CN102860411A

CN102860411A - 一种鼠李糖乳杆菌益生素及其制备方法

Info

Publication number: CN102860411A
Application number: CN2012103914250A
Authority: CN
Inventors: 刘颖; 徐春厚; 谢为天; 邝雪梅; 赵生才
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2012-10-16
Filing date: 2012-10-16
Publication date: 2013-01-09

Abstract

本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌益生素及其制备方法，属于微生态制剂及饲料添加剂技术领域，其成分由鼠李糖乳杆菌LT22培养物、絮凝剂、冻干保护剂、填充料所组成，其制备方法为：菌种活化、菌种扩培、菌体细胞絮凝、菌体细胞冷冻干燥、填充料吸附、两种制剂相混合；该方法制得的鼠李糖乳杆菌益生素含有抵抗力强的菌体细胞、乳酸、抑菌活性物质、大豆蛋白、麸皮等有益成分；能够促进饲料中蛋白质、脂肪和碳水化合物的消化，提高饲料利用率，促进动物生长；防止病原微生物入侵，抑制有害菌的生长，维持消化道微生态平衡，刺激机体免疫系统反应，提高免疫细胞的活性和抗体水平，使动物抗病能力提高，市场前景非常广阔。

Description

一种鼠李糖乳杆菌益生素及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物饲料添加剂，具体涉及鼠李糖乳杆菌益生素及其制备方法，属于微生态制剂及饲料添加剂技术领域。

背景技术

目前，由于对食品安全的关注，对抗生素作为饲料添加剂产生的副效应引起了人们的重视，国际社会已提出减少抗生素生长促进剂使用量或取消饲用抗生素的使用。而益生素就是在这种前提下开发出来的一类较为理想的饲用抗生素替代品。

在益生素的生产菌种上，乳杆菌在维护人和动物机体健康方面的作用越来越为人们所关注。乳杆菌是动物肠道内的常在菌，乳杆菌类益生素具有营养、保健、提高机体抵抗力、拮抗病原菌及促进生长等多方面的作用，被广泛地应用于医疗、保健、食品、畜物业和水产业等行业。 CN101507466A公开了一种生物益生素及其制备方法，其菌株液是以占50~60%重量比的乳杆菌液为主要成分组成的四联菌，但乳杆菌抵抗力较弱，保存期较短，给生产带来一些不便，不能很好的适应市场的需要。

鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG），是20世纪80年代由两位美国科学家从健康人的肠道中分离而得，是目前最受全球关注的益生菌之一，国外已开发出许多人用产品。而鼠李糖乳杆菌LT22（Lactobacillus rhamnosus LT22）是发明人所在的项目组分离鉴定的益生菌，具有生长速度快、产酸能力强、抑菌活性高、提高机体免疫力和无毒副作用等特点，是一株非常理想的益生菌，有待于开发利用。

通过将鼠李糖乳杆菌培养物絮凝后的菌体细胞冷冻干燥，将剩余发酵液用填充料吸附，然后二者混合的生产工艺制备鼠李糖乳杆菌益生素，即增强了鼠李糖乳杆菌的抵抗力、延长了保存期和保证了有效活菌数，又保留了培养物中乳酸、抑菌活性物质、未知生长因子等有益代谢产物，故本发明制备的益生素在动物上使用效果会更好，市场前景广阔。

发明内容

本发明的目的是针对养殖场和饲料厂大量使用抗生素的弊端及现有益生素产品的不足，提供一种动物用鼠李糖乳杆菌益生素及其制备方法。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

鼠李糖乳杆菌益生素，是由下述成分组成的：

鼠李糖乳杆菌LT22培养物，絮凝剂，冻干保护剂，填充料。

鼠李糖乳杆菌LT22培养物是将鼠李糖乳杆菌LT22接种于扩大培养基，然后在33℃ ~ 37℃条件下静置培养48h ~ 60h，得到发酵液，其主要成分是：菌体细胞、乳酸、抑菌活性物质；絮凝剂为黄豆浆；冻干保护剂由重量份为10%脱脂奶粉、4%蔗糖、2%海藻糖和余量水组成，其中脱脂奶粉的蛋白含量为32% ~ 34%；填充料为麸皮。

一种用于制备权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌益生素的方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将鼠李糖乳杆菌LT22菌种接种于活化培养基，在34℃ ~ 37℃恒温箱中静置培养24h ~ 36h，即为鼠李糖乳杆菌LT22一级菌液；其活化培养基是由重量份为1%蛋白胨、0.5%牛肉膏、 0.5%酵母膏、2%葡萄糖、0.2% K₂HPO₄、 0.5%乙酸钠、0.2%柠檬酸三铵、0.06% MgSO₄·7H₂O、0.02% MnSO₄·H₂O、0.1%吐温80和余量水组成，pH为6.2~6.5；

