝麻粕3‑5份，玉米副产品5‑10份，果蔬渣3‑10份，氨基酸0.35‑1.2份，β‑胡萝卜素0.02‑0.06份，叶黄素0.05‑0.1份，复合酶制剂0.05‑0.1份，益生素0.05‑0.1份，蛋白锌0.01‑0.07份，植酸酶0.01‑0.03份。能够显著提高产蛋后期蛋鸡免疫功能和抗病力，蛋鸡后期死亡率降低9.3％，每只鸡产蛋期多产蛋15枚以上，多赚6.6元以上，显著提高鸡场经济效益。

Description

一种提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料及制备方法

技术领域

本发明属于饲料组合物技术领域，具体涉及一种提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，并涉及该饲料的制备方法。

背景技术

蛋鸡的整个产蛋期共分为产蛋高峰前期，产蛋高峰期、产蛋后期三个阶段，营养设计的产蛋后期是指在59周龄以后到72周龄阶段。72周龄阶段会出现蛋变小，品质变差，软壳蛋，沙皮蛋、破损率高等现象。目前伊莎褐、迪卡白等蛋鸡品种培育倾向于延长蛋鸡饲养周期从72周龄达到100周龄，以此来降低前期育雏育成期的培育成本。但是由于目前饲料针对72周龄以前的营养需求，与72周龄以后直到100周龄的蛋鸡生理状况和营养需求不匹配，因此鸡群面临产蛋性能逐渐下降，发病力高，死亡率高等诸多问题。在实际的养殖工作中，养殖户通常对产蛋初期，产蛋高峰期关注较多，对产蛋后期的关注则很少，其实如果提高产蛋后期的管理措施，避免蛋鸡的产蛋周期过早结束，从而达到提高经济效益的目的。申请号为201210126046的中国发明《一种提高蛋鸡免疫力以及受精率的饲料》，提高免疫力的成分主要是采用中药添加剂，此发明筛选了玉米、豆粕、石粉、麦麸、微量元素、复合维生素等原料，该专利旨在诱导蛋鸡机体生成干扰素，有效提高了蛋鸡免疫力，避免了蛋鸡精神沉郁、食欲下降等病理现象的发生，对多重传染病和瘟疫具有良好的抵抗作用。上述公开的专利发表的中草药制剂不全面，况且蛋鸡肠道短，消化时间短，中草药粉碎后直接饲喂起不到最佳效果，另外该专利是种鸡用于产蛋前期的饲料，不适合商品蛋鸡产蛋后期72—110周龄阶段的生理特点与营养需求。申请号为2013105100557.5的中国发明《一种增强蛋鸡免疫功能的复合饲料》主要采用了熟地黄、淮山药、白沙参、百花蛇舌草、桔梗等中药成分，同时使用高粱糠、甜玉米、碎米、米糠饼、大麦芽根、豆粕、花生麸、石粉、螺蛳干粉、毛毛虫粉、鸭血粉、乳清粉、甜瓜籽、苦瓜籽、荠菜、马铃薯皮、食盐、诱食剂等原料；该发明指出能够有效的增加蛋鸡的免疫能力，促进免疫细胞的发育和修复，有效的降低了蛋鸡常见病的发病率。该发明中草药发挥作用需要很长时间，且未经过科学提取与制备，作用效果并不是很理想；专利中螺蛳干粉、毛毛虫粉、鸭血粉等属于动物蛋白，毒素含量难以控制，反而容易提高发病率；马铃薯皮往往含有毒物质龙葵素，也会对蛋鸡健康造成损害；况且该发明不具有专利推广价值，因为成本比现有蛋鸡饲料提高至少3倍，饲料成本占养殖成本的70％，意味着该专利提高养殖成本至少每只鸡40元以上，不适合做为蛋鸡饲料大规模生产。

公开号:105941987A的中国发明《一种蛋鸡产蛋后期饲料的制备方法》公开了蛋鸡产蛋后期饲料的制备方法,称取以下重量份的原料：玉米50-58、麸皮8-12、豆粕20-25、骨粉1-3、植物油0.5-1、贝壳粉1-1.5、食盐0.3-0.6、复合维生素0.1-0.5、微量元素0.3-0.6、γ-氨基丁酸0.2-0.5、中药微生态微胶囊4-6，将玉米、麸皮、豆粕粉碎后，加入余下原料，经高温制粒冷却，制得颗粒饲料。本发明饲料具有增加肠道内有益菌群数量、提高免疫功能、增强鸡体抗应激、抗病力、增加产蛋量、提高合格蛋率等功效，且制备方法简单、使用方便、无残留。该发明关注的仍然是传统意义上的59周龄以后到72周龄阶段的产蛋后期,解决的核心问题的关键技术与本发明不同,主要是从肠道健康一个角度来考虑，而提高免疫功能还需要从抗氧化、抗应激等多个方面进行考虑。

公开号:105145475A的中国发明《蛋鸡产蛋期的无公害饲养方法》公开的产蛋后期饲养管理方式为限制饲喂在高峰期过后2周后，控制日粮能量和蛋白质水平，能量摄入减少5-10％，蛋白质降低12-14％，饲料中，钙的增加3.6-3.9％。与我们拟合理产蛋后期营养，延长产蛋后期的思想是相悖的。

