CN115806920B

CN115806920B - 一种富锌副干酪乳杆菌及生产有机锌的方法

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Publication number: CN115806920B
Application number: CN202211689058.2A
Authority: CN
Inventors: 韩景; 郭仁妹; 李仁靓; 韩峰
Original assignee: Suzhou Weike Life Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Weike Life Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-27
Filing date: 2022-12-27
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2042-12-27
Also published as: CN115806920A

Abstract

本发明公开了一种富锌副干酪乳杆菌及生产有机锌的方法，富锌副干酪乳杆菌由副干酪乳杆菌经富锌培养基培养得到，其中，富锌培养基为添加了牛骨胶原蛋白肽和锌离子的MRS培养基。本发明提供的富锌副干酪乳杆菌可高效吸收转化无机锌，可实现有机锌高效富集，锌含量可达682.25mg/kg，经过驯化培养后锌含量达到782.81mg/kg，提升14.74％，且具有明显的抑菌效果，使其更具有工业应用价值。

Description

一种富锌副干酪乳杆菌及生产有机锌的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种富锌副干酪乳杆菌及生产有机锌的方法。

背景技术

副干酪乳杆菌具有调节人体肠道菌群平衡，增强人体免疫，预防疾病等生理作用，在益生菌作用人体方面有着广阔发展前景。研究表明：副干酪乳杆菌可以增强宿主对病原体的非特异性抵抗力，加快清除肠道病原体，有助于改善肠道菌群平衡和增加肠道通透性，以此防止宿主急性腹泻和食物过敏等；副干酪乳杆菌还会增加淋巴细胞和抗低密度氧化脂抗体，增强粒细胞的噬菌作用，帮助宿主免疫调节防止产生肿瘤。乳酸菌能否在人体肠道内环境中存活和定植是益生菌发挥其保健作用的重要前提之一，而副干酪乳杆菌具有良好的耐酸耐胆汁性，体外体内的存活能力都较强。

锌元素作为人体不可或缺的微量元素之一，对维持人体的正常生长、发育以及消化道、皮肤、肝等正常分泌密切相关。人体含有2～3g锌，其中约90％存在于肌肉和骨骼中，一个健康成年人每天通过饮食摄入10～15毫克锌。锌营养缺乏症是全世界常见的营养缺乏症，约占全球人口的31％，特别是发展中国家的人口，尤其是幼儿、孕妇和产后女性缺锌的风险较高。根据Fons等人，25名患有低血清锌水平的特征是生长显著降低、骨龄延迟，在整个发育过程中的适当时期补充锌也可能有助于恢复增长和发展。此外，锌对男性生育至关重要，锌缺乏会导致精子异常以及血清睾酮浓度降低。

目前，锌缺乏症的锌补充主要通过补充摄入锌补充剂，包括无机锌(如，ZnCl₂、ZnSO₄)，简单有机锌(如，葡萄糖酸锌、醋酸锌)和有机锌(如氨基酸螯合锌和蛋白质螯合锌)。有机锌比无机锌更容易被吸收人体，而无机锌通常伴随着副作用，例如对胃肠道的刺激。有机锌主要是人工合成的，但其合成比较复杂。锌的富集微生物在近几十年来得到了广泛的研究。富锌细菌在含锌介质和无机锌的生长过程中产生可以转化为更容易吸收和利用的有机锌。富含锌的活性益生菌除了补充营养外，还可以调节肠道微生物群锌。作为一种新型的膳食锌源，富含锌的益生菌比其他锌补充剂具有更多的优势。

综上，本发明旨在基于副干酪乳杆菌开发一种高效的生物富集有机锌的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明优化得到一株可富集无机锌并转化为有机锌的副干酪乳杆菌，并实现了更高的锌元素富集，在生产有机锌、代谢产物抑菌方面均有巨大的应用前景。