（2）菌种扩培：将鼠李糖乳杆菌LT22一级菌液按5%接种量接入扩大培养基，在33℃ ~ 37℃恒温箱中静置扩大培养48h ~ 60h，期间每隔12h摇动一次培养基，连续传2代，即为鼠李糖乳杆菌LT22二级菌液和三级菌液；其扩大培养基是由重量份为1%大豆蛋白胨、0.5%酵母膏、2%葡萄糖、0.1% NaCl、0.03% K₂HPO₄、0.02% MgSO₄·7H₂O和余量水组成，pH值自然；

（3）菌体细胞絮凝：将鼠李糖乳杆菌LT22三级菌液与黄豆浆混合，二者重量比为12.5:1，置于30℃ ~ 35℃温度下缓慢搅拌20min，然后静置2h，收集培养物底部的菌体细胞絮状物，其余部分可称为鼠李糖乳杆菌发酵上清液；其黄豆浆是由重量份为3.3%黄豆和水经过浸泡、磨碎、过滤、灭菌后制得；

（4）菌体细胞冷冻干燥：用冻干保护剂将菌体细胞絮状物稀释成1 x 10¹⁴CFU/mL以上的菌体悬液，分装后进行低温冷冻干燥，即得到鼠李糖乳杆菌菌粉；

（5）填充料吸附：将鼠李糖乳杆菌菌粉与麸皮混合，二者重量比为1:10，即为鼠李糖乳杆菌菌粉制剂；将鼠李糖乳杆菌发酵上清液用麸皮吸附，二者重量比为1:2.5，50℃ ~ 60℃温度下风干，粉碎，即为鼠李糖乳杆菌发酵上清液固体制剂；

（6）鼠李糖乳杆菌益生素的制备：将鼠李糖乳杆菌菌粉制剂与发酵上清液固体制剂混合，二者重量比为1:100，即为鼠李糖乳杆菌益生素，活菌数在1 x 10¹⁰CFU/g以上。

本发明的有益效果是：

（1）选用鼠李糖乳杆菌LT22菌株，生长速度快，抵抗力较强，高产乳酸和抑菌活性物质，是理想的益生菌株；本发明制得的鼠李糖乳杆菌益生素含有菌体细胞、乳酸、抑菌活性物质、黄豆浆、冻干保护剂和麸皮等有益成分。

（2）用黄豆浆作为絮凝剂沉降菌体细胞效果好，沉降率在85%以上，且方法简便、成本低，残留的大豆蛋白亦可增加冻干保护剂的蛋白含量，对菌体细胞保护有益。

（3）将沉降的菌体细胞用冻干保护剂和冷冻干燥法处理，获得了鼠李糖乳杆菌菌粉；该菌粉中的细胞含水量低，处于一种休眠的保护状态，利于高温制粒、运输、长时间保存和使用，很好地解决了乳杆菌抵抗力低、不耐热等问题。

（4）用麸皮作为填充料，吸附去除了大部分菌体细胞的鼠李糖乳杆菌培养物，获得了鼠李糖乳杆菌发酵上清液固体制剂；该制剂在烘干过程中不需要考虑温度对菌体细胞的影响，利于用较高的温度进行快速烘干；同时保留了乳酸、抑菌活性物质等胞外代谢产物，利于其发挥相应的活性作用；麸皮中含有丰富的膳食纤维、B族维生素、维生素E、氨基酸和微量元素等动物必需营养成分，选用麸皮作为填充料对动物有一定的营养功能。

（5）本发明用鼠李糖乳杆菌菌粉制剂和鼠李糖乳杆菌发酵上清液固体制剂制备鼠李糖乳杆菌益生素，其中的菌体细胞抵抗力强，可在肠道内定植，具有调节肠道菌群平衡和拮抗病原菌的作用；乳酸可改善饲料风味，增加适口性，起到酸化剂的作用；抑菌活性物的抑菌谱宽，抑菌活性强，具有热稳定性，起到抗生素的作用。