公开号:104222491A的中国发明《一种蛋鸡饲料及其饲养技术》，该发明的目的在于最大限度地延长产蛋鸡的产蛋高峰期，其公开的产蛋后期蛋鸡饲料是由以下重量比的原料组成：玉米：62.41％-65.41％，小麦麸：5.28％-7.28％，大豆粕：13.04％-15.04％，棉籽粕：6.50％-8.50％，菜籽粕：1.73％-2.73％，肉骨粉：1.47％-3.47％，33％畜禽专用甜菜碱：0.08％-0.12％，50％氯化胆碱：0.10％-0.30％，5000单位植酸酶：0.01％-0.03％，复合酶：0.10％-0.30％，复合微量元素：0.10％-0.30％，复合维生素：0.02％-0.04％，杆菌肽锌预混剂：0.03％-0.05％，食盐：0.31％-0.51％，蛋氨酸原料：0.09％-0.12％，石粉：15.5％-16.5％，红辣椒粉：0.1％-0.3％，苜蓿叶粉：3％-5％，松针粉：4％-6％。该发明是延长产蛋高峰期，一般高峰期是22周龄---50周龄产蛋率90％以上，该专利延长的是比50周龄更长一点的90％产蛋率，与本发明72—100周龄的营养设计理念和解决的问题明显不同。

公开号:103875943A的中国发明《一种蛋鸡产蛋后期饲料配方》蛋鸡产蛋后期饲料配方，其特征在于，包括按重量份计的下述组分：玉米50-60、高粱15-20、大麦10-15、油茶饼粕5-10、板栗粉3-6、黄粉虫粉2-4、苹果渣干粉3-5、麦饭石粉1.5-2.5、葵花盘粉2.5-3.5、大豆卵磷脂1-2、改性沸石颗粒1-3、油菜花粉1.5-2.5、鱼粉2-3、扇贝粉1.5-2；所述改性沸石颗粒的制备方法如下：a、取烘干后的沸石粉放入0.05-0.1mol/L的柠檬酸溶液中浸泡2-3h，过滤，滤渣沥干水分后加入0.3-0.5％的番茄籽油和0.2-0.3％的大蒜精油，搅拌均匀，低温干燥，粉碎，待用；b、以100份沸石粉为重量计，取以下重量份的原料：伊利石15-20、膨润土10-15、杜仲1-2、麦芽2-3、白芍1.5-2.5、当归1-2、甜菊叶0.5-1.5、延胡索1-2、决明子2-3、山药2-3、酸枣根1-2、川芎2-3、月见草1-2、山楂根0.5-1；将杜仲、麦芽、白芍、当归、甜菊叶、延胡索、决明子、山药、酸枣根、川芎、月见草、山楂根混合均匀，加4-8倍量水微沸煎煮1-2h，过滤，滤渣再加3-6倍量水微沸煎煮0.5-1h，过滤，合并滤液，然后加入伊利石和膨润土打浆，水浴加热至70-80℃，1500-2000rpm高速研磨20-30min,浓缩，冷冻干燥成粉末；c、将步骤a得到的粉末与步骤b得到的粉末混合均匀，再加入2-3％的魔芋粉和1-2％的沙蒿籽粉，500-1000rpm高速搅拌10-15min，湿法造粒，粒度控制在1-2cm，烘干，即可。并就该饲料进行了饲喂试验，但试验周期仅为70同龄-84周龄。且该发明配方过于复杂，所用原料并非本领域常规原料，成本高、原料稀缺，不具有推广应用价值。

公开号:103931908A的中国发明《改善蛋鸡产蛋后期生产性能和蛋壳质量的饲料》公开的饲料其含有玉米45-50份、大豆粕10-15份、小麦8-12份、玉米胚芽饼5-10份、苜蓿草粉3-6份、钙粒4-6份、啤酒糟4-6份、钙粉3-5份、玉米蛋白粉2-4份、磷酸氢钙0.5-1份、膨润土0.1-0.2份、植物油脂0.2-0.4份、甜菜碱0.0005-0.0008份、食盐0.2-0.4份、赖氨酸0.2-0.4份、复合维生素0.1-0.2份、胆碱0.1-0.2份、复合微量元素0.1-0.2份、碳酸氢钠0.1-0.2份、蛋氨酸0.1-0.2份、植酸酶0.002-0.006份。本发明饲料能够满足产蛋鸡后期的营养需求，提高产蛋率和蛋壳厚度，改善蛋壳质量。

公开号:103815142A的中国发明《一种提高蛋鸡后期生产性能和消化功能的专用饲料》公开了提高蛋鸡后期生产性能和消化功能的专用饲料，所述的专用饲料按质量百分比计包含玉米42％-66％、小麦2％-24％、豆粕5％-22％、鱼粉0.5％-2％、麸皮1％-5％、玉米蛋白粉0.5％-5％、石粉6％-10％、磷酸氢钙0.1％-3％、蛋氨酸0.01％-0.2％、食盐0.2％-0.4％、凹凸棒石黏土1％-3％、乳化剂0.01％-0.1％、复合酶制剂0.05％-0.1％、复合动物保健剂0.5％-2％以及维生素和微量元素预混料1％。本发明的专用饲料能够补充产蛋后期蛋鸡的内源消化酶，延长食糜的停留时间，调节蛋鸡肠道微生态平衡，维持肠道健康，提高蛋鸡后期消化功能、改善生产性能和养殖经济效益。