本发明的第一个目的是提供一种富锌副干酪乳杆菌，由副干酪乳杆菌经富锌培养基培养得到，所述富锌培养基为添加了牛骨胶原蛋白肽和锌离子的MRS培养基。

进一步地，将副干酪乳杆菌在富锌培养基中驯化培养至少80代。

进一步地，所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌CCFM1089，已于2019年11月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.60880，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

进一步地，所述富锌培养基中牛骨胶原蛋白肽的浓度为1～10g/L。

进一步地，所述富锌培养基中锌离子的浓度为60～120mg/L。

进一步地，所述MRS培养基的组成为：蛋白胨5～20g/L、牛肉浸膏5～20g/L、酵母提取物2.5～10g/L、葡萄糖10～30g/L、三水·乙酸钠2.5～10g/L、柠檬酸氢二胺1～5g/L、三水·磷酸氢二钾1～5g/L、七水·硫酸镁0.25～0.75g/L、一水·硫酸锰0.1～0.3g/L、吐温80 0.5～2g/L。

本发明的第二个目的是提供上述富锌副干酪乳杆菌在生产有机锌、制备富锌产品或制备调理肠道功能制剂中的应用。其中，肠道在长期缺锌的情况下，微生物群将显著减少，而本发明通过对富锌副干酪乳杆菌的活菌数、耐酸、耐胆盐情况的测试，加之副干酪乳杆菌在肠道内环境定植的性质，可作为肠道功能制剂对肠道进行调理。

本发明的第三个目的是提供上述富锌副干酪乳杆菌在抑菌中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种生产有机锌的方法，采用上述富锌副干酪乳杆菌进行发酵生产。

进一步地，发酵条件为温度35～40℃、转速50～120rpm、pH5.5～6.0。

本发明的有益效果：

本发明通过对副干酪乳杆菌的培养条件进行优化，得到的菌株可高效转化无机锌生产有机锌，使菌体中的总锌含量可达682.25mg/kg，且其发酵代谢产物对金黄葡萄球菌有一定的抑制作用。在此基础上，通过连续的富锌驯化获得了具有高稳定性、较高富锌能力的副干酪乳杆菌子代，发酵所得富锌副干酪乳杆菌菌粉锌含量达到782.81mg/kg，相对于未驯化提升了14.74％，并且有优异的抑菌能力，在富锌益生菌的生产及致病菌抑制方面有着极高的应用前景。

附图说明

图1为副干酪乳杆菌CCFM1089在发酵生产中的存活率结果；

图2为普通副干酪乳杆菌CCFM1089与锌驯化副干酪乳杆菌CCFM1089耐酸耐胆盐试验比较结果；

图3为金黄色葡萄球菌的抑制效果；

图4为金黄色葡萄球菌的阳性对照。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中涉及的材料如下：

硫酸锌(产品编号Z0251-100G：、CAS：7446-20-0)、胃蛋白酶(产品编号：P7000-25G、CAS：9001-75-6)、胰蛋白酶(产品编号：T4799-25G、CAS：9002-07-7)均购自北京伊诺凯科技有限公司、胆盐(产品编号：LP0055、CAS：8049-47-6)购于国药集团化学试剂有限公司。

副干酪乳杆菌CCFM1089由苏州硒泰克生物科技有限公司授权使用。详细信息如菌株的形态、核苷酸序列已记载于专利CN111004753B中。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

锌的检测方法：参考《GB5009.14—2017食品安全国家标准食品中锌的测定》中的第一法火焰原子吸收光谱法。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS液体培养基：蛋白胨15g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、三水·乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、三水·磷酸氢二钾2g/L、七水·硫酸镁0.5g/L、一水·硫酸锰0.2g/L、吐温80 1g/L。

第一液体富锌改良培养基：蛋白胨15g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、三水·乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、三水·磷酸氢二钾2g/L、七水·硫酸镁0.5g/L、一水·硫酸锰0.2g/L、吐温80 1g/L、牛骨胶原蛋白肽5g/L，硫酸锌90mg/L。