（6）综上所述，鼠李糖乳杆菌益生素对动物必将有较好的营养作用、免疫作用和生物拮抗作用，市场前景广阔，对于养殖业的发展、人类健康和环境保护具有重要意义。

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

鼠李糖乳杆菌益生素及其制备方法，步骤如下：

（1）菌种活化：将鼠李糖乳杆菌LT22菌种接种于活化培养基，在35±1℃恒温箱中静置培养36h，即为鼠李糖乳杆菌LT22一级菌液；其活化培养基是由重量份为1%蛋白胨、0.5%牛肉膏、0.5%酵母膏、2%葡萄糖、0.2% K₂HPO₄、0.5%乙酸钠、0.2%柠檬酸三铵、0.06% MgSO₄·7H₂O、0.02% MnSO₄·H₂O、0.1%吐温80和余量水组成；

（2）菌种扩培：将鼠李糖乳杆菌LT22一级菌液按5%接种量接入扩大培养基，在35±1℃恒温箱中静置扩大培养60h，期间每隔12h摇动一次培养基，连续传2代，即为鼠李糖乳杆菌LT22二级菌液和三级菌液；其扩大培养基是由重量份为1%大豆蛋白胨、0.5%酵母膏、2%葡萄糖、0.1% NaCl、0.03% K₂HPO₄、0.02% MgSO₄·7H₂O和余量水组成；

（3）菌体细胞絮凝：将鼠李糖乳杆菌LT22三级菌液与黄豆浆混合，二者重量比为12.5:1，置于30℃温度下缓慢搅拌20min，然后静置2h，收集培养物底部的菌体细胞絮状物，其余部分可称为鼠李糖乳杆菌发酵上清液；其黄豆浆是由重量份为3.3%黄豆和水经过浸泡、磨碎、过滤、灭菌后制得；

（4）菌体细胞冷冻干燥：用冻干保护剂将菌体细胞絮状物稀释成3.5 x 10¹⁴CFU/mL的菌体悬液，分装后进行低温冷冻干燥，得到鼠李糖乳杆菌菌粉0.05kg；

（5）填充料吸附：将鼠李糖乳杆菌菌粉与麸皮混合，二者重量比为1:10，得鼠李糖乳杆菌菌粉制剂0.5kg；将鼠李糖乳杆菌发酵上清液用麸皮吸附，二者重量比为1:2.5，50℃温度下风干，粉碎，得鼠李糖乳杆菌发酵上清液固体制剂50kg；

（6）鼠李糖乳杆菌益生素的制备：将鼠李糖乳杆菌菌粉制剂与发酵上清液固体制剂混合，二者重量比为1:100，获得鼠李糖乳杆菌益生素50kg，活菌数为3.1 x 10¹⁰CFU/g。

（7）鼠李糖乳杆菌存活率测定：取不同保藏时间的鼠李糖乳杆菌益生素，用灭菌生理盐水稀释后涂布MRS琼脂平板，35±1℃培养48h，计算菌落数量，根据稀释倍数计算活菌的数量，存活率测定结果见表1：

表1 鼠李糖乳杆菌存活率测定结果

保藏时间（d）	60	120	180	240	300	360
							细菌总数（CFU/g）	3.0x10¹⁰	2.6x10¹⁰	1.3x10¹⁰	8.7x10⁹	4.2x10⁹	2.1x10⁹
存活率（%）	96.8	83.9	41.9	28.1	13.5	6.8

实施例2

鼠李糖乳杆菌益生素及其制备方法，步骤如下：

（1）菌种活化：将鼠李糖乳杆菌LT22菌种接种于活化培养基，在35±1℃恒温箱中静置培养24h，即为鼠李糖乳杆菌LT22一级菌液；其活化培养基是由重量份为1%蛋白胨、0.5%牛肉膏、0.5%酵母膏、2%葡萄糖、0.2% K₂HPO₄、0.5%乙酸钠、0.2%柠檬酸三铵、0.06% MgSO₄·7H₂O、0.02% MnSO₄·H₂O、0.1%吐温80和余量水组成；

（2）菌种扩培：将鼠李糖乳杆菌LT22一级菌液按5%接种量接入扩大培养基，在35±1℃恒温箱中静置扩大培养48h，期间每隔12h摇动一次培养基，连续传2代，即为鼠李糖乳杆菌LT22二级菌液和三级菌液；按5%的接种量将鼠李糖乳杆菌LT22三级菌液接种于装有扩大培养基的500L发酵罐中，35±1℃静置扩大培养48h，期间每隔12h搅拌一次培养基，获得鼠李糖乳杆菌LT22发酵液；其扩大培养基是由重量份为1%大豆蛋白胨、0.5%酵母膏、2%葡萄糖、0.1% NaCl、0.03% K₂HPO₄、0.02% MgSO₄·7H₂O和余量水组成；