公开号:102293343A的中国发明《产蛋鸡后期配合饲料及其制备方法》种蛋鸡产蛋后期配合饲料及其制备方法，可以解决传统蛋鸡后期产蛋率迅速下降及淘汰体重低的问题。该配合饲料由以下原料按重量百分比配比组成：玉米50-55％，米糠15-20％，玉米酒糟粕4-6％，豆粕15-20％，食盐0.2-0.4％，石粒8-9％，植酸酶0.02％，氨基酸0.7-0.8％，微生态0.02-0.05％，氯化胆碱0.08-0.10％，蛋鸡用多维多矿0.4％。所有原料都经过粉碎，100％经过8目标准筛，混合均匀。本发明满足产蛋鸡后期的营养需求，为产蛋鸡后期继续发挥高产性能和提高淘汰体重。

产蛋后期占了整个产蛋期接近45％的比例，大部分养殖户在70周龄淘汰时，产蛋率仍维持在80％以上水平，处于养鸡可以赚钱的阶段，这种淘汰早的做法影响了整个产蛋期的经济效益。我们必须要改变传统的思维模式，加强产蛋后期的营养管理，按照72—100周龄阶段的生理要求，针对提高产蛋后期免疫功能和抗氧化功能进行营养设计与饲喂管理，提高鸡场经济效益。

β-胡萝卜素动物体内不能合成，必须由食物摄入。β-胡萝卜素不仅是动物体内维生素A的重要来源，而且具有抗氧化、着色、提高免疫力和繁殖机能，促进细胞间的缝隙联接等多种生理功能并能消除动物体内自由基,达到防病、抗病的作用,是动物的理想营养强化剂。β-胡萝卜素在特定条件下可提高机体的细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫反应,增强动物对某些疾病的抵抗力,改善其健康状况。饲喂添加β-胡萝卜素的饲粮可增加血浆溶菌酶浓度。β-胡萝卜素对免疫调节作用的主要机制与其抗氧化功能有关,可保护免疫细胞免受活性氧类损害。β-胡萝卜素是一种有发展前景的安全、高效、绿色饲料添加剂。

据报道南瓜渣中富含维生素A、维生素E、β-胡萝卜素等功能性物质，还含有磷、钾、钙镁、锌等营养，可以有效调节糖代谢，增强机体免疫力，并防止血管动脉硬化。叶黄素是一种VA原活性的类胡萝卜素,万寿菊花瓣中含有丰富的叶黄素，叶黄素在防止自由基对生物膜的损害、淬灭单线态氧及捕获自由基方面具有独特的效果。将其加入到食品中,可防止人体器官衰老引发的一系列疾病,如白内障、动脉硬化、癌症等；叶黄素可调节免疫活性。补充叶黄素可促进抗原刺激的淋巴细胞增殖反应,并可影响细胞表面分子的功能性表达。维生素E和酵母硒这两个产品都具有抗氧化作用，在饲料中添加抗氧化物酵母硒或维生素E可提高氧化应激状态下蛋鸡的平均蛋重、蛋黄颜色和哈氏单位及蛋壳L值，改善鸡蛋品质，还可提高氧化应激状态下蛋鸡GSH-Px和SOD活性，降低血清中MDA的含量，提高机体抗氧化能力。大部分研究表明酵母硒和维生素E同时使用具有协同作用，同时添加的效果优于单一添加。

综上所述，根据72周龄--100周龄阶段的生理特点与营养需求，从原料和添加剂使用等综合营养措施入手，发明一种增强蛋鸡产蛋后期的免疫功能和抗氧化功能的饲料，才能为蛋鸡养殖创造更大经济价值。

发明内容

本发明所解决的是产蛋后期蛋鸡产蛋性能下降、免疫力低下和抗氧化功能弱等问题，根据产蛋后期蛋鸡特殊的生理、生长特性，以产蛋后期72-100周龄阶段生理需要和营养需求为主要营养设计依据；以提高产蛋后期蛋鸡免疫功能和抗氧化能力为主要目标，科学复配显著提高蛋鸡繁殖性能、免疫功能、抗病力、营养性的β-胡萝卜素、叶黄素、益生菌、维生素E和酵母硒，制备一种有效提高机体免疫力和抗氧化功能的产蛋后期饲料。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，由以下重量份数的原料制成：

谷物53-60份，豆粕5-20份，玉米蛋白粉1-5份，芝麻粕3-5份，玉米副产品5-10份，小米糠1-8份，果蔬渣3-10份，石粉8-15份，磷酸氢钙0.5-0.8份，食盐0.2-0.4份，米糠油1-3份，氨基酸0.35-1.2份，复合预混料0.5份，β-胡萝卜素0.02-0.06份，叶黄素0.05-0.1份，酵母硒0.001-0.003份，维生素E0.01-0.02份，复合酶制剂0.05-0.1份，氯化胆碱0.05-0.12份，益生素0.05-0.1份，蛋白锌0.01-0.07份，蛋白锰0.01-0.07份，植酸酶0.01-0.03份。

进一步地，所述谷物为玉米、大麦、小麦、高粱中的至少一种；

进一步地，所述玉米副产品为DDGS、玉米胚芽粕、玉米麸中的至少一种；

进一步地，所述果蔬渣为胡萝卜渣、南瓜渣、柑橘渣中的至少一种；

进一步地，所述益生素为低聚异麦芽糖、寡果糖、酵母多糖、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌中的至少一种；