第二液体富锌改良培养基：蛋白胨5g/L、牛肉浸膏5g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖10g/L、三水·乙酸钠2.5g/L、柠檬酸氢二胺5g/L、三水·磷酸氢二钾5g/L、七水·硫酸镁0.25g/L、一水·硫酸锰0.3g/L、吐温80 0.5g/L、牛骨胶原蛋白肽1g/L，硫酸锌120mg/L。

第三液体富锌改良培养基：蛋白胨20g/L、牛肉浸膏20g/L、酵母提取物2.5g/L、葡萄糖30g/L、三水·乙酸钠10g/L、柠檬酸氢二胺1g/L、三水·磷酸氢二钾1g/L、七水·硫酸镁0.75g/L、一水·硫酸锰0.1g/L、吐温80 2g/L、牛骨胶原蛋白肽10g/L，硫酸锌60mg/L。

下述实施例中涉及的培养方法如下：

将菌株接种至普通MRS培养基中，于温度为35～40℃、转速为50～120rpm、pH为5.5～6.0的条件下发酵16～24h，发酵停止后，加入硫酸锌溶液，温度为35～40℃、转速为30～60rpm，孵育1h，然后将菌体进行处理。

将菌株接种至富锌改良培养基中，于温度为35～40℃、转速为50～120rpm、pH为5.5～6.0的条件下发酵16～24h，然后将菌体进行处理，得到富锌副干酪乳杆菌。

实施例1培养基的优化

分别在普通MRS培养基中分别添加0.2％、0.5％、1.0％的乳清蛋白粉、大豆蛋白粉、牛骨胶原蛋白肽、鱼胶原蛋白肽对副干酪乳杆菌CCFM1086进行培养，测定各组益生菌的单位活菌数。结果显示，培养基中加入牛骨胶原蛋白肽对副干酪CCFM1086的生长繁殖促进作用相对显著，提高了益生菌单位数量的菌落数。

实施例2副干酪乳杆菌CCFM1089的锌富集

(1)将副干酪乳杆菌CCFM1089平板划线活化，37℃条件下培养16～24h。挑取长势较好的单菌落接种到液体培养基(同平板培养基，只是没有添加琼脂)试管中，进行第二次活化，37℃条件下培养24h；按3％接种量将活化后的菌液接种到100mlMRS液体培养基中，37℃条件下培养16～24h；6000×g离心10min，超纯水洗涤菌体两遍后获得湿菌体；将湿菌体加入到100ml120mg/L硫酸锌溶液中，摇床振荡孵育6h；6000×g离心10min，收集上清液；超纯水洗涤菌体两遍后获得湿菌体，并收集最终的洗涤上清液；将湿菌体于烘箱55℃烘干至恒重，称重后利用原子吸收分光光度计测试菌体锌元素含量。

(2)按上述(1)中同样的方法将副干酪乳杆菌CCFM1089活化；按3％接种量将活化后的菌液接种到100ml Zn离子浓度120mg/L的第一液体富锌改良培养基中，37℃条件下培养16～24h；6000×g离心10min，超纯水洗涤菌体两遍后获得湿菌体，并收集最终的洗涤上清液；将湿菌体于烘箱55℃烘干至恒重，称重后利用原子吸收分光光度计测试菌体锌元素含量。

上述(1)～(2)中菌体的有机锌含量测定结果如表1所示。

表1有机锌含量

实施例3副干酪乳杆菌CCFM1089的富锌驯化

将副干酪乳杆菌CCFM1089接种到第一富锌改良液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在同Zn离子浓度的富锌改良固体平板培养基上进行划线培养，此为一代；挑取固体平板上较大的菌落接入新的第一富锌改良液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在同Zn离子浓度的富锌改良固体平板培养基上进行划线培养，此为二代。如此重复，驯化培养100代，获得具有高稳定性、较高富锌能力的副干酪乳杆菌CCFM1089子代，发酵所得富锌副干酪乳杆菌菌粉锌含量达到782.81mg/kg，相对未驯化提升14.74％。