（3）菌体细胞絮凝：将鼠李糖乳杆菌LT22发酵液与黄豆浆混合，二者重量比为12.5:1，置于35℃温度下缓慢搅拌20min，然后静置2h，收集培养物底部的菌体细胞絮状物，其余部分可称为鼠李糖乳杆菌发酵上清液；其黄豆浆是由重量份为3.3%黄豆和水经过浸泡、磨碎、过滤、灭菌后制得；

（4）菌体细胞冷冻干燥：用冻干保护剂将菌体细胞絮状物稀释成2.5 x 10¹⁴CFU/mL的菌体悬液，分装后进行低温冷冻干燥，得到鼠李糖乳杆菌菌粉0.5kg；

（5）填充料吸附：将鼠李糖乳杆菌菌粉与麸皮混合，二者重量比为1:10，得鼠李糖乳杆菌菌粉制剂5kg；将鼠李糖乳杆菌发酵上清液用麸皮吸附，二者重量比为1:2.5，60℃温度下风干，粉碎，得鼠李糖乳杆菌发酵上清液固体制剂500kg；

（6）鼠李糖乳杆菌益生素的制备：将鼠李糖乳杆菌菌粉制剂与发酵上清液固体制剂混合，二者重量比为1:100，获得鼠李糖乳杆菌益生素500kg，活菌数为2.7 x 10¹⁰CFU/g。

（7）鼠李糖乳杆菌益生素饲喂生长育肥猪试验分析：

选用90头三元杂交小猪，体重20kg左右，随机分为3组，每组30头；对照组小猪饲喂基础日粮；试验一组和试验二组小猪饲喂添加有鼠李糖乳杆菌益生素的基础日粮，添加量分别为5g/kg饲料、10g/kg饲料；试验期100d。

试验一组、试验二组的生长育肥猪与对照组比较，平均日增重提高6.58%和5.82%；料重比降低4.90%和5.24%；死亡淘汰率降低50.07%，结果见表2：

表2 鼠李糖乳杆菌益生素饲喂生长育肥猪试验

组别	平均始重/kg	平均末重/kg	平均日增重/g	平均日采食量/kg	料重比	死淘率/％
							对照组	20.86	95.79	749.3	2.14	2.86	6.67
试验一组	20.43	100.29	798.6	2.17	2.72	3.33
							试验二组	20.58	99.87	792.9	2.15	2.71	0

Claims

1.一种鼠李糖乳杆菌益生素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）菌种活化：将鼠李糖乳杆菌LT22菌种接种于活化培养基，在34℃ ~ 37℃恒温箱中静置培养24h ~ 36h，即为鼠李糖乳杆菌LT22一级菌液；

（2）菌种扩培：将鼠李糖乳杆菌LT22一级菌液按5%接种量接入扩大培养基，在33℃ ~ 37℃恒温箱中静置扩大培养48h ~ 60h，期间每隔12h摇动一次培养基，连续传2代，即为鼠李糖乳杆菌LT22二级菌液和三级菌液；

（3）菌体细胞絮凝：将鼠李糖乳杆菌LT22三级菌液与黄豆浆混合，二者重量比为12.5:1，置于30℃ ~ 35℃温度下缓慢搅拌20min，然后静置2h，收集培养物底部的菌体细胞絮状物，其余部分可称为鼠李糖乳杆菌发酵上清液；

2.一种采用权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌益生素的制备方法制备的鼠李糖乳杆菌益生素。

3.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌益生素的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的活化培养基组分如下，各组分的含量均为重量百分比：

1%蛋白胨、0.5%牛肉膏、0.5%酵母膏、2%葡萄糖、0.2%K₂HPO₄、0.5%乙酸钠、0.2%柠檬酸三铵、0.06% MgSO₄·7H₂O、0.02% MnSO₄·H₂O、0.1%吐温80、余量水，pH6.2~6.5。

4.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌益生素的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的扩大培养基组分如下，各组分的含量均为重量百分比：

1%大豆蛋白胨、0.5%酵母膏、2%葡萄糖、0.1% NaCl、0.03% K₂HPO₄、0.02% MgSO₄·7H₂O、余量水，pH值自然。

5.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌益生素的制备方法，其特征在于：所述的黄豆浆，其组分如下，各组分的含量均为重量百分比：

3%黄豆，余量水；将3.3%的黄豆经浸泡、磨碎、过滤、消毒后即为所述的黄豆浆。

6.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌益生素的制备方法，其特征在于：所述的冻干保护剂由重量份为10%脱脂奶粉、4%蔗糖、2%海藻糖和余量水组成，其中脱脂奶粉的蛋白含量为32% ~ 34%。

7.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌益生素的制备方法，其特征在于：所述的填充料为麸皮。