进一步地，所述益生素包含重量份数为2-5:1-3:2-5的低聚异麦芽糖、寡果糖、酵母多糖；

进一步的，所述益生素中的有效活菌数为：枯草芽孢杆菌≥100亿/g、地衣芽孢杆菌≥1000亿/g、酵母菌≥100亿/g、乳酸菌≥50亿/g；

进一步的，所述酵母菌为保藏菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)tlj2016，保藏编号为CGMCC No.12789；

较佳的，所述酵母菌由如下方法培养制备：

(1)摇瓶培养

取tlj2016斜面菌种一环，接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养30h得种子液；

摇瓶培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6、葡萄糖35、K₂HPO₄·3H₂O 3、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO₄ 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1，pH6.0；

(2)5L发酵罐培养

将种子液按10％接种量，接入装有3L发酵培养基的发酵罐中，30℃,通气量6L/min,罐压0.03MPa，500rpm,恒pH6.0条件下进行发酵培养，发酵至30h时，一次性添加终浓度为25mmol/L的L-半胱氨酸，总发酵时间为50h；

发酵完毕，调节pH至6.5，喷雾干燥得酵母菌粉剂；

发酵培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 10、葡萄糖100、K₂HPO₄·3H₂O 8、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO₄ 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1,pH6.0；

进一步地，所述氨基酸为赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸或色氨酸中至少两种；

优选地，所述氨基酸为赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸按质量比1：0.8-1.6:0.5-1.0:0.1-0.5均匀混合。

进一步，所述复合预混料：辽宁禾丰牧业股份有限公司生产，Q/HF J02.03-2012，产品批准文号为辽饲预字(2013)003024；产品组成为复合维生素和微量元素，商标为禾丰，市场有售。复合预混料组成如下：铁15000mg/Kg，铜3000mg/Kg，锌20000mg/Kg，锰24000mg/Kg，硒60mg/Kg，碘100mg/Kg，维生素A1600KIU，维生素D600KIU，维生素E320mg/Kg，维生素K₃200mg/Kg，维生素B₁200mg/Kg，维生素B₂880mg/Kg，维生素B₆600mg/Kg，维生素B₁₂2.0mg/Kg，烟酸6000mg/Kg，泛酸800mg/Kg，叶酸100.0mg/Kg，生物素5.5mg/Kg；

进一步，所述植酸酶：北京昕大洋科技发展有限公司生产的1万单位植酸酶，生产许可证号为饲添(2012)0017，批准文号：京饲(添)字(2012)403711；主要成分为植酸酶；市场有售；

进一步，所述复合酶制剂：沈阳丰美生物技术有限公司生产，生产许可证号为饲添(2011)1986，批准文号：辽饲(添)字(2011)040008；主要成分含量如下：木聚糖酶3000U/g,甘露聚糖酶800U/g，酸性蛋白酶U/g，脂肪酶800U/g，淀粉酶300U/g，葡聚糖酶400U/g。市场有售；

本发明同时提供一种提高免疫功能的产蛋期72-100周龄蛋鸡饲料的制备方法，包括以下步骤：

按照配方准确称取各组分原料，均按照常规蛋鸡料加工方法粉碎，然后按重量份数自大至小依次加入，均匀混合，加工，即得提高免疫功能的产蛋期72—100周龄蛋鸡饲料。

有益效果

本发明能够显著提高产蛋后期蛋鸡免疫功能和抗病力，蛋鸡后期死亡率降低9.3％，每只鸡整个产蛋期多产蛋15枚以上，每只鸡多赚6.6元以上，显著提高蛋鸡场经济效益。添加益生素能够抑制有害细菌的增殖，促进有益菌的增殖，改善蛋鸡小肠绒毛发育，降低腹泻率，提高动物免疫力；特别是添加高产谷胱苷肽的保藏菌种tlj2016，谷胱苷肽作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外，对改善蛋鸡的健康机能，很有益处，与其他原料协同作用能够显著提高产蛋率、产蛋量，降低死亡率，提高抗氧化功能，增强肠道健康水平，增强抗病力，提高输卵管健康和机体健康水平，因此提高产蛋性能。蛋壳强度和哈夫单位明显提高，鸡蛋的新鲜度高，蛋壳强度提高50％，对应的破蛋率降低，商品蛋率提高，因而饲喂本发明的饲料养鸡能够多赚钱，极大地提高养殖经济效益。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。

所述酿酒酵母菌株具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)tlj2016，该菌株已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12789，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

所述酿酒酵母tlj2016的最适生长pH为6.0-6.5，最适生长温度为28-35℃；

所述酿酒酵母tlj2016是从一株宁夏果园中分离得到的酿酒酵母出发菌株经以下步骤得到：

原始出发菌种→试管活化→硫酸二乙酯(DES)诱变→高渗平板筛选→亚硝基胍(NTG)诱变筛选→高渗平板初筛→摇瓶筛选→发酵复筛(产谷胱苷肽GSH能力)→传代稳定性试验。

经过诱变后获得的菌株tlj2016，其葡萄糖耐受能力以及L-半胱氨酸耐受能力均得到提高，一方面在高浓度葡萄糖培养下能够提高细胞密度，另一方面L-半胱氨酸耐受能力的提高将有利于GSH在胞内大量合成，从而提高菌株大规模生产GSH的能力。

本发明所采用的酿酒酵母对葡萄糖的耐受能力达到300g/L，利于其在高浓度葡萄糖条件下生产GSH；在5L发酵罐中发酵生产GSH终浓度达到3308mg/L；耐受L-半胱氨酸的能力远高于出发菌株，在5mmol/L L-半胱氨酸作用下仍能缓慢生长，在40mmol/LL-半胱氨酸作用下仍能保持GSH大量合成；耐盐能力达到18％，有利于扩展其应用领域。