实施例4

(1)按照实施例2中(2)的步骤进行锌富集实验，区别在于将第一富锌改良液体培养基分别替换为第二富锌改良液体培养基和第三富锌改良液体培养基。菌体的有机锌含量测定结果如表2所示。

表2有机锌含量

(2)将副干酪乳杆菌CCFM1089接种到第二富锌改良液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在同Zn离子浓度的富锌改良固体平板培养基上进行划线培养，此为一代；挑取固体平板上较大的菌落接入新的第二富锌改良液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在同Zn离子浓度的富锌改良固体平板培养基上进行划线培养，此为二代。如此重复，驯化培养80代，获得具有高稳定性、较高富锌能力的副干酪乳杆菌CCFM1089子代，发酵所得富锌副干酪乳杆菌菌粉锌含量达到762.36mg/kg，相对未驯化提升13.87％。

将副干酪乳杆菌CCFM1089接种到第三富锌改良液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在同Zn离子浓度的富锌改良固体平板培养基上进行划线培养，此为一代；挑取固体平板上较大的菌落接入新的第三富锌改良液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在同Zn离子浓度的富锌改良固体平板培养基上进行划线培养，此为二代。如此重复，驯化培养105代，获得具有高稳定性、较高富锌能力的副干酪乳杆菌CCFM1089子代，发酵所得富锌副干酪乳杆菌菌粉锌含量达到741.57mg/kg，相对未驯化提升12.86％。

实施例5副干酪乳杆菌CCFM1089在发酵生产中的存活率实验

以实施例3驯化得到的湿菌体为例进行存活率验证。在实施例3获得的湿菌体中加入无菌生理盐水重悬，将重悬液吸取1mLEP管中，制备冻干管，待测。按照梯度逐级稀释的方法，分别测定普通MRS培养基、富锌培养基发酵终止时发酵液、冻干前、冻干后三个时期副干酪乳杆菌CCFM1089的活菌数。

结果见图1，可知采用本发明改进后的富锌培养基在发酵中以及冻干过程前后活菌数没有明显下降，其对菌株的存活率没有不利影响。

实施例6副干酪乳杆菌CCFM1089耐酸耐胆盐试验

将实施例3获得的湿菌体，经冻干保护剂混匀后，分装至1ml EP管中，制备冻干管，用于耐酸耐胆盐测试。

模拟胃液：称取定量的胃蛋白酶(Sigma，p7000)溶解于2/3所需体积的生理盐水(0.5％w/v)，用浓盐酸调节pH至3.0，用0.22μm无菌滤膜过滤后定容到所需体积，使终浓度达到3g/L。

模拟肠液：称取定量的胰蛋白酶(Sigma，p1500)，胆盐(oxoid，LP0055)溶解于2/3所需体积的生理盐水(0.5％，w/v)，用0.1mol/L的NaOH调节pH至8.0，用0.22μm无菌滤膜过滤后定容到所需体积，使终浓度分别达到1g/L和0.3％。

分别取冻干的普通MRS副干酪乳杆菌菌粉、富锌副干酪乳杆菌菌粉各0.1g，加0.9g生理盐水(0.5％w/v)。分别取10μL稀释菌液加至1mL的模拟胃液和模拟肠液中，于旋涡混合仪中档旋振3次。分别于0h、2h、4h、6h进行取样，计数。结果见图2及表3。

表3耐酸耐胆盐测试结果

从表3中可知，在经过模拟胃液和模拟肠液的处理后，相对于食品级的MRS培养基，采用本发明富锌培养基培养后的活菌数未发生明显降低，证明其具有耐酸耐胆盐的能力。

实施例7副干酪乳杆菌CCFM1089发酵上清的抑菌试验

1、制备副干酪乳杆菌CCFM1089代谢产物

将实施例2(1)中发酵得到的上清液，高压均质机压力最大，100mL均质，压力在400-600Bar，均质破碎后，离心取上清液，过0.22μm无菌滤膜过滤，保存备用。