1.DES诱变选育

1)在超净台上取试管斜面上的出发菌株1一环，接入装有50mL麦芽汁培养基的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养10h左右，使菌体处于对数生长前期。

2)取5mL菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。

3)用pH7.0磷酸缓冲液稀释成10⁷个/mL菌悬液。

4)取32mL pH7.0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mL DES在预先放入转子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1％(v/v)。

5)在30℃摇床中150rpm反应30min，取1mL混合液，加入0.5mL 25％Na₂S₂O₃溶液中止反应。

6)稀释涂布于含150g/L KCl的麦芽汁培养基平皿中，在30℃培养2-3天后挑取菌落最大的菌株1。

2.亚硝基胍诱变

1)在超净台上取试管斜面上的酿酒酵母菌菌株1一环，接入装有50mL麦芽汁培养基的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养10h左右，使菌体处于对数生长前期。

2)取5mL菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。

3)用pH6.0磷酸缓冲液稀释成10⁷个/mL菌悬液。

4)取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。

5)在30℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。

6)适当稀释涂布，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于含200g/L KCl的麦芽汁培养基平皿中。在30℃培养2-3天后挑取菌落20支。

3.摇瓶初筛

1)在超净台上分别取上述20支酿酒酵母菌各一环，分别接入装有50mL麦芽汁培养基的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。

2)取5mL菌液，接入装有50mL高渗麦芽汁培养基(葡萄糖浓度为300g/L)中的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养3-4天，每天检测葡萄糖浓度和乙醇浓度变化。发酵结束后，比较20株菌种的葡萄糖和乙醇消耗速率、最终残糖浓度和乙醇浓度、葡萄糖对乙醇的转化率以及杂酸含量。

3)选择葡萄糖消耗速率快、最终残糖浓度低和乙醇浓度高的5株菌命名为Y-1，Y-2，Y-3，Y-4，Y-5。

4.发酵复筛

将步骤3中所得的5株菌Y-1，Y-2，Y-3，Y-4，Y-5以及出发菌株，分别按照10％接种量，在装有30mL液体培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养30h，取发酵液测定GSH浓度；

液体培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6、葡萄糖35、K₂HPO₄·3H₂O 3、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO₄ 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1；

GSH测定方法：发酵液离心洗涤后得新鲜酵母，30℃下，40％乙醇处理3h，离心取上清液做GSH测定样品；

采用四氧嘧啶法进行GSH测定：其原理为GSH上的-SH与四氧嘧啶反应，生成的物质在305nm处有吸收峰，且与谷胱甘肽浓度成线性关系，故可用紫外分光光度计进行定量测定GSH含量。

表1：GSH检测结果

菌株	出发菌株	Y-1	Y-2	Y-3	Y-4	Y-5
							GSH浓度(mg/L)	127.9	195.7	172.3	263.2	216.5	185.2

由表1结果可知，菌株Y-3具有最高的GSH发酵能力，因此确定Y-3为最终的生产菌株，并将其命名为tlj2016。

5.遗传稳定性试验

将tlj2016菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。

酿酒酵母tlj2016高糖条件下发酵产GSH能力实验

(1)摇瓶培养

取tlj2016斜面菌种一环，接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养30h得种子液；

摇瓶培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6、葡萄糖35、K₂HPO₄·3H₂O 3、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO₄ 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1，pH6.0；

(2)5L发酵罐培养

将种子液按10％接种量，接入装有3L发酵培养基的发酵罐中，30℃,通气量6L/min,罐压0.03MPa，500rpm,恒pH6.0条件下进行发酵培养，发酵至30h时，一次性添加终浓度为25mmol/L的L-半胱氨酸，总发酵时间为50h；

发酵培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 10、葡萄糖100、K₂HPO₄·3H₂O 8、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO₄ 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1,pH6.0；

发酵结束后，测定发酵液中GSH的含量为3308mg/L。

酿酒酵母tlj2016L-半胱氨酸耐受力实验

将出发菌株以及tlj2016斜面菌种各一环，分别接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养进行培养，在培养至12h时，向摇瓶中加入不同终浓度的L-半胱氨酸，再培养10h，测定细胞干重，结果表2、3；

摇瓶培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6、葡萄糖20、K₂HPO₄·3H₂O 3、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO₄ 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1，pH6.0；

表2：出发菌株L-半胱氨酸耐受力

表3：tlj2016L-半胱氨酸耐受力

L-半胱氨酸浓度mmol/L	0	5	10	15	20	40
							tlj2016干重g/L	25.7	28.5	23.6	21.2	20.6	18.7
GSH浓度(mg/L)	73.2	98.3	113.5	121.7	127.5	135.8

从表2的结果可以看出，对于出发菌株，培养基中添加L-半胱氨酸，细胞停止生长，并且开始自溶，导致GSH增长率随着L-半胱氨酸浓度的升高而降低；从表3的结果可以看出，低浓度L-半胱氨酸下，tlj2016仍能够缓慢生长，随着L-半胱氨酸浓度的提高，tlj2016菌株的细胞干重缓慢下降，而GSH浓度持续增长，这一结果将有利于GSH生产过程中通过添加前体氨基酸-L-半胱氨酸促进GSH的生产。

酿酒酵母tlj2016耐盐能力实验

取tlj2016菌液1mL接种菌种于含有不同NaCl浓度的(含量梯度为0％、2％、5％、10％、15％、18％)的10mL YPD液体培养基(pH＝6.5)，置于30℃下分别培养24h，每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于YPD固体平板中涂布，于30℃生化培养箱中倒置培养36小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表4，可知该菌的耐盐浓度为18％，说明tlj2016不仅可以在常规环境中生存，在高盐条件下依然具有活力，可应用于酱油、腌制品等高盐食品加工过程中耗糖产谷胱甘肽。

表4：耐盐能力检测(×10⁷cfu/ml)

NaCl含量

0％

2％

5％

10％

15％

18％

原始菌株

5.16±0.42

4.38±0.42

2.15±0.21

0.12±0.11

0

0

tlj2016

5.33±0.28

5.10±0.71

4.83±0.42

3.98±0.33

2.57±0.48

0.83±0.15

实施例1

一种提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，由以下重量份数的原料制备：

高粱28份，玉米27份，豆粕14份，玉米蛋白粉2份，芝麻粕3份，玉米胚芽粕5份，柑橘渣2份，胡萝卜渣2份，小米糠5份，米糠油1.5份，石粉10份，磷酸氢钙0.6份，食盐0.35份，复合预混料0.5份，氯化胆碱0.08份，叶黄素0.1份，酵母硒0.003份，维生素E0.01份，1万单位植酸酶0.02份,70％赖氨酸0.15份，DL-蛋氨酸0.18份，苏氨酸0.1份，色氨酸0.02份,β-胡萝卜素0.04份，复合酶制剂0.05份，益生素0.06份，蛋白锌0.04份，蛋白锰0.04份；

所述益生素包含重量份数为3:2:2的低聚异麦芽糖、寡果糖、酵母多糖；

所述益生素中的有效活菌数为：枯草芽孢杆菌≥100亿/g、地衣芽孢杆菌≥1000亿/g、酵母菌≥100亿/g、乳酸菌≥50亿/g；

所述酵母菌为保藏菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)tlj2016，保藏编号为CGMCC No.12789；

所述酵母菌由如下方法培养制备：

(1)摇瓶培养

取tlj2016斜面菌种一环，接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养30h得种子液；

摇瓶培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6、葡萄糖35、K₂HPO₄·3H₂O 3、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO₄ 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1，pH6.0；

(2)5L发酵罐培养

将种子液按10％接种量，接入装有3L发酵培养基的发酵罐中，30℃,通气量6L/min,罐压0.03MPa，500rpm,恒pH6.0条件下进行发酵培养，发酵至30h时，一次性添加终浓度为25mmol/L的L-半胱氨酸，总发酵时间为50h；

发酵完毕，调节pH至6.5，喷雾干燥得酵母菌粉剂；

发酵培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 10、葡萄糖100、K₂HPO₄·3H₂O 8、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO₄ 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1,pH6.0；

一种提高免疫功能的产蛋期72-100周龄蛋鸡饲料的制备方法，包括以下步骤：

按照配方准确称取各组分原料，均按照常规蛋鸡料加工方法粉碎，然后按重量份数自大至小依次加入，均匀混合，加工，即得提高免疫功能的产蛋期72—100周龄蛋鸡饲料。

实施例2

一种提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，由以下重量份数的原料制成：

大麦17份，玉米41份，豆粕13份，DDGS5份，玉米蛋白粉3份，南瓜渣3份，胡萝卜渣2份，小米糠5份，米糠油1.3份，石粉10份，磷酸氢钙0.6份，食盐0.35份，复合预混料0.5份，氯化胆碱0.08份，叶黄素0.1份，益生素0.05份，复合酶制剂0.05份，1万单位植酸酶0.02份，蛋白锌0.03份，蛋白锰0.03份，赖氨酸0.17份，DL-蛋氨酸0.18份，苏氨酸0.1份，色氨酸0.03份，芝麻粕5份，β-胡萝卜素0.02份，酵母硒0.003份，维生素E0.01份；

所述益生素包含重量份数为2:1:5的低聚异麦芽糖、寡果糖、酵母多糖；

所述益生素中的有效活菌数为：枯草芽孢杆菌≥100亿/g、地衣芽孢杆菌≥1000亿/g、酵母菌≥100亿/g、乳酸菌≥50亿/g；

所述酵母菌为保藏菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)tlj2016，保藏编号为CGMCC No.12789；

所述酵母菌培养制备方法同实施例1；

一种提高免疫功能的产蛋期72-100周龄蛋鸡饲料的制备方法同实施例1。

实施例3

一种提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，由以下重量份数的原料制成：

小麦18份，玉米42份，豆粕15份，玉米麸5份，柑橘渣5份，小米糠5份，米糠油1.5份，石粉10份，磷酸氢钙0.6份，食盐0.35份，复合预混料0.5份，氯化胆碱0.08份，益生素0.05份，复合酶制剂0.05份，1万单位植酸酶0.02份，蛋白锌0.03份，蛋白锰0.03份，β-胡萝卜素0.02份，赖氨酸0.17份，DL-蛋氨酸0.18份，苏氨酸0.1份，色氨酸0.03份，玉米蛋白粉5份，芝麻粕5份，叶黄素0.05份，酵母硒0.003份，维生素E0.02份；