2、制备副干酪乳杆菌CCFM1089富锌胞内代谢产物

将实施例3中发酵得到的上清液，高压均质机压力最大，100mL均质，压力在400-600Bar，均质破碎后，离心取上清液，过0.22μm无菌滤膜过滤，保存备用。

3、制备副干酪乳杆菌CCFM1089富锌胞外代谢产物

将实施例3中发酵得到的上清液，4℃离心取上清液，过0.22μm无菌滤膜过滤，保存备用。

4、副干酪乳杆菌CCFM1089代谢产物抑菌性试验

采用牛津杯法，测定菌株对金黄色葡萄球菌的抑制效果。

1)指示菌的制备：将金黄色葡萄球菌从保菌管中划线于LB固体培养基，培养24h后，挑取单菌落至5mL LB液体培养基中，37℃培养20h，再吸取100μL菌液于5mL mMRS液体培养基中，37℃厌氧培养20h，得到三代活化菌液。以2％的接种量接种于适宜的液体培养基中进行培养。

2)制备含指示菌的适宜固体培养基，调节菌浓度为10⁶CFU/mL～10⁷CFU/mL。在铺有一层水琼脂的平板中摆上牛津杯，小心倒入含指示菌的培养基(注意不要倒入牛津杯孔中)，待其凝固后拔出牛津杯。在形成的孔中加入100μL制备好的无菌上清液，4℃条件下扩散4h，随后37℃静置培养16h～18h，观察并测定抑菌圈的大小。

以MRS液体培养基作为阴性对照，克林霉素作为阳性对照。用生理盐水调节指示菌菌浓度为10⁶CFU/mL～10⁷CFU/mL，涂布在铺有相应固体培养基的平板上，然后摆上牛津杯，在牛津杯中加入100μL制备好的无菌上清液，4℃条件下扩散4h，随后37℃静置培养16h～18h，观察并测定抑菌圈的大小。

由图3可见(从左往右、从上至下依次为低浓度锌离子、副干酪乳杆菌CCFM1086的上清、富锌副干酪乳杆菌CCFM1086的上清、富锌副干酪乳杆菌CCFM1086胞内代谢产物的抑菌圈)，副干酪乳杆菌CCFM1086富锌后的代谢产物具有良好的抗菌效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种富锌副干酪乳杆菌，其特征在于：所述富锌副干酪乳杆菌由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)在富锌培养基中驯化培养至少80代得到，其中，富锌培养基为添加了牛骨胶原蛋白肽和锌离子的MRS培养基，副干酪乳杆菌的保藏编号为GDMCC No.60880，所述富锌培养基中锌离子的浓度为60~120 mg/L。

2.根据权利要求1所述的富锌副干酪乳杆菌，其特征在于：所述富锌培养基中牛骨胶原蛋白肽的浓度为1~10 g/L。

3.根据权利要求1所述的富锌副干酪乳杆菌，其特征在于：所述MRS培养基的组成为：蛋白胨5～20 g/L、牛肉浸膏5～20 g/L、酵母提取物2.5～10 g/L、葡萄糖10～30 g/L、三水·乙酸钠2.5～10 g/L、柠檬酸氢二胺1～5 g/L、三水·磷酸氢二钾1～5 g/L、七水·硫酸镁0.25～0.75 g/L、一水·硫酸锰 0.1～0.3 g/L、吐温80 0.5~2 g/L。

4.权利要求1-3任一项所述的富锌副干酪乳杆菌在抑制金黄色葡萄球菌中的应用，其特征在于：所述应用为非治疗目的的应用。

5.一种生产有机锌的方法，其特征在于：采用权利要求1-3任一项所述的富锌副干酪乳杆菌进行发酵生产。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：发酵条件为温度35～40℃、转速50～120rpm、pH5.5～6.0。