所述益生素包含重量份数为2:2.4:3.5的低聚异麦芽糖、寡果糖、酵母多糖；

所述益生素中的有效活菌数为：枯草芽孢杆菌≥100亿/g、地衣芽孢杆菌≥1000亿/g、酵母菌≥100亿/g、乳酸菌≥50亿/g；

所述酵母菌为保藏菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)tlj2016，保藏编号为CGMCC No.12789；

所述酵母菌的培养制备方法同实施例1：

一种提高免疫功能的产蛋期72-100周龄蛋鸡饲料的制备方法同实施例1。

实施例4

一种提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，由以下重量份数的原料制成：

玉米53份，豆粕5份，玉米蛋白粉1份，玉米麸10份，柑橘渣5份，南瓜渣5份，小米糠1份，米糠油1份，石粉8份，磷酸氢钙0.5份，食盐0.2份，复合预混料0.5份，氯化胆碱0.05份，益生素0.05份，复合酶制剂0.05份，1万单位植酸酶0.03份，蛋白锌0.01份，蛋白锰0.07份，β-胡萝卜素0.02份，赖氨酸0.3份，DL-蛋氨酸0.48份，苏氨酸0.27份，色氨酸0.15份，芝麻粕5份，叶黄素0.05份，酵母硒0.003份，维生素E0.01份；

所述益生素包含重量份数为5:3:2的低聚异麦芽糖、寡果糖、酵母多糖；

所述益生素中的有效活菌数为：枯草芽孢杆菌≥100亿/g、地衣芽孢杆菌≥1000亿/g、酵母菌≥100亿/g、乳酸菌≥50亿/g；

所述酵母菌为保藏菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)tlj2016，保藏编号为CGMCC No.12789；

所述酵母菌由本领域常规方法培养制备；

一种提高免疫功能的产蛋期72-100周龄蛋鸡饲料的制备方法同实施例1。

实施例5

一种提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，由以下重量份数的原料制成：

玉米50份，高粱10，豆粕20份，玉米蛋白粉5份，柑橘渣2份，胡萝卜渣1份，小米糠8份，米糠油3份，石粉15份，磷酸氢钙0.8份，食盐0.4份，复合预混料0.5份，氯化胆碱0.12份，益生素0.1份，复合酶制剂0.1份，1万单位植酸酶0.03份，维生素E0.02份，酵母硒0.003份，赖氨酸0.14份，DL-蛋氨酸0.11份，苏氨酸0.08份，色氨酸0.03份，芝麻粕3份，玉米胚芽粕5份，β-胡萝卜素0.06份，叶黄素0.1份，蛋白锌0.07份，蛋白锰0.01份；

所述益生素包含重量份数为5:1:5的低聚异麦芽糖、寡果糖、酵母多糖；

所述益生素中的有效活菌数为：枯草芽孢杆菌≥100亿/g、地衣芽孢杆菌≥1000亿/g、酵母菌≥100亿/g、乳酸菌≥50亿/g；

一种提高免疫功能的产蛋期72-100周龄蛋鸡饲料的制备方法，同实施例1。

实施例1-5中

所述复合预混料：辽宁禾丰牧业股份有限公司生产，Q/HF J02.03-2012，产品批准文号为辽饲预字(2013)003024；产品组成为复合维生素和微量元素，商标为禾丰，市场有售。复合预混料组成如下：铁15000mg/Kg，铜3000mg/Kg，锌20000mg/Kg，锰24000mg/Kg，硒60mg/Kg，碘100mg/Kg，维生素A1600KIU，维生素D600KIU，维生素E320mg/Kg，维生素K₃200mg/Kg，维生素B₁200mg/Kg，维生素B₂880mg/Kg，维生素B₆600mg/Kg，维生素B₁₂2.0mg/Kg，烟酸6000mg/Kg，泛酸800mg/Kg，叶酸100.0mg/Kg，生物素5.5mg/Kg；

所述植酸酶：北京昕大洋科技发展有限公司生产的1万单位植酸酶，生产许可证号为饲添(2012)0017，批准文号：京饲(添)字(2012)403711；主要成分为植酸酶；市场有售；

所述复合酶制剂：沈阳丰美生物技术有限公司生产，生产许可证号为饲添(2011)1986，批准文号：辽饲(添)字(2011)040008；主要成分含量如下：木聚糖酶3000U/g,甘露聚糖酶800U/g，酸性蛋白酶U/g，脂肪酶800U/g，淀粉酶300U/g，葡聚糖酶400U/g。市场有售；

试验例，以本发明提高免疫功能的蛋鸡产蛋后期饲料与市售类似饲料做对照试验，比较各饲料对蛋鸡免疫功能和产蛋性能的影响

1.试验材料与方法

1.1试验时间2015年3月7日—11月12日，试验期为266天，其中预饲期为7天。

1.2试验地点：辽宁省东港市马家店镇王众蛋鸡养殖场

1.3试验设计：试验鸡采用1152只ISA公司的迪卡白蛋鸡，周龄为70周龄，分为本发明组实施例1-5与对照组共6组，每组6个重复，每个重复32只鸡(2组笼，三层，每层16只鸡)，实施例数据取平均值，与对照组进行对比；

1.4饲喂方法：手工上料，每天三次，自由采食；自由饮水，水为自来水，水温15-21℃。

1.5鸡舍：纵向通风，温度为19-25℃。按照ISA公司的迪卡白蛋鸡饲养管理程序严格执行控制。

1.6检测指标

1.6.1产蛋性能指标：初始与结束体重，产蛋枚数，蛋重，采食量；

1.6.2血液中免疫功能指标：IgG,IgA,IgM。采血方法采用心脏采血。

1.6.3蛋品质检测结果，采用蛋品检测仪

2.试验结果：将每批次试验指标进行检测结果统计，计算各批次平均数，统计结果如表5、表6和表7。

表5对蛋鸡72—110周龄综合影响对照表

项目	本发明组	对照组
			初始体重(千克)	1.53±0.79	1.54±0.68
结束体重(千克)	1.75±0.62	1.63±0.95
			平均蛋重(克)	61.9±0.06	58.7±0.09
产蛋率(％)	83.54±1.57	76.85±2.71
			产蛋量(克/只/日)	51.7±0.95	45.1±1.19
死亡率(％)	3.22±0.52	12.56±0.08
			盈利(元/只)	26.8	20.2

由表5可见，本发明组产蛋率提高,6.69％，产蛋量提高14.63％，死亡率显著降低，达到9.34％，抗氧化功能提高，肠道健康水平增强，抗病力增强，输卵管健康和机体健康水平也随之提高，因此产蛋性能提高。

表6对蛋鸡免疫功能的影响对照表

项目	本发明组	对照组
			IgG	7.83	6.12
IgA	1.02	0.89
			IgM	0.86	0.75

由表6可见，蛋鸡72—100周龄阶段免疫功能显著提高。

表7对蛋鸡72—100周龄蛋品质的影响对照表

由表7可见，产蛋后期72-100周龄阶段，蛋壳强度和哈夫单位本发明组效果十分明显，哈夫单位提高6.73％，说明鸡蛋的新鲜度高。蛋壳强度提高50％，对应的破蛋率降低，商品蛋率提高，因而养鸡多赚钱。

Claims (10)

1.一种提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，由以下重量份数的原料制成：

谷物53-60份，豆粕5-20份，玉米蛋白粉1-5份，芝麻粕3-5份，玉米副产品5-10份，小米糠1-8份，果蔬渣3-10份，石粉8-15份，磷酸氢钙0.5-0.8份，食盐0.2-0.4份，米糠油1-3份，氨基酸0.35-1.2份，复合预混料0.5份，β-胡萝卜素0.02-0.06份，叶黄素0.05-0.1份，酵母硒0.001-0.003份，维生素E0.01-0.02份，复合酶制剂0.05-0.1份，氯化胆碱0.05-0.12份，益生素0.05-0.1份，蛋白锌0.01-0.07份，蛋白锰0.01-0.07份，植酸酶0.01-0.03份；

所述氨基酸为赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸或色氨酸中至少两种；

所述复合预混料：辽宁禾丰牧业股份有限公司生产，Q/HF J02.03-2012，产品批准文号为辽饲预字(2013)003024；

所述植酸酶：北京昕大洋科技发展有限公司生产的1万单位植酸酶，生产许可证号为饲添(2012)0017，批准文号：京饲(添)字(2012)403711；

所述复合酶制剂：沈阳丰美生物技术有限公司生产，生产许可证号为饲添(2011)1986，批准文号：辽饲(添)字(2011)040008。

2.根据权利要求1所述提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，其特征在于，所述谷物为玉米、大麦、小麦、高粱中的至少一种。

3.根据权利要求1所述提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，其特征在于，所述玉米副产品为DDGS、玉米胚芽粕、玉米麸中的至少一种。

4.根据权利要求1所述提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，其特征在于，所述果蔬渣为胡萝卜渣、南瓜渣、柑橘渣中的至少一种。

5.根据权利要求1所述提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，其特征在于，所述益生素为低聚异麦芽糖、寡果糖、酵母多糖，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌中的至少一种。

6.根据权利要求5所述提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，其特征在于，所述益生素中的有效活菌数为：枯草芽孢杆菌≥100亿/g、地衣芽孢杆菌≥150亿/g、酵母菌≥100亿/g、乳酸菌≥100亿/g。

7.根据权利要求5或6所述提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，其特征在于，所述酵母菌为保藏酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)tlj2016，保藏编号为CGMCC No.12789。

8.根据权利要求7所述提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，其特征在于，所述酵母菌由如下方法培养制备：

(1)摇瓶培养

取tlj2016斜面菌种一环，接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养30h得种子液；

摇瓶培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6、葡萄糖35、K₂HPO₄·3H₂O 3、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO₄ 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1，pH6.0；

(2)5L发酵罐培养

将种子液按10％接种量，接入装有3L发酵培养基的发酵罐中，30℃,通气量6L/min,罐压0.03MPa，500rpm,恒pH6.0条件下进行发酵培养，发酵至30h时，一次性添加终浓度为25mmol/L的L-半胱氨酸，总发酵时间为50h；

发酵完毕，调节pH至6.5，喷雾干燥得酵母菌粉剂；

发酵培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 10、葡萄糖100、K₂HPO₄·3H₂O 8、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO₄ 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1,pH6.0。

9.根据权利要求1所述提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料，其特征在于，所述氨基酸为赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸按质量比1：0.8-1.6:0.5-1.0:0.1-0.5均匀混合。

10.制备权利要求1-9任一所述提高免疫功能的72-100周龄蛋鸡饲料的方法，包括以下步骤：

按照配方准确称取各组分原料，均按照常规蛋鸡料加工方法粉碎，然后按重量份数自大至小依次加入，均匀混合，加工，即得提高免疫功能的产蛋期72—100周龄蛋鸡饲